Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab`)2-фрагментов

Генералов, Сергей Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab`)2-фрагментов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab`)2-фрагментов"

На правах рукописи

ГЕНЕРАЛОВ СЕРГЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

003462Э22

Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе Р(аЬ')2-фрагментов

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

0 3

и.-.

Саратов - 2009

003462922

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель: кандидат медицинских наук

Никифоров Алексей Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Дыкман Лев Абрамович,

кандидат медицинских наук Храмов Михаил Владимирович

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита диссертации состоится 19 марта 2009 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г.Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Автореферат диссертации разослан С/М^^СЯЛ^-Я-— 2009 г.

и размещён на сайте wvw.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», учёному секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь диссертационного совета

Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Бешенство, являясь легальном, острой зоопозной природно-очаговой инфекцией, представляет большую опасность для человека и, по оценке ВОЗ, по наносимому экономическому ущербу среди инфекционных болезней занимает пятое место. Заболеваемость бешенством регистрируется на территории большинства стран мира, где ежегодно свыше 10 миллионов человек получают различные повреждения от животных и более 4 миллионов человек — специфическую антирабическую помощь. Бешенство до сих пор остается практически неизлечимым заболеванием, от него ежегодно погибает до 50 тысяч человек. В Российской Федерации социально-экономическое значение проблемы бешенства в последние годы неуклонно растет, в том числе вследствие формирования новых очагов инфекции. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Почти во всех регионах страны периодически отмечается активизация природных , очагов бешенства, растет число случаев заболевания среди диких плотоядных животных, вовлекаются в эпизоотический процесс домашние и сельскохозяйственные животные. В период с 2000 по 2006 годы в 35 субъектах Российской Федерации было зарегистрировано 99 случаев гидрофобии среди людей (Ха-дарцев с соавт., 2006; Государственный доклад о санитарно-эпидемиологической обстановке..., 2007).

Оптимальным методом системной антнрабнческой постэкспозициопной профилактики бешенства является комбинированное введение антнрабнческой вакцины и антирабического иммуноглобулина (WHO Expert Consultation on Rabies..., 2004). Для пассивной иммунизации людей применяют гетероло-гичный или гомологичный иммуноглобулин. Отрицательной стороной всех гетерологичиых препаратов антирабического иммуноглобулина является опасность развития аллергических осложнений. Согласно данным ВОЗ, у 1-2% пациентов при введении гетерологичного иммуноглобулина могут возникнуть

побочные реакции (WHO Expert Consultation on Rabies..., 2004). При использовании гомологичного иммуноглобулина таких осложнений не возникает, но его себестоимость в несколько раз превышает таковую гетерологичного иммуноглобулина. Перспективным направлением является создание препаратов с менее выраженными реактогенными свойствами, но в то же время с доступной ценой.

Наиболее рациональным направлением совершенствования лошадиных иммуноглобулинов представляется разработка способов дополнительной очистки с помощью ферментативного гидролиза иммуноглобулина с последующим фракционированием на хроматографической колонке. Настоящее исследование посвящено разработке нового препарата с улучшенными свойствами на основе антирабического иммуноглобулина.

Цель работы состояла в разработке оптимальной схемы получения препарата Р(аЬ')1-фрагмеитов антирабического гетерологичного иммуноглобулина с применением иммобилизованного пепсина.

Задачи исследования:

1. Выбрать оптимальный способ получения препарата иммобилизованного пепсина, стабильного в условиях ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.

2. Охарактеризовать биохимические свойства иммобилизованного пепсина.

3. Разработать. экспериментальную схему эффективного ферментативного гидролиза иммуноглобулина с помощью иммобилизованного пепсина.

4. Подобрать оптимальные условия для хроматографического фракционирования и концентрирования препарата Ir(ab'^-фрагментов антирабического иммуноглобулина.

5. Охарактеризовать препарат Р(аЬ'Ь-фрагмептов антирабического гетерологичного иммуноглобулина по соответствию физико-химических свойств нормативным документам, предъявляемым к антирабическому иммуноглобулину.

6. Исследовать протективиые и реактотенпые свойства препарата аитпраби-ческого иммуноглобулина на основе 1т(аЬ'^-фрагментов в сравнении с коммерческим препаратом псрасщепленного гетерологичиого ангнрабк-ческого иммуноглобулина на лабораторных животных. Научная иотглш

Получен антнрабический препарат на основе Р(аЬ')2-фрагмеитов, для осуществления этапа ферментативного гидролиза предложено использование иммобилизованного пепсина. Сконструированы стабильные биокатализаторы, пригодные для осуществления ферментативного гидролиза антирабичсского иммуноглобулина. Показано, что реактогеппые свойства препарата Р(аЬ')г фрагмеитов менее выражены, чем у перасшепленного иммуноглобулина, при этом специфическая активность препаратов практически одинакова.

Практическая лшчимасшь /шСшты

Разработана биотехиологическая схема получения препарата 17(аЬ'); фрагментов антмрабпческого иммуноглобулина, предназначенного для по-стэкспознннонпой профилактики гидрофобии у людей. Схема включает следующие этапы: иммобилизацию пепсина. ферментативный гидролиз антнраби-ческого иммуноглобулина, хроматографнчсск'ос отделение Р(аЬ'Ь-фрагмептов от остатков Г'с-частн молекулы иммуноглобулина и перасщеплсипого иммуноглобулина, концентрирование и стерилизующую фильтрацию. Показано, что для осуществления ферментативного гидролиза иммуноглобулина наиболее эффективно использовать пепсин, иммобилизованный па нерастворимых матрицах. В качестве матриц могут выступать АН-агароза, Оои'ех АС 1X8, природный силикат. Для очистки препарата подобраны условия хроматографичеекого фракционирования на геле ЗР-БерЬапке-ХЬ. Г(аЬ' ^-фрагменты элюнровадн вторым пиком без примесей пнзкомолскулярных пептидов и иерасщеплеппых молекул иммуноглобулина. Элюцию проводили 0,02 М ацетатным буфером (рН 5,5) на колонке размером 5.0 х 30 см со скоростью 4 мл/мин. Для копиентрироиапня препарата подобраны условия лиофплыюго высушивания. Высушивание проводили в течение 48 часов, начальная температура материала составляла минус

40 °С, давление в камере — 2-3 Па. температура испарителя — минус 90 + 2°С. Полученный препарат на основе F(alV):-(|)parMeiiTOB нетоксичен, его специфическая активность не уступает таковой нсраешепленного иммуноглобулина, при этом peaicroreиные свойства менее выражены.

По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Получение F(ab'^-фрагментов антирабнческого иммуноглобулина в лабораторных условиях». Методические рекомендации одобрены Учёным советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 2 от 17 апреля 2007 г.) и утверждены директором института 15.05.2007.

Основные положения, ныносимые па иицишу:

/.Способ иммобилизации пепсина па природном силикате с помощью растворимого карбодиимнда является оптимальным для получения биокатализатора, предназначенного для ферментативного гидролиза антнрабичсского иммуноглобулина.

2. Разработанная схема с использованием ферментолнза гетсрологичпого антирабнческого иммуноглобулина при 37°С и рМ 4,5+0,5 в течение 24 часов н хромагографпчсского фракционирования па геле SP-Sepharose-XL позволяет получать аитирабнческий препарат, представляющий собой моиофракцию Р(аЬ'Ь-фрагмеитов антител.

3. Препарат 17(а1">')2-фрагментов антирабнческого иммуноглобулина соответствует нормативным физико-химическим параметрам, предъявляемым к коммерческому препарату гегерологпчпого антирабнческого иммуноглобулина: содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретнческой однородности.

4. Уровень внруснейтралпзующои активности экспериментальных образцов препарата Г(аЬ" Ь-фрагмептои ранен таковому коммерческого препарата гетерологнчпого антирабнческого иммуноглобулина.

5. Препарат на основе Р(аЬ'):-фрпгмонгов антнрабичсского иммуноглобулина не обладает апафнлактогепными свойствами.

Работа выполнена в отделе профилактических препаратов РосНИПЧИ "Микроб" в рамках темы НИР: «Разработка и внедрение в производство новых медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы» (шифр: 26205).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2007 - 2008); Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» (Москва, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы е инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями па территории государств-участников СИГ: Материалы» (Волгоград, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи, одна в издании, рекомендованном «Перечнем ведущих рецензируемых научных журнгтов и изданий» ВАК РФ.

/ 8

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 192 источников, из них зарубежных - 100. Объём диссертации составляет 144 страниц машинописного текста, включает 28 рисунков и 5 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Материалы и методы

Методы иммобилизации ферментов. Иммобилизацию пепсина осуществляли следующими методами: адсорбцией на DEAE-целлюлозе (Chen et а!., 1977), сополимернзацией фермента (Khan et al.. 1985), с осаждением гидроксн-дом титана (Райхер с соавт., 1992), коиалентным присоединением фермента к следующим носителям: природному силикату (Puvanakrishnan et al., 1984), ионообменным смолам Amberlite А26 и Dowex AG 1X8 (Sannier et al., 1993), DEAE-целлюлозе, амнногексилагарозе (Tomono el al., 1981).

Штаммы микроорганизма«. Штамм фиксированного вируса бешенства CVS был предоставлен ГИСК им. J1.A Тарасовича для постановки реакции нейтрализации.

Характеристика биофизических и иммунобиологических свойств препарата. Для определения активности пепсина применяли метод Н.П. Пятницкого (Кушмамова, Ивченко, 1983). Для определения рИ- и термостабильиости иммобилизованного пепсина испытуемый образец инкубировали при соответствующих условиях в течение 18 часов без перемешивания, после чего исследовали активность образца.

Концентрацию белка определяли бнурстовым методом (МУК 4.1/4.2.58896). Оптическую плотность раствора определяли на фоточлектроколориметре при длине волны 540 им в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с кон-

трольным раствором. Контрольный раствор готовили из стандартного образна предприятия.

Для определения цветности и прозрачности измеряли оптическую плотность исследуемого раствора в кюветах с толщиной слоя 3 мм по сравнению с дистиллированной водой при длинах волн 400 и 540 нм соответственно. Измерение оптической плотности каждой пробы проводили трижды, затем рассчитывали средний арифметический показатель.

Для определения белкового состава использовали методы электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы (МУК 4.1/4.2.588-96) и в полиакриламидиом геле(ЬаетП, 1970).

