Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование и оптимизация биотехнологических процессов производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Моделирование и оптимизация биотехнологических процессов производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной"

На правах рукописи

Г'

ЗАДОХИН СЕРГЕИ НИКОЛАЕВИЧ

МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ХОЛЕРНОЙ БИВАЛЕНТНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ

Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнолопш)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

1 июл т

005570260

Щелково — 2015

005570260

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научным руководитель

Комиссаров Александр Владимирович, кандидат технических наук, доцент, Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, заведующий отделом

Официальные оппоненты:

Похиленко Виктор Данилович, доктор технических наук, старший научный сотрудник, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ведущий научный сотрудник отдела биологических технологий

Щербаков Анатолий Анисимович, доктор биологических наук, профессор. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н И. Вавилова», кафедра микробиологии, биотехнологии и химии, профессор кафедры

Ведущая организация:

Научно-исследовательский центр федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации (г. Киров)

J у

Защита состоится «__» сентября 2015 г., в 10 часов на заседании диссертационного совета Д

006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский н технологический институт биологической промышленности ФАНО России по адресу: 141142, Московская область, Щелковский р-н, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП, e-mail: vnilibp@mail.ni.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский н технологический институт биологической промышленности.

Автореферат разослан « июня 2015 г. и размещен на сайте ВНИТИБП www.vnitibp.com и на официальном сайте ВАК httir/Avww.vak.ed.gov.m.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В XXI веке холера продолжает оставаться болезнью, вызывающей эпидемии и крупные вспышки, преимущественно, в азиатских и африканских странах. Однако масштабная вспышка холеры в 2010 году на Доминиканской Республике и Республике Гаити позволяет сделать вывод о расширении ее ареала. Данное обстоятельство объясняется межконтинентальными, меж- и внутригосударственными заносами возбудителя холеры. В полной мере это относится и к России, где ежегодно регистрируют случаи ввоза инфекции из других стран и выделяют бактерии Vibrio cholerac Ol и 0139 серо групп из объектов окружающей среды. Вакцинация против холеры остается наиболее действенным способом ее специфической профилактики.

Национальная холерная химическая вакцина производимая РосНИПЧИ «Микроб» не менее эффективна чем ее зарубежные аналоги (Кутырев В.В. и др. 2006; Щуковская Т.Н. н др., 2009). Производство данной вакцины состоит из ряда биотехнологических этапов, определяющим из которых является культивирование производственных штаммов холерных вибрионов с целью получения их антигенов. Общепризнано, что использование методов математического моделирования позволяет оптимизировать работу действующих ферментационных установок.

Холерная вакцина представляет собой смесь лиофилизнрованных холерогена-анатоксина и О-антигенов, полученных из ннактивированных формалином бульонных культур холерных вибрионов 01 серогруппы — V. cholerae 569В классического биовара серовара Инаба и V. cliolerae М-41 классического бповара серовара Огава. В качестве вспомогательных веществ используются следующие наполнители: сахароза, крахмал, тальк, кальций стеарат. Таблетка покрыта кншечно-растворимой оболочкой из целлацефата (ацетилфталилцеллюлозы). Используемый в настоящее время способ получения готовой лекарственной формы вакцины методом прямого прессования требует усовершенствования в связи с большими потерями (от 10 до 30 %) таблеточной смеси, возникающими из-за различий в плотности используемых компонентов.

Одним из недостатков технологии изготовления таблетки является использование 5 % раствора целлацефата в ацетоне для нанесения покрытия. Ацетон является легковоспламеняющейся жидкостью и работа с ним требует создания дополнительных условий для обеспечения техники безопасности.

Степень разработанности темы. Проведенный обзор литературы позволяет сделать ряд выводов. Математическое моделирование процессов микробиологического синтеза позволяет, в ряде случаев, стандартизировать его управление и повысить количество целевого продукта. Оптимизации процессов выращивания микроорганизмов и биосинтеза продуктов, используя математические методы планирования экспериментов, посвящено большое количество исследовании, изложенных в работах Бирюкова В.В, Кантере В.М., Винарова Л.Ю., Перта С.Дж., Васильева H.H. и ряда других. Между тем работ, посвященных математическому описанию процессов биосинтеза протектнвных антигенов холерных вибрионов, нам обнаружить не удалось.

Анализ данных технологии получения и компонентного состава существующих вакцин в виде таблетки показал, что они обладают низкой механической прочностью, что не позволяет использовать технологические приемы их получения для холерной химической вакцины. Обзор сведений по применению гранулирования в технологиях твердых лекарственных форм позволил выявить, что предварительное гранулнровання таблеточной смеси позволяет улучшить ее способность к прессованию и улучшить ряд показателен самой таблетки. При этом весьма перспективным является метод гранулирования в псевдоожиженном слое, для эффективного проведения которого необходим правильный подбор ряда технологических параметров. Обзор литературы по

применению вспомогательных веществ для формирования твердых лекарственных форм показал на необходимость тщательного подбора их качественно-количественного состава. При этом выявлена предпочтительность применения при гранулировании в качестве наполнителей — лактозы н микрокристаллической целлюлозы, а в качестве связующего вещества - водных растворов поли-винилпирролидона. Проведенный анализ данных по оборудованию для нанесения покрытия на таблетки показал, что для таблеток большого размера предпочтительно использование аппаратов барабанного типа (коутеров), являющихся, к тому же, самыми распространенными для нанесения пленочных покрытий. Обзор литературы по видам пленочных покрытий II особенностям их нанесения на таблетки позволил выявить предпочтительность использования водных систем, при этом показана преимущественность готовой многокомпонентной системы Асгу1-Е/Ь. Было показано, что для эффективной организации процесса нанесения покрытия Асгу1-Е7Е необходим правильный подбор ряда технологических параметров.

Цель и задачи исследований. Цель работы - разработать математические модели процесса микробиологического синтеза протектнвных антигенов холерного вибриона, оптимизировать технологии грануляции компонентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной и нанесения покрытия на ее таблетку. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Разработать математические модели кинетики накопления О-антигена штамма V. Ыю1-егае М-41 серовара Огава, а также О-антигена и токсина штамма V. с1к>1егае 569В серовара Инаба в ходе периодического процесса культивирования холерных вибрионов.

2. Апробировать результаты моделирования при производственном культивировании холерных вибрионов - продуцентов протектнвных антигенов.

3. Определить технологические показатели (форма и размер частиц, распределение размера частиц, насыпная плотность, сыпучесть (текучесть), остаточная влажность, коэффициенты сжимаемости и Хауснера, угол естественного откоса) лиофилизатов холерогена-анатоксина штамма V. с/юкгае 569В серовара Инаба, О-антпгена штаммов V. с!ю1егае 569В серовара Инаба и V. сИо!егае М-41 серовара Огава.

4. Обосновать качественное и количественное содержание вспомогательных веществ в таблеточной смеси и оптимальные технологические параметры проведения этапа влажной грануляции компонентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной в псевдоожнжен-ном слое.

5. Определить оптимальные технологические режимы нанесения пленочного покрытия на таблетку вакцины.

6. Исследовать свойства вакцнны холерной бивалентной химической таблетированной приготовленной по предложенным технологическим решениям.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в рамках научно-исследовательских тем № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923), № 48-2-14 «Разработка и внедрение в производство МИБП новых решений, направленных на повышение качества препаратов и эффективности технологических процессов» (номер госрегистрации: 01201457722) н «Разработка современных безопасных химических вакцин против холеры и создание универсальной технологии их производства», выполненной согласно распоряжению Правительства Российской Федерации № 1426-р от 02.10.2009 г. о выделении финансовых средств на проведение научно-исследовательских работ, направленных на разработку новых средств диагностики и профилактики тропических болезнен.

Научная новизна. Разработана математическая модель, адекватно описывающая кинетику синтеза протектпвных антигенов при периодическом культивировании холерных вибрионов. При проведении теоретических и экспериментальных исследовании получены результаты, позволяющие получить частное решение дифференциальных уравнений, описывающих кинетику синтеза протектпвных антигенов, и уточнить входящие параметры и величины в существующие решения указанных уравнений. Результаты моделирования позволили разработать алгоритм автоматического введения в культуральную среду основного источника углеводного питания (глюкозы) при культивировании V. сЬоЫгае М-41 серовара Огава и 569В серовара Инаба.

Впервые исследованы технологические показатели лиофилизатов холерогеиа-анатоксина штамма V. сЬЫегае 569В серовара Инаба, О-антнгена штаммов V. сЬЫегае 569В серовара Инаба и V. с1ю!егае М-41 серовара Огава.

Экспериментально обоснован новый состав вспомогательных веществ вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. Впервые в технологии ее производства на стадии получения твердой лекарственной формы применен процесс влажной грануляции в псевдоожижен-ном слое и определены оптимальные параметры его проведения.

Впервые в технологии производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной использована система пленочного покрытия на водной основе и обоснованы технологические характеристики процесса нанесения покрытия на таблетку.

Новизна п приоритетность исследований подтверждена заявкой на выдачу патента на изобретение № 2014132179 от 05.08.2014 г. «Способ получения таблетированной формы холерной бивалентной химической вакцины».

Практическая значимость. Разработано программное обеспечение для моделирования периодического процесса культивирования холерных вибрионов — продуцентов протектпвных антигенов, позволяющее на основе кинетики накопления биомассы и целевых продуктов определять характеристики и условия процесса выращивания микроорганизмов.

Материалы исследовании использованы при разработке программ для ЭВМ «Программа для расчета концентрации и скорости роста микроорганизмов и продуктов их биосинтеза в зависимости от концентрации субстрата» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2012614773) и «Программа для расчета кинетики выделения двух продуктов биосинтеза, образующихся в процессе глубинного культивирования микроорганизмов» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2013617558).

По результатам исследований разработаны проекты изменений в фармакопейную статью предприятия ФСП Р N001465/01-220708 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворнмой оболочкой», регламент производства № ПР 01898109-39-12 «Вак-цнна холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворнмой оболочкой», оформлены стандартные операционные процедуры и инструкции по эксплуатации оборудования.

Степень достоверности результатов работы основывается на значительном объеме полученных соискателем экспериментальных данных, их соответствием теоретическим положениям, обработкой полученных результатов с использованием статистических методов, а также выполнением работы на сертифицированном и прошедшем метрологическую проверку оборудовании.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанные математические модели адекватно описывают кинетику накопления О-антигена штамма V. с!ю1егае М-41 серовара Огава, а также О-антигена и токсина штамма V. с!ю1-егае 569В серовара Инаба в процессе периодического культивирования микроба холеры.

2. Новый состав вспомогательных веществ (лактозы моногидрат - от 44,3 до 36,3; целлюлоза микрокристаллическая - от 44,3 до 36,3 массовых %) и гранулирование таблеточной смеси в псевдоожиженном слое снижает потери препарата при таблетированни с 10-30 % до 1 %.

3. Разработанная технология нанесения пленочного покрытия в аппаратах барабанного типа позволяет снизить экологическую нагрузку на окружающую среду и улучшить условия работы производственного персонала.

4. Готовая лекарственная форма холерной химической вакцины с новым составом вспомогательных веществ, приготовленная по оптимизированным технологиям гранулирования и нанесения пленочного покрытия на таблетку соответствует требованиям нормативной документации.

Апробация работы. Результаты экспериментов докладывались на ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2012, 2013, 2014) и были представлены на конференциях «Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии. Перспективы развития» (Казань, 2012); «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2013); «Биотехнология: реальность и перспективы» (Саратов, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций. Получено 2 свидетельства о государственной регистрации программы для ЭВМ.

Струкггура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих в себя материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также выводов, списка используемых литературных источников, включающего 180 наименований и приложений. Работа изложена на 182 страницах и иллюстрирована 30 рисунками, 21 таблицей.

Личный вклад автора определяется непосредственным участием в обсуждении основной идеи диссертации и поиске наиболее эффективных путей для решения поставленных задач, а также в постановке экспериментов и обработке данных. Автор принимал личное участие в разработке математических моделей процессов культивирования V. cholerae, технологических процессов гранулирования компонентов таблеточной смеси холерной вакцины, таблетпрования и нанесения покрытия, а также в написании научных публикаций, программ для ЭВМ и патента на изобретение.

Благодарности. Автор выражает благодарность сотрудникам Федерального казенного учреждения здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» кандидату биологических наук Ливановой Л.Ф., кандидату медицинских наук Беляковой Н.И., кандидату биологических наук Лобовиковой O.A., кандидату медицинских наук Шульгиной И.В., кандидату биологических наук Кузнецову О.С. за участие в организации и проведении исследований при работе с вирулентными штаммами V. cholerae, изучении морфологии холерных вибрионов с использованием атомно-снловой .микроскопии н оценке качества вакцины.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Обзор литературы

В обзоре литературы обсуждены технология получения холерной химической вакцины и применение математического моделирования процессов микробиологического синтеза. При анализе технологий и аппаратурного оформления процессов изготовления твердых лекарственных форм рассмотрены существующие таблетнрованные вакцины, применение гранулирования и различных вспомогательных веществ. Проанализированы сведения об оборудовании для нанесения покрытий на таблетки, а также видам пленочных покрытий и особенностям их нанесения на таблетки. Проведенный анализ литературы позволил определить цель и задачи исследования.

2.2 Материалы и методы исследования

Все экспериментальные этапы работы проводили в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенио-сти (опасности)» (СП 1.3.1285-03). При проведении исследований по разработке математических моделей использовали штаммы продуценты протективных антигенов: V. cholcrac М-41 серовара Огава и V. cholcrae 569В серовара Ииаба. Для контроля иммупогепности вакцины применялись культуры V. cholcrac 3122-Р серовара Огава и V. cholcrac 879-М серовара Пнаба.

Гранулирование проводили на аппарате GPCG 2 LabSystem (Glatt. Германия), реализующем гранулирование материалов методом псевдоожиженного слоя с подачей связмощего вещества сверху. В экспериментах по гранулированию использовали лиофилизаты холерогспа-апатоксина штамма V. cholcrae 569В серовара Инаба. О-аитигепа штамма V. cholcrac 569В серовара Ииаба и О-антигсна штамма V. cholcrae М41 серовара Огава. полученные по производственной технологии приготовления холерной химической вакцины. Применяли вспомогательные вещества: лактозы моногидрат (Applichem. Германия), соответствующая требованиям Фармакопеи США: целлюлоза микрокристаллическая марки Comprecel (Mingtai Chemical. Тайвань), соответствующая требованиям Европейской. Британской и Японской Фармакопеи; полпвипилпирролндон (Plasdone К-90) производства ISP. Швейцария - соответствует требованиям Европейской Фармакопеи. Прессование таблеточной смеси проводили на таблеточном прессе MiniTabT (Luxner. Германия). Нанесение покрытия на таблетку выполняли в машине барабанного типа (коутере) GMPC I Mini (Glatt. Германия). Использовали кишечно-растворимое покрытие Acryl-EZE 93А (Colorcon, Великобритания).

Установление иммуногенной и антигенной активности, токсичности, специфической стерильности. микробиологической чистоты, а также определение распадаемости и растворимости таблеток проводили по методам, изложенным в фармакопейной статье предприятия на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную. Определение концентрации формалина, содержания ионов аммония и сульфат-ионов, водородных ионов, остаточной влажности осуществляли по методикам, представленным в методических указаниях «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям» (МУК 4.1/4.2.588-96). Морфологические свойства холерных вибрионов исследовали на атомно-силовом микроскопе Solver P47-PRO (NT-MDT, Россия). Обработка изображений выполнялась в программе Nova (NT-MDT. Россия).

Определение сыпучести проводили по методике предложенной Хншовой О.М. (Хишова О.М.. 2005). Установление насыпной плотности порошков и гранулятов проводили па приборе SVM-10 (Enveka. Германия) в соответствии с методикой, описанной в Европейской Фармакопее. Коэффициенты сжимаемости и Хауснера рассчитывали по общеизвестным формулам. Испытания на истираемость таблеток осуществляли на приборе GTA 120 (Enveka. Германия) при числе качаний флакона в минуту, равном 300. в течение 3 мин. Истираемость таблеток вычислялась разнице масс таблеток до и после испытания. Угол естественного откоса определяли при насыпанин материала горкой в виде конуса. Определение твердости таблеток проводили с использованием тестера ТВН 125 TD (Enveka. Германия), используя режим работы перемещения измерительного молотка «постоянная скорость» при величине ньютон-фактора, равного 19.0. Ситовой анализ порошков и гранулятов проводили за счет автоматического процесса просеивания образца сыпучего материала через набор сит с отверстиями различного размера. Просеивание проводили в течение 5 мип при амплитуде, равной 1.5.

Для оптимизации процесса культивирования применяли известные математические модели: Моно и Моно-Иерусалимского (Бирюков В.В, 2004). Для оптимизации параметров процессов гра-

нулирования компонентов таблеточной смеси и нанесения покрытия на готовую лекарственную форму использовали методы математического планирования: полный факторный эксперимент 2" и метод «крутого» восхождения, где п - число факторов. Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли по стандартной методике определения грубых ошибок (Ашмарин И.Г!.. Воробьёв A.A., 1962). Расчеты осуществляли с помощью Microsoft Office Excel 2010 и Mathcad (версия 15.0), построение технологических схем и графиков - с помощью программы Corel Draw 10.0.

Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.

Анализ технологии получения холерной химической вакцины,

Рисунок 1 — Общая схема исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.2 Математическое моделирование процессов микробиологического синтеза протек-тивных антигенов холерного вибриона

При разработке моделей процессов микробиологического синтеза протективных антигенов холерного вибриона были сделаны следующие основные допущения: биореактор является реактором идеального смешения: реологические свойства культуральной среды в реакторе остаются постоянными в течение всего процесса; неисследуемые параметры (температура, рН, концентрация растворенного кислорода) не принимались в расчет, так как поддерживались на оптимальном уровне в ходе всего процесса.

При рассмотрении процессов аэробного биосинтеза на удельную скорость роста клеток влияет как количество растворённого кислорода, так и концентрация углеродного субстрата. Мы

8

поставили задачу сформулировать математическую модель с лимитацией по углеродному субстрату.

3.2.1 Модель процесса синтеза О-антигена У/Ьп'о сИо1егае М-41 Огава

На первоначальном этапе исследований было необходимо обосновать выбор уравнения, описывающего скорость роста V. с1ю1егае М-41 Огава. С этой целью были проанализированы данные по накоплению биомассы и О-антигена, скоростям их роста и выделения, утилизации глюкозы, полученные при культивировании холерного вибриона в химическом реакторе РЗРЯ 6/0.5 (Химмаш. Россия), приспособленном для выращивания микроорганизмов. Показано, что рост биомассы холерного вибриона зависит не только от концентрации субстрата-глюкозы, но и от концентрации О-антигена. причем его накопление снижает скорость роста микроорганизмов. Наиболее распространенным уравнением, учитывающим влияние субстрата и продукта на скорость роста биомассы является уравнение Моно-Иерусалимского (Бирюков В.В.. 2004).

где /(„„и- - удельная максимальная скорость роста микроорганизмов, ч ; Sl. - текущая концентрация растворенной глюкозы, г/л: Ах и А',х - кинетические константы, г/л: Р - концентрация О-антигена. г/л.

По нашим данным, секреция О-антигена в среду роста происходит после 3 часов от начала процесса, скорость его накопления подавляется избытком клеток холерного вибриона, и зависит от концентрации глюкозы в процессе культивирования. Таким образом, удельную скорость накопления О-антигена можно выразить выражениями (2):

При этом в уравнении изменения концентрации продукта во времени первый член отвечает за зависимость кинетики накопления О-антигена от концентрации холерного вибриона и глюкозы, а второй - за подавление накопления О-антигена избытком клеток V. сИо1егае.

Скорость потребления глюкозы V. сИо!егае М-41 Огава выражается уравнением (3): ц-Х

(3)

'л*

где Хлх-расходный коэффициент, г/г.

Таким образом, математическая модель накопления О-антигена представляет систему дифференциальных уравнений (4). описывающих изменение во времени концентраций клеток холерного вибриона, глюкозы и О-антигена в культуральной среде.

(1)

(2)

г

О, есл и 0<Г<3

дрт" СК^+Х)

где Кг. К,,, - кинетические константы, г/л; цг> - скорость потребления глюкозы клетками. ч'1; ЦРтт - удельная максимальная скорость образования О-антигена. ч'1; Х - концентрация биомассы, г/л.

В системе уравнений (4) для того периода процесса, когда не секретируется О-антиген (0-3 часа), представлялось целесообразным исключить выражение, характеризующее кинетику накопления продукта и тогда оно будет иметь вид (5).

dX dt dS

(5)

Удельная скорость роста клеток холерного вибриона в этом периоде выражается уравнением Mono:

SL

А = И,„

' Ks+S,

(6)

На основе анализа полученных нами экспериментальных данных и с использованием разработанной программы для ЭВМ в среде МаИзсас! 15.0 при решении системы дифференциальных уравнений (5) с начальными концентрациями клеток холерного вибриона и глюкозы 0,13 г/л и 22,0 г/л были определены значения максимальной удельной скорости роста //„«,.,=0,95 ч '. параметра Кта=0,927 г/г и коэффициента ^й=0,5 г/л. При моделировании второго периода процесса использовались значение параметров, определенных для первого периода. Данный период описывается 3 уравнениями (4).

С использованием разработанной программы для ЭВМ в среде МаЛсас! 15.0 при решении системы дифференциальных уравнений (4) с начальными концентрациями клеток холерного вибриона и глюкозы, которые были конечными для первого периода процесса, а также концентрации О-антигена 0.0375 г/л были получены следующие значения: К,,=2,1 г/л. К,,,=0,001 г/л. К,5=0.103 и

<?л™,=0,005 ч1.

Разработанная в среде МаЛсас! 15.0 программа ЭВМ для расчета концентрации и скорости роста микроорганизмов и продуктов их биосинтеза в зависимости от концентрации субстрата показала следующие графические результаты моделирования процесса синтеза О-антигена V. с1ю1-егае М-41 Огава (рисунок 2).

Р. г/л &.г/л X г/л О - концентрация нномасеы (эксперимент)

□ - ШНЦСНфЛЦИЯ ГЛЮКОЗЫ (эксперимент) ф

О - юннентрашм О-ишигена (эксперимент) ^ '

Время кулыивпривашш. ч

Рисунок 2 - Результаты моделирования и экспериментальные данные: 1 - кинетика накопления О-антигена (моделирование); 2 - кривая роста клеток холерного вибриона (моделирование); 3 - кинетика потребления глюкозы (моделирование)

Анализ данных рисунка 2 показывает, что расхождения составляют: для кинетики накопления О-антигена - до 15 %; для роста клеток холерного вибриона — до 15 %: для кинетики потребления глюкозы - до 5 %. Эти значения говорят о том. что наши исследования не противоречат мнению других исследователей (Казеев И.В.. 2009; Озеренко O.A.. 2004), и являются достоверными для трудно прогнозируемых процессов культивирования микроорганизмов.

3.2.2 Модель процесса синтеза токсина и О-антигена Vibrio cltolerae 569В Ппаба В ходе наших исследований показано, что рост холерного вибриона 569В Инаба зависит не только от концентрации субстрата-глюкозы, но и от концентрации антигенов, причем их накопление снижает скорость роста микроорганизмов. При обосновании выбора уравнения, описывающего скорость роста V. cliolerae 569В Инаба была предложена следующая модификация уравнения Моно-Иерусалимского. учитывающая влияние на удельную скорость роста микроорганизма концентраций двух продуктов биосинтеза.

S, 1

Ks+SL (J+P1 + P¿) (7)

где //,„,„ — удельная максимальная скорость роста микроорганизмов, ч"1; 5/. — текущая концентрация растворенной глюкозы, г/л; и К^ - кинетические константы, г/л; Л - концентрация О-антигена. г/л: Р; - концентрация токсина, г/л.

По нашим данным, секреция О-антигена и токсина в среду роста происходит после 3, ч от начала процесса, скорость их накопления подавляется избытком клеток холерного вибриона, и зависит от концентрации глюкозы в процессе культивирования. Таким образом, удельные скорости накопления токсина и О-антигена можно выразить выражением (8): 0, если 0</<3

dt

X2

<7/ч,--К,п,-Х2. если Г> 3

(К Я + Х)

л

(8)

{0, если 0<1<3 X2

(1Р2„^--АГ, ■ Х~. если I > 3

{Кр15>+Х) р

При этом в уравнениях изменения концентраций продуктов во времени выражения

и -—- и ,, А " отвечают за зависимость кинетики накопления антигенов от

(-£„,£ + X) ( А'г-5 + А")

концентрации холерного вибриона и глюкозы, а : * и Х - за ингибирование процесса избытком клеток V. с!го1егае.

Скорость потребления глюкозы V. сИокгае М-41 Огава выражается уравнением (9): и ■ X

4-1 = у С)

* да

Таким образом, математическая модель накопления О-антигена и токсина представляет систему дифференциальных уравнений (10). описывающих изменение во времени концентраций клеток холерного вибриона, глюкозы и О-антигена в культуральной среде. При этом Кр/, К,Г1, К,,:. К,П2 - кинетические константы, г/л; да -скорость потребления глюкозы клетками, ч"1; дг1,„ау, цгьтв

- удельная максимальная скорость образования О-антигена и токсина соответственно, ч'1; X — концентрация биомассы, г/л.

С = X

Л

<

«к. ~dt~

'El dt

dP. di

-<h

О, если 0<t<3 X2

Чпшт

-К , -X' .если t>3 (K,,S+X) "

(10)

0, если 0<í<3 X2

V

4n,

7 kp,S+X)

■X' .если l>3

В системе уравнений (10) для начального периода процесса, где отсутствует выделение токсина и О-антигена (от 0 до 3 часов), представляется целесообразным исключить выражения, характеризующее кинетику увеличения продукта, и оно будет иметь вид выражений (II). dX .. li = f'X

dS i11»

Также можно говорить о том. что удельная скорость роста биомассы будет описываться уравнением Моно:

S,

" A\+S,

(12)

На основе анализа экспериментальных данных и с использованием разработанной программы для ЭВМ в среде Ма(Ьсас1 15.0 при решении системы дифференциальных уравнений (11) для роста V. с/ю!егае 569В Инаба с начальными концентрациями клеток холерного вибриона и глюкозы 0.13 г/л и 22.0 г/л были получены значения максимальной удельной скорости роста ,и,тх=0.99 ч"1, параметра Уд5=0,824 г/г и коэффициента Л"5=0.5 г/л.

При моделировании второго периода процесса использовались значение параметров, определенных для первого периода. Данный период описывается 4 уравнениями (10). С использованием разработанной программы для ЭВМ в среде МаИкас! 15.0 при решении системы дифференциальных уравнений (10) с начальными концентрациями клеток холерного вибриона и глюкозы, которые были конечными для первого периода процесса, а также концентраций О-антигена /'/»=0.032 г/л и токсина Ру/=0.014 г/л были получены следующие значения: Кр/ = 1.7 г/л, Кр2=2,2 г/л. К,„,=0.001 г/л. К/р2=0.001 г/л. /05=0,122, д,.1„1а,=0.007 ч"1 и дР2,ш«=0,005 ч"1.

Разработанная в среде МаЛса<1 15.0 программа ЭВМ для расчета кинетики выделения двух продуктов биосинтеза, образующихся в процессе глубинного культивирования микроорганизмов показала следующие графические результаты моделирования процесса синтеза О-антигена и токсина V. с1ю!егае 569В Инаба (рисунок 3).

Рисунок 3 - Результаты моделирования и экспериментальные данные:

1 - кривая роста клеток холерного вибриона (моделирование); 2 - кинетика потребления глюкозы (моделирование); 3 - кинетика накопления О-антигена (моделирование); 4 - кинетика накопления токсина (моделирование)

Анализ данных рисунка 3 показывает, что расхождения составляют: для кинетики накопления О-антигена и токсина - до 15 %; для роста клеток холерного вибриона - до 15 %; для кинетики потребления глюкозы — до 20 %.

3.2.3 Разработка программ для ЭВМ

Значительное количество расчетов, необходимых для нахождения неизвестных значений параметров разработанных математических моделей процессов микробиологического синтеза протективных антигенов холерного вибриона, вызвало необходимость конструирования программ для ЭВМ. Для их разработки был использован пакет Mathcad (версия 15.0), часто используемый для расчетов и визуализации результатов математического моделирования. Для решения системы дифференциальных уравнений использовался встроенный в Mathcad алгоритм Рунге-Кутта четвертого порядка с фиксированным шагом. На первом этапе, используя имеющиеся данные результатов процесса синтеза антигенов, вычисляются кинетические коэффициенты. На втором этапе, используя посчитанные коэффициенты, производится расчет системы дифференциальных уравнений с граничными значениями от времени //=0 до íj=3 (отсутствие синтеза антигенов). На третьем этапе, используя посчитанные коэффициенты, производится расчет системы дифференциальных уравнений с граничными значениями от 3 до ts=9 времени окончания процесса. На заключительном этапе программа строит графическое решение системы дифференциальных уравнений.

3.2.4 Апробация результатов моделирования при культивировании Vibrio cholerae М-41 Огава и Vibrio cliolerae 569В Ипаба

На данном этапе исследований культивирование холерных вибрионов проводили в биореакторе BioFors Pilot 300 (Biotron, Южная Корея). Входящее в комплект программное обеспечение С-ВЮ* SCADA (Sysbiotech. Франция) в комплексе с техническими средствами позволяет автоматизировать процесс ферментации по выбранной стратегии путем реализации серии команд, предназначенных для управления биореактором.

На основании кривой, полученной в результате моделирования процесса и характеризующей потребление глюкозы был разработан и реализован алгоритм ее автоматического введения в культуральную среду при культивировании V. cholerae М-41 серовара Огава и V. cholerae 569В се-ровара Инаба. Профиль введения глюкозы, реализованный в С-ВЮ* SCADA представлен на рисунке 4.

Рисунок 4 - Профиль введения глюкозы (по оси ординат - производительность перистальтического насоса, %) Примечание. Производительность насоса при 100 % равна 30 мл/мин

т - с^з ' Сш

Реализация данного профиля введения глюкозы в культуральную среду при культивировании холерных вибрионов осуществлялась при следующих условиях. Оптимальная температура культивирования (37±0,5) °С поддерживалась системой автоматического регулирования. рН куль-туральной среды при снижении до 7.6 восстанавливали до 8,0 введением 10 % раствора аммиака со скоростью его подачи, равной 30 мл/мин. Содержание растворенного кислорода до минимального критического уровня 30 % поддерживалось при ранее экспериментально обоснованных режимах аэрации-перемешивания культуральной среды, позволяющих обеспечить массопередачу кислорода на уровне от 2,2 до 3,1 гОгАдм-Уч) (Ульянов, АЛО. и др., 2011). При обильном пенооб-разовании данные режимы сохранялись за счет введения пеногасителя «Антиспумин TZ» в количестве (4,5±1,5) мл на 150 дм1 культуральной среды.

Временные профили концентрации микробной биомассы, рН среды культивирования, количества глюкозы при выращивании V. cholerae М41 Огава и V. cholerae 569В Инаба представлены на рисунках 5 и 6 соответственно. Очевидно практически полное совпадение временных профилей рН среды культивирования. Максимальное закисление культуральной среды до рН 7.6 происходит к 5 часу культивирования. Далее в течение часа рН возрастает до 8.0 за счет введения аммиака в течение этого промежутка времени. Значение рН достигает максимума к 7 часам и далее не меняется до окончания выращивания. Размножение клеток V. cholerae происходит по известным закономерностям роста микробных клеток в периодической культуре: фаза привыкания продолжается до 1,5-2 часов, ускоренный рост происходит в промежуток от 1,5-2 часов до 5-6 часа роста: далее микроорганизмы переходят в экспоненциальная фазу роста, которая длится до 9 часа: затем рост холерных вибрионов переходит в стационарную фазу. Обращает на себя внимание

Рисунок 5 - Временные профили рН среды культивирования, количества глюкозы и концентрации микробной биомассы при выращивании холерного вибриона штамма V. ско1егае М41 Огава

Время, ч

Рисунок б - Временные профили рН среды культивирования, количества глюкозы и концентрации микробной биомассы при выращивании холерного вибриона штамма V. сИо/егае 569В Инаба

Наибольшая продукция антигенов наблюдалась при переходе в стационарную фазу. Необходимо отметить, что продукция антигенов, определенная в реакции иммунной диффузии, в два раза превышала нормируемые значения (таблица I).

Таблица 1 - Содержание антигенов при культивировании V. скокгае М-41 Огава и V. скокгае 569В Инаба (п=3)___

Антиген Содержание аитигена в культуральной жидкости по времени культивирования Нормируемое содержание антигенов в РИД

8 часов 9 часов 10 часов

РИД ИФА РИД ИФА РИД ИФА

О-антиген V. с1ю1егае М-41 Огава 12 0,72 16 0,92 16 0,91 8, не менее

О-антиген V. сИокгае 569В Инаба 6 0,51 8 0,73 8 0,73 4. не менее

Токсин V. с!ю1егае 569В Инаба 3 0,28 4 0,35 4 0,34 2, не менее

Примечания. 1. РИД - реакция иммунной диффузии, ИФА - иммуноферментный анализ. 2. Содержание в РИД - обратный титр, содержание в ИФА - г/л.

С использованием атомно-силовой микроскопии была изучена морфология холерных вибрионов (рисунок 7).

Необходимо отметить, что холерные вибрионы обоих штаммов имели сходный размер и морфологию поверхностных структур клеток. Обращает на себя внимание увеличенная в два раза, в сравнении с данными литературы (Адамов А.К.. Наумшина М.С.. 1984). толщина микробной клетки (1.1 мкм). Однако, это хорошо согласуется с исследованиями Магу l_.de. а а1. (2004). в которых показано, что при глубинном аппаратном культивировании, в условиях достаточного количества компонентов, необходимых для развития холерных вибрионов, происходит увеличение размеров клетки.

Таким образом, экспериментальная апробация результатов моделирования при культивировании V. с1ю!егае М-41 Огава и V. с/ю/егае 569В Инаба, показала удовлетворительную сходимость результатов.

3.3 Совершенствование процессов изготовления твердой лекарственной формы вакцины холерной бивалентной химической таблстнрованной

3.3.1 Проведение исследований по гранулированию компонентов холерной химической вакцины

3.3.1.1 Оценка возможности применения метода гранулирования в исевдоожиженном слое с существующим компонентным составом таблеточной смеси

Определение характеристик лиофилизированных активных компонентов холерной вакцины

С целью принятия решения о целесообразности проведения исследований по гранулированию таблеточной массы холерной вакцины изучены технологические характеристики лиофилизи-рованных порошков холерогена-анатоксина и О-антигенов: форма и размер частиц, распределение размера частиц, насыпная плотность, сыпучесть (текучесть), остаточная влажность, коэффициенты сжимаемости и Хауснера. угол естественного откоса.

Распределение размера частиц в лиофилизатах холерогена-анатоксина, О-антигена Огава и О-аитигена Инаба, определенное ситовым методом, составляло следующие величины: холероген-анатоксин: пыль-(35.1±0.3) %, 112-500 мкм-(31,3±0.5) %, 500 мкм-1.0 мм - (24,1±0,2) %, 1.0 мм-2.5 мм - (6,7±0.1) %, >2,5 мм - (2,8±0.6) %; О-антиген Огава: пыль - (33,3±0.7) %, 112-500 мкм -(29,1 ±0,3) %, 500 мкм-1.0 мм - (28,5±0.5) %, 1.0 мм-2.5 мм-(6,3±0,2) %, >2,5 мм-(2,8±0.3) %; О-

антиген Инаба: пыль - (30,5±0,5) %, 112-500 мкм - (31,4±0,4) %, 500 мкм-1.0 мм-(29,3±0,6) %, 1,0 мм-2,5 мм - (5,5±0,3) %, >2.5 мм - (2,3±0.2) %.

Насыпная плотность (до/после утряски) всех трех компонентов была определена па уровне от 0,035 до 0,038/'от 0,043 до 0,047 г/см1. Соответственно коэффициенты сжимаемости и Хауснера составляли от 18.6 до 19,2 и от 1,29 до 1.09. Значение текучести было равно 0. Величина угла естественного откоса составляла (67±1)°, что также свидетельствует о крайне низкой сыпучести. Остаточная влажность колебалась от 1.1 до 1.9 %. Все порошки хорошо растворялись в воде. Был сделан вывод, что лиофилизированные компоненты вакцины являются аморфными субстанциями с значительным разбросом значений по фракционному составу, при этом очень большое количество лиофилизатов находится в виде пыли. Это обуславливает неудовлетворительные для получения таблеток значения таких технологических характеристик, как сыпучесть, насыпная плотность, угол естественного откоса, коэффициенты сжимаемости и Хауснера. Вышеизложенное предопределило необходимость проведения исследований по гранулированию компонентов таблеточной смеси.

Гранулирование «плацебо»

Для оценки возможности применения метода гранулирования в псевдоожиженном слое с существующим компонентным составом таблеточной смеси на первоначальном этапе проведены исследования без использования активных лекарственных компонентов - холерогена-анатоксипа и О-антигенов, заменив их на сахарозу. Испытания показали, что гранулирование в псевдоожиженном слое может быть использовано для получения гранул «плацебо». Однако, «выход» пригодных для последующего таблетирования гранул был очень низким (от 62 до 85 %).

Гранулирование с активными лекарственными компонентами

Исходя из результатов экспериментов по гранулированию «плацебо» представлялось целесообразным провести опыты с активными лекарственными компонентами. Состав таблеточной смеси (1,2 кг), подвергаемой гранулированию был следующий: смесь лиофилизировапных холерогена-анатоксипа V. с!ю1егае 569В серовара Инаба, О-антигена V. с1ю!егае 569В серовара Инаба и О-антигена V. с1ю!егае М-41 серовара Огава, (6 массовых %) и вспомогательные вещества, массовые %: сахароза - 57; крахмал -27; тальк - 1,5; кальция стеарат- 1.0. При проведении исследований за основу брали технологические приемы, использованные для получения серии «плацебо»: раствор кукурузного крахмала нагревапи до точки кипения и охлаждали до комнатной температуры, при этом жидкость до распыления не подвергали перемешиванию магнитной мешалкой. Режим работы технологических улавливающих фильтров - асинхронный с интервалом и периодом встряхивания 10 с и 5 с соответственно; содержание твердых веществ в связующем растворе - 5 %: температура поступающего воздуха - 50 "С; расход воздуха на псевдоожижение - 20 м'/ч. При распылении связующего вещества варьировали скоростью и давлением воздуха (таблица 2). Дополнительно к технологическим характеристикам оценивали таблетируемость и потери смеси при выполнении данного процесса.

Таблица 2 - Значения технологических параметров (п-3)

Номер варианта Значения параметров

Скорость распыления связующего вещества, г/мин Давление воздуха для распыления связующего вещества, бар

1 2 3

1 4,5 3,0

2 4,5 1,0

3 5,5 3,0

4 5,5 1,0

1 2 3

5 6.5 3,0

6 6.5 1.0

7 7.5 3,0

8 7.5 1.0

9 8,5 3,0

10 8,5 1,0

Можно сделать вывод о том, что при увеличении расхода связующего вещества потери таблеточной массы при гранулировании уменьшаются. При этом прослеживается закономерность -при уменьшении количества фракции в виде пыли уменьшаются потери препарата. Однако, даже в лучшем варианте (№ 10) полученные таблетки-ядра обладали малой механической прочностью [в пределах (14±2) Н], что позволяет прогнозировать их разрушение при нанесении кишечно-растворимого покрытия. Таким образом, на данном этапе, нам не удалось добиться таких результатов гранулирования таблеточной смеси холерной вакцины, которые позволили бы снизить потери препарата. Это, на наш взгляд, связано с неудовлетворительным качественным и/или количественным составом вспомогательных веществ вакцинного препарата.

3.3.1.2 Разработка нового состава вспомогательных веществ н экспериментальное обоснование оптимальных технологических параметров проведения влажной граиуляцнн в псевдоожижеином слое

Анализ данных литературы показал широкое применение в технологиях гранулирования таких вспомогательных веществ, как целлюлоза микрокристаллическая и лактозы моногидрат, а в качестве связующего вещества — водных растворов поливинилпирролидона. Мы остановили свой выбор на следующей рецептуре: по 50 массовых % микрокристаллической целлюлозы и лактозы. Использование в качестве связующего 10 % раствора поливинпирролидона (Р1а8(1опе К90). Дополнительным аргументом в выборе данных вспомогательных веществ было то. что целлюлоза микрокристаллическая и поливинилпирролидон описаны в качестве вспомогательных веществ в Государственной Фармакопее, а лактоза зарегистрирована в РФ в качестве активной фармацевтической субстанции. С целью подбора оптимальных технологических режимов процесса гранулирования был реализован полный факторный эксперимент 2'. Неисследуемыми факторами, которые были постоянны во всех вариантах проведения эксперимента, являлись: масса таблеточной смеси - 2,2 кг (из расчета одной загрузки коутера); температура гранулируемой смеси - (25±1) "С. Критерии оптимизации - потери при таблетировании, %. Уровни варьирования факторов были выбраны исходя из технических характеристик оборудования и представлены в таблице 3.

Таблица 3 — Уровни варьирования факторов

Наименование факторов Основной уровень (нулевой) Интервал варьирования Верхний уровень (+) Нижний уровень (-)

X/ — расход связующего вещества, мл/мин 15,0 10,0 25,0 5,0

X'-давление воздуха, подаваемого на форсунку, бар 0,8 0,4 1,2 0,4

X}— расход поступающего воздуха для псевдоожижения, м'/ч 60 30 90 30

В результате обработки данных эксперимента было получено уравнение регрессии, адекватно описывающее процесс (/>„=!,51 </•)„,.„,,=19.16 при вероятности /'=95%).

Г=7,67-0,44*,-1,54Л:-5,05.У( (12)

Необходимо отметить, что в результате обработки данных эксперимента было выявлено, что можно отбросить парные и т.д. взаимодействия. По уравнению видно, что наиболее сильное влияние на процесс гранулирования оказывает фактор Хз (расход поступающего воздуха для псев-доожиження), так как он имеет наибольший по абсолютной величине коэффициент. Далее по степени влияния идут факторы X: (давление воздуха, подаваемого на форсунку) и Л'; (расход связующего вещества). Близкие к оптимуму значения параметров процесса нанесения покрытия были следующими (вариант № 1 эксперимента): расход связующего вещества - 25,0 мл/мин; давление воздуха, подаваемого на форсунку - 1.2 бар; расход поступающего воздуха для псевдоожижепия -90 м3/ч. При этих показателях значение критерия оптимизации составило 1,0 %. Основываясь на представленных данных, было решено не проводить дальнейшую их оптимизацию.

Дополнительно, кроме критерия оптимизации, в ходе реализации полного факторного эксперимента исследовали технологические характеристики гранулятов. Результаты исследований свидетельствовали о том, что потери при таблетировании существенно возрастают в тех вариантах полученных гранул, где наблюдались повышенное содержание «пыли» и крупных фракций с размерами от 1,0 до 2,5 мм. При этом, самые неудовлетворительные результаты получены при минимальном расходе воздуха на псевдоожжижение, равный 30 м'/ч. То же самое можно константиро-вать о насыпной плотности, которая уменьшалась при повышенном содержания более мелких фракций. Кроме того, происходит ухудшение и других характеристик: коэффициентов сжимаемости и Хауснера, текучести и угла естественного откоса. Для варианта эксперимента, в котором наблюдались наилучшие показатели по критерию оптимизации, определили форму и размер гранул (рисунок 8). Показано, что полученные агломераты имеют неправильные геометрическую форму, размеры которых составляют, в основном, от 0,5 до 1,0 мм. При этом присутствуют частицы и меньшего размера. Полученные данные сопоставимы с результатами исследования свойств гранул ситовым методом.

Рисунок 8 - Формы и размеры гранул, полученных в ходе реализации полного факторного эксперимента

Получение таблеток-ядер холерной химической вакцины и исследование их свойств Основным параметром, определяющим свойства таблеток-ядер после их таблетирования является давление прессования. От его правильного выбора зависят такие свойства, как: распадае-мость - эта характеристика является нормируемой в готовой лекарственной форме вакцины), механическая прочность па сжатие таблеток-ядер и их истираемость - от них зависят режимы нанесения покрытия на таблетку, а, в ряде случаев, возможность его нанесения. Таблица 4 — Результаты исследований характеристик таблеток-ядер (п=5)

Давление прессования, кН Распадаемость, мин Механическая прочность на сжатие, Н Истираемость, %

1 2 3 4

5 22,5 30 3,3

8 29,4 54 2,1

10 34,2 70 1,9

1 2 3 4

12 40,1 82 1,7

15 62,4 115 1.5

20 73,8 130 0,9

25 88,1 150 0,1

По данным таблицы 4 можно сделать следующие выводы: при давлениях прессования, равных и превышающих 15 кН, таблетки-ядра не проходят тест на «распадаемость». Таблетирование при 5 кН приводит к повышенной истираемости (требования Государственной Фармакопеи - не более 3 %). Оптимальным диапазоном давления прессования является от 8 до 12 кН.

3.3.2 Выбор оптимальных технологических режимов напссения пленочного покрытия

При проведении исследований по выбору оптимальных технологических режимов нанесения пленочного покрытия Acryl-EZE были проведены эксперименты по выбору скорости вращения барабана коутера. Выявлено, что при числе оборотов барабана (7±1) об/мин через 70 мин, (11±1) об/мин — через 45 мин, (15±1) об/мин — через 30 мин наблюдаются повреждения ядер таблеток (сколы, расслоение). Таким образом, установлены максимальные временные интервалы, за которые на ядра таблеток необходимо нанести первоначальный слой покрытия, препятствующий их разрушению.

Необходимым этапом исследований было определение режимов работы коутера. при котором температура таблеточной массы не превышает 37 "С и не опускается ниже 30 "С. Данного температурного интервала удалось достичь при расходе и температуре воздуха подаваемого на сушку - от 55 до 60 м'/ч и от 40 до 45 °С соответственно.

Далее определяли оптимальную концентрацию сухих веществ в водном растворе Acryl-EZE. Исследовали возможность нанесения покрытия на таблетки 5. 10. 15, 20 и 25 % раствора при следующих режимах работы ко}тера: расход подаваемого раствора — 8,0 мл/мин; давление сжатого воздуха, подаваемого на форсунку для атомизацни —1.4 бар; число оборотов барабана - (11±1) об/мин; давление воздуха, подаваемого на форсунку — 1.2 бар; масса таблеток — 2.0 кг; расход воздуха. подаваемого в коутер - от 55 до 60 м'/ч; температура воздуха, подаваемого в коугер - от 40 до 45 °С. Покрытие наносили до увеличения массы таблеток равной 2 %.

При использовании различных концентраций Acryl-EZE процесс покрытия протекал адекватно. При работе с 25 % раствором было обнаружено, что внутри барабана не создавался аэрозоль. Это не позволяло наносить покрытие иа таблетки. Оптимальное время было определено при работе с 20 % раствором.

Следующим этапом исследований было определение необходимого количества Acryl-EZE нанесенного на таблетки, при котором обеспечивается успешное испытание таблетки по тесту «растворимость». Испытания подвергали таблетки с нанесенным покрытием до 2. 4, 6. 8 и 10 % увеличения массы таблеток. Таблетки с 2 %. 4 % и 6 % покрытия не прошли испытания. Что касается 8 % и 10 % покрытия то они не имели видимых повреждений через 220 мин теста (время наблюдения). Таким образом, целесообразно нанесение покрытия Acryl-EZE до 8 % увеличения массы таблеток.

С целью подбора оптимальных технологических режимов нанесения пленочного покрытия на таблетки был реализован полный факторный эксперимент. Неисследуемыми факторами, которые были постоянны во всех вариантах эксперимента, являлись: давление сжатого воздуха, подаваемого на форсунку для атомизации —1,4 бар; число оборотов барабана — (11±1) об/мин; содержание сухих веществ в водном растворе Acryl-EZE (использовался 20 % раствор). В качестве критерия оптимизации было принято увеличение массы таблеток, при этом раствор пленочного

покрытия наносился до максимального теоретического увеличения массы таблеток, равного 8 %. Уровни варьирования факторов были выбраны исходя из технических характеристик оборудования и представлены в таблице 5. Таблица 5 - Уровни варьирования факторов

Наименование факторов Основной уровень(нулевой) Интервал варьирования Верхний уровень (+) Нижний уровень (-)

X1 — расход подаваемого раствора, мл/мин 8,0 0,3 8,3 7,7

X: — давление воздуха, подаваемого на форсунку, бар 1,2 0,2 1,4 1,0

Х< - масса таблеток, г 2000 200 2200 1800

Ха — расход воздуха, подаваемого в коутер. м'/ч 60 10 70 50

В результате обработки данных эксперимента было получено уравнение рсгрессии, адекватно описывающее процесс (/>ас=3,36<^„то,,= 19)4 при вероятности Р=95%).

>'=6,94+0,54Л-0,29Х:-0, ЫХ4 (13)

Необходимо отметить, что в результате обработки данных эксперимента было выявлено, что можно отбросить парные и т.д. взаимодействия. Кроме того, фактор Хз (масса таблеток) в выбранных интервалах варьирования не является значимым. По уравнению видно, что наиболее сильное влияние на процесс гранулирования оказывает фактор Л'; (расход подаваемого раствора), так как он имеет наибольший по абсолютной величине коэффициент. Далее по степени влияния идут факторы X: (давление воздуха, подаваемого на форсунку) и Л!» (расход воздуха, подаваемого в коутер).

Близкие к оптимуму значения параметров процесса нанесения покрытия были следующие (вариант № 11 эксперимента): давление сжатого воздуха, подаваемого па форсунку для распыления - 1,0 бар; расход подаваемого раствора .\cryl-EZH - (8,3±0,1) мл/мин; расход воздуха, подаваемого в коутер — от 50 до 55 м'/ч. При них значение критерия оптимизации составило 7,9 %. Основываясь на представленных данных, нами было решено не проводить дальнейшую их оптимизацию.

3.3.3 Характеристики холерной вакцины, полученной но разработанным технологическим решениям

По предложенным технологическим решениям гранулирования компонентов таблеточной смеси холерной вакцины и нанесения покрытия на ее таблетку была приготовлена экспериментально-производственная серия, оценены ее характеристики по требованиям нормативной документации (таблица 6).

Таблица 6 - Спецификациоипые характеристики вакцины

Наименование показателя Требования ФСП Р N001465/01-220708 Значение показателя

1 2 3

Описание Таблетка - серовато-желтая компактная масса, покрытая светлой блестящей кислотоустойчивой оболочкой Таблетка — ссровато-жслтая компактная масса, покрытая желтой кислотоустойчивой оболочкой

Средняя масса таблетки от 0.285 г до 0.315 г 0,330

1 2 3

Распадаемость Оболочка таблетки вакцины должна быть устойчива к действию децимо-лярного раствора соляной кислоты в течение 3 ч и распадаться в децимо-лярном растворе натрия гидроксида в течение 1 ч при температуре (37+1) °С Устойчива к действию децимолярно-го раствора соляной кислоты в течение 3 ч и распадается в децимоляр-ном растворе натрия гидроксида в течение 35 мин при температуре (37±1)°С

рН растворенного препарата от 6.7 до 7.4 6,1

Специфическая активность: антигенная активность по анатоксино-связывашно; содержание О-антигена; иммуногенность Должна содержать (100 000+20 000) единиц связывания анатоксина не менее 2000 ус. ед. О-антигена штаммов V. скокгае 01 ЕД?о должна быть не более 1/20000 части таблетки 80000 12288 1/58978 (сер. Огава) 1/26618 (сер. Инаба)

Данные таблицы 6 свидетельствуют о соответствии изученных показателей требованиям фармакопейной статьи предприятия, за исключением: внешнего вида и средней массы таблетки; рН растворенного препарата.

Изменение внешнего вида оболочки таблетки объясняется применением нового кишечно-растворимого покрытия, в состав которого входит краситель - оксид железа желтый. Увеличение массы таблетки происходит за счет того, что применяется новое покрытие, при этом раствор пленочного покрытия Лсгу1-Е7Е наносится до максимального увеличения массы таблеток, равного 8 % (см. подраздел 3.2.2.2). Снижение рН происходит вследствие низкого уровня данного показателя вспомогательных веществ: целлюлозы микрокристаллической, лактозы моногидрата и Р1а5<1опе К-90 (рН по данным Европейской Фармакопеи - от 5,0 до 7,5; от 3,0 до 7,0 и от 4,0 до 7,0 соответственно). У взятых для проведения исследований названных вспомогательных веществ данный показатель составлял 6,1; 5.5 и 4.2 соответственно.

Вышеизложенное позволяет рекомендовать внесение в фармакопейную статью предприятия следующих изменений: таблетка - серовато-желтая компактная масса, покрытая желтой кислотоустойчивой оболочкой; средняя масса таблетки — от 0,285 до 0,340 г; рН растворенного препарата - от 5.0 до 7.4.

Таким образом, применение предложенных технологических решений гранулирования компонентов таблеточной смеси холерной вакцины и нанесения покрытия на ее таблетку не оказывает отрицательного влияния на основные спецификационные свойства вакцины, что позволяет рекомендовать их для внедрения в производственный процесс.

4 ВЫВОДЫ

1. Разработаны математические модели, адекватно описывающие кинетику накопления протективпых антигенов холерных вибрионов. Проведенные исследования позволили реализовать найденные профили введения глюкозы в технологическом процессе культивирования V. скокгае М-41 серовара Огава и V. скокгае 569В серовара Инаба.

2. Установлено, что лиофилизаты холерогена-анатоксина штамма V. скокгае 569В серовара Инаба, О-антигена штаммов V. скокгае 569В серовара Инаба и V. скокгае М-41 серовара Огава

являются аморфными субстанциями со значительным разбросом значений по фракционному составу, при этом от 30 до 35 % находится в виде пыли. Это обуславливает неудовлетворительные для получения таблеток значения таких технологических характеристик, как сыпучесть, насыпная плотность, угол естественного откоса, коэффициенты сжимаемости и Хауснера.

3. Обосновано качественное и количественное содержание вспомогательных веществ для гранулирования таблеточной смеси следующего состава: смесь лпофнлизированных холерогена-анатоксина V. cholerae 569В серовара Инаба, О-антигена V. cholerae 569В серовара Инаба и О-антнгена V. cholerae М-41 серовара Огава, (от 6 до 19 массовых %) и вспомогательные вещества, массовые %: лактозы моногидрат - от 44,3 до 36,3; целлюлоза микрокристаллическая - от 44,3 до 36,3. В качестве связующего - 10 % водный раствор поливинплпирролндона до конечной концентрации - от 0,4 до 0,8 массовых %.

4. Определены оптимальные технологические параметры проведения этапа влажной грануляции компонентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной в псевдоожп-женном слое: расход связующего вещества - 25,0 мл/мин; давление воздуха, подаваемого на форсунку - 1,2 бар; расход поступающего воздуха для псевдоожнжения - 90 м3/ч; масса таблеточной смеси - 2,2 кг; температура гранулируемой смеси - (25±1) °С.

5. Выбран оптимальный технологический режим нанесения пленочного покрытия Acryl-EZE на таблетку вакцины: давление сжатого воздуха, подаваемого на форсунку для распыления и атомизацин, - 1,0 и 1,4 бар соответственно; расход подаваемого раствора Acryl-EZE - (8,3±0,1) мл/мин; число оборотов барабана - (11±1) об/мин; расход и температура воздуха, подаваемого на сушку, - от 50 до 55 м3/ч н от 40 до 45 "С соответственно.

6. Показано, что применение экспериментально обоснованных технологических решений гранулирования компонентов таблеточной смеси холерной вакцины с новым составом вспомогательных веществ н нанесения покрытия на ее таблетку не оказывает отрицательного влияния на основные спецификационные свойства вакцины, что позволяет рекомендовать пх для внедрения в производственный процесс.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие документы:

изменение № 2 (проект) в фармакопейную статью предприятия ФСП Р N001465/01В220708 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кпшечнорастворнмой оболочкой»;

изменение № 2 (проект) а промышленный регламент № ПРО 1898109-39-12 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кпшечнорастворнмой оболочкой».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список научных публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования н науки РФ

1. Комиссаров, A.B. Математическая модель кинетики накопления О-антигена в ходе периодического глубинного культивирования Vibrio cholerae М-41 Огава с лимитацией по углеродному субстрату [Текст] / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, С.Н. Задохнн, С.А. Еремин, O.A. Волох, 10.А. Алешина // Проблемы особо опасных ннф. - 2013. - Вып. 1. - С. 91-93.

2. Комиссаров, A.B. Экспериментальное обоснование внедрения пленочного покрытия на водной основе для готовой лекарственной формы холерной химической вакцины [Электронный ресурс] / A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, С.Н. Задохнн, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, 10.Г. Васин, ОД. Клокова, Л.Ф. Ливанова, А.К. Никифоров // Современные проблемы науки и

образования. - 2013. - № 6 (Электронный журнал). Режим доступа: http://w\vw.science-education.ru/] 13-11114.

3. Комиссаров, Л.В. Математическая модель кинетики накопления антигенов в ходе периодического глубинного культивирования Vibrio cholerae 569В Инаба с лимитацией по углеродному субстрату [Текст] / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, С.Н. Задохин, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.А. Алешина // Проблемы особо опасных инф. - 2014. - Вып. 3. - С. 96-99.

4. Комиссаров, A.B. Гранулирование компонентов холерной химической вакцины [Электронный ресурс] / A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, С.Н. Задохнн, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, Ю.Г. Васин, О Д. Клокова, Л.Ф. Ливанова, А.К. Никифоров // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 3 (Электронный журнал). Режим доступа: httn://www.science-education.ru/l 17-13326.

Свидетельства о государственной регистрации программы для ЭВМ

1. Комиссаров, A.B. Программа для расчета концентрации и скорости роста микроорганизмов и продуктов их биосинтеза в зависимости от концентрации субстрата [Текст] / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, С.Н. Задохнн, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.А. Алешина // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2012614773. Публ.

20.09.2012. Бюл. №3(80).

2. Комиссаров, A.B. Программа для расчета кинетики выделения двух продуктов биосинтеза, образующихся в процессе глубинного культивирования микроорганизмов [Текст] / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, C.I1. Задохнн, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.А. Алешина // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2013617558. Публ.

20.09.2013. Бюл.ХаЗ.

Список научных публикации в других изданиях

1. Комиссаров, A.B. Использование нового пленочного покрытия для холерной химической вакцины [Текст] / A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, С.Н. Задохин, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, Ю.Г. Васин, О.Д. Клокова, Л.Ф. Ливанова, А.К. Никифоров // Актуальная биотехнология. - 2013. -№ 1.-С. 15-18.

2. Комиссаров, A.B. Математическая модель синтеза О-антпгепа в ходе периодического глубинного культивирования Vibrio cholerae М-41 Огава с лимитацией по углеродному субстрату [Текст] / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, С.Н. Задохнн, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.А. Алешина // Сборник трудов международной Интернет-конференции «Математическое и компьютерное моделирование в биологии н химии. Перспективы развития». — Казань. — 2012. — С. 97-98.

3. Комиссаров, A.B. Программа для расчета концентрации и скорости роста микроорганизмов и продуктов их биосннтеза в зависимости от концентрации субстрата / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, С.Н. Задохнн, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.А. Алешина // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реферат, сб. - Саратов. - 2012. - С. 37.

4. Комиссаров, A.B. Моделирование процессов производства вакцины холерной бивалентной химической таблетнрованной / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, С.А. Еремин, О.В. Громова, Ю.А. Алешина, Ю.Г. Васин, O.A. Волох, B.C. Бронникова, O.A. Лобовикова, С.Н. Задохнн, Л.Ф. Ливанова, A.B. Гаева // Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы». - Саратов. - 2013. - С. 63-65.

5. Комиссаров, A.B. Изучение возможности применения новых пленочных покрытий для готовой лекарственной формы холерной бивалентной химической вакцины / A.B. Комиссаров,

A.K. Никифоров, O.A. Еремин, C.II. Задохни, ОД. Клокова, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова // Материалы II международной научной Интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее». - Казань. - 2013. - С. 156.

6. Комиссаров, A.B. Математическая модель кинетики накопления антигенов в ходе периодического глубинного культивирования Vibrio cholerae 569В Инаба с лимитацией по углеродному субстрату / A.B. Комиссаров, А.К. Никифоров, С.Н. Задохнн, С.А. Еремин, O.A. Волох, Ю.А. Алешина // Материалы II международной научной Интернег-конференцни «Биотехнология. Взгляд в будущее». - Казань. - 2013. - С. 157-158.

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ИФА — нммуноферментный анализ;

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты;

ООИ — особо опасные инфекции;

РИД - реакция иммунной диффузии;

ФСП — фармакопейная статья предприятия;

ус. ед. — условные единицы;

ЕДзо — доза вакцины, защищающая 50% животных от гибели при заражении вирулентным штаммом.

Подписано в печать 16.06.2015г. Усл.п.л. - 1.5 Заказ № 28042 Тираж: 100 экз. Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru