Разработка технологии производства панкреатического гидролизата рыбной муки и конструирование на его основе бактериологических питатетльных сред

Шепелин, Анатолий Прокопьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии производства панкреатического гидролизата рыбной муки и конструирование на его основе бактериологических питатетльных сред
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии производства панкреатического гидролизата рыбной муки и конструирование на его основе бактериологических питатетльных сред"

005059389

правах рукописи

ШЕПЕЛИН АНАТОЛИЙ ПРОКОПЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ГИДРОЛИЗАТА РЫБНОЙ МУКИ И КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ЕГО ОСНОВЕ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

03.01.06. -биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03. - микробиология

1 6 ИДЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2013

005059389

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

член-корреспондент РАМН Дятлов Иван Алексеевич

Официальные оппоненты:

Коровкин Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно - исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Алиева Елена Васильевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом бактериологии ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России

Миронов Андрей Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры микробиологи, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова» Минздрава России

Ведущая организация - Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится С? июня 2013 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10

Автореферат разослан ^ « 2013 г.

Ученый секретарь диссертационногосовста,.

доктор медицинских наук Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В Российской Федерации ежегодно регистрируется 31-32 млн. случаев инфекционных заболеваний, значительную часть в которых составляют острые кишечные инфекции. По данным Всемирной организации здравоохранения около 70% всех случаев ОКИ имеют вирусное происхождение и 30 % бактериальную этиологию. В последние годы в РФ наблюдалась устойчивая тенденция к росту заболеваемости ОКИ, а удельный вес заболеваний, вызванных возбудителями неустановленной этиологии, составляет от 62 % до 69 % (Государственный доклад «О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2010 году», Онищенко Г.Г.).

Для совершенствования лабораторной диагностики инфекционных заболеваний большое значение имеют питательные среды. Долгие годы производство питательных сред базировалось на панкреатическом гидролизате кильки каспийской, гидролизате казеина и пептоне ферментативном (Мед-жидов М.М., 1985). Недостаточный ассортимент сред в нашей стране приводил к практике их лабораторного изготовления, что естественно сказывалось на их качестве и стандартности (Раскин Б.М.,1988). Зарубежные фирмы производят питательные среды на основе гидролизатов мяса, сои, казеина, причем, доля питательных сред на основе ферментативных пептонов, переваров и экстрактов мяса составляет более 50 % (Culture Media Manual, bioMe-rieux, 1994; Microbiology Manual «Merck», 1990).

При рассмотрении вопроса замены пищевого белка в составе питательных сред на другие виды сырья, прежде всего, возникают проблемы их доступности и стандартности. В качестве такого источника белка может быть использована рыбная кормовая мука (ГОСТ 2116-82), содержание сырого протеина в которой составляет 60-70 %. При панкреатическом гидролизе этого сырья очевидно, что будет проявляться специфичность фермента, а аминокислотный и пептидный составы, получаемых гидролизатов, могут быть близки к пептонам, получаемым из мяса, рыбы, казеина. Для приготовления такого вида гидролизатов необходимо создать такие технологические стадии, при которых будут реализованы все необходимые условия для получения конечного продукта с заданными свойствами.

Острота проблемы обусловлена возрастающими требованиями санитарно-эпидемиологического надзора по расширению спектра диагностируемых инфекционных заболеваний, среди которых социально-значимые инфекции (ОКИ, дифтерия, туберкулез, др.) занимают одно из лидирующих положений. Разработка технологии и организации производства питательных сред вносят существенный вклад в обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения России.

Цель исследования - разработать технологию производства сухого панкреатического гидролизата рыбной муки и сконструировать на его основе бактериологические питательные среды для выращивания микроорганизмов.

Задачи исследования

1. Выявить альтернативные источники белкового сырья в производстве питательных сред, определить их аминокислотный и минеральный составы.

2. Определить оптимальные параметры получения панкреатического гидро-лизата рыбной муки, изучить биохимический и аминокислотный состав получаемых гидролизатов, провести сравнительные исследования получаемых препаратов с известными аналогами и разработать технологию его производства.

3. Изучить ростовые свойства панкреатического гидролизата рыбной муки с использованием широкого круга микроорганизмов различных таксономических групп, определить состав питательных сред общего назначения питательного агара - ГРМ-агара, питательного бульона—ГРМ-бульона.

4. С использованием панкреатического гидролизата рыбной муки определить оптимальные составы питательных сред для выделения и дифференциации энтеробактерий: среды Эндо-ГРМ агара, Левина-ГРМ агара, Висмут-сульфит-ГРМ агара, SS-arapa.

5. Экспериментально обосновать состав и разработать сухую питательную среду для выделения возбудителя дифтерии, не требующую добавления нативной крови.

6. Разработать комплекс питательных сред для контроля микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств.

7. Разработать нормативно-техническую документацию, провести государственные испытания и зарегистрировать питательные среды в качестве изделий медицинского назначения

Научная новизна

Впервые, с использованием микробиологических, биохимических и мас-спектрометрических исследований показано, что панкреатический гидроли-зат рыбной муки является в физиологическом и химическом отношении полноценным биологическим препаратом для конструирования бактериологических питательных сред. Аминокислотный состав и другие важные для роста бактерий показатели гидролизата находятся на уровне таких классических питательных основ как пептон ферментативный и ферментативные гидроли-заты мяса. В своем составе ПГРМ содержит 3,5 % аминного азота, 10 % общего азота, 18 % свободных аминокислот, 20 % хлористого натрия.

Впервые, на основе исследования параметров роста ряда патогенных бактерий и их основных свойств, важных для диагностических исследований, с использованием разработанного ПГРМ как питательной основы, сконструирован ряд питательных сред для культивирования, выделения и дифференциации бактерий: ГРМ-агар, ГРМ-бульон, Эндо-ГРМ агар, SS-arap, Левина-ГРМ агар, Висмут-сульфит-ГРМ агар.

Впервые, на основе экспериментальных исследований по оптимизации роста возбудителя дифтерии на питательных средах, основу которых составили разработанный препарат ПГРМ и стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, создана питательная среда для выделения этого патогена - ко-ринебакагар, не требующая добавления крови и обеспечивающая рост диф-

терийных бактерий на уровне сред с использованием цельной крови.

Впервые разработаны оптимальные прописи питательных сред для определения микробной обсемененности нестерильных лекарственных средств на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Указанные препараты прошли все этапы государственной регистрации и рекомендованы для применения в практике здравоохранения.

Теоретическая значимость

Обоснована возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки как основы питательных сред для культивирования широкого спектра микроорганизмов. Обоснована возможность замены в рецептуре питательных сред пищевого сырья (пептон ферментативный, ферментативные гид-ролизаты мяса, килька каспийская, кровьи др.) на непищевые компоненты. Разработаны теоретико-методологические основы и методические подходы по замене панкреатический гидролизат кильки каспийской, гидролизат казеина, пептона ферментативного на панкреатический гидролизат рыбной муки. Обоснована возможность замены крови на стимулятор роста гемофильных микроорганизмов в составе питательной среды для выделения возбудителя дифтерии.

Практическая значимость

Разработана технология производства панкреатического гидролизата рыбной муки — утвержден регламент производства ПР № 78095326-63-2006, показатели качества определены в технических условиях ТУ 9385-17-78095326-2006.

На основе панкреатического гидролизата рыбной муки разработана технология производства 40 наименований питательных сред, 37 из которых прошли все этапы государственной регистрации. Среды рекомендованы для применения в практике здравоохранения, были зарегистрированы в Государственном реестре лекарственных средств, в настоящее время включены в реестр изделий медицинского назначения.

Разработанные питательные среды широко используются в бактериологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений здравоохранения и центров гигиены и эпидемиологии при диагностике инфекционных заболеваний, при проведении санитарных исследований объектов внешней среды, питьевой воды, стоков, молочных и мясных продуктов, а также в фармацевтической промышленности при контроле лекарственных средств на микробную загрязненность.

Ежегодно с использованием разработанных препаратов проводится до 50 млн. бактериологических исследований, значительную часть из которых составляют исследования по диагностике кишечных инфекций.

Внедрение в практику

Разработана технология производства 40 наименований питательных сред, 37 из которых прошли все этапы государственной регистрации. На базе ФБУН ГНЦ ПМБ организован промышленный выпуск питательных сред с ежегодным объемом производства более 75 тонн.

Осповные положения, выносимые на защиту

1. Разработана и экспериментально обоснована технология получения

панкреатического гидролизата рыбной муки, являющегося в физиологическом и химическом отношении полноценным биологическим препаратом для конструирования бактериологических питательных сред и полноценной питательной основой для выращивания широкого круга микроорганизмов, не уступающего пептону ферментативному.

2. Панкреатический гиролизат рыбной муки может быть использован в составе микробиологических питательных сред общего назначения лабораторного и промышленного изготовления.

3. Новые составы питательных сред: Эндо-ГРМ агар, Левина-ГРМ агар, Висмут-сульфит-ГРМ агар, SS-arap - обеспечивают выделение и дифференциацию энтеробактерий.

4. Созданная питательная среда - коринебакагар, в состав которой входит панкреатический гидролизат рыбной муки и стимулятор роста гемо-фильных микроорганизмов по ростовым свойствам не уступает средам для выделения возбудителя дифтерии лабораторного приготовления с добавлением нативной крови.

5. Сконструированные сухие питательные среды с использованием панкреатического гидролизата рыбной муки широко используются при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств.

Апробация работы

Диссертация апробирована на межлабораторной научной конференции ФБУН ГНЦ ПМБ 5 октября 2012 г., протокол № 26 .

Результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных научных конференциях: "Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии", 26-27 мая 1988 г., Махачкала; отраслевом совещании "Питательные среды в производстве бактерийных препаратов", 3-4 октября 1989 г., Оболенск; «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии» 1990 г., Махачкала; Всероссийской научно-практической конференции "Принципы и практика борьбы с холерой в Республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тест-систем" 31 октября 1994 г., Махачкала; Всероссийской научно-практической конференции "Актуарные вопросы разработай и производства питательных сред по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения России" с 31 мая по 5 июня 1999 г., Оболенск; Юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" 14-15 декабря 1999 г., Оболенск; Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест - систем" 2001 г. Махачкала; 11-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология. Состояние и перспективы развития" 10-14 ноября 2003 г., Москва; VII Межгосударственной научно - практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств». Оболенск - 2006; XVI научно-практической конференции «Высокие технологии модернизация в лабораторной медицине» 30 марта 2011г., Москва.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 44 работы, в том числе 15 работ в рецензируемых изданиях и 6 патентов на изобретения РФ. Разработано и утверждено 40 регламентов производства и 40 технических условий, получено 37 регистрационных удостоверений. Результаты исследований отражены в 12 научно-исследовательских отчетах ГНЦ ПМ.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения; обзора литературы; 6 глав собственных исследований; заключения; выводов и списка литературы.

Диссертация изложена на 206 страницах, содержит 59 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 201 работу, в том числе 156 отечественных и 45 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

При разработке технологии производства белковых основ в качестве исходного сырья использовали: рыбную кормовую муку (ГОСТ 2112-82), альбумин черный технический (ГОСТ 8115-73), ферментами являлись панкреатин или поджелудочная железа (ТУ 49619-79) и протосубтилин ГЗх (ГОСТ 23636-79).

Определение оптимального режима панкреатического гидролиза рыбной муки выполнено в лабораторных условиях в термостатируемых качалках в колбах вместимостью 250 мл, а также в производственных условиях в аппаратах вместимостью 100 л и 5000 л. Для изготовления сухих белковых основ использовали метод распылительного высушивания на сушилках "Ангидро", "ОДВ-25", "УРС-3Ц-10/50" и сушилке в виброкипящем слое "А1 - ФМУ".

Методика проведения исследований при разработке технологии производства питательных сред проводилась в несколько этапов:

1. Выбор оптимального состава питательной среды на основе панкреатического гидролизата рыбной муки путем изучения физико-химических и биологических показателей питательных сред с использованием тест-штаммов, полученных из ГИСК им. ЛА. Тарасевича.

2. Наработка лабораторных образцов сухих питательных сред и изучение биологических показателей на расширенном наборе микроорганизмов, уточнение состава питательной среды.

3. Наработка экспериментальных серий питательных сред, составление соответствующих актов и паспортов на серии, представление образцов в практические учреждения здравоохранения, проведение исследований на клиническом материале, определение сроков годности разработанных препаратов.

4. Разработка нормативно-технической документации, представление документов и образцов в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитет МИБП, проведение Государственных испытаний, проведение сертификации производства, получение разрешения на выпуск питательной среды, регистрация питательной среды в Государственном реестре лекарственных средств, а в на-

стоящее время в реестре изделий медицинского назначения.

Для определения физико-химических параметров на различных стадиях получения панкреатического гидролизата рыбной муки и сухих питательных сред использованы методы анализа-определения общего азота по Кьельдалю, белка по Лоури, аминного азота методом формольного титрования, редуцирующих веществ ортотолуидиновым методом, сухого остатка весовым методом и рефрактометрическим методом, липидов, золы и протеолитической активности в соответствии с МУК 2.2316-08. Определение прочности студня готовой питательной среды по ГОСТ 26185-84.

Аминокислотный состав панкреатических гидролизатов рыбной муки определяли на аминокислотном анализаторе "Becman-12114",углеводный состав на газовом хроматографе "Hewlett Packard 5890" с масс-спекрометрическим детектором, фракционный состав на жидкостном хроматографе фирмы "Gilson", определение содержания воды с использованием ЯМР-релаксометра "Протон-20", минеральный состав определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре.

Конструирование питательных сред осуществляли в соответствии с методиками, изложенными в нормативных документах, контроль сред по биологическим показателям осуществляли согласно методическим рекомендациям МЗ СССР, методическим указаниям ГИСК им. JI. А. Тарасевича и в соответствии с требованиями, изложенными в соответствующих фармакопейных статьях. Определение скорости роста, диаметра и высоты колоний с ранее разработанной методикой в ГНЦ ПМ.

Для контроля питательных сред использовали тест-штаммы: для ГРМ-агара — S.flexneri la 8516, S. sonnei «S form», P. aeruginosa 27/99, S.marcescens 1; для ГРМ-бульона - С. xerosis 1911, S.flexneri la 8516, S. typhi H-901 ГДР/ГИСК, S. aureus Wood-46, P. aeruginosa 27/99, E. coli 3912/41 (055:K59); для агара Эндо - S. sonnei «S form», S. dysenteriae I 1362, E. coli 3912/41 (055:K59), £ coli 168/59 (0111:K58), S. aureus Wood-46; для среды Левина - S.flexneri la 8516, К coli 168/59 (0111-.K58), S. aureus 209-P (АТСС 6538-P); для висмут-сульфит агар - 5. typhi Н-901 ГДР/ГИСК, S. typhimurium 79, S. paratyphi A 225, S. london 3496, S. gallinarum 665, S. typhi "bismuth",S. aureus Wood-46, K. rhinoscleromatis NCTC 5046, P. vulgaris HX 19 222 ; для SS-агара-5. typhi H-901 ГДР/ГИСК, S. paratyphi A-225, S. flexneri la 8516, S. sonnei "S form", S. aureus Wood-46, P. mirabilis 3177, P. vulgaris HX 19 222;для коринебакагара-С. diphtheriae gravis 665, С. diphteriae mitis 6765,C. xerosis 1911, C.ulcerans 675, S. aureus Wood-46, S. pyogenes Dick I.

