Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина"

На правах рукописи

Кочкалова Наталия Николаевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЛИОФИЛЬНОГО ВЫСУШИВАНИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 ПАР 2015

Саратов - 2015

005560285

005560285

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (РосНИПЧИ «Микроб»)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Абрамова Елена Геннадьевна

кандидат биологических наук

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лаборатория профилактических иммуноглобулинов, заведующая лабораторией Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»,

кафедра микробиологии, биотехнологии и химии, профессор кафедры Саяпина Лидия Васильевна

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный эксперт

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Оболенск

Защита состоится « 8 » апреля 2015 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук

по адресу: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452) 970383

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ. Диссертация и автореферат размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnw-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан «¿^»^УЛ ¿У1. -' .-> ¿/ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.146.01

доктор биологических наук

Н.Н. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бешенство остается одной из серьезнейших медико-ветеринарных проблем. Современные данные о распространении бешенства в мире и Российской Федерации за последнее десятилетие свидетельствуют о неблагоприятной эпизоотической и эпидемиологической ситуации (Черкасский и др., 2005; Онищенко, 2011; World Health Organization Expert Consultation on Rabies on rabies, 2013).

Для экстренной профилактики заболевания людей гидрофобией при тяжелых укусах бешеными или подозрительными на бешенство животными применяют антирабический иммуноглобулин в комбинации с концентрированной антирабической вакциной. Ежегодно в различные лечебные учреждения Российской Федерации за антирабической помощью обращаются около полумиллиона человек, примерно половина из них получают направление на специфическое антирабическое лечение (Онищенко, 2012).

В настоящее время в России зарегистрированы в Государственном Реестре лекарственных средств гомологичный антирабический иммуноглобулин (Китай, Франция) и гетерологичный антирабический иммуноглобулин (АИГ) производства РосНИПЧИ «Микроб». Оба препарата выпускаются в виде раствора для инъекций.

Жидкая форма иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП), в том числе антирабического иммуноглобулина, является наиболее удобной для практического применения, однако она имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, низкая термостабильность и необратимость процессов биодеградации, происходящих с веществом из-за несоблюдения температурного режима хранения или транспортировки. Во-вторых, при хранении жидких форм ИЛП в стеклянных ампулах или флаконах могут происходить процессы, вызывающие выщелачивание или растворение верхнего слоя стекла и выход из него оксидов щелочных и щелочноземельных металлов, что приводит к изменениям лекарственных свойств, в основе которых лежат различные химические процессы: гидролиз, окисление, восстановление, декарбоксилирование, изомеризация и др. (Wang et al., 1984; Borchert et al., 1989; Чуешов, 2002; Franks, 2003). Жидкая форма антирабического иммуноглобулина характеризуется небольшим сроком годности, который составляет 1 год 6 месяцев при температуре хранения от 2 до 8°С.

Одним из наиболее эффективных способов сохранения исходных свойств иммунобиологических объектов является получение их в сухой форме, для чего используют метод лиофилизации, основанный на предварительном замораживании и сублимации продукта при температуре, обеспечивающей щадящее удаление свободной и связанной влаги (Бланков, 1961; Долинов, 1969; Никитин, 1971). Лиофилизация, помимо обеспечения стабильности молекулярных параметров и специфической активности, создает оптимальные условия для предотвращения фрагментации и агрегации белков в процессе хранения и транспортировки (Franks, 2007).

Степень разработанности проблемы. Первые исследования по разработке лиофилизированной формы гетерологичного АИГ проводились в Томском НИИ вакцин и сывороток в 80-х годах прошлого столетия (Пилявская и др., 1984). Однако предложенный метод не имел научно обоснованных режимов высушивания, требовал значительных энергозатрат и продолжался более 48 ч. Высушенный без наполнителя АИГ обладал плохой растворимостью (45-50 мин); впоследствии в качестве лиопротектора томские ученые применяли сорбит, который, по современным данным, может вызвать нарушение кислотно-щелочного баланса крови пациента (Алсынбаев и др., 2004). В литературе описан способ получения экспериментальных серий гетерологичного АИГ для внутривенного введения, предусматривающий использование стабилизатора мальтозы - относительно нового стабилизатора, используемого производителями отечественных лекарственных средств с 2000 г. (Ситник и др., 2008). Тем не менее, отмечено, что редуцирующие сахара - лактоза и мальтоза могут ухудшать качество белков, вызывая реакцию «потемнения» белка, что является проявлением биодеградации (1гШ5и е/ а!., 1991; 1^етап, 1992). Кроме того, введение ИЛП, содержащего мальтозу, может вызвать развитие анафилактоидной реакции (ЕпоЫЬоп е! а1, 1998).

Очевидно, что существует необходимость подбора не только подходящих, но и безопасных стабилизаторов, так как с некоторыми из них связаны серьезные побочные реакции (Навкт ею!., 1999).

До настоящего времени не разработаны оптимальные режимы лиофилизации гетерологичного антирабического иммуноглобулина, эффективные для применения в промышленных условиях, что определило актуальность диссертационного исследования.

Цель работы - разработка оптимальных режимов лиофильного высушивания антирабического иммуноглобулина, обеспечивающих максимальное сохранение его спецификационных показателей.

Задачи исследования:

1 .Исследовать тепловые параметры гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

2. Подобрать оптимальную рецептуру лиопротектор/препарат для сохранения стабильности свойств лиофилизированного иммуноглобулина.

3. Экспериментально обосновать параметры лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов.

4. Провести сравнительный анализ спецификационных свойств гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов в жидкой и лиофилизированной формах.

5. Исследовать молекулярно-массовый состав жидкого и лиофилизированного антирабического иммуноглобулина.

6. Изучить стабильность лиофилизированного антирабического иммуноглобулина в процессе хранения.

Научная новнзна заключается в том, что научно обоснована технология лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов в условиях промышленного производства препарата. Получены новые сведения о тепловых свойствах раствора гетерологичного антирабического иммуноглобулина, позволяющие обосновать конечную температуру замораживания препарата. Научно обосновано качественно-количественное содержание лиопротектор/препарат. Определены оптимальные температурно-временные параметры процесса лиофилизации гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Исследован молекулярно-массовый состав антирабического иммуноглобулина жидкой и лиофилизированной форм в процессе хранения. Изучены основные свойства лиофилизатов гетерологичного антирабического иммуноглобулина после длительного хранения в течение 3 лет. Показано, что лиофилизированные препараты сохраняют свои спецификационные свойства.

Практическая значимость работы. Разработанная технология лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина апробирована в производственных условиях, что позволяет рекомендовать ее для промышленного выпуска препарата. С использованием предложенной технологии получен стандартный образец предприятия (СОП) специфической активности антирабического иммуноглобулина в лиофилизированной форме.

Разработанные технологические решения и использование нового лиофилизационного оборудования позволяет сократить энергопотребление производства на 41887,2 кВт в год. Проведенные исследования позволяют увеличить срок годности препарата с 1,5 до 3 лет.

Результаты исследований были использованы при составлении методических рекомендаций «Разработка лиофилизированной формы гетерологичного антирабического иммуноглобулина» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» 22.12.2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная технология позволяет получать в производственных условиях новую лекарственную форму гетерологичного антирабического иммуноглобулина - лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения.

2. Предложенные температурно-временные параметры лиофилизации и применение в качестве лиопротектора глицина позволяют получать лиофилизаты антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов, не уступающие по качественным характеристикам препаратам в жидкой форме.

3. Лиофилизированный антирабический иммуноглобулин по показателю молекулярно-массовое распределение обладает преимуществом по сравнению с препаратом в жидкой форме.

4. Гетерологичный антирабический иммуноглобулин в лиофилизированной форме сохраняет нормируемые свойства в процессе длительного хранения (3 года).

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам технологии лиофильного высушивания лекарственных средств, в том числе иммуноглобулиновой природы, подбора

эффективных и безопасных лиопротекторов, оценки качества лиофилизированных препаратов. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы. При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа. Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Работа выполнена в отделе экспериментальных фармацевтических форм, лаборатории профилактических иммуноглобулинов, лаборатории экспериментальной биотехнологии отдела профилактических препаратов, отделе экспериментальных животных с виварием ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках плановых научно-исследовательских тем: 26-2-05 «Разработка и внедрение в производство новых медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы» (номер госрегистрации 0120.0504663); 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации 0120.0853923).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Саратов, 2007); научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье человека» (Рязань, 2007); Всероссийской научно-практической конференции: «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); V Московском международном конгрессе: «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора: «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010; 2011); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012); научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летию Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (Иркутск, 2012), ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2006; 2007; 2009-2011; 2014).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 14 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах из списка ВАК.

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в получении и обработке экспериментальных данных. Лично автором проведен анализ литературы, выполнены исследования по определению эвтектической температуры раствора антирабического иммуноглобулина, подбору лиопротектора, отработке параметров лиофильного высушивания

антирабического иммуноглобулина и его F(ab'^-фрагментов на различном сублимационном оборудовании, изучению специфической активности лиофилизатов в тесте in vitro. Исследования спецификационных показателей лиофилизатов проведены совместно с сотрудниками лаборатории профилактических иммуноглобулинов при участии соискателя. Определение молекулярно-массового состава антирабического иммуноглобулина проведены на базе лаборатории экспериментальной биотехнологии при непосредственном участии автора. Дифференциальная сканирующая калориметрия выполнена на базе Института химии растворов Российской академии наук (г. Иваново), соискатель непосредственно участвовал в интерпретации данных и подготовке публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 источников, из них 109 отечественных и 126 зарубежных. Объем диссертации составляет 141 страницу машинописного текста, включает 12 таблиц, 23 рисунка.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты, материалы и методы исследований Объекты исследования

Иммуноглобулиновые препараты. Для получения лиофилизатов использовали: антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»; препарат на основе F(ab'^-фрагментов антирабического иммуноглобулина, полученный путем ферментативного гидролиза.

Вирусный штамм. В работе использовали штамм фиксированного вируса бешенства Virus fixe CVS, предоставленный ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» (г. Москва).

Экспериментальные животные. Для постановки реакции нейтрализации (РН) вируса бешенства использовали белых мышей (Mus musculus) обоего пола линии BALB/c массой 11±1 г, прошедших контроль генетической стандартности лабораторных животных инбредных линий. Испытания лиофилизатов иммуноглобулина на токсичность проводили на беспородных морских свинках (Cavia porcellus) обоего пола, массой 300±50 г и беспородных белых мышах массой 19±1 г. Испытания на пирогенность проводили на кроликах (Oryctolagus cuniculus) обоего пола породы «Шиншилла» массой 2,0±0,5 кг.

Материалы и методы исследований

Лиофилизацию антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов проводили на установках Frigera LZ-9 (Чехия), Heto Power Dry PL9000/-50/HSC (Дания), Epsilon 2-6 D («Christ», Германия). Для охлаждения и замораживания антирабического иммуноглобулина (5

мл) и его Р(аЬ')г-фрагментов использовали рефрижератор сверхнизких температур MDF-U7386S («Sanyo», Япония), для регистрации значений использовали датчик и точечный самописец «Зепакорд».

Термический анализ образцов иммуноглобулина проводили методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) на ДСК-калориметре DSC 204 Fl («Phoenix», Германия). Определение эвтектической точки раствора антирабического иммуноглобулина проводили методом электропроводности с помощью низкотемпературного холодильника НС 700/50 («Frigera», Чехия) с регистрацией данных на установке лиофильного высушивания Frigera LZ-9 (Чехия).

Биологические и физико-химические свойства лиофилизированного иммуноглобулина и его F(ab'^-фрагментов контролировали по следующим показателям: описание - визуальным методом; растворимость - согласно Государственной Фармакопее (ГФ) РФ, 12 изд., ч. I; подлинность - методом диффузной преципитации; потеря в массе при высушивании (ПМВ) -согласно МУК 4.1/4.2.588-96; прозрачность и цветность - спектрофотометрическим методом по ФС 42-3874-99; электрофоретическая однородность - методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы по ФС 42-3874-99; pH — потенциометрическим методом согласно ГФ РФ, 12 изд., ч. I; остаточный спирт — методом газовой хроматографии согласно ГФ РФ, 12 изд., ч. I; остаточный риванол - визуальным методом согласно МУК 4.1/4.2.588-96; содержание белка -методом с биуретовым реактивом по ФС 42-3874-99; молекулярно-массовое распределение -методом колоночной гель-фильтрации по ФС 42-3874-99; токсичность и пирогенность -биологическим методом согласно ГФ РФ, 12 изд., ч. I; стерильность - методом прямого посева по ГФ РФ, 12 изд., ч. I; специфическая активность - in vivo в Реакции Нейтрализации фиксированного вируса бешенства на белых мышах (Meslin et al., 1996) и in vitro в прямом варианте дот-иммуноанализа по общепринятой методике с использованием диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота (Шарапова и др., 2010). Определение стабильности свойств антирабического иммуноглобулина проводили в долгосрочных испытаниях, в тестах на «ускоренное старение» и «стресс-условия» (Петухов, 2003).

Обработку результатов проводили с применением стандартных методов статистической обработки (Ашмарин и др., 1962).

Результаты исследований и их обсуждение

Определение эвтектической температуры антирабического иммуноглобулина

Обязательным условием для проведения лиофилизации с максимальным сохранением биологической активности препарата является оптимальный выбор температуры замораживания, что определяется значением эвтектической температуры раствора препарата. Определение эвтектической температуры гетерологичного АИГ проводили с использованием образцов № 1,2, 3, соответствующих требованиям фармакопейной статьи на жидкий препарат и содержащих различные комбинации лиопротекторов. В образец № 1 в качестве стабилизатора

был добавлен глицин в концентрации 2,25±0,25%; образец № 2 содержал двухкомпонентный стабилизатор - глицин (2,25±0,25%) и сахарозу (1%); образец № 3 - глицин (2,25±0,25%) и мальтозу (1%). В качестве контрольного был взят раствор 0.9% ЫаС1, эвтектическая температура которого, по литературным данным, составляет минус 21°С (Новикова и др., 1977). Измерение эвтектических температур образцов гетерологичного АИГ и контрольного раствора ЫаС1 проводили при исследовании температурной зависимости удельного сопротивления растворов в интервале от минус 50 до 0°С. Значение эвтектической температуры каждого образца получали, проецируя прямолинейный отрезок кривой, соответствующий бесконечно большому значению удельного электрического сопротивления, на ось температур. На рисунке 1 представлены графики зависимости величины удельного электрического сопротивления от температуры исследуемого материала. Эвтектическая температура раствора ЫаС1 оказалась равной минус 21°С, что совпадает с литературными данными (Новикова и др., 1977).

Примечание - образец № 1 - АИГ, стабилизированный глицином (2,25±0,25) %; образец № 2 - АИГ, стабилизированный глицином (2,25±0,25) % и сахарозой (1 %); образец № 3 - АИГ, стабилизированный глицином (2,25±0,25) % и мальтозой (1 %) Рисунок 1 — Зависимость удельного электрического сопротивления образцов иммуноглобулина от температуры их замороженных растворов

Присутствующие в образцах иммуноглобулина стабилизаторы различной природы оказали влияние на показатели температуры эвтектики; так, температура эвтектики для образца № 1, содержащего глицин, соответствовала минус 36°С; для образца № 2, содержащего глицин и сахарозу - минус 44°С; для образца № 3, содержащего глицин и мальтозу - минус 34°С.

Подбор лиопротекторов и определение оптимальной рецептуры лнопротектор/препарат

Глицин в концентрации 2,25±0,25% традиционно используется в технологии изготовления жидкого антирабического иммуноглобулина в качестве стабилизатора, обеспечивающего стабильность физико-химических и специфических свойств жидкого препарата. Глицин относится к типу формообразующих наполнителей и, по литературным данным, успешно применяется в качестве лиопротектора (Carpenter et at., 1997). В связи с этим практический интерес представляло изучение эффективности применения глицина в качестве лиопротектора в сравнении с различными комбинациями глицина с мальтозой и сахарозой.

В экспериментах использовали образцы иммуноглобулина с глицином (2,25±0.25%) и

двухкомпонентными лиопротекторами, содержащих, помимо глицина, сахарозу и мальтозу (Таблица 1). Жидкий АИГ с содержанием белка 10%, в состав которого вошли различные комбинации лиопротекторов, разливали по 1 мл в стеклянные флаконы объемом 3 мл. Замораживание образцов проводили с учетом эвтектических температур в рефрижераторе сверхнизких температур до температуры минус 38±1°С для образцов с глицином и глицином в комбинации с мальтозой; минус 44±1°С - для образцов с добавлением сахарозы, выдерживая препарат при этой температуре 3 ч. Наличие стабилизаторов углеводной природы - сахарозы и мальтозы обусловило стеклование образцов при замораживании; процесс сублимации был более длительным, чем в случае высушивания иммуноглобулина с глицином - соответственно 25, 21 и 15 ч (Рисунок 2).

-•-образец АИГ с глицином 2,25% и сахарозой 1% -■-образец АИГ с глицином 2,25% и мальтозой 1% -^-образец АИГ с глицином 2,25%

Рисунок 2 - Длительность сублимации антирабического иммуноглобулина с различными

лиопротекторами

Эффективность включения сахарозы и мальтозы в состав АИГ в качестве лиопротекторов оценивали по таким показателям лиофилизатов, как внешний вид таблетки, потеря в массе при высушивании, растворимость, содержание белка, специфическая активность на момент получения лиофилизатов и через 1 месяц хранения при температуре 37°С (тест на «ускоренное старение»).

Лиофилизированные образцы после высушивания имели вид хорошо сформированной таблетки, плотно прилегающей к стеклу. Лиофилизаты с глицином и сахарозой имели белый цвет, образцы с мальтозой характеризовались незначительным потемнением. Через 1 месяц хранения при температуре 37°С внешний вид таблеток не изменился. В таблице 1 представлены результаты исследований показателей растворимости, потери в массе при высушивании и содержания белка при испытании лиофилизатов в тесте на «ускоренное старение». Как свидетельствовали результаты экспериментов, использование как одного глицина, так и в комбинации с сахарозой и мальтозой позволило получить стабильные сухие образцы АИГ, выдержавшие испытания на «ускоренное старение». Содержание белка в лиофилизатах соответствовало требованиям Нормативной документации на антирабический иммуноглобулин в жидкой форме. Включение в состав иммуноглобулина сахарозы и мальтозы в дополнение к глицину в различных концентрациях не оказало существенного влияния на качество

лиофилизатов, можно отметить лишь увеличение времени растворения лиофилизатов. содержащих сахара.

На момент получения все лиофилизированные образцы АИГ и жидкий контрольный образец с глицином характеризовались уровнем содержания антирабических антител, соответствующим 1:5120 при исследовании прямым дот-иммуноанализом. После испытаний в тесте на «ускоренное старение» у лиофилизированных образцов не было отмечено снижения специфической активности, жидкий образец характеризовался некоторым снижением специфической активности до уровня 1:2560, что обусловлено неблагоприятным воздействием высокой температуры.

Таблица 1 - Влияние различных комбинаций лиопротекторов на показатели

лиофилизированного антирабического иммуноглобулина

ч\ Показатель Лио- N. протектор4-. Растворимость, мин Потеря в массе при высушивании, % Содержание белка в лиофилизате. %

на момент получения через 1 мес при 137°С на момент получения через 1 мес при 1 37°С на момент получения через 1 мес при 1 37°С

глицин 2,25±0,25%, сахароза 1% 1,4±0,3 1,4±0,4 1.40±0.03 1,42±0,01 9,2±0,1 9.1 ±0,3

глицин 2,25±0,25 %, сахароза 5% 1,3±0,2 1,6±0,2 1.90±0.08 1,78±0,05 9.2±0,1 9,1±0,1

глицин 2,25±0,25%, сахароза 10% 1,0±0,1 1,2±0,2 2,45±0,05 1,57±0,04 9,4±0,3 9,4±0,2

глицин 2,25±0,25%, мальтоза 1% 0,55±0,01 0,60±0,04 0,90±0,02 1,23±0,03 9,5±0,3 9,3±0,1

глицин 2,25±0,25% мальтоза 5% 1,0±0,1 1,1 ±0,2 1,70±0,04 2.13±0,01 9,2±0,2 9.3±0.1

глицин 2,25±0,25%, мальтоза 10% 1,0±0,4 1,6±0,3 2.30±0.05 1.96±0.02 9.5±0.1 9.4±0.3

глицин 2,25±0,25% 0.25±0.03 0.22±0.02 1,58±0.02 1,37±0.03 9.4±0,1 9.3±0.2

4орма - не более 20 мин Норма - не более 3% Норма - 10±1%

На основании полученных данных можно заключить, что использование глицина (2,25±0,25%) в качестве лиопротектора вполне приемлемо; применение сахарозы и мальтозы, на наш взгляд, нецелесообразно, так как их добавление в состав препарата существенно увеличивает длительность процесса лиофилизации иммуноглобулина, что обусловлено углеводной природой лиопротекторов.

Разработка технологии сублимационного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагмснтов

При разработке технологии лиофильного высушивания АИГ за основу была взята уже разработанная в институте промышленная технология лиофилизации диагностических препаратов иммуноглобулиновой природы, предусматривающая их предварительное замораживание до минус 45°С и последующую лиофилизацию в течение 43 ч с использованием

сублимационной установки Frigera LZ 9. Данное оборудование, в свое время, хорошо зарекомендовавшее себя в производстве, морально устарело и давно отработало свой номинальный ресурс. Приобретение новых, современных сублиматоров потребовало оптимизации существующей технологии, что явилось целью следующего этапа исследования.

Используемая в настоящей работе современная сублимационная установка Power Dry 9000 выгодно отличается от устаревшего оборудования наличием хладоносителя R404A органического происхождения, не содержащего фтор и хлор. К преимуществам R404A относятся высокое постоянство состава, нулевой потенциал разрушения озонового слоя, более интенсивная холодопроизводительность (на 4-5% выше по сравнению с R22), обеспечивающая энергосбережение до 2% и снижение на 8% температуры нагнетания компрессора.

В экспериментах по лиофильному высушиванию на установке Power Dry 9000 использовали АИГ с содержанием белка 9,4%, соответствующий требованиям нормативной документации, разлитым по 5 мл в стеклянные флаконы объемом 10 мл. Данная дозировка является наиболее удобной для потребителя, поскольку близка к терапевтической дозе.

Первый этап лиофилизации - замораживание проводили до температуры препарата минус 38°С. Данное значение на несколько градусов ниже, чем выявленная эвтектическая температура АИГ, и объясняется тем, что для полного затвердевания жидкого препарата необходима температура на несколько градусов ниже эвтектической из-за переохлаждения промежуточных эвтектических смесей при замораживании (Долинов, 1969; Логвинов и др., 2007). Применение данного параметра позволило сократить время замораживания с 14 до 9 часов при скорости замораживания 7,6°С/час (Рисунок 3).

Примечание - 1 - замораживание до температуры минус 38°С;

2 - замораживание до температуры минус 45°С Рисунок 3 - Длительность этапа замораживания раствора антирабического иммуноглобулина в зависимости от температуры замораживания

Для установления оптимального режима подвода тепла к продукту на стадии первичного обезвоживания лиофильное высушивание АИГ, замороженного до минус 38±1°С, проводили при следующих значениях температуры плиты сублиматора (Тпл): 30±1, 35±1 и 40±1°С. Высушивание по выбранным параметрам проводили при величине вакуума от 7 до 10 Па; контроль параметров сушки (температура материала, температура конденсатора, хладоносителя, полок сублиматора и разрежение в камере) осуществляли каждый час. Графики

сублимации представлены на рисунке 4.

Установлено, что при интенсивном подводе тепла (Тпл = 40±1°С) температура материала Тм во время сублимации была выше температуры эвтектики, при других значениях Тпл удаление влаги из препарата происходило в эвтектической зоне.

Рисунок 4 - Температура антирабического иммуноглобулина (Тл<) во время первичной сушки в зависимости от режима подвода тепла (Тпл)

Процесс сублимации при данном значении Тпл занял 9±1 ч, при Тпл = 30±1°С и Тпл = 35±1°С, соответственно 13±1 и 18±1 ч. Препарат, лиофилизированный при различных значениях Тпл, по окончании высушивания представлял собой аморфную массу белого цвета, равномерно прилегающую к стеклу, т.е. внешний вид таблетки был удовлетворительным при всех способах сублимации. Однако при определении содержания белка в регидратированном иммуноглобулине были выявлены определенные различия. Препарат, сублимированный при Тпл = 40±1°С, характеризовался значительными потерями белка - 10,5±0,8%, что можно объяснить тем, что основной процесс сублимации протекал при температуре выше эвтектической и имел место процесс плавления замороженного продукта. Кроме этого, после хранения образцов в течение 3 месяцев растворимость иммуноглобулина, сублимированного при Тпл = 40±1°С, ухудшилась и составляла более 3 мин. После 3 месяцев хранения ухудшения показателей лиофили-зата, полученного при высушивании двумя другими способами, не наблюдали. Следовательно, интенсификация процесса сублимации путем сокращения его продолжительности за счет увеличения подвода тепла не является эффективной, способствуя увеличению потерь белка и ухудшению растворимости препарата после лиофилизации. Полученные данные свидетельствуют о том, что значения Тпл = 30±1°С и Тпл = 35±1°С при сублимации АИГ являются приемлемыми, такая интенсивность нагрева обеспечивает удаление влаги в зоне эвтектической температуры, что минимизирует риск деградации белка и, как следствие, падения специфической активности иммуноглобулина. Данные условия позволяют свести к минимуму потери белка - 0,7±0,03 и 0,8±0,01%, соответственно. Однако при Тпл = 35±1°С Тм при десорбции соответствует значениям, вплотную приближенным к границе эвтектической зоны, и во избежание риска выхода Тм за пределы зоны эвтектики при проведении процесса первичной десорбции, за оптимальное было принято значение Тпл = 30±1°С.

На заключительном этапе лиофилизации - этапе вторичного обезвоживания, при котором удаляется связанная влага, основными параметрами, определяющими физико-химические и биологические характеристики сухих препаратов, являются Тм и длительность процесса досушивания. На данном этапе необходимо было определить максимально допустимую температуру лиофилизируемого АИГ и время, в течение которого поддерживается данная температура для достижения оптимального показателя потери в массе при высушивании (ПМВ). Исследования показали, что оптимальной величиной ПМВ лиофилизированного антирабического иммуноглобулина является значение от 1 до 2%. Лиофилизаты с ПМВ менее 1% обладают растворимостью более 3 мин, что критично в условиях оказания антирабической помощи; при величине ПМВ более 3% происходит снижение специфической активности иммуноглобулина в процессе хранения (Таблица 2).

Таблица 2 - Влияние показателя потери в массе при высушивании на значения растворимости и специфической активности лиофилизатов антирабического иммуноглобулина в процессе хранения

Серия АИГ, лиофили-зат Период хранения, мес Значение показателя потери в массе при высушивании, % Растворимость, мин Специфическая активность, МЕ/мл (норма - не менее 150 МЕ/мл)

097 на момент получения 0,20±0,01 5,25±0,1 214

6 0,25±0,02 5,5±0,3 189

12 0,21 ±0,01 6,3±0,4 212

18 0,22±0,01 7,7±0,1 196

098 на момент получения 1,5±0,1 1,6±0,2 204

6 1,6±0,3 2,0±0,2 175

12 1,5±0,2 1,7±0,1 223

18 1,5±0,3 1,8±0,3 187

099 на момент получения 4,2±0,1 2,2±0,1 195

6 3,9±0,1 2,0±0,2 141

12 4,2±0,3 1,9±0,3 126

18 4,1 ±0,2 2,1±0,2 138

Экспериментальным путем установлено, что для достижения оптимального показателя ПМВ вторичную десорбцию необходимо проводить до конечной температуры продукта 25± 1 °С при температуре плиты 30±1°С, при достижении максимальной температуры препарат необходимо досушивать не более 3 ч. Увеличение времени досушивания ведет к уменьшению показателя ПМВ. Использование установки Power Dry 9000 позволило сократить продолжительность этапа десорбции до 10±1 ч, в то время как на установке Frigera LZ 9 досушивание иммуноглобулина при положительных температурах от 0 до 25 °С при аналогичном нагреве плиты Тпл = 30±1°С проводили в течение 23±1 ч (Рисунок 5).

Таким образом, в результате проведенных исследований оптимизирован процесс лио-фильного высушивания антирабического иммуноглобулина на современной сублимационной установке Power Dry 9000 (Рисунок 5). Отработаны следующие основные параметры оптимизированного режима высушивания: температура замораживания -минус 38±1°С; скорость замораживания - 7,6°С /ч; продолжительность замораживания 8±1 ч; рабочий вакуум - 7±3 Па; температура нагрева плиты сублиматора - 30±1°С; скорость повышения температуры при сублимации - 1,56±0,59°С /ч; время первичной сублимации - 18±1 ч; конечная температура материала при десорбции - 25± 1 °С; время десорбции - 10± 1 ч; общее время сублимации - 28± 1 ч.

Рисунок 5 - Параметры сублимационного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина (5 мл) на установках Frigera и Power Dry

Практический интерес представляли исследования по лиофильному высушиванию экспериментальных серий F(ab )г-фрагментов АИГ на установке лиофильного высушивания Power Dry. Препарат F(ab )2-фрагментов, соответствующий требованиям НД, высушивали во флаконах объемом 3 мл в дозировке 1 мл. В качестве стабилизатора был использован глицин в конечной концентрации 2,25±0,25%. При разработке схемы лиофилизации F(ab )2-фрагментов учитывали оптимальные параметры, выявленные при высушивании цельного иммуноглобулина. Отработаны следующие параметры лиофилизации F(ab )2-фрагментов: температура замораживания -минус 38±1°С; скорость замораживания — 7,6°С/ч; продолжительность замораживания 6±1ч; рабочий вакуум - 7±3 Па; температура нагрева плиты сублиматора - 30 ±°С; скорость повышения температуры при сублимации - 4,1±0,1 °С /ч; время первичной сублимации - 12±1 ч; конечная температура материала при десорбции - 25±1°С; время десорбции - 4±1 ч; общее время сублимации - 18±1 ч (Рисунок 6).

Рисунок 6 - Параметры сублимационного высушивания F(ab ^-фрагментов антирабического иммуноглобулина (1 мл) на установке Power Dry

В рамках данного исследования были проведены исследования по лиофильному высушиванию антирабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл. Данная дозировка оправдана при изготовлении стандартного образца предприятия (СОП) специфической активности АИГ. Для приготовления СОП был использован антирабический иммуноглобулин производственной серии 0141, отвечающий требованиям ФСП. Лиофильное высушивание образцов проводили на установке Epsilon 2-6 D «Christ», являющейся наиболее подходящей для лиофилизации небольших объемов препарата и обладающей рядом существенных преимуществ: этап замораживания происходит непосредственно в камере установки, что исключает риск микробной контаминации препарата при переносе из одного вида оборудования на другое; нет необходимости использования дополнительного холодильного оборудования; конструкция установки позволяет автоматически закрывать флаконы резиновыми пробками сразу после высушивания, что также предпочтительнее для стерильно разливаемых растворов.

Иммуноглобулин разливали по 1 мл во флаконы объемом 3 мл, замораживали с учетом эвтектической температуры при атмосферном давлении непосредственно на полках сублиматора до температуры минус 38±1°С. Для подбора оптимальных параметров первичной и вторичной десорбции процесс высушивания осуществляли при следующих режимах. По 1 способу первичную лиофилизацию проводили при температуре препарата от минус 38±1°С до 25±1°С, со скоростью нагрева полки 6,3°С/ч, десорбцию проводили в течение 2±1 ч при температуре полки 30±1°С. После лиофилизации препарат имел вид таблетки со следами вспенивания, что свидетельствовало об имевшем месте коллапсе; ПМВ составляла 3%, время растворения - 30 мин. По 2 способу лиофилизацию проводили при температуре препарата от минус 38±1 до 25±1°С со скоростью нагрева полки 3°С/ч, вторичную десорбцию проводили в течение 2±1 ч при температуре полки 30±1°С. Лиофилизат представлял собой хорошо сформированную таблетку белого цвета, остаточная влажность составляла - 1,09%, время растворения - 1 мин. В 4 сериях опытов по калибровке значений специфической активности полученного кандидата в СОП относительно II Международного образца специфической

активности иммуноглобулина против бешенства зарегистрировано среднее значение показателя специфической активности 192,1±17,83 ME/мл (норма по НД - не менее 150 ME/мл), что позволило рекомендовать его как СОП специфической активности АИГ.

Учитывая результаты экспериментов, были выявлены следующие параметры лиофилизации СОП специфической активности АИГ: температура замораживания - минус 38±1°С; скорость замораживания - 6,5±0,1°С/ч; продолжительность замораживания 2±1 ч; рабочий вакуум - 7±3 Па; температура нагрева плиты сублиматора - 30±1°С; скорость повышения температуры при сублимации - 3,0± 0,5°С/ч; время первичной сублимации - 8±1 ч; конечная температура материала при десорбции - 25±1°С; время десорбции - 2±1 ч; общее время сублимации - 11±1 ч. График лиофильного высушивания СОП специфической активности АИГ представлен на рисунке 7.

Таким образом, в результате исследований экспериментальным путем отработаны оптимальные параметры лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина в дозировке 5 и 1 мл и F(ab )2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл на современном сублимационном оборудовании Power Dry

Рисунок 7 - Параметры сублимационного высушивания СОП специфической активности антирабического иммуноглобулина ( 1 мл) на установке Epsilon 2-6 D

Исследование молекулярно-массового состава антирабического иммуноглобулина жидкой и лиофилизированной форм

Задачей следующего этапа исследований явилась оценка уровня содержания мономеров, фрагментов и агрегатов в препарате гетерологичного АИГ жидкой и лиофилизированной форм на момент получения и в процессе хранения.

При хроматографическом разделении образцов АИГ жидкой и сухой форм на момент их получения наблюдали один пик мономерной фракции (Рисунок 8а). Хранение жидкого АИГ в течение срока годности (1 год 6 месяцев) в условиях, соответствующих СП 3.3.2.1248-03, не привело к изменению молекулярно-массового состава иммуноглобулина, на хроматограмме регистрировали 100% фракцию мономеров аналогично рисунку 8а.

0.18 0.16 о.и 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

60 100 Обздип

0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0.06 0,04 0,02 О

У -ЛА

0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02

4

50 100

06л, ил

150

Примечание - а - на момент получения, 100 % фракция мономеров; б - фрагментация жидкого АИГ через 3 года хранения; в - агрегация жидкого АИГ, испытанного в стресс-условиях.

Рисунок 8 - Профили элюции образцов антирабического иммуноглобулина (гель-фильтрация на колонке 25 х 2,6 см через ультрагель трисакрил в? 2000М) При исследовании препарата жидкой формы после хранения в течение 3 лет на

хроматограмме после мономерной фракции наблюдали дополнительные пики,

соответствующие фракции фрагментов (Рисунок 86). Содержание фрагментов в среднем

составило 3,15±0,16%. Гель-хроматография образцов лиофилизированного АИГ, хранившихся

в течение 3 лет в условиях, оговоренных в СП 3.3.2.1248-03, выявила наличие 100% фракции

мономеров, аналогично рисунку 8а.

После 3 лет хранения фракцию агрегатов не регистрировали ни в одном из образцов

АИГ жидкой и лиофилизированной форм, несмотря на период хранения АИГ жидкой формы,

вдвое превышающий срок годности препарата, что свидетельствует о высоком качестве

очистки раствора АИГ от остаточного этилового спирта. Тем не менее, дополнительный пик,

соответствующий фракции агрегатов (Рисунок 8в), был зарегистрирован при исследовании

жидкого АИГ серии № 38, помещенного в стресс-условия (56°С в течение 1 ч). Данный тест

применим при изучении стабильности иммуноглобулинов и, как показали результаты гель-

фильтрации, подобные условия резко ухудшили качество препарата жидкой формы, вызвав

образование агрегатов в количестве 15,4±0,09%. В аналогичные стресс-условия были

помещены и образцы лиофилизатов АИГ. В результате гель-хроматографии лиофилизата АИГ,

испытанного в стресс-условиях, не были отмечены изменения в молекулярно-массовом

распределении, на хроматограмме был зафиксирован один пик мономерной фракции,

аналогично рисунку 8а. Полученные результаты указывают на преимущество

лиофилизированной формы АИГ, обеспечивающей стабильность молекулярных параметров в

процессе хранения, а также при неблагоприятных температурных воздействиях.

Исследование свойств лиофилизатов гетерологичного антирабического иммуноглобулина

Необходимым этапом работы при разработке технологии лиофильного высушивания антирабического иммуноглобулина являлась экспериментальная оценка физико-химических и биологических свойств полученных лиофилизатов.

Лиофилизированные образцы АИГ (5 мл) были изучены по спецификационным критериям: описание, содержание белка, специфическая активность in vivo, содержание белка, рН, электрофоретическая однородность, прозрачность, цветность, токсичность, пирогенность, наличие остаточного риванола и этилового спирта, стерильность, а также по следующим показателям: ПМВ, время растворения, молекулярно-массовое распределение, специфическая активность in vitro (Рисунок 9, Таблица 3).

1 -»I

2— j

4 —>]

5 -►]

Примечание - 1-3 ряд - двукратные разведения лиофилизатов АИГ сер. 0101, 0102,0103 с 1:80. Титр 1:5000; 4 ряд - двукратные разведения АИГ жидкого, сер. 101, с 1:80 (полож. контроль); титр 1:5000; 5 ряд - двукратные разведения нормальной лошадиной сыворотки с 1:20 (отриц. контроль) Рисунок 9 - Специфическая активность лиофилизатов АИГ в дот-иммуноанализе с использованием диагностикума на основе наночастиц коллоидного золота

В результате исследования биологических и физико-химических показателей лиофилизатов антирабического иммуноглобулина выявлено соответствие свойств полученных образцов требованиям фармакопейной статье предприятия (ФСП) на «Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций», а по показателям растворимость, потеря в массе при высушивании, молекулярно-массовое распределение -Европейской и Британской фармакопей на лечебные иммуноглобулины. Выявленные значения подтвердили эффективность предложенной технологии лиофильного высушивания АИГ. Изучение стабильности лиофилизатов антирабического иммуноглобулина в процессе длительного хранения Основным критерием качества процесса лиофилизации является сохранность физико-химических и биологических свойств препарата во время длительного хранения.

В таблице 4 представлены данные изучения стабильности лиофилизатов антирабического иммуноглобулина экспериментальных серий 092, 093, 094, полученных в результате сублимационного высушивания на установке.

Power Dry 9000, в процессе хранения. Стабильность свойств оценивали через 6, 12, 24 и 36 месяцев хранения (срок наблюдения) в условиях согласно СП 3.3.2.1248-03. Исследовали на соответствие требованиям НД следующие показатели: внешний вид, растворимость, остаточную влажность, прозрачность и цветность регидратированного препарата, содержание белка, специфическую активность в РН вируса бешенства на белых мышах.

Таблица 3 - Характеристика физико-химических и биологических показателей лиофилизированного антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади

Показатели Нормы НД Р N 002639/01-250210, Результаты испытаний

ЕР (0338) и BP (1051, 1083) сер. 0101 |сер. 0102 |сер. 0103

Описание Пористая гигроскопичная масса в виде таблетки или порошка белого цвета, допускается слабо-желтая окраска. После растворения - прозрачная или слабо опалесцирующая жидкость, от бесцветной до слабо-желтой окраски. Не допускается розового окрашивания препарата Пористая гигроскопичная масса в виде таблетки белого цвета. После растворения - слабо опалесцирующая бесцветная жидкость

Время растворения, мин 20 при температуре 20-25 °С 1,5 2,0 2,2

ПМВ, % не более 3 1,2 1,4 1,7

Прозрачность, ед. ОП Не более 0,05 0,031 0,020 0,021

Цветность, ед. ОП Не более 0,15 0,076 0,068 0,066

РН От 6,6 до 7,4 7,0 7,1 7,1

Белок, % От 9 до 11 % 9,2 9,3 9,2

Электрофоретичес -кая однородность, % Фракция у-глобулина - не менее 80; наличие примесей а, р-глобулинов — не более 20. Альбумин должен отсутствовать у-глобулин -100; а-, р-глобулиньг, альбумины отсутствуют

Молекулярно-массовое распределение, % Сумма площадей пиков мономеров и димеров IgG должна составлять не менее 85, а агрегатов и полимеров - не более 10 от общей площади хроматограммы Фракция мономеров и димеров — 100; агрегаты и полимеры отсутствуют

Риванол Должен отсутствовать Отсутств. Отсутств. Отсутств.

Спирт этиловый, % Не более 4,5 0,7 0,6 0,4

Стерильность Препарат должен быть стерильным Стерилен Стерилен Стерилен

Пирогенность, °С Не более 1,4 0,6 1,4 1,4

Токсичность Препарат должен быть нетоксичным Нетоксич Нетоксич. Нетоксич.

Специфическая активность in vivo, МЕ/мл Не менее 150 в реакции нейтрализации (РН) вируса бешенства на мышах с фиксированным вирусом бешенства 165 170 171

Полученные результаты свидетельствуют, что после 6, 12, 24 и 36 месяцев хранения показатели растворимости, остаточной влажности, содержания белка, цветности, прозрачности и внешний вид препарата не изменились и соответствовали требованиям нормативной документации на антирабический иммуноглобулин жидкой формы.

Определяющим показателем качества антирабического иммуноглобулина является значение специфической активности. Значения данного показателя всех исследуемых экспериментальных серий сухого антирабического иммуноглобулина в процессе хранения при температуре 6±2°С в течение 3 лет составляли более 150 МЕ/мл, что соответствовало спецификационным требованиям и свидетельствовало о стабильности основного показателя антирабического иммуноглобулина.

Таким образом, на основании полученных данных можно рекомендовать срок годности лиофилизированного антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади - 3 года, в течение этого периода времени качественные характеристики препарата остаются на уровне, соответствующем требованиям НД.

Таблица 4 - Стабильность основных физико-химических и биологических показателей лиофилизированного антарабического иммуноглобулина в процессе длительного хранения

Наименование показателя, единица измерения Требования ФСП на жидкий анти- рабический иммуноглобулин Значение показателей качества экспериментальных серий лиофилизированного антарабического иммуноглобулина в процессе хранения, мес.

092 093 094

6 12 24 36 6 12 24 36 6 12 24 36

Время растворения, мин - 2,4±0,2 2,6±0,1 2,6±0,2 2,7±0,2 2,0±0,2 2,1 ±0,2 2,2±0,1 2,1 ±0,1 2,3±0,1 2,2±0,2 2,4±0,1 2,4±0,2

Потеря в массе при высушивании, % - 1,4±0,2 1,3±0,2 1,4±0,1 1,2±0,1 1,5±0,1 1,6±0,1 1,4±0,2 1,4±0,1 1,5±0,2 1,6±0,3 1,4±0,3 1,5±0,1

Прозрачность, ед. ОП Не более 0,05 0,024± 0,001 0,022± 0,002 0,025± 0,001 0,026± 0,001 0,031± 0,002 0,032± 0,002 0,030± 0,001 0,032± 0,001 0,034± 0,003 0,035± 0,002 0,029± 0,001 0,031± 0,003

Цветность, ед. ОП Не более 0,15 0,046± 0,002 0,048± 0,001 0,046± 0,002 0,045± 0,001 0,034± 0,003 0,036± 0,003 0,034± 0,001 0,036± 0,002 0,041± 0,001 0,040± 0,001 0,038± 0,003 0,042± 0,002

Содержание белка, % от 9 до 11 9,4±0,3 9,4±0,2 9,3±0,1 9,3±0,3 9,4±0,2 9,4±0,2 9,3±0,2 9,4±0,1 9,3±0,2 9,2±0,1 9,2±0,2 9,1±0,1

рН От 6,6 до 7,4 7,1 ±0,1 7,0±0,1 7,1 ±0,1 7,0±0,2 6,8±0,1 6,9±0,1 6,8±0,2 7,0±0,0 7,0±0,2 7,0±0,1 6,9±0,1 6,9±0,2

Токсичность Препарат должен быть нетоксичным Нетоксичны

Пирогенность Препарат должен эыть апирогенным Апирогенны

Стерильность Препарат должен быть стерильным Стерильны

Специфическая активность, МЕ/мл Не менее 150 173 161 170 158 204 210 234 188 184 177 179 156

Расчет экономической эффективности внедрения оптимизированной технологии лиофильного высушивания антирабического иммуноглобулина

Представлялось целесообразным произвести расчет экономического эффекта от внедрения предложенных технологических решений при производстве лиофилизированной формы антирабического иммуноглобулина. Расчет производили, учитывая количество электроэнергии, потребляемой технологическим оборудованием при лиофилизации среднегодового количества выпускаемого в институте «Микроб» АИГ. При средней стоимости 1кВт/ч электроэнергии, равной 6,5 руб., затраты на эксплуатацию установки Frigera LZ-9 в целом за год составят 278382,0 руб., использование установки Power Dry обойдется в 6115,2 руб.

Таким образом, за счет экономии потребляемой электроэнергии экономический эффект от внедрения новой технологии с использованием современного сублимационного оборудования Power Dry 9000 составит 272266,8 руб. за год.

Заюиочение

В настоящее время препарат антирабического иммуноглобулина выпускают в жидкой форме. С одной стороны, такая форма наиболее удобна для потребителя, однако препарату в жидкой форме присущи недостатки, связанные с нестабильностью во время длительного хранения и транспортировкой, требующей неукоснительного соблюдения холодовой цепи во избежание ухудшения свойств иммуноглобулина, главным образом, снижения вируснейтрализующей активности. Лучшим способом сохранения стабильности антирабического иммуноглобулина при длительном хранении и транспортировке является лиофилизация. Для максимальной эффективности процесса сублимационного высушивания антирабического иммуноглобулина был необходим рациональный выбор параметров каждого технологического этапа лиофилизации.

На первом этапе работы были исследованы тепловые параметры антирабического иммуноглобулина и определена эвтектическая температура препарата с различными комбинациями лиопротекторов. На основании полученных результатов выявлен оптимальный лиопротеетор - глицин. Определение температуры эвтектики позволило оптимизировать этап замораживания иммуноглобулина путем сокращения его продолжительности с 14 до 9 ч.

Второй и третий этапы сублимационного высушивания антирабического иммуноглобулина в дозировке 5 мл осуществляли на современной установке Power Dry 9000. С использованием данной установки оптимизированы температурно-временные параметры лиофилизации антирабического иммуноглобулина в дозировке 5 мл, а также Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл. При изучении этапа вторичной десорбции был определен оптимальный показатель потери в массе при высушивании, который

обеспечивает хорошую растворимость препарата при хранении и неизменность показателя специфической активности.

С использованием современного оборудования Epsilon 2-6 D «Christ» был предложен режим сублимационного высушивания стандартного образца предприятия специфической активности антирабического иммуноглобулина в дозировке 1 мл. Активность полученных образцов была изучена в реакции нейтрализации на белых мышах; выявленные значения подтвердили эффективность предложенного режима высушивания.

Молекулярно-массовое распределение в антирабическом иммуноглобулине жидкой и сухой форм изучали методом гель-фильтрации. Выявлено, что при хранении жидкого иммуноглобулина в течение 3 лет в нем происходит частичная фрагментация белковых молекул до уровня (3,15±0,16) % при отсутствии агрегатов; лиофилизат иммуноглобулина через 3 года сохранил первоначальные показатели молекулярно-массового распределения и характеризовался 100 % фракцией мономеров и димеров.

На заключительном этапе исследований была изучена стабильность свойств лиофилизированного антирабического иммуноглобулина в процессе хранения и рекомендован срок годности сухого препарата - 3 года.

Выводы

1. Разработана производственная технология получения новой лекарственной формы гетерологичного антирабического иммуноглобулина - лиофилизата для приготовления раствора для внутримышечного введения.

2. Определены тепловые параметры гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Показано, что эвтектическая температура препарата с различными комбинациями лиопротекторов имеет следующие значения: с глицином - минус 36°С; с глицином и сахарозой - минус 44°С; с глицином и мальтозой - минус 34°С.

3. Экспериментально обосновано применение глицина в качестве лиопротектора при получении лиофилизированного антирабического иммуноглобулина.

4. Установлены оптимальные параметры лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов.

5. Изучены спецификационные показатели лиофилизированного гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов. Показано соответствие выявленных значений требованиям нормативной документации.

6. Исследован молекулярно-массовый состав антирабического иммуноглобулина жидкой и лиофилизированной форм. Выявлено, что при хранении жидкого препарата происходит частичная фрагментация белковых молекул. Доказано сохранение первоначальных показателей молекулярно-массового распределения в лиофилизированном антирабическом иммуноглобулине в процессе хранения.

7. Изучена стабильность лиофилизированного антирабического иммуноглобулина в процессе хранения и установлен срок годности сухого препарата - 3 года.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Генералов, C.B. Получение препарата Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина с использованием иммобилизованного пепсина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Е.М. Храмкова, И.А. Шепелев, Л.В. Савицкая, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, Т.А. Михеева, H.H. Кочкалова, М.Н. Киреев// Проблемы особо опасных инфекций.

- 2008. - Вып. 97. - С. 53-56.

2. Абрамова, Е.Г. Определение молекулярных параметров препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина методом гель-фильтрации / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, H.H. Кочкалова , C.B. Генералов, А.Г. Селезнева, Л.В. Савицкая, Ю.В. Иванов//Проблемы особо опасных инфекций.-2010.-№ 4 (106).-С. 54-57.

3. Абрамова, Е.Г. Получение лиофилизированного препарата антирабического иммуноглобулина и исследование его основных свойств / Е.Г. Абрамова, H.H. Кочкалова А.К. Никифоров, А.Ю. Бутырский, Ю.В. Иванов, Н.В. Синицына, Т.А. Михеева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, Л.В. Савицкая, C.B. Генералов, М.Н. Киреев, H.A. Шарапова // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 2(108). - С. 75-78.

4. Кочкалова, H.H. Определение эвтектической температуры и исследование тепловых параметров гетерологичного антирабического иммуноглобулина методами электропроводности и дифференциальной сканирующей калориметрии / H.H. Кочкалова, А.К. Никифоров, Н.Г. Манин, Е.Г. Абрамова // Биотехнология. - 2011. - № 5. - С. 80-84.

5. Кочкалова, H.H. Оптимизация формы выпуска и потребительской тары иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади / H.H. Кочкалова, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, O.A. Лобовикова, Л.В. Савицкая, С.А. Бадарин, C.B. Генералов, Н.И. Костылева, H.A. Шарапова, Ю.В. Иванов // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - № 5 (87), ч. 1. - С. 236-238.

Публикации в сборниках научных и научно-практических конференций:

6. Абрамова, Е.Г. Получение и изучение качества лиофилизированной формы антирабического иммуноглобулина / Е.Г. Абрамова, H.H. Кочкалова, А.К. Никифоров, Н.В. Синицына, Ю.В. Иванов, М.Н. Киреев, H.A. Подборонова // Окружающая среда и здоровье человека: Материалы Всерос. науч.-практ. конференции. - Рязань, 2007. - С. 233-235.

7. Кочкалова, H.H. Исследование основных свойств лиофилизированного антирабического иммуноглобулина / H.H. Кочкалова, Е.Г. Абрамова, Н.В. Синицына, Н.И. Костылева, Ю.В. Иванов, М.Н. Киреев, H.A. Подборонова, O.A. Лобовикова, А.К. Никифоров// Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы VIII Межгосуд. науч.-практ. конференции государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 231-232.

8. Генералов, C.B. Способ получения Р(аЬ')г-фрагментов антирабического иммуноглобулина с использованием иммобилизованного пепсина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Е.М. Храмкова, И.А. Шепелев, Л.В. Савицкая, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, Т.А. Михеева, H.H. Кочкалова, М.Н. Киреев // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств: Материалы IX Межгосуд. науч.-практ. конф.

- Волгоград, 2008. - С. 49-50.

9. Абрамова, Е.Г. Оптимизация потребительской формы гетерологичного антирабического иммуноглобулина / Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, H.H. Кочкалова, Л.В. Савицкая, А.Г. Селезнева, Т.А. Михеева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, H.A. Шарапова, М.Н. Киреев, Ю.В. Иванов// Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Материалы Всерос. науч.-практ. конференции. - Москва, 2008. - С. 12.

10. Генералов, C.B. Получение антирабического препарата на основе Г(аЬ')2-фрагментов иммуноглобулина / C.B. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Е.М. Храмкова, И.А.

Шепелев, JI.B. Савицкая, H.H. Кочкалова, М.Н. Киреев // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Материалы Всерос. науч.-практ. конференции. - Москва, 2008. - С. 38.

11. Никифоров, А.К. Производство препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина: достижения и пути усовершенствования / А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, O.A. Лобовикова, C.B. Генералов, H.H. Кочкалова // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы Пятого Московского международного конгресса, часть 1. - Москва, 2009. -С. 182-183.

12. Кочкалова, H.H. Определение молекулярных параметров препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина методом гель-фильтрации / H.H. Кочкалова, Е.Г. Абрамова // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы науч.-практ. школы-конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 279-282.

13. Кочкалова, H.H. Определение эвтектической температуры и исследование тепловых параметров гетерологичного антирабического иммуноглобулина методами электропроводности и дифференциальной сканирующей калориметрии / H.H. Кочкалова, А.К. Никифоров, Е.Г. Абрамова, Н.Г. Манин // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы III науч.-практ. школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2011. - С. 273-275.

14. Абрамова, Е.Г. Разработка лиофилизированной формы гетерологичного антирабического иммуноглобулина / Е.Г. Абрамова, H.H. Кочкалова, А.К. Никифоров, М.Н. Киреев, Ю.В. Иванов, Н.В. Синицына, Т.А. Михеева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, Л.В. Савицкая, C.B. Генералов // Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Рос. Федерации: Материалы X Съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2012. —Том 2, № 1-2. - С. 91.

Подписано в печать 10.02.2015. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Шрифт New Roman Cyr. Усл. печ. Л. 1,38. Уч.-изд. Л. 1,48. Заказ № 60. Тираж 100 экз. Отпечатано: ИП Фатеев М.С. г. Саратов, ул. Рабочая, д. 19/21, оф. 1 ИНН 645503657876