Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиология популяции культуры клеток DIOSCOREA DELTOIDEA в условиях закрытого протока

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиология популяции культуры клеток DIOSCOREA DELTOIDEA в условиях закрытого протока"

На правах рукописи

ОРЕШНИКОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

ФИЗИОЛОГИЯ ПОПУЛЯЦИИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК йЮБСОЯЕА ОЕЬТОЮЕА В УСЛОВИЯХ ЗАКРЫТОГО ПРОТОКА

Специальность 03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научные руководители: доктор биологических наук

А. М. Носов

доктор химических наук, профессор М.Н. Манаков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук.

профессор

Т.Г. Корженевская

доктор биологических наук,

Л.Н. Цоглин

Ведущее учреждение: АООТ "Биохиммашпроект"

Защита состоится "29" октября 1996 г. в Ю30 часов на заседании Диссертационного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан " сентября 1996г.

II

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Изучение роли компонентов питательных сред и других факторов, участвующих в регуляции физиологических процессов. которые протекают в популяциях соматических клеток растений In vitro, представляет теоретический и практический интерес. При проведении физиологических экспериментов важно обеспечить стационарные условия клеточного микроокружения. Однако, при использовании периодического способа культивирования из-за нестационарности системы, невозможно создать постоянные концентрации компонентов питательной среды в течение продолжительного времени. Открытый проток является стационарной системой, но при этом способе выращивания происходят дополнительные изменения в составе клеточной популяции вследствие отбора клеток.

Выращивание суспензионных клеточных культур в режиме закрытого протока. как было показано некоторыми авторами [Wilson et al.,1971. Su. 1991], позволяет избавиться от ряда недостатков, присущих вышеизложенным методам. Однако, по немногочисленным опубликованным результатам нельзя выявить основные факторы, регулирующие физиолого-биохимические характеристики клеточной популяции, в режиме закрытого протока. Остается неясной стратегия подбора оптимального аппаратурного оформления для этого метода. Поэтому актуальным является изучение процессов роста клеток, а также„биосинтеза вторичных соединений культурой клеток растений в режиме закрытого протока.

Цель работы. Изучение закономерностей роста культуры клеток ди-оскореи дельтовидной и биосинтеза фуростаноловых гликозидов при выращивании в режиме закрытого протока.

Задачи исследования.

1. Создание различных биореакторов для реализации процесса выращивания в режиме закрытого протока.

2. Исследование особенностей роста клеточной популяции D.äeltoidea в разработанных биореакторах.

3. Изучение возможности регулирования роста культуры клеток D. deltoidea в условиях закрытого протока путем варьирования различных параметров культивирования, а именно;

- плотности биомассы к моменту включения протока.

- скорости протока.

- 4 -

- концентрации питательных веществ,

- степени неспецифического стрессового воздействия.

4. Анализ изменений качественного и количественного состава фу-ростаноловых гликозидов при выращивании культуры клеток диоскореи в условиях закрытого протока.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение особенностей роста культуры клеток диоскореи дельтовидной и биосинтеза фуроста-ноловых гликозидов в режиме закрытого протока.

Показано, что гелевый слой, образующийся на поверхности мембраны. существенным образом влияет на физиолого-биохимические характеристики клеточной популяции диоскореи дельтовидной.

Впервые показано, что используя различные варианты закрытого протока можно реализовать различные физиологические состояния клеточной популяции: с преимущественным содержанием клеток меристемо-идного или паренхимоподобного типа, остановку роста с сохранением жизнеспособности, быстрого старения и гибели популяции.

Показано, что режим закрытого протока не приводит к изменению качественного состава стероидов в клетках, но влияет на их количественное содержание.

Практическое значение работы.

Разработана серия биореакторов, позволяющих реализовать метод закрытого протока. Определен оптимальный для биосинтеза фуростано-ловых гликозидов режим выращивания культуры клеток диоскореи дельтовидной в условиях закрытого протока. Продуктивность по фуроста-ноловым гликозидам при этом варианте культивирования составляет более 160 мг/л/сутки.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущи-но. 1993 г.. на II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алматы. 1993 г. На III Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия". Пущино 1993. На семинаре Института физиологии растений и клеточной биологии при Гумбольдт-Университете. Берлин 1994г. На семинаре Института женьшеня и табака, г. Тайджон, Ю. Корея. 1994.

Публикации.' По материалам диссертации опубликованы четыре работы.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав: обзор литературы, материалы и методы иссле-

дования, результаты и обсуждение (четыре главы), а также заключения. выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемой литературы - 146 публикаций, из которых 116 зарубежные.

Принятые сокращения и обозначения. 2.4Д -2.4 дихлорфеноксиуксусная кислота. М - сухая масса клеток г/л, Мс - сырая масса клеток, г/л. N - число клеток, кл/мл., V -жизнеспособность клеток. %. ц - удельная скорость роста, сутки"1, Б - скорость протока, сутки"1, Г - содержание стероидных гликози-дов в биомассе клеток, в %. Б - концентрация Сахаров, г/л

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служила суспензионная культура клеток О1оэсогеа йеЬШйеа, штамм ИФР ДМ 0,5. Этот мутантный штамм был получен в результате индуцированного химического мутагенеза из исходного штамма ИФР-Д1 в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН (Каранова и др.. 1974).

Суспензию клеток диоскореи выращивали на среде Мурасиге - Скуга (МБ) , содержащей следующие фитогормоны: 2,4-0 - 0,25 мг/л и кине-тин -0.1 мг/л.

В работе использовали биореакторы трех типов:

МБР - аппарат, собственной конструкции, с встроенной в днище ферментера мембраной. Аппарат снабжен тефлоновой мешалкой типа "морской" винт, рабочий объем 2 л.

АК-210 - аппарат производства СКВ БП (г. Пущино) с турбинной мешалкой, рабочий объем - 8 л.

Фермус - аппарат производства НИЦ "Биоавтоматика" (г. Нижний Новгород) с открытой турбинной мешалкой, рабочий объем 6 л.

Все биореакторы были оснащены перистальтическими насосами с измерителями расхода жидкости, сосудами для питательной среды и бесклеточной культуральной жидкости.

В зависимости от конструкции, массообменных характеристик аппарата и режима культивирования расход воздуха на барботаж составлял 0.1 + 1.8 л/л в минуту, скорость перемешивания - 20 + 220 об/мин.

Анализ показателей поста и компонентов культуральной среды.

Концентрацию сухой и сырой биомассы, число клеток определяли по

общепринятым методикам [Бутенко 1964, Dixon et al.. 1989]

Жизнеспособность клеток определяли как процент не прокрашиваемых О,025Ж синькой Эванса клеточных агрегатов.

Количество общих Сахаров в фильтрате измеряли фенол-сернокислотным методом [Dubois et al.,1956].

Анализ стероидных гликозидов.

Для качественного анализа стероидных соединений в клеточной биомассе использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), для анализа агликонов гликозидов -газо-жидкостную хроматографию после гидролиза [Носов. 1992]

Количественное содержание фуростаноловых гликозидов в сухой биомассе определяли модифицированным спектрофотометрическим методом с реактивом Эрлиха [Васильева и др.. 1987].

Для анализов использовали лиофилизированную биомассу клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Разработка и усовершенствование конструкций биореакторов с целью проведения ферментация в режиме закрытого протока.

Первый этап работы был посвящен разработке и изготовлению специальных биореакторов и устройств, необходимых для реализации режима закрытого протока. Для этого были использованы два принципа отделения биомассы от культуральной среды: с помощью мембран и путем седиментации.

щ

Разработка устройства для непрерывного отделения биомассы от культуральной жидкости пол действием силы тяжести.

В качестве основы конструкции для отделения клеточной биомассы от культуральной жидкости под действием седиментации было использовано устройство, принцип которого был предложен [Wilson et al.. 1971]. Эта конструкция представляет собой трубку, опущенную практически до дна ферментера. В трубке происходит седиментация клеток под действием силы тяжести, которые таким образом возвращаются в биореактор. Из верхней части трубки перистальтическим насосом отбирается бесклеточная жидкость.

Основная проблема при использовании этого устройства состояла в

удалении пузырьков воздуха, снижающих эффективность седиментации клеток и изменяющих расход культуральной жидкости. Эта проблема была решена путем изменения формы нижней части трубки и введения в конструкцию уловителя пузырьков воздуха с их последующим удалением. ■

Для предотвращения стрессового воздействия гипоксии на клетки, находящиеся внутри разделительного устройства, в трубке были сделаны специальные отверстия. Конструкция устройства была унифицирована и пригодна для установки в стандартные штуцера биореакторов "Фермус" и "АК-210".

Используя разработанное разделительное устройство удалось реализовать разделение клеток и культуральной среды вплоть до концентрации сухой массы клеток 30 г/л.

Разработка устройства для непрерывного отделения биомассы от культуральной жидкости при помощи мембран.

Для решения поставленной задачи нами был разработан биореактор собственной конструкции в котором мембрана устанавливалась в днище аппарата.

Необходимой и важной частью работы явилось исследование типов и характеристик мембран, пригодных для выращивания культур клеток растений. Принципиальными моментами для этого оказались:

1. Производительность мембраны и размер пор.

В результате проведенных модельных экспериментов было установлено. что для отделения клеток 0. йеМоЫеа от культуральной жидкости пригодны микро- и макрофильтрационные материалы со средним размером пор. не превышающим 50 мкм. При этом производительность мембран по культуральной жидкости с течением времени значительно снижалась {более чем в 100 раз). Это явление было обусловлено постепенным образованием на поверхности мембраны гелевого слоя, образующегося из выделяемых культурой в среду пектиновых соединений. С увеличением объема культуральной жидкости.пропущенной сквозь мембрану. на ее поверхности сначала образовывалась рыхлая гелевая структура, которая затем превращалась в устойчивую пленку, легко отделяемую от мембраны. Было установлено, что этот слой образуется на всех микро- и макрофильтрационных материалах, однако скорость его образования увеличивалась с уменьшением диаметра пор мембраны. Так. на микрофильтрационных мембранах гелевый слой образовывался в первые часы после включения протока, а при использовании крупнопо-

ристой фильтровальной бумаги (при той же скорости протока 13 л/сут.м2) - только в конце второго месяца фильтрации.

2. Токсичность мембран.

В результате работы по подбору нетоксичных для растительной клеточной культуры диоскореи мембран, были выбраны следующие фильтрационные материалы: ме.талло-керамические, полисульфонные мембраны. а также фильтровальная бумага.

Культивирование Шозсогеа йеиоОеа в режиме закрытого протока.

Следующим этапом работы было исследование принципиальной возможности культивирования клеток растений в режиме закрытого протока в разработанных конструкциях биореакторов.

Культивирование Р1овсогеа йеШ1йеа в мембранных биореакторах.

Первые эксперименты были проведены в МБР. в котором в качестве фильтрующего материала использовалась крупнопористая фильтровальная бумага. На рис. 1 показано выращивание культуры клеток диоскореи в режиме закрытого протока со скоростью протока Б=0,1 сут"1.

Как следует из представленных результатов, на кривой роста после включения протока можно выделить фазы линейного роста, стационара и деградации. Максимальная концентрация сухой массы клеток, достигнутая в этих условиях, составила 25 г/л.

Следующий эксперимент, представленный на рис.2, был проведен с использованием микрофильтрационной мембраны. В течение ферментации было проведено переключение скоростей протока с 0,2 на 0,1 сут"1. При этом наблюдали существенное отличие в форме кривой роста от выращивания в биореакторе с фильтровальной бумагой в качестве мембраны. В первые дни как после включения, так и переключения протока, происходило уменьшение сухого веса клеток, отмирание больших клеточных агрегатов. Однако, в целом жизнеспособность суспензии увеличивалась из-за образования небольших (3-6 клеток), активно делящихся клеточных агрегатов. После 26 дня выращивания наблюдалось резкое падение жизнеспособности и сухого веса клеток, не зависящее от внешних условий культивирования.

Как было изложено выше, замена фильтровальной бумаги на микрофильтрационную мембрану изменяет время начала и интенсивность формирования гелевого слоя на поверхности мембраны. Поэтому можно сделать предположение, что отличия в ростовых характеристиках кле-

М,

Г. М

О 20 <0 60 20 100 120 |<0 сутки

'-*- м (г/л) ■ Г (уд.Х) — V (Я)

А Б ., Б

0. Су!

-0.2 =0.1

£ \/Д

о и

/ и г I 1-а "\\

0. \

"11

100

о 5 10 15 20 23 10 40

су1КИ

-*- М (г/л) — V <*) -в- Г (ул.я)

, М (г/л)

2 4 ( а 10 12 14 16 сутки

КОНЦСНГРАГ »илыслг

КУЛЬТ.ЖИДКОСТЬ -в- КОНТРОЛЬ

со

Рис. 1. Динамика изменения основных физиолого-биохимичес-ких параметров культуры клеток 0. йеШЫеа. выращиваемой в МБР с фильтровальной бумагой в режиме закрытого протока.

Рис. 2. Динамика изменения Рис. 3. Динамика изменения

основных физиолого-биохимичес- сухой массы клеток Б.

ких параметров культуры клеток йеЬШйеа, выращиваемой в кол-

й. йеиоЫеа, выращиваемой в бах на качалке с фракциями

МБР с микрофильтрационной мем- культуральной жидкости, браной в режиме закрытого протока. 1 : •

Обозначения см. стр. 5

Пунктирная линия отделяет культивирование в периодическом режиме (А) от режима закрытого протока (Б).

точной популяции при выращивание в МБР с различными фильтрационными материалами определяются временем и интенсивностью образования гелевого слоя. При этом образование плотной пленки, наблюдающееся после длительного периода протока, может иметь токсичное действие и приводить к лизису клеток.

Для доказательства этого положения был поставлен эксперимент с добавлением различных- фракций экзометаболитов из культуральной жидкости к среде культивирования клеток диоскореи. Полученные результаты предствлены на рис 3. Как видно из графика, добавление высокомолекулярной фракции (фракции, не проходящей сквозь микрофильтрационную мембрану) приводит к гибели клеток. Рост культуры с низкомолекулярной фракцией лишь незначительно хуже, чем с добавлением нефраквдонированной культуральной жидкостью или с контролем.

Изложенные результаты позволяют сделать вывод, что 'включение и/или переключение протока приводит к образованию гелевого слоя на мембранах, а в последствии - к изменениям его физико-химического состояния. Это может являтся причиной изменений физиологических характеристик популяции, в частности - уменьшения сухого веса клеточной биомассы и даже к деградации клеточной культуры.

V. Мс. 5

м. г

Рис. 4. Динамика изменения основных физиолого-биохимических параметров культуры клеток й. йеНоЫеа в перфузионном биореакторе АК-210.

Обозначения см. стр. 5.

Пунктирная линия отделяет культивирование в периодическом режиме (А) от режима закрытого протока (Б).

Культивирование Dioscorea deltoidea в биореакторах (перфузион-ных биореакторах). оснащенных седиментационным устройством.

Типичная кривая роста культуры клеток диоскореи. выращиваемой в режиме закрытого протока, представлена на рис. 4. Как видно из данного рисунка, динамика изменения сухой массы клеток имеет линейный характер. В то же время, как и при культивировании в мембранном биореакторе, после определенного времени проточного выращивания наблюдается снижение жизнеспособности и гибель клеточной популяции. Однако, при использовании седиментационного разделительного устройства не происходит фракционирования культуральной жидкости. а следовательно и отсутствует влияние структурных изменений пектиновых веществ на физиолого-биохимические характеристики растительной клеточной популяции диоскореи. Поэтому дальнейший поиск факторов, определяющих ростовые и биосинтетические характеристики клеточной культуры диоскореи в режиме закрытого протока, был проведен с использованием этого типа биореакторов (АК-210, Фермус), а также МБР с фильтровальной бумагой.

Влияние факторов культивирования на физиолого-биохимические характеристики культуры клеток D. deltoidea при выращивании в режиме закрытого протока.

Влияние плотности культуры в момент включения протока.

Для выяснения значимости этого фактора были проведены эксперименты по выращиванию культуры клеток в перфузионных биореакторах с постоянной скоростью разбавления D = 0.15 сут"1. соразмеримой с максимальной удельной скоростью роста культуры. При этом в первом случае проток включали при плотности сухой массы клеток 8,5, в другом - 6 г/л. Результаты экспериментов представлены на рис.4 и 5 соответственно. Как следует из рисунков, в первом случае после включения протока наблюдали линейный рост биомассы. Включение протока с той же скоростью, но при концентрации сухой массы клеток 6 г/л привело к остановке роста клеток. При этом существенно, что жизнеспособность клеток оставалась на уровне 60-7095 на протяжении всех 10 дней, в течение которых проток был включен. После остановки протока начался интенсивный рост клеточной биомассы. На 47 сутки культивирования проток был вновь включен с той же скоростью 0,15 сут"1, но при концентрации биомассы 10 г/л. В этом случае наблюдали линейный рост биомассы практически без лаг-фазы.

сутки сутки

-+- м (г/л) -V (г.) Мс (г/л) -*- М (г/л) -а- г (ул.7.) Б (г/л)

Рис. 5. Динамика изменения основных ростовых (I) и биосинтетических (II) параметров культуры клеток 0. йе1Ьо1йеа в перфузионном биореакторе Фермус.

Обозначения см. стр. 5.

Пунктирная линия отделяет культивирование в периодическом режиме (А) от режима закрытого протока (Б).

Таким образом, существенно важным параметром для роста в режиме закрытого протока оказалась плотность биомассы при включении протока. Это явление можно объяснить абсолютным количеством экзомета-болитов, выделяемых клетками. Включение протока при концентрации сухой массы клеток 6 г/л, видимо, привело к вымыванию из биореактора факторов кондиционирования до уровня недостаточного для роста клеток. Возрастание сухой массы до ю г/л обусловило пропорциональное увеличение выделяемых клетками экзометаболитов. содержание которых при включении протока оказывается достаточным для пролиферации.

Влияние скорости протока.

Для выяснения степени влияния скорости протока были поставлены эксперименты с использованием аппарата АК-210. При этом были выбраны две скорости протока: 0,3 и 0.45 суток"1 рис. (6 и 7 соот-

V. мс м. г

сутки

— V (Г.) -+- М (г/л) -+- Мс

Рис. 6. Динамика изменения основных физиолого-биохимичес-ких параметров культуры клеток Б. йе1 Шйеа. выращиваемой в перфузионном биореакторе

АК-2Ю со скоростью протока 0=0,3 сут"1.

сутки

-в- г'(ул.Ъ)

Рис. 7. Динамика изменения основных физиолого-биохимичес-ких параметров культуры клеток 0. йеио1йеа. выращиваемой в перфузионном биореакторе

АК-210 со скоростью протока 0=0.45 сут"1.

Обозначения см. стр. 5-

Пунктирная линия отделяет культивирование в периодическом режиме (А) от режима закрытого протока (Б).

ветственно). В качестве контроля были использованы изложенные выше эксперименты со скоростью разбавления 0=0,15 сут'1. Как следует из приведенных данных, высокая скорость разбавления вызывала снижение сухой массы клеток, жизнеспособности и содержания сапонинов. Гибель клеток при скоростях протока, значительно превышающих максимальную удельную скорость роста , вероятно может быть вызвана практически полным удалением из биореактора экзометаболитов. синтезируемых самой клеткой и необходимых ей для сохранения жизнеспособности.

Таким образом, увеличение скорости протока может значительно

изменять физиологическое состояние клеточной популяции вплоть до ее гибели, что можно объяснить вымыванием экзометаболитов, необходимых клеточной культуре для сохранения жизнеспособности.

5.2. Влияние неспецифического стресса (механического воздействия) на клеточную популяцию диоскореи.

Для решения этой задачи необходимо было сопоставить используемые биореакторы по интенсивности воздействия механического стресса на клеточную популяцию.

Чтобы устранить фактор несоответствия скорости вращения мешалки плотности биомассы для различных биореакторов был определен алгоритм изменения скорости перемешивающего устройства . Суть алгоритма заключалась в том. что скорость вращения мешалки во всех биореакторах изменяли дискретно в зависимости от концентрации сухой массы клеток.

В качестве метода сопоставления интенсивности механического воздействия для разных биореакторов был предложен подход, заключающийся в использовании инокулята различного возраста. Как было показано ранее [Носов, 1994], в экспоненциальной фазе роста (7-10 сутки выращивания) клеточная культура диоскореи состоит преимущественно из клеток меристемоидного типа, а в стационарной фазе, наступающей к 13-15 суткам, преобладают паренхимоподобные клетки. Рядом авторов [Wagner, Vogelmann, 1977; Tanaka et al., 1988] продемонстрировано. что клеточные культуры, состоящие преимущественно из меристемоидных клеток, менее чувствительны к механическому стрессу, чем культуры в которых преобладают паренхимоподобные клетки. Таким образом, анализ изменения жизнеспособности клеток в первые дни после инокуляции биореактора клеточной культурой различного возраста может выявить интенсивность механического стресса.

Данный подход позволил сразу выделить биореактор Фермус, как аппарат с максимальным механическим стрессовым воздействием на клеточную популяцию. Инокуляция этого ферментера 14 - дневной культурой всегда приводила к гибели клеток. Успешное проведение ферментации было возможным только при инокуляции клеточной культурой, находящейся в экспоненциальной фазе роста. При этом варьирование сухой массы клеток, вносимой в биореактор, в пределах 0,94-1.37 г/л, не изменяло общей картины колебания жизнеспособное-

ти. Сильный механический стресс, приводящий к росту только мерис-темоидных клеток, при использовании биореактора Фермус вероятнее всего был вызван встроенным в днище магнитным приводом.

Напротив, инокуляция биореакторов АК-210 и МБР клеточной культурой с различными сроками выращивания сопровождалась лишь незначительным снижением жизнеспособности в первые дни культивирования Таким образом, при использовании этого метода не удалось определить достоверное отличие в интенсивности механического стресса для этих биореакторов. Поэтому на следующем этапе было проведено выращивание в биореакторах АК-210 и Фермус в режиме закрытого протока при сопоставимой скорости протока: Фермус - 0=0,15 сут"1 рис.5 и МБР - 0=0,1 сут"1 рис.1. Было показано, что только при использовании МБР в режиме закрытого протока после 40 дня выращивания в культуре появляются изогнутые, спиралеобразные одиночные клетки. Такие клетки характерны для каллусной ткани диоскореи и их не удается получить любыми другими методами выращивания суспензионных клеточных культур. В биореакторе АК-210 в режиме закрытого протока в зависимости от фаз роста встречаются, как и при периодическом выращивании в колбах на качалке, меристемоидные и паренхимоподоб-ные клетки.

Таким образом биореакторы можно расположить в ряд по степени увеличения механического стрессового воздействия на суспензионную растительную клеточную популяцию Б. йеШ1йва: МБР, АК-210, Фермус.

Следующий этап работы заключался в анализе ростовых кривых культуры диоскореи, выращенной в различных биореакторах, но при сопоставимых условиях закрытого протока а именно: скорость протока 0=0,15 сут"1 (Фермус рис.5 и АК-210 рис.4) и 0=0,1 сут"1 (МБР рис. 1). При этом, хотя во всех ферментациях и сохранялись основные закономерности роста, свойственные режиму закрытого протока, основные физиолого-биохимические показатели клеточной популяции различались при использовании различных биореакторов.

Продолжительность линейной фазы роста по сухой биомассе, измеренная от 10 г/л до начала стационарной фазы составляла 95, 18 и 7 суток а максимальный уровень сухой массы клеток - 22, 15 и 14 г/л для биореакторов МБР, АК-210 и Фермус соответственно. Продолжительность стационарной кривой роста и фазы клеточной деградации также уменьшалась с увеличением степени механического воздействия.

Таким образом, увеличение интенсивности механического стресса

оказывает сильное селективное воздействие, снижая гетерогенность клеточной популяции , что приводит к следующим физиологическим реакциям: сокращению во времени фаз роста и снижению максимальной концентрации сухой массы клеток.

Влияние концентрации питательных веществ.

Для изучения воздействия концентрации питательных веществ на рост культуры клеток диоскореи нами был поставлен эксперимент, изображенный на рис.8, в котором концентрация всех компонентов перфузионной среды была увеличена в два раза. Как и в аналогичном

s. F

■=— N (кл/мл)

М (г/л)

F (УД-'О

Рис. 8. Динамика изменения основных ростовых (I) и биосинтетических (II) параметров культуры клеток D. deltoidea в биореакторе АК-210, с протоком перфузионной среды, в которой удвоена концентрация всех компонентов.

Обозначения см. стр. 5.

Пунктирная линия отделяет культивирование в периодическом режиме (А) от режима закрытого протока (Б).

эксперименте с использованием стандартной среды Мурасиге-Скуга (рис. 4) наблюдали линейный прирост сухой и сырой клеточной биомассы. Однако увеличение содержания количества клеток происходило по экспоненциальному закону в течении первых 8 суток с момента

включения протока. После 12 суток культивирования динамика изменения количества клеток приобрела линейный характер. В целом, как интенсивность прироста клеточной биомассы ( в среднем 2 г/л*сутки для 2*МБ и 0,5 г/л*сутки для IхМБ), так и ее максимальная концентрация (более 30 г/л для 2*МБ и в среднем 16 г/л для IхМБ) различались более, чем в 2 раза. Таким образом, можно сделать предположение. что ростовые характеристики культуры клеток И. йеИоЬЗеа в режиме закрытого протока при прочих равных условиях могут определяться количеством внесенных питательных веществ. При данном режиме культивирования достаточно хорошо виден эффект несбалансированного роста. Избыточные концентрации вносимых питательных веществ инициируют экспоненциальный рост по числу клеток, в то время как сухая и сырая масса клеток увеличиваются линейно. С увеличением концентрации клеточной биомассы концентрация Сахаров в среде культивирования перестает увеличиваться а затем начинает снижаться. В этот период рост сухой клеточной биомассы и количества клеток имеет линейный характер и лимитируется вероятнее всего концентрацией питательных веществ в среде. Однако достаточно сложно выявить определенный фактор, лимитирующий прирост клеточной биомассы. Так. в эксперименте с 1*МБ и 2*МБ концентрация Сахаров в культуральной жидкости при протоке перфузионной средой со скоростью 0=0.15 сут"1 не снижалась ниже 10 г/л. Вероятнее всего рост клеточной биомассы в данном случае лимитируется концентрацией нескольких компонентов питательной среды.

Еще одним подтверждением определяющей роли концентрации компо-нетов питательной среды при выращивании культуры клеток диоскореи в режиме закрытого протока могут служить результаты эксперимента, представленные на рис. 9. Скорость протока питательной среды была уменьшена в два раза по сравнению с контрольным опытом ( рис 4), но одновременно в два раза была увеличена концентрация питательной среды. Таким образом, суммарный поток питательных веществ был выровнен по сравнению с контролем. Сразу после включения протока при концентрации сухой массы клеток 10 г/л происходило резкое снижение жизнеспособности до 50Ж. В то же время при этом наблюдали линейное увеличение концентрации сухой и сырой биомассы и незначительный прирост количества клеток. Увеличение скорости протока в два раза при той же концентрации питательной среды привело к опережающему росту количества клеток над концентрацией сухой и сырой биомассы, а также увеличению жизнеспособности.

сутки сутки

Мс (г/л) — V (Г.) -в- N (кл/ыл) -*- м (г/л) -х- Э (г/л) "в- Г (ул.Я)

Рис. 9. Динамика изменения основных ростовых (I) и биосинтетических (II) параметров культуры клеток 0. йеЬШйеа в биореакторе АК-210. со сменой скорости протока.

Обозначения см. стр. 5.

Пунктирная линия отделяет культивирование в периодическом режиме (А) от режима закрытого протока (Б. Б1).

В экспериментах, представленных на рис.4 и 9 при одинаковом протоке питательной среды достоверное снижение жизнеспособности наблюдается при концентрации сухой массы клеток около 14-15 г/л, что может служить дополнительным доказательством влияния концентрации компонентов питательной среды на ростовые характеристики клеточной культуры й. йеЬШйеа, выращиваемой в режиме закрытого протока.

Содержание стероидных гликозидов и продуктивность культуры клеток по этим соединениям в режиме закрытого протока.

Качественный состав и соотношение стероидных гликозидов.

Первым этапом исследования было определения формы гликозидов (фуростаноловая или спиростаноловая) в растительной биомассе 0.

йеЬШйеа. выращиваемой при различных режимах закрытого протока, (проанализировано около 10 различных образцов биомассы). Анализ показал, что содержание спиростаноловых сапонинов в отобранных пробах составляет менее 1%. Эти результаты подтверждают ранее установленный факт [Носов. 1992]. что штамм ДМ-О.5 практически не содержит спиростаноловых гликозидов.

Определение качественного состава фуростаноловых сапонинов показало наличие во всех отобранных пробах двух основных сапонинов -протодиосцина и дельтозида и небольшого количества их 25-3 аналогов. Типичная ВЭЖХ-хроматограмма фуростаноловых гликозидов. "иредс-тавлена на рис. 10.

Рис. 10. Типичная ВЭЖХ - хроматограмма гликозидов культуры клеток диоскореи. выращенной в режиме закрытого протока.

1 - 253-дельтозид. 2 - дельтозид.

3 - 253-протодиосцин. 4 - протодиосцин.

Таким образом, было показано, что при выращивании растительных клеток 0. йеМо1йеа в режиме закрытого протока изменения качественного состава и соотношения стероидных гликозидов не происходит.

Количественое содержание фуростаноловых гликозидов и влияние на него Факторов культивирования.

Как следует из данных, представленных на рис. 1. 4. 5.6,7.8.9 по выращиванию клеток диоскореи в различных режимах закрытого протока. внутриклеточное содержание фуростаноловых гликозидов варьирует в пределах от 0.8 до 8.5 % на сухой вес клеток. Причем, наиболее сильно содержание гликозидов отличается при выращивали клеток в различных биореакторах. Динамика изменения содержания гликозидов в МБР (рис.1) имеет пик с концентрацией 4,5%. В дальнейшем концентрация уменьшается 0,8%. В то же время, характер изменения содержания сапонинов в режиме закрытого протока при использовании биореакторов АК-210 и Фермус аналогичен. Увеличение содержания сапонинов происходило для растущей культуры в фазу линейного роста, достигая своего максимального значения в стационарной фазе роста. В стадии деградации клеточной биомассы снижалось и внутриклеточное содержание сапонинов. В то же время, максимальное содержание сапонинов в режиме закрытого протока для этих биореакторов сильно различалось и составляло около 6% для ферментера АК-210 и 3,5 % для биореактора Фермус. Отсюда можно сделать вывод о влиянии механического стресса на накопление фуростаноловых гликозидов культурой клеток 01оБСОгеа йе1Шйеа. Максимальный биосинтез сапонинов наблюдался при использовании биореактора АК-210, перемешивающая система которого разрушала старые, сильно вакуолизированные клетки и клеточные агрегаты. При этом, меристемоидные клетки и клетки, начавшие рост растяжением, как более устойчивые к механическому стрессовому воздействию, были способны к росту в этом ферментере. Возможно, именно для этих клеток характерно максимальное накопление фуростаноловых гликозидов. Небольшие клетки и клеточные агрегаты преимущественно меристемоидных клеток, отселектированные механической перемешивающей системой биореактора Фермус. были способны синтезировать сапонины на более низком уровне. Меньшее содержание сапонинов, наблюдавшееся после 50-х суток выращивания с использованием мембранного биореактора, вероятно можно объяснить увеличением доли в клеточной популяции старых, сильно дифференцированных клеток, не встречающихся при обычных методах выращивания суспензионных культур. Эти клетки встречаются только в каллусных тканях й. йеЬШйеа. При этом известно, что накопление фуростаноловых сапонинов в каллусной ткани в 5-10 раз ниже чем в суспензионной культуре.

Продуктивность по фуростаноловым гликозидам.

Максимальное содержание фуростаноловых гликозидов было достигнуто при выращивании клеток диоскореи в режиме закрытого протока с использованием биореактора АК-210 и перфузионной среды с удвоенной концентрацией питательных веществ (рис.8). В этом эксперименте прирост клеточной массы составил около 2 г/л/сутки. Таким образом, продуктивность по фуростаноловым гликозидам в режиме закрытого протока составила 160 мг/л/сутки. По имеющимися данным литературы, это максимальная продуктивность по.гликозидам.для...культуры 0. йе1-Шйеа. Таким образом, этот вариант выращивания может быть теоретической основой для создания перспективного биотехнологического производства.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны биореакторы для выращивания растительных клеточных культур в условиях закрытого протока, различающиеся по принципу отделения клеточной биомассы от культуральной жидкости: с использованием мембран и путем седиментации клеток.

2. Характеристики роста культуры клеток диоскореи в режиме закрытого протока различаются при использовании МБР и перфузионного биореактора. Основной причиной указанных различий является образование гелевого слоя экзометаболитов на мембране, что может приводить к изменению физиологических характеристик популяции и далее к деградации клеточной культуры.

3. Показано значительное влияние на характеристики роста культуры в режиме закрытого протока следующих факторов: начальной плотности биомассы, скорости протока, концентрации компонентов питательной среды и механического стресса.

3.1. Установлено, что существует критическая плотность биомассы на момент включения протока, ниже которой рост клеток прекращается. Так. при плотности биомассы 6 г/л и скорости протока 0.15 сут."1 происходила остановка роста, а при 10 г/л - интенсивный рост. Такое поведение культуры объясняется абсолютным количеством факторов кондиционирования, выделяемых клетками.

3.2. Показано, что увеличение скорости протока выше максимальной удельной скорости роста культуры приводит к остановке роста и

последующей гибели культуры. Это также может быть обусловлено вымыванием факторов кондиционирования.

3.3. Изменение концентрации компонентов перфузионной среды приводит к непропорциональному изменению ростовых характеристик. Так. проточное культивирование при двойной концентрации среды привело к увеличению интенсивности прироста биомассы почти в 4 раза.

3.4. Установлено, что интенсивный механический стресс оказывает сильное селективное воздействие на популяцию, снижая ее гетерогенность. Это приводит к сокращению фаз роста и снижению максимальной концентрации сухой биомассы клеток.

4. Выращивание культуры клеток Dioscorea deltotdea в режиме закрытого протока может приводить к изменению количественного содержания фуростаноловых гликозидов без изменения их качественного состава. Максимальная продуктивность по этим соединениям была достигнута в биореакторе АК-210 при скорости протока D=0.15 сут"1 средой Мурасиге-Скуга двойной концентрации и составляла 160 мг/л/сутки.

5. Показано, что используя режим закрытого протока и комбинируя изученные факторы (скорость протока, плотность биомассы, состав среды) можно целенаправленно переводить популяцию клеток в различные физиологические состояния: интенсивный рост, отсутствие роста при сохранении жизнеспособности, старение культуры с последующей гибелью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Носов A.M. Орешников A.B., Воробьев A.C.. Суриков Б.П.. Па-сешниченко В.А.. Арзамасцев Е.В. Получение медицинских и ветеринарных препаратов на основе фуростаноловых гликозидов из мутантно-го штамма ИФР-ДМ-0,5 культуры клеток Диоскореи Дельтовидной.// III Всеросийская планово-отчетная конференция по направлению "Генная и клеточная инженерия". Тез.докл. - Москва.. - 1993. - С. 76.

2. Орешников А.В.. Манаков М.Н., Носов А.М. Управляемое культивирование растительных клеток Di oscorea deltotdea в режиме закрытого протока по биомассе.// II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Тез. докл. - Пущино..-1993.- С.161.

3. Орешников A.B., Манаков М.Н.. Воробьев A.C.. Носов A.M. Биосинтез фуростаноловых гликозидов при перфузионном выращивании культуры клеток Dioscorea deltotdea.// II Международная конферен-

ция: Биология культивируемых клеток растений и биотехнология. Тез. докл. - Алматы.. 1993. - 2^- С. 189.

4. Орешников А.В.. Носов А.М., Манаков М.Н. Физиологические особенности культивируемых клеток Dioscorea йеНогйеа Wall, при выращивании в режиме закрытого протока.// Физиология растений. 1994.-41.- N 6. С. 918-922.