Статистическая обработка результатов.

Оптимизацию компонентных составов питательных сред проводили методом полного факторного эксперимента. Исследования при конструировании питательных сред были направлены на варьирование содержания основных компонентов, обеспечивающих ингибирующие и дифференцирующие свойства сред. Матрицы планирования полных факторных экспериментов с факторами в двух уровнях позволили получить модель, обладающую оптимальными свойствами.

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ Statistica для Windows версии 5.0 и Microsoft Office Excel 2007, рассчитывая среднюю арифметическую, стандартную ошибку и доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальное обоснование технологии получения панкреатического гидролизата рыбной муки

Показатель Данные литературы Авторские данные

Сырой протеин, % 60-66 60-75

Жир, % 3,4-9,7 6,0-14,0

Влага, % 6,2-9,3 4,0-12,0

Зола, % 10,0-20,0 14,0-19,0

Аминокислоты, г/100 г белка

Аспарагиновая кислота 9,15±0,31 10,98±0,45

Треонин 4,19*0,2 4,96±0,21

Серии 4,08±0,37 5,48±0,33

Глутамшювая кислота 12,68±0,35 14,58±1,64

Пролин 4,70±0,51 4,60±1,02

Глицин 7,23±1,44 6,74±1,23

Алании 6,29±0,24 6,56±0,45

Валии 5,17±0,33 4,98±0,96

Метионин 2,78±0,11 3,30±0,21

Изолейцин 4,37±0,31 4,18±0,46

Лейцин 7,21±0,36 8,34±0,27

Тирозин 3,16±0,26 3,60±0,06

Фенилаланин 3,90±0,29 4,26±0,34

Лизин 7,53±0,34 7,32±0,83

Гистидин 2,60±0,47 3,16±0,69

Аргинин 6,07±0,24 7,52±0,64

Макроэлементы, %:

Кальций 4,79±2,20 4,81±1,07

Фосфор 2,97±1,19 Не определяли

Натрий 0,54±0,23 0,83±0,02

Магний 0,16±0,05 0,14±0,02

Калий 0,87±0,21 0,53±0,08

Микроэлементы, мг%

Железо, мг% 28,0±10,0 22,0i9,0

Медь, мг% 0,96±0,24 1,6±1,9

Цинк 12,0±1,9 6,3

Марганец 1,44±1,25 0,5

Рыбная кормовая мука, производство которой в мире превышает 5 млн. тонн в год, является непищевым белковым сырьем с высоким содержанием сырого протеина. Установлено, что рыбная мука содержит 60-70 % сырого протеина, 7-14 % жира, 14-19 % золы и 4-12 % влаги. Содержание аминокислот, микро и макроэлементов является достаточно постоянной величиной (табл.1). По основным компонентам, определяющим питательную ценность белковых гидролизатов, рыбная кормовая мука является ценным белковым сырьем в производстве питательных сред, удовлетворяющая требованиям доступности и стандартности.

С целью определения оптимального режима ферментативного гидролиза изучено влияние следующих параметров: продолжительность гидролиза; температура гидролизуемой смеси; расход ферментного препарата; концентрация рыбной муки (гидромодуль). Контроль за процессом гидролиза проводился по основным биохимическим показателям и аминокислотному составу, ростовые свойства полученных гидролизатов, изучались на модели сухого питательного бульона и сухого питательного агара. Общий и аминный азот, мг %

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 о

/Г -ф-

—X -

-V / \ &

——

Время, ч

Рисунок 1— Динамика накопления общего (кр. 1-3) и аминного азота (кр. 4-6) в панкреатических и ферментативных гидролизатах рыбной муки при различном гидромодуле (Т = 50 °С, панкреатин - 5 %).

1,4-гидромодуль 1:5; 2,5-гидромодуль 1:7; 3.6- гидромодуль 1:10.

Динамика накопления аминного азота в ферментативных гидролизатах рыбной муки при различном гидромодуле представлена на рисунке 1. Значительное накопление аминного азота наблюдается за первые 4-6 ч гидролиза и достигает 280, 350 и 450 мг% при гидромодуле 1:10; 1:7 и 1:5, соответственно. Дальнейшее увеличение продолжительности гидролиза приводит к увеличению содержания аминного азота лишь на 5-6 мг% за каждый час гидро-

лиза. Аналогичная зависимость наблюдается и для общего азота. При гидролизе рыбной муки в течение 6 ч содержание общего азота в гидролизатах при гидромодуле 1:10; 1:7 и 1:5 составляет 900, 1200 и 1550 мг%, соответственно.

э-

я ч о

к л с: ш

а о о и н о

и о л и о о я т з о я

О)

Время, ч

Рисунок 2 — Пептидный профиль гидролизатов при различном времени

гидролиза. 1 - сухой ПГРМ; 2 - 6 ч; 3 раствор рыбной муки.

1 ч; 4 - 30 мин; 5-15 мин; 6 -

Пептидный профиль гидролизатов, полученных при различном времени гидролиза представлен на рисунке 2. Анализ представленных данных позволяет предположить, что при данных условиях гидролиза рыбной муки (температура 50 °С, гидромодуль 1:5, содержание панкреатина — 5 %) в первый час гидролиза интенсивно происходит процесс ферментативного переваривания белка рыбной муки, в результате которого образуется сложная смесь белковых продуктов - высокомолекулярные растворимые белки (м.в. ~ 40000) про-теазы (м.в. ~ 6000), собственно пептоны (м.в. ~ 2000), ди, три-пептиды и свободные аминокислоты. В этот момент скорость накопления аминного азота падает более чем в 5 раз (от 500 мг%/ч до 100 мг%/ч) За последующие 3 ч гидролиза скорость накопления аминного азота падает еще в 10 раз (от 100

мг%/ч до 10 мг%/ч). При увеличении продолжительности гидролиза после 4 ч происходят реакции с низкими скоростями (скорость накопления аминного азота составляет 5 мг%/ч) гидролиза растворимых полипептидов до более низкомолекулярных соединений (ди, три-пептиды, свободные аминокислоты).

Для определения оптимального температурного режима эксперименты по ферментативному гидролизу панкреатином и поджелудочной железой проводили в интервале температур 22-58 °С. Панкреатические гидролизаты рыбной муки, полученные при температуре 50 °С и времени гидролиза 4-8 ч характеризуются высоким содержанием лейцина (5,4-5,8 г/л), тирозина (2,7-2,8 г/л), фе-нилаланина (2,4-2,7 г/л), лизина (3,3-3,7 г/л) и аргинина (4,1-6,4 г/л). Содержание других аминокислот составляет от 0,3 до 1,5 г/л. Такой аминокислотный состав гидролизатов рыбной муки определяется специфичностью ферментативного действия панкреатина, который наиболее активен в отношении пептидных связей аргинина, лизина, тирозина, триптофана, фенилаланина и лейцина.

Ферментативное переваривание рыбной муки при комнатной температуре представляет интерес только для их лабораторного изготовления, поскольку высокий выход аминного азота и свободных аминокислот удается получить за 3-7 суток, что является не технологичным при крупномасштабном производстве белковых гидролизатов. В переварах рыбной муки отмечается более высокое содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот, что в ряде случаев повышает питательную ценность белковой основы (табл. 2).

С повышением температуры скорость инактивации фермента возрастает, однако отношение Н^/Н^щ. в зависимости от температуры в интервале 34-58 °С практически остается постоянной величиной и составляет 32,3±1,8 %. Определение оптимального значения рН гидролизуемой смеси показало, что эта зависимость выражается кривой с максимумом при рН равном 8,0, что является типичным для реакции ферментативного гидролиза.

Экспериментальные данные по выбору оптимальной концентрации гид-ролизующего агента показали, что существуют две области - до и после 5 % панкреатина, значительное повышение концентрации аминного азота при 5 % ферменте и более медленное при дальнейшем увеличении содержания панкреатина в реакционной смеси. При содержании фермента менее 5 % отношение Нам/Ыобщ. имеет значение 20-22 %, повышение содержания панкреатина приводит к повышению этого отношения до 28-30 %. Аналогичная зависимость наблюдалась и в случае использования в качестве фермента поджелудочной железы.

Сравнение относительного аминокислотного состава гидролизатов полученных с использованием поджелудочной железы и панкреатина показывает, что оба вида ферментативных гидролизатов характеризуются высоким содержанием лейцина, тирозина, фенилаланина, лизина и аргинина (табл. 2).

Выбор оптимального гидромодуля в пределах от 1:5 до 1:10, как наиболее технологически приемлемый, должен определяться степенью извлечения готового продукта. Поскольку гидролизаты рыбной муки трудно

фильтруются на рамных фильтр-прессах для получения готового продукта, был предложен метод декантации.

Таблица 2 — Аминокислотный состав ферментативных гидролизатов рыбной муки, г/л__

Панкреатин, 5 % Поджелудочная железа 40 %

1:5 1:10 1:5 (37 °С) 1:10 (50 °С)

6ч 12 ч 6ч 12 ч 6ч 24 ч 6ч 12 ч

Аспарагиновая кислота 0,25 0,48 0,17 0,44 0,60 1,67 0,54 0,76

Треонин 0,89 0,55 0,72 0,94 1,87 0,76 0,88

Серии 0,54 0,38 0,49 1,10 1,92 0,90 1,03

Глутаминовая кислота 0,90 1,56 0,53 0,77 1,95 3,76 1,53 1,73

Глицин 0,26 0,4 0,16 0,25 0,59 0,92 0,49 0,58

Алании 1,29 2,33 0,82 1Д1 2,40 3,43 1,80 1,93

Валим 1,40 2,43 0,89 1,25 2,19 3,63 1,65 1,69

Метионин 0,91 1,40 0,63 0,92 1,22 1,94 0,93 0,93

Изолейцин 1,38 2,46 0,91 1,26 1,91 3,24 1,48 1,50

Лейцин 4,66 7,82 2,7 3,62 5,20 7,4 3,98 4,02

Тирозин 2,28 1,72 1,32 1,77 1,60 1,58 1,76 1,73

Фенилаланин 2,18 3,67 1,30 1,77 2,28 3,27 1,78 1,76

Лизин 2,76 4,88 1,52 1,99 3,62 4,87 2,61 2,56

Гиегадин 0,60 0,73 0,37 0,38 0,81 1,22 0,56 0,39

Аргинин 3,5 5,66 2,07 2,61 4,28 5,36 3,12 3,07

Сумма аминокислот 23,8 38,8 14,28 19,45 30,67 46,10 23,83 24,56

Исходя из экспериментальных данных по изучению биохимического и аминокислотного состава гидролизатов, были определены следующие параметра гидролиза: продолжительность гидролиза -6 ч, температура - 48 °С, pH - 8,0, концентрация панкреатина - 5 % от веса сырья (концентрация поджелудочной железы - 40 % от веса сырья), гидромодуль - 1:8. Осветление ферментативных гидролизатов осуществляли путем двойной фильтрации растворов после осаждения в изоэлектрических точках белков при pH 4,0 и pH 8,0. Для получения сухих белковых гидролизатов использовали метод распылительного высушивания. Для определения оптимальных режимов высушивания эксперименты проводили на лабораторной сушилке "Ангидро". Выбраны следующие режимы сушки ПГРМ: температура воздуха на входе -150-165 °С, температура воздуха на выходе- 78-80 °С

В 1990 году разработана и утверждена нормативно-техническая документация на производство опытной партии в объеме 60 тонн сухого панкреатического гидролизата рыбной муки — ОПР 64-15-12-90 и ТУоп. 64-15-12090. Технические условия были согласованы с НПО «Питательные среды» (г. Махачкала), утверждены и зарегистрированы Министерством медицинской промышленности СССР.

Таблица 3 - Состав панкреатических гндролизатов, %

Аминокислота, элемент ПГРМ Панкреатический гид-ролизат отходов мяса криля Гидролизат кильки каспийской

Аспарагиновая кислота 0,51±0,07 0,63 0,85

Треонин 0,62±0,05 0,60 0,85

Серии 0,44±0,06 0,40 0,85

Глутаминовая кислота 0,66±0,0б 0,53 1,25

Глицин 0,2±0,02 0,23 0,7

Алании 0,97±0,09 0,80 0,4

В алии 1,08+0,13 1,00 1,55

Метионин 0,61 ±0,09 0,50 0,85

Изолейцин 1,0б±0,07 1,00 1,35

Лейцин 3,08+0,25 2,50 3,05

Тирозин 1,38±0,31 1,00 1,55

Фенилаланин 1,57±0,16 1,74 1,6

Лизин 3,22±0,40 2,50 2,6

Гистидин 0,4б±0,12 0,36 1,25

Аргинин 3,0±0,61 3,00 2,15

Триптофан не опред. 0,33 не опред.

Калий 1,00±0,04 не опред. 0,89

Натрий 5,05±0,50 Тоже 14,7

Кальций 0,3±0,07 .". не опред.

Магний 0,16+0,02 0,02

Железо, мг% 4,1±1,9 1,5

Медь, мг% 0,4+0,2 0,6

Свинец, мг% 0,1 .". не обнаруж.

В соответствии с разработанными опытно-промышленным регламентом и техническими условиями в 1990-1991 гг. наработано 16 опытных партий сухого ПГРМ. По всем показателям опытные партии соответствуют требованиям технических условий. Наряду с этим, определен аминокислотный и минеральный состав 10 опытных партий сухого ПГРМ, средние значения которых в сравнении с гидролизатами из кильки каспийской и отходов производства мяса криля представлены в таблице 3.

Сходство биохимического, аминокислотного и минерального состава гидролизатов ПГРМ и кильки каспийской позволяют сделать вывод о возможности широкого использования ПГРМ в составе различных дифференциально-диагностических сред, что подтверждено результатами биологических испытаний, выполненных в различных учреждениях страны.

Исследования, проведенные в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, позволили установить, что сухой ПГРМ может быть рекомендован для конструирования бактериологических питательных сред различного назначения. В НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) изучены биологические свойства трех серий ПГРМ на моделях 10 наименований питательных сред, предназначенных для культивирования, выделения и идентификации энтеробактерий. Показана возможность использования ферментативного гидролизата рыбной

муки в качестве питательной основы в составе срсд, имеющих промышленный выпуск. К такому же выводу пришли сотрудники НПО «Аллерген» (г. Ставрополь) после испытаний панкреатического гидролизата рыбной муки.

В дальнейшем в результате проведенных исследований были внесены некоторые уточнения в технологический процесс ферментативного гидролиза, связанные с корректировкой рН в первые часы гидролиза; в 2006 году разработаны новые технические условия -ТУ 9385-17-78095326-2006 (рис.3).

