Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологических приемов малоотходных технологий в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологических приемов малоотходных технологий в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина"

Жулидов Иван Михайлович

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ МАЛООТХОДНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ПРОИЗВОДСТВЕ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 ИАР 2013

Саратов-2013

005050653

005050653

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководитель: кандидат медицинских наук, доцент

Никифоров Алексей Константинович

Официальные оппоненты: Гулий Ольга Ивановна

доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии микроорганизмов

Морозов Николай Васильевич

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань), заведующий лабораторией бионанотехнологии с основами микробиологии

Ведущая организация: ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится ¡-(.CQjPiU^ . 2013 г. в 11 ^ часов на

заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» "по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «Z7 13 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Карпунина J1.B.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема охраны окружающей среды от загрязнения отходами в последние десятилетия является актуальной как в России, так и за рубежом. На предприятиях Российской Федерации ежегодно образуется около 90 млн тонн токсичных промышленных отходов, из которых 87 млн тонн относятся к III и IV классам опасности (Санитарная очистка ... , 1990). По оценке Росприроднадзора, на конец 2010 года в России было накоплено около 90 млрд тонн отходов разного происхождения, из них порядка 16 млрд тонн твердых бытовых отходов (ТБО). Объем ежегодного образования ТБО составляет более 40 млн тонн. В 2011 году в России перерабатывалось только 6% ТБО, что привело к потере 90% продукции на рынке вторичного сырья. Однако потенциал рынка позволяет перерабатывать до 42% от всей массы образуемых отходов (Особенности организации бизнеса ... , 2010; РБК исследования рынков ..., 2012).

После вступления в силу Федерального закона от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании» идет процесс наработки общих и специальных технических регламентов. С гигиенических позиций важно, чтобы в каждом регионе, на каждом предприятии решались вопросы защиты окружающей среды. Одним из серьезных вопросов, требующих должного отражения, является решение вопросов обращения с отходами производства и потребления. По данным ООН, от 25 до 33% регистрируемых в мире заболеваний напрямую связаны с низким качеством окружающей человека среды; в 18% случаев причиной преждевременной смерти являются неблагоприятные условия окружающей среды, из них 1% приходится на негативное воздействие промышленных и бытовых отходов (Онищенко, 2008). На фоне усиливающегося антропогенного воздействия на окружающую среду ежегодно в Российской Федерации регистрируется более 30 млн. случаев инфекционных и паразитарных заболеваний (доклады Главного государственного санитарного врача Российской Федерации, 2006-2011).

В медицинской практике для профилактики и лечения инфекционных заболеваний широко применяют медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) - сыворотки, вакцины, иммуноглобулины и т. д. Производство МИБП сопровождается образованием значительного количества белковых отходов. При изготовлении сыворотки побочными продуктами являются форменные элементы крови и фибрин, при получении иммуноглобулинов - белковые фракции (фибрин, альбумин, а-, р- и у-глобулины), в вакцинном производстве - культуральная жидкость. Все выше перечисленные отходы сегодня успешно перерабатываются различными биофабриками и научно-производственными объединениями в ценные продукты различного назначения (Грызык, 1990; Агольцов, 1999; Шишкин, Тимирова, Степаненко, 1999; Кузьмиченко и др. 2003; 2009; Бердинських, Курищук, Лялюшко, 2006; Городницкая, Мартынов, Осолодченко, 2007; Байбулатова, Волкова, 2009; Huang, Gang, 2001; Vaiman, Eviatar, Segal, 2002; Deuk, et al., 2003).

Однако комплексные программы по утилизации основных типов отходов, образующихся в процессе производства МИБП и, в частности, гетерологичного антираби-ческого иммуноглобулина (АИГ), в литературе не описаны.

При производстве антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади в РосНИПЧИ «Микроб» в качестве отходов ежегодно образуется около 3 т эритроцитарной массы, более 250 кг фибрина и 20 м3 спиртосодержащих стоков (IV-V классы опасности). Указанные отходы являются весьма ценным вторичным сырье-

вым ресурсом (ВСР) для получения продуктов, которые в дальнейшем могут быть использованы при производстве МИБГТ.

В этой связи разработка комплексной программы по переработке отходов производства антирабического иммуноглобулина с получением продуктов, которые могут быть вовлечены в замкнутый цикл производства МИБП, является важным и перспективным направлением научных исследований.

Цель работы — разработка биотехнологических приемов переработки отходов производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина - эритроцитарной массы, фибрина и спиртосодержащего стока.

Задачи исследования:

1. Разработать технологические приемы переработки эритроцитарной массы для получения биологически активной добавки к рациону продуцентов и выделения сорбированного антирабического иммуноглобулина

2. Экспериментально обосновать биотехнологическую схему получения жидкой и сухой форм гидролизата фибрина и провести сравнительный анализ физико-химических свойств белковых гидролизатов, полученных из традиционного сырья и фибрина.

3. Оценить возможность применения гидролизата фибрина при конструировании питательных сред для глубинного культивирования холерных вибрионов в производстве профилактических и диагностических препаратов.

4. Разработать технологические приемы регенерации утильного спиртосодержащего стока и оценить возможность применения восстановленного спирта для осаждения у-глобулина.

Научная новизна: заключается в том, что впервые научно обоснованы и разработаны основные биотехнологические приемы комплексной утилизации отходов производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Впервые экспериментально обоснована биотехнологическая схема переработки эритроцитарной массы из крови продуцентов антирабической сыворотки, предусматривающая получение ценных биологических продуктов. Создана технология получения гидролизата фибрина жидкой и сухой форм и показана эффективность его применения в качестве основы питательных сред для глубинного культивирования холерных вибрионов в производстве профилактических и диагностических препаратов, что подтверждено патентом «Питательная среда для глубинного культивирования холерного вибриона», № 2425866 РФ, МПК С12>П/20, С12К1/63; 10.08.2011, Бюл. № 22. Впервые разработан биотехнологический алгоритм регенерации этилового спирта. Показана возможность использования регенерированного этилового спирта на заключительных стадиях выделения антирабического иммуноглобулина.

Практическая значимость работы:

Предложена технология выделения методом десорбции резервного количества антирабического иммуноглобулина из отхода производства - эритроцитарной массы, что позволяет увеличить выход продукта в среднем на 19% без дополнительного привлечения продуцентов.

Разработана инструкция по эксплуатации сушильной установки для получения сухой эритроцитарной массы с учетом конструкционных особенностей аппарата и биологических характеристик объекта высушивания.

Показана возможность использования питательных сред сконструированных на основе гидролизата фибрина для глубинного культивирования штаммов холерного вибриона при производстве профилактических и диагностических препаратов. Разра-

ботан проект ТУ «Питательная основа микробиологических сред - сухой гидролизат фибрина».

Разработана инструкция по эксплуатации регенерационной установки и стандартная операционная процедура получения спирта с учетом термодинамических характеристик спиртосодержащего стока и технологических особенностей химического реактора.

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации «Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных микробиологических сред для культивирования микроорганизмов» и «Выделение сорбированного на поверхности эритроцитов иммунной крови продуцентов ан-тирабического иммуноглобулина - дополнительного источника получения препарата», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором института, протокол № 2 от 21.04.10 г., протокол № 5 от 23.09.10 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанные биотехнологические приемы по переработке отхода производства антирабического иммуноглобулина - эритроцитарной массы обеспечивают дополнительный выход специфического иммуноглобулина из иммунной крови и получение ценной минеральной подкормки для лошадей-продуцентов.

2. Экспериментально обоснована биотехнологическая схема утилизации фибрина как отхода производства, позволяющая получить ферментативный гидролизат для производства микробиологических питательных сред.

3. Питательные среды, приготовленные на основе гидролизата фибрина жидкой и сухой форм, по физико-химическим и биологическим показателям соответствуют требованиям нормативных документов и пригодны для культивирования холерных вибрионов.

4. Предложен биотехнологический прием по регенерации этанолсодержащего отхода, обеспечивающий рециклинг восстановленного ректификата в технологический процесс производства антирабического иммуноглобулина.

5. Экспериментальные серии антирабического иммуноглобулина, полученного с использованием разработанных приемов, по качественным характеристикам соответствуют требованиям нормативной документации на иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций.

Работа выполнена в лаборатории профилактических иммуноглобулинов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательской темы № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на: итоговой научно-практической конференции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2009-2012 г.г.), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010 г.), научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010-2011г.г.), VI Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 г.), научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Инновационные технологии обеспечения противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 2011 г.), X съезде Всероссийского научно-практического обще-

ства эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012 г.), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (Пермь, 2012 г.), научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (Иркутск, 2012 г.), Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве», посвященной 100-летию СГАУ имени Н.И. Вавилова (г. Саратов, 2013 г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент на изобретение № 2425866.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих объекты, материалы и методы исследований, результатов и обсуждений, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 185 источников, в том числе 154 - отечественных и 31 - зарубежных. Объем диссертации составляет 124 страницы машинописного текста, включает 14 таблиц, 15 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты, материалы н методы исследований

Объекты исследования. В работе использовали штамм фиксированного вируса бешенства Virus fixe CVS, предоставленный ФГБУ «НЦ ЭСМП Минздравсоцразви-тия»; тест-штаммы Yersinia pestis EV НИИЭГ, Vibrio cholerae OI P-l (145) и производственные штаммы V. cholerae OI М-41, V. cholerae 569В, V. cholerae не OI 105, полученные из Госколлекциии патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Производственные штаммы V. cholerae OI М-41 и V. cholerae 569В используют в процессе производства холерной вакцины. Штамм V. cholerae не 01 105 применяют в качестве адсорбента при производстве холерной диагностической агглютинирующей сыворотки OI.

В работе использовали белых мышей (Mus musculus) обоего пола линии BALB/c массой 10-12 г для постановки реакции нейтрализации (РН) фиксированного вируса бешенства. Для осуществления испытания на токсичность использовали беспородных морских свинок (Cavia porcellus) обоего пола, массой 250-350 г и беспородных белых мышей массой 18-20 г. Определение пирогенности антирабического иммуноглобулина проводили на кроликах (Oryctolagus cuniculus) обоего пола породы «Шиншилла» массой 1,5-2,5 кг.

В работе использованы отходы, образующиеся согласно биотехнологической схемы производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина - эритроци-тарная масса, фибрин и спиртосодержащий отход.

Материалы и методы исследований. Антирабический у-глобулин выделяли из иммунной сыворотки риванол-спиртовым методом (Карпов, Прегер, Синельников, 1976; Тихонов и др., 2005; Краснопольский, Борщевская, 2008).

Специфический иммуноглобулин, сорбированный на поверхности эритроцитов, выделяли методом десорбции с применением неионных детергентов (Першин, Кузьмин, Филатов, 1994; Емельянов, Чепулис, Соколов, 1999).

Основные физико-химические и биологические свойства иммуноглобулина ан-тирабического, десорбированного с поверхности эритроцитов, и иммуноглобулина антирабического, полученного с применением восстановленного этилового спирта, контролировали по следующим показателям: описание - визуальным методом; подлинность — в реакции диффузной преципитации; прозрачность и цветность - спек-трофотометрическим методом; содержание белка - методом с биуретовым реактивом; электрофоретическую однородность - электрофоретическим методом (Фармакопейная статья 42-3874-99, 2000); pH - потенциометрическим методом; содержание спирта- методом перегонки; пирогенность и токсичность - биологическим методом (Государственная Фармакопея РФ XII, 2008); содержание риванола - визуальным методом (Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96, 1998); специфическую активность-in vivo в биологической РН вируса бешенства на белых мышах (Meslin, Kaplan, Koprowski, 1996) и in vitro в прямом дот-иммуноанализе (ДИА) по общепринятой методике с использованием конъюгата с наночастицами коллоидного золота (Шарапова, Абрамова, Никифоров и др., 2010).

Контроль показателей крови лошадей-продуцентов антирабической сыворотки проводили по следующим показателям: количество эритроцитов - унифицированным методом подсчета в счетной камере, концентрация гемоглобина -гемоглобинцианидным методом с применением ацетонциангидрина и цветной показатель (Кондрахин, Курилов, Малахов, 1985; Риган, Сандерс, ДеНикола, 2000).

В настоящей работе использовали методы, применяемые для контроля качества белковых основ и питательных сред по биологическим и физико-химическим показателям в соответствии с требованиями МУК 3.3.2.2124-06 (Методические указания МУ 3.3.2.2124-06, 2007), методическим руководством (Дятлов и др. 1991), МУК 4.2.2316-08 (Методические указания МУК 4.2.2316-08, 2008). Дополнительно применяли реакцию диффузной преципитации (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА) для количественного учета синтеза холерного токсина (XT) и О-антигена (О-АГ). Определение фаголизабельных свойств микроорганизмов проводили по методу Грациа (Адаме, 1961). В гидролизате дополнительно к регламентированным показателям, характеризующим химический состав питательной основы, определяли содержание кальция методом де Ваарда (Неменова, 1972); магния - методом Гадиента (Петрунькина, 1961); железа - методом колориметрии с роданистыми солями, общего фосфора - методом колориметрии с молибдатом аммония в присутствии восстановителя, неорганического фосфора - методом Фиске-Суббароу (Фердман, Сопин, 1957) и углеводов - фенол-серным методом (Dubois et al. 1956).

В работе использовали метод глубинного культивирования производственных штаммов V. cholerae на реакторах-ферментерах РЗРЯ-6/0,63. Культивирование тест-штаммов в лабораторных условиях осуществляли согласно МУ 3.3.2.2124-06 (Методические указания МУ 3.3.2.2124-06, 2007).

Определение объемной доли этилового спирта проводили ареометрическим методом; определение цвета, прозрачности, запаха, вкуса - органолептическим и визуальным методами; определение окисляемости - фотоэлектроколориметрическим методом (ГОСТ Р 51652-2000).

Обработку результатов проводили с применением методов вариационной статистики (Ашмарин, Воробьев, 1962; Лакин, 1990), рассчитывали степень

достоверности различий по Стьюденту (р).

Результаты исследований и их обсуждение Разработка технологических приемов переработки эритроцитарной массы и использование полученных продуктов

Возможность переработки эритроцитарной массы - отхода, образующегося после сепарирования иммунной крови продуцентов, связана с высокой сорбционной емкостью эритроцитов. В настоящее время эритроцитарная масса, образующаяся на этапе получения иммунной плазмы, уничтожается путем сжигания. Между тем, с поверхности мембран эритроцитов возможно выделение специфического иммуноглобулина методом десорбции. Нами предложен прием обработки эритроцитарной массы неионными детергентами Tween 80 и Span 20 с последующим выделением гамма-глобулина риванол-спиртовым методом. Экспериментально доказано, что оптимальным является десорбционный раствор, содержащий 0,9% NaCl с 0,5% неионного детергента Tween 80 рН 8,2. Максимальный выход десорбированного иммуноглобулина со 100 см эритроцитарной массы в среднем составил (1,23±0,15)%. С применением данного детергента получены три экспериментальные серии десорбированного АИГ. При изучении основных качественных характеристик десорбированного иммуноглобулина зарегистрированы показатели, соответствующие требованиям ФСП Р N002639/01 на «Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций». Содержание белка в препарате экспериментальных серий составило (9,1 ±0,1)% при требовании ФСП от 9 до 11%. Значение специфической активности, выявленное in vivo в РН, составило 345 МЕ/мл при требовании ФСП не менее 150 МЕ/мл. Титр специфических антител, зарегистрированный в ДИА - 1:5000 (рисунок 1).

ft • • •

i í ф 1 2 3 0 • ©

• f 9 ф •

И Еь

а б

Рисунок 1 - Определение активности антирабического иммуноглобулина десорбированного с поверхности эритроцитов in vitro в дот-иммуноанализе

Примечание - а) 1 ряд - иммуноглобулин, десорбированный с эритроцитов 0,9% NaCl рН 4 5 и 0,5% Твин 80. Разведение с 1:160. Титр 1:5000;

2 ряд - иммуноглобулин, десорбированный с эритроцитов 0,9% NaCl рН 8,2 и 0,5% Твин 80. Разведение с 1:160. Титр 1:5000;

3 ряд - гетерологичный антирабический иммуноглобулин серия 86 (положительный контроль). Разведение с 1:160. Титр 1:10000;

4 ряд - нормальная лошадиная сыворотка (отрицательный контроль), с цельного разведения;

б) 1 ряд - иммуноглобулин, десорбированный с эритроцитов 3% NaCl рН 8,2 и 0 5% Span 20. Разведение с 1:320. Титр 1:2500;

2 ряд - гетерологичный антирабический иммуноглобулин серия 87 (положительный контроль). Разведение с 1:320. Титр 1:5000;

3 ряд - нормальная лошадиная сыворотка (отрицательный контроль), с цельного разведения.

Результаты электрофореза подтвердили однородность десорбированного иммуноглобулина - была получена практически 100% фракция у-глобулина без примесей альбумина, а-, Р - глобулинов (рисунок 2).

альбумин —> а - глобулин —> Р - глобулин —»

у - глобулин —>

Рисунок 2 - Электрофореграммы антирабического иммуноглобулина, десорбированного с поверхности эритроцитов (на пленке из ацетатцеллюлозы),

окраска амидочерным Примечание - 1 - иммуноглобулин, десорбированный с эритроцитов 0,9% NaCl рН 8,2 и 0,5% Твин 80;

2 - иммуноглобулин, десорбированный с эритроцитов 0,9% NaCl рН 4,5 и 0,5% Твин 80;

3 - иммуноглобулин, десорбированный с эритроцитов 3% NaCl pi I 8,2 и 0,5% Span 20;

4 - нормальная лошадиная сыворотка;

5 - антирабическая лошадиная сыворотка;

6 - гетерологичный антирабический иммуноглобулин коммерческой серии 86.

Следовательно, для увеличения выпуска антирабического иммуноглобулина без повышения численности лошадей-продуцентов имеется резерв - иммуноглобулины, сорбированные на поверхности форменных элементов иммунной крови. Выявлено, что дополнительный выход иммуноглобулина после обработки эритроцитов десорби-рующим раствором составляет от 10 до 19%, в зависимости от применяемого десор-бента.

Еще один способ переработки эритроцитарной массы - получение из нее ценной минеральной подкормки для лошадей-продуцентов. Известно, что систематическое вскармливание лошадям эритроцитов хорошо действует на регенерацию крови и значительно ускоряет восстановление гемоглобина при кровопускании (Козляков, 1968). Для получения качественной белковой подкормки продуцентов была разработана биотехнологическая схема высушивания эритроцитарной массы методом распыления на установке марки КЯУЛ, где высокая температура обеспечивается нагнетаемым в сушильную камеру горячим воздухом. В ходе экспериментов подобран оптимальный температурный режим высушивания эритроцитов, предохраняющий их от обугливания: на входе в камеру - 125°С, на выходе - 105°С. Для лучшей адсорбции эритроцитов на наполнителе был подобран оптимальный размер фторопластовых частиц, который соответствовал 0,4 см3 и обеспечивал эффект «псевдокипящего слоя» при конвекционной сушке. Предварительно перед высушиванием проводили разбавление сырца - эритроцитарной массы водой очищенной до конечной концентрации 20%.

W 1 *

1 2 3 4 5 6

Скорость-высушивания составила 5 кг/ч- из рас-чета-похухой-массе. Полуиены три эксперимеиталыше^серии^сухих.эршращтож-общим. весом-19,2 кг из-300 дм- ... жидкой эритроцитарной массы. Экспериментально доказано, что включение в рацион питания лошадей-продуцентов антирабической сыворотки пищевой добавки на основе сухой эритроцитарной массы способствует стабилизации показателей красной крови животных, находящихся под иммунизацией и подвергающихся кровопусканиям. Показатели гемоглобина в опытной группе лошадей, получавших подкормку, были достоверно выше показателей гемоглобина у продуцентов контрольной группы — (107,20±1,59) г/л и (98,80±2,35) г/л соответственно. Полученные данные были статистически обработаны с установлением значимости их различий путем подсчета критерия Стьюдента по результатам 6 повторов - 1ст>2; р<0,05.

За рабочий год (10 месяцев) от 100 лошадей-продуцентов можно получить около 3 т высокопитательного белкового корма-сырца или более 160 кг сухой эритроцитарной массы из 8500 дм3 иммунной крови.

Таким образом, отработаны биотехнологические приемы по переработке одного их отходов производства иммуноглобулина - эритроцитарной массы с получением специфического иммуноглобулина и ценной пищевой подкормки.

Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных микробиологических сред для культивирования микроорганизмов

Отходом фракционирования гипериммунной плазмы продуцентов является фибрин — ценнейшее белоксодержащее сырье. Фибрин содержит полноценный по аминокислотному составу белок, близкий к белку мышечной ткани — миозину, а также необходимые для питания бактерий макро- и микроэлементы. В связи с этим вполне обосновано использование фибрина как альтернативы мясному сырью и казеину для изготовления питательных сред.

Для получения питательной основы фибрин подвергали гидролизу ферментами поджелудочной железы крупного рогатого скота при рН 8,0. Предварительно проводили термическую обработку фибрина при 100°С в течение 30 мин и для лучшей денатурации белка применяли механическое измельчение. Содержание аминного азота в гидролизате фибрина составило от 0,5 до 0,7%. По истечении 6 мес созревания гидролизата осуществляли контроль качества белковой основы микробиологических сред согласно нормативной документации. Было проведено сравнительное изучение физико-химических свойств панкреатических гидролизатов фибрина, мяса крупного рогатого скота и казеина , (таблица 1).

Анализ данных показал, что гидролизаты фибрина и пищевого сырья близки по большинству показателей, что вполне объяснимо при использовании одних и тех же технологических приемов при изготовлении гидролизатов. Однако гидролизат фибрина имеет преимущество как более стандартный, поскольку для его изготовления используегся сырье,-{[артии-коюрого-имеют-минималь«ые-различи»-«о-общим-био—— химическим показателям, аминокислотному и минеральному составам, в отличие, например,, от мяса крупного рогатого скота_____

Следующий этап нашей работы заключался в приготовлении питательной среды: . из экспериментального жидкого ферментативного гидролизата фибрина (ФГФ) и исследовании ее свойств. Бульон готовили из расчета содержания в нем аминного азота 0,2%.

Таблица 1 ^ Сравнительнаяосарактеристикаи})юика--химических-свойств _ферментативныхлздролизатов из белкового сырья__ ___

Показатель Гидролизат фибрина (экспериментальные серии) Гидролизат мяса КРС (производственные серии) Гидролизат казеина (производственные серии)

Описание Прозрачная жидкость темно-коричневого цвета Прозрачная жидкость темно-коричневого цвета Прозрачная жидкость темно-коричневого цвета

Сухой остаток, % 6,06±1,16 8,05±0,99 10,27±0,62

Пептон, % 1,84±0,12 2,49±0,93 2,51 ±0,11

Углеводы, мкг 425±0,00 * *

Железо, мкг 393±12 404±171 438±138

Фосфор общий, % 0,048±0,01 0,080±0,02 0,100±0,005

Хлориды, % 0,26±0,01 0,08±0,00 *

Кальций, % 0,0005±0,00 0,0018±0,0006 0,0100±0,00

Магний, % 0,0022±0,0002 0,0032±0,0021 0,0170±0,02

Примечание — * - не определяли.

По физико-химическим и биологическим показателям питательные среды на основе гидролизата фибрина при выращивании на них тест-штаммов холерного вибриона и чумного микроба удовлетворяли требованиям нормативной документации (НД).

Об эффективности применения питательных сред, приготовленных на основе гидролизата фибрина, для глубинного культивирования холерных вибрионов свидетельствуют данные экспериментального масштабированного выращивания производственных штаммов V. cholerae 01 М-41, используемого для изготовления холерной вакцины, и К- cholerae не Ol 105; применяемого в качестве адсорбента-при-производ-стве холерной диагностической агглютинирующей сыворотки 01 (рисунок 3).

При культивировании V. cholerae не Ol 105 показатель эффективности составил 40 млрд м.к./мл, тогда как на традиционной среде из гидролизата мясного сырья - 18 млрд м.к./мл. При культивировании V. cholerae Ol М-41 этот показатель имел значение 158 млрд м.к./мл, в то время как на традиционной-среде.из,ка!ешшвого_гидроли-зата - 111,4 млрд м.к./мл. Следовательно, показатель эффективности сред, полученных на основе гидролизата фибрина, в 1,5-2 раза выше по сравнению со средами, полученными на основе гидролиза мяса и казеина. Полученные данные были статистически обработаны с установлением значимости их различий путем подсчета критерия Стьюдента по результатам 6 повторов - tCT>2; р<0,05.

При определении-количества-О-антигена-в-центрифугате-формалинизированной-культуры V; cholerae М-41, выращенной на бульоне-из гидролизата фибрина и

традиционном__казеиновом_бульоне, _ регистрировали___положительную__реакцию

преципитации в разведении соответственна 1/16 и 1/8 при нормировашявсзлаясшш: не менее 1/8.

■ среда на основе гидролизам мяса КРС

■ среда на основе гидрошпага фибрина

• среда на основе гидролизата казенна - среда на основе гидролизата фибрина

Рисунок 3 — Эффективность жидких питательных сред для глубинного культивирования V. cholerae не OI 105 (а) и V. cholerae 01 М-41 (б)

Если учесть, что для производства 100 л питательной среды требуется 40 л гидролизата фибрина, а за год от 100 лошадей возможно получить свыше 250 кг фибрина или 250 л питательной основы, то, используя данный отход, можно ежегодно производить не менее 1000 л питательного бульона для глубинного культивирования микроорганизмов.

Научно-практический интерес представляло получение и изучение свойств сухой формы питательной основы из фибрина, поскольку сухая форма имеет более долгий срок хранения и удобнее в использовании. Для получения сухого гидролизата жидкую фибриновую основу предварительно концентрировали методом выпаривания на установке вакуум-выпарной УВВ-50 с подбором оптимальных параметров. Общий объем трех серий жидкого гидролизата фибрина составил 240 дм3, общий объем трех серий сконцентрированного - 35,5 дм3.

Концентрированную основу высушивали на установке распылительного типа КЯУЛ методом «псевдокипящего слоя», с подбором оптимальных условий. В сериях сухого гидролизата фибрина отсутствовали следы конгломерации, обугливания, излишняя гигроскопичность. По агрегатному состоянию высушенный ФГФ представлял собой мелкодисперсный порошок с нежно-желтым оттенком. Результаты анализа физико-химических параметров сухого соответствовали требованиям нормативной документации.

Всего было изготовлено три экспериментальных серий сухой формы гидролизата фибрина. Выход конечного продукта составил 1,9 кг из 240 дм3 жидкого гидролизата фибрина.

На основе сухого гидролизата фибрина были сконструированы жидкие и плотные питательные среды для культивирования холерных вибрионов.

Для исследования биологических показателей экспериментальных питательных сред для культивирования холерных вибрионов использовали тест-штамм V. cholerae OI P-l (145), производственные штаммы: V. cholerae М-41 и V. cholerae 569 В.

По физико-химическим, биохимическим и биологическим показателям жидкие и плотные питательные среды на основе ферментативного гидролизата фибрина удовлетворяли требованиям НД.

Для моделирования условий глубинного культивирования производственных штаммов V. сИоІегае 569 В и К сИоІегае М-41 при производстве холерной вакцины были проведены эксперименты по малообъемному глубинному выращиванию холерных вибрионов на экспериментальных и контрольной питательных средах. Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты малообъемного глубинного культивирования штаммов _V. сіюіегае 569 В и V. сііоіегае М-41

Жидкие среды

ФГФ

V. сИо/егае 569 В

Эффективность, м.к./мл

15-10

О-АГ (титр РДП)

1/2

ХТ

Титр РДП

1/2

ИФА, мкг/мл

5,13

V. сИокгае М-41

Эффективность, м.к./мл

20-109

О-АГ (титр РДП)

1/2

О-АГ* (титр РДП)

1/32

ФГФ с добавле-нием 1%АПД

20-10

1/2

1/2

5,28

16-10

1/2

1/16

Контроль, среда по Хоттинге-ру рН (7,6±0,1)

17-10

1/2

1/2

6,13

20-10

1/2

1/32

Примечание -трифугате.

- концентрация О-АГ (титр РДП) в формализированном безмикробном цен-

При глубинном культивировании штаммов V. сИокгае 569 В и К. скокгае М-41 на экспериментальных и контрольной среде получены сопоставимые результаты как по способности накапливать биомассу, так и продуцировать О-антиген (О-АГ) и холерный токсин (ХТ).

Исследование биологических показателей экспериментальных питательных сред на основе сухого гидролизата фибрина (рН 7,2) для культивирования чумного микроба проводили на тест-штамме У. /;ез7и- ЕУ линии НИИЭГ. Приготовленные из моноосновы ФГФ питательные среды для культивирования чумного микроба содержали 0,6; 0,8; 1,0% аминного азота в жидкой (бульонной) среде и 0,8; 1,0% в плотной (ага-ризованной) среде. Вариантом были среды с основой из гидролизата фибрина и стимулирующей добавкой автолизата пекарских дрожжей (АПД) с содержанием аминного азота в жидкой и плотной среде 0,6; 0,7; 1,0; 1,2%. Результаты испытаний показали, что среды, приготовленные из сухой основы ФГФ с содержанием аминного азота в жидкой и плотной среде соответственно 0,8; 1,0% и 0,8% соответствуют требованиям МУ 3.3.2.2124-06 и являются пригодными для культивирования чумного микроба.

Они обеспечивали типичный рост тест-штамма К реу/й ЕУ линии НИИЭГ, однако несколько уступали по показателю чувствительности контрольной среде, приготовленной из гидролизата по Хотгингеру (ОРХ). Среды на основе сухого ФГФ с использованием ростостимулирующей добавки АПД с содержанием аминного азота в

жидкой и плотной среде 0,6; 0,7% соответствуют требованиям МУ 3.3.2.2124-06 и могут быть использованы для культивирования чумного микроба. В опыте они обеспечивали типичный рост тест-штамма ЕУ линии НИИЭГ, не уступали по показателю чувствительности контрольной среде, приготовленной из гидролизата по Хот-тингеру.

Таким образом, из отхода производства - фибрина путем ферментативного гидролиза получена питательная основа для микробиологических сред. Экспериментальные плотные и жидкие питательные среды, приготовленные на основе жидкой и сухой форм гидролизата фибрина, соответствуют требованиям НД и могут быть использованы в микробиологической практике для культивирования микроорганизмов, в том числе для глубинного культивирования холерных вибрионов.

Разработка способа регенерации этанола из спиртосодержащих отходов

Переработку еще одного органического отхода производства антирабического иммуноглобулина — спиртосодержащего стока, образующегося после осаждения у-глобулина 96% этиловым спиртом, проводили на оригинальной регенерационной установке, сконструированной на базе емкости реактора РЗРЯ рн-6/0,63-1нж. Процесс регенерации спиртосодержащего отхода (фугата) проводили при максимальной температуре кипения, равной 98°С, температура в дефлегматоре на всем протяжении цикла поддерживалась в пределах 78,8°С. Производительность регенерационной установки составила 7 л/ч. Первые 3-5 л легколетучих фракций (хлороформсодержащие соединения) и остатки после регенерации с 1% содержанием спирта утилизировали в канализационную систему. Объемная доля этилового спирта после процесса регенерации составила (93±1)% (таблица 3).

Таблица 3 — Основные физико-химические показатели экспериментального _ ректификованного этилового спирта_

Анализируемые показатели Показатели по ГОСТ Р 51652-2000 Фактические показатели

Внешний вид прозрачная жидкость, без посторонних частиц прозрачная жидкость, без посторонних частиц

Цвет бесцветная жидкость бесцветная жидкость

Вкус и запах характерный без привкуса и запаха посторонних веществ характерный без привкуса и запаха посторонних веществ

Объемная доля этилового спирта, % не менее 96,3 93±1

Объемная доля метилового спирта, % не более 0,02 менее 0,02

Окисляемость, мин не менее 22 26±3

Как видно из таблицы, основные показатели экспериментально-полученного ректификованного этилового спирта соответствуют ГОСТ «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия», однако, процентное содержание объемной доли этилового спирта несколько уступает требованиям норматимвной документации, что вызвано ограничением размера ректификационной колонны, зависящего от высоты эксплуатируемого помещения. Тем не менее, учитывая, что процесс осаждения специфического гамма-глобулина проводится при конечной концен-

трации спирта в рабочем растворе 25%, восстановленный этанол вполне применим в производстве иммуноглобулина, что было доказано нами экспериментально.

Для изучения возможности применения регенерированного (93±1)%, этилового спирта в производстве гетерологичного АИГ было проведено три экспериментальных цикла фракционирования антирабической лошадиной сыворотки риванол-спиртовым методом в лабораторных условиях. В результате осаждения были получены три осадка специфического иммуноглобулина. Каждый осадок разводили физиологическим раствором, приготовленным на воде для инъекций, в пропорции 1:2,5 до конечного содержания белка (10±1)%. По истечении 1,5 месяцев стабилизации раствор иммуноглобулина подвергали процессам очистки и стерилизации, куда входили такие ба-ромембранные процессы, как диализ для удаления остаточного этилового спирта, предварительная фильтрация через глубинные модифицированные фильтры /йаСаг-Ьоп и ZetaPlus для улучшения показателей прозрачности и цветности, а также удаления пирогенов и стерилизующая фильтрация через дисковые ацетатцеллюлозные фильтрационные мембраны с размером пор 0,22 мкм.

Очищенный раствор иммуноглобулина контролировали согласно НД по основным показателям - содержание белка, цветность, прозрачность, пирогенность, токсичность, стерильность, электрофоретическая однородность, специфическая активность. Электрофоретический анализ полученных экспериментальных серий АИГ подтвердил однородность выявленных у-глобулиновых фракций, выделенных с применением восстановленного этанола - содержание примесей в виде а-, [¡-глобулинов составило (4,25±2,89)% при отсутствии альбуминов (рисунок 4).

ц т ■

1 2 3 4 5

Рисунок 4 - Электрофореграммы антирабического иммуноглобулина, полученного с применением регенерированного этилового спирта (на пленке из ацетат-целлюлозы), окраска Ponso red.

Примечание - 1 - Антирабическая лошадиная сыворотка;

2 - АИГ, коммерческая серия № 125;

3 - АИГ, экспериментальная серия № 1;

4 - АИГ, экспериментальная серия № 2;

5 - АИГ, экспериментальная серия № 3.

Все показатели качества соответствовали требованиям норматимвной документации - ФСП Р N002639/01 что указывает на эффективность процесса рециклинга вторичного сырья (25% спиртосодержащего фугата).

Ежегодно при производстве антирабического иммуноглобулина образуется свыше 20000 л спиртосодержащих стоков, из которых возможно получить методом ректификации более 3600 л этилового спирта с объемной долей (93±1)%, с последующим его вовлечением в замкнутую цепь производства гетерологичного иммуноглобулина

Выводы

1. Разработаны технологические приемы переработки эритроцитарной массы для получения дополнительного количества десорбированного антирабического иммуноглобулина и получения минеральной добавки в рацион лошадей-продуцентов.

2. Обоснована биотехнологическая схема получения жидкой и сухой форм ферментативного гидролизата фибрина Выявлено, что физико-химические свойства белковых гидролизатов на основе традиционного сырья и фибрина значимо не отличаются друг от друга и соответствуют требованиям нормативных документов.

3. Экспериментально доказана возможность применения ферментативного гидролизата фибрина жидкой и сухой форм при конструировании питательных сред для глубинного культивирования холерных вибрионов в производстве профилактических и диагностических препаратов.

4. Сконструированная на базе реактора-ферментёра РЗРЯ рн-6/0,63-1нж ректификационная установка позволяет получить в процессе регенерации (93±1)% этиловый спирт и обеспечивает возможность применения восстановленного ректификата в качестве осадителя у-глобулиновой фракции антирабической сыворотки. Полученный антирабический иммуноглобулин соответствует требованиям нормативной документации ФСП Р N002639/01 на «Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жулидов, И.М. Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных сред для культивирования микроорганизмов / И.М. Жулидов, М.В. Антонычева, Н.И. Бахрушина [и др.] // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: матер. Междунар. науч.-практ. конф. — СПб, 2010.-С. 116.

2. Жулидов, И.М. Безотходные технологии в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер, науч.-практ. школы конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора - ФГУН ГНЦПМБ. -Оболенск, 2010.-С. 122-124.

3. Жулидов, И.М. Безотходные технологии в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров [и др.] //Проблемы особо опасных инфекций. —2011. - Вып. 4(110). - С. 80-85.

4. Жулидов, И.М. Разработка безотходных технологий в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова [и др.] // Биотехнология: состояние и перспективы

развития: матер. VI Междунар. конгресса / РХТУ им. Д.И. Менделеева. - Москва, 2011.-С. 396.

5. Жулидов, И.М. Биотехнологические аспекты переработки и применения отходов производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова [и др.] // Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения: матер, науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора, поев. 90-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной. - Н.Новгород, 2011. - С. 95-98.

6. Жулидов, И.М. Получение сухого гидролизата фибрина и применение его в качестве основы для изготовления питательных сред / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова [и др.] // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер. III науч.-практ. школы конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора - Оболенск, 2011.-С. 261-263.

7. Жулидов, И.М. Биотехнологические аспекты переработки фибрина - отхода производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, Е.Г. Абрамова, М.В. Антонычева [и др.] // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. — 2011. - Т.7, № 3. - С. 17-23.

8. Никифоров, А.К. Новые питательные среды для культивирования возбудителей чумы и холеры / А.К. Никифоров, М.В. Антонычева, И.М. Жулидов // Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ: матер. X съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов / Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т.2, № 1,2,- С.306.

9. Жулидов, И.М. Новая питательная среда для глубинного культивирования холерных вибрионов в производстве профилактических и диагностических препаратов / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова [и др.] // Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: матер. Всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. — Пермь, 2012. - Т. 1. - С. 200-202.

10. Жулидов, И.М. Новая питательная среда на основе сухого гидролизата фибрина для культивирования холерных вибрионов / И.М. Жулидов, М.В. Антонычева, O.A. Лобовикова [и др.] // Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии: матер, науч. конф. с междунар. участием / Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СОРАН. - 2012. - № 5(87), Ч. 1. - С. 220223.

11. Жулидов, И.М. Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных микробиологических сред для культивирования микроорганизмов / И.М Жулидов, С.А. Нижегородцев, М.В. Антонычева [и др.] // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Рефер. сборник. - Саратов, 2010. - Вып. 13. - С. 15.

12. Жулидов, И.М. Выделение сорбированного на поверхности эритроцитов иммунной крови продуцентов антирабического иммуноглобулина - дополнительного источника получения препарата / И.М. Жулидов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров [и др.] // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Рефер. сборник. - Саратов, 2011. - Вып. 14. - С. 17.

13. Пэт. 2425866 Российская Федерация, МПК С12141/20; С121Ш63. Питательная среда для глубинного культивирования холерного вибриона / М.В. Антонычева, С.А. Нижегородцев, С.А. Ерёмин, Т.В. Алёнкина, И.В. Шульгина, Н.И. Бахрушина, А.Д. Белоусов, И.М. Жулидов, А.К. Никифоров; заявитель и патентообладатель Российский науч.-исслед. противочумный ин-т «Микроб» - № 2010121691/10; заявл. 27.05.2010; опубл. 10.08.2011, Бюл. № 22.

14. Жулидов, И.М. Разработка приемов безотходных технологий в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, М.В. Антонычева [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Саратов: Издательство «КУБиК», 2013.-С. 54-56.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Гарнитура Тайме. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жулидов, Иван Михайлович, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ «МИКРОБ»

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ МАЛООТХОДНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ПРОИЗВОДСТВЕ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА

На пр: писи

ЖУЛИДОВ ИВАН МИХАЙЛОВИЧ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СО <0

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент-А.К. Никифоров

Саратов - 2013

Содержание

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................................11

Глава 1. Основные принципы безотходных и малоотходных производств..........11

Глава 2. Особенности утилизации и переработки отходов на предприятиях

по производству медицинских иммунобиологических препаратов............................23

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................................................................................30

Глава 3. Объекты, материалы и методы исследований............................................................30

3.1. Вирусные и бактериальные штаммы..........................................................................................31

3.2. Экспериментальные животные..................................................................................................................31

3.3. Отходы производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина........................................................................................................................................................................................32

3.4. Реактивы, растворы и питательные среды..............................................................................32

3.5. Приборы и оборудование........................................................................................................................35

3.6. Методы выделения гамма-глобулина..........................................................................................37

3.7. Методы контроля гетерологичного антирабического иммуноглобулина.. 37

3.8. Методы контроля гематологических показателей продуцентов..............................38

3.9. Методы контроля питательных сред................................................................................................38

3.10. Методы и условия культивирования бактериальных штаммов........................39

3.11. Методы контроля ректифицированного этилового спирта....................................40

3.12. Методы статистической обработки................................................................................................40

Глава 4. Разработка технологических приемов переработки эритроцитарной

массы и использование полученных продуктов..........................................................................41

4.1. Выделение антирабического иммуноглобулина, сорбированного на эритроцитах иммунной крови лошадей-продуцентов............................................................41

4.2. Изучение качественных характеристик антирабического иммуноглобулина, десорбированного с поверхности эритроцитов............................................................43

4.3. Отработка технологических приемов высушивания эритроцитарной

массы для получения пищевой добавки в рацион лошадей-продуцентов............50

Глава 5. Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных микробиологических сред для культивирования микроорганизмов......................................................................................................................................................................58

5.1. Получение ферментативного гидролизата фибрина......................................................58

5.2. Сравнительный анализ физико-химических свойств белковых гидроли-затов, полученных из традиционного сырья (мяса крупного рогатого скота

и казеина) и фибрина............................................................................................................................................63

5.3. Приготовление питательной среды на основе жидкого гидролизата фибрина..............................................................................................................................................................................64

5.4. Сравнительный анализ ростовых свойств и эффективности питательных сред, полученных по традиционной технологии и на основе жидкого гидролизата фибрина...................................................................... 66

5.5. Получение сухой основы питательных сред из концентрированного гидролизата фибрина........................................................................ 72

5.6. Физико-химический анализ свойств сухого гидролизата фибрина......... 75

5.7. Анализ ростовых свойств питательных сред, полученных на основе

сухого гидролизата фибрина............................................................... 77

Глава 6. Разработка способа регенерации этанола из спиртосодержащего отхода......................................................................................... 87

6.1. Конструирование установки для восстановления этилового спирта из спиртосодержащего стока и отработка оптимальных параметров регенерации спирта................................................................................... 87

6.2. Оценка физико-химических свойств этилового спирта, полученного в результате регенерации................................................................... 90

6.3. Изучение основных свойств антирабического иммуноглобулина, полученного при фракционировании регенерированным этиловым спиртом....... 92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................. 100

ВЫВОДЫ...................................................................................... 106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................... 107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................... 108

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................... 123

Введение

Актуальность темы. Проблема охраны окружающей среды от загрязнения отходами в последние десятилетия является актуальной как в России, так и за рубежом. Особенно актуальной является проблема контроля промышленных отходов как наиболее токсичных, часто устойчивых к разложению и опасных для человека и среды его обитания.

На предприятиях Российской Федерации ежегодно образуется около 90 млн тонн токсичных промышленных отходов, из которых 87 млн тонн относятся к III и IV классам опасности [122].

По оценке Росприроднадзора, на конец 2010 года в России было накоплено около 80-90 млрд тонн отходов разного происхождения, из них порядка 16 млрд тонн твердых бытовых отходов (ТБО). Объем ежегодного образования ТБО составляет более 40 млн тонн. В 2011 году в России перерабатывалось только 36% ТБО, что привело к потере 90% продукции на рынке вторичного сырья. Однако потенциал рынка позволяет перерабатывать до 42% от всей массы образуемых отходов [94, 116].

После вступления в силу Федерального закона от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании» идет процесс наработки общих и специальных технических регламентов. С гигиенических позиций важно, чтобы в каждом регионе, на каждом предприятии решались вопросы защиты окружающей среды. Одним из серьезных вопросов, требующих должного отражения, является решение вопросов обращения с отходами производства и потребления. По данным ООН, от 25 до 33% регистрируемых в мире заболеваний напрямую связаны с низким качеством окружающей человека среды; в 18% случаев причиной преждевременной смерти являются неблагоприятные условия окружающей среды, из них 1%> приходится на негативное воздействие промышленных и бытовых отходов [91].

Однако комплексные программы по утилизации основных типов отходов, образующихся в процессе производства медицинских иммунобиологических

препаратов (МИБП) и, в частности, гетерологичного антирабического иммуноглобулина (АИГ), в литературе не описаны.

При производстве антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади в РосНИПЧИ «Микроб» в качестве отходов ежегодно образуется свыше 3 т эритроцитарной массы, более 250 кг фибрина и 20 т спиртосодержащих стоков (IV-V классы опасности). Указанные отходы являются весьма ценным вторичным сырьевым ресурсом (ВСР) для получения продуктов, которые в дальнейшем могут быть использованы при производстве МИБП.

Высокая востребованность антирабического иммуноглобулина на Российском фармацевтическом рынке, обусловленная неблагоприятной эпизоотической обстановкой по бешенству, диктует необходимость увеличения выпуска препарата. В настоящее время РосНИПЧИ «Микроб» ежегодно выпускает 300-320 л АИГ, однако этого количества недостаточно для удовлетворения потребностей лечебно-профилактических учреждений РФ.

Одним из путей решения этой проблемы без существенных вложений является получение дополнительного количества у-глобулина методом десорбции с поверхности эритроцитов - отхода производства АИГ.

Немаловажным является поддержание в оптимальном работоспособном состоянии организма лошадей-продуцентов, особенно их органов кроветворения. Этому способствует и рациональная схема эксплуатации, и сбалансированный рацион питания, включающий ценные минеральные добавки. Одной из таких добавок является сухая эритроцитарная масса, получаемая путем переработки отхода - форменных элементов иммунной крови, образующихся на этапе сепарирования.

Все вышеперечисленное диктует необходимость разработки технологических приемов по переработке эритроцитарной массы, являющейся источником дополнительного количества АИГ и ценной минеральной подкормки.

При производстве АИГ образуется еще один отход белкового происхождения - фибрин. По своим биологическим характеристикам он не уступает традиционному сырью, что делает его перспективным при конструировании

питательных сред.

Для осаждения АИГ применяют 96% этиловый спирт, который в виде отхода - 25% спиртового фугата удаляется в очистные сооружения.

Используя способ ректификации можно получить из спиртосодержащего стока этиловый спирт и использовать его для осаждения у-глобулина, что будет являться примером экономичного производства.

Все вышеперечисленное предопределило цели и задачи нашего исследования.

Цель работы состояла в разработке биотехнологических приемов переработки отходов производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина - эритроцитарной массы, фибрина и спиртосодержащего стока.

Задачи исследования:

1. Разработать технологические приемы переработки эритроцитарной массы для получения биологически активной добавки к рациону продуцентов и выделения сорбированного антирабического иммуноглобулина.

2. Экспериментально обосновать биотехнологическую схему получения жидкой и сухой форм гидролизата фибрина и провести сравнительный анализ физико-химических свойств белковых гидролизатов, полученных из традиционного сырья и фибрина.

3. Оценить возможность применения гидролизата фибрина при конструировании питательных сред для глубинного культивирования холерных вибрионов в производстве профилактических и диагностических препаратов.

4. Разработать технологические приемы регенерации утильного спиртосодержащего стока и оценить возможность применения восстановленного спирта для осаждения гамма-глобулина.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые разработаны основные биотехнологические приемы комплексной утилизации отходов производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Впервые экспериментально обоснована биотехнологическая схема переработки эритроцитарной массы из крови продуцентов антирабической сыворотки, предусматривающая получение ценных биологических продуктов.

Создана технология получения гидролизата фибрина жидкой и сухой форм и показана эффективность его применения в качестве основы питательных сред для глубинного культивирования холерных вибрионов в производстве профилактических и диагностических препаратов, что подтверждено патентом «Питательная среда для глубинного культивирования холерного вибриона», № 2425866 РФ, МПК С12141/20, С121Ш63; 10.08.2011, Бюлл. №22.

Впервые разработан биотехнологический алгоритм регенерации этилового спирта. Показана возможность использования регенерированного этилового спирта на заключительных стадиях выделения антирабического иммуноглобулина.

Практическая значимость работы

Предложена технология выделения методом десорбции резервного количества антирабического иммуноглобулина из отхода производства -эритроцитарной массы, что позволяет увеличить выход продукта в среднем на 19% без дополнительного привлечения продуцентов.

Разработана инструкция по эксплуатации сушильной установки для получения сухой эритроцитарной массы с учетом конструкционных особенностей аппарата и биологических характеристик объекта высушивания.

Показана возможность использования питательных сред, сконструированных на основе гидролизата фибрина, для глубинного культивирования штаммов холерного вибриона при производстве профилактических и диагностических препаратов. Разработан проект ТУ «Питательная основа микробиологических сред - сухой гидролизат фибрина».

Разработана инструкция по эксплуатации регенерационной установки и стандартная операционная процедура получения спирта с учетом термодинамических характеристик спиртосодержащего стока и технологических особенностей химического реактора.

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации «Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его

основе питательных микробиологических сред для культивирования микроорганизмов» и «Выделение сорбированного на поверхности эритроцитов иммунной крови продуцентов антирабического иммуноглобулина - дополнительного источника получения препарата», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором института, протокол № 2 от 21.04.10 г., протокол № 5 от 23.09.10 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанные биотехнологические приемы по переработке отхода производства антирабического иммуноглобулина - эритроцитарной массы обеспечивают дополнительный выход специфического иммуноглобулина из иммунной крови и получение ценной минеральной подкормки для лошадей-продуцентов.

2. Экспериментально обоснована биотехнологическая схема утилизации фибрина как отхода производства, позволяющая получить ферментативный гидролизат для производства микробиологических питательных сред.

3. Питательные среды, приготовленные на основе гидролизата фибрина жидкой и сухой форм, по физико-химическим и биологическим показателям соответствуют требованиям нормативных документов и пригодны для культивирования холерных вибрионов.

4. Предложен биотехнологический прием по регенерации этанолсо-держащего отхода, обеспечивающий рециклинг восстановленного ректификата в технологический процесс производства антирабического иммуноглобулина.

5. Экспериментальные серии антирабического иммуноглобулина, полученного с использованием разработанных приемов, по качественным характеристикам соответствуют требованиям нормативной документации на иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций.

Работа выполнена в лаборатории профилактических иммуноглобулинов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательской темы № 40-2-09

«Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923).

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были доложены на итоговой научно-практической конференции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2009-2012 г.г.), а также представлены в виде тезисов на международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010 г.); на научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010-2011 г.г.), на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 г.); на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Инновационные технологии обеспечения противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 2011 г.); на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012 г.); на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (Пермь, 2012 г.), на научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (Иркутск, 2012 г.) и на научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве», посвященной 100-летию СГАУ имени Н.И. Вавилова (Саратов, 2013 г.).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 13 научных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных «Перечнем ведущих рецензируемых

научных журналов и изданий» ВАК РФ. Получен патент на изобрете