Испытание препарата Р(аЬ'):-фрагментов аитирабического иммуноглобулина на токсичность осуществляли па белых мышах, которым внутрибрюшип-но вводили I мл препарата. Наблюдение за животными осуществляли ежедневно в течение 7 суток.

Определение специфической активности препарата на основе P(ab')i-фрагмеитов проводили методами in vivo и in vitro. Определение специфической активности in vivo осуществляли в реакции централизации с предварительно установленной дозой инфицирующего вируса (Методы лабораторных исследований по бешенству, 1975). Для определения активности препарата на основе Г(аЬ')2-фрагменто» иммуноглобулина в качестве стандарта использовали отраслевой стандартный образец аитирабического иммуноглобулина ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Наблюдение за животными вели в течение 14 суток. Начиная с пятых суток учитывали животных погибших от бешенства. Анализ результатов проводили по методу Reed и Muench (Методы лабораторных исследований по бешенству, 1975). Для изучения специфической активности препарата F(ab)r фрагментов in vitro использовали метод дот-иммуноаналнза с использованием диагностикумц на основе коллоидного золота, разработанного в РосИИПЧИ "Микроб" (Подборонова с соавт., 2008).

Реактогеппые свойства F(ab'),-фрагментов аитирабического иммуноглобулина изучали па морских свинках в реакции активной анафилаксии. Живот-

пых однократно сенсибилизировали подкожным введением испытуемых препаратов в количестве 0,5 мл, содержащих 0,1 мг белка. На двадцать первый день внутрисердечно вводили разрешающие дозы соответствующих препаратов. Учёт результатов проводили по соотношению числа погибших животных к числу взятых в опыт и по тяжести реакции. Силу анафилактической реакции оценивали по четырехплюсовон схеме (Руководство по иммунологии, 1973).

Анафилактический индекс определяли по формуле Weigle W.O. (Степанова, Менявцева, 1983):

(4с/ + ЗЛ + 2с+1с/ + 0с)

К —-;

(a + h + c + d + е)

где 4,3,2,1,0 - оценка шока н крестах; a,b.c,d,e - количество животных, у которых имел место шок соответствующей тяжести.

Лабораторные животные. В работе использовали белых мышей обоего пола, массой 10-12 г для постановки реакции нейтрализации и 18-20 г для осуществления испытания на токсичность. Для постановки реакции активной анафилаксии использовали морских свинок обоего пола массой 300-350 г.

Статистические методы. Статистический анализ результатов проводили по стандартным методикам (Ашмарнн, Воробьёв, 1962; Лакни, 1990). Вычисления проводили с использованием программ Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corporation) и Statistica 6 (Statsolt Inc).

Получение 11МА1оП||лнзов:111НОГ() фермен та iiciiciina На начальном этапе исследовании был сконструирован иммобилизованный пепсин. Изучено десять вариантов иммобилизации пепсина па носителях различного происхождения. Для присоединения ферментов к носителям былн использованы методы адсорбционной н коваленгной иммобилизации. В таблице 1 сравнивается протеолитическая активность пепсина, иммобилизованного на различных носителях, измеренная но методу Н.П. Пятницкого. Для дальнейшего ферментативного гидролиза иммуноглобулина и получения F(alv)i-фрагмептов целесообразно выбрать бпокатализатор с активностью не менее 3-4 ед/мл. Использование менее активных ферментов приводит к значительному

увеличению объема твёрдой фазы в реакционной среде, что затрудняет перемешивание и способствует снижению скорости реакции.

Таблица I

Протеолитмческая активность иммобилизованного пепсина, полученного различными способами

№ Способ иммобилизации Носитель Протеол ити ческая активность

1 Физический (адсорбция) ОЕАЕ-целлюлоза 4,90 ед/мл

2 Гл утаро воапьдегнднын Не используется 110,60 ед/г

п J Осаждение хлоридом титана Не используется 9,36 ед/мл

4 Гл утаро воал ьде гидн ы й Оо\уех Ай 1Х8 9,20 ед/г

5 Карбоднимидиын Эои'ех АС 1X8 11,20 сд/г

6 Глутаровоал ьдсгндны й АтЬеНие А 26 менее 1,00 ед/г

7 Карбодиимидиый АтЬегМе А 26 2,97 ел/г

8 Глутаровоальдегидный с использованием у-АПТС Природный силикат менее 1,00 ед/г

9 Карбо ди и м н ди ы й с использованием у-АПТС Природный силикат 4,00 ед/г

10 Глутаровоальдегидный А И-а га роза 9,58 ед/мл

При выборе метода иммобилизации фермента, помимо его активности, учитывали другие свойства: стабильность при фиксированных значениях рН (3,5; 4,5; 5,5) и температуры (23, 30, 37°С), стабильность при храпении в течение 30 дней прн 4°С, возможность многократного применения. Установлено, что для этапа ферменативпого гидролиза наиболее подходят нерастворимые ферменты, полученные ковалептпым присоединением пепсина к амииогекси-лагарозе с помощью глутарового альдегида, а также ковалептпым присоединением к полистнрольному носителю Оо\уех АС 1X8 и природному силикату с помощью карбодппмида. Бмокаталнзаторы, полученные иммобилизацией на природном силикате или носителе Рои'ех, после пятикратного применения со-

храняют 80-82% первоначальной протеолитической активности, а пепсин, иммобилизованный на АН-агарозе, сохраняет 75-76% первоначальной активности. Для проведения гидролиза рекомендуется выбирать пепсин, иммобилизованный на природном силикате с помощью карбодиимида, поскольку данный биокатализатор достаточно активен, стабилен, а стоимость носителя, необходимого для его получения, минимальна.

Разработка технологии получения Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина с помощью гетерогенного катализа В последующих экспериментах были выбраны условия получения, очистки и концентрации Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина. Для осуществления этапа ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина выбрана модель реактора периодического действия ёмкостного типа с мешалкой. В качестве исходного сырья для получения Р(аЬ)2-фрагментов использовали коммерческий препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина (РосНИПЧИ "Микроб"). Наиболее эффективно проведение ферментативного гидролиза в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,0 - 5,0) в течение 24 ч при температуре 37°С. Оптимальная концентрация иммуноглобулина в реакционной смеси должна составлять 20-30 мг/мл. Было установлено, что для ферментативного гидролиза иммобилизованным пепсином одного грамма иммуноглобулина оптимальным соотношением является такое количество фермента, которое бы обеспечивало 200 единиц протеолитической активности, измеренной по методу Н.П.Пятницкого.

Схемы ферментативного гидролиза могут отличаться типом используемого иммобилизованного фермента, поскольку, как было установлено, глубина расщепления молекул иммуноглобулина практически не зависит от данного фактора. На окончательный выбор иммобилизованного фермента влияют такие параметры, как его биохимические свойства, стоимость носителя, удобство работы.

л' Н о

н о ч с

к ь с

158 214 274 3 34 3 94

Элюируемый объём, мл Рис. 1. Профиль элюции продуктов ферментативного гидролиза на БР-сефарозе ХЬ

Рис. 2. Электрофорез продуктов ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина в полиакриламидном геле

Примечание: 1 - маркеры молекулярного веса; 2 - антирабический иммуноглобулин (фракция 1); 3-7 - Р(аЬ')гфрагменты антирабического иммуноглобулина (фракция 2); 8-9 - гидролизат антирабического иммуноглобулина.

Для отделения Р(аЬ'Ь-фрагмемтов нз реакционной смеси были подобраны условия хроматографического ф^кциоиирования продуктов ферментативного гидролиза. Было показано, что для этой цели следует применять гель SP-Sepharose-XL. При хроматографии на колонке размером 5,0x30 см и скорости элюции 4 мл/мни Р(аЬ')2-фрагмепты элюировали вторым инком без примесей низкомолекулярных пептидов и нерасщепленных молекул иммуноглобулина (рис. 1, 2). Элюцию проводили 0,02 М Na-ацетэтным буфером, pH 5,5.

Для концентрирования Г(аЬ')гфрагментов был предложен метод лио-фильного высушивания. Данный метод позволяет в конечном итоге получить препарат с высокой концентрацией белка с минимальным риском снижения протективнон активности. Учитывая большой объем удаляемого растворителя и низкую концентрацию белка, лиофнлнзацию проводили в течение 48 часов. Предварительно осуществляли замораживание материала до температуры минус 40 °С. Процесс лнофильпого высушивания характеризовался максимально щадящими условиями. Продолжительность процесса сублимационной сушки до температуры препарата минус 34°С составляла 8 часов, давление в камере составляло порядка 2-3 Па, температура испарителя — минус 90 + 2°С. Повышение температуры препарата от минус 34 до минус 10 происходило в течение двух часов. Этап удаления связанной влаги занимал 27 часов. При завершении процесса заданные параметры не менялись в течение пяти часов и соответственно равнялись следующим показателям: температура сублиматора - минус 91°С, температура нагревателей — 15°С, температура материала — 21°С. Лио-фильио высушенный препарат представлял собой белую пористую массу, легко растворимую в воде. Для дальнейших исследований препарат в стерильных условиях растворяли в физиологическом растворе до необходимой концентрации.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана технология получения препарата на основе Р(аЬ')>-фрагмеитоо гетерологичного аитнрабпческого иммуноглобулина с использованием иммобилизованного пепсина и методов хроматографического фракционирования, принципиальная схема осуществления которой представлена на рисунке 3.

Рис. 3. Схема получения препарата 17(аЬ'):-фрагмеитов антирабического иммуноглобулина

Основными лапами получения препарата на основе Р(аЬ'^-фрагментов антирабического гетерологнчпого иммуноглобулина являются им мобилизация

пепсина, ферментативный гидролиз антирабического иммуноглобулина, хро-матографическое отделение Г(аЬ,)гфрагмеитов от остатков Fe-части молекулы иммуноглобулина и нерасщеплепного иммуноглобулина, концентрирование и стерилизующая фильтрация.

Полученный поданной схеме препарат па основе Р(аЬ'Ь-фрагментов антирабического иммуноглобулина представлял прозрачную жидкость слабо жёлтого цвета. Концентрация белка составляла 8,0%, рН — 6,7; цветность — 0,11; прозрачность — 0,03. Препарат был электрофоретически однороден, не содержал примесей Рс-фрагмеитов пли остатков иерасщеплениого иммуноглобулина. Таким образом, по физико-химическим параметрам препарат Р(аЬ,):-ф|мгмептоп антирабического иммуноглобулина, полученный по данной схеме, удовлетворяет требованиям, предъявляемым к препарату антирабического гетерологпчного иммуноглобулина.

Исследование иммунологических свойств Г(а1)1)гфр;»гментов гсчсршшгичного ангнрабнчеекого иммуноглобулина

Заключительным этапом исследований явилось изучение протсктнвных и реактогенных свойств Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина. При изучении протсктнвных свойств препарата на основе Р(аЬ'Ь-фрагментов ¡n vivo установлено, что данный препарат обладает достаточной вируснейтралн-зуюшей активностью. Результаты исследования специфической активности в реакции нейтрализации приведет.! в таблице 2.

Средняя величина логарифма титра нейтрализующих антител составила 3,73 + 0,52 для Р(аЬ')2-фрагмеитов и 3,9 + 0,23 для отраслевого стандартного образца антирабического иммуноглобулина. Полученные данные указывают на несущественность различий в нейтрализующей способности сравниваемых препаратов.

Таблица 2

Результаты реакции нейтрализации

№ опыта Название препарата Титр антител lg титра антител

1 IgOCO 1:3475 (400ME) 3,54

lg цельный (исходный препарат) 1:3119 (359ME) 3,49

F(ab')i 1:2460 (283ME) 3,39

2 IgOCO 1:11748 (400ME) 4,07

F(ab'b 1:4000(136 ME) 3,60

3 IgOCO 1:1282! (400ME) 4,11

F(ab')i 1:16000 (136 ME) 4,20

Исследование протективных свойств in vitro, методом дот-иммуноанализа, также показало, что титр антител препарата Р(аЬ')гфрагментов ' н антирабического иммуноглобулина примерно одинаков и составляет 1:3200 -1:6400. Таким образом, специфическая активность Р(аЬ');>-фрагментоп антирабического иммуноглобулина существенно не отличается от специфической активности исходного препарата в тестах in vivo и in vitro.

Для оценки безопасности испытуемого препарата, а также для установления выраженности его повреждающего действия на живой организм, были изучены токсигенные и реактогенные свойства. При сравнении реактогенных свойств установлено, что препарат на основе Р(аЬ')1-фрагментов нетоксичен, обладает меньшей реактогенностыо, чем исходный иммуноглобулин (рис. 4).

10 40 80

Концентрация белка, мг/мл

Рис.4. Сравнительное исследование реактогенных свойств антирабического

иммуноглобулина и выделенных из него Р(аЬ')2-фрагментов

Примечание:

■ Антирабический иммуноглобулин

□ Р(аЬ')2-фрагменты антирабического иммуноглобулина-

При проведении тестов активной анафилаксии реакция животных на введение Р(аЬ')2-фрагментов отсутствовала, в то время как при введении аналогичных доз иммуноглобулина имели место случаи гибели животных. Различие анафилактогенных свойств гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его Р(аЬ')2-фрагментов статистически достоверно (р < 0,05; X = 4,5).

Таким образом, в результате нашей работы разработана оптимальная биотехнологическая 'схема получения препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, обладающего достаточной протективной активностью и менее выраженными реактогенными свойствами по сравнению с препаратом нерасщепленного иммуноглобулина. Результаты проведённых исследований обосновывают перспективность применения Р(аЬ')2-фрагментов в качестве лечебно-профилактического малореактогенного иммуноглобулиново-го препарата.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы стабильные препараты иммобилизованного пепсина, пригодные для осуществления ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Для иммобилизации пепсина наиболее подходящим является ковалеитное присоединение к природному силикату с помощью кар-бодиимнда.

2. Разработана методология ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Установлено, что для ферментативного гидролиза иммобилизованным пепсином одного грамма иммуноглобулина оптимальным соотношением является такое количество фермента, которое бы соответствовало 200 единицам протеолитпческой активности.

3. Разработаны оптимальные условия хроматографического отделения Р(аЬ')>-фрагмептов от компонентов реакционной смеси па колонке с гелем БР-БерИагозе-Х!- и последующего концентрирования методом лнофнльпого высушивания.

4. Препарат Р(аЬ')гфрагме11Тов антирабического иммуноглобулина соответствует нормативным физико-химическим параметрам, предъявляемым к препарату коммерческого гетерологнчпого антирабического иммуноглобулина: содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретическон однородности, не содержит примесей Рс-фрагментов или остатков нерасще-плеиного иммуноглобулина.

5. При сравнении вируснентрализующен активности препаратов на основе Р(аЬ')гфрагмептов антирабического иммуноглобулина и нерасщеплеиного антирабического иммуноглобулина в реакции нейтрализации и дот-иммупоанализе показано, что внрусиеПтралнзующая активность исследуемых препаратов находи тся па равном уровне.

6. В сравнительном изучении реактогеппых свойств в реакции активной анафилаксии показано, что препарат на основе Р(аЬ'):-фрагмеигов антира-

2(1

бического иммуноглобулина является более безопасным, чем исходным

препарат иерасщепленного гетерологнчного аитирабического иммуноглобулина.

Список работ, опубликованных по теме днсссрзацни

1. Никифоров А.К., Волох O.A., Киреев М.Н., Дятлов H.A., Генералов C.B. Применение новых технологий в производстве гетерологнчного аитирабического иммуноглобулина // Инновационные технологии медицины XXI века: Материалы Всероссийского научного форума. - М.: ЗАО «МЕДИ Экспо». - 2006. - C.I37-I3S.

2. Никифоров А.К., Генералов C.B., Волох O.A., Киреев М.Н., Абрамова Е.Г. Использование ферментативного катализа для получения препарата аитирабического иммуноглобулина с улучшенными свойствами на основе F(ab')rфрагментов // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — М.: Санэпидмедиа, 2007. - T. I. - С. S6 - 87.

3. Генералов C.B., Волох O.A., Абрамова 12.Г., Киреев М.И., Лобовикова O.A., Никифоров А.К. Конструирование иммобилизованного пепсина для получения Р(аЬ'Ь-фрагмситов аитирабического иммуноглобулина // Окружающая срсда и здоровье: Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов. - Рязань, 2007. - С. 239 - 240.

4. Генералов C.B., Волох O.A., Лобовикова O.A., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К. Получение Р(аЬ'Ь-фрагментов аитирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях // Ме тодические документы и отчёты по санитар-но-эпндемнологической охране территории Российской Федерации. Реферативный сборник. - Саратов, 2007. -С.20.

5. Генералов C.B., Волох O.A., Абрамова Е.Г., Киреев М.Н., Лобовикова O.A., Никифоров А.К. Получение иммобилизованного пепсина для ферментативного гидролиза аитирабического иммуноглобулина // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ:

Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Саратов: ООО «Приволжское издательство». - 2007,-С. 189- 190.

6. Никифоров. А.К., Генералов C.B., Волох O.A., Лобовикова O.A., Абрамова Е.Г., Кпреев М.Н. Применение нативиого и иммобилизованного пепсина для получения Р(аЬ')1-фрагментов антирабического иммуноглобулина // Биопрепараты. - 2007. - №2. - С. 20 - 21.

7. Генералов C.B., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Храмкова Е.М., Шепелев И.А., Савицкая Л.В., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Михеева Т.А., Кочкалова H.H., Киреев М.Н. Способ получения Р(аЬ'):-фрагментов антирабического иммуноглобулина с использованиием иммобилизованного пепсина // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. — Волгоград: Издательство ВолГМУ. - 2008. - С. 13 -15.

8. Генералов C.B., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Храмкова Е.М., Шепелев И.А., Савицкая Л.В., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Михеева Т.А., Кочкалова H.H., Киреев М.Н. Получение препарата Р(аЬ')гфрагмемтов антирабического иммуноглобулина с использованием иммобилизованного пепсина // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - № 3. - С. 53 -56.

9. Генералов C.B., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Храмкова Е.М., Шепелев И.А., Савицкая Л.В., Кочкалова H.H., Кпреев М.Н. Получение антирабического препарата на основе Р(аЬ'Ь-фрагментов иммуноглобулина И Вакцинологня. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - М. - 2008. -С.38-39.

10. Генералов C.B., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Савицкая Л.В., Галкина М.В., Минаева Л.Н., Михеева Т.А., Будыхо C.B. Характеристика протек-тивных и реактогенных свойств препарата Р(аЬ')?-фрагментов антирабического иммуноглобулина // Вашинология 2008. Совершенствование

иммунобиологических средств профилактики, диагностики и леченн инфекционных болезней: тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - М. - 2008. - С. 39.

Сдано в набор 06. 02. 2009 г. Подписано к печати 09. 02.2009 г. Формат 60 х 90 1/6. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Объём 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в РосНИПЧИ "Микроб", 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Генералов, Сергей Вячеславович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Иммуноглобулиновые профилактические препараты: классификация и технологии получения.

Глава 2. Основные принципы получения иммобилизованных ферментов.

2.1. Типы носителей, применяемых для иммобилизации ферментов.'.

2.2. Методы иммобилизации ферментов.

2.3. Влияние иммобилизации на биохимические свойства ферментов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Реактивы и растворы.

3.2. Оборудование и приборы.

3.3. Методы иммобилизации ферментов.

3.4. Штаммы микроорганизмов.

3.5. Биохимические, биофизические, иммунологические и иммунохимические методы исследования.

3.5.1. Определение протеолитической активности пепсина.

3.5.2. Определение рН- и термостабильности пепсина.

3.5.3. Определение концентрации белка.

3.5.4. Определение прозрачности и цветности препарата Г(аЬ?)2- фрагментов антирабического иммуноглобулина.

3.5.5. Определение белкового состава методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.

3.5.6. Определение белкового состава методом электрофореза в ПААГ.

3.5.7. Дот-иммуноанализ.

3.5.8. Испытание на токсичность.

3.5.9. Реакция нейтрализации на белых мышах.

3.5.10. Реакция активной анафилаксии.

3.6. Лабораторные животные.

3.7. Статистические методы.

Глава 4. Получение иммобилизованного фермента пепсина.

4.1. Выбор оптимального способа иммобилизации пепсина.

4.2. Изучение активности иммобилизованного фермента.

4.3. Изучение стабильности иммобилизованного пепсина.

4.3.1. рН- и термостабильность.

4.3.2. Стабильность фермента при хранении.

4.3.3. Операционная стабильность.

Глава 5. Разработка технологии получения Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина с помощью гетерогенного катализа.

5.1. Выбор основных параметров ферментативного гидролиза АИГ.

5.1.1. Выбор температурного режима ферментативного гидролиза АИГ.

5.1.2. Выбор рН реакционной среды.

5.1.3. Исследование количества добавляемого иммобилизованного фермента на степень гидролиза АИГ.

5.1.4. Выбор временного интервала этапа ферментативного гидролиза.

5.2. Хроматографическое фракционирование Р(аЬ')2-фрагментов АИГ.

5.3. Концентрирование препарата Р(аЬ')2-фрагментов АИГ.

5.4. Контроль физико-химических показателей препарата Р(аЬ '^-фрагментов

Глава 6. Исследование иммунологических свойств Р(аЬ')2-фрагментов гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

6.1. Исследование протективных свойств Р(аЬ')2-фрагментов АИГ.

6.2. Определение токсигенных свойств препарата Р(аЬ')2-фрагментов АИГ.

6.3. Исследование реактогенных свойств препарата Р(аЬ')2-фрагментов АИГ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab`)2-фрагментов"

Бешенство, являясь летальной, острой зоонозной природно-очаговой инфекцией, представляет большую опасность и, по оценке ВОЗ, по наносимому экономическому ущербу среди инфекционных болезней занимает пятое место. Заболеваемость бешенством регистрируется на территории большинства стран мира, где ежегодно свыше 10 миллионов человек получают различные повреждения от животных и более 4 миллионов человек — специфическую антирабическую помощь. Бешенство до сих пор остается практически неизлечимым заболеванием, от него ежегодно погибает до 50 тысяч человек. В мире на современном этапе происходит глобальный рост рабической инфекции [190]. То же самое отмечается и в Российской Федерации, где социально-экономическое значение проблемы бешенства в последние годы неуклонно растет, в том числе вследствие формирования новых очагов инфекции. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Почти во всех регионах страны периодически отмечается активизация природных очагов бешенства, растет число случаев заболевания среди диких плотоядных животных, вовлекаются в эпизоотический процесс домашние и сельскохозяйственные животные [83].

По всем видам животных в 2005 году было зарегистрировано 4 270 неблагополучных пунктов против 2 792 в 2004 г. При этом число заболевших бешенством диких животных по сравнению с 2000 годом увеличилось в 4,3 раза. В Приволжском федеральном округе в 2005 году показатель заболеваемости бешенством диких животных, по сравнению с 2000 годом, возрос в 6,7 раза, в основном за счет Республик Башкортостан и Татарстан, Пензенской, Самарской и Саратовской областей.

В период с 2000 по 2005 годы число ежегодных обращений за антирабической помощью стабилизировалось на уровне 450 тысяч, на детей в возрасте до 14 лет приходится около 30% обращений. Среди лиц, обращающихся за антирабической помощью по поводу укусов различными животными, городских жителей в 3,5 раза больше чем сельских жителей. В период с 2000 по 2006 годы в 35 субъектах Российской Федерации было зарегистрировано 99 случаев смерти людей от гидрофобии [57, 83].

Из-за чрезвычайной опасности и абсолютной летальности от этой инфекции у людей вопросы профилактики бешенства после повреждения, нанесенного больным или подозрительным на бешенство животным, имеют исключительно важное значение. Существующая во всем мире единая тактика профилактики заболевания после контакта с возбудителем инфекции обеспечивается путем немедленной местной обработки раны с последующим специфическим лечением антирабической вакциной, а в случаях тяжёлых множественных укусов опасной локализации и антирабическим иммуноглобулином.

В качестве профилактических препаратов используют вакцины КоКАВ, КАВ и антирабический иммуноглобулин, полученный из лошадиной или человеческой сыворотки. При введении препарата гетеро логичного антирабического иммуноглобулина могут иметь место побочные реакции, основными из которых являются активация системы комплемента с образованием анафилотоксинов, системы свертывания крови, гиперчувствительность к чужеродным сывороточным белкам. Согласно данным ВОЗ, у 1-2% пациентов при введении гетерологичного иммуноглобулина могут возникнуть побочные реакции [190]. При использовании гомологичного иммуноглобулина таких осложнений не возникает, но его себестоимость в несколько раз превышает таковую гетерологичного иммуноглобулина. Перспективным направлением является создание препаратов с менее выраженными реактогенными свойствами, но в то же время с доступной ценой.

Настоящее исследование посвящено разработке нового препарата с улучшенными свойствами на основе антирабического иммуноглобулина.

При воздействии пепсина на молекулу иммуноглобулина имеет место расщепление этой молекулы на Р(аЬ')2- и Бс-фрагменты. Препарат, состоящий из Р(аЬ')2-фрагментов должен отличаться менее выраженными реактогенными свойствами, поскольку в нём отсутствует Бс-часть молекулы иммуноглобулина, которая ответственна за развитие побочных реакций [169].

Для проведения ферментативного гидролиза иммуноглобулина предлагается применить иммобилизованный пепсин. Преимущество использования иммобилизованных ферментов заключается в возможности их многократного использования и быстрого механического удаления из реакционной среды, что позволяет получить продукт, в котором отсутствуют примеси фермента. На сегодняшний день существует небольшое число публикаций по получению Р(аЬ'^-фрагментов иммуноглобулинов с помощью иммобилизованных ферментов, а данные по гетерокаталитическому расщеплению гетерологичного АИГ отсутствуют.

Цель работы состояла в разработке оптимальной схемы получения препарата Р(аЬ')2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина с применением иммобилизованного пепсина. Задачи исследования: 1. Выбрать оптимальный способ получения препарата иммобилизованного пепсина, стабильного в условиях ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.

2. Охарактеризовать биохимические свойства иммобилизованного пепсина.

3. Разработать экспериментальную схему эффективного ферментативного гидролиза иммуноглобулина с помощью иммобилизованного пепсина.

4. Подобрать оптимальные условия для хроматографического фракционирования и концентрирования препарата Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина.

5. Охарактеризовать препарат Р(аЬ')2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина по соответствию физико-химических свойств нормативным документам, предъявляемым к антирабическому иммуноглобулину.

6. Исследовать протективные и реактогенные свойства препарата антирабического иммуноглобулина на основе Р(аЬ')2-фрагментов в сравнении с коммерческим препаратом нерасщепленного гетерологичного антирабического иммуноглобулина на лабораторных животных.

Научная новизна

Получен антирабический препарат на основе Р(аЬ'^-фрагментов, для осуществления этапа ферментативного гидролиза предложено использование иммобилизованного пепсина. Сконструированы стабильные биокатализаторы, пригодные для осуществления ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Показано, что реактогенные свойства препарата Р(аЬ')2-фрагментов менее выражены, чем у нерасщепленного иммуноглобулина, при этом специфическая активность препаратов практически одинакова.

Практическая значимость работы

Разработана биотехнологическая схема получения препарата Р(аЬ')2 фрагментов антирабического иммуноглобулина, предназначенного для постэкспозиционной профилактики гидрофобии у людей. Схема включает следующие этапы: иммобилизацию пепсина, ферментативный гидролиз антирабического иммуноглобулина, хроматографическое отделение Р(аЬ')2-фрагментов от остатков Бс-части молекулы иммуноглобулина и нерасщепленного иммуноглобулина, концентрирование и стерилизующую фильтрацию. Показано, что для осуществления ферментативного гидролиза иммуноглобулина наиболее эффективно использовать пепсин, иммобилизованный на нерастворимых матрицах. В качестве матриц могут выступать АН-агароза, Бо\уех АО 1X8, природный силикат. Для очистки препарата подобраны условия хроматографического фракционирования на геле БР-БерЬагозе-ХЬ. Р(аЬ')2-фрагменты элюировали вторым пиком без I примесей низкомолекулярных пептидов и нерасщепленных молекул иммуноглобулина. Элюцию проводили 0,02 М ацетатным буфером (рН 5,5) на колонке размером 5,0 х 30 см со скоростью 4 мл/мин. Для концентрирования препарата подобраны условия лиофильного высушивания. Высушивание проводили в течение 48 часов, начальная температура материала составляла минус 40 °С, давление в камере — 2-3 Па, температура испарителя — минус 90 + 2°С. Полученный препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов нетоксичен, его специфическая активность не уступает таковой нерасщепленного иммуноглобулина, при этом реактогенные свойства менее выражены.

По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Получение Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях». Методические рекомендации одобрены Учёным советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 2 от 17 апреля 2007 г.) и утверждены директором института 15.05.2007.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ иммобилизации пепсина на природном силикате с помощью растворимого карбодиимида является оптимальным для получения биокатализатора, предназначенного для ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.

2. Разработанная схема с использованием ферментолиза гетерологичного антирабического иммуноглобулина при 37°С и рН 4,5+0,5 в течение 24 часов и хроматографического фракционирования на геле БР-ЗерЬагоБе-ХЬ позволяет получать антирабический препарат, представляющий собой монофракцию Р(аЬ')2-фрагментов антител.

3. Препарат Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина соответствует нормативным физико-химическим параметрам, предъявляемым к коммерческому препарату гетерологичного антирабического иммуноглобулина: содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретической однородности.

4. Уровень вируснейтрализующей активности экспериментальных образцов препарата Р(аЬ'^-фрагментов равен таковому коммерческого препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

5. Препарат на основе Р(аЬ'^-фрагментов антирабического иммуноглобулина не обладает анафилактогенными свойствами.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2007 - 2008); Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» (Москва, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Материалы» (Волгоград, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи, одна в издании, рекомендованном «Перечнем ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 192 источников, из них зарубежных — 100. Объём диссертации составляет 144 страниц машинописного текста, включает 28 рисунков и 5 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Генералов, Сергей Вячеславович

Выводы

1. Сконструированы стабильные препараты иммобилизованного пепсина, пригодные для осуществления ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Для иммобилизации пепсина наиболее подходящим является ковалентное присоединение к природному силикату с помощью карбодиимида.

3. Разработаны оптимальные условия хроматографического отделения Р(аЬ')2-фрагментов от компонентов реакционной смеси на колонке с гелем 8Р-8ер1тгозе-ХЬ и последующего концентрирования методом лиофильного высушивания.

4. Препарат Р(аЬ,)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина соответствует нормативным физико-химическим параметрам, предъявляемым к препарату коммерческого гетерологичного антирабического иммуноглобулина: содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретической однородности, не содержит примесей Рс-фрагментов или остатков нерасщепленного иммуноглобулина.

5. При сравнении вируснейтрализующей активности препаратов на основе Р(аЬ'^-фрагментов антирабического иммуноглобулина и нерасщепленного антирабического иммуноглобулина в реакции нейтрализации и дот-иммуноанализе показано, что вируснейтрализующая активность исследуемых препаратов находится на равном уровне.

6. В сравнительном изучении реактогенных свойств в реакции активной анафилаксии показано, что препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина является более безопасным, чем исходный препарат нерасщепленного гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Заключение

Своевременная постэкспозиционная профилактика бешенства после заражения имеет большое значение в виду абсолютной смертности, сопутствующей клиническим случаям данной болезни.

По мнению Комитета экспертов ВОЗ, оптимальным методом системной антирабической постэкспозиционной профилактики бешенства является комбинированное введение антирабической вакцины и антирабического иммуноглобулина [190]. Для пассивной иммунизации людей применяют гетерологичный или гомологичный иммуноглобулин. Отрицательной стороной всех гетерологичных препаратов антирабического иммуноглобулина является опасность развития аллергических осложнений. Препараты, приготовленные из крови иммунизированных людей, с нашей точки зрения, являются более безопасными, однако их стоимость значительно выше стоимости гетерологичных препаратов. В связи с этим актуальным является разработка подходов, направленных на уменьшение реактогенных свойств антирабического иммуноглобулина, получаемого из сыворотки крови лошадей или других животных.

Данная работа посвящена исследованиям, направленным на конструирование препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, получаемого из сыворотки крови лошадей риванол-спиртовым методом. Основными этапами получения препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина являются иммобилизация пепсина, ферментативный гидролиз антирабического иммуноглобулина, хроматографическое отделение Р(аЬ')2-фрагментов от остатков Рс-части молекулы иммуноглобулина и нерасщепленного иммуноглобулина, концентрирование и стерилизующая фильтрация.

Применение иммобилизованного пепсина на этапе ферментативного гидролиза иммуноглобулина является ключевой особенностью данной технологической схемы получения Б(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина. Использование иммобилизованных ферментов оправдано их высокой стабильностью, возможностью многократного применения, возможностью предотвратить контаминацию целевого продукта ферментом и остановить реакцию в нужный момент.

Первый этап наших исследований заключался в получении иммобилизованного пепсина и в изучении его биохимических свойств. Иммобилизованный фермент должен быть достаточно активным, стабильным в условиях этапа ферментативного гидролиза, а также при хранении. Не менее важным является возможность повторного использования иммобилизованного фермента. На данном этапе исследований было изучено десять вариантов иммобилизации пепсина на носителях различного происхождения. Для присоединения ферментов к носителям были использованы методы адсорбционной и ковалентной иммобилизации (в том числе сополимеризация). При проведении экспериментов, связанных с выбором носителя, метода иммобилизации и изучения свойств биокатализаторов установлено, что для решения данной задачи наиболее подходят иммобилизованные ферменты, полученные ковалентным присоединением пепсина к аминогексилагарозе с помощью глутарового альдегида, а также ковалентным присоединением к полистирольному носителю Бо\уех АО 1X8 и природному силикату с помощью карбодиимида. Следует отметить, что высокая стоимость носителей иммобилизованных ферментов ограничивает их применение.

Поэтому для проведения ферментативного гидролиза иммуноглобулина рекомендуется использовать пепсин, иммобилизованный на природном силикате с помощью карбодиимида. Данный биокатализатор достаточно активен (4,0 ед/г), стабилен, а стоимость носителя, необходимого для его получения, минимальна.

В последующих экспериментах были выбраны условия получения, очистки и концентрации Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина.

Для осуществления этапа ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина выбрана модель реактора периодического действия ёмкостного типа с мешалкой. В качестве исходного сырья для получения Р(аЬ' )2-фрагментов использовалась фракция иммуноглобулинов, поскольку при этом многократно снижается количество балластного белка, подвергаемого протеолизу. Наиболее эффективно проведение ферментативного гидролиза в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,0-5,0) в течение 24 ч при температуре 37°С. Оптимальная концентрация иммуноглобулина в реакционной смеси должна составлять 20-30 мг/мл. Было установлено, что для ферментативного гидролиза иммобилизованным пепсином одного грамма иммуноглобулина оптимальным соотношением является такое количество фермента, которое бы обеспечивало 200 единиц протеолитической активности, измеренной по методу Н.П. Пятницкого. Схемы ферментативного гидролиза могут отличаться типом используемого иммобилизованного фермента, поскольку, как было установлено, глубина расщепления молекул иммуноглобулина практически не зависит от данного фактора. На окончательный выбор иммобилизованного фермента влияют такие параметры, как его биохимические свойства, стоимость носителя, удобство работы.

Для отделения Р(аЬ')2-фрагментов из реакционной смеси были подобраны условия хроматографического фракционирования продуктов ферментативного гидролиза. Было показано, что для этой цели следует применять гель БР-ЗерЬагозе-ХЬ. При хроматографии на колонке размером 5,0 х 30 см и скорости элюции 4 мл/мин Б(аЬ ^-фрагменты элюировали вторым пиком без примесей низкомолекулярных пептидов и нерасщепленных молекул иммуноглобулина. Элюцию проводили 0,02 М ацетатным буфером, рН 5,5. *

Для концентрирования Б(аЬ ^-фрагментов был предложен метод лиофильного высушивания. Данный метод позволяет в конечном итоге получить препарат с высокой концентрацией белка с минимальным риском снижения протективной активности. Учитывая большой объём удаляемого растворителя и низкую концентрацию белка, лиофилизацию проводили в течение 48 часов. Предварительно осуществляли замораживание материала до температуры минус 40°С. Процесс лиофильного высушивания характеризовался максимально щадящими условиями. Продолжительность процесса сублимационной сушки до температуры препарата минус 34°С составляла 8 часов, давление в камере — 2-3 Па, температура испарителя — минус 90 + 2°С. Повышение температуры препарата от минус 34 до минус 10°С происходило в течение двух часов. Этап удаления связанной влаги занимал 27 часов. При завершении процесса заданные параметры не менялись в течение пяти часов и соответственно равнялись следующим показателям: температура сублиматора - минус 91°С, температура нагревателей — 15°С, температура материала — 21 °С.

После растворения в необходимом объёме физиологического раствора, препарат F(ab'^-фрагментов антирабического иммуноглобулина представлял прозрачную жидкость слабо жёлтого цвета. Концентрация белка составляла 8,0%, рН — 6,7; цветность — 0,11; прозрачность — 0,03. Препарат был электрофоретически однороден, не содержал примесей Fc-фрагментов или остатков нерасщепленного иммуноглобулина. Таким образом, по физико-химическим параметрам препарат Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, полученный по данной схеме, удовлетворяет требованиям, предъявляемым к препарату антирабического гетерологичного иммуноглобулина.

Заключительным этапом исследований явилось изучение протективных и реактогенных свойств Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина.

При изучении протективных свойств препарата на основе F(ab')2-фрагментов in vivo установлено, что данный препарат обладает достаточной вируснейтрализующей активностью. Средняя величина логарифма титра нейтрализующих антител составила 3,73 + 0,52 для Р(аЬ')2-фрагментов и 3,9 + 0,23 для ОСО антирабического иммуноглобулина. Полученные данные указывают на несущественность различий в нейтрализующей способности сравниваемых препаратов. Исследование специфической активности in vitro, методом дот-иммуноанализа, также показало, что титр антител препарата F(ab')2-фрагментов и антирабического иммуноглобулина примерно одинаков и составляет 1:3200 - 1:6400.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о безопасности исследуемых препаратов. При сравнении реактогенных свойств установлено, что препарат на основе Р(аЬ')2-фрагментов обладает меньшей реактогенностью, чем исходный иммуноглобулин. При проведении тестов активной анафилаксии реакция животных на введение Р(аЬ')2-фрагментов отсутствовала, в то время как при введении аналогичных доз иммуноглобулина имели место случаи гибели животных.

Таким образом, в результате нашей работы разработана оптимальная биотехнологическая схема получения препарата на основе Р(аЬ')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, обладающего достаточной протективной активностью и менее выраженными реактогенными свойствами по сравнению с препаратом нерасщепленного иммуноглобулина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Генералов, Сергей Вячеславович, Саратов

1. Аверченков В.М., Палагин И.С. Внутривенные иммуноглобулины: механизмы действия и возможности клинического применения // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. -Т.6, №3. — С. 273 -281.

2. Алгазинова М.К., Роговский В.Я., Орлова Д.Д. Значение противомозговых антител в реактогенности антирабического гамма-глобулина // Научные основы вакцинно-сывороточного дела: Материалы республиканской конференции. Киев, 1968. - С. 25 - 26.

3. Алсынбаев М.М., Исрафилов А.Г., Еникеева С.А., Бакиева И.Г., Трофимов В.А., Воронин С.С., Хафизова Р.Н., Гайтанова Е.И. Препарат внутривенного противоаллергического иммуноглобулина и способ его получения. Патент № 2238106 РФ, МКИ А61К39/395; 20.10.2004.

4. Амштутц X., Лерх П.Г., Моргенталер Ж. Способ получения иммуноглобулинов из фракций, которые образуются при фракционировании человеческой плазмы крови. Патент 96118916 РФ, МКИ А61К39/40; 20.02.1999.

5. Анастасиев В.В., Короткова Т.В., Змачинская Т.Б., Крайнова Т.А., Зубкова Н.В., Пискарёва Ю.К. Способ получения иммуноглобулинового препарата. Патент № 2000123226 РФ, МКИ А61К39/395; 10.08.2003.

6. Антонов С.Ф., Сигаев Г.И., Никонов Б.А., Кобатов А.И. Особенности сублимационной сушки лекарственных и диагностических препаратов в ампулах // Биотехнология. 1998. - № 5. - С. 48-69.

7. Антонин P.K. Иммуноглобулин человеческий для внутривенного введения, мономерный, вирусинактивированный // Производственная трансфузиология на рубеже XXI века. 1999. - С. 39.

8. Аффинная хроматография: Методы./Под ред. Дина П., Джонсона У., Мидла Ф. -М.: Мир, 1988. 288 с.

9. П.Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. -JL: Медгиз, 1962. 180 с.

10. Барбан П.С., Пантюхина А.Н. Fab-фрагменты антител как основа малореактогенных иммуноглобулиновых препаратов антимикробного спектра действия // Материалы Всесоюзного симпозиума, посвященного 60-летию Тбилисского НИИВС. 1984. - С. 491 - 495.

11. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. 4.1. - М.: Мир, 1989. —692 с.

12. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов A.B., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. М.:Высш. шк., 1987. -159 с.

13. Блохина И.Н., Киселёва И.А., Анастасиев В.В., Савкина М.А. Удаление биологически активных примесей из препаратов иммуноглобулинов // ЖМЭИ. 1985. - №2. - С.65 - 68.

14. Боровикова В.П., Тарасова H.H., Лавренова Г.Н., Степанов В.М. DNP-гексаметилендиамин-сефароза 4В как сорбент для хроматографии карбоксильных протеаз // Химия природных соединений. 1979. - №2. -С. 191-199.

15. Ванаг В.К., Бахарев В.Н., Еремеев Н.Л., Лившиц Б.А., Грицкова И.А., Казанская Н.Ф., Зубов В.П., Алфимов М.В. Иммобилизация ферментов на монодисперсных латексах // Биотехнология. 1989. - Т.5, №6. - С. 729 -734.

16. Ведерникова Н. В. Антитоксический противодифтерийный препарат «Антидиф»: технология получения, иммунобиологическая характеристика: автореф. дис. . канд. мед. Пермь, 2000. - 19 с.

17. Вирник А.Д., Кильдеева Н.Р., Красовская С.Б., Водолазская Л.В., Соломон З.Г., Бибер Б.Л. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и плёнок в процессе их формования // Биотехнология. 1988. - Т. 4, № 1. -С. 91-95.

18. Вирник А.Д., Седов A.A., Красовская С.Б., Кильдеева Н.Р., Ныс П.С., Булычева М.С. Способ получения гетерогенных биокатализаторов. Патент № 845475 РФ; МКИ C12N11/02; 10.05.1996.

19. Воробьёва О.В., Кунижев С.М., Анисенко О.В., Филь A.A., Бородина Т.Н. Способ получения иммобилизованной уреазы. Патент № 2294369; МКИ C12N11/14; 27.02.2007.

20. Горленко Л.Е., Емельянова Г.И. Зверев М.П., Лунин В.В. Способ получения иммобилизованных ферментов. Патент № 2054481 РФ. МКИ C12N11/08; 20.02.1996.

21. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: Санитарные правила СП 3.3.2.561- 96. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. - 127 с.

22. Грачёва И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Агропромиздат, 1987.-335 с.

23. Давыдкин В.Ю., Гаврин А.Г., Алешкин В.А. Отработка процесса сублимационного высушивания комплексного иммуноглобулинового препарата//Проблемы инфекционных болезней. М., 2000. - Ч. 2. - С. 6166.

24. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. -Ставрополь, 1996. 131 с.

25. Змачинская Т.Е., Анастасиев В.В. Оптимизация технологической схемы получения препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного введения//Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского -2001. -№ 1. -С.70-73.

26. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы/ Под ред. Дж.Вудворда. -М.: Мир, 1988. -215 с.

27. Иммунологические препараты и перспективы их применения в инфектологии/ Под ред. Онищенко Г .Г., Алёшкина В.А., Афанасьева С.С., Поспеловой В.В. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

28. Исрафилов А. F., Алсынбаев M. М., Трофимов В. А., Лаптева Л. К. Иммуноглобулин человека нормальный. Препараты для внутримышечного и подкожного введения Уфа : РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, 2008. - 130 с.

29. Исрафилов А.Г., Лютов А.Г., Корнилова И.А., Мостовская Е.В. Предварительная подготовка полуфабрикатов для получения внутривенного иммуноглобулина // Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии. Уфа, 1998. - С. 174 -181.

30. Карпов С.П., Прегер С.М., Синельников Г.Е., Фёдоров Ю.В. Гипериммунные сыворотки. Томск, 1976. - 378 с.

31. Киселева И.А., Анастасиев В.В., Чадаев В.А. Особенности получения иммуноглобулина для внутривенного введения // Иммуноглобулины и другие препараты крови. Л., 1976. - С. 47 - 54.

32. Коваленко Г.А., Комова О.В. Симаков A.B., Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов I. Адсорбция глюкоамилазы // Биотехнология. 2002. - № 3. - С.55 - 66.

33. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. М.: Высш. шк., 1985. - 287 с.

34. Кускова З.Р. Модификация метода очистки Fab-фрагмента кроличьего иммуноглобулина G // Вирусные и бактерийные препараты. Т. 33. -Томск, 1984.-С.106- 109.

35. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1983. - С. 175 - 176.

36. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш.шк., 1990. - 352 с.

37. Лимарева Т.Д., Ратнер Г.М., Кондратьева М.Л. Выделение Fab-фрагментов иммуноглобулина G человека и получение антисывороток к ним // Вирусные и бактерийные препараты. Т. 33. - Томск, 1984. - С.100 -105.

38. Лурье A.A. Сорбенты и хроматографические носители (справочник). -М.: Химия, 1972.-320 с.

39. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. - 128 с.

40. Методы лабораторных исследований по бешенству. Третье издание./ Под ред. Каплан М.М., Копровски Н. Пер. с англ. Женева: ВОЗ, 1975. - 360 с.

41. Мигунов В.Н., Позина И.М., Кутимова Л.Р., Миниович Ф.Л., Лобань С.А., Ляхова Т.Д., Котова Т.С. Способ получения иммуноглобулина. A.c. 1109170, А61К39/395; 23. 08. 1984.

42. Минстер А.Б., Перельман Е.В., Булк В.Ф., Сусова О.В. Выбор метода получения Р(аЬ')2-фрагментов IgG человека для определения антител к стафилококковому протеину А // ЖМЭИ. 1991. - №11. - С.45 - 47.

43. Мосолов В.М. Протеолитические ферменты. М: Наука,1971. - 404 с.

44. Незлин P.C. Биохимия антител. М.: Наука, 1966 - 307 с.

45. Немов В.В. Сравнительное изучение сенсибилизирующей активности гетерологичных сывороточных препаратов // ЖМЭИ. 1985. - № 7. - С. 63 -67.

46. Николаева А.М., Ведерникова Н.В., Ефимова Н.П. Препарат для профилактики и лечения дифтерии и способ его получения. Патент № 2174408 РФ, МКИА61К39/395, А61К35/16; 10.10.2001.

47. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2006 году: Государственный доклад. -М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. 360 с.

48. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. -288 с.

49. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М: Наука, 1985.-536 с.

50. Платэ H.A., Чупов В.В., Валуев JI.H. Способ иммобилизации сериновых протеаз. Патент № 888544 РФ. МКИ: C12N11/08; 01.10.1998.

51. Райхер Л.И., Райхер И.И., Фарцейгер Н.Л., Зотова Е.В., Жуковский Ю.Г., Онорин A.C., Лехтцинд Е.В. Способ получения иммобилизованного коммерческого пепсина. A.c. № 1730148 СССР, МКИ C12N11/14; 30.04.1992.

52. Рахимова Ф.И., Бердникова О.Г., Шахматова Е.М., Кущева Л.Е. Разработка малореактогенного антирабического лошадиного иммуноглобулина // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. 4.2. - Уфа, 1995. - С. 155- 157.

53. Руководство по вакцинному и сывороточному делу /под ред. Бургасова П.Н. -М.: Медицина, 1978. 440 с.

54. Руководство по иммунологии / под ред. Вязова O.E., Ходжаева Ш.Х. -М.: Медицина, 1973.-387 с.

55. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/ Под ред. Хабриева Р.У. М.: Медицина, 2005.-832 с.

56. Сапожникова B.C., Думкин И.М. Способ очистки противостолбнячного препарата иммуноглобулина человека. Патент № 1628293 РФ, МКИ А61К39/08, 28.02.1994.

57. Селеменев В.Ф., Стоянова О.Ф., Шкутина И.В., Смирнов В.Б Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы. Патент №2204600 РФ, МКИ C12N11/08; 20. 05.2003.

58. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 358 с.

59. Степанов В.М., Тельнова М.А., Котова Т.С., Тельбух В.П. Действие растворимых и иммобилизованных карбоксильных протеаз на сывороточные белки// Химия природных соединений. 1978. - № 6. - С. 770-776.

60. Степанова Л.А. Очистка и концентрация антирабической сыворотки по различным технологическим схемам // Вирусные и бактерийные препараты. Т. 29. - Томск, 1980. - С.312 - 317.

61. Степанова Л.А., Менявцева Т.А. Изучение анафилактогенных свойств ферментированного антирабического иммуноглобулина методами ин виво и ин витро // Вирусные и бактерийные препараты. Т.31. - Томск, 1983. -С. 85 -89.

62. Степанова Л.А., Музафарова Н.Х. Сравнительная оценка некоторых свойств антирабического иммуноглобулина и сыворотки, очищенной методом ферментолиза // Вирусные и бактерийные препараты. Т.30. -Томск, 1981.-С. 93 -99.

63. Тельнова М.А., Степанов В.М. Иммобилизация протеиназ на аминосилохроме// Химия природных соединений. 1978. - №3. - С. 770 -776.

64. Титова Е.В., Голубева В.Л., Бодина З.К., Белова В.В., Новикова Л.И., Серова Л.Д. Технологические особенности получения внутривенных иммуноглобулиновых препаратов из иммунной плазмы крови коз // Вестник службы крови России. 2006. - № 3. - С. 32 - 34.

65. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. -М: Мир, 1983. 213 с.

66. Туркова Я. Аффинная хроматография. М.: Мир, 1980. - 472 с.

67. Уонг Д., Кооней Ч., Демайн А., Даниил П., Хампфрей А., Лилли М. Ферментация и технология ферментов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. - 336 с.

68. Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - С. 413423.

69. Фром A.A., Скобелев Л.И., Русанов В.М., Никитенко A.A. Белки плазмы и их фракционирование в производстве препаратов крови. — М.: Медицина, 1974.-252 с.

70. Холчев Н.В. Современные препараты иммуноглобулинов для медицинского применения //Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека. Т. 18. - 1976. - С. 5 - 14.

71. Хромецкая Т.М., Тихонова Н.Т., Потемкина Е.Е., Волевач Е.В. О побочном действии препаратов у-глобулина // Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека. Т.18. - 1976. - С. 142-147.

72. Чоупек Й., Гемейнер П., Йирку В., Калал Й., Кубанек В., Куниак Л., Пешка Й., Рексова Л., Штамберг Й., Швец Ф., Туркова Я., Веруович В., Земек Й. Носители для иммобилизации ферментов и клеток, созданные в

73. Чехословакии // Химическая энзимология / под. ред. Березина И.В., Мартинека К. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983. - С. 260 - 275.

74. Шарыгин СЛ., Сапожникова B.C., Мальцева О.В., Старостина Е.Е., Анастасиев В.В. Способ получения иммуноглобулина человека антистафилококкового для внутривенного введения. Патент № 2141341 РФ, МКИ А61К39/395,39/085; 20.11.1999.

75. Шемеровская Т.Г., Софронов Б.Н. Снижение антикомплементарности и придание толерогенных свойств человеческому глобулину путем обработки мочевиной // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1986. - Т.102, №11.- 1986. - С. 625 - 627.

76. Шнепф Ф. Использование препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения в неонатологии и акушерстве // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2002. - №1. - С. 12 - 22.

77. Якин О.Г. Антитоксические сыворотки: достижения и. проблемы // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение. — Уфа, 2005. — С. 88 93.

78. Янкевич М.И., Шмелёва В.Г., Яковлев В.И., Пономарёва Л.В. Иммобилизация трипсина на силикагеле // Прикладная биохимия и микробиология. 1981. - Т. 17, № 4. - С. 500 - 504.

79. Altun G.D., Cetinus S.A. Immobilization of pepsin on chitosan beads// Food Chemistry. 2007. -Vol. 100. - P. 964-971.

80. Amemiya H, Yokoyama T, Torisu M. The reduction of antigenicity of heterologous antilymphocyte serum with acid Taka-protease // Clin. Exp. Immunol. -1972. Vol. 11. - P. 67-81.

81. Anita A., Sastry C., Hashim M. Immobilization of urease using Amberlite MB-1//Bioprocess Engineering. 1997. - Vol. 17. - P. 355-359.

82. Beddows C. G., Mirauer R. A., Guthrie J. T. The use of graft copolymers as enzyme supports I. The immobilization of p-galactosidase and papain onto nylon-polyacrylamide graft copolymers// Polymer Bulletin. 1979. - Vol. 1. -1979. - P. 749-753.

83. Beeson J., Wissler R. The use of agarose-bound pepsin for the preparation of F(ab')2 fragments of IgG // Immunochemistry. 1977. - Vol. 14 - P. 305 -312.

84. Betancor L., Lopez-Gallego F., Alonso-Morales N., Dellamora G., Mateo C., Fernandez-Lafiiente R., Guisan J. Glutaraldehyde in protein immobilization //Immobilization of enzymes and cells/edited by Guisan J.M. -Humana Press, 2006,- P.57 64.

85. Bouvet J., Stahl D., Rose S., Quan C., Kazatchkine M., Kaveri S. Induction of natural autoantibody activity following treatment of human immunoglobulin with dissociating agents// Journal of Autoimmunity. 2001. - Vol. 16. -P. 163172

86. Brena B., Batista-Viera M. Immobilization of enzymes//Immobilization of enzymes and cells/edited by Guisan J.M. -Plumana Press, 2006. P. 15 - 30.

87. Chellapandian M., Sastry C.A Immobilization of microbial protease on vermiculite // Bioprocess Engineering. 1992. - Vol. 8. - P. 33 - 38.

88. Chen F.M., Liu C.Z., Gaffar S.A., Epstein A.L. Chromatographic methods for large-scale preparation of immunoglobulin G2a monoclonal antibodies Lym-1 and TNT-1 F(ab')2 fragments // J. Chromatogr. -1991. Vol. 563 - P. 243-255.

89. Chen J.P., Chiu S.H. Preparation and characterization of urease immobilized onto porous chitosan beads for urea hydrolysis // Bioprocess Engineering. -1999.-Vol.21.-P. 323-330.

90. Chen L., Tsao G. Chemical procedures for enzyme immobilization on porous cellulose beads // Biotecnology and bioengineering. 1977. - Vol.19. - P. 1463-1473.

91. Cheryan M., Wyk P., Richardson T., Olson N. Stability characteristics of pepsin immobilized on protein-coated glass used for continuous milk coagulation // Biotechnology and bioengineering. 1976. - Vol. 18. - P. 273 -279.

92. Coulet P. R., Julliard J. H., Gautheron D. C. A mild method of general use for covalent coupling of enzymes to chemically activated collagen films // Biotehnology and bioengineering. 1974. - Vol. 16. - p. 1055 - 1068.

93. Crambliss A.L., Stonehuerner J., Henkens R.W., O'Daly J.P., Zhao J. The use of inorganic materials to control or maintain enzyme activity// New J. Chem. 1994. - Vol.18. - P.327 - 339.

94. Cuatrecasas P. Protein Purification by Affinity Chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrlamide beads //The Journal of biological chemistry. 1970. - Vol.245. - P. 3059 - 3065.

95. Esawy M. A., Combet-Blanc Y. Immobilization of Bacillus licheniformis 5A1 milk-clotting enzyme and characterization of its enzyme properties //World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2006. - Vol.22. - P. 197-200.

96. Esquisabel A., Hernández R.M., Gascon A., Pedraz J. Immobilized enzymes for biomedical applications //Immobilization of enzymes and cells/edited by Guisan J.M. Humana Press, 2006. - P. 283 - 293.

97. Favreau B., Giurgiu D., Bizzini B. A new method for the large scale preparation of antitoxic antibodies exhibiting high specific protective activities // Experienta. 1983. - Vol. 39. - P. 483 - 487.

98. Fernandes I., Takehara H.A., Mota I. Isolation of horse IgG with protein A // Braz. J. Med. Biol. Res. 1991. - Vol. 24. - P. 1129 -1131.

99. Findlay C.J., Parkin K.L., Yada R.Y. Bone as a solid support for immobilization of enzymes // Biotechnology Letters. 1986. - Vol. 8. - P. 649 -652.

100. Gazzei G., Gianozzi A., Valery A. Method for preparation of immunoglobulins suitable for intravenous administration. Patent № 0221505 EP. Int. CI. A61K 39/395; 13.05.1987.

101. George S., Chellapandian M., Sivasankar B., Sundaram P.V. Flow rate dependent kinetics of urease immobilized onto diverse matrices // Bioprocess Engineering. 1996. - Vol. 15. - P. 311-315.

102. Glenn S., Smariga P., O'Connel E. Method of producing F(ab')2 fragments of immunoglobulins. Patent № 9213876 WO; Intel. C07K3/10; 29.01.1992

103. Goldstein L., Freeman A., Sokolovsky M. Chemically modified nylons as supports for enzyme immobilization. Polyisonitrile-nylon // Biochemical Journal. 1974. - Vol.143. - P. 497 - 509.

104. Gonzalez G., Alea J. Pepsin Immobilized by covalent binding to a chitosan derivative// J. Chem. Tech. Biotechnol. 1995. - Vol. 63. - P. 247-248.

105. Guidolin R., Morais J., Stephano M. Effect of 3-Propiolactone treatment on the complement activation mediated by equine antisera // Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo. 1997. - Vol.39.-P. 119-122.

106. Flailing PJ., Dunnill P. Hydrolysis of lactose in milk by lactase immobilized to a non-porous magnetic support // European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. -1979.-Vol. 8.-P. 27-36.

107. Hanlon C.A., Niezgoda M., Morril P.A., Rupprecht C.E. The incurable wound revisted: progress in human rabies prevention? // Vaccine. 2001. - Vol. 19. -P. 2273 - 2279.

108. Hirano S., Miura O. Alkaline phosphatase and pepsin immobilized in gels // Biotechnology bioengineering. 1979. - Vol.21. - P.711 - 714.

109. Hofstee B.H.J. Immobilization of enzymes through non-covalent binding to substituted agaroses // Biochemical and biophysical research communications. 1973.-Vol. 53.-P. 1137- 1144.

110. Hong H., Rooijakkers E., Ke N., Groen J., Osterhaus A. Methods for the purification of equine rabies immunoglobulin: effects on yield and biological activity // Biological. 1994. - Vol.22. - P. 1 - 6.

111. Hu J., Li S. Liu B. Properties of immobilized pepsin on Modified PMMA Microspheres // Biotechnology Journal. 2006. - Vol. 1. - P. 75-79.

112. Huckel M., Wirth H. J., Hearn M. Porous zirconia: a new material for enzyme immobilization// J. Biochem. Biophys. Methods. 1996. - Vol. 31. - P. 165 — 179.

113. Jang S., Kim D., Choi J., Row K. Trypsin immobilization on mesoporous silica with or without thiol functionalization// Whaseung Aim. J. Porous. Mater. -2006,- Vol.13. -P. 385-391.

114. Josic D., Lim Y. Analytical and preparative methods for purification of antibodies // Food technol. biotechnol. 2001. - Vol. 39. - P. 215 - 226.

115. Kartal F, Kilinc A. Immobilization of pancreatic lipase on polyvinyl alcohol by cyanuric chloride // Prep. Biochem. Biotechnol. 2006. - Vol.36. - P. 139 -151.

116. Kay G. Crook E.M. Coupling of enzymes to cellulose using clororo-s-triazines//Nature. 1967. - Vol. 216. -P. 514 -515.

117. Khan S.S., Siddiqi A.M. Studies on chemically aggregated pepsin using glutaraldehyde // Biotechnology and bioengineering. 1985. - Vol.27. - P. 415 -419.

118. Killion J., Holtgrewe E. Preparation of F(ab')2 fragments of Immunoglobulin G // Clin. Chem. 1983. - Vol.29. - P. 1982 - 1984.

119. Krajewska B. Chitin and its derivatives as supports for immobilization of enzymes //Acta Biotechnologica. 1991. - Vol.11. -P.269 - 277.

120. Kukongviriyapan V., Poopyruchpong N., Ratanabanangkoon K. Some parameters of affinity chromatography in the purification of antibody against Naja naja siamensis toxin 3// J. Immunol. Methods. -1982. Vol.49. - P. 97 -104.

121. Kumakura M., Kaetsu I. Behavior of enzymes activity in immobilized proteases // hit. J. Biochem. 1984. - Vol. 16. - P. 1159 - 1161.

122. Kumakura M., Kaetsu I. Polymeric materials having a porous structure prepared by radiation polymerization //Journal of materials science. 1984. -Vol. 19.-P. 1616-1621.

123. Kumpalume P., Boushaba R., Jones R., Slater N. Facile F(ab')2 Manufacturing: Strategies for the Production of Snake Antivenoms // Food and Byproducts Processing. 2002. - Vol. 80. - P. 88 - 97.

124. Kurimoto E., Harada T., Akyama A., Sakai T., Kato K. In vitro refolding of porcine pepsin immobilized on agarose beads // J. Biochem. -2001. Vol.130. -P.295 - 297.

125. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol.227. - P. 680 - 685.

126. Lang J., Kamga-Fotso L., Peyrieux J., Blondeau C., Lutch C., Forrat R. Safety and immunogenecity of a new equine tetanus immunoglobulin associated with tetanus-diphtheria vaccine // Am.J.Trop.Med.Hyg. 2000. -Vol. 63. - P. 298-305.

127. Lee C., Chern C. and Fan C. Enzyme Crystal Embedded in Latex Film as Immobilized Enzyme // Biotechnology techniques. 1995. - Vol.9. - P. 827832.

128. Leuba, J. L., Widmer, F. Immobilization of proteinases on chitosan. // Biotechnol. Lett. 1979. - Vol.1. - P. 109 - 114.

129. Lilly M.D. Enzymes Immobilized to Cellulose // Methods Enzymol. 1976 -Vol. 44.-P. 46-53.

130. Line W. Kwong A., Weetall H. Pepsin insolubilized by covalent attachment to glass: preparation and characterization // Biochem. Biophys. Acta. 1971. -Vol. 242. - P. 194 - 202.

131. Madyastha K.M., Ganguli A.R., Kubair V.G., Kowser N., Vidya D. Extracellular invertase from Aspergillus atheticus: isolation and immobilization // Biotechnology Letters. 1987. - Vol. 9. - P. 555 - 560.

132. Mariani M, Camagna M, Tarditi L, Seccamani E. A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab')2 suitable for clinical use from mouse IgGl // Mol. Immunol. 1991. - Vol. 28. - P. 69 - 77.

133. Moráis V., Massadi H. Effect of pepsin digestion on the antivenom activity of equine immunoglobulns // Toxicon. 2005. - Vol. 46. - P. 876 - 882.

134. Muzzarelli R. Immobilization of enzymes on chitin and chitosan // Enzyme Microb. Technol. 1980. - Vol.2. -P.177 - 184.

135. Muzzarelli R., Barontini G., Rocchetti R. Immobilized enzymes on chitosan columns: a-chymotrypsin and acid phosphatase // Biotechnology and bioengineering. 1976. - Vol. 18. - P. 1445 - 1454.

136. Nemat-Gorgani M., Karimian K. Non-ionic adsorptive immobilization of proteins to palmityl-substituted Sepharose 4B // Eur. J. Biochem. 1982. -Vol.123.-P. 601-610.

137. Ngo T., Kumar H. Method for preparing immunoglobulin fragments. Patent № 5328834 US. Int. el. C12P 21/00; 12.07.1994.

138. Ohmiya K., Tanimura S., Kobayashi T., Shimizu S. Preparation and Properties of Proteases Immobilized on Anion Exchange Resin with Glutaraldehyde // Biotechnology and Bioengineering. 1978. - Vol. 20. - P. 115.

139. Otero-Patino R., Cardoso J., Pligashi H. A randomized, blinded, comparative trial of one pepsin-digested and two whole IgG antivenoms for Bothrops snakebites in Uraba, Colombia // AinJ.Trop.Med.Hyg. 1998. - Vol. 58. - P. 183 -189.

140. Pepin-Covatta S., Lutsch C., Grandgeorge M., Scherrmann J.M. Immunoreactivity of a new generation of horse F(ab')2 preparations against European viper venoms and the tetanus toxin // Toxicon. 1997. - Vol.35. - P. 411 -422.

141. Puvanakrishnan R., Bose S. Immobilization of pepsin on sand: preparation, characterization and application // Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 1984. - Vol. 21. - P. 323 - 326.

142. Puvanakrishnan R., Bose S. Studies of the immobilization trypsin on the sand // Biotechnology and bioengineering. 1980. - Vol.22. - P. 919 - 928.

143. Rea D.W., Ultee M.E. A novel method for controlling the pepsin digestion of antibodies // J. Immunol. Methods 1993. - Vol. 157. - P. 165 - 173.

144. Rojas G, Jimenez J.M., Gutierrez J.M. Caprylic acid fractionation of hyperimmune horse plasma: description of a simple procedure for antivenom production // Toxicon. 1994. - Vol. 32. - P. 351 - 363.

145. Rossi A, Morana A, Lernia ID, Ditombrino A, De Rosa M. Immobilization of enzymes on spongy polyvinyl alcohol cryogels: the example of beta-galactosidase from Aspergillus oryzae // Ital. J. Biochem. 1999. - Vol. 48. -P. 91-97.

146. Rousseaux J., Rousseaux-Prevost R., Bazin H., Biserte G. Proteolysis of rat IgG subclasses by Staphylococcus aureus V8 proteinase // Biochim. Biophys. Acta. 1983. - Vol. 748. - P. 205 - 212.

147. Sannier F., Piot J.M., Guillochon D., Dhulster P., Thomas D. Stabilization of pepsin on duolite for continuos hydrolysis of bovine haemoglobin at pH 2 and 40 °C // Biotechnology techniques. 1993. - Vol. 7. - P. 25 - 30.

148. Schlaeger E.J., Eggiman B., Gast A. Proteolytic activity in the culture supernatants of mouse hybridoma cells // Dev.Biol.Stand. 1987. - Vol. 66. -P. 403 -408.

149. Sedlacek H.H., Gronski P., Hofstaetter T., Kanzy E.J., Schorlemmer H.U., Seiler F.R. The biological properties of immunoglobulin G and its split products F(ab')2 and Fab. // Klin. Wochenschr. 1983. - Vol. 61. - P.723 -736.

150. Shah B., Kumar S. R., Devi S. Immobilized proteolytic enzymes on resinous materials and their use in milk-clotting // Proc. Biochem. 1995. - Vol. 30. - P. 63 -68.

151. Shamsuzzaman K., Haard N. Immobilzation of pepsinogen on sepharose // Biotechnology Letters. 1984. - Vol. 6. - P. 351 - 356.

152. Shukla S.P., Devi S. Immobilization of pepsin on an acrylamide/2-liydroxyethyl methacrylate copolymer and its use in casein hydrolysis // Journal of Applied Polymer Science. 2005. - Vol. 96. - P. 1544 - 1549.

153. Simionescu Cr., Dumitriu S., Popa M., Dumitriu M., Hritcu D. Bioactive polymers: Hydrolases immobilized on Biozan R // Colloid & Polymer. 1984. -Vol. 262.-P. 705-711.

154. Sisti A.M., Vitaly M.S., Manfredi M.J., Zarzur J.A. Preparetion of lyophilized and liquid intravenous immunoglobulin G: development and scale-up// Vox. Sanguinis. 2001. - Vol. 80. - P. 216 - 224.

155. Stanley W.L., Waters G.G., Kelly S.H., Olson A.C. Glucoamylase immobilized on chitin with glutaraldehyde // Biotecnology and Bioengeneering. Vol.20. - 1978. - P. 135 - 140.

156. Steele R., Steele R. Functional capacity of immunoglobulin G Prepaarations and the F(ab')2 split product // Journal of clinical microbiology. 1989. -Vol.27.-P. 640-643.

157. Taylor M.J., Cheryan M., Richardson T., Olson N.F. Pepsin immobilized on inorganic supports for the continious coagulation of skim milk // Biotecnolology and bioengineering. 1977. - Vol. 19. - P. 683 - 700.

158. Tomono T., Suzuki T., Tokunaga E. Cleavage of human serum immunoglobulin G by immobilized pepsin preparation // Biochimica et Biophysica Acta. 1981. - Vol. 660. - P. 186 - 192.

159. Tomotani E. J., Vitolo M. Screening of Dowex anion-exchange resins for invertase immobilization // Appl. Biochem. Biotechnol. 2004. - Vol. 113. - P. 145-159.

160. Ultee M., Alvarez V. Method for preparation of antybody-fragment conjugates. Patent № 4937183 US. Int. cl. C12P21/06; 26.06.1990.

161. Utsumi S., Okada M, Udaka K, Amano T. Preparation and biologic characterization of fragments containing dimeric and monomeric C gamma 2 domain of rabbit IgG // Molecular immunology. 1985. - Vol. 22. - P. 811 -819.

162. Valentova O., Turkova J., Lapka R. Pepsin immobilized by covalent fixation to hydroxyal methacrylate gels: preparation and characterization // Biochimica et Biophysica Acta. 1975. - Vol. 403,- P. 192 - 196.

163. Vinod V.P., Shinde S., D'Britto V., Shukla P.G., Rao M. Preparation and characterization of urea-formaldehyde-pepsin bioconjugate: a new biocatalyst system // Biotechnol Prog. 2006. - Vol. 22. - P.l 585 -1590.

164. Vretblad P., Axen P. Covalent fixation of pepsin to agarose derivatives // FEBS Letters. 1971. - Vol.18. - P. 254 - 256.

165. Weetall H.H. Alkaline phosphatase insolubilized by covalent linkage to porous glass // Nature. 1969. - Vol. 223. - P. 959 - 960.

166. WHO Expert Consultation on Rabies : first report. Geneva, 2004. — 121 p.

167. Wilde H., Khawplod P., Hemachudha T., Sitprija V. Postexposure treatment of rabies infection: can it be done without immunoglobulin?//Clinical Infectious Diseases. 2002. - Vol.34. - P. 477 - 480.

168. Yesiloglu Y., Sagiroglu A. Trypsin-Catalyzed Peptide Synthesis in Acetonitrile with Low Water Content // Turk. J. Chem. 2002. - Vol. 26. - P. 529 - 534.

Информация о работе

Генералов, Сергей Вячеславович
кандидата биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab`)2-фрагментов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы