Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.)

Доан Тху Тхуй

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.)
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.)"

На правах рукописи

ДОЛИ ТХУ ТХУЙ

ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РЕДКИХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (EUONYMUS NANA Bieb., DIOSCOREA NIPPONICA Makino., DIOSCOREACAUCASIA Lipsky. и ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS Kom.)

Специальность 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005050468

1 •» MAP 2013

Москва-2013

005050468

Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Калашникова Блена Анатольевна

Официальные оппоненты: Аладина Ольга Николаевна •

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет -МСХА имени К.А. Тимирязева», профессор на кафедре плодоводства Васильева Ольга Григорьевна кандидат биологических наук, Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, лаборатория биотехнологии растений, младший научный сотрудник

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита диссертации состоится «13» марта 2013 года в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел/факс: (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «12» февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время сохранение биоразнообразия растений и создание генетических банков in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии, в частности широко применяемый метод клонального микроразмножения, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество растений при недостатке исходного материала, а также получать потомство, генетически идентичное исходному виду или форме. Стратегия сохранения биоразнообразия отражена в различных нормативных документах, таких как «Национальная стратегия по сохранению биоразнообразия России» (2001) и «Стратегия ботанических садов России по сохранению биоразнообразия растений» (2003). Задачами этих программ являются: формирование единого банка данных; инвентаризация редких видов и разработка системы критериев для их выявления и определения уровня их охраны; изучение биологических особенностей редких видов и механизмов действия на них лимитирующих факторов; разработка биологических принципов и способов сохранения редких видов; разработка единых методик работы с редкими и исчезающими видами растений при проведении популяционных исследований, интродукции и культивирования in vitro.

К редким растениям относятся, например, диоскорея ниппонская, диоскорея кавказская, бересклет карликовый, а также кирказон манчьжурский, которые занесены в Красную Книгу РФ. Кроме того, диоскорея является ценной лекарственной культурой, богатой биологически активными веществами, в частности, диосгенином, который накапливается в различных тканях и органах этих растений, и обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость растений к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды и др. Данные культурные растения являются богатством России, которое необходимо сохранять для будущих поколений. Поэтому разработка методологических подходов по сохранению изучаемых видов растений является актуальной проблемой.

Цели и задачи исследования. Целью работы - оптимизация условий культивирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky и Aristolochia manshuriensis Кот. и разработка технологии их клонального микроразмножения.

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи: • отработать методику по получению хорошо растущей стерильной культуры изолированных эксплантов Euonymus папа и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis-,

• оптимизировать состав питательной среды для культирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus папа и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis;

• изучить влияние нетрадиционных регуляторов роста Дропп и Цитодеф, а также препарата Мицефит на морфогенетическую активность изолированных эксплантов;

• изучить влияние условий культивирования на суммарное содержание растворимых фенольных соединений в разных типах пересадочной культуры;

• изучить локализацию фенольных соединений в тканях растений in vivo и in vitro.

Научная новизна работы. Усовершенствована технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ииппонскои и кирказона маньчжурского. Впервые установлены особенности размножения в условиях in vitro исследуемых видов, занесенных в Красную книгу РФ.

Показано, что для бересклета карликового и кирказона маньчжурского размножение осуществляется за счет активации развития существующих меристем, а для диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской - за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов и в пазухе листа.

Впервые изучено влияние нетрадиционных для культуры in vitro регуляторов роста Дропп, Цитодеф и Мицефит на морфогенетическую активность изолированных органов и пересадочной культуры изучаемых видов. Установлено, что присутствие в составе питательной среды препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов или микроклубней, и увеличивало коэффициент размножения. Выявлено, что длительное культивирование микропобегов бересклета карликового на средах, содержащих препарат Мицефит в концентрации 10"6 мг/л, приводило к формированию побегов не только первого порядка, но и побегов второго и третьего порядка, а также активизировался процесс ризогенеза. Для растений диоскореи в этих условиях культивирования формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом.

Впервые на растениях диоскореи ниппонской и кавказской, бересклета карликового и кирказона маньчжурского изучено содержание растворимых фенольных соединений и их локализация в тканях интактных растений, микроклонах и каллусной культуре. Установлены особенности их накопления в зависимости от первичного экспланта и условий культивирования.

Практическая значимость работы. Усовершенствованные технологии клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской

и диоскореи ниппонской могут быть применены для сохранения и создания коллекции in vitro данных видов. Для ускорения процесса размножения in vitro редких, лекарственных и исчезающих растений рекомендуется применять препарат Мицефит в концентрации 10"6 мг/л.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам «Сельскохозяйственная биотехнология», «Основы биотехнологии», «Прикладная биотехнология» для студентов агрономических специальностей.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Особенности размножения в условиях in vitro Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky и Aristolochia manshuriensis Kom.

2. Эффективность применения препаратов Дропп, Цитодеф и Мицефит при клональном микроразмножении изучаемых видов

3. Закономерности в синтезе растворимых фенольных соединений и их локализация в тканях интактных растений, микроклонах и каллусной ткани.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: 11-ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА (Москва. 2011); II Международной школе-конференции молодых ученных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2011); Международной научной конференции молодых ученых РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2012); Юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси» (Минск, 2012); Международной конференции молодых ученых «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов» (Киев, 2012).

Личный вклад автора. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены лично автором на кафедре генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Автор принимал непосредственное участие в разработке программы исследований, планировании и проведении экспериментов по изучению особенностей клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонской и кирказона маньчжурского in vitro. Результаты диссертационной работы обобщены совместно с научным руководителем, д.б.н. Е.А. Калашниковой. Соискателем лично написан литературный обзор и оформлена диссертационная работа.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 2 в журналах из списка ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов и библиографического списка. Общий объем рукописи 135 стр., содержит 15 таблиц, 52 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 203 источника, в том числе 135 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на кафедре генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в период с 2010 по 2013 г.

Материалом для работы служили растения бересклета карликового (.Euonymus nana Bieb.), диоскореи ниппонской (Dioscorea rtipponica Makino.), диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia Lipsky.) и кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Кош.), пересаженные из природных условий на участок редких и исчезающих растений Главного ботанического сада РАН (Москва). В качестве эксплантов использовали боковые и верхушечные почки, листовые пластинки, многолетние клубни (диоскорея) и семена (диоскорея и кирказон).

Стерилизацию растительных эксплантов проводили по схеме: 1) обработка КМп04 - 20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы - 7 мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой.

Для индукции образования пазушных побегов, адвентивных почек и микроклубней первичные экспланты культивировали на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасиге и Скуга, а также различные вещества с цитокининовой и ауксиновой активностью. В качестве цитокининов изучали влияние БАП, 2ip, кинетина в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/л, а также препаратов Дропп (0,01-1,0 мг/л) и Цитодеф (0,01-1,0 мг/л), и препарата Мицефит (10"4 - 10"7 мг/л). Из веществ с ауксиновой активностью изучали влияние НУК (0,5-1,0 мг/л), ИМК (1-7 мг/л), ИУК (1-7 мг/л) и 2,4-Д. Препарат Мицефит во всех экспериментах добавляли в питательную среду после ее автоклавирования. Стерильный раствор препарата Мицефит получали путем пропускания его через стерильный фильтр с диаметром пор 0,45мц. В экспериментах испытание препарата Мицефит проводили отдельно, а также в сочетании с регуляторами роста БАП, 2ip и Дропп. Уровень pH питательной среды доводили до 5,7 - 6,0.

Экспланты культивировали при температуре 24°С, 16-ти часовом фотопериоде, при освещении белыми люминесцентными лампами интенсивностью 3 тыс. лк.

Для укоренения микропобегов использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 1Л нормы макросолей, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, а так же ИУК в концентрации 1 мг/л.

Адаптацию растений проводили в контейнерах, содержащих проавтоклавированный субстрат.

Биохимические и морфофизиологические исследования.

Определение суммы растворимых фенольных соединений в интактных растениях, микроклонах, микроклубнях и каллусных культурах проводили по методике М.Н. Запрометова (1971, 1993). Клетки растений или каллусную ткань экстрагировали 96%-ным этанолом в течение 1 часа. Для определения содержания суммы растворимых фенольных соединений к 0,5 мл этанольного экстракта в мерной пробирке добавляли 3 мл дистиллированной воды и перемешивали. После этого прибавляли 0,5 мл реактива Фолина-Дениса, перемешивали и через 3 мин приливали 1 мл насыщенного раствора соды, и доводили общий объем до 10 мл дистиллированной водой. Через 1 час определяли содержание суммы соединений при длине волны 725 нм на спектрофотометре.

Содержание флаванов определяли с 1%-ным раствором ванилина в 70% серной кислоте при 500 нм (Swain, Hillis, 1959; Запрометов, 1971). Калибровочные кривые строили по (-)-эпикатехину.

Содержание флавонолов определяли по реакции с 1%-ным водным раствором А1С13 с последующим спектрометрированием при 415 нм (Gage, Wendei,1950). Калибровочную кривую строили по рутину.

Для определения тканевой локализации фенольных соединений использовали 0,08% раствор реактива «Fast- Blue» в фосфатном буфере (pH = 6,5) и 0,01% ванилиновый реактив в хлороформе (Soukurova,2000; Приступа и др., 1970; Зайцева, 2007). Препараты анализировали при помощи светового микроскопа Carl Zesis (Германия) и фотодокументировали.

Статическая обработка данных. Математическая обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики (Доспехов,1985; Смиряев, Кильчевский, 2007).

Дисперсионный анализ проведен с использованием программы MS ECXEL.

Эксперименты проводили в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях. На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской и ниппонской и кирказона маньчжурского

В работе использовали следующие приемы клонального микроразмножения: 1) активация развития существующих в растении меристем; 2) индукция образования адвентивных почек из тканей первичного экспланта; 3) регенерация растений из каллусной ткани. Изучали влияние

традиционных для культуры in vitro регуляторов роста (БАЛ, 2ip, ИУК, НУК) на изучаемые морфогенетические процессы на всех этапах клонального микроразмножения.

1. Бересклет карликовый (Euonvmus nana Bieb.)

На первом этапе микроразмножения необходимо было отработать методику по получению хорошо растущей стерильной культуры. Экспериментально нами установлено, что оптимальным режимом стерилизации оказалась ступенчатая стерилизация: 1) обработка КМп04 - 20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы -7 мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой. При этом максимальное число жизнеспособных эксплантов составило 78%, минимальное число инфицированных - 12% и некротизированных эксплантов - 10%. В остальных вариантах число жизнеспособных эксплантов было незначительным и составило в среднем от 5 до 23%.

Известно, что коэффициент размножения, а также морфометрические показатели сформировавшихся побегов находятся под контролем гормонального состава питательной среды. Нами установлено, что присутствие в составе среды БАП в концентрации 1 мг/л в сочетании с НУК 0,5 мг/л приводило к формированию в среднем от 2 до 3 побегов на один эксплант, которые характеризовались активным ростом, в то время как в других вариантах эти учитываемые показатели не превышали 1,5-2,3 и 1,2 - 1,5 см, соответственно (Рис. 1).

Рис.1 Влияние гормонального состава питательной среды на морфометрические показатели

микропобегов

1юг/лБАГН 1 мг/л БАП + 1мг/л21р + 1*г/л21р + 0,5 мг/л НУК 1,0 Мг/л НУК 0,5глг/лНУН 1,0мг/лНУК

Дальнейшее культивирование микропобегов бересклета на оптимальной среде приводило к стабильному формированию хорошо растущих побегов и среднему коэффициенту размножения.

Другой используемый прием клонального микроразмножения - индукция образования адвентивных почек из тканей первичного экспланта. В нашем опыте в качестве первичного экспланта была взята листовая пластинка, изолированная с растений in vitro. Экспериментально установлено, что сочетание кинетина (0,2 мг/л) с НУК (4 мг/л) приводило к прямой регенерации

растений из тканей листа. Причем в этом варианте учитываемый показатель был максимальный и составил 45,6% (Табл.1).

Таблица 1

Влияние гормонального состава питательной среды на регенераионный потенциал изолированных листьев бересклета карликового_

Варианты сред Образование адвентивных почек, %

4 мг/л НУК+ 2 мг/л Кинетин 0

1 мг/л НУК + 0,5 мг/л БАП 0

2 мг/л НУК+ 0,5 мг/л БАП 8,2 ± 0,4

0,2 мг/л Кинетин + 4 мг/л 2.4-Д 0

0,2 мг/л Кинетин + 4 мг/л НУК 45,6 ±2,1

2 мг/л НУК + 0,2 мг/л Кинетин + 2 мг/л 2,4 Д 12,5 ± 0,5

Сформировавшиеся побеги (после 6 пассажей) в дальнейшем укореняли и переносили для адаптации в условия нестерильной культуры. Приживаемость растений составляла в среднем 86-92%.

2. Диоскорея кавказская (Dioscorea caucasica Lipskv) и диоскорея ниппонская (Dioscorea nipponica Making')

В работе в качестве исходного материала были взяты растения in vitro, с которых изолировали сегменты стебля с одной или двумя пазушными почками, листовые пластинки, а также в качестве эксплантов изучали семена и изолированные зародыши. Экспланты культивировали на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей различные концентрации 2,4—Д, кинетина, БАП, НУК, сахарозу и агар. Установлено, что у обоих изучаемых в работе видов диоскореи процесс клонального микроразмножения осуществляется за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов или в пазухе листа, которые в дальнейшем использовали для клонирования. Причем формирование микроклубней происходило более интенсивно у диоскореи ниппонской по сравнению с диоскореей кавказской (Рис. 2), для которой не характерно в условиях in vivo формирование воздушных корней. Наилучшей была среда, содержащая 2ip 1 мг/л в сочетании

Рис. 2 Влияние состава питательной среды на

морфометрические показатели

диоскореи кавказской и ниппонской in vitro

с НУК 1 мг/л.

1мг л2ф+'1мг ЛБАП+ 1мг л2 ip+ 1мг лБАД+ 1.0мг л НУК1.0 мг л HVK1,0мг л HVK1,0 мг л НУК

□Ср.количество микроклубней в основании,шт □Ср.количестсо воздушных микроклубней,шт

Дпосквреякавкянкяя Диогк ор ея ниппонская

В дальнейшем полученные микроклоны переносили на среды для укоренения с ИУК или ИМК. Установлено, что присутствие в составе питательной среды ИУК в концентрации 3-5 мг/л приводило к формированию в 95% случаях хорошо развитой корневой системы. Это позволило микрорастениям хорошо переносить адаптацию к нестерильным условиям выращивания.

Поскольку диоскорея относится к исчезающим видам и имеет ограниченный ареал распространения в природе, то большое практическое значение приобретает получение ей каллусных и суспензионных культур, как возможных источников биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Для инициации каллусных культур использовали изолированные зародыши, сегменты стебелей и листьев, а также фрагменты клубней, полученные с растений диоскореи кавказской и ниппонской in vitro и in vivo.

Установлено, что процесс каллусогенеза зависит от типа первичного экспланта и гормонального состава питательной среды. Так, каллусная ткань, полученная из изолированных зародышей, характеризовалась плотной консистенцией и имела белый или светло-желтый цвет. Причем на среде, содержащей 2,4-Д, этот процесс происходил с максимальной интенсивностью. При последующих пассажах пролиферативная активность каллусных клеток не снижалась.

Иная картина наблюдалась при использовании в качестве первичного экспланта изолированных сегментов клубней. В этих вариантах формирование каллусной ткани происходило в местах поранения и, в частности, в периферийной зоне экспланта. Каллусная ткань была средней консистенции и состояла из глобулярных структур, которые имели светло-зеленую окраску. Присутствие в составе питательной среде 2,4-Д и кинетина в концентрации 1 мг/л и 0,1 мг/л, соответственно, приводило к более интенсивному формированию каллусной ткани по сравнению со средой, содержащей 2,4-Д. Отмечено, что при использовании в качестве первичного экспланта сегментов, изолированных с клубней in vivo, формирование каллусной ткани происходило в 5 % случаев, в то время как при использовании сегментов, полученных из клубней in vitro, учитываемый показатель составил 72%. Возможно, это связано с накоплением в первичных эксплантах фенольных соединений.

При культивировании изолированных сегментов стеблей и листьев формирование каллусной ткани не было отмечено нами ни в одном из испытанных вариантов сред.

3. Кирказон маньчжурский (Aristolochia manshuriensis Кот.)

Как и в предыдущих исследованиях с растениями диоскореи и бересклета для кирказона маньчжурского были изучены условия культивирования изолированных эксплантов на разных этапах клонального микроразмножения.

На первом этапе установлено, что оптимальным режимом стерилизации оказалась ступенчатая стерилизация: 1) обработка КМп04 - 20 минут; 2) промывка дистиллированной водой; 3) стерилизация в 0,1% растворе сулемы -7 мин; 4) промывка стерильной дистиллированной водой. При этом максимальное число жизнеспособных эксплантов составило 30%, минимальное числе инфицированных - 12% и некротизированных эксплантов - 58%. В остальных вариантах число жизнеспособных эксплантов было незначительным и составило 1 -10%.

Нами установлено, что наиболее эффективным способом размножения кирказона маньчжурского в условиях in vitro оказался способ, основанный на активации развития существующих меристем (пазушных почек). Экспериментально показано, что при культивировании микрочеренков на среде, содержащей 0,5 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК, наблюдалось наилучшее формирование микропобегов из пазушных почек. Такие микропобеги характеризовались быстрым ростом, правильной морфологией листа, а также были ярко-зеленого цвета. В базальной части микрочеренков наблюдали формирование рыхлой каллусной ткани желтого цвета, которая, вероятно, ингибировала развитие корневой системы. Кроме того, во всех вариантах отмечалось побурение среды, вероятно, из-за выделения фенольных соединений, несмотря на присутствие в ее составе активированного угля. Поэтому через 2-3 пассажа сформировавшиеся микропобеги погибали. Все это свидетельствовало о том, что в отличие от растений бересклета и диоскореи, для растений кирказона необходимо проводить более детальные исследования.

В другой серии экспериментов с кирказоном маньчжурским был изучен морфогенетический потенциал изолированных зародышей, так как известно, что изолированные ткани и органы растений, находящиеся в ювенильной стадии развития, обладают большей морфогенетической активностью. Исследования показали, что не более 10% изолированных зародышей обладали жизнеспособностью, которая проявлялась лишь в раскрытии семядольных листьев. Развития гипокотиля и корневой системы не наблюдали. При дальнейшем культивировании таких зародышей формирование проростка не происходило из-за его последующей гибели.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами были подобраны условия культивирования изолированных эксплантов, обеспечивающие клонирование бересклета карликового, диоскореи кавказской и ниппонской, а также кирказона маньчжурского. Однако полученные результаты свидетельствуют о невысоком коэффициенте размножения требуют проведения дополнительных исследований.

Изучение влияния нетрадиционных регуляторов роста на морфогенетическую активность изолированных эксплантов и пересадочной культуры бересклета, диоскореи и кирказона.

Существующие для травянистых растений традиционные методы клонального микроразмножения нельзя применять без серьезных корректировок для древесных пород. При размножении древесных растений in vitro встречается множество трудностей на всех этапах микроразмножения, начиная с получения стерильной культуры эксплантов, дальнейшего размножения и кончая этапом укоренения. Для кустарниковых пород, в частности, для бересклета карликового (Euonymus nana Bieb.) и многолетних лиан - диоскореи кавказской (Dioscorea caucasica Lipsky), диоскореи ниппонской (Dioscorea nipponica Makino) и кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Кот.) указанные трудности значительно усиливаются.

Формообразовательные процессы в условиях in vitro происходят при наличии в составе питательной среды биологически активных веществ, таких как регуляторы роста, аминокислоты, растительные экстракты и др. Однако применение традиционных, широко используемых в культуре веществ не всегда приводит к получению положительного результата. Поэтому поиск или создание новых отечественных высокоэффективных нетоксичных регуляторов роста остается актуальной проблемой в целом для сельского хозяйства, и для биотехнологии растений, в частности.

К таким веществам относится препарат Мицефит, а также вещества с цитокининовой активностью Дропп и Цитодеф.

Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на клональное микроразмножение бересклета, диоскореи и кирказона.

2. Бересклет карликовый (Euonymus nana Bieb.)

Экспериментально установлено, что оптимальной средой на первом этапе клонального микроразмножения бересклета карликового была среда, содержащая препарат Цитодеф в изучаемых концентрациях (Табл. 2). В этих условиях наблюдали формирование на одном экспланте от 3 до 5 шт. побегов, которые развивались из существующих меристем первого и второго порядка, средняя высота которых составляла 2,3-2,5 см. (Рис. 3 а, б).

В вариантах, в состав которых входил 2ip развитие побегов второго порядка нами не было отмечено. Как правило, побеги формировались из существующих меристем первичного экспланта, и средняя высота этих побегов не превышала 2 см. (Рис. 3 в). В основании побега было отмечено формирование каллусной ткани средней интенсивности.

Таблица 2

Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов бересклета карликового на этане введения в культуру in vitro Варианты '"—------------ - -

2iP 1,0 мг/л

Дропп 0,5 мг/л

Дропп 1,0 мг/л

Цитодеф 0,5-мг/л

Цитодеф 1,0 мг/л

Количество побегов на 1 эксплант,

2,3 ± 0,3

12,1 ±2,4

18,3 ±3,0

3,6 ± 0,2

4,1 ±0,5

Высота побегов, см

1,9 ±0,1

0,1±0

0,3 ±0,1

2,3 ± 0,2

2,5 ± 0,3

Формирование каллусной ткани

±*

Примечание:«+» сильное образование каллусной ткани; «±» среднее образование каллусной ткани; «-» отсутствие образования каллусной ткани.

Особо следует отметить вариант питательной среды, в состав которой входил препарат Дропп. Уже на 14 сутки с начала культивирования было отмечено сильное формирование каллусной ткани не только в основании экспланта, но и по всей поверхности сегментов стебля, клетки которого из дифференцированного состояния переходили в дедифференцированное. Следует отметить, что сформировавшаяся каллусная ткань отличалась позеленением на свету и имела плотную консистентность. Кроме того, в хорошо пролиферирующей каллусной ткани под действием препарата Дропп наблюдали массовое образование адвентивных почек, среднее число которых составило от 12 до 19 шт. на один эксплант (Рис. 3 г, д). Развитие адвентивных почек происходило медленно, и лишь через 4 недели было отмечено формирование укороченных побегов, размер которых не превышал 3 мм.

Таким образом, проведенные исследования позволили заключить, что на первом этапе клонального микроразмножения с целью формирования хорошо растущих побегов целесообразно включать в состав питательной среды препарат Цитодеф в концентрациях 0,5 - 1,0 мг/л, а для увеличения коэффициента размножения - Дропп 0,5 - 1,0 мг/л. Однако, данные концентрации приводили к незначительному росту побегов, что, вероятно, связано с применением данных препаратов в очень высоких концентрациях. Исходя из литературных данных, исследуемые препараты применяются в более низких концентрациях, таких как 0,0001-0,01 мг/л. Поэтому в своей дальнейшей работе - на этапе микроразмножения - мы исследовали влияние препаратов Дропп и Цитодеф в концентрациях 0,01 мг/л.

Экспериментально установлено, что именно в низких концентрациях исследуемые препараты оказывали существенное влияние на индукцию образования адвентивных почек, их дальнейший рост и формирование хорошо развитых побегов (Рис. 4) по сравнению с контрольным вариантом. Кроме того, в этих вариантах наблюдали высокий коэффициент размножения, который

составлял 12-26 растений с одного экспланта, в то время как в контрольном варианте этот учитываемый показатель составил 9.

Таким образом, установлено, что присутствие в составе питательной среды нетрадиционных для культуры in vitro препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов и увеличивало коэффициент размножения.

Экспериментально нами было показано, что сформировавшиеся побеги не были способны образовывать корни в процессе микроразмножения. Поэтому в следующей серии экспериментов нами было изучено влияние веществ ауксинового типа действия (ИУК и ИМК) на процесс ризогенеза. Причем, действие данных гормонов было изучено на фоне постоянного присутствия в питательной среде препарата Дропп в концентрации 0,01 мг/л. Установлено, что рекомендуемые в литературе для корнеобразования ауксины в наших экспериментах не оказали положительного действия, поэтому поиск новых методологических подходов и стимуляторов корнеобразования остается актуальной проблемой для бересклета.

2. Диоскорея кавказская (Dioscorea caucasica Lipskvl и диоскорея ниппонская (Dioscorea nivvomca Making)

Исследования показали, что гормональный состав питательной среды приводил к изменению морфофизиологических процессов, которые проявлялись: 1) в формировании каллусной ткани в основании первичного экспланта с одновременной регенерацией растений; 2) в индукции развития существующих в растении меристем; 3) в формировании микроклубней de novo.

Экспериментально установлено, что для диоскореи ниппонской и диоскореи кавказской из всех изучаемых цитокининов наибольшей стимулирующей активностью индуцировать образование клубней и побегов обладал препарат Дропп. В этих вариантах учитываемый показатель находился в пределах 3-4 шт., в то время как в вариантах с присутствием в питательной среде 2ip (контрольный вариант) или препарата Цитодеф частота образования клубней в среднем составила 1-2 шт. на один эксплант. Показано, что с увеличением концентрации препаратов в питательной среде (с 0,5 до 1,0 мг/л во всех вариантах) коэффициент размножения увеличивался, однако при этом наблюдали формирование мелких клубней и небольших по размеру побегов.

Наши исследования подтверждают данные, полученные ранее другими авторами (Чулафич, 1991; Грубишич и др., 1993; Орешников и др., 1994), что именно гормональный состав питательной среды оказывает существенное влияние на процесс формирования микроклубней, который зависит от исследуемого генотипа. Так, для диоскореи ниппонской было характерно формирование микроклубней двух типов: 1) у основания стебля, 2) воздушные

клубни в пазухе листьев, в то время как у диоскореи кавказской формирование микроклубней, как правило, происходило у основания побега.

В исследованиях с диоскореей кавказской и диоскореей ниппонской были установлены некоторые закономерности: 1) из двух изучаемых видов наибольшей морфогенетической активностью обладала диоскорея кавказская, для которой было характерно во всех изучаемых вариантах образование от 2 до 4 шт. клубней, от 7 до 9 шт. корней, высота растений составила в среднем 5,7 см; 2) формирование клубней происходило в 97,3% случаев в основании побега; 3) коэффициент размножения зависел от исследуемого генотипа и гормонального состава питательной среды (Рис. 5).

Дропп Дролп Цитодеф Цитодеф 0,5 мг/л 1,0 мг/ л 0,5 мг/л 1,0мг/л

Ср. количество микроклубней, агг О ср. количество побегов, шт Я Ср. количество корней, ил

21Р 1,0 Дропп Дропп 1,0 Цитодеф Цитодеф мг/л 0,5 мг/л мг/л 0,5 мг/ п 1,0мг/л

Ср. количество микроклубней, шт □ Ср. количество побегов, шт * ср. количество корней, шт

а б

Рис. 5 Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на морфометрические показатели растений диоскореи кавказской (а) и диоскореи ниппонской (б) in vitro

Однако исследования, проведенные на протяжении 5 месяцев культивирования, показали, что в процессе выращивания в условиях in vitro скорость формирования хорошо развитых побегов существенно уменьшалась, что проявлялось не только на высоте растений, но и на размерах индуцированных микроклубней, которые не превышали 1-2 мм по диаметру (Рис. 6). Поэтому в последующих экспериментах данные препараты были изучены в концентрации 0,01 мг/л.

Нами экспериментально и статистически доказано, что уменьшение концентрации препаратов Цитодеф и Дропп до концентрации 0,01 мг/л в питательной среде оказывает существенное положительное влияние на рост побегов и формирование микроклубней на протяжении длительного культивирования in vitro, причем концентрация 0,01 мг/л препарат Дропп была оптимальной для учитываемых показателей (Рис. 6), так как в этом

а б в г д

Рис. 3 Формирование пазушных и адвентнвных почек на среде МС, содержащей различные цитокинины: а - Цитодеф 0,5 мг/л, б - Цитодеф 1,0 мг/л, в - 2ip 1,0 мг/л (контроль), г - Дропп 0,5 мг/л, д - Дропн 1,0 мг/л

Рис. 4 Формирование побегов бересклета карликового на среде, содержащей 21р (а) - контроль, препарат Дропп (б), препарат Цитодеф

(в)

Рис. 7 Формирование пазушных побегов на среде с БАП (а), Дропп (б) и Цитодеф (в)

культивирования

а б в г

Рис. 6 Формирование микроклубней на среде, содержащей препарат Цитодеф 1,0 мг/л (а) и 0,01 мг/л (б) и препарат Дропп 1,0 мг/л (в) и 0,01 мг/л (г) после 6 месяцев

варианте формировались более крупные клубни, и они имели правильную морфологию.

Таким образом, для получения стабильного коэффициента размножения и формирования растений с правильной морфологией целесообразно в питательную среду в качестве цитокинина добавлять препарат Дропп в концентрации 0,01 мг/л.

Известно, что формирование клубней находится под контролем ауксинов. Поэтому представляло интерес изучить влияние этих гормонов на индукцию образования микроклубней de novo в условиях in vitro. В работе испытывали ИУК и ИМК в различных концентрациях (3-7 мг/л) в сочетании с препаратом Дропп 0,01 мг/л. Полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие в составе питательной среды ауксинов ИУК или ИМК повышало процесс ризогенеза и клубнеобразования. Однако, ИУК оказывала больший стимулирующий эффект на учитываемые процессы по сравнению с ИМК. Были выявлены некоторые закономерности: 1) с увеличением концентрации изучаемых ауксинов в питательной среде до 7 мг/л повышалась способность эксплантов формировать микроклубни; 2) при концентрации ауксинов 1 мг/л наблюдали минимальное формирование микроклубней как в основании побега, так и в пазухе листа; 3) присутствие в питательной среде ИУК и ИМК не оказывало влияние на частоту формирования воздушных микроклубней в пазухе листьев и у основания стебля.

Таким образом, на последнем этапе клонального микроразмножения диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской целесообразно включать в состав питательной среды ИУК или ИМК в концентрациях 1 - 5 мг/л с целью увеличения коэффициента размножения и укоренения микропобегов.

3. Кирказон маньчжурский (Aristolochia manshuriensis KoirO

Исследования показали, что препараты Дропп и Цитодеф в изучаемых концентрациях не оказывали существенного влияния на активацию развития пазушных почек. В тестируемых вариантах наилучшее формирование побегов было отмечено лишь в варианте с Дропп 0,01 мг/л. Несмотря на это, в контрольном варианте (БАП 0,5 мг/л в сочетании с ИУК 0,5 мг/л) наблюдали интенсивный рост пазушных меристем и формирование хорошо развитых побегов (Рис. 7).

Таким образом, в отличие от бересклета и диоскореи, для которых наилучшей средой была среда, содержащая препарат Дропп (0,01 мг/л), для кирказона маньчжурского оптимальным цитокинином был БАП 0,5 мг/л.

Влияние препарата Мицефит на клональное микроразмножение бересклета карликового, диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской

Препарат Мицефит получен в ОАО "Биохиммаш" и разработан на основе микоризных грибов, выделенных из корней багульника, штамм Phialocephala fortinii F-833.

1. Бересклет карликовый (Euonvmus nana BietO

Экспериментально установлено, что присутствие в составе питательной среды препарата Мицефит в разных концентрациях в сочетании с различными цитокининами оказывает неодинаковое влияние на процессы морфогенеза, в частности на образование микропобегов, их рост и формирование корневой системы.

Установлено, что сочетание цитокининов с препаратом Мицефит в различных концентрациях не оказывает существенного влияния на процессы формирования побегов de novo. Учитываемый показатель во всех вариантах находился на уровне контроля. Исключение составили лишь варианты, с Мицефитом в концентрации 10"7 мг/л, в которых количество побегов на один эксплант было ниже, чем в контроле.

Визуальные наблюдения и биометрические измерения показали, что скорость формирования адвентивных побегов зависела от применяемых цитокининов (Табл. 3).

Таблица 3

Влияние препарата Мицефит на морфогенетическую реакцию микропобегов бересклета карликового in vitro

Варианты Кол-во побегов на 1 эксплант, шт Высота побегов, см Кол-во укоренившихся побегов, % Кол-во корней на 1 растение, шт

БАП 1 мг/л (контроль) 5,6±0,5 2,2±0,1 0 0

БАП + Мицефит 10'7 мг/л 4,5± 0,3 l,9i01 0 0

БАП+ Мицефит 10"® мг/л 4,91 0,5 1,810,1 0 0

2ip 1 мг/л (контроль) 2,0t0,2 1,710,1 0 0

21р+ Мицефит 10"' мг/л 1,4±0,1 1,91 ОД 5,610,5 3,110,3

21р + Мицефит Ю"4 мг/л 1,710,1 1,810,1 0 0

Дропп 0,01 мг/л (контроль) 3,5±03 1,410,1 0 0

Дропп+ Мицефит 10'7 мг/л 1,9±0,2 2,110,1 12,511,2 3,310,2

Дропп+ Мицефит 10"" мг/л 2,410,2 2,010,2 29,411,7 5,310,2

Так, в вариантах с сочетанием БАП и препаратам Мицефит высота побегов была ниже контроля, в варианте с Ир и Мицефитом - на уровне контроля, а в варианте с Дропп и Мицефитом - выше контрольного варианта. Что касается укореняемости микропобегов, то данная ответная реакция не была нами отмечена в вариантах с БАП и Ир. Эффект применения Мицефита усиливался лишь при его совместном применении с препаратом Дропп. Проявление ауксинового эффекта объясняется тем, что в состав препарата Мицефит входят ауксины, в частности ИУК, примерно 0,00005%, а также янтарная кислота 3,158% (Синчурина, 2011), которая применяется при зеленом черенковании растений.

Дальнейшее культивирование микропобегов в течении 4 месяцев на средах, содержащих препарат Мицефит в различных концентрациях, особенно в сочетании с препаратом Дропп, оказывало стимулирующее действие на формирование хорошо развитой корневой системы.

Таким образом, препарат Мицефит оказался эффективным препаратом при клональном микроразмножении бересклета карликового.

2. Диоскооея кавказская (Ршсогеа саисаэка ЫрБкуЛ и диоскорея ниппонская (Рю.чсогеа пшротса Макто)

В результате проведенных исследований было сделано заключение, что присутствие в составе питательной среды препарата Мицефит в различных концентрациях приводило к повышению морфогенетической активности культивируемых эксплантов: усиливается рост растений в высоту и стимулируется укореняемость побегов по сравнению с контрольным вариантом.

Более того, наблюдали формирование воздушных микроклубней и микроклубней в основании побегов. Следует отметить, что скорость формирования микроклубней находилась в прямой зависимости от наличия Мицефита в питательной среде. Так, в этих вариантах формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом, а именно, в варианте с Мицефитом через 2 месяца, а в контрольном варианте - через 4-5 месяцев в зависимости от исследуемого вида. Можно предположить, что такое стимулирующее действие препарат Мицефит проявляет благодаря высокому содержанию в его составе углеводов (75,1%), из которых на долю сахарозы приходится 17,8%, глюкозы - 37,6% (Синчурина, 2011). Хорошо известно, что именно сочетание высоких концентраций углеводов с ауксинами приводит к индукции образования микроклубней и их дальнейшему росту.

Вместе с тем следует отметить, что результативность действия препарата Мицефит связана именно с наличием в его составе комплекса веществ, обладающих стимулирующим действием, например, гормонов роста (ауксины, цитокинины, гибберелловая кислота), аминокислот (глютаминовая кислота, глицин, цистеин, валин, лейцин), а также присутствием таких кислот, как янтарная, фумаровая, фосфорная, гликолевая и др.

Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в интактных растениях и в микроклонах. Одной из задач диссертационной работы было выяснение особенностей накопления соединений фенольной природы (суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и флавонолов) в различных органах интактных растений бересклета, кирказона и диоскореи. Экспериментально установлено, что исследуемые в работе виды растений обладают разной способностью к синтезу фенольных соединений. Так, в растениях диоскореи кавказской образование полифенолов было в 1,5-2 раза

выше, чем в растениях диоскореи ниппонской, а для растений бересклета карликового отмечалось существенное снижение количественного содержания соединений фенольной природы (в 2 - 3,5 раза) по отношению к другим исследуемым видам. Что касается кирказона маньчжурского, то для данной культуры количественный показатель растворимых фенольных соединений занимал промежуточное положение (Рис. 8). Аналогичные закономерности были отмечены и при определении флаванов и флавонолов (флавоноидов), которые в зеленых тканях растений являются наиболее распространенными полифенолами (Запрометов, 1993, Chattopadhyay, 1999, 2000). При анализе корневищ диоскореи кавказской было установлено, что максимальное количество полифенолов накапливается в многолетних корневищах (Рис. 9), в то время как для растений бересклета и кирказона их уровень был самым высоким в надземных частях растений (особенно в листьях). Полученные нами существенные отличия в накоплении фенольных соединений у различных видов растений и в разных органах согласуются с данными других исследователей (Запрометов, 1964; Ishikura, 1976; Juntheikki, 2000,Wagner, 2003).__

■ Сушзрко« содержание растворимых Фенолыммедаиений, мг/r сырой массы ЕФлаеаны,мг/г сырой массы

ОФйавонолы,мг/г сырой массы

□Суммарное содержание растворимых фенольных соединений мг/г сырой массы

дфлаванымг/гсырой массы

молодые корневкщн старые корневнщи

Рис. 8 Содержание растворимых фенольных Рис. 9 Содержание растворимых соединений в интактных растениях фенольных соединений в корневищах диоскореи, бересклета и кирказона интакных растений диоскореи

В следующей серии эксперимента был изучен количественный состав растворимых фенольных соединений в микроклонах диоскореи, кирказона и бересклета. Экспериментально установлено, что клеточные культуры сохраняют способность к синтезу фенольных соединений, характерную для интактных растений. Однако данный учитываемый показатель был значительно ниже по сравнению с исходными тканями интактных растений. Вероятно, это связано с тем, что в процессе культивирования микропобегов в условиях in vitro уменьшается выделение фенолов в питательную среду, что снижает их ингибирующее действие на ткани культивируемых эксплантов. Кроме того,

ранее многими авторами было показано, что присутствие в составе питательной среды различных регуляторов роста оказывает определенное влияние на способность культур in vitro к синтезу полифенолов (Загоскина, 2009). В наших экспериментах было установлено, что существенное увеличение биосинтеза полифенолов наблюдается в микроклонах, полученных на питательных средах, содержащих препарат Дропп в концентрации 0,01 мг/л (Рис. 10, 11), а также сочетание его с препаратом Мицефит (10"6 мг/л) (Рис. 12 )._

QCyawejwoe содержание рхт&ржья £гншнш соединений w/r сырой

M2KW

В Флананы мг/г сырой массы

ОФлавокалы мг/г сырей икал

мщинж вдац»мк U12P.IK« t>m&im адщиюк (цнынж Дцоскорея кавкаггкая Дшгореяшлвоипйй

0 Суммарное (одержан»? рзггюриаых феяатлык

соедмкюй м/i сирой шсы

0,01 Д» 0,0114+1 |l)2iP+ 0ДЦ+ 0,011|+ |1}2JP+ 1НУК НУК 1НУК 1HVK 1НУК 1НУК

Дивгсертекявшпгпя Дпоскореянгашшпя

Рис. 10 Содержание растворимых фенольиых соединений в

микроклубнях диоскореи in vitro

Рис. 11 Содержание растворимых фенольных соединений в корнях диоскореи in vitro

□ Суммарно« содержание раствори мы к фенольных соединений мг/rсырой массы

■ флавэны мг/г сырой

D Флавонолы мг/г сырей

Рис. 12 Содержание растворимых фенольных соединений в микроклонах бересклета карликового

Именно в этих вариантах микроклоны характеризовались интенсивным ростом и формированием мощной надземной биомассы, в последнем случае -

адвентивных корней. Для микроклонов бересклета максимальное накопление фенольных соединений было отмечено в листьях, в то время как у диоскореии их было больше в микроклубнях, также как и у интактного растения. Это согласуется с данными других исследователей, показавших, что клеточные культуры сохраняют способность к синтезу вторичных соединений, характерных для интактных тканей, однако учитываемый показатель в микроклонах ниже, чем у исходных тканей (Носов, 1991, ВЫзпц», 1998).

Локализация растворимых фенольных соединений в интактных растениях, микроклонах и каллусных культурах (диоскореи, бересклета и кирказона). Растениям родов Оюясогеа Ь., Еиопутш Ь., АпвМосЫа Ь. присуще образование разнообразных низкомолекулярных соединений. Для определения внутритканевой локализации фенольных соединений в работе использовали корневищные клубни, молодые побеги и листья, микроклоны и каллусные культуры данных растений (Рис. 13).

Рис. 13 Локализация фенольных соединений: А - в железистом волоске листа бересклета; Б - в корневищных клубнях диоскореи; В - в побеге кирказона; Г - в каллусных культурах бересклета; Д - в каллусных культурах кирказона; Е - в железистых волосках листа бересклета с экскретом, выделенным под кутикулу (А, Б, В, Е - реакция на флавоны (с ванилиновым реактивом), Г, Д - реакция на сумму растворимых фенольных соединений (с реактивом Fast Blue)

Специфические гистохимические реакции позволили обнаружить эти вещества в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях как интактных растений, так и микроклонов (Рис. 13). Полифенолы в них локализуются в клеточных стенках, межклетниках и в специализированных фенолзапасающих эпибластах, дающих положительную реакцию на сумму растворимых фенольных соединений (с реактивом Fast Blue) и на флаваны (с ванилиновым

реактивом). Кроме того, феиольиые соединения выявлены в клетках покровных и запасающих тканей.

В каллусных культурах полифенолы были также обнаружены в цитоплазме, вакуолях, реже - в межклетниках.

выводы

1. Усовершенствована технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонской и кирказона маньчжурского. Показано, что для бересклета карликового и кирказона маньчжурского размножение осуществляется за счет активации развития существующих меристем, а для диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской - за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов и в пазухе листа.

2. Впервые изучено влияние нетрадиционных для культуры in vitro регуляторов роста Дропп, Цитодеф и Мицефит на морфогенетическую активность изолированных органов и пересадочной культуры изучаемых видов. Присутствие в составе питательной среды препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов или микроклубней, и увеличивало коэффициент размножения.

3. Выявлено, что длительное культивирование микропобегов бересклета карликового на средах, содержащих препарат Мицефит в концентрации 10 мг/л, приводило к формированию побегов не только первого порядка, но и побегов второго и третьего порядков, а также активизировало процесс ризогенеза. Для растений диоскореи в этих условиях культивирования формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом.

4. Впервые изучено содержание растворимых фенольных соединений, а также флавоноидов у представителей диоскореи, кирказона и бересклета и показано, что растения диоскореи характеризуются более высокой способностью к синтезу фенольных соединений, чем растения бересклета и кирказона. Это проявляется как на уровне суммарного накопления фенольных соединений, так и на процентном соотношении различных классов растворимых фенольных соединений (флаваны и флавонолы). Наибольшее содержание фенольных соединений, в том числе флавонолов и флаванов отмечено в листьях растений, а наименьшее - в корнях, за исключением корневищ диоскореи.

5. Установлено, что фенольные соединения (ФС) в интактных растениях и микроклонах локализуются в эпидермальных и паренхимных тканях, а также в клетках сосудисто-проводящих пучков и замыкающих клетках устьиц, клеточных стенках в межклетниках. Однако в микропобегах локализация ФС

происходит менее интенсивно, что связано с их меньшим содержанием в тканях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Доан, Тху Тхуи. Клональное микроразмножение бересклета карликового (Euonymus nana Bieb) / Е.А. Калашникова, Доан Тху Тхуи, О.И. Молканова // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ /ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии. - Москва, 2011. - Т. XXVI. - С. 244-249

2. Доан, Тху Тхуи. Клональное микроразмножение редких и исчезающих видов растений / Е.А. Калашникова, Доан Тху Тхуи, О.И. Молканова // Известия ТСХА. 2012. - № 5, - С. 48-52

3. Доан, Тху Тхуи. Влияние ауксинов на образование микроклубней диоскореи ниппоской и диоскореи кавказской in vitro / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова // Тезисы докладов П Международной школы-конференции молодых ученных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». - Звенигород: Цифровичок, 2011. - С. 37

4. Доан, Тху Тхуи. Сохранение биоразнообразия диоскореи японской (Dioscorea nipponica) и диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia) in vitro // Материалы 11-ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - Москва, 2011. - С. 22

5. Доан, Тху Тхуи. Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на клональное микпроразмножение редких исчезающих видов растений / Доан Тху Тхуи, А.И. Ефимова // Сборник статей Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА. - Москва, 2012. - Т.1. - С. 21-23

6. Доан, Тху Тхуи. Клональное микроразмножение кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Кот.) / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова // Тезисы докладов юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси». - Минск, 2012. - С. 472-473

7. Доан, Тху Тхуи. Получение каллусной ткани из изолированных частей диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia) и диоскореи ниппонской (Dioscorea nipponica)» / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов». - Киев, 2012. - С. 251-252.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/16. Усл. печ. л 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 53.

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12,977-26-90, 977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Доан Тху Тхуй

Принятые сокращения.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Актуальность проблемы сохранения редких и исчезающих видов растений.

1.2. Применение биотехнологических методов для сохранения редких и исчезающих видов растений.

1.3. Биологическая характеристика растений диоскореи, бересклета карликового и кирказона маньчжурского.

1.3.1. Диоскорея.

1.3.2. Бересклет.

1.3.3. Кирказон.

1.4. Фенольные соединения растений.

1.5. Способность клеточных культур диоскореи, кирказона к синтезу вторичных культур.

Глава II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 .Описание объектов.

2.1.1. Бересклет карликовый (Еиопутш папа В1еЬ.).

2.1.2. Диоскорея ниппонская (йюБсогеа трротса Макто) и диоскорея кавказская (йюзсогеа саисаяга ЫрБку).

2.1.3. Кирказон маньчжурский (АпзЫосЫа таткиг1ет1з).

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Выбор экспланта.

2.2.2. Стерилизация растительного материала.

2.2.3. Укоренение и адаптация растений к нестерильным условиям.

2.2.4. Биохимические и морфофизиологические исследования

2.3. Статическая обработка данных.

Глава III. ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ БЕРЕСКЛЕТА КАРЛИКОВОГО, ДИОСКОРЕИ КАВКАЗСКОЙ И НИППОНСКОЙ И КИРКАЗОНА МАНЬЧЖУРСКОГО.

3.1 Бересклет карликовый {Еиопутт папа В1еЬ.).

3.2. Диоскорея кавказская {йюБсогеа саисаягса Ырвку) и диоскорея ниппонская фюзсогеа трротса Макто).

3.3. Кирказон маньчжурский (АпйШосМа татИипетгз Кот.)

Глава IV. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НЕТРАДИЦИОННЫХ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА МОРФОГЕНЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЭКСПЛАНТОВ И ПЕРЕСАДОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ БЕРЕСКЛЕТА, ДИОСКОРЕИ И КИРКАЗОНА.

4.1. Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на клональное микроразмножение бересклета карликового (Еиопутиз папа В1еЬ.), диоскореи кавказской {Пюясогеа саисаБка Ырвку), диоскореи ниппонской {йюБсогеа трротса Макто) и кирказона маньчжурского (Аг1з(о1осЫа таткшчетгЕ Кот.)

4.1.1. Бересклет карликовый {Еиопутш папа Bieb.).

4.1.2. Диоскорея кавказская (йюзсогеа саисазка Ырэку) и диоскорея ниппонская фюхсогеа трротса Макто).

4.1.3. Кирказон маньчжурский (АгШо1осЫа таткипет1$ Кот.)

4.2. Влияние препарата Мицефит на клональное микроразмножение бересклета карликового {Еиопутги папа В1еЬ.), диоскореи кавказской фюБСОгеа саиса$1са ЫрБку) и диоскореи ниппонской {ГЯозсогеа трротса Макто).

4.1.2. Диоскорея кавказская фюБсогеа саисаяка Глрэку) и диоскорея нипонская (Dioscorea nipponica Makino).

ГЛАВА V. ИЗУЧЕНИЕ СУММАРНЫХ СОДЕРЖАНИЙ РАСТВОРИМЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ИХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ В ИНТАКТНЫХ РАСТЕНИЯХ, МИКРОКЛОНАХ И КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ (ДИОСКОРЕИ, БЕРЕСКЛЕТА И КИРКАЗОНА).

5.1. Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в интактных растениях, микроклонах и каллусных культурах (диоскореи, бересклета и кирказона).

5.2. Локализация растворимых фенольных соединений в интактных растениях, микроклонах и каллусных культурах (диоскореи, бересклета и кирказона).

5.2.1 Локализация растворимых фенольных соединений в интактных растениях Dioscorea L., Euonymus L., Aristolochia L.

5.2.2 Локализация растворимых фенольных соединений в микроклонах растениях Dioscorea L., Euonymus L.

5.2.3 Локализация растворимых фенольных соединений в каллусных культурах Dioscorea L., Euonymus L., Aristolochia L.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.)"

Актуальность работы. В настоящее время сохранение биоразнообразия растений и создание генетических банков in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии, в частности, широко применяемый метод клонального микроразмножения, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество растений при недостатке исходного материала, а также получать потомство, генетически идентичное исходному виду или форме. Стратегия сохранения биоразнообразия отражена в различных нормативных документах, таких как «Национальная стратегия по сохранению биоразнообразия России» (2001) и «Стратегия ботанических садов России по сохранению биоразнообразия растений» (2003). Задачами этих программ являются: формирование единого банка данных; инвентаризация редких видов и разработка системы критериев для их выявления и определения уровня их охраны; изучение биологических особенностей редких видов и механизмов действия на них лимитирующих факторов; разработка биологических принципов и способов сохранения редких видов; разработка единых методик работы с редкими и исчезающими видами растений при проведении популяционных исследований, интродукции и культивирования in vitro.

К редким растениям относятся, например, диоскорея ниппонская, диоскорея кавказская, бересклет карликовый, а также кирказон манчьжурский, которые занесены в Красную Книгу РФ. Кроме того, диоскорея является ценной лекарственной культурой, богатой биологически активными веществами, в частности, диосгенином, который накапливается в различных тканях и органах этих растений и обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость растений к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды и др. Данные культурные растения являются богатством России, которое необходимо сохранять для будущих поколений. Поэтому разработка методологических подходов по сохранению изучаемых видов растений является актуальной проблемой.

Цели и задачи исследования. Цель работы - оптимизация условий культивирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caacasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Кот. и разработка технологии их клонального микроразмножения.

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:

• отработать методику по получению хорошо растущей стерильной культуры изолированных эксплантов Euonymus папа и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis',

• оптимизировать состав питательной среды для культивирования in vitro вегетирующих побегов Euonymus папа и Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia, Aristolochia manshuriensis',

• изучить локализацию фенольных соединений в тканях растений in vivo и in vitro.

Научная новизна работы. Усовершенствована технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонскои и кирказона маньчжурского. Впервые установлены особенности размножения в условиях in vitro исследуемых видов, занесенных в Красную книгу РФ.

Впервые изучено влияние нетрадиционных для культуры in vitro регуляторов роста Дропп, Цитодеф и Мицефит на морфогенетическую активность изолированных органов и пересадочной культуры изучаемых видов. Установлено, что присутствие в составе питательной среды препаратов Цитодеф и Дропп в концентрации 0,01 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов или микроклубней, и увеличивало коэффициент размножения. Выявлено, что длительное культивирование микропобегов бересклета карликового на средах, содержащих препарат Мицефит в концентрации 10"6 мг/л, приводило к формированию побегов не только первого порядка, но и побегов второго и третьего порядков, а также активизировался процесс ризогенеза. Для растений диоскореи в этих условиях культивирования формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом.

Практическая значимость работы. Усовершенствованы технологии клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской могут быть применены для сохранения и создания коллекции in vitro данных видов. Для ускорения процесса размножения in vitro редких, лекарственных и исчезающих растений рекомендуется применять препарат Мицефит в концентрации 10"6 мг/л.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Особенности размножения в условиях in vitro Euonymns nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky и Aristolochia manshuriensis Kom.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: 11-ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА (Москва. 2011); II Международной школе-конференции молодых ученных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2011); Международной научной конференции молодых ученых РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева (Москва, 2012); Юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси» (Минск, 2012); Международной конференции молодых ученых «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов» (Киев, 2012).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 2 - в журналах из списка ВАК РФ.

1. Доан, Тху Тхуи Клональное микроразмножение бересклета карликового {Eiionymns nana Bieb) / Е.А. Калашникова, Доан Тху Тхуи, О.И. Молканова // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ /ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии. - Москва, 2011. - Т. XXVI. - С. 244-249

2. Доан, Тху Тхуи Клональное микроразмножение редких и исчезающих видов растений / Е.А. Калашникова, Доан Тху Тхуи, О.И. Молканова // Известия ТСХА. 2012. - № 5, - С. 48-52

3. Доан, Тху Тхуи Влияние ауксинов на образование микроклубней диоскореи ниппоской и диоскореи кавказской in vitro / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова // Тезисы докладов II Международной школы-конференции молодых ученных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». - Звенигород: Цифровичок, 2011. - С. 37

4. Доан, Тху Тхуи. Сохранение биоразнообразия диоскореи японской (Dioscorea nipponica) и диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia) in vitro // Материалы 11 -ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - Москва, 2011. - С. 22

5. Доан, Тху Тхуи Влияние препаратов Дропп и Цитодеф на клональное микпроразмножение редких исчезающих видов растений / Доан Тху Тхуи, А.И. Ефимова // Сборник статей Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХ А. - Москва, 2012. - Т. 1. - С. 21 -23

6. Доан, Тху Тхуи Клональное микроразмножение кирказона маньчжурского (АшШосЫа тапзИипепз15 Кот.) / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова // Тезисы докладов юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси». - Минск, 2012. - С. 472-473

7. Доан, Тху Тхуи Получение каллусной ткани из изолированных частей диоскореи кавказской {рюъсогеа саиса51а) и диоскореи ниппонской ( Оюзсогеа трротса) / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов». - Киев, 2012. - С. 251-252.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Доан Тху Тхуй

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована технология клонального микроразмножения бересклета карликового, диоскореи кавказской, диоскореи ниппонской и кирказона маньчжурского. Показано, что для бересклета карликового и кирказона маньчжурского размножение осуществляется за счет активации развития существующих меристем, а для диоскореи кавказской и диоскореи ниппонской -за счет индукции образования микроклубней в базальной части побегов и в пазухе листа.

3. Выявлено, что длительное культивирование микропобегов бересклета карликового на средах, содержащих препарат Мицефит в концентрации Ю-0 мг/л, приводило к формированию побегов не только первого порядка, но и побегов второго и третьего порядков, а также активизировало процесс ризогенеза. Для растений диоскореи в этих условиях культивирования формирование микроклубней наступало в два раза быстрее по сравнению с контрольным вариантом.

4. Впервые изучено содержание растворимых фенольных соединений, а также флавоноидов у представителей диоскореи, кирказона и бересклета и показано, что растения диоскореи характеризуются более высокой способностью к синтезу фенольных соединений, чем растения бересклета и кирказона. Это проявляется как на уровне суммарного накопления фенольных соединений, так и на процентном соотношении различных классов растворимых фенольных соединений [флаваны и флавонолы]. Наибольшее содержание фенольных соединений, в том числе флавонолов и флаванов отмечено в листьях растений, а наименьшее - в корнях, за исключением корневищ диоскореи.

5. Установлено, что фенольные соединения [ФС] в интактных растениях и микроклонах локализуются в эпидермальных и паренхимных тканях, а также в клетках сосудисто-проводящих пучков и замыкающих клетках устьиц, клеточных стенках в межклетниках. Однако в микропобегах локализация ФС происходит менее интенсивно, что связано с их меньшим содержанием в тканях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Доан Тху Тхуй, Москва

1. Андреев, JI.H. О некоторых аспектах деятельности ботанических садов Советского Союза / JI.H. Андреев // Бюлл. ГБС АН СССР. 1988. — Вып. 151. — 39с.

2. Андреев, JI.H. Охрана редких и исчезающих видов растений — приоритетная задача ботанических садов / Л.Н.Андреев, Ю.Н. Горбунов // Сибирский экологический журнал. — 1997. — Т. 4 — № 1.-С. 3—6.

3. Атанасов, А. Биотехнология в растениеводстве./ А. Атанасов. — Новосибирск: ИЦ и Г СО РАН , 1993. — 242 с.

4. Баскаков, Ю.А. О взаимосвязи рострегулирующей активности и фитотоксичности синтетических цитокининов./ Ю.А.Баскаков, А.А.Шаповалов, Н.М. Жирмунская, Т.В. Овсянникова // ДАН СССР—1981. —Т. 257—№6—, С. 1514-1516.

5. Баскаков, Ю.А. Сравнительное изучение рострегулирующей активности синтетических и природных цитокининов/ Ю.А. Баскаков, Н.М. Жирмунская, A.A. Шаповалов, Т.В.Овсянникова.// Агрохимия -—1982,—№8—. С. 124—129.

6. Батукаев, A.A. Влияние препарата дропп на размножение винограда in vitro / A.A. Батукаев, М. Маашева // Тезисы докладов VI международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» : М., МСХА — 2001, С. 140.

7. Батыгина, Т.Б. Размножение растений./ Т.Б. Батыгина, В.Е. Васильева СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та. - 2002. - 232 с.

8. Белокурова, В.Б. Сохранение биологического разнообразия растений в коллекции клеточных культур / В. Б. Белокурова // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: тез. докл. VII междунар. конф.-М., 1997. С. 513.

9. Бересклет // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: В 86 томах—СПб., 1890—1907.

10. П.Буданцев, JT. Ю. Семейство бересклетовые Celastraceae./ JT. Ю. Буданцев // Жизнь растений. В 6-ти т. / под ред. A. JI. Тахтаджяна. — М.: Просвещение, -1981.— Т. 5. Ч. 2. Цветковые растения.— С. 313—316.

11. Бумагина, С. И. Культура in vitro пазушных почек винограда / С. И. Бумагина, С. С.Хачунова, Н. М. Шамова // Биология культивируемых клеток и биотехнология: тез. докл. V междунар. конф. Новосибирск, 1988. -Ч. 2.-С. 312.

12. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе./ Р.Г. Бутенко М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. -160 с.

13. Бутенко, Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология./ Р.Г. Бутенко- М.: Наука, 1986.- 280 с.

14. Быков, В.А. Виды рода диоскорея флоры Вьетнама / В.А.Быков, А.М.Рабинович, Нгуен Минь Кхой // Генет.ресурсы лекарств.и аромат.растений. М., 2001. - С. 35-44.

15. Варлыгина, Т.И. Список семенных растений для Красной книги Российской Федерации / Т.И. Варлыгина, Л.В.Денисова, Р.В. Камелин, С.В.Никитина, B.C. Новиков // Ботан.журн., 2000,- Т.85.- № 2.-С. 119-128.

16. Васильева И.С.; Пасешниченко В.А. Стероидные гликозиды растения и культуры клеток диоскореи // Нетрадиционные сельскохозяйственные, лекарственные и декоративные растения, 2005; N 1. С. 45-50

17. Васильева, И.С. Приют.биохим. и микробиол.,1995/ И.С.Васильева, В.А. Пасешниченко Прикл.биохим. и микробиол.,1995.-Т.31.- С.238-24.

18. Васильева, О.Г. Биолого-морфологические основы клонального микроразмножения некоторых представителей рода Rhododendron L. : автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук : 03.00.05 / Васильева Ольга Григорьевна. Москва, 2009. - 20 с.

19. Вечернина, H.A. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений / H.A. Вечернина Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2004. - 205 с.

20. Воробьев, A.C. Культура клеток диоскореи дельтовидной, как продукт фуростаноловых сапонинов : Автореф. дис.канд. биол. наук : 03.00.23 / A.C. Воробьев Всесоюз. н.-и. проект.-конструкт, ин-т прикл. Биохимии,- М., 1991. - 26 с.

21. Высоцкий, В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала плодово-ягодных культур: Автореф. дисс. . докт. с.-х. наук: 03.00.23/ В.А. Высоцкий М., 1998.-44 с.

22. Гельцер, Ф.Ю. Симбиоз с микроорганизмами — основа жизни растений / Ф.Ю. Гельцер. М.: Изд-во МСХА, - 1990.

23. Герасименко, И.И. О прорастании семян некоторых видов диоскорей / И.И. Герасименко, Е.Ф. Тропова // Раст. Ресуры.1966. -Т.2,- вып. 3. -С. 346-353.

24. Глушкова, Т.Н. Изучение нетрадиционных регуляторов роста в культуре ткани картофеля / Т.Н. Глушкова : Автореф. дис.канд. биол. наук :03.00.23, 2003,- 24 с.

25. Деверилина, Ю.В. Повышение качества продукции новых сортов винограда путем обработки регуляторами роста / Ю.В. Деверилина // Тезисы докл. VI Международная конференция "Регуляторы роста и развития в биотехнологиях",- Москва,- 2001.- С. 231.

26. Демидов, А. С. Главный ботанический сад им. Н. В. Цицинв РАН история, становление и достижения.К 60-летию основания. / А. С.Демидов, 3. Е.Кузьмин, В. Г. Шатко М: ГБС РАН; Тула: ИПП «Гриф и К», 2005,- 112 с.

27. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта, учеб.по агрон. спец / Б.А.Доспехов. -5. изд., доп. и перераб. М.: Агропромиздат, 1985. 351 с.

28. Жученко, A.A. Проблемы лекарственного растениеводства в Российской Федерации / Жученко, A.A. // Лекарственное растениеводство,- М., ВИЛАР, 2000. С. 4-16.

29. Загоскина, Н.В. Влияние 1 -нафтилуксусной кислоты на гетеротрофные и фотомиксотрофные каллусные культуры чайного растения и накопление в них фенольных соединений / Н.В.Загоскина,

30. Г.А. Дубравина // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях, 2001. С. 157-158.

31. Загоскина, Н.В. Особенности формирования хлоропластов и накопление фенольных соединений в фотомиксотрофных каллусных культурах чайного растения / Н.В.Загоскина, Г.А. Дубравина, М.Н. Запрометов // Физиология растений, 2000 Т.47,- № 4. - С. 537-543.

32. Загоскина, Н.В. Фенольные соединения каллусных культур чайного растения и возможность регуляции их образования / Н.В. Загоскина, М.Н. Запрометов // Культура клеток растений и биотехнологии М, 1986.-с. 49-52.

33. Зайцева, С.М. Образование и локализация фенольных соединений в растениях тисса и в инициированных из них каллусных культурах: автореф. дис.канд. биол. наук.: 03.00.23 / Зайцева Светлана Михайловна Москва, 2007. - 22 с.

34. Запрометов, М.Н. Локализация пероксидазы и лигнина в тканях чайного растения и в полученных из них каллусных культурах / М.Н. Запрометов // Физиология растений, 1982.- Т.2 Вып. 2- С. 302-311.

35. Запрометов, М.Н. Основы биохимии фенольных соединений / М.Н. Запрометов М.: Высш. шк., 1974,- 214с.

36. Запрометов, М.Н. Специализированные функции фенольных соединений / М.Н. Запрометов // Физиология растений, 1993. Т. 40 -С. 921.

37. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования / М.Н. Запрометов // Биохимические методы в физиологии растений / Под ред. O.A. Павлиновой М.: Наука,1971. - С.185-197.

38. Иванова, З.Я. Экзотические лианы / З.Я. Иванова Москва : МСП, 2005. - 96 с.

39. Калашникова Е.А.Теоретические и практические аспекты получения гаплоидных и дигаплоидных растений in vitro различных видов Brassica./ Е.А.Калашникова, Май Дык Чунг LAP: LAMBERT Academic Pablishing. - 2012. - 121 с.

40. Калашникова, Е.А. Клеточная инженерия растений: учебное пособие / Е.А. Калашникова,- М.:Изд-во РГАУ- МСХА, 2012,- 318с.

41. Каранова, C.JI. Использование методов клеточной селекции и индуцированного мутагенеза для получения штаммов культивируемых клеток Dioscorea deltoidea Wall с повышенным биосинтезом стероидов / C.J1. Каранова // Биотехнология, 2006. № 2. -С. 16-19.

42. Катаева, Н.В. Клональное микроразмножение растений / Н.В.Катаева, Р.Г. Бутенко М.: Наука, 1983. - 230 с.

43. Киченко, В.И. Интродукция диоскореи кавказской в Подмосковье / В.И. Киченко //Раст. Ресурсы. 1968,- Т.4 вып.4.- С.541-552.

44. Князьков, И.Е. Определение локалиациистреоидных гликозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea на основе изучения их ультраструктуры / И.Е.Князьков, Е.С.Лобакова, A.M. Носов // Физиология растений, 1994,-Том 41.- № 6.- С. 896-902.

45. Ковалев, В.М. Скрининг регуляторов роста с целью применения их в биотехнологии в культуре ткани картофеля./ В.М.Ковалев // Тезисы докл. VI Международная конференция "Регуляторы роста и развития в биотехнологиях".- Москва,- 2001.- С. 165.

46. Ковалева, Я.П.Особенности роста и развития Rhodiola rosea при выращивании в условиях светокультуры / Я.П.Ковалева, А.А.Тихомиров, В.А. Долгушев // Физиология растений, 2003 Т.50 -№ 4. - С. 593-597.

47. Конвенция о биологическом разнообразии. 1992. (http://www.un.org/ru/documents/declconv/conventions/biodiv.shtml)

48. Корнилова, О.В. Особенности размножения стевии in vitro / О.В. Корнилова, Е.А. Калашникова // Материалы 2-й международной конференции г. Минск, 26—28 августа 1996 г.- С.97.

49. Коропачинский И.Ю. Роль ботанических садов в охране биологического разнообразия России // Сиб. экол. журн. 1997. Т.4. -№ 1.-С. 7-12.

50. Коротков, О.И. Формирование и комплексное изучение коллекции (род Clematis L.) биотехнологическое и молекулярно-генетические аспекты: афтореф.дисс.канд.биол.наук: / Коротков, О.И.- М., 2008.-23с.

51. Котов, М.М. Применение биометрических методов в лесной селекции / М.М. Котов, Э.П. Лебедева. Горький:Марийская республиканская типография, - 1977. - 121 с.

52. Красная книга РСФСР: Растения.- М: Росагропромиздат, 1988,- С. 135-136.

53. Кротова, И.В. Исследование химического состава коры лианы Aristolochia manshuriensis / Кротова И.В., А.А.Фремов // Химия растительного сырья, 2002. -№ 3.- С. 85-87.

54. Кулаева, О.Н. Исследование цитокининовых свойств дефолианта дропп и гербицида ДПХ-4189 / О.Н. Кулаева, Ю.А.Баскаков, Н.Н.Борисова, В.В.Кузнецов, JI.B.Цибуля, A.A. Шаповалов // Физиол. раст. 1982.- т. 29,- Вып.2,- С. 266-269.

55. Куркин, В.А. Фенилпропаноиды перспективные природные биологически активные соединения / В.А. Куркин // Самара: Изд. Гос. Мед. Ун-т. 1996.- С. 31-37.

56. Лебедева, A.A. К биологии диокореи кавказкой / A.A. Лебедева // Экологические исследования в Кавказском биосферном заповеднике. Ростов- на Дону, 1985.- С. 99-103.

57. Леонова, Т.Г. Бересклеты СССР и сопредельных стран / Леонова Т.Г -Л. Наука, 1974. 132 с.

58. Лобокова, Е.С. Особенности образования фенольных соединений в апогеотропных корнях саговниковых растений / Е.С. Лобокова, Г.А. Дубранина, Н.В. Загоскина // Физиология растений, 2004,- Т. 51.- № 4.- С. 541-548

59. Лукнер, М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных / М. Лукнер.- М.: Мир, 1979. 548с.

60. Маланкина Е.Л. Лекарстенные растения на приусадебном участке. Учебное пособие/ Е.Л. Маланкина ЗАО «Фитон +»,2007,- С. 66-68.

61. Митрофанова, И.В. Соматические зародыши зизифуса в культуре in vitro / И.В.Митрофанова, Л.Т.Синько Новые методы биотехнологии растений. - Пущино, 1993. - С. 156

62. Молканова, О.И. Сохранение редких и исчезающих растении в банке меристем ГБС РАН / О.И. Молканова, Ю.Н. Горбунов // Биологическое разнообразное. Интродукция растений: тез. докл. III Межд. науч. конф. СПб.,2003,- С. 42.

63. Наконечная, О.В. Структурные особенности гинецея и андроцея Aristolochia contorta Bunge // О.В.Наконечная, О.Г.Корень, C.B. Нестерова, Т.Ю // Горпенченко Ботанические исследования в Азиатской России / Рус. ботан. о-во. Барнаул, 2003,- Т. 2. - С. 79-80.

64. Николаева, М.Г. Покой семян / М.Г. Николаева // Физиология семян. М.: Наука, 1982. С. 125- 183.

65. Новикова Е.В.Морфологическая изменчивость семян Aristolochia contorta Bunge. Десятая молодеж.науч.конф."Актуал.пробл.биологии и экологии"Материалы. Сыктывкар, 2003. - С. 160-161

66. Носов, A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / А.М.Носов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под редакцией Р.Г. Бутенко.- М. Наука.-1991.- С. 5-20.

67. Орешников, A.B. Физиологические особенности культивируемых клеток Dioscorea deltoidea wall, при выращивании в режиме закрытого протока / A.B.Орешников, А.М.Носов, М.Н. Манаков // Физиология растений, 1994,- Т.41.- № 6,- С. 918 922.

68. Перечень объектов растительного мира, занесенных в Красную книгу Российской Федерации и исключенных из Красной книги Российской Федерации по состоянию на 1 июня 2005 г. : Приказ министра природных ресурсов РФ от 25.10.2005 г.- № 289.

69. Печеницын, В.П. Изучение модифицирующего влияния дроппа ДП. на процессы морфогенеза монстеры in vitro / В.П. Печеницын, В.А. Ефимков, О.Я.Весманова, О.В. Крюкова // Материалы 2-й международной конференции г. Минск, 26—28 августа 1996 г.- С.55.

70. Плотников, М.Б. Лекарственные препараты на основе диквертина / М.Б.Плотников, H.A. Тюкавкина. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 2005.228 с.

71. Поздова, Л.М. Биология прорастания и качество семян Dioscorea nipponica Makino Dioscoreaceae. / Л.М.Поздова, Г.Е.Титова, A.A. Торшилова // Растительные ресурсы, 2005.- Вып. 2. С. 53- 63.

72. Приступа, H.A. Гистохимическое выявление полифенолов в растительном материале / H.A. Приступа, Р.К. Петрова, Т.Х. Шаламберидзе Цитология, 1970,- Т.42. - С. 403-408

73. Прохоров А. А. Экологические проблемы сохранения биологического разнообразия на примере генетических ресурсов ботанических садов

74. России: автореф. дис. докт. биол. наук. / Прохоров А. А. Петрозаводск, 2004,- 46 с.

75. Семенихин, И.Д. Валериана лекарственная / И.Д.Семенихин, Н.И. Коломиец., Н.Т. Конон, JI.A. Евтушенко; Ю.И. Федоров, A.A. Мксимейко //Возделывание лекарств, культур, 1987,- Т. 1. С. 10-22.

76. Созонова JT.И. Морфолого-анатомическая характеристика плодов бересклета Euonymus L. в связи с масличностью присемянников / Л.И.Созонова, H.A. Трусов // Аграр.сектор и его соврем.состояние. -М., 2002. С. 58-59.

77. Соколова А.Я. Влияние биологически активных веществ на рост и развитие газонных трав в стрессовых условиях / А.Я. Соколова // Тезисы докл. VI Международная конференция "Регуляторы роста и развития в биотехнологиях". Москва.- 2001.- С. 122.

78. Стратегия Ботанических садов России по сохранению биологического разнообразия растений,- М.: Красная Звезда, 2003. 33 с.

79. Тахтаджян А. Л. Жизнь растений: в 6-ти томах./ А. Л. Тахтаджян— М.: Просвещение. 1974.

80. Титова, М.В. Длительное аппаратурное выращивание суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall в полупроточном режиме / М.В.Титова, Н.А.Шумило, И.Е.Куличенко, В.В.Коростелев, A.B.Орешников, A.M. Носов // Биотехнология, 2006,- № 2. С. 28-31.

81. Тихонова, В.Л. Долговременное хранение семян / В.Л. Тихонова // Физиология растений,1999,- Т.46. № 3,- С.467-476.

82. Торшилова, A.A. Репродуктивная биология Dioscorea nipponica Makino Dioscoreaceae.: афтореф.дисс.канд.биол.наук: / Торшилова Алла Анатольевна. Санкт- Петербург, 2007. - 20с.

83. Упадышев, М.Т. Роль фенольных соединений в процессах жизнедеятельности садовых растений / М.Т. Упадышев Изд. дом МСП, 2008. -319 с.

84. Федоров, А. А. Атлас по описательной морфологии высших растений. Стебель и корень / А. А. Федоров и др М.; Л.: Изд-во АН СССР. 1962.

85. Чуб, В.В. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов Crocus L./ В.В.Чуб, Т.А.Власова, Р.Г. Бутенко // Физиология растений, 1994,- Т.41- N 6. С. 815-820.

86. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха, C.B. Дегтярев, Г.М. Артамонова и др. М.: изд-во МСХА, 1995. -310 с.

87. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.З. Кочинева и др.- М.: Высш. Шк., 2008,- 710с.

88. Шипилова, C.B. Фенилаланинаммиаклиаза и образование катехинов в чайном растении / C.B.Шипилова, М.Н.Запрметов // Физиология растений, 1977,- Т. 24.- №4.- С. 803-809.

89. Шлегель, Г.Г. История микробиологии / Г.Г. Шлегель. М.: Изд-во УРСС. - 2002.

90. Шухободский, Б.А. Сем. Бересклетовые- Celastraceae Lindl / Б.А. Шухободский // Деревья и курстарники СССР. Дикорастущие, культивируемые и перспективные для интродукции. М.-Л.: Издательство Академии Наук, 1958.- Т.4.- С.357- 397

91. Ярославцев, Е. И. Живые изгороди. / Е. И. Ярославцев — М.: Изд. дом МСП, 2004. — С. 63. — 160 с.

92. Chandra Prabha, A. Micropropagation of Aristo lochia indica L. (Aristolochiaceae)) / A. Chandra Prabha, R. Rama Subbu, S.K. Kulloli // Ecology, environment and conservation paper. 2008.- Vol. 14. -1. 2-3. -P. 409-411.

93. Ammirato P.V. Yams // Handbook of Plant Cell Culture. 1984. - V.3. -Crop Species. N. Y.:MacMillan, - P. 327/

94. Anderson, W.C. Tissue culture propagation of red raspberries / W.C. Anderson // Proc. Conf. on nursery production of fruit plants through tissue culture-application and feasibility. Beltsville Md. 1980. - P. 7-34.

95. Thomas, Anita. In vitro plant regeneration of Aristolochia indica through axillary shoot multiplication and organogenesis / Anita Thomas, Benny Daniel, G.M. Mair, S. Manjula. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture, -1997.-V. 51.-I. 2.-P. 145-148.

96. Mukherjee, Archana. Gains through biotechnology in tuber crops / Archana Mukherjee, M. Unnikrishnan and N.G. Nair //Indian Hortic, 1993. -Vol.38.-N. 3. - P. 15-16.

97. Barney, P.E Interaction of nitrate and sulfate reduction in tobacco. 2. Influence of apical meristem removal. / P.E Barney, L.P. J. Bush // Plant Nutrit,- 1985. -T.8. -N6. P. 517-526.

98. Bhaising, S.R. Plant tissue culture a potential source of medicinal compounds / S.R. Bhaising, V.L. Maheshwari // J. Scientific and Industrial research. - 1998. - V. 57. - P. 703-708.

99. Blout, J. Over-expression of cinnamate 4-hydroxylase leads to increased accumulation of acetosyringone in slicited tobacco cell-suspension cultures /Blout J., Masoud S. //Planta, 2002. - Vol. 214. -1. 6. - P. 902-910.

100. Boudet, A.M. Lignans and lignification: Selected issues / A.M. Boudet // Plant Physiology and biochemistry, 2000. -Vol.38. - P. 81-96.

101. Butt, V.S. Oxygenation and oxidation in the metabolism of aromatic compounds / V.S. Butt // The biochemistry of plant phenolics. Oxford: Clarendon press, 1985. - P. 349- 366.

102. Carter, J. Development of tissue culture methods for multiplication of Hibiscus rose sinensis: abstr. World congr. in vitro / J. Carter, S.Dhir // Biol., San and Dev. Biol. Anim. 1996. - 32. № 3. - Pt. 2. - P. 1.

103. Chattopadhyay, S.K. Studies on the Himalayan yew Taxus- wallichiana-part VI- isolation of nontoxoid constituents. / S.K. Chattopadhyay, M.Kulshrestha // Indian journal of chemistry section. 1999. - Vol.38. -1.2. - P. 246-247.

104. Compton, M.E. Response of tobacco callus to shoot tip exudation from five species. / M.E. Compton, J.E. Preece // HortScience, 1988. - T.23. - N 1. -P. 208-210.

105. Crowe, J.H. