Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка микробиологической питательной среды из утильного мясного сырья

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка микробиологической питательной среды из утильного мясного сырья"

На правах рукописи

У03447387

Калягина Светлана Юрьевна

Разработка микробиологической питательной среды из утильного мясного сырья

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 2 О КТ 2008

Москва-2008

003447387

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва и на Опытном заводе биопрепаратов «Нихол» Республиканского Онкологического Центра МЗ Республики Узбекистан, г. Ташкент

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Блинкова Лариса Петровна кандидат биологических наук Икрамов Адыл Абидович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Афанасьев Станислав Степанович

доктор биологических наук Мельникова Валентина Андреевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится иЬ2008 г. в 12 часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан « {9 » ЩЩ1Лб^-Е. 2008г.

Учёный секретарь диссертационного г'"»*-"

кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Традиционным сырьем для приготовления микробиологических питательных сред являются мясо, печень, рыба и другие пищевые продукты с высоким содержанием белка (Меджидов М.М., 2003, Лабинская A.C. и др., 2004). В некоторых случаях при получении биотехнологической продукции, связанной с культивированием микроорганизмов, необходимы среды на низкобелковой основе. В связи с этим исследователями проводится активный поиск непищевых, экономичных видов сырья для производства питательных сред. В качестве сырья, имеющего более низкую белковую ценность, предложены гидролизаты крови животных и кровезаменители с истекшим сроком годности (Раскин Б.М., Денисова C.B., 1992, Ковтун Ю.Н., 1992, Мельникова В.А. и др., 2003, Грубер И.М. и др., 2006), кормовые дрожжи, виноградная мука (Меджидов М.М, 1987), отходы пушного звероводства, микроводоросли (Блинкова Л.П. и др., 1994,1998)и др.

На наш взгляд, для создания питательных сред целесообразно использование утильного мясного сырья - отходов скотобоен (толстый кишечник крупного рогатого скота и др.). Поскольку вновь разрабатываемые питательные среды представляют интерес для выращивания микроорганизмов разных таксономических групп, в качестве тест-объектов при изучении свойств создаваемой питательной среды выбраны широко распространенные представители энтеробактерий, стафилококков, дрожжевых грибов, а также один токсигенный и два не-токсигенных штамма дифтерийных бактерий. Следует отметить, что последние принадлежат к «требовательным» микроорганизмам, нуждающимся в полноценных белковых субстратах и факторах роста (среда Лингуда, бульон Мартена, среды с кровью, сывороткой) (Фаво-рова Л.А. и др., 1988, Костюкова H.H., 1997) и др. Поэтому для более полной оценки новой питательной среды целесообразно было провести выращивание на ней такого прихотливого микроба, как Corynebac-trium diphtheriae, с последующим изучением специфичности антигенного препарата, полученного из его биомассы.

Ранее эксперименты по выделению антигенов методом гидро-ксиламиновой экстракциии после культивирования на питательных средах из другого вида утильного мясного сырья (кишечник кроликов, использованных в сывороточном производстве) проводили со штаммами семейств Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Staphylococcaceae

(Икрамов А.А, 1988, Садритдинова Д.Б., 1995). Авторами показано, что подобные среды с невысоким количеством белка более пригодны для глубинного выращивания бактерий и получения протективных антигенов с помощью гидроксиламина из биомассы испытанных штаммов, чем высокобелковые. На основе выделенных антигенов были созданы диагностические и вакцинные препараты.

Таким образом, разработка и испытание среды из утильного мясного сырья для культивирования как прихотливых, так и неприхотливых микроорганизмов, является актуальной задачей.

Цель работы - разработка микробиологической питательной среды из утильного мясного сырья и изучение ее физико-химических и биологических свойств.

Задачи исследования:

1. Установить оптимальные условия аутолиза сырья и составить схему приготовления питательной среды на основе утильного мясного сырья.

2. Определить физико-химические характеристики экспериментальной среды и изучить влияние выбранного варианта среды на морфологические, тинкториальные, физиолого-биохимические свойства тест-культур разных таксономических групп.

3. Изучить возможность использования новой питательной среды при периодическом культивировании прихотливого штамма С.сИрЫкепае 279

4. Выделить с помощью гидроксиламина из биомассы С.сИрЫкепае 279 (ох+, полученной при периодическом культивировании на экспериментальной среде, антигенный препарат и изучить его физико-химические и биологические свойства.

Научная новизна

Впервые использовано утильное мясное сырье (толстый кишечник крупного рогатого скота) для приготовления питательной среды со сниженным содержанием азотистых веществ для культивирования штаммов различных таксономических групп. Новая питательная среда охарактеризована по основным физико-химическим и биологическим показателям, рекомендованным для питательных сред.

Показана возможность выращивания «требовательных» штаммов дифтерийных бактерий в разработанной жидкой среде со сниженным содержанием азотистых веществ.

Впервые с помощью гидроксиламина гидрохлорида получен антигенный препарат из токсигенного штамма С.сИрЫкепае, выращенного на созданной среде, и изучены его физико-химические и биологические свойства.

Практическая значимость

Микробиологическая питательная среда на предлагаемой основе со сниженным количеством азотистых веществ может быть использована для культивирования бактерий различных таксономических групп.

Созданная питательная среда из утильного мясного сырья внедрена в производство на Опытном заводе биопрепаратов «Ни-хол» при Республиканском Онкологическом Научном Центре (г. Ташкент) в отделе микробиологии и в отделе бактериальных препаратов (Акт внедрения, приказ №01/1-60 от 20.03.2003), а также в бактериологической лаборатории ОАО «Узбиофарм» при ТашНИ-ИВС (Акт внедрения, приказ №.27 от 15.01.2008) для выращивания энтеробактерий, стафилококков и дифтерийных бактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная основа может быть использована для приготовления питательной среды из утильного мясного сырья.

2. Созданная питательная среда пригодна для выращивания микроорганизмов разных таксономических групп (энтеробактерии, стафилококки, дифтерийные бактерии, дрожжевые грибы).

3. Препарат, впервые выделенный с помощью метода гидроксилами-новой экстракции из токсигенного штамма С. сИрЫкепае после периодического культивирования на созданной среде, имеет липидно-полисахаридный состав с примесью белка, и обладает выраженной антигенностью.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 175 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками.

Апробация материалов диссертации. Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИ-ИВС им. И.И. Мечникова РАМН 19 мая 2008 г. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Химическое загрязнение среды обитания», (5-6 февраля 2003 г., г. Пенза), на заседании Научного Совета 03 «Нихол» биопрепаратов РОНЦ МЗ РУ (27.07.2004 г.), представлены на Четвертом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (29-31 марта 2006г., г.Москва), на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология-2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», (21-22 ноября 2006г., г. Москва), на Пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (28-30 марта 2007 г., г. Москва), на Международном конгрессе «Пробиотики, пре-биотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», 15-16 мая 2007 г., г. Санкт-Петербург).

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Бактериальные штаммы. Для испытания биологических свойств экспериментальной среды использованы штаммы Salmonella enterica Typhi Ту2 4446; S. enterica Typhimurium 79; S. enterica Paratyphi A 22; S. enterica Paratyphi В 8006; S. enterica Enteritidis DP, Shigella flexneri 2a 1605, S. sonnei "S-form"; S. dysenteriae 1 1362; E. coli 168/59 (0111:K59); Proteus vulgaris HX 463; Staphylococcus aureus Wood 46, S. aureus 6538-P, Serratia marcescens I; Candida albicans K-l, а также 3 штамма С. diphtheriae: 279 tox+ биовара gravis, применяемый в Республике Узбекистан в качестве эталонного токсигенного штамма и нетоксигенные штаммы С. diphtheriae 1499 и С. diphtheriae migravis.

Утильное мясное сырье. Сырье отбирали сразу после убоя крупного рогатого скота (КРС) на скотобойне. В качестве сырья были изучены нижний отдел тонкого кишечника - субстрат №1, отдел толстого кишечника - субстрат №2 и легкие -субстрат №3.

Микробиологические методы. Тест-штаммы микроорганизмов находились в лиофилизированном состоянии или на среде хранения (0,3% агар, под вазелиновым маслом). Тест-культуры из ампул или со среды хранения пересевали в МПБ и на МПА. При выращивании штаммов дифтерийного микроба использовали среды как с добавлением 5-10 % лошадиной сыворотки, так и без нее (при культивировании в ферментере). После хранения, а также после пассирования микроорганизмы контролировали на стабильность морфологических, тинкториальных и физиолого-биохимических свойств. Контроль тест-штаммов на спонтанную агглютинацию проводили с 2 млрд. микробной взвесью после 1 ч кипячения.

Культивирование бактерий проводили в течение 22±2 ч при 36±1°С (или при 20±2°С) на жидкой и плотной экспериментальной среде (ЭС), а также на мясопептонных средах (МПА, МПБ), использованных как среды сравнения. Питательные среды контролировали на стерильность, чувствительность, показатель прорастания (отношение числа колониеобразующих единиц (КОЕ), в опыте к числу КОЕ в контроле), эффективность по величине оптической плотности, скорость роста (срок появления видимого роста, час). Опыты осуществляли не менее, чем 4-хкратно, в соответствии с «Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям», (М., 1980) и МУК 4.1/4.2.588-96. Для изучения морфологии клеток тест-штаммов применяли методы окрашивания мазков по Граму и по Нейссеру; для определения числа жизнеспособных клеток - метод изучения нуклеоидов в мазках по способу НС1-Гимза («Методические рекомендации по определению числа жизнеспособных клеток», М., 1977).

Периодическое культивирование дифтерийных бактерий проводили в реакторе марки «ЬКВ-ВБ-С8 2» (Германия) объемом 2 л со средой на основе субстрата №2, с выбранными параметрами перемешивания и аэрации, при 36±1°С, в 3-х повторностях.

Биохимические методы. Физико-химический состав трех вариантов ЭС и мясопептонной среды изучали согласно МУК 4.1/4.2.58896 при участии сотрудников кафедры биохимии биологического факультета ТашГУ. Прозрачность и цветность определяли на фотоэлек-троколориметре ФЭК 56М при длинах волн 540 и 400 нм, общий азот - по методу Кьельдаля на автоматическом анализаторе фирмы «Тека-тор» (Швеция); аминный азот - формольным титрованием; углеводы -антроновым методом; pH - потенциометрически; пептидный состав -методом гельфильтрации на сефадексе G - 10, 15, 25; содержание свободных аминокислот - на аминокислотном анализаторе АА - 881; прочность агаровых сред - по Валенту; массу сухого остатка - после высушивания; хлориды - по методу Рушняка, редуцирующие вещества - по методу Граббе. Наличие железа, кальция, магния, меди и других микроэлементов изучали методом масс-спектрального анализа на кафедре неорганической химии химического факультета ТашГУ. Дифтерийный антигенный препарат (АП) получали после инактивации биомассы С. diphtheriae 279 tox+ 0,5% гидроксиламином гидрохлоридом (ГТ) методом выделения антигенов по Синяшину Н.И. (1970) в модификации Икрамова А.А (1988) с последующим определением остаточного ГГ (МУК 4.1/4.2.588-96). Образцы лиофильно высушенного АП исследовали по физико-химическим показателям на базе химической лаборатории ООО «Узбиофарм» в ТашНИИВС при участии к.х.н. Проскуриной Т.В. и к.б.н. Икрамова A.A. Исследования АП проводили на приборах: рН-метр-кондуктометр «Seven Multi» фирмы Metler (Швейцария) для определения pH 0,1% раствора; прибор для определения точки плавления «Schmelzpunkt Bestimmer» (Германия); определитель влажности «HG53 Halogen Moisture Analayzer» (Швейцария); поляриметр для определения угла вращения Сахаров «A.Krüss OptroniK» (Германия); рефрактометр для определения коэффициента преломления «ABBE» Krüss. (Германия); рентгено-структурньш анализатор «СЕ 3021» QuadroLab. (Германия) для определения молекулярной массы; спектрофотометр «Specord 50» Analiti-cal Jena, (Германия) для определения оптической плотности 0,01% водного раствора АП в диапазоне 280 нм - 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Количество белка определяли по методу Лоури. Хроматографию раствора АП (1 мг/мл) проводили на жидкостном хроматографе «Agilent 1100» с УФ-детектором. Анализ хроматограммы проведен с использованием программы НРСНЕМ LC20-2002, библиотека LC Library Ver. 0756-2003 (пр-во США, Италия, Япония).

Иммунохимические и иммунобиологические методы. Свойство токсигенности штамма С. diphtheriae 279 tox+ контролировали методом иммунопреципитации в агаре с дисками, пропитанными дифтерийным антитоксином на среде ОТДМ (МУ 42. 698. 98).

Определение среднетоксической дозы АП проводили на беспородных белых мышах массой 14-16 г путем внутрибрюшинного введения в объеме 0,5 мл 5; 2,5; 1,25; 0,625; и 0,312 мг АП, растворенного в стерильном физиологическом растворе, по 11 мышей на дозу. В качестве контроля использовали 11 мышей, которым вводили физиологический раствор. Учет результатов проводили в течение 7 дней. Величину LDso рассчитывали по формуле Рида и Менча. В опыте использовано 66 животных.

Способность вызывать образование антител у АП изучали на 4-х группах кроликов (по 5 особей в каждой) весом 2,5-3 кг при 4-хкратном внутривенном введении возрастающих доз АП с интервалом 7 дней. Первой группе вводили дозы 5-20-50-80 мг, второй - 10-30-75120 мг, третьей - 15-40-100-160 мг, четвертой группе - 20—50—125— 200 мг. Контрольная группа состояла из кроликов, которым вводили физиологический раствор. Взятие крови для определения титра антител осуществляли перед каждой иммунизацией и через 7 дней после последней иммунизации. В эксперименте использовано 45 кроликов. Опыты проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», М.,1977.

Специфическую активность экспериментальной сыворотки изучали в реакции кольцепреципитации (РКП) с АП, а также с аналогичными АП из двух нетоксигенных штаммов (АП-1 и АП-2). Испытуемую сыворотку разводили, начиная с титра 1:4 до 1:2420. АП в физиологическом растворе наслаивали в концентрации 0,1мг/мл. Результат учитывали по «четырехплюсовой» системе через 20-30 мин после инкубации при 36±1°С.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрических критериев (X, a, t - критерий Стьюдента), а также программы Microsoft Excel.

Результаты исследований и обсуждение

Приготовление вариантов экспериментальной питательной среды из утильного мясного сырья и изучение их физико-химических свойств. Субстраты №№1,2,3 гомогенизировали и под-

вергали вначале солянокислому гидролизу (Ш НС1) в течение 16-18 ч при рН 3,2±0,2 и 1° 4±2°С, затем - аутолизу в течение 1-4 ч при рН 8,2±0,2 и 1° 42±2°С.

В образцах, полученных из субстратов с различной экспозицией аутолиза (1-4 ч) и коррекцией рН до 8,2±0,1 в течение всего процесса, определяли содержание общего и аминного азота (рис. 1).

4

1 2 Время,ч 3 4

Рис. 1. Динамика показателей общего (три верхние линии) и аминного азота в процессе аутолиза различных субстратов

-*-Суб.№1

-Суб.№2

—х—Суб.№3

Как видно го данных, представленных на рис.1, количество общего и аминного азота в образцах повышалось в течение 3 часов аутолиза субстратов; в течение 4-го часа показатели рН, общего и аминного азота менялись незначительно. Наименьшее содержание общего и аминного азота отмечено в образце, приготовленном из легких (общий азот - 2,2 %; аминный азот - 0,65%), а наибольшее - в среде из толстого кишечника (общий азот -3,4 %; аминный азот - 1,05%). Таким образом, оптимальной была 3-хчасовая экспозиция аутолиза.

После прохождения аутолиза, осаждения балластных веществ 4М раствором А1С1з, корректировки рН до 7,2±0,1 и стерилизации получали готовую жидкую питательную среду. Физико-химические характеристики вариантов ЭС из субстратов №№1, 2, 3 в сравнении с контролем приведены в табл. 1-3.

Таблица 1

Физико-химические показатели жидких и агаризованных вариан-

Показатели Варианты ЭС МПБ (контроль) Достоверность различий с контролем,р

№1 №2 №3

Прозрачность 0,006 ±0,002 0,008 ±0,002 0,005 ±0,001 0,048 ±0,002 <0,05

Цветность 0,021 ±0,003 0,030*0,005 0,024±0,003 0,065 ±0,010 <0,05

рН 7,1 ±0,1 7,2±0,1 7,1 ±0,1 7,2 ±0,1 >0,05

Масса сухого осгаюа, 1Ул 2,5±0,15 3,2£0Д) 2Д±0,25 4,8 ±0,35 <0,05

Прочность агаровой среды, г 370±10 380±15 375 ±15 370±25 >0,05

Как видно из данных, представленных в табл. 1, показатели прозрачности, цветности и масса сухого остатка вариантов ЭС среды были ниже, чем для контрольной среды (р<0,05). Величина рН и прочность у испытуемых агаровых сред были примерно одинаковыми (р>0,05).

По количеству общего и аминного азота, а также свободных аминокислот и углеводов варианты ЭС оказались менее насыщены, чем МПБ (табл. 2).

Таблица 2

Биохимические характеристики ЭС и МПБ, (Х±ш)

Показатели, % Варианты ЭС МПБ (контроль) Достоверность различий с контролем, ри.з

№1 №2 №3

Общий азот 2,5±0,06 3,1±0,075 2,0±0,14 4,55±0,1 <0,05

Аминный азот 0,70±0,075 1,05±0,06 0,60±0,15 1,50±0,07 <0,05

Углеводы 1,0±0,06 1,20±0,07 0,95±0,10 1,65±0,06 <0,05

Свободные аминокислоты 2,6±0Д5 3,7±0,1 2,5±0,2 4,9±0,15 <0,05

Хлориды 5,8±0,2 5,90±0,2 5,15±0,17 6,10±0,11 Ри>0,05 Рз<0,05

Пептиды, (Да): I фрак. (150-240) II фрак. (250-540) III фрак.(550-1100 0,03±0,005 0,06±0,0015 0,18±0,001 0,045±0,001 0,08±0,0015 0,22±0,0025 0,035±0,005 0,11±0,0025 0,12±0,001 0,09±0,0025 0,17±0,002 0,42±0,0025 <0,05 <0,05, <0,05

Редуцирующие вещества 0,8±0,017 1,1 ±0,025 0,б±0,027 2,65±0,035 <0,05

Изучение пептидного состава ЭС показало, что в них имеются пептиды с различной молекулярной массой (от 150-240 Да до 5501100 Да). Содержание пептидных фракций в МПБ было достоверно выше, чем в вариантах ЭС. Количество редуцирующих веществ в МПБ также превысило соответствующие значения в ЭС (р<0,05). Уровень хлоридов в вариантах ЭС №1 и №2 и МПБ не имел статистических различий, в то время как в варианте ЭС №3 содержание хлоридов было ниже, чем в МПБ (р<0,05). По количеству микроэлементов варианты ЭС и контрольная среда не имели достоверных различий (р>0,05) (табл. 3).

Таблица 3

Содержание микроэлементов в вариантах ЭС и МПБ;(Х£)Т1}

Микроэлементы, % зольного остатка Варианты ЭС МПБ (контроль) Достоверность различий с контролем, р

№1 №2 №3

Кремний 0,89±0,09 0,90±0,09 0,89±0,09 0,95±0,09 >0,05

Кальций 0,50±0,05 0,50±0,05 0,46±0,05 0,49±0,05 >0,05

Натрий 0,40±0,04 0,42±0,05 0,42±0,04 0,44±0,04 >0,05

Железо 0,0055±0,0006 0,0050±0,0005 0,0046±0,0005 0,0058±0,0006 >0,05

Магний 0,50±0,05 0,45±0,05 0,45±0,05 0,50±0,05 >0,05

Медь 0,0004±0,00004 0,0005±0,00005 0,0005±0,00005 0,0006*0,00005 >0,05

Марганец 0,00015±0,00002 0,00016±0,00003 0,00012±0,00002 0,00018±0,00003 >0,05

Для дальнейших экспериментов применяли вариант ЭС №2, который оказался, в основном, более насыщенным по питательным веществам.

Сравнительное изучение ростовых свойств экспериментальной и контрольной питательных сред. После контроля сред на стерильность проводили изучение их ростовых свойств. Рост штаммов семейства Enterobacteriaceae и S. aureus в жидких средах (ЭС и МПБ) был диффузным, характерным для данных культур. При культивировании в этих средах с 5% лошадиной сыворотки, штаммы С. diphtheriae росли в виде пленки и зернистого осадка, что характерно для биовара gravis. Выявлено, что все изученные тест-штаммы имели чувствительность 10"7 как для жидких, так и для плотных сред. Однако для тест-штаммов S. sonnei, S. dysenteriae, P. vulgaris отмечен более низкий уровень чувствительности на жидкой ЭС и МПБ (10"6).

Таблица 4

Оценка ростовых свойств агаризованной ЭС и МПА, (Х±т)

Тест-штаммы Количество КОЕ [высев 0,1 мл из 10"6) Показатель про-раста кия Достоверность различий с контролем, р Размер колоний, мм Достоверность различий с контролем, Р

ЭС МПА (контроль) ЭС МПА (контроль]

S. enterica Typhi Ту2 4446 63,2±4,5 65,1±8,5 0,97 >0,05 1,0±0,12 1,5±0,18 >0,05

S. enterica Ту-phimurium 79 61,4±4,2 64,6±5,4 0,95 >0,05 1,2±0,15 1,6±0,25 >0,05

S. enterica Paratyphi A 225 67,3±3,1 66,3±7,1 1,01 >0,05 1,1±0,08 1,5±0,15 >0,05

S. enterica Paratyphi В 8006 52,1±5,9 45,8±8,9 1,13 >0,05 1,2±0,10 1,4±0,14 >0,05

S. enterica En-teritidis D1 58,5±4,6 55,5±7,6 1,05 >0,05 1,2±0,15 1,3±0,20 >0,05

S. sonnei "S-form" 29,5±3,3 38,6±7,2 0,76 >0,05 1,4±0,15 1,9±0,21 >0,05

S. flexneri 2a 1605 54,7±2,4 56,3±5,2 0,97 >0,05 1,5±0,20 1,7±0,30 >0,05

S. dysenteriae 1362 33,2±3,8 38,6±3,7 0,86 >0,05 1,5±0,16 1,5±0,25 >0,05

E. coli 168/59 71,3±3,2 68,3±5,6 1,04 >0,05 1,1±0,15 1,2±0,22 >0,05

P. vulgaris HX 4636 32,5±4,5 39,1±8,5 0,83 >0,05 1,9±0,26 2,5±0,28 >0,05

S. aureus 6538-P 40,3±2,2 44,8±3,1 0,89 >0,05 1,4±0,16 1,6±0,22 >0,05

S. aureus Wood 46 42,3±2,2 45,4±2,2 0,93 >0,05 1,3±0,18 1,5±0,20 >0,05

C. albicans K-l 34,2±2,5 35,9±3,6 0,94 >0,05 1,3±0,1 1,4±0,14 >0,05

*C.diphtheriae 279tox± 65,5±3,5 70,1±5,6 0,93 >0,05 0,70±0,05 1,1±0,12 <0,05

*C.diphtheriae 1499tox- 59,2±4,3 62,4±5,2 0,95 >0,05 0,85±0,05 1,05±0Д5 >0,05

*C.diphtheriae 0801tox- 74,5±4,3 72,3±6,1 1,05 >0,05 0,75±0,1 1,15±0,10 <0,05

*Для штаммов С. сИрЫкепае использовали среды с добавлением 10% лошадиной сыворотки

Как видно из результатов, приведенных в таблице 4, количество КОЕ, выросших из 100 м.к. на агаризованной ЭС и на МПА достоверно не различалось. Размеры колоний штаммов семейства Enterobacteriaceae при выращивании на ЭС оказались несколько меньше, чем на МПА, однако различие было статистически недостоверным. Наиболее высокие показатели прорастания были у S. enterica Paratyphi В 8006, S. enterica Paratyphi А 225, S. enterica Enteritidis Dl, E.coli 168/59, C.diphtheriae 0801tox-. Цвет колоний тест-штаммов эн-теробактерий на ЭС и МПА не имел существенных различий. Пигментация штаммов S. aureus 6538-Р, S. aureus Wood 46 и Serratia marcescens 1, также не отличалась от контроля. Необходимо отметить, что при культивировании на плотной ЭС штаммы семейства Enterobacteriaceae до 90-100% находились в S-форме,. При выращивании на МПА до 70% колоний имели S-форму. Колонии S. aureus 6538-Р и S. aureus Wood 46 как на ЭС, так и на среде сравнения имели округлую форму, были непрозрачными, желтыми, выпуклыми, блестящими. На отсутствие диссоциации и стабильность серологических свойств у тест-штаммов указывала отрицательная реакция спонтанной агглютинации.

В мазках культур энтеробактерий, сделанных с жидкой и плотной ЭС, наблюдали мономорфизм клеток, в то время как культуры, выросшие на МПА (МПБ), характеризовались полиморфизмом - наряду с однотипными встречались мелкие, кокковидные, а также удлиненные клетки.

При культивировании штаммов C.diphtheriae на плотной ЭС с добавлением 10% сыворотки колонии были круглые, светло-серые, с более темным и выпуклым центром и полупрозрачной периферией, а при культивировании на МПА колонии окрашены в светло-бежевый цвет. У большинства колоний C.diphtheriae были исчерченные края, что соответствовало R-форме, свойственной биоварианту gravis. В мазках, сделанных из культур C.diphtheriae со скошенных сывороточных сред и окрашенных по Граму, отмечено типичное для дифтерийных бактерий V-образное расположение клеток. Бактерии имели темно-синюю окраску, размеры 3-4 мкм в длину и 0,3-0,5 мкм в диаметре и были полиморфны. Метахроматические гранулы в мазках суточной культуры С. diphtheriae 279tox+, окрашенных по Нейссеру, встречались: в 86,5±4,2% (ЭС) и в 88,2±7,4 % (МПА) бактерий, р>0,05.

Эффективность плотной среды ЭС и МПА, изученная с помощью показателя оптической плотности, представлена в таблице 5.

Таблица 5

Эффективность агаризованной ЭС в сравнении с МПА (контроль)

Тест-штаммы Оптическая плотность смывов со скошенного агара, (Х±ш) Достоверность различий с контролем,р

ЭС МПА

S. enterica Typhi Ту2 4446 2,8±0,10 3,1 ±0,20 >0,05

S. enterica Typhimurium 79 3,0±0,15 3,2±0,22 >0,05

S. enterica Paratyphi A 225 3,2±0,18 3,3±0,15 >0,05

S. enterica Paratyphi В 8006 3,0±0Д0 3,1±0,20 >0,05

S. enterica Enteritidis D1 3,1±0,16 3,4±0,14 >0,05

S sonnei "S-form" 1,8±0,08 2,2±0,15 >0,05

S.flexneri2a 1605 2,2±0,10 2,3±0,18 >0,05

S. dysenteriae 1362 2,3±0,15 2,6±0,15 >0,05

E. coli 168/59 3,4±0,08 3,5±0,10 >0,05

P. vulgaris HX 4636 2,0±0,12 2,3±0,15 >0,05

S. aureus 6538-P 3,1±0,18 3,3±0,17 >0,05

S. aureus Wood 46 3,5±0,20 3,4±0,16 >0,05

C. albicans K-l 2,4±0,11 2,7±0,15 >0,05

Из данных таблицы 5 видно, что эффективность тест-штаммов не имела значимых различий между ЭС и МПА (р>0,05).

Скорость роста тест-штаммов на ЭС и контрольной средах была примерно одинаковой. Признаки видимого роста быстрее всего (после 14-15 ч) появлялись у штаммов S. enterica Typhi Ту2 4446, E.coli 168/59, S. enterica Typhimurium 79, S. enterica Paratyphi A 225, S. enterica Paratyphi В 8006. Остальные штаммы обнаруживали признаки видимого роста после 16-17 ч.

После 20-кратного пассирования тест-культур энтеробактерий, стафилококка и кандиды на ЭС и МПБ (МПА) проводили испытание их биохимических свойств следующим образом: штаммы засевали со скошенных ЭС и МПА на эти среды с добавлением 0,3% агара, 0,5% дифференциально значимых субстратов и индикатора. Утилизация субстратов на средах оказалась типичной для тест-штаммов. Для штаммов С. diphtheriae ферментация глюкозы, мальтозы, сахарозы, крахмала, гликогена, отсутствие уреазы и наличие цистиназы на соответствующих средах также оказались типичными. Сохранение токси-

генных свойств штамма С. сИрккепае 279 Шх+, пассированного на ЭС и МПА, подтверждено с помощью реакции иммунопрецитации.

Таким образом, при культивировании на ЭС у тест-штаммов подтверждена стабильность морфологических, тинкториальных и фи-зиолого-биохимических свойств клеток.

На основании экспериментальных данных составлена схема получения и контроля питательной среды из утильного мясного сырья -толстого кишечника КРС, включающая последовательные этапы (Э):

Рис. 2. Схема приготовления и контроля питательной среды из толстого кишечника КРС

Периодическое культивирование дифтерийных бактерий и получение из них антигенного препарата с помощью гидроксила-мина гидрохлорида. Получение АП из клеток штамма С. сЧрЫкепае 279 к>х+, выбранного как модель требовательного эпидемиологически значимого микроорганизма и дальнейшее изучение препарата представляло интерес для доказательства полноценности новой среды. С целью максимального выхода биомассы были установлены оптимальные условия периодического культивирования штамма С. сИрЫИепае 279 ¿ох+ в ЭС без добавления сыворотки.

Начальное значение рН ЭС составляло 7,6±0,1. Данные по накоплению биомассы и удельной скорости роста при разных режимах периодического культивирования представлены на рис. 3.

10,2

* 10,15 О

<5 ю,1

« 10,05 с;

g 10 у

ГО 9,95 9,9 9,85

0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

1 2 3 4 5

Режимы

Рис. 3. Рост штамма С.6'\рМЬепае 279 ?ох+

при разных режимах периодического культивирования

ЕШ lg количества клеток

максимальная удельная скорость роста

Следует отметить, что для рассмотренных режимов лаг-фазы были примерно одинаковыми и в среднем составили 2,5±0,2 часа.

При скорости перемешивания 100 об/мин и аэрации 0,2 л/мин (режим №1) завершение экспоненциальной фазы наступало после 11 часов культивирования, при этом количество дифтерийных бактерий составляло 8,3±0,9><109 м.к./мл (lg=9,96). При скорости перемешивания 200 об/мин и аэрации 0,5 л/мин (режим №2) завершение экспоненциальной фазы наступало после 10-и часов культивирования, при этом количество клеток составило 10,5±0,75 х 109 м.к./мл (lg=10,03).

После завершения экспоненциальной фазы роста значения концентрации клеток для режимов №3 (300 об/мин и 1 л/мин) и №4 (400 об/мин и 1,5 л/мин) соответственно были равны 14,0±1Дх109 м.к./мл (lg=10,15) на 10-м часу культивирования и 14,5±1,0хЮ9 м.к./мл

(1§=10,16) на 9-м часу культивирования. Для режима №5 (500 об/мин и 2 л/мин) количество клеток составило 14,3±0,9><109 м.к./мл (1§=10,15) после 11 часов культивирования. Наибольшая удельная скорость роста отмечена при режиме №4 (0,16 ч"'). К этому значению близки величины цтах при режимах №3 и №5 (соответственно 0,14 ч'1 и 0,12 ч'1). Значения цтах при режимах №№1и 2 были равны 0,06 ч"! и ОД ч"1. Таким образом, выявлена зависимость накопления биомассы от перемешивания и аэрации.

Понижение рН для всех режимов происходило через 3 часа культивирования после перехода в экспоненциальную фазу размножения бактерий. Для режимов №№ 1-3 изменение рН за время экспоненциальной фазы составило 0,5±0,1; а для режимов №№ 4 и 5 было 0,9±1,0.

Для получения биомассы и выделения из нее антигенного препарата использован режим №4 как оптимальный. Как дополнительный энергетический субстрат, к ЭС вначале, затем 4-кратно с интервалом 1,5 ч прибавляли стерильный раствор мальтозы (до 0,3%). Лаг-фаза культуры С. сИрЫЬепае в ЭС с углеводом составила 2 ч; при этом режиме удельная скорость роста Н-^тла равна 0,18 час"1.

И.Ю. Ильницкой и И.А. Баснакьян (1986) при исследовании динамики роста дифтерийных бактерий в процессе периодического культивирования показано, что синтез антигенов у дифтерийных бактерий возрастал после 5 ч выращивания, а существенное накопление токсина отмечено в культуральной жидкости через 12 ч. В наших экспериментах была поставлена задача получения АП в период, когда культура находится в физиологически активном состоянии, а значительного накопления токсина ещё не произошло. Поэтому периодическое культивирование штамма С.сИрЫИепае 279 1ох+ прекращали в конце экспоненциальной фазы после 9-10 ч роста. Количество микробных клеток к этому времени составило 18,2±1,2><109 м.к./мл.

После культивирования бактериальную массу инактивировали ГГ, проверяли на стерильность, и получали из нее антигенный препарат, охарактеризованный по физико-химическим свойствам (табл. 6). Аналогичным способом получали АП из двух нетоксигенных штаммов С. сИрЫкепае биовара ^гау/я 1499 (АП-1) и 0801 (АП-2) для изучения специфичности экспериментальной сыворотки.

Таблица 6

Определение физико-химических свойств дифтерийного АП

Наименование показателей

Результат исследования

Внешний вид, растворимость

Массовая доля влаги, % Температура плавления, °С Показатель преломления рН (0,1% водный р-р при 25°С) Молекулярная масса Белок, % Углеводы

Оптическая плотность 0,01% раствора АП (Х,=280нм)_

Кристаллы кремового цвета. Растворимы в воде; растворимы в спирте с опалесценцией 2,7±0,1 240±2

1,3337±0,0002 4,54±0,01 41-45 кДа 0,5±0,01

Правовращающие сахара, угол вращения 106,35±0,02°

0,1032±0,01

При проведении высокоэффективной жидкостной хроматографии наблюдали пик в промежутке времени 10,5 мин площадью 4,43 (рис. 4). Согласно данным хроматографической программы НРСНЕМ LC20-2002 с библиобазой LC Library Ver. 0756-2003, такая зона характерна для липополисахаридов с примесью пептидов.

Время, мин

Рис.4. Хроматограмма образца АП (растворитель спирт-вода 4:7)

При спектрофотометрш 0,01% раствора АП максимум поглощения отмечен при длине волны 280 нм.

Таким образом, из полученных результатов можно сделать вывод, что исследуемые образцы АП, имеют липидно-полисахаридный состав с примесью белка.

Изучение биологических свойств антигенного препарата из C.diphtheriae 279 tox+. Дополнительным доказательством того, что ЭС не изменяет характерных свойств дифтерийного микроба, явилось изучение способности АП вызывать синтез антител. Перед иммунизацией кроликов АП устанавливали среднетоксическую дозу препарата в экспериментах с мышами. (LDS0). Наиболее высокую летальность (38-92%) наблюдали в группах мышей, получивших 1,25-5,0мг АП. Вычисленная по формуле Рида и Менча, LD5Û АП составила 1,775 мг. В контрольной группе мышей гибели не отмечено. Способность стимулировать выработку специфических антител изучали при иммунизации 4-х групп кроликов (рис. 5).

I II III IV

Группы кроликов

Рис.5. Схема иммунизации кроликов

□ 1-я им. доза

И 2-я им. доза

©3-я им. доза

04-я им. доза

Каждой группе кроликов вводили последовательно возрастающие дозы АП.

В результате иммунизации титр преципитирующих антител возрастал во всех случаях (рис. 6). Минимальным в эксперименте оказался конечный титр антител у 1-й группы кроликов, иммунизированной 5-20 мг АП (1:400±30). У 2-й группы, получившей 20-50 мг АП, титр антител составил 1:1600±20. Максимальные титры антител выявлены в 3-й и 4-й группах животных (соответственно 1:2400±80 и 1:2420±40), иммунизированных наиболее высокими дозами АП (15-160 мг и 20-200 мг). Следовательно, АП обладал выраженной антигенной активностью.

2500

2000

1500

1000

500

7 14 21

Сроки иммунизации, дни

Рис. 6. Динамика накопления преципитирующих антител при иммунизации АП в течение 28 дней

28

-К-1 -•-II -¿-III -■-IV

Оценку специфичности преципитирующей сыворотки проводили в РКП с АП, АП-1, АП-2 и с дифтерийным анатоксином (50 ЬСмл). При разведениях сыворотки 1:4-1:40 и концентрации антигенных препаратов 0,1 мг/мл наблюдали РКП во всех случаях. При разведении сыворотки 1:400 (концентрация антигенов 0,1 мг/мл) отмечена РКП для АП и АП-1. При дальнейших разведениях сыворотки (1:800, 1:2400) и антигенных препаратов (0,01 мг/мл и 0,001 мг/мл) реакции с АП-1 и АП-2 не наблюдали, в то время как с АП (0,01мг/мл) наблюдали отчетливую РКП в титре до 1:2400. С дифтерийным анатоксином сыворотка реагировала в разведениях 1:4 -1:200 так же интенсивно, как с АП. При разведении сыворотки свыше 1:400 реакции взаимодействия с анатоксином не отмечено. Судя по результатам, полученным при постановке РКП, АП, АП-1, АП-2 содержат общие детерминанты, к которым у подопытных животных при иммунизации образовались антитела. Видимо, в связи с этим при разведениях сыворотки до 1:400 наблюдали образование слабых преципитатов с АП-1 и АП-2. При дальнейших разведениях сыворотки специфичность РКП возрастала и реакций с АП-1, АП-2 не отмечено. Так как испытуемая сыворотка взаимодействовала в РКП с дифтерийным анатоксином, это свидетельствовало о наличии в её составе антитоксических антител. Данный факт подтверждает наше предположение о присутствии дифтерийного токсина или его фрагментов в составе АП. Таким образом, в РКП с гомоло-

гичным АП, выделенным из биомассы С. diphtheriae после выращивания на ЭС, иммунная кроличья сыворотка была высокоактивной и обладала выраженной специфичностью.

Выводы:

1. Разработана микробиологическая питательная среда со сниженным содержанием азотистых веществ из утильного мясного сырья (толстый кишечник крупного рогатого скота) и составлена схема этапов ее приготовления и контроля.

2. Выявлено, что физико-химические и биологические свойства сконструированной среды отвечают требованиям, предъявляемым к микробиологическим питательным средам и обеспечивают рост микробных культур разных таксономических групп.

3. На модели С. diphtheriae показано, что использование новой среды позволяет проводить в ферментере периодическое культивирование прихотливых штаммов без добавления сыворотки.

4. Антигенный препарат, впервые полученный из штамма С. diphtheriae с помощью экстракции гидроксиламином после периодического культивирования на созданной среде, имел липидно-полисахаридный состав с примесью белка и обладал способностью

■ вызывать синтез специфичных антител in vivo.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. A.A. Икрамов, С.Ю. Калягина. Питательная среда для микробиологии на основе утильного мясного сырья // Химическое загрязнение среды обитания и проблемы экологической реабилитации нарушенных экосистем: Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции. - Пенза, 2003. - С.61

2. С.Ю. Калягина, A.A. Икрамов. Свойства Corynebacterium diphtheriae при культивировании на среде из непищевого сырья // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2004. - №4. - С.76-78

3. С.Ю. Калягина, Л.П. Блинкова. Питательная среда для выращивания бактерий и микромицетов на основе утильного мясного сырья // Материалы Четвертого Всероссийского конгресса по

медицинской микологии. «Успехи медицинской микологии» -М., 2006. - T.VII. -С. 285-286

4. С.Ю. Калягина, A.A. Икрамов. Модельные опыты по обнаружению растворимых дифтерийных антигенов в биологических субстратах // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - М., 2006. - С.46

5. С.Ю, Калягина, A.A. Икрамов. Биотехнология получения дифтерийной преципитирующей сыворотки // Анали Мечниювського шституту. - Харьюв, 2006. - №3. - С. 61-69

6. С.Ю. Калягина, A.A. Икрамов. Физико-химические свойства микробного антигена, полученного с использованием новой питательной среды // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Успехи медицинской микологии» -М., 2007. - Т.Х. - Гл. 4. - С. 81-83

7. С.Ю. Калягина, Л.П. Блинкова. Новая питательная среда для культивирования бактерий // Научно-практический журнал «Клиническое питание». - №1-2. - 2007. - С.43-44

8. Л.П. Блинкова, О.Б. Горобец, С.Ю. Калягина. Перспективные источники сырья с высокой питательной ценностью для создания отечественных микробиологических сред // Материалы Всероссийской конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Вестник ВМА.-С.-Пб., 2008-№2 (22). -Прилож. Ч.2.-С.220-221

9. С.Ю.Калягина. Создание питательной среды из утильного мясного сырья и оценка ее свойств // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - №3. - С. 91-94

Заказ № 525. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калягина, Светлана Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1Л. Классификация питательных сред. Применение питательных сред со сниженным количеством белка.

1.2. Питательные среды, используемые для культивирования энтеробакте-рий, стафилококков, коринебактерий и дрожжевых грибов.

1.3. Зависимость антигенного строения прихотливой культуры С. diphtheriae от состава питательного субстрата и других условий культивирования.

1.4. Свойства бактериальных гидроксиламиновых антигенов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Приготовление вариантов экспериментальной питательной среды из утильного мясного сырья, сред сравнения и изучение их физико-химических свойств.

2.2. Изучение ростовых свойств экспериментальной и контрольной питательных сред.

2.3. Периодическое культивирование тест-штамма С. diphtheriae 279tox+ в экспериментальной среде.

2.4. Получение гидроксиламинового дифтерийного антигенного препарата и изучение его физико-химических и биологических свойств.

ГЛАВА 3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВАРИАНТОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ИЗ УТИЛЬНОГО МЯСНОГО СЫРЬЯ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

3.1. Зависимость количества осаждаемых балластных веществ от времени ау-толиза сырья.

3.2. Количественные изменения общего и аминпого азота в вариантах экспериментальной среды в зависимости от времени аутолиза.

3.3. Физико-химические характеристики трех вариантов экспериментальной питательной среды.

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РОСТОВЫХ СВОЙСТВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КОНТРОЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД.

4.1. Морфологические, тинкториальные, физиолого-биохимические свойства тест-штаммов при культивировании на экспериментальной и контрольной средах.

4.2. Токсигенные свойства штаммов C.diphtheriae, пассированных на экспериментальной и контрольной средах.

ГЛАВА 5. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТЕСТ-ШТАММА С. DIPHTHER1AE 279ТОХ+ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СРЕДЕ И ПОЛУЧЕНИЕ ГИДРОКСИЛАМИНОВОГО ДИФТЕРИЙНОГО АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА.

5.1. Выбор оптимального режима периодического культивирования тест-штамма С. diphlheriae 279tox+ в экспериментальной среде.

5.2. Периодическое культивирование тест-штаммов дифтерийных бактерий в оптимальных условиях и получение из клеток антигенных препаратов с помощью гидроксиламина гидрохлорида.

ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ БИОМАССЫ ТЕСТ-ШТАММА C.DIPHTHERIAE 279ТОХ+

6. 1. Физико-химические свойства дифтерийного антигенного препарата.

6.2. Биологические свойства дифтерийного антигенного препарата.

ГЛАВА 7. СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ РАЗРАБОТАННОЙ

ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка микробиологической питательной среды из утильного мясного сырья"

Актуальность проблемы. Традиционным сырьем для приготовления микробиологических питательных сред являются мясо, печень, рыба и другие пищевые продукты с высоким содержанием белка [70, 1241. В некоторых случаях при получении биотехнологической продукции, связанной с культивированием микроорганизмов, необходимы среды на низкобелковой основе. В связи с этим исследователями проводится активный поиск непищевых, экономичных видов сырья для производства питательных сред. В качестве сырья, имеющего более низкую белковую ценность, предложены гидролизаты крови животных и кровезаменители с истекшим сроком годности [101, 52, 71, 30], кормовые дрожжи, виноградная мука [69], отходы пушного звероводства, микроводоросли [13, 14, 15] и др.

На наш взгляд, для создания питательных сред целесообразно использование утильного мясного сырья - отходов скотобоен (толстый кишечник крупного рогатого скота и др.). Поскольку вновь разрабатываемые питательные среды представляют интерес для выращивания микроорганизмов разных таксономических групп, в качестве тест-объектов при изучении свойств создаваемой питательной среды выбраны широко распространенные представители энтеробактерий, стафилококков, дрожжевых грибов, а также один токсигенный и два нетоксигенных штамма дифтерийных бактерий. Следует отметить, что последние принадлежат к «требовательным» микроорганизмам, нуждающимся в полноценных белковых субстратах и факторах роста (среда Лингуда, бульон Мартена, среды с кровью, сывороткой) [33, 58, 76] и др. Поэтому для более полной оценки новой питательной среды целесообразно было провести выращивание на ней такого прихотливого микроба, как Corynebactrium diphtheriae, с последующим изучением специфичности антигенного препарата, полученного из его биомассы.

Ранее эксперименты по выделению антигенов методом гидроксила-миновой экстракциии после культивирования на питательных средах из другого вида утильного мясного сырья (кишечник кроликов, использованных в сывороточном производстве) проводили со штаммами семейств Еп-terobacteriaceae, Vibrionaceae, Staphylococcaceae [47, 104]. Авторами показано, что подобные среды с невысоким количеством белка более пригодны для глубинного выращивания бактерий и получения протективных антигенов с помощью гидроксиламина из биомассы испытанных штаммов, чем высокобелковые. На основе выделенных антигенов были созданы диагностические и вакцинные препараты.

Таким образом, разработка и испытание среды из утильного мясного сырья для культивирования как прихотливых, так и неприхотливых микроорганизмов, является актуальной задачей.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Калягина, Светлана Юрьевна

ВЫВОДЫ:

Разработана микробиологическая питательная среда со сниженным со держанием азотистых веществ из утильного мясного сырья (толстый к» шечник крупного рогатого скота) и составлена схема этапов ее приготовления и контроля.

Выявлено, что физико-химические и биологические свойства сконструиро ванной среды отвечают требованиям, предъявляемым к микробиологиче ским питательным средам и обеспечивают рост микробных культур разных таксономических групп.

На модели С. diphtheriae показано, что использование новой среды позволяет проводить в ферментере периодическое культивирование прихотливых штаммов без добавления сыворотки.

Антигенный препарат, впервые полученный из штамма С. diphtheriae с помощью экстракции гидроксиламином после периодического культивирования на созданной среде, имел липидно-полисахаридный состав с примесью белка и обладал способностью вызывать синтез специфичных антител in vivo. юг

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калягина, Светлана Юрьевна, Москва

1. Алексахина Н.Н. Изменение специфического полисахарида и белков менингококка серогруппы В в процессе глубинного культивирования // Дисс. канд. биол. наук. — М., 1988. 205 с.

2. Аминопептид для микробиологических питательных сред. ТУ 42.14-356-86

3. Андреева И.Н., Огородникова Т.И. Влияние условий культивирования на рост и пигментацию Serratia mcircescens II Журн. микробиол. 1999. - №3.- с. 16-20

4. Ахапкина И.Г. Изучение ферментативного гидролизата хлореллы в качестве основы питательных сред // Дис. канд. биол наук. -М., 1997.-144 с.

5. Баснакьян И. А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М., 1992. — С. 10

6. Баснакьян И.А., Мирясова Л.В., Соколова Т.В. и др. Оптимизация технологии культивирования вакцинных штаммов Shigella flexneri// Журн. микробиол. 1993. - №5. - С. 6- 13

7. Батурина А.В., Аверкиева И.Т., Симакова Н.Н., Строгонова Р.А. Использование среды 199 в бактериологической диагностике дифтерии // Лабораторное дело. 1990. - №1. - С. 69- 70

8. Ю.Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф., Шубин Ф.Н. Тимченко Н.Ф. Влияние глюкозы и галактозы на морфологию и биологические свойства Yersenia pseudotubercolosis II Журн.микробиол. — 2005. №5. - С.6-10

9. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии: В 2 т. /М.: Мир, 1989. -Т.1. -С. 484- 497

10. Биргер М. О., Гренкова Е. П., Фиш Н. Г и др. Защитный соматический антиген Corynebacterium diphtheriae II Журн. микро-биол. 1980. - №1. - С. 46- 4

11. Блинкова Л. П., Зотина М. 10., Щербатых Н. В. и др. Микробиологические питательные среды на основе отходов пушного звероводства // Журн. микробиол. — 1994. №6 — С.

12. Б2ний&ова Л. П., Ахапкина И. Г., Яковлева И.Г. и др. Применение ферментативного гидролизата хлореллы в средах для выращивания клеток эукариот // Журн. микробиол. 1995. - №6 — С.6-7

13. Блинкова Л. П., Ахапкина И. Г., Бутова Л. Г. Изучение возможности применения биомассы спирулины в производстве питательных сред // Журн. микробиол. 1998. — №8 - С. 85- 86

14. Ванеева Н.П., Ёлкина С.И., Ястребова Н.Е. и др. Химическая и иммунохимическая характеристика антигенов Shigelladysenteriae 1, выделенных с помощью солянокислого гидрокси-ламина // Журн. микробиол. 1995. - №6.- С. 45- 48

15. Вернер И.К. Структурные и иммунобиологические характеристики углеводсодержащих антигенов Neisseria meningitidis се-рогруппы В штамма №125 выращенного в условиях управляемого культивирования. Автореф. канд. дисс. М., 1997. - 20 с.

16. Высоцкий В.В. К вопросу о строении поверхностных структур коринебактерий // Журн. микробиол. 1976. - №7. - С. 112 -119

17. Гаврилова Н.А. Особенности роста, биосинтеза дифтерийного токсина и клеточных белков при культивировании Corynebacterium diphtheriae в условиях дефицита железа: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2000. - 24 с.

18. Гавристова И.А., Штанчаева С.М., Преображенская Е.И. Сравнительная оценка питательных сред для выделения шигелл исальмонелл // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - №3. - С.53-54

19. Газиумарова Л.Д., Абдурашидова З.М. Разработка среды накопления для обнаружения бактерий трибы протея // Там же. -С.24-25

20. Гамзулина Л.Н. Спектр антител к железорегулируемым белкам Neisseria meningitidis у здоровых лиц и больных менингококко-вовой инфекцией. Автореф. дисс. канд. биол. наук. - М., 2005.-25 с.

21. Государственная фармакопея СССР, XI издание М., 1987. Выпуск 1. - 334с.

22. Грубер И.М., Дмитриева М.Н., Гаврилова Н.А. Взаимосвязь накопления биомассы и токсина с динамикой физико-химических параметров культивирования Corynebacterium diphtheriae PW8II Журн. микробиол. 1999. - №2. - С. 29-32

23. Грубер И.М., Рощупкина М.Н., Гиршович Е.С., Дубинина Г.П. Питательная среда на основе «Бактофок-М» для культивирования производственного дифтерийного штамма // Мат. докл., Пермь, 1993.-С. 41-42

24. Далин М.В., Фиш Н.Г. Значение гетерогенности специфического антигена в защитной активности дифтерийного анатоксина // Журн. микробиол. 1972. - №1. - С. 27-33

25. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. в 3-х томах. М.: Мир, 1982.-С.888, С.902

26. Дифтерия / JI. А. Фаворова, Н. А. Астафьева, М. П. Корженкова и др. -М.: Медицина, 1988. 208 с.

27. Досон Р., Элиот Д. Эллиот Д., Джонс К. Справочник биохимика. М.:Мир. - 1991. - С.253 , 266.

28. Дубинина Г.П., Баснакьян И.А., Волкова Н.В., Гордон Н.Ю. Методические рекомендации по определению числа жизнеспособных клеток и однородности популяции патогенных микроорганизмов. М.: Минздрав. - 1977. — 12 с.

29. Дьяченко Ю.В., Левицкий А.П. Соевые бактериологические питательные среды и перспективы их использования в клинической бактериологии // Клиническая лабораторная диагностика. 2001№3.- С.49-51

30. Жданова Л.Г., Машилова Г.М., Грубер И.М. и др. // В кн.: Вакцины и сыворотки. М., 1975.-t.23, С.3-10

31. Зайцева Е. В., Левина J1. А. Характеристика биологической активности и химического состава антигенных препаратов эпге-рихий, изолированных с помощью гидроксиламина // Журн. микробиол.- 1991.-№5.-С. 77-78

32. Захарова Н.Е. Определение влияния гидроксиламингидрохло-рида па состав и свойства антигенов Shigella dysenteriae /: Ав-тореф. дисс. канд. биол. наук. М., 2001. - 23 с.

33. Захарова Н.С., Агальцова С.И. Шмелева Е.И. и др. Морфологические изменения в органах животных после введения бесклеточной коклюшной вакцины с иммуномодуляторами. Журн. микробиол. 2003. - №3. - С. 30-34

34. Иванова В.В., Кветная А.С., Скрипченко Н.В. и др. Определение диагностической ценности латексного гелевого диагности-кума фирмы «Диамед АГ» для выявления дифтерийного токсина // Клин. лаб. диагностика. 2000. - №4. - С. 42-44.

35. Ильницкая И.Ю., Баснакьян И.А. Совершенствование культивирования дифтерийных коринебактерий для получения токсина-анатоксина // Журн. микробиол. 1986. - №7. - С. 40- 44

36. Икрамов А.А. Ускоренный метод диагностики сальмонеллезов групп В и D: Дисс. канд. биол. наук. — М., 1988. 146 с.

37. Каверина К.Г., Баснакьян И.А., Мирясова Л.В., Захарова Н.Е. Зависимость растворимых антигенов протея от условий культивирования бактерий // Сб. тр. НИИВС им. И.И. Мечникова «Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии». М., ~ 1992.-С. 166-170

38. Карабак В.И. Синтетическая питательная среда для управляемого культивирования менингококка и получения группоспе-цифического В-полисахарида // Дисс. канд. мед. наук -М.,1986. 222 с.

39. Карташова Л.Д., Шеремет О.В., Технология изготовления гид-ролизата отрубей // Тез. докл. Махачкала, 1990. - 4.1. - С.40-41

40. Клиническая лабораторная аналитика. Том IV. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории./ Под. ред. Меньшикова В.В. М.: Агат-Мед. -2003. - 816 с.

41. Ковтун Ю.С. Разработка сухих питательных сред из непищевого сырья для контроля микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств: Дисс. канд. мед. наук. М., 1992. - 134 с.

42. Колепко В.В. Непрерывное культивирование Neisseria meningitidis серогруппы В для получения диагностических агглютинирующих сывороток // Дисс. канд. мед. наук. М., 1990. - 137 с.

43. Кондратьева Л.К., Гинзбург P.M. Питательная среда для выделения возбудителей дифтерии // Клин. лаб. диагностика. 1997.- №7. С.40-41

44. Костина Г.И. К вопросу о механизмах химической инактивации микроорганизмов // Журн. микробиол. — 1981. — №8. — С.25-32

45. Костюкова Н.Н. Микробиологические факторы, определяющие носительство при капельных инфекциях // Журн. микробиол. -1997. -№4,- С. 10- 15

46. Костюкова Н.Н. Возбудитель дифтерии и условно-патогенные коринебактерии (лекция) // Клин. лаб. диагностика. — 2001,— №6.-С. 26-31.

47. Костюкова Н.Н., Кадырова Х.В., Езепчук Ю.В. Серологическое исследование соматического компонента, выделенного из Corynebacterium diphtheriae II Журн. микробиол. — 1970. №4. -С. 559- 564.

48. Крейнин Л.С., Каверина К.Г., Левина Л.А. и др. Вакцина из растворимых антигенов для специфической терапии протейной инфекции // Журн. микробиол. 1983. - №10. - С. 88-92

49. Лакин Г.Ф. "Биометрия" / Учебное пособие для биологических специальностей ВУЗов М.: Высшая школа, 1990 - 352 с.

50. Ляшенко Н.Э., Иванов Ю.Б. Питательная среда для выделения эшерихий с персистирующими свойствами // Журн. микробиол.- 1997.-№4.-С.115-117

51. Мавраева Р.Н., Меджидов М.М. Питательная среда обогащения для энтеробактерий// Там же, — С. 39.

52. Маргулис И.Л., Головина Н.М., Б.М. Раскин и др. Новая сухая питательная среда для выделения Corynebacterium diphtheriae (разработка и изучение) // Журн. микробиол. 1988. — №10. — С.6-8

53. Машилова Г. М., Жданова Л. Г., Баснакьян И. А. и др. Роль кислорода в управлении процессом культивирования С. diphtheriae II Журн. микробиол. 1977. - №3. - С. 47- 52

54. Меджидов М.М., Адилова М.А. Разработка питательной среды для дифференциальной диагностики энтеробактерий по индо-лообразованию // Там же. С.40-41

55. Меджидов М.М. Разработка и производство микробиологических питательных сред на основе непищевого сырья: Автореф дисс. докт. мед. наук. — М., 1987. -43 с.

56. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М., 2003. - С.29

57. Мельникова В.А., Батуро А.П. Новые рецептуры питательных сред для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний // Мат. IX Всерос. науч.практ. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2007. - С.64

58. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. — М., 1980. 15 с.

59. Методические рекомендации. Микробиологическая диагностика вульво-вагинального кандидоза. Пермь, 2006.

60. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96.—М.: Минздрав, 1998. 128 с.

61. Методические указания МЗ РФ по диагностике дифтерии. МУ 42. 698. 98. М., 1998

62. Методические указания. Определение остаточного гидрокси-ламина в вакцинных препаратах. РД 42-28-28-86. М., 1986. — 9 с.

63. Мигунов А.И., Вопияшин О .Я., Качурина Л.В. и др. Физико-химическая характеристика питательного бульона на основе гидролизата куриных эмбрионов // Журн. микробиол. 1994. — №4. -С.13-16

64. Мирясова Л.В., Баснакьян И.А., Егорова Н.Б. и др. Иммунобиологические свойства антигенных препаратов, полученных из вакцинного штамма Klebsiella pneumoniae 204, выращенного на средах различного состава // Журн. микробиол. 1990. - №7. - С. 43- 46

65. Мирясова Л.В., Ефимцева О.В., Карабак И.В. и др. Изучение фракционного состава состава гидроксиламиновых препаратов и липополисахарида вакцинного штамма Klebsiella pneumoniae!7 Журн. микробиол. 1997. - №3. - С. 73- 76

66. Мусаева Г. X. Биологические свойства современных возбудителей С. diphtheriae и пути усовершенствования бактериологической диагностики дифтерии: Автореф. дис. . канд. мед. наук.-Т., 2001.-22 с.

67. Мухленов А.Г., Бойков Ю.А., Резвая С.П. Способ получения гидролизатов из рыбного сырья. Патент РФ №1755417. 1996

68. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотера-пия. М., 1982.-496 с.

69. Нуриддинова Н.Р., Иванова JI.E., Шереметьев Н.Н., Гариб Ф.Ю. Синегнойная вакцина на основе антигенов, выделенных из супернатанта среды культивирования К-4 // Журн. микробиол. 2002. - №4. - С. 40-43.

70. Няникова Г.Г., Водолажская С.В., Маметнабиев Т.Э. Питательная основа из ракообразных // Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем. Мат. 4-й науч.пр. конф. - Махачкала, 15-17 сентября, 2003. - С.51-52

71. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С. JTa-бинской, Л.Г1. Блииковой, А.С. Ещиной. М., 2004. - 576 с.

72. Овсова Л.М., Мазрухо А.Б., Ломов Ю.М. и др. Влияние различных аминокислот и солей аммония в составе синтетической питательной среды на продукцию холерного энтеротоксина. Журн. микробиол. 2003. - №3. - С.16-21

73. Октябрьский О. П., Смирнов Г. В. Биофизика микробных популяций. Красноярск, 1987.- 422 с.

74. Омарова С.М. Разработка питательных сред и микротест-ситем для накопления, выделения и идентификации листерий. — Дисс. докт. биол. наук. — М., 2007. 332с.

75. Омарова С.М., Баснакьян И.А., Артемьева Т.А. Сухие питательные среды для культивирования пневмококков и менингококков // Журн. микробиол. 1999. - №6. - С.30-33

76. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. 9-е издание. Перевод с англ. / Под ред. акад. РАМН Г.А. Заварзина. М.: Мир, 1997. -800 с.

77. Орлова О.Е., Ванеева Н.П., Львов В.Л. и др. Культивирование Haemophilus influenzae серотипа В па полусинтетической питательной среде на основе аминопептида // Журн. микробиол. -2002. -№3.-С.56-58.

78. Орлова О.Е., Ястребова Н.Е., Ёлкина С.И. Особенности состава синтетических питательних сред для культивирования Haemophilus influenzae типа В с позиций современных представлений о метаболизме этих бактерий // Журн. микробиол. -2001. -№3. С. 111-117.

79. Панасовец О.П., Нетрусов А.И., Головина С.В. и др. Обоснование возможности применения новой жидкой питательной среды накопления для выделения сальмонелл из водных объектов // Журн. микробиол. 2007. - №4. - С.56-58.

80. Патент РФ №94019810/13. Способ получения поликомпонентной вакцины для иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно патогенными микроорганизмами. М., 1997.

81. Панкреатический гидролизат казеина (ПГК). ТУ 9385-002004979327-94

82. Пивоварова Н.И. Разработка промышленной технологии изготовления гидролизатов кормовых дрожжей и оценка возможности их применения в производстве микробиологических питательных сред // Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1985. - 26 с.

83. Пшеничнов В.А., Семенов Б.Ф., Зезеров Е.Г. /в кн.: Стандартизация методов вирусологических исследований. — М.: Медицина, 1974.-С. 123-128

84. Раскин Б.М. Экспериментальное обоснование рационального использования сырья в производстве микробиологических питательных сред. Автореф. дис. докт. мед. наук. — М., 1982. -26 с.

85. Раскин Б.М., Денисова С.В. Конструирование микробиологических питательных сред //Сб. тр. «Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии». -М., 1992. С. 123-135

86. Раскин Б.М., Мельникова В.А., Денисова С.В. и др. Проблемы питательных сред, актуальность и задачи // Проблемы медицинской биотехнологии. Мат. Всесоюзн. науч. конф., окт. 1988.-Л.: 1990. С.179-181

87. Романов В.Е. Биотехнология, экология, медицина // Мат. III-IV Междунар. науч. семинаров 2001-2002гг. Под ред. д.т.н. А.Ф.Труфанова. Москва-Киров: Экспресс. 2002, С.78-84

88. Садритдипова Д. Б. Антигены и антигенные комплексы, индуцирующие невосприимчивость к стафилококку. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Ташкент, 1995. - 22 с.

89. Сергеев В. В., Цветкова Н. В., Ястребова Н. Е. и др. Характеристика антигенного препарата Salmonella typhi ТУ2 4446, выделенного с помощью гидроксиламина солянокислого // Журн. микробиол. 1993. - №6. - С. 65 - 68

90. Сиволодский Е.П. Профили утилизации 20 аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода у бактерий Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Escherichia // Журн. микробиол., 2005. №5. - C.l 1-14

91. Синяшин Н. И., Лобачева Л. А. Щадящий метод выделения защитных антигенов из патогенных бактерий // Использование разных методов в изучении и изготовлении вакцин и анатоксинов: Тр. ТашНИИВС. Т., 1970. - Т. VII. - С. 7- 8

92. Смирнова Г.А., Мельникова В.А., Раскин Б.М., Целигорова Е.Л. Изучение влияния пептидного и аминокислотного состава питательных основ на параметры роста микроорганизмов // Журн. микробиол. ~ 1987. №9. - С.26-30

93. Скачкова В.Г., Пичугина Е.В., Новикова А.А и др. Испытание нового питательного агара // Там же, С. 16-17

94. Соколова Т. В. Создание и изучение поливакцины, состоящей из антигенных комплексов Shigella flexneri la, lb и 2a. Ав-тореф. дисс. . канд. мед. наук. М., 1995. - 22 с.

95. Справочник по микробиологическими вирусологическим методам исследования// Под. ред. М.О. Биргера. — М., 1982. — С.71

96. Станиславский Е. С. Бактериальные структуры и их анти-генность. М„ 1971.-230 с

97. Султанов 3.3., Алиев А.З, Какулина Е.А., Перепелица А.Г. Основные технологические аспекты производства гидролизатов сои // Там же. С.40-41

98. Султанов 3.3., Степанова Э.Д., Алиев А.З. и др. Разработка технологии получения сухого пептона из рыбного сырья // Там же. С. 38-39

99. Суханова С.М., Беляева Г.А., Захарова Н.Е. и др. Новые коммерческие основы бактериологических питательных сред // Там же. С.47

100. Сгандюкова Р.А., Баснакьян И.А., Стукалова Н.В., Алекса-хина Н.Н. Влияние метилированного циклодекстрина на накопление коклюшного токсина в культуре Bordetella pertussis в биорсакторе // Журн. микробиол. 1999. — №6. - С. 14-17

101. Убайдуллаева Д. А., Икрамов А. А. Биотехнология и свойства новых типов вакцин против бактериальной дизентерии // Медицинский журнал Узбекистана. 1982. - №3. - С. 20-24

102. Филиппова Л. М., Холчев Н. В., Мазурова И. К. Фракционный состав экстрактов коринебактерий дифтерии по данным ионообменной хроматографии и гель-фильтрации // Проблемыэпидемиологии и клиники инфекционных болезней. — М., 1978. Т.ХХ1. - С.118- 122.

103. Хеншен А., Хупе К.-П., Лотшпайх Ф., Вельтер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988 — С.56

104. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С. Ла-бинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. М., 2005. - 600 с.

105. Ценева Г. Я., Щедеркина Е. Е. Характеристика основных патогенных свойств Corynebacterium diphtheriae // Журн. микробиол. 2000. - №6. - С. 10-13

106. Шепилова Р. Г., Андреева 3. М., Сальникова Г. П. и др. -Сравнительное изучение питательных сред для выделения ко-ринебактерий дифтерии // Лабораторное дело. -1989. №8. -С.62-64

107. Шмелёва Е.А. Биологическая функция антигенов клеточной стенки коринебактерий дифтерии и научно-производственная разработка иммуномодулирующего препарата «Кодивак» // Дисс. докт. биол. наук МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. — 1991.- 336 с.

108. Энглер К. X., Норн Д., Козлов Р. С. и др. Быстрые феноти-пические методы определения дифтерийного токсина клинических штаммов коринебактерий // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - Т.З. - №2

109. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа. -М.: Мир, 1989.-С.81

110. Яровая Л. М., Шмелёва Е. А., Самсонова В. С., Куликовская Е. В. Химический состав препарата клеточных стенок

111. Cory neb acterium diphtheriae II Журн. микробиол. — 1985. — №8.- С. 26- 29.

112. Abou-Zeid С., Harbol M., Sundsten В. Cross-reactivity of antigens from cytoplasma and cell wall of some Corynebacteria and Mycobacteria//J. Infect. Dis. 1985. -V. 151(1). -P.l70-178

113. Aravena-Roman M., Bowman R., C'Neil G. Polymerase chain reaction — the detection of toxygenic Corynebacterium diphtheriae // Pathology. 1995. - V.2. - P.234 - 236

114. Barksdale L. Corynebacterium diphtheriae and its relatives // Bacteriology Review. 1970. - V.34. - P.378 -388

115. Cummins C. S. Some observations on the nature of the antigens in cell wall of Corynebacterium diphtheriae // Brit. exp. Path. -1954.-V. 35 (2).-P. 166-180

116. Cummins C. S. Cell wall composition Corynebacterium bovis and some other Corynebacteria // J. Bacteriology. — 1971. — V. 105.- P.1227-1229

117. Collier R. J. Diphtheria toxin: Mode of action and structure // Bact. Review. 1975. - V.39. - P.54-85

118. Collier R. J., Kandel J. Structure and activity of diphtheria toxin //J. of Biol. Chem.- 1971,-V. 246 (5).-P. 1496-1503

119. Efstratiou A., Engler К. H., Dawes C. S., Sesardic D. Comparison of phenotypic and genotypic methods for detection of diphtheria toxin among isolates of pathogenic corynebacteria // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36 (11).-P. 3173 -3177

120. Engler К. H., Glushkevich Т., Mazurova I. K. et. al. A modified Elek test for detection of toxigenic corynebacteria in diagnostic laboratory // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35 (2). - P. 495- 498

121. Freeman V. Studies of the virulence of bacteriophage infected strains of Corynebacterium diphtheriae // J. Bacteriology. 1951. — V.61.-P. 675

122. Gill D., Pappenheimer A. Structure-activity relationships in diphtheria toxin // J. Biol. Chemistry. 1971. - V. 246. - P. 14921495

123. Groman N. B. Evidence for the active role of bacteriophage in the conversion of nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae to toxin production // J. Bacteriology. 1955. - v. 69. - №1. - P. 9-15

124. Holmes R.K., Must L.M., Lee J.G. et al. Regulation of toxino-genesis in Corynebacterium diphtheriae // Abstr. of the 5 international Meeting of the European laboratory working group on diphtheria. 1998. - P.34

125. Kato I. Mode of action of diphtheria toxin on protein synteis.— J. Exp. Med. 1962. - V.32. - P.335-343

126. Kipp F., Kahl B.C., Becker K. et al. Evaluation of Two Chro-mogenic Agar Media for Recovery and Identification of Staphylococcus aureus Small-Colony Variants // J. Clin. Micribiol. 2005. -43 (4).-P. 1956-1959

127. Krech Т., Hollis D. Corynebacterium and related organisms // Manual of Clinical Microbiology, 5 ed.: Editor in chief A. balow; ed. W.j. Hauster et al. / American Society of Microbiology. -Washington D.C. - 1991. P. 277-286

128. Kwapinsky J. В. Cytoplasmic antigens relationships among the actinomycetales // J. Bacteriology. 1964a. - v. 87. - 5. - P. 1234 -1241

129. Kuklinska D., Chodorovska M. Novelty of laboratory diagnosis for diphtheria // Med Dosw Mikrobiol. 2002. - V. 54 (1). - P. 3543

130. Lautrop H. On the extensce of antibacterial factor in diphtheria immunity // Acta Path. Microbiol. Scand. 1955. - V. 36 (3). - P. 274-288

131. Lee C.W., Halperin S.A., Morris A., Lee S.F. Expression of diphtheria toxin in Streptococcus mutants and induction of toxin-neutralizing antisera // Can. J. Microbiol. 2005. - V.51 (10). - P. 841-846

132. Litwin C.M., Calderwood S.B. Role of iron in regulation of virulence genes // Clin. Microbiol. Rev. 1993. - V. 6. - p. 137-149

133. Liu X., Ferenci T. Regulation of porin-mediated outer membrane permeability by nutrient limitation in Eshcerichia coli // J.Bacteriol. 1998.- 180 (15). -P.3917-3922

134. Manual of BBL Products and Laboratory Procedures. 6th Edition. - USA. - 1988. - 389 p.

135. Meitzner T.A., Morse S.A. The role of iron-binding proteins in the survival of pathogenic bacteria // Ann. Rev. Nutr. 1994. -V.14. -p.471-493

136. Nakao H., Popovic Т. Development of a direct PCR for detection of diphtheria toxin gene // J. Clin. Microbiology. 1997. - V.7 - P. 1651 -1655

137. Oeding P. Thermostabile and thermolabile antigens in diphtheria bacillus // Acta Path. Microbiol, scand/ 1950. - V. 27 (3). - P. 427- 435

138. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels in vitro method for testing the toxin producing capasity of Corynebacteria diphtheriae // Acta Path. Microbiol. Scand. 1949. - V.26. - P.507-515

139. Pappenheimer A. M., Gill D. M. Diphtheria. Recent studies have clarified the molecular mechanism involved in its pathogenesis // Science. 1973.-V.182 (4110).-P.353-358

140. Pappenheimer A. M. The diphtheriae bacillus and its toxin: a model system. - J. Hyg. Camb. 1984, v. 93, p. 397- 404

141. Pappenheimer A. M. The story of a toxic protein 1888-1992. Protein S. 1993. V.2. - P.292- 298

142. Pallen M. J. Rapid screen for toxigenic Corynebacterium diphtheriae by the polymerase chain reaction 11 J. Clin. Pathol. 1991. -V.44.-P. 1025- 1026

143. Pallen M. J., Hay A. J., Puckey L. H., Efstratiou A. Polymerase chain reaction for screening clinical isolates of corynebacteria for the production of diphtheria toxin // J. Clin. Pathol. 1994. - V.47. -P. 353- 356

144. Pope C. G., Stevans M. F. Isolation of cristallin protein from highly purified diphtheriae toxin // Lancet. 1953. - V.2. - P.l 19 -125

145. Pine L., George J.R., Reeves M.W., Harrell W.K. Development of a chemically defined liquid medium for growth of Legionella pneumophila II J. Clin. Microbiol. 1979. - V.9(5) - P.615-626

146. Rappuolli R., Michel J. L., Murphy J.R. Integration of coryne-bacteriophages |3tox+, a>tox+, ytox- into two attachment sites on the Corynebacterium diphtheriae chromosome 11 J. Bacteriol. — 1983. -V. 153(3). — P. 1202-1210

147. Rolf J.M., Eidels L. Characterization of the diphtheria toxin receptor-binding domen // Mol. Microbiol. 1993. - V.7 (4). - P. 585-91

148. Rousselle P., Freydiere A., Couillerot P. et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. - V.32 - P.3034-3036

149. Schmitt M.R., Talley B.G., Holmes R.K. Characterization of lipoprotein IRP1 from Corynebacterium diphtheriae, which is regulated by the diphtheria toxin repressor (DtxR) and iron// Inf. Imm. -1997. V/ 65(12). - P.5364-5367

150. Shilling C.H., Palson B.O. Assessment of the metabolic capabilities of Haemophilus influenzae Rd through a genom-scale Pathway Analisis // J. Theor. Biol. 2000. - 203(3). P.249-284

151. Tchorbanov A.I., Dimitrov J.D., Vassilev T.V. Optimizatition of casein-based semisythetic medium for growing of toxigenic Corynebacterium diphtheriae in a fermenter // Can. J. Microbiol. 2004. -V. 50(10).-P. 821-6

152. The HiMedia Manual for microbiology Laboratory practice/ India, Mumbai, HiMedia laboratories pvt. limited. 1998. - 524p.

153. Tokyshasu K.T. Immunochemistry of ultrathin frozen section// J. Histochem. 1980. - V. 12.- P.381-403

154. Walory J., Grzesiowski P., Hrynievicz W. Comparison of four serological methods for the detection of diphtheria antitoxin antibody // J. Immunol. Methods. 2000. - Nov. 1. - V. 245 (1-2). -P.55-56

155. Wilks A., Schmitt M.R. Expression and characterization of heme oxygenase (HmuO) from Corynebacterium diphtheriae. Iron ac-qnisition requires oxidative cleavage of the heme macrocycle// J. Biol. Chem. 1998. - V.273(2). - P.837-841