Рисунок 3. Технологическая схема производства сухого ПГРМ

ПГРМ представляет собой однородный мелкодисперсный, гигроскопичный порошок светло-желтого цвета со следующими показателями:

аминный азот, %..................................................не менее 3,0

общий азот, %......................................................не менее 9,0

массовая доля натрия хлористого, %.................14,0-26,0

массовая доля влаги, не более %.........................7,0

Определение состава сухого питательного бульона и сухого питательного агара на основе ПГРМ

Результаты авторских исследований, полученные на первом этапе работ и заключения сторонних организаций (НПО «Питательные среды» (г. Махачкала), ГИСК им. Л .А. Тарасевича, НПО "Аллерген" (г. Ставрополь) показали принципиальную возможность использования ПГРМ в составе питательного бульона и питательного агара. Задачей дальнейших исследований явилось

изучение влияния условий получения ПГРМ на биологические показатели питательного бульона и питательного агара, выбор оптимального состава, наработка экспериментальных серий сухих препаратов и определение факторов, влияющих на стандартность физико-химических и биологических свойств.

При разработке технологии получения сухого питательного бульона определены ростовые свойства ПГРМ в отношении С. xerosis 1911,5. pyogenes Dick I, S. typhi H-901, S.flexneri la 8516 и показано, что панкреатические гидроли-заты рыбной муки обладают хорошими ростовыми свойствами.

При определении ростовых свойств питательного бульона были приготовлены 6 серий ГРМ-бульона, полученных путем высушивания ПГРМ совместно с хлоридом натрия. Результаты биологической проверки показали, что ГРМ-бульон на основе ПГРМ обеспечивает рост всех тест-штаммов. Результаты экспериментов по изучению динамики роста :Е. coli К-2 S. typhi Н-901, Р. aeruginosa, S. aureus 209-Р, S. sonnei «S form», S. pyogenes Dick I, S. flexneri la 8516, C. xerosis показали хорошее сходство между предлагаемым препаратом и коммерческим питательным бульоном.

Получена новая питательная среда - ГРМ - бульон следующего состава г/л:

панкреатический гидролизат рыбной муки...............18,0

натрия хлорид...................................................2,0.

В соответствии с проведенными исследованиями и разработанной документацией - ТУ 9398-021-78095326-2006 - ГРМ-бульон - универсальная питательная среда для получения накопительных культур микроорганизмов различных таксономических групп может быть использована в санитарных исследованиях пищевых продуктов и воды. При необходимости может быть обогащена углеводами, сывороткой, желчью.

При разработке технологии производства другого препарата общего назначения - сухого питательного агара изучалось влияние различных параметров гидролиза параметров на рост некоторых тест - штаммов. Изменение продолжительности гидролиза от 4 до 24 ч и содержание фермента от 0,5 до 5 % не оказывает значительного влияния на рост тест - штаммов. При посеве 100 м.к S.flexneri через 19 ч инкубации при 37 °С вырастают бесцветные, прозрачные, круглые колонии, диаметром 1,5±0,5 мм по количеству (30-70 кол.) не уступающие контрольной среде. Вырастающие колонии S. sonnei «S form» практически всегда находились в S - форме в отличие от коммерческого питательного агара, для которого чаще обнаруживались колонии в переходной или R - форме.

На гидролизатах рыбной муки, в отличие от коммерческого питательного агара, наблюдалось более ранее образование пигмента у S. marcescens и Р. aeruginosa (эксперименты выполнены при посевной дозе 100 м.к. указанных микроорганизмов). Образование пигмента не зависело от режима гидролиза рыбной муки (0,5-5,0 % панкреатина).

Для определения оптимального содержания ПГРМ в составе питательного агара были выполнены эксперименты по определению скорости роста

и диаметра колоний S. Jlexneri и S. paratyphi при различном содержании ПГРМ составе питательного агара. Повышение содержания ПГРМ в составе питательного агара приводит к увеличению скорости роста и диаметра колоний изученных тест-штаммов. При содержании ПГРМ в составе питательного агара 5,0 г/л S. paratyphi растет со скоростью 0,08 мм/ч и через 24 ч инкубации имеют диаметр колоний 1,3-1,5 мм, а при содержании ПГРМ в составе питательного агара 25,0 г/л указанный тест-штамм растет со скоростью 0,13-0,16 мм/ч и диаметр 2,22-2,8 мм.

Для S. Jlexneri изменение содержания ПГРМ в составе питательного агара от 5,0 до 25,0 г/л также приводит к увеличению скорости роста от 0,05 до 0,12 мм/ч и диаметру колоний от 0,96 до 1,9-2,4 мм. При содержании ПГРМ равным 24,0 г/л, размер колоний, который образуется через 19 ч культивирования, не отличается от размера колоний на коммерческом питательном агаре и составляет 1,6-1,8 мм.

Наработаны экспериментальные образцы ГРМ-агара и проведены испытания на базе ГИСК им. JI.A. Тарасевича, Московского городского центра Госсанэпиднадзора и Федерального центра Госсанэпиднадзора. Результаты проведенных исследований дали заключение о возможности применения ГРМ-агара в практике здравоохранения.

Анализ экспериментальных данных позволил разработать питательную среду ГРМ-агар следующего состава, г/л:

панкреатический гидролизат рыбной муки.......24,0

натрия хлорид............................................4,0

агар.........................................................11,0

В соответствии с разработанной документацией ТУ 9398-020-780953262006 - ГРМ-агар предназначен для культивирования широкого спектра микроорганизмов. Может быть использована в санитарных исследованиях воды, стоков и других материалов. При необходимости может быть обогащена углеводами, кровью, сывороткой и т.д.

Разработка состава питательных сред для выделения и дифференциации энтеробакгерий

При выделении из клинического материала принадлежность к семейству Enterobacteriaceae устанавливают по культуральным, морфологическим, тинк-ториальным, ферментативным и антигенным свойствам. Большинство видов ферментирует глюкозу с образованием органических кислот (молочная, муравьиная, уксусная и др.). Для выявления ферментативной активности обычно используют дифференциально-диагностические среды Эндо, Левина, висмут-сульфит и бактоагар Плоскирева. Все среды селективны для грамотрицатежных бактерий, содержат вещества, ингибирующие рост грамположительных кокков. Питательная среда ЭНДО-ГРМ-агар

Для дифференциации лактозоферментирующих энтеробакгерий используется питательная среда, включающая в качестве ингибитора грамположительных микроорганизмов сульфит натрия и основной фуксин, из-

вестная как агар Эндо.

Таблица 4 - Биологические свойства различных серий питательной среды Эндо-ГРМ___

№ се- Тест-штаммы

рии Количество колоний, d (мм)

агара S. sonnei 5. 4'узеп- Е. coli 168/59 Е. coli S. sonnei X (¡уэеп- S.

Эндо "S form" 1епае I (0111:К58) 3912/41 "Sform"/ ггпае I aureus

1362 (055: К59) Е. coli 1362!Есо1 Wood-

168/59 13912/41 46

№1 51 43 54 72 четкая четкая нет

1,5-2,5 1,0-1,5 1,5-2,5 2,0-3,0 дифф. дифф. роста

круглые, круглые, круглые, ма- круглые,

прозрачные, прозрач- линов. со малинов.

бл.розовые ные, слаб, металл. металл.

№2 56 34 35 70 четкая четкая нет

1,5-2,5 1,0-1,5 1,5-2,5 2,0-3,0 дифф. дифф. роста

круглые, круглые, круглые, ма- круглые,

прозрач- прозрач- линов. со малинов.

ные, ные, слаб. металл.

бл.розовые бесцв. металл, блеск блеск

№3 53 31 63 86 четкая четкая нет

1,5-2,5 1,0-1,5 1,5-2,5 2,0-3,0 дифф. дифф. роста

круглые, круглые, круглые, ма- круглые,

прозрач- прозрач- ЛИ1ЮВ. со малинов.

ные, ные, слаб. металл.

бл.розовые бесцв. металл, блеск блеск

Кон- 47 39 35 64 четкая четкая нет

троль 1,5-2,0 1,0-1,5 1,5-2,0 1,5-2,5 дифф. дифф. роста

агар круглые, круглые, круглые, ма- круглые,

Эндо прозрач- прозрач- линов. со малинов.

(г.Ма ные, ные, слаб. с металл.

хач- бл.розовые бесцв. металл, бле- блеском

кала) ском

Проведены исследования по оптимизации состава питательной среды -агара Эндо на основе панкреатического гидролизата рыбной муки по основным компонентам. Увеличение содержания натрия сульфита в среде до 1,2 г/л не оказало существенного влияния на качество питательной среды. При исключении из состава агара Эндо натрия фосфата двузамещенного колонии 5. зотгег и 5. (¡уяеМепае вырастают в 811 форме диаметром 0,5-1,5 мм, кроме того, среда окрашена в малиновый цвет, что значительно ухудшает дифференциацию. Увеличение содержания лактозы до 13,0 г/л не оказывает влияния на качество питательной среды.

По культурально-морфологическим свойствам вырастающих колоний лабораторные образцы сухой питательной среды Эндо-ГРМ агар не уступают коммерческим препаратам (табл. 4). По совокупности экспериментальных данных была разработана питательная среда Эндо-ГРМ (ТУ 9398-027-

780955326-2007) следующего состава, г/л:

панкреатический гидролизат рыбной муки............12,0

экстракт пекарных дрожжей..................................................1,0

натрий хлористый............................................................................3,4

Д- (+)-лактоза,......................................................................................10,0

сульфит натрия безводный........................................................0,8

натрий фосфорнокислый 2-зам.12 водный..............0,5

фуксин основной................................................................................0,2

агар микробиологический........................................................10,0±3,0

Проведены государственные испытания препарата, приказом Министра здравоохранения № 206 от 14.07.1997г. питательная среда разрешена для медицинского применения. В 2007 г. зарегистрирована в качестве изделия медицинского назначения.

Питательная среда Левина-ГРМ-агар

Концентрации лактозы и красителей в среде Левина с эозин-метиленовым голубым отработаны и практически не отличаются друг от друга. Поэтому при выборе оптимального состава среды Левина с использованием панкреатического гидролизата рыбной муки использовали известные концентрации лактозы и красителей.

В состав разрабатываемой среды вносили двузамещенные фосфаты калия и натрия в концентрации 2,0 и 0,7 г/л соответственно. Результаты исследования показали, что использование двузамещенного фосфата натрия в концентрации 0,7 г/л обеспечивает достаточную буферность в среде и позволяет получить питательную среду со стабильными ростовыми свойствами. Колонии Kcoli 168/59 (0111:К58) приобретают более яркий металлический зеленоватый цвет, колонии S. aureus 209-Р (АТСС 6538-Р) образуют темный центр.

Панкреатические гидролизаты рыбной муки с добавлением экстракта или автолизата пекарных дрожжей обеспечивают через 19-20 ч инкубации при температуре (37±1) °С рост шигелл в виде бесцветных или бледно-розовых колоний диаметром 1,0-1,5 мм, а эшерихий растут в виде круглых фиолетовых колоний с металлическим блеском диаметром 1,5-2,0 мм. Колонии стафилококка через 48 ч инкубации прорастают на данных средах в виде колоний диаметром до 1,0 мм с темным центром.

Свойства экспериментальных образцов сухой питательной среды Леви-на-ГРМ- агар изучались в несколько этапов с использованием музейных тест-штаммов, имеющихся в коллекции ГНЦ ПМ, свежевыделенных клинических штаммов и клинического материала на базе централизованной лаборатории клинической микробиологии ЦРБ г. Серпухова.

На десяти сериях питательной среды Левина-ГРМ наблюдается примерно одинаковый рост использованных тест-штаммов, не уступающий контрольной среде. S.flexneri la 8516 на питательной среде Левина-ГРМ вырастала в виде бесцветных круглых колоний, количество которых в ряде случаев превосходило контрольную среду и не уступало по их размеру (1,0-1,5 мм). Е. coli 168/59 (0111:К58) на всех десяти сериях питательной среды вырастала

в виде колоний фиолетового цвета с металлическим блеском диаметром 1,0-1,5 мм. На контрольной среде металлический блеск отсутствовал. Наличие металлического блеска позволяет более четко дифференцировать штаммы Е. coli 168/59 (0111:К58) от S.flexneri la 8516 на испытуемой среде по сравнению с контрольной.

Колонии S. aureus 209-Р (АТСС 6538-Р) на среде Левина-ГРМ не отличались от контрольной среды - были круглыми с темным центром диаметром до 1,0 мм. Шигеллы и сальмонеллы вырастали в виде бесцветных колоний диаметром от 1,0 до 1,8 мм, количество колоний не уступало этому же показателю на контрольной среде и ГРМ - агаре. Эти данные свидетельствуют о высокой чувствительности среды Левина — ГРМ, не уступающей контрольной среде. Е. coli 3912/14 (055:К59) вырастала в виде колоний фиолетового цвета в отличие от колоний Е. coli 168/59 (0111:К59), имеющих дополнительно металлический блеск.

Следующим этапом исследований явилось изучение биологических свойств среды Левина-ГРМ на широком наборе музейных штаммов (27 наименований) не только энтеробактерий, но и других микроорганизмов.

При посеве на чашки Петри с экспериментальной средой лактозоотрица-тельные тест-штаммы S. sonnei, S. dysenteriae, S.flexneri, S. typhi, S. paratyphi A и В, S. typhimurium, a также H alvei, A. faecalis, P. aeruginosa, S. faecalis, P. inconstans и P. morganii образуют бесцветные колонии диаметром 1,0-2,5 мм, процент прорастания при этом составляет не менее 70 %. На контрольной среде Левина рост данных тест-штаммов аналогичен, но S. typhi, S. typhimurium, S. sonnei образуют колонии несколько крупнее в диаметре, а колонии S. sonnei в SR-форме. Колонии розового цвета на исследуемой и контрольной средах образовывали тест-штаммы К. pneumoniae Е. aerogenes, Е. cloaceae и С. jreundii, причем колонии К. pneumoniae крупные, слизистые, диаметром 2,0-2,5 мм. При росте P. vulgaris НХ-19 222, P. vulgaris HX-L 19 4636 и P. mirabilis 3177 наблюдалось сплошное роение на обеих контролируемых средах. При росте P. inconstans и P. morganii роение отсутствовало. При посеве на чашки Петри с испытуемой средой S. epidermidis и S. saprophyticus через 48 ч инкубации наблюдался рост в виде мелких колоний диаметром до 0,8 мм, бесцветных или розового цвета. Эти же тест-штаммы на контрольной среде Левина образовывали бесцветные или розовые колонии диаметром от 0,9 до 1,2 мм. Темные колонии диаметром до 1,0 мм наблюдались при росте на чашках Петри и с испытуемой и контрольной средами S. aureus Wood-46 и S. aureus 209-D (АТСС 6538-B).

Е. coli 3912/41(055:К59) и Е. coli 168/59 (0111:К58) образуют на экспериментальной среде фиолетовые колонии, диаметром 1,5-2,0 мм. Колонии Е. coli 168/59 (0111:К58) с характерным металлическим блеском, что обеспечивает четкие дифференцирующие свойства среды. На контрольной среде Левина эти тест-штаммы образовывали фиолетовые колонии диаметром 1,52,5 мм, но металлический блеск отсутствовал.

Произведено 50 посевов фекалий от пациентов инфекционного стационара

и поликлиник г. Серпухова с подозрением на ОКИ. Выделено 11 культур, подозрительных на энтеробактерии, в том числе 2 штамма шигелл Зонне.

По ростовым, дифференцирующим и ингибирующим свойствам экспериментальная партия среды Левина-ГРМ не уступает контрольной, а в одном случае при выделении подозрительных на шигеллы колоний даже превосходит контрольную по дифференцирующим свойствам. Колонии лактозо-положительных культур микроорганизмов на испытуемой среде имеют четкую темно-фиолетовую или темно-синюю окраску, некоторые штаммы приобретали зеленый (металлический) блеск. Лактозоотрицательные микроорганизмы образовывали на экспериментальной среде бесцветные или нежно-розовые колонии различной консистенции.

Испытуемая среда, как и контрольная не ингибировала рост энтерококков, стафилококков и грибов при посеве нативного клинического материала.

По результатам исследований составлена пропись питательной среды с эозин-метиленовым голубым среда Левина-ГРМ (ТУ 9385-054-780953262008) для выделения энтеробактерий следующего состава в г/л:

панкреатический гидролизат рыбной муки..........................................12,0

экстракт пекарных дрожжей..............................................................................1,0

лактоза....................................................................................................................................10,0

натрий фосфорнокислый 2-зам....................................0,7

натрий хлористый........................................................4,2

эозин-Н..................................................................................................................................0,4

метиленовый голубой................................................0,065

агар микробиологический................................................................................9,0+3,0

Питательная среда Левина - ГРМ с 2008 года зарегистрирована в качестве медицинского изделия - ФСР 2008/03063.

Питательная среда висмут-сульфит-ГРМ-агар Содержание глюкозы, двузамещенного фосфата натрия и сульфата железа в составе висмут-сульфит агара различных изготовителей практически одинаково, оптимизация компонентного состава питательной среды для выделения сальмонелл на основе ПГРМ проводилась по трем факторам, определяющим ее ингибирующие и дифференцирующие свойства, т.е. по содержанию висмута лимоннокислого, сульфита натрия и бриллиантового зеленого.

Эксперименты с использованием метода планирования полного факторного эксперимента позволили получить пропись питательной среды для выделения сальмонелл на основе панкреатического гидролизата рыбной муки, сбалансированную по компонентному составу и концентрации компонентов, определяющих ее основные свойства.

Определение оптимального содержания аминного азота в среде показало, что висмут-сульфит-ГРМ агар с содержанием аминного азота 50-60 мг% не обеспечивает рост тест-штамма P. vulgaris НХ 19 222, рост S. gallinarum 665 наблюдался в виде точечных колоний, а продуцирующие сероводород тест-штаммы сальмонелл образовывали коричневые колонии со слабым металлическим блеском, что несколько затруднило дифференциацию. Увеличение

концентрации аминного азота выше 100 мг% приводит к снижению ингиби-рующих свойств среды в отношении E.coli, а ряд сальмонелл на таких средах образуют крупные, серые, слизистые колонии. Оптимальное содержание аминного азота в висмут-сульфит-ГРМ агаре 80-100 мг%, что обеспечивает рост тест-штаммов сальмонелл, используемых для контроля, в достаточной степени подавляет рост Exoli и тем самым обеспечивает дифференциацию сальмонелл.

Биологические свойства питательной среды для выделения сальмонелл (висмут-сульфит-ГРМ-агар) изучались в несколько этапов с использованием музейных штаммов, имеющихся в коллекции ГНЦ ПМ, свежевыделенных клинических штаммов и клинического материала на базе клинических лабораторий г. Тулы, Серпухова и Калуги.

Установлено, что разработанная среда обладает достаточно высокой чувствительностью и обеспечивает рост тест-штаммов сальмонелл при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10"7 (10 м.к.). Через 24 ч инкубации колонии тест-штаммов S. typhi Н-901 ГДР/ГИСК, S. typhi «bismuth», S. typhimurium 79, S. london 3496 прорастают в виде круглых, зелено-коричневых колоний с потемнением среды вокруг и металлическим блеском. Колонии S. paratyphi А-225 - круглые, прозрачные. Рост Е. coli 3912/41 (055:К59) может наблюдаться в виде точечных колоний. Уже через 24 ч на данной среде возможна предварительная дифференциация. Через 48 ч инкубации на висмут-сульфит-ГРМ агаре колонии S. typhi Н-901 ГДР/ГИСК, S. typhi «bismuth», S. typhimurium 79 и S. london 3496 становятся черными с металлическим блеском и потемненнием среды. При снятии колоний бактериологической петлей остается черный след. S. paratyphi А-225 - круглые, зеленые с темным центром, a S. gallinarum 665 образует зелено-коричневые, круглые колонии диаметром 0,8-1,2 мм. На среде полностью подавляется рост тест-штаммов S. aureus Wood-46 и К. rhinoscleromatis NCTC 5046 и роение P. vulgaris НХ 19 222. На висмут-сульфит-ГРМ агаре ингибируется рост тест-штаммов Е. coli 3912/41.

Характер роста 47 тест-штаммов при посеве на чашки Петри с экспериментальной и контрольной средами показал, что на экспериментальной среде, как и на коммерческом висмут-сульфат агаре, тест-штаммы, продуцирующие сероводород, вырастают в виде черных колоний с потемнением среды и металлическим блеском. Чувствительность экспериментальных сред в отношении сальмонелл не уступала контрольной - процент прорастания составлял 90-100 % к контролю роста тест-штаммов на ГРМ-агаре. По ростовым и дифференциально-диагностическим свойствам висмут-сульфит-ГРМ агар производства ГНЦ ПМ соответствует аналогичной среде производства НПО "Питательные среды" (г. Махачкала).

Разработана питательная среда висмут-сульфит-ГРМ-агар (ТУ 9398-04678095326-2008) следующего состава, г/л:

панкреатический гидролизат рыбной муки................ 24,0

дрожжевой экстракт пекарных дрожжей................... 1,0

натрий хлористый................................................ 2,0

глюкоза............................................................................................................................5,0

натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный.... 4,0

висмут лимоннокислый....................................................................................1,2

натрия сульфит..........................................................................................................4,0

железа (II) сульфат................................................................................................0,5

бриллиантовый зеленый..................................................................................0,01

агар....................................................................................................................................13,0+2,0

Питательная среда висмут-сульфит ГРМ-агар зарегистрирована в качестве изделия медицинского назначения (РУ № ФСР 2008/03237) и разрешена к медицинскому применению.

Питательная среда SS-arap

Отечественная коммерческая среда для выделения шигелл и сальмонелл — бактоагар Плоскирева не обладает достаточными ингибирующими свойствами по отношению к кишечной палочке и роению протея. За основу разработки принят рекомендуемый ведущими зарубежными фирмами SS-arap. Важным компонентом этой среды являются смесь желчных кислот или сухая желчь. Исследованы образцы сырой желчи различных заводов — изготовителей и способы ее переработки. Разработана методика получения сухой очищенной желчи с суммарным содержанием желчных кислот не менее 40 % с определенным количеством минеральных веществ. Сухая очищенная желчь (ТУ 9385 - 009- 00479327-98) близка по физико-химическим параметрам к импортным препаратам. Содержание аминного азота в питательной среде для выделения шигелл и сальмонелл на основе ПГРМ должно составлять 60-80 мг%, а содержание желчи от 5,5 до 7,5 г/л. Показано, что S.flexneri la 8516 формирует колонии размером 1.0-2.0 мм в количестве, незначительно отличающемся от контроля (ГРМ-агар). Хорошо на этих средах растут S. sonnei "S form", S. paratyphi A 225 и S. typhi H-901 ГДР/ГИСК, образуя колонии в достаточном количестве удовлетворительного размера. Е. coli 3912/41 (055:К59) вырастают в виде малиновых колоний диаметром 1,5-2,5 мм с коэффициентом ингибирования 5-10. P. vulgaris НХ 19 222 вырастает в виде изолированных колоний, диаметром 2.0-4.0 мм со слабым роением. Колонии P. mirabilis 3177 - бурого цвета с темным центром диаметром 2.0-4.0 мм. Рост стафилококка отсутствует.

С целью уменьшения слеживаемости сухого SS-arapa и увеличения сроков его хранения без изменения качества изучена возможность внесения в жидкий ПГРМ перед сушкой различных компонентов питательной среды. Приготовлен ряд основ SS-arapa двумя способам. Первый способ включал в себя внесение различных компонентов среды в жидкий ПГРМ, растворение этих компонентов и высушивание полученной основы методом распыления. Второй способ получения основ заключался в смешивании сухих компонентов в смесителе барабанного типа. Полученные образцы исследованы на содержание влаги и подвижность молекул воды методами ЯМР (табл. 5).

Таблица 5 - Содержание влаги (%) в основах питательной среды

для выделения шигелл и сальмонелл

Состав основы Способ получения сухой основы

Распылительная сушка ПГРМ с добавленными компонентами Смешивание сухих компонентов

ПГРМ-26 Натрия тиосульфат 5,6 анатиз не проводился

ПГРМ-32 Натрия тиосульфат Натрия цитрат Лактоза 1,77 8,9

ПГРМ-32 Натрия тиосульфат Натрия цитрат 1,81 7,2

ПГРМ-50 Натрия тиосульфат Натрия цитрат Железа(Ш) цитрат 2,46 15,0

Содержание влаги в образцах, полученных методом распылительного высушивания гидролизата рыбной муки с компонентами среды, значительно меньше (1,8-2,5 %), чем в образцах, полученных смешиванием отдельных сухих компонентов в смесителе барабанного типа (7,2-15,0 %). Определение методами ЯМР времени спин-решеточной релаксации установило, что наименьшая подвижность молекул воды наблюдается у основ № 2. Данный образец будет иметь лучшие биофизические показатели при хранении.

На втором этапе отработан технологический режим получения основы для SS-arapa из панкреатического гидролизата рыбной муки, высушенного с углеводной и гигроскопичными солевыми добавками. В прописи питательной среды экстракт БВК заменен на автолизат пекарных дрожжей.

На основании исследований физико-химических и биологических свойств на расширенном наборе штаммов, питательная среда для выделения шигелл и сальмонелл SS-arap превосходит по ряду показателей коммерческий препарат-бактоагар Плоскирева. Готовая питательная среда обеспечивает через 18-20 ч инкубации при температуре (37±1)°С при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10~6 рост тест-штаммов: S.typhi Н-901 ГДР/ГИСК, S. paratyphi А-225, S.Jlexneri la 8516, S. sonnei "S form" в виде бесцветных колоний диаметром 1,0-2,0 мм в S форме. Escherichia coli 3912/41 (055:К59) в виде колоний малинового цвета, диаметром не менее 1,5 мм в S форме. P. vulgaris НХ 19 222, P. vulgaris HXL 4636 в виде бесцветных колоний диаметром 2-3 мм. P. mirabilis 3177 в виде бурых колоний с темным центром, диаметром 2-3 мм. Роение Р. mirabilis 3177 должно быть подавлено полностью, роение P. vulgaris НХ 19 222 и P. vulgaris HXL 4636 - частично.

Сравнительная характеристика биологических показателей бактоагара

Плоскирева и SS-агара представлена в таблице 6.

Таблица 6 - Сравнительная характеристика биологических показателей бактоагара Плоскирева н SS-arapa_

Тест-штаммы Бактоагар Плоскирева г. Махачкала SS-arap серия 4 ГНЦПМБ

Кол-во колоний, диаметр (мм), морфология

S. typhi H 901 ГДР/ГИСК разведение 10"6 88 1,0-1,5 круглые, бесцветные 80 1,0-1,5 бесцв., нежные, гладкие, круглые

S. paratyphi А-225 разведение 10"6 89 1,0-1,5 круглые, бесцветные 102 1,0-1,5 бесцв., нежные, гладкие, круглые

S. flexneri 1 а 8516 разведение 10"6 92 1,0-1,5 круглые, бесцветные 82 1,0-1,5 бесцв., нежные, гладкие, круглые

S.sonnei "S-form" разведение 10"6 95 1,0-1,5 круглые, бледно-розов, колонии 72 1,0-1,5 S form, слабо розового цвета, нежные, гладкие, круглые

К coli 3912/41 (055:К59) разведение 10"4 76 2,0-2,5 круглые, малиновые, Б-ф 7 2,0-2,5 круглые, выпуклые, гладкие, малиновые

S. typhi H 901 ГДР ГИСК/ Е. coli 3912/41 (055:К59) дифференциация четкая дифференциация

S.paratyphi А-225/ Е. coli 3912/41 (055:К59) дифференциация четкая дифференциация

S. flexneri la 8516/ Е. coli 3912/41 (055:К59) дифференциация четкая дифференциация

S. sormei "S form"/ E. coli 3912/41 (055:K59) дифференциация четкая дифференциация

Р. vulgaris HX 19 222 разведение 10"6 роение 2,0-4,0 слабое роение 2,0-4,0 бесцветные

Р. vulgaris HXL-4636 разведение 10 й роение 2,0-4,0 слабое роение 2,0-4,0 бесцветные

P. mirabilis 3177 разведение 10"6 83 2,0-3,0 роение 75 2,0-3,0 бурого цвета с темным центром

S. aureus Wood-46 разведение 10"1 нет роста нет роста

Составлена пропись питательной среды, в соответствии с которой приготовлены лабораторные образцы 88-агара и направлены для контрольных испытаний в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, областные центры санитарно-эпидемиологического надзора городов Екатеринбурга и Воронежа. На основании заключений и рекомендаций, представленных этими организациями,

составлена окончательная пропись питательной среды для выделения шигелл

и сальмонелл следующего состава, г/л:

панкреатический гидролизат рыбной муки..................16,0

экстракт БВК............................................................................................................................5,0

желчь очищенная сухая......................................................................................7,5

натрий тиосульфат......................................................................................................8,5

натрий цитрат......................................................................................................................10,0

лактоза..............................................................................................................................................10,0

бриллиантовый зеленый........................................... 3,3-Ю"4

нейтральный красный ......................................................................................0,04

железа (III) цитрат........................................................................................................1,0

агар микробиологический..............................................................................11,0 + 2,0

pH среды - 7,1±0,2

Разработаны прописи дифференциально-диагностических питательных сред для выделения энтеробактерий на основе ПГРМ: Эндо-ГРМ агар, Леви-на-ГРМ агар, Висмут-сульфит-ГРМ агар, SS-arap. Сравнительный анализ состава вновь разработанных сред с широко используемыми в практике здравоохранения питательными средами производства НПО "Питательные среды" (г. Махачкала) показал, что они отличаются не только белковыми гидро-лизатами, но и содержанием других компонентов среды. Для улучшения ростовых свойств в состав разработанных сред входит дрожжевой экстракт (или автолизат дрожжей), экспериментально обосновано различное содержание лактозы или глюкозы, оптимизированы составы солей и красителей. Состав ряда вновь разработанных питательных сред является более простым, поскольку не содержит таких компонентов как агароид, соли желчных кислот, йод, соды кальцинированной. Биологические показатели новых сред не уступают, а в ряде случаев и превосходят среды промышленного производства.

Сравнительное исследование качества питательных сред

Для сравнительной оценки качества питательных сред - питательного бульона, питательного агара, среды Эндо, SS - агара изучены ростовые свойства этих сред различных производителей «HiMedia» (Индия), «Merck» (Германия) и «Pronadisa» (Испания). Установлено, что питательные среды с использованием ПГРМ не только не уступают, но в ряде случаев и превосходят импортные аналоги (табл.7-9).

Питательные агары различных фирм обеспечивают рост многих микроорганизмов из разведения 10"6 в виде колоний различной морфологии. ГРМ -агар производства ФБУН ГНЦ ПМБ не уступает по качеству импортным препаратам, а в ряде случаев их превосходит (табл.7).

Количество и размер колоний Е. coli 055 3912/41, Е. aerogenes 10006, С. xerosis 1911, 5. sonnei "S-form, S. typhimurium 79, S. aureus Wood-46, S. epidermidis 14990 на испытуемых агарах примерно одинаково. Лучшими ростовыми свойствами по сравнению с импортными аналогами ГРМ-агар обладает в отношении S.flexneri la 8516. На ГРМ-агаре производства

ФБУН ГНЦ ПМБ наблюдается классический пигмент у S. marcescens 1 -красный и у P. aeruginosa 27/99 — сине-зеленый, что играет существенную роль для первичной идентификации микроорганизмов.

Таблица 7 — Биологические показатели питательных агаров различных производителей________

Nutrient agar

Штаммы (разведение 10"6) HiMedia | Merck | Pronadisa | ГНЦПМБ

кол-во колоний, морфология, диаметр (мм)

С. xerosis 1911 36 0,5-0,6 Круглые, бесцветные 19 0,3-0,4 Круглые, бесцветные Нет роста 28 0,5-0,6 Круг, непрозрачные, бесцветные

E.coli 055 3912/41 76 1,6-2,0 Кругл, прозрачные, бесцвет 71 1,4-1,8 Кругл, прозрачные, бесцв. 75 1,2-1,4 Кругл, прозрачные, бесцвет 82 1,8-2,2 Кругл, прозрачные, бесцвет

Е. aerogenes 10006 75 1,2-1,6 Круглые, прозрачные, бесцвет 74 1,4-1,6 Круглые, прозрачные, бесцвет 58 1,0-1,2 Круглые, прозрачные, бесцвет 78 1,8-2,2 Круглые, прозрачные, бесцвет

S.flexneri 1 а 8516 43 1,2-1,5 Круглые, прозрачные, бесцвет 5 0,6-0,8 Круглые, прозрачные, бесцвет Нет роста 58 1,8-2,0 Круглые, прозрачные, бесцвет

S. sonnei "S-form" 55 1,8-2,0 Круглые, прозрачные, бссцвет 46 1,6-1,8 Круглые, прозрачные, бссцвет 47 0,8-1,2 Круглые, прозрачные, бесцветные 56 2,2-2,5 Круглые, прозрачные, бесцвет

S. typhimurium 79 75 1,6-1,8 Круглые, прозрачные, бесцвет 68 1,6-2,0 Круглые, прозрачные, бесцвет 66 1,4-1,8 Круглые, прозрачные, бесцвет 75 1,8-2,0 Круглые, прозрачные, бесцвет

S. aureus Wood-46 28 0,8-1,0 Круглые, бесцвет 28 0,8-1,0 Круглые, бесцвет 33 0,4-0,6 Круглые, бесцвет 33 1,2-1,4 Круглые, бесцвет

S. epidermidis 14990 18 0,2-0,4 Круглые, бесцвет 27 0,3-0,5 Круглые, бссцвет 18 0,2 Круглые, бесцвет 37 0,6-0,8 Круглые, бесцвет

Лактозоположительные тест-штаммы микроорганизмов образовывали на всех образцах питательных сред агара Эндо розовые либо малиновые колонии с металлическим блеском или без него. Лактозоотрицательные штаммы форми-

ровали на средах бесцветные или бледно-розовые колонии (табл. 8). Таблица 8 - Биологические показатели среды ЭНДО различных

шрм-изготовителей

Endo Agar

Штаммы HiMedia Merck Pronadisa ГНЦПМБ

(разведение 10" 6) кол-во колоний, диаметр (мм), морфология

Б. coli АТСС 20 57 40 53

25922 0,8-1,2 1,2-1,4 1,4-1,6 2,0-2,5

Круглые, розо- Круглые, Круглые, мали- Круглые, малиновые, с ме-

вые, без металл. бледно- новые, с металл. талл. блеском

блеска розовые, блеском

без металл.

блеска

Е. cloacae А- 80 76 76 97

186 0,6-1,4 1,6-1,8 0,6-1,4 1,8-2,2

Круглые, розо- Круглые, Круглые, мали- Круглые, розовые

вые розовые новые

Е. aerogenes 95 92 98 89

10006 1,2-1,4 1,6-1,8 1,0-1,2 1,6-1,8

Круглые, блед- Круглые, Круглые, мали- Круглые, розовые

но-розовые бледно- новые

розовые

К. pneumonia 93 83 75 80

418 1,6-1,8 2,0-2,2 2,5-3,0 2,5-3,0

Круглые, розо- Круглые, Круглые, мали- Круглые, розовые с про-

вые бледно- новые зрачным ободком

розовые

£ typhi ! 1-901 85 79 80 83

ГДР/ГИСК 0,6-0,8 1,8-2,0 1,0-1,2 1,4-1,6

Круглые, блед- Кругл, про- Круглые, про- Круглые, прозрачные,

но-розовые зрачн, зрачные, розовые бледно-розовые

бледно-

розовые

£ typhimurium 100 98 94 93

79 0,6-0,8 2,0-2,5 0,6-0,8 2,0-2,2

Круглые, блед- 50% БИ- Круглые, розо- Круглые, бледно-розовые

но-розовые форма вые

Кругл,

бледно-

розовые

£ dysenteriae 1 Слабая диффе- Слабая Нет дифферен- Четкая дифференциация

Вбгю^+Е. ренциация дифферен- циации

coli 055 3912/41 циация

10"6

S. sormei "S- Нет дифферен- Слабая Четкая диффе- Четкая дифференциация

form" 10'6+ E. циации дифферен- ренциация

coli 0111 168/59 циация

ю-6

В их число входили следующие штаммы Е. cloacae А-186, Е. aerogenes 10006, S. typhimurium 79, S. typhi H-901 ГДР/ГИСК, К. pneumonia 418. На исследуемых средах полностью подавлен рост грамположительного тест-штамма S. aureus Wood-46. На агаре Эндо-ГРМ формировались более крупные колони в S-форме. На питательных средах Endo Agar фирм HiMedia и Merck тест-штаммы К coli не имели металлического блеска, что отрицательно сказывалось на дифференцирующих свойствах.

Endo Agar фирмы Merck не обеспечивал сохранение морфологических свойств тест-штаммов Е. coli 055 3912/41 и S. typhimurium 79, а на среде Endo Agar фирмы Pronadisa подавлен рост S. dysenteriae 11362.

Питательная среда SS-агар производства ГНЦ ПМБ обладала хорошими ростовыми свойствами и обеспечивала рост всех тест-штаммов без изменения их морфологических признаков. На SS-агаре отечественного производства, в отличие от импортных аналогов, колонии тест-культур по истечении срока инкубации посевов имели больший диаметр колоний. Это улучшало визуальную оценку результатов исследований. На среде не выявлено ингибирую-щего эффекта в отношении энтеробактерий (табл.9). На всех испытуемых средах тест-штаммы микроорганизмов, способных продуцировать сероводород из тиосульфата натрия образовывали колонии с темным центром. Исключение составлял SS-arap фирмы Pronadisa, на котором P. mirabilis 3177 прорастал в виде круглых бесцветных колоний без темного центра.

Положительным фактором является отсутствие роения Р. vulgaris НХ 19 222 на средах фирм Merck и Pronadisa, тогда как на SS-агаре ГНЦ ПМБ наблюдалось очаговое роение данного тест-штамма, а на SS-агаре фирмы HiMedia — роение отдельных колоний. Результаты биологического контроля выявили ряд существенных недостатков SS-агара фирмы HiMedia. На данной среде тест-штаммы S.flexneri 1 а 8516, S. paratyphi А-225 и S. typhi Н-901 ГДР /ГИСК изменяли свои культуральные свойства, образуя колонии в SR-форме. Колонии лактозоположительных тест-штаммов E.coli имели коричневато-красную окраску, что в значительной степени ухудшало дифференциацию от лактозоотрицательных тест-культур сальмонелл и шигелл. Следует отметить высокую чувствительность данной среды в отношении энтеробактерий.

Исследуемый SS-arap фирмы Pronadisa обладает более низкой, в сравнении с остальными образцами чувствительностью. Е. coli 055 3912/41 образовывала на среде колонии малинового цвета с зоной преципитации, что обеспечивало хорошие дифференцирующие свойства среды. SS-arap фирмы Merck полностью ингибировал рост тест-штамма S. paratyphi А-225.

Лактозоположительные микроорганизмы образовывали на среде колонии розового или малинового цвета, четко дифференцируемые от лактозоотрицательных энтеробактерий.

Ученый совет Роспотребнадзора (№ 16 от 14.12.2010 г) отметил, что «...учитывая значительно более низкую стоимость отечественных микробиологических питательных сред по сравнению с зарубежными образцами при аналогичном качестве, а также необходимость существенной экономии

средств при осуществлении надзорных функций, необходимо ориентировать организации Роспотребнадзора, прежде всего центры гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, на приобретение питательных сред отечественного производства».

Таблица 9 - Биологические показатели SS agar различных фирм-изготовителей_

SS agar

Штаммы HiMedia Merck | Pronadisa ГНЦПМБ

(разведение 10' кол-во колоний, диаметр (мм), морфология

S.flexneri 1 а 8516 39 1,2-1,5 БЯ-форма бесцветные 38 1,4-1,6 Круглые, бесцветные 17 0,8-1,0 Круглые, бесцветные 48 1,6-1,8 Круглые, бесцветные

S paratyphi А-225 19 1,4-1,6 БЯ-форма бесцветные Нет роста 18 1,0-1,2 Круглые, бесцветные 38 1,5-1,8 Круглые, бесцветные

S. typhimurium 79 74 1,4-2,0 Круглые, бесцветные с темным центром 74 1,6-2,0 Круглые, бесцветные с темным центром 72 1,6-2,0 Круглые, бесцветные с темным центром 79 1,8-2,2 Круглые, бесцветные с темным центром

S. enteriiidis 11272 91 1,6-2,0 Круглые, бесцветные с темным центром 91 1,8-2,0 Круглые, бесцветные с темным центром 76 1,0-2,0 Круглые, бесцветные с темным центром 97 2,0-2,5 Круглые, бесцветные с темным центром

Е. aerogenes 10006 58 1,8-2,0 Круглые, розовые 37 1,8-2,0 Круглые, розовые 11 0,6-1,0 Круглые, розовые 58 2,0-2,4 ' Круглые, розовые

К. pneumonia 418 65 1,8-2,0 Круглые, слизистые, розовые 66 2,0-2,2 Круглые, слизистые, розовые 54 2,0-2,5 Круглые, слизистые, розовые 64 3,0-3,5 Круглые, слизистые, розовые

P. mirabilis 3177 73 2,0-2,5 Круглые, бесцветные с темным центром 71 2,0-2,5 Круглые, бесцветные с темным центром 77 0,8-1,0 Круглые, бесцветные 75 2,5-3,0 Круглые, бесцветные с темным центром

S.flexneri 1 a 8516 10"® +E. coli 055 3912/41 ю-5 Нет дифференциации Дифференциация Дифференциация. Е. coli с зоной преципитацией Дифференциация

Разработка питательной среды — корпнебакагара для выделения возбудителя дифтерии

Для выделения коринебактерий из инфицированного материала в соответствии с приказом Минздрава СССР № 450 "О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией" практические работники здравоохранения широко используют среды лабораторного изготовления - кровяной теллуритовый агар и среду Клауберга II. В состав этих сред входит сухой питательный агар, а в качестве стимулятора роста — кровь крупного рогатого скота. В отделе питательных сред ГНЦ ПМ для культивирования возбудителя туляремии и легионеллеза разработаны сухие питательные среды, содержащие в качестве заменителя крови -стимулятор роста гемофильных микроорганизмов — СРГМ (ТУ 9385-01678095326-2007), который получают путем ферментативного гидролиза суспензии черного альбумина с последующей сушкой методом распыления.

На первом этапе исследований определена возможность использования СРГМ взамен крови в составе сред для культивирования коринебактерий. Введение в состав питательного агара стимулятора роста в количестве 10 г/л позволяет получить питательную среду, ростовые свойства которой находятся на уровне кровяно-теллуритового агара. Через 20-24 ч культивирования на среде наблюдается рост С. diphtheriae, размер колоний биовара mitis и gravis достигает 0,5-0,7 мм и 0,8-1,0 мм соответственно, что несколько лучше, чем на КТА. Через 48 ч культивирования на среде формируются крупные колонии, по размеру и количеству, превосходящие контрольную среду КТА. Увеличение содержания агара в питательной среде приводит к повышению прочности студня среды и к уменьшению размера вырастающих колоний. Если в среду добавить 10 г/л агара и плотность при этом 220 г, то наблюдается хороший рост гравис и митис. Увеличение содержания агара до 15-17 г/л приводит к повышению прочности агара до 350-420 г, размер вырастающих колоний С. diphtheriae уменьшается.

Следующим этапом исследований явилось определение оптимального количества теллурита калия, необходимого для введения в состав среды (табл.10). Теллурит калия (2 %-ный раствор) в количестве 2 мл на 100 мл среды (что является общепринятым в средах лабораторного изготовления) подавляет рост стрептококка и стафилококка, однако при этом подавлен и рост коринебактерий. Последнее проявляется в малом размере вырастающих колоний, трудно поддающихся учету через 24 ч культивирования и малом размере колоний через 48 ч культивирования. Уменьшение концентрации теллурита в среде приводит к увеличению размера колоний коринебактерий и к появлению роста стрептококка и стафилококка из больших посевных доз. Теллурит калия в количестве 1,25 мл на 100 мл среды является оптимальной концентрацией в составе среды (табл.10). При этой концентрации наблюдается хороший рост коринебактерий, и достаточно высокая степень ингиби-ции по отношению к посторонней микрофлоры.

В ходе исследований, выполненных на первом этапе в Московском цен-

тре Госсанэпиднадзора, с использованием широкого набора свежевыделен-ных штаммов коринебактерий дифтерии установлено, что предлагаемая питательная среда уступает по ростовым свойствам среде Клауберг II. Проведены дополнительные исследования по подбору компонентов, позволяющих повысить высеваемость С. diphtheria и увеличить размер колоний в особенности для 24 ч культивирования. Изучено влияние различных добавок на рост дифтерийного микроба — экстракты пекарных и кормовых дрожжей, цистина, глюкозы, гидролизатов растительного сырья, сыворотки и др. Наибольшим стимулирующим эффектом обладает небольшая добавка глюкозы.

Таблица 10 - Рост С. ШрМкегме на питательных средах с различным количеством 2 %-ного раствора теллурита калия _

Серия КБА Кол-во 2%-ного р-ра теллурита калия мл/100 мл С. mitis С. gravis S. aureus

24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 48 ч

d, мм КОЕ (500 м.к.) d, мм d, мм КОЕ (500 м.к.) d, мм ю-1 ю-2 ю-3 10 А

12 1,0 0,3-0,6 125 1,5-2,0 0,30,6 100 2,53,5 130 25 4 н/ Р

12 1Д5 03-0,5 100 1,5-2,5 0,30,5 100 2,53,5 51 10 н/р н/ Р

12 1,3 0,2-0,5 120 1,7-2,0 0,30,5 100 2,53,0 71 6 н/р н/ р

12 1,4 0Д-0.5 135 1,7-2,0 0,30,5 95 2,53,0 23 2 н/р н/ р

12 1,5 0,1-0,2 80 0,9-1,8 0,30,5 90 2,53,0 5 н/р н/р н/ р

12 1,75 Точ. 70 0,5-1,3 0,20,3 90 2,02,5 н/р н/р н/р н/ р

12 2,0 Точ. 55 0,5-0,8 0,20,3 75 2,02,5 н/р н/р н/р н/ р

Добавление глюкозы в концентрации 0,5 г/л среды приводит к повышению чувствительности среды, причем наиболее четко это проявляется для С. diphtheriae var. mitis. Рост С. diphtheriae gravis также улучшается. Если через 20-24 ч культивирования на питательной среде, не содержащей глюкозы, наблюдается точечный рост колоний, то на средах, содержащих 0,5-2,0 г/л глюкозы размер колоний достигает 0,5-0,6 мм. Не отмечается существенных отличий в размере колоний при изменении концентрации глюкозы от 0,5 до 2,0 г/л, т.е. можно считать, что концентрация глюкозы 0,5 г/л является достаточной для повышения ростовых свойств коринебакагара. Введение в состав среды глюкозы приводит к увеличению количества вырастающих колоний.

Разработана следующая пропись питательной среды, г/л:

панкреатический гидролизат рыбной муки................................................20,0

стимулятор роста гемофильных микроорганизмов..............................10,0

натрия хлорид ......................................................................................................................5,0

глюкоза........................................................................................................................................0,5

агар микробиологический..........................................................................................11,0

теллурит калия (2 % -ный раствор)....................................................................12,5 мл

В лабораторных условиях наработано 14 серий сухой основы питательной среды. Отдельные серии коринебакагара были испытаны в практическом здравоохранении. Получены положительные отзывы от 15 организаций, включая городские и областные центры санэпиднадзора.

Свойства коринебакагара испытаны на клиническом материале на базе Московского центра Госсанэпиднадзора (выращено 174 свежевыделенных штамма методом титрованных разведений); в лаборатории диагностики дифтерийных инфекций ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского (выращеноЮ музейных штаммов); в I инфекционной больнице г. Серпухова (обследовано 215 лиц, выделено 7 культур (3 - С. mitis и 4 - С. gravis) как на контрольной, так и экспериментальной средах); в I инфекционной больнице г. Москвы (обследовано 166 больных, выделена 21 культура (20 токсигенных штаммов С. gravis и 1 - С. milis) как на контрольной среде (Клауберг II), так и на коринеба-кагаре); в Республиканском информационно-аналитическом центре Госком-санэпиднадзора (обследовано 215 лиц, выделено 3 культуры, как на экспериментальной, так и контрольной средах).

За период проведения Государственных испытаний коринебакагара в инфекционной клинической больнице № 1 (г. Москва) было изучено 794 парных мазков из зева и носа больных, поступивших или находящихся на лечении. Токсигенные штаммы С. diphtheriae были выделены от 123 больных; в 17 случаях токсигенные штаммы были выделены как из зева, носа больных. Всего был проведен посев 140 токсигенных штаммов С. diphtheriae из них 139 штаммов биотипа gravis и один штамма биотипа mitis. При этом 139 штаммов токсигенных С. diphtheriae было выделено на контрольной среде и 137 штаммов на испытуемой среде. Практически не было выявлено различий в количестве колоний С. diphtheriae («подозрительные» на коринебак-терии колонии), выросших на испытуемой и контрольной средах.

По совокупности результатов биологические показатели коринебакагара находятся на уровне кровяно-теллуритового агара и среды Клауберг II и отвечают требованиям к питательным средам, изложенным в приказе № 450.

I. Всхожесть коринебактерий дифтерии: при посеве 500 м. к. через 24-48 ч инкубации при температуре 37° С вырастает от 50 до 100 колоний коринебактерий, а при посеве 100 м. к. - от 10 до 20 колоний коринебактерий.

И. Ингибирующая активность в отношении сопутствующей микрофлоры коринебакагар: при содержании 12,5 мл 2% теллурита калия на 1 л среды полностью подавляет рост стафилококка из разведения 10"4; при содержании 20,0 мл 2% теллурита калия на 1 л среды полностью подавляет рост стафилококка из разведения 10"';

III. Время формирования колоний: через 24 ч инкубации посевов материала на среде формируются колонии коринебактерий размером от 0,5 до 1,5 мм. Биовар gravis образует более крупные колонии 1,0-1,5 мм, а биовар mitis более мелкие — 0,5-1,0 мм. С помощью бинокуляра можно дифференцировать колонии: С. diphtheriae mitis - S-колонии, чёрного цвета, гладкие, блестящие, выпуклые с приподнятым центром и ровными краями; С. diphtheriae gravis -S-R-колонии плоские, морщинистые с неровными краями, с приподнятым центром, серовато-матовые (форма колоний «маргаритка»). Через 48 ч визуально легко наблюдаются колонии коринебактерий, размер которых достигает для варианта mitis 1,0-2,0 мм. Морфология колоний позволяет дифференцировать биовар mitis и gravis.

Питательные среды для контроля микробной обсемеиеиности нестерильных лекарственных средств

Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, растворы, экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе производства, могут быть контаминированы микроорганизмами и поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту. Испытание на микробиологическую чистоту включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а также выявление определённых видов микроорганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах. Согласно Государственной Фармакопее для контроля микробной обсеменён-ности нестерильных лекарственных средств рекомендовано использовать 15 наименований питательных сред. Описаны составы этих сред и их назначение. Указанные питательные среды являются средами лабораторного изготовления с использованием пептона ферментативного.

Нами разработаны 12 прописей питательных сред на основе ПГРМ для определения микробной обсеменённости нестерильных лекарственных средств. Выбран оптимальный состав белковой основы - ПГРМ в сочетании с другими гидролизатами. Такой подход обусловлен тем, что содержание других компонентов, которые обуславливают специфичность действия среды широко известны и описаны в соответствующих фармстатьях, в Государственной фармакопее и иностранных фармакопеях.

Разработаны составы питательных сред. Все вновь разработанные питательные среды в качестве белковой основы содержат ПГРМ. Питательные среды для контроля микробной обсеменённости нестерильных лекарственных средств прошли государственные испытания и рекомендованы для применения в практическом здравоохранения, зарегистрированы в Государственном реестре лекарственных средств.

Разработанные питательные среды зарегистрированы в качестве изделий медицинского назначения и имеют следующее назначение:

1. Среда № 1-ГРМ (ФСР 2011/11415) для культивирования и подсчёта аэробных бактерий при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств и для других объектов.

2. Среда № 2-ГРМ (ФСР2011/11416) для культивирования и подсчёта дрожжевых и плесневых грибов при контроле микробной загрязнённости нестерильных лекарственных средств и для других объектов.

3. Среда № 3-ГРМ (ФСР 2007/00373) для накопления бактерий семейства Ente-robacteriaciae при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств и для других объектов.

4. Среда № 6-ГРМ (ФСР 2011/11417) для определения ферментации глюкозы бактериями семейства Enterobacteriaciae в аэробных и анаэробных условиях.

5. Среда № 7-ГРМ (ФСР 2011/11418) для определения способности энтеро-бактерий восстанавливать нитраты в нитриты.

6. Среда № 8-ГРМ (ФСР 2007/00839) - универсальная питательная среда для получения накопительных культур микроорганизмов различных таксо-нометрических групп, в том числе синегнойной палочки и стафилококков.

7. Среда № 9-ГРМ (ФСР 2011/11419) - для выявления пигмента пиоциа-нина синегнойной палочки.

8. Среда № 10-ГРМ (ФСР 2007/00374) - для идентификации стафилококков.

9. Среда № 11-ГРМ (ФСР 2007/00372) - для предварительного накопления эн-теробактерий.

10. Среда № 13-ГРМ (ФСР 2011/11420) - для определения сероводорода, продуцируемого бактериями рода Salmonella и определения ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы.

11. Среда № 14-ГРМ ( ФСР 2007/00371) - для определения утилизации цитрата натрия энтеробакгериями

12. Среда № 15-ГРМ (ФСР 2011/11421) - для дифференциации микроорганизмов по их способности к образованию индола

Выполненные исследования по выбору и определению режимов и способов получения белковых компонентов питательной среды позволили разработать технологию производства новых препаратов — ПГРМ, стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, желчи сухой очищенной. Детальное изучение физико-химических свойств и химического состава разработанных препаратов позволили целенаправленно подойти к конструированию состава питательных сред. На основе ПГРМ разработаны составы 37 наименований питательных сред, которые прошли все этапы Государственных испытаний и регистрации и разрешены для применения в практике здравоохранения (табл. 11).

Дальнейший прогресс в разработке новых питательных сред будет связан, по-видимому, с разработкой новых белковых компонентов, таких как мясные, печеночные, сердечно-мозговые экстракты и перевары. Конструирование питательных сред на основе панкреатического гидролизата рыбной муки с использованием новых белковых компонентов является задачей будущих исследований и приведет к дальнейшему увеличению номенклатуры и качества питательных сред.

Все это позволит в конечном итоге повысить качество микробиологиче-

ских исследований в области диагностики инфекционных заболеваний, и направлено для улучшения санитарно-эпидемиологического благополучия населения России.

Таблица 11 - Перечень питательных сред ФБУН ГНЦ ПМБ, в состав которых входит панкреатический гидролизат рыбной муки_

Наименование препарата Регистрационное удостоверение Л'»

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон)» ФСР 2007/00002

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)» ФСР 2007/00001

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения энтеробактерий сухая (агар Эндо-ГРМ)» ФСР 2007/00375

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда с эозин-метиленовым синим сухая (среда Левина-ГРМ)» ФСР 2008/03063

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения сальмонелл сухая (Висмут-сульфит-ГРМ агар)» ФСР 2008/03237

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения сальмонелл и шигелл сухая (вБ-агар)» ФСР 2007/00838

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда д ля выделения коринебактерий (Коринебакагар)» ФСР 2007/00003

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 1 ГРМ для количественного определения микробной загрязненности» ФСР 2011/11415

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 2 ГРМ (Сабуро) для контроля микробной загрязненности (для выращивания грибов)» ФСР 2011/11416

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 3 ГРМ для контроля микробной загряз-нешюсти (среда обогащения для бактерий семейства Ешего- ФСР 2007/00373

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 6 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для определения ферментации глюкозы)» ФСР 2011/11417

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 7 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для определения восстановления нитратов в нитриты)» ФСР 2011/11418

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 8 ГРМ для контроля микробной загряз- ФСР 2007/00839

ненности (для выращивания Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus)»

Набор реагентов для бактериолог ических исследований «Питательная среда № 9 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для выявления пигмента пиоцианина)» ФСР 2011/11419

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 10 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для идентификации Staphylococcus aureus)» ФСР 2007/00374

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 11 ГРМ для контроля микробной загрязненности (лактозный бульон - среда для предварительного накопления бактерий семейства Enterobacteriaceae)» ФСР 2007/00372

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 13 ГРМ для контроля микробной загрязненности (трехсахарный агар с солями железа - для выявления сероводорода и определения ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы)» ФСР 2011/11420

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда № 15 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для определения индола)» ФСР 2011/11421

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения возбудителей кишечного иер-синиоза и псевдотуберкулеза (Иерсиния-агар)» ФСР 2007/00900

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (Агар Клиглера-ГРМ)» ФСР 2007/00968

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для обнаружения бактерий группы кишечной палочки сухая (среда Кссслера-ГРМ)» ФСР 2007/00971

Набор реагентов для бактериологических исследовашш «Питательная среда для выделения и идентификации энтеробактерий сухая (SDS-бульон)» ФСР 2007/00969

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения и дифференциации E.coli 0157:Н7 и других энтеробактерий по признаку ферментации сорбита сухая (Сорбитол E.coli 0157:117 агар)» ФСР 2007/00970

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения шигелл и сальмонелл сухая (агар Плоскирсва-ГРМ)» ФСР 2008/03938

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для первичной идентификации энтеробактерий сухая (среда Ресселя-ГРМ)» ФСР 2008/02818

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (среда Гисса-ГРМ)» ФСР 2008/03494

Набор реагентов для бактериологических исследовашш «Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бак- ФСР 2008/03665

терий по признаку ферментации глюкозы сухая (среда Эйк-мана с глюкозой)»

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бактерий по признаку ферментации лактозы сухая (среда Эйк-мана с лактозой)» ФСР 2008/03666

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения и культивирования лактоба-цилл сухая (Лактобакагар)» ФСР 2010/09164

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный бульон для накопления сальмонелл по Раппапор-ту-Вассилиадису сухой (RVS-бульон)» ФСР 2010/09163

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения листерий (ПАЛ)» ФСР 2010/09162

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения стафилококков сухая (Ста-фнлококкагар)» ФСР 2011/10007

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для первичной идентификации энгеробактерий сухая (Железо-глюкозо-лактозиый агар с мочевиной)» ФСР 2011/10006

Питательная среда для выделения и культивирования холерного вибриона сухая (Щелочной агар) ФСР 2009/05473

Питательная среда для обнаружения и выделения колиформных бактерий и кишечных патогенов сухая (Агар МакКонки-ГРМ) ФСР 2009/05628

Питательная среда для обнаружения E.coli и колиформных бактерий сухая (Бульон МакКонки-ГРМ) ФСР 2009/05627

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам сухая» (АГВ) ФСР 2012/13687

выводы

1. Научно обосновано и экспериментально доказано, что рыбная мука является одним из важнейших источников белка в производстве питательных сред для культивирования широкого круга микроорганизмов различных таксономических групп.

2. На основе рыбной муки разработана технология производства белкового гидролизата, определены параметры технологического процесса на стадиях гидролиза, осветления, фильтрации и высушивания препарата. Показано, что панкреатический гидролизат рыбной муки содержит не менее 3,5 % аминного азота, 10 % общего азота, 18 % свободных аминокислот, 20 % натрия хлорида. По аминокислотному составу и другим биохимическим показателям он отвечает требованиям аналогичным пептону для приготовления питательных сред.

3. Утвержден регламент производства панкреатического гидролизата рыбной муки — ПР № 78095326-63-2006, показатели качества определены в технических условиях - ТУ 9385-17-78095326-2006.

4. Изучены ростовые показатели панкреатического гидролизата рыбной муки с использованием широкого круга микроорганизмов различных таксономических групп на модели питательного бульона и питательного агара. Определен состав питательных сред общего назначения: ГРМ-бульона и ГРМ-агара.

5. Определён и обоснован оптимальный состав питательных сред для выделения и дифференциации энтеробактерий: Эндо-ГРМ агар, Левина-ГРМ агар, Висмут-сульфит ГРМ агар, ЗБ-агар.

6. Разработан состав и технология производства питательной среды - ко-ринебакагара, позволяющая без добавления нативной крови проводить диагностику возбудителя дифтерии. Объёмы производства этого препарата обеспечивают ежегодное выполнение более 2 млн. бактериологических исследований по диагностике дифтерии.

7. Разработано 12 наименований питательных сред для контроля микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств, которые прошли все этапы государственной регистрации и рекомендованы к медицинскому применению.

8. Разработана нормативно-техническая документация (опытно-промышленные регламенты и технические условия), проведены государственные испытания 37 наименований питательных сред на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. В ФБУН ГНЦ ПМБ создано промышленное производства питательных сред, которые разрешены к медицинскому применению и широко используются в клинической и санитарной микробиологии.

9. Решена важная государственная задача в области биобезопасности и санитарно-эпидемиологического благополучия населения по созданию в центре России производства питательных сред. Объёмы производства питательных сред, достигнутые в 2012 г., удовлетворяют потребности страны в диагностических питательных средах до 50% и обеспечивают выполнение более 50 млн. бактериологических исследований.

Практические рекомендации

1. Панкреатический гидролизат рыбной муки (ТУ 9385-17-780953262006) может быть использован в качестве белковой основы для разработки и производства питательных сред лабораторного и промышленного изготовления.

2. Учреждениям Роспотребнадзора для осуществления санитарно-эпидемиологического надзора за социально-значимыми инфекциями, для выделения и идентификации энтеробактерий рекомендуется использовать отечественные питательные среды: Эндо-ГРМ-агар, Леви-на-ГРМ-агар, Плоскирева-ГРМ-агар, висмут-сульфит ГРМ-агар, ЗЭ-агар, рекомендованные для применения соответствующими Приказами Миздрава РФ.

3. Учреждениям Роспотребнадзора для осуществления санитарно-эпидемиологического надзора за социально-значимыми инфекциями (дифтерия) для выделения и идентификации СогупеЬа&епит сИрИЛе-пае рекомендуется использовать отечественную питательную среду «коринебакагар», рекомендованную для применения соответствующим Приказом Миздрава РФ.

4. Учреждениям Роспотребнадзора для исследований объектов окружающей среды на микробную загрязнённость рекомендуется использовать 12 наименований отечественных питательных сред на основе ПГРМ, рекомендованных для применения соответствующими Приказами Миздрава РФ.

5. Заведующим микробиологических (бактериологических) лабораторий ЛПУ при диагностике ОКИ для выделения и идентификации энтеробактерий рекомендуется использовать отечественные питательные среды: Эндо-ГРМ-агар, Левина-ГРМ-агар, Плоскирева-ГРМ-агар, висмут-сульфит ГРМ-агар, ББ- агар, рекомендованные для применения соответствующими Приказами Миздрава РФ.

6. Заведующим микробиологических (бактериологических) лабораторий ЛПУ при диагностике дифтерии для выделения и идентификации Со-гупеЬааегшт сНрЫИепае рекомендуется использовать отечественную питательную среду «коринебакагар», рекомендованную для применения соответствующим Приказом Миздрава РФ.

7. Заведующим микробиологических (бактериологических) лабораторий ЛПУ для исследований объектов окружающей среды на микробную загрязненность рекомендуется использовать 12 наименований отечественных питательных сред на основе ПГРМ, рекомендованных для применения соответствующими Приказами Миздрава РФ.

8. Фармпроизводителям для контроля лекарственных средств на микробную загрязненность рекомендуется использовать 12 наименований отечественных питательных сред на основе ПГРМ, рекомендованных для применения соответствующими Приказами Миздрава РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шепелин, А.ГГ. Кормовые дрожжи - источник белка в производстве питательных сред / А.П. Шепелин, И.Н. Шамичева, В.И. Артюхин, С.П. Королев, И.Ю. Дмитриева, E.H. Федорова // Актуальные вопросы разработки препаратов медицииской биотехнологии: тез. конф. (26-27 мая 1988), Махачкала. - 1988. - Ч. 1 - С. 9.

2. Марчихина, ИЛ. Ферментативные и кислотные гидролизаты рыбной муки / И.И. Марчихина, А.П. Шепелин, И.Ю. Дмитриева, АА. Рахимов, Л.П. Шолохова, Т.И. Бабаева, НЛ. Никольская // Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии: тез. конф., Махачкала. - 1990. - 4.1. - С. 11-12.

3. Шепелин, А.П. Казеин и гидролизаты на его основе / А.П. Шепелин, И.Ю. Дмитриева, И.И. Марчихина, A.A. Рахимов, Л.П. Шолохова, И.Н. Шамичева, Т.И. Бабаева, С.П. Королев, H.H. Никольская, О .Я. Вопия-шин // Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии: тез. конф., Махачкала. -1990. - Ч. 1. - С. 13-14.

4. Ковтун, B.C. Сравнительное изучение биологических свойств некоторых гидролизатов / B.C. Ковтун, А.П. Шепелин, С.А. Угрюмов, Т.П. Чурилова // Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии: тез. конф., Махачкала. - 1990. - Ч. 1. - С. 25.

5. Арпохин, В.И. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред / В.И.Артюхин, А.П. Шепелин, Н.В. Киселева. // Производство и применение продуктов микробиологических производств: М., -1990. - вып. 9-10. — 52с.

6. Гавристова, ИА. Испытание новой питательной среды для выделения коринебактерий (Коринебакагар) / И.А. Гавристова, С.М. Штан-чаева, Е.Б. Ершова, И..Н. Филимонова, Т.С. Шобухова, Г.А. Юсова, А.П. Шепелин // Принципы и практика борьбы с холерой в рес. Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиолгических питательных сред и те-стсистем: матер, докл. Всерос. науч.-практ. конф. (31 окт. 1994 г., Махачкала). Махачкала. - 1994. - Ч. 1. - С. 73.

7. Родин, В.Б. Модель роста бактериальной колонии / Б.В. Родин, В.Б. Фролов, Н.С. Грищенко, Т.И. Инковская, А.П. Шепелин, В.И. Артюхин // Прикладная биохимия и микробиология. - 1994. - Т. 30. № 6. -С. 871-876.

8. Степапшина, B.II. Взаимосвязь состава питательной среды с ростовыми и биологическими свойствами B.pertussis / В.Н. Степаншина, Л.Н. Алексеева, О.В. Коробова, Л.В. Логачева, А.П. Шепелин, ГА. Ани-симов, К.И. Волкова //Жури, микроб, эпидем. иммунол. - 1994. - № 6. - С. 26-27.

9. Булатова, Р.Ф. Новые подходы к разработке критериев оценки качества сухих питательных сред / Р.Ф. Булатова, А.П. Шепелин., В.Я. Волков. // Клиническая лабораторная диагностика. -1997. - № 6. - С. 61.

10. Домотенко, Л.В. Питательные среды для диагностики дис-

биотических состояний / Л.В. Домотенко, Л.В. Логачева, А.П. Шепелин // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 6. - С. 63.

11. Марчихина, И.И. Питательные среды для выделения стафилококков / И.И. Марчихина, Л.П. Шолохова, А.П. Шепелин, Н.Н Никольская // Клиническая лабораторпая диагностика. -1997. - № 6. - С. 65.

12. Морозова, Т.П. Питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам (типа Muller Hinton) / Т.П. Морозова, А.П. Шепелин // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 6. - С. 66.

13. Никольская, H.H. Сухие питательные среды для контроля микробной загрязненности / Н.Н Никольская, Е.В. Штанникова, А.П. Шепелин // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 6. - С. 66.

14. Гавристова, И.А. Изучение качества питательной среды для выделения стафилококков (Стафилококкагар) / И.А. Гавристова, ГЛ. Беляева, М.В. Храмов, А.П. Шепелин, Л.П.. Шолохова // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: сб. тез. докл. юбил. научн. конф. (14-15 декабря 1999г.). Оболенск. - 1999. - С. 40.

15. Домотенко, Л.В.Новые питательные среды для диагностики дис-бактериозов / Л.В. Домотенко, Л.В. Логачева, Т.П. Морозова, А.П. Шепелин // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: сб. тез. докл. юбил. научн. конф. (14-15 декабря 1999г.). Оболенск. - 1999. - С. 54.

16. Домотенко, Л.В. Набор питательных сред для определения лекарственной устойчивости М. Tuberculosis / Л.В. Домотенко, А.П. Шепелин, В.И. Го-лышевская. // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: сб. тез. докл. юбил. научн. конф. (14-15 декабря 1999г.). Оболенск. - 1999. - С. 55

17. Храмов, М.В. Новая питательная среда для диагностики эшери-хиоза Е. coli 0157:Н7 / М.В. Храмов, Т.А. Попова, Н.И. Ажермачева, А.П. Шепелин // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: сб. тез. докл. юбил. научн. конф. (14-15 декабря 1999г.). Оболенск. - 1999. - С.148.

18. Шепелин, А.П. Производство питательных сред в ГНЦ прикладной микробиологии / А.П. Шепелин, Л.В. Домотенко, М.В. Храмов // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: сб. тез. докл. юбил. научн. конф. (14-15 декабря 1999г.). Оболенск. - 1999. - С. 301.

19. Булатова, Р.Ф. Анализ состояния воды в сухих питательных средах и разработка критериев по их, вызываемого кишечной палочкой О157влажности I Р.Ф. Булатова, М.Н. Марговецкий, А.П. Шепелин // Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тестсистем: матер. 3-й междунар. научн.-практ. конф., Махачкала. -2001.-С. 55.

20. Шепелин, А.П. Микробиологические среды - основа бактериальной инфекционной диагностики и биотехнологии / А.П. Шепелин, М.В. Храмов // Биотехнология: состояние и перспективы развития: матер. II Моск. междунар. конгр. (Москва, 10-14 ноября 2003). Москва. - 2003. - Ч. 1. - С. 83.

21. Шепелин, А.П. Использование унифицированной белковой основы

при производстве питательных сред для диагностики ООИ / А.П. Шепелин, М.В. Храмов, М.Н. Мартовецкий, E.H. Миронова, И.И. Марчихина, О.В. Полосенко // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»: матер. VII межгосудар. науч.-пракг. конф. (3-5 октября 2006). Оболенск. -2006.-С. 255.

22. Косилова, И.С. Оценка качества дисков с антибиотиками при определении антимикробной чувствительности / И.С. Косилова, Т.П. Морозова, JI.B. Домотенко, А.П. Шепелин // Материалы III науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов науч. исслед. Организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (31 мая-2 июня 2011). Оболенск. -2011. - С. 197-200.

23. Шепелин, А.П. Сравнительный анализ качества питательных сред различных производителей для выделения энтеробактерин / А.П. Шепелин, И.А. Дятлов, Л.П. Шолохова, И.И. Марчихина // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - № 9. - С. 42.

24. Шепелин, А.П. Разработка технологии приготовления панкреатического гидролизата рыбной муки - белковой основы бактериологических питательных сред / А.П. Шепелин, И.А. Дятлов, И.И. Марчихина, E.H. Миронова // Клиническая лабораторная диагностика. -2011. - № 9. - С. 48-49.

25. Косилова, И.С. Оценка свойств агара Мюллера-Хинтон разных фирм-производителей / И.С. Косилова, Г.П. Глазкова, JI.B. Домотенко, А.П. Шепелин // Клиническая Микробиология и антимикробная химиотерапия. -2011.-Т. 13. -№2. - С 21.

26. Шепелин, А.П. Современное состояние и тенденции в производстве питательных сред / А.П. Шепелин, И.А. Дятлов // Лаборатория. - 2011. -№2-С. 17-18.

27. Шепелин, А.П. Современное состояние и тенденции в нормативно-правовом регулировании производства, реализации и применения питательных средУА.П.. Шепелин, И.А. Дятлов. Протвино: A-ПРИНТ ЗАО, 2012. - 48 с.

28. Шепелин, А.П. Роль и место микробиологии в решении вопросов модернизации здравоохранения / А.П. Шепелин, И.А. Дятлов. Протвино: A-ПРИНТ ЗАО, 2012. - 112 с.

29. Шепелин, А.П., О правовом статусе питательных сред / А.П. Шепелин, И.А. Дятлов, Т.В. Мотуз // Справочник заведующего КДЛ. - 2012. -№ 2. - С. 3-9.

30. Шепелин, А.П. Разработка диагностических питательных сред с использованием панкреатического гидролизата рыбной муки / А.П. Шепелин [и др.] // Лаборатория. - 2012. - № 2. - С. 45.

31. Подкопаев, Я.В. Разработка питательной среды для выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов / Я.В. Подкопаев, Л.В. Домотенко, Т.П. Морозова, М.В. Храмов, А.П. Шепелин. Материалы IV

ежегод. всерос. конгр. по инфек. Болезням (Москва, 26-28 марта 2012 г.) // Инфекционные болезни. - 2012. - Т. 10 (приложение № 1). - С. 302.

32. Шепелин, А.П. Разработка технологии приготовления панкреатического гидролизата рыбной муки, используемого для конструирования питательных сред. / Шепелин А.П. // Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. - 2012. - № 4. - С. 80-85.

33. Шепелин, А.П. Отечественная питательная среда - коринеба-кагар для выделения возбудителя дифтерии. / Шепелин А.П. // Курский паучно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2012. - № 4. -С. 109-111.

34. Шепелин, А.П. Новые питательные среды для бактериологических исследований. / Шепелин А.П. // Современная лабораторная диагностика. - 2012. - № 4. - С. 22-23.

35. Шепелин, А.П. Роль и место культурных бактериологических методов в диагностике инфекционных болезней / А.П. Шепелин, И.А. Дятлов // Профилактическая и клиническая медицина. - 2012. - № 4. - С.100-103.

36. Шепелин, А.П. Оценка качества питательных сред для определения чувствительности к антибактериальным препаратам / А.П.Шспелин, Т.П. Морозова, И.С. Косилова, Г.П. Глазкова // Дезинфекция. Антисептика. -2013.-№ I.- С.43-48.

37. Шепелин, А.П. Сравнительная оценка дифференциально-диагностических свойств питательной среды Эндо различных производителей / А.П.Шепелин, И.И. Марчихина, О.В. Полосенко, Г.Е. Складан // Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - № 5. - С.47-50.

38. Шепелин, А.П. Сравнительная оценка качества основных питательных сред отечественного и импортного производства. /Шепелин А.П. // Астраханский медицинский журнал. - 2013. - №1. - С.21-24.

Изобретения

1. Пат. 2041947 Российская Федерация, МПК6 С 12 N 1/20. Питательная среда для выделения дифтерийного микроба / А.П. Шепелин, H.A. Татаринцева, Г.В. Бизяева, В.И. Артюхин; заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии; патентообладатель Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии. № 5030693 / 13; заявл. 04.03.92; опубл. 20.08.95.

2. Пат. 2089609 RU, МПК6 С 12 N 1/20. Питательная среда для выращивания микроорганизмов / А.П. Шепелин, И.И. Марчихина, Т.И. Бабаева, Л.П. Шолохова, H.H. Никольская; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии. № 93054024 / 13; заявл. 02.12.93; опубл. 10.09.97, Бюл. № 25.

3. Пат. 2079254 RU, МГПС С 12 G 1/40, С 12 N 1/20II (С 12 Q 1/04. С 12 R 1:42). Питательная среда для выделения сальмонелл и шигелл / А.П.

Шепелин, И.И. Марчихина, Т.И. Бабаева, Л.П. Шолохова, Н.П. Приймак, И.Ю. Дмитриева, В.Б. Фролов; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии. № 93054025 / 13; заявл. 02.12.93; опубл. 10.05.97, Бюл. № 13.

4. Пат. 2103368 1Ш, МПК6 С 12 С? 1/04 / / С 12 N 1/20. Питательная среда для выделения и культивирования менингококков (менингоагар) / Т.В. Морозова, М.В.Храмов, А.П. Шепелин; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии. № 96101614 /13; заявл. 29.01.96; опубл. 27.01.98, Бюл. № 3.

5. Пат. 2139343 1Ш, МПК6 С 12 N 1/20, С 12 0 1/10 / / (С 12 N 1/20. С 12 II 1:19). Питательная среда для выделения возбудителя геморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом:Н7 (Сорбитол Е.соП 0157:Н7 агар) / М.В.Храмов, А.П. Шепелин, Н.И. Ажермачева, Г.М. Савельева; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии /№ 97118081 /13; заявл. 31.10.97; опубл. 10.10.99, Бюл. № 28.

6. Пат. 2101357 1Ш, МПК6 С 12 О 1/04. С 12 N 1/20. Питательная среда для выделения и культивирования коклюшного микроба / Л.Н. Алексеева, Л.В. Логачева, М.В.Храмов, А.П. Шепелин; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии № 95119951 / 13; заявл. 23.11.95; опубл. 10.01.98, Бюл.№ 1.

Список сокращений, используемых в тексте

Нам аминный азот

^общ общий азот

гиск Государственный институт стандартизации и контроля меди-

цинских биологических препаратов

ГРМ аббревиатура в названии питательных сред, указывающая на

то, что в состав препарата входит гидролизат рыбной муки

Да дальтон, единица молекулярной массы

КОЕ колоние образующие единицы

КТА кровяно-теллуритовый агар

ОКИ острые кишечные инфекции

ПГК панкреатический гидролизат казеина

ПГРМ панкреатический гидролизат рыбной муки

ПР промышленный регламент

РУ регистрационное удостоверение

СПА сухой питательный агар

СПБ сухой питательный бульон

СРГМ стимулятор роста гемофильных микроорганизмов

ТУ технические условия

ЭКД экстракт кормовых дрожжей

Подписано в печать:

22.04.2013

Заказ № 8396 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Шепелин, Анатолий Прокопьевич, Москва

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

03.01.06. -биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03. - микробиология

На правах рукописи

05201351 047

ШЕПЕЛИН АНАТОЛИЙ ПРОКОПЬЕВИЧ

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор член-корреспондент РАМН Дятлов Иван Алексеевич

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ....................................................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................5

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................14

1.1 .Белковые гидролизаты - основа производства питательных

сред..............................................................................................................................................................14

1.1.1 .Источники белкового сырья..................................................................................14

1.1.2.Способы переработки белкового сырья......................................................19

1.1.3 .Способы очистки гидролизатов........................................................................22

1.1 АВысушивание белковых гидролизатов......................................................23

1.1.5.Белковые гидролизаты, используемые в производстве питательных сред......................................................................................................................................23

1.2. Дифференциально-диагностические питательные среды для

выделения энтеробактерий..................................................................................................31

1.2.1 .Питательные среды Эндо и Левина..............................................................32

1.2.2.Питательная среда висмут-сульфит агар........................................................35

1.2.3.Питательная среда бактоагар Плоскирева и 88-агар......................38

1.3 .Питательные среды для выделения возбудителя дифтерии.... 41

1.4.Питательные среды для контроля микробной загрязнённости нестерильных лекарственных средств........................................................................45

1.5.Актуальность организации производства питательных сред... 50

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................................................................52

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................52

2.1 .Материалы................................................................................................................................52

2.1.1.Штаммы бактерий, используемые для контроля качества

питательных сред..........................................................................................................................52

2.2.Методы исследований....................................................................................................54

2.3.Методика получения гидролизатов....................................................................54

2.3.1.Методика проведения исследований при разработке технологии производства питательных сред......................................................................54

2.3.2.Физико-химические методы исследований............................................55

2.4. Методика проведения посева и учёта результатов..............................56

2.5.Программы сравнительных и Государственных испытаний.... 57

2.6. Статистическая обработка результатов..........................................................57

Глава 3 ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО

ГИДРОЛИЗ ATA РЫБНОЙ МУКИ..............................................................59

3.1. Физико-химический состав производственных партий рыбной муки................................................................................................................................................59

3.2. Продолжительность гидролиза..............................................................................59

3.3 .Температура и pH гидролиза....................................................................................65

3.4.Концентрация фермента................................................................................................68

3.5.Гидромодул ь............................................................................................................................73

3.6.Осветление и сушка гидролизатов......................................................................74

Глава 4 РАЗРАБОТКА СОСТАВА И УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ПИТАТЕЛЬНОГО БУЛЬОНА И ПИТАТЕЛЬНОГО

АГАРА....................................................................................................................................................82

Глава 5 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ.........................................86

3.3.1 .Питательная среда Эндо-ГРМ агар..................................................................86

3.3.2.Питательная среда Левина-ГРМ агар............................................................92

3.3.3 .Питательная среда Висмут-сульфит-ГРМ-агар....................................109

3.3.4.Питательная среда SS-arap....................................................................................123

3.4.Сравнительное исследование качества питательных сред............140

Глава 6 РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ

ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ - КОРИНЕБАКАГАРА..............................148

Глава 7 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ МИКРОБНОЙ ЗАГРЯЗНЁННОСТИ НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ................................................................................................161

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................................................178

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................184

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................188

ПЕРЕЧЕНЬ N

^общ

БВК

гиск

ГНЦПМБ

ГРМ

Да КОЕ КТА ОКИ

пгк

ПГРМ

ПР

РУ

СПА

СПБ

СРГМ

ТУ

ФС

экд эпд

СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ

- аминный азот

- общий азот

- белково-витаминный концентрат

- Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов

- Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

- аббревиатура в названии питательных сред, указывающая на то, что в состав препарата входит гидролизат рыбной муки

- дальтон, единица молекулярной массы

- колоние образующие единицы

- кровяно-теллуритовый агар

- острые кишечные инфекции

- панкреатический гидролизат казеина

- панкреатический гидролизат рыбной муки

- промышленный регламент

- регистрационное удостоверение

- сухой питательный агар

- сухой питательный бульон

- стимулятор роста гемофильных микроорганизмов

- технические условия

- Фармакопейная статья

- экстракт кормовых дрожжей

- экстракт пекарных дрожжей

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

В Российской Федерации ежегодно регистрируется 31-32 млн. случаев инфекционных заболеваний различной этиологии. В структуре инфекционных и паразитарных болезней преобладают острые инфекции верхних дыхательных путей множественной или неуточненной локализации (включая грипп), доля которых составляет 93-95% [44, 45].

Острые кишечные инфекции занимают второе место во всем мире по заболеваемости и уровню наносимого экономического ущерба, уступая только острым респираторным заболеваниям. По данным ВОЗ около 70% всех случаев ОКИ имеют вирусное происхождение и 30% бактериальную природу.

В последние годы в России наблюдалась устойчивая тенденция к росту заболеваемости ОКИ со средним ежегодным темпами прироста 6-7%. Показатель по заболеваемости в 1997 г. составлял 300 случаев на 100 тыс. человек, а в 2010 г. этот показатель составил более 550 случаев на 100 тыс. человек. В последние годы стабилизировался удельный вес ОКИ, вызванных возбудителями неустановленной этиологии, который в течение последних семи лет составляет от 62% до 69%, что особенно важно на фоне многолетней тенденции к росту показателей этой нозологии [96, 97, 105, 122, 171].

Для совершенствования микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, улучшения качества существующих и производства новых иммунобиологических препаратов большое значение приобретают микробиологические питательные среды. Производство сухих коммерческих дифференциально-диагностических питательных сред в России долгие годы базировалось на панкреатическом гидролизате кильки каспийской, гидролиза-тах казеина и пептоне ферментативном. Номенклатура питательных сред, выпускаемых в России, составляет около 100 наименований, тогда как каждая из ведущих зарубежных фирм (Merk, Oxoid, Bio-Meriux, Becton Dickinson, HiMedia) выпускает no 300-500 наименований сред. Недостаточный ассортимент сред в нашей стране приводит к практике их лабораторного изготовления, что естественно сказывается на их качестве и стандартности. Зарубежные фир-

мы производят питательные среды на основе гидролизатов мяса, сои, казеина, причём, доля питательных сред на основе ферментативных пептонов, переваров и экстрактов мяса составляет более 50% [160, 183, 187, 195, 196,197].

При рассмотрении вопроса замены пищевого белка в составе питательных сред на другие виды сырья, прежде всего, возникают проблемы их доступности и стандартности. В качестве источника белка может быть использована рыбная кормовая мука, содержание сырого протеина в которой составляет 60-70%. При панкреатическом гидролизе этого сырья очевидно, что будет проявляться специфичность фермента, а аминокислотный и пептидный составы получаемых гидролизатов могут быть близки к пептонам, получаемым из мяса, рыбы, казеина. Для приготовления такого вида гидролизатов необходимо создать технологические стадии, при которых будут все необходимые условия для получения конечного продукта с заданными свойствами [6].

Увеличение номенклатуры белковых основ целесообразно проводить только для сред специального назначения, в которых, как показывает зарубежный опыт, используются сердечно-мозговые и печеночные перевары, мясные и дрожжевые экстракты и др. По-видимому, путь, по которому развивается производство питательных сред за рубежом — максимальное количество сред из минимального числа белковых основ при соблюдении необходимой стандартности и экономичности является целесообразным. Проведение исследований в этом направлении гарантирует успешное получение питательных сред столь необходимых нашей стране [1, 104, 121].

До начала наших исследований в России существовало единственное специализированное предприятие — НПО «Питательные среды» (г. Махачкала). В 1995 г. Комиссией Совета Безопасности Российской Федерации было принято решение «Рекомендовать Минздравмедпрому России, Госсанэпиднадзору России и РАМН подготовить предложения по снятию с производства устаревших, недостаточно эффективных диагностических средств и питательных сред, разработке новых питательных сред, отвечающих современным требованиям. Принять меры к организации их производства, созданию дублирующих предприятий по выпуску питательных сред».

В 1993 г. Правительством Российской Федерации принято Постановление «О неотложных мерах по предупреждению заболеваний дифтерией в Российской Федерации». В исполнении указанного Постановления Государственным Комитетом санитарно-эпидемиологического надзора России поручено ГосНИИ прикладной микробиологии разработать и организовать промышленный выпуск питательной среды для выделения возбудителя дифтерии.

Роспотребнадзором отмечена необходимость ориентировать Центры гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, на приобретение питательных сред отечественного производства [110].

Всё возрастающие требования санитарно-эпидемиологического надзора, обусловленные расширением диагностики инфекционных заболеваний, среди которых социально-значимые инфекции (дифтерия, туберкулёз, ОКИ и др.) занимают одно из лидирующих положений, подчеркивают остроту проблемы. Проведение научных исследований по разработке технологии и организации производства питательных сред вносят существенный вклад в обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения России [49].

Задачи исследования:

1. Выявить альтернативные источники белкового сырья в производстве питательных сред, определить их аминокислотный и миненральный состав.

2. Определить оптимальные параметры получения панкреатического гидролизата рыбной муки, изучить биохимический и аминокислотный состав получаемых гидролизатов, провести сравнительные исследования получаемых препаратов с известными аналогами и разработать технологию его производства.

3. Изучить ростовые свойства панкреатического гидролизата рыбной му-

ки с использованием широкого круга микроорганизмов различных таксономических групп, определить состав питательных сред общего назначения питательного агара - ГРМ-агара, питательного бульона - ГРМ-бульона.

4. С использованием панкреатического гидролизата рыбной муки определить оптимальные составы питательных сред для выделения и дифференциации энте-робактерий: среды Эндо-ГРМ агара, Левина-ГРМ агара, Висмут-сульфит-ГРМ агара, ЭЗ-агара.

5. Экспериментально обосновать состав и разработать сухую питательную среду для выделения возбудителя дифтерии, не требующую добавления натив-ной крови.

7. Разработать нормативно-техническую документацию, провести государственные испытания и зарегистировать питательные среды в качестве изделий медиицнского назначения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработана и экспериментально обоснована технология получения панкреатического гидролизата рыбной муки, являющегося в физиологическом и химическом отношении полноценным биологическим препаратом для конструирования бактериологических питательных сред и полноценной питательной основой для выращивания широкого круга микроорганизмов, не уступающего пептону ферментативному.

3. Новые составы питательных сред: Эндо-ГРМ агар, Левина-ГРМ агар, Висмут-сульфит ГРМ агар, 88-агар - обеспечивают выделение и дифференциацию энтеробактерий.

4. Созданная питательная среда - коринебакагар, в состав которой входит панкреатический гидролизат рыбной муки и стимулятор роста гемофильных

микроорганизмов по ростовым свойствам не уступает средам для выделения возбудителя дифтерии лабораторного приготовления с добавлением натив-ной крови

5. Сконструированные сухие питательные среды с использованием панкреатического гидролизата рыбной муки широко используются при контроле микробной загрязнённости нестерильных лекарственных средств.

Научная новизна

Впервые, с использованием микробиологических, биохимических и масспектрометрических исследований показано, что панкреатический гидро-лизат рыбной муки является в физиологическом и химическом отношении полноценным биологическим препаратом для конструирования бактериологических питательных сред. Аминокислотный состав и другие важные для роста бактерий показатели гидролизата находятся на уровне таких классических питательных основ как пептон ферментативный и ферментативные гид-ролизаты мяса. В своём составе ПГРМ содержит 3,5% аминного азота, 10% общего азота, 18% свободных аминокислот, 20% хлористого натрия.

Впервые, на основе исследования параметров роста ряда патогенных бактерий и их основных свойств, важных для диагностических исследований, с использованием разработанного ПГРМ как питательной основы, сконструирован ряд питательных сред для культивирования, выделения и дифференциации бактерий: ГРМ-агар, ГРМ-бульон, Эндо-ГРМ агар, 88-агар, Левина-ГРМ агар, Висмут-сульфит-ГРМ агар.

Впервые разработаны оптимальные прописи питательных сред для определения микробной обсеменённости нестерильных лекарственных средств

на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Указанные препараты прошли все этапы государственной регистрации и рекомендованы для применения в практике здравоохранения.

Теоретическая значимость

Обоснована возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки как основы питательных сред для культивирования широкого спектра микроорганизмов. Обоснована возможность замены в рецептуре питательных сред пищевого сырья (пептон ферментативный, ферментативные гидролизаты мяса, килька каспийская, кровь и др.) на непищевые компоненты. Разработаны теоретико-методологические основы и методические подходы по замене панкреатический гидролизат кильки каспийской, гидролизат казеина, пептона ферментативного на панкреатический гидро�

Информация о работе

Шепелин, Анатолий Прокопьевич
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка технологии производства панкреатического гидролизата рыбной муки и конструирование на его основе бактериологических питатетльных сред - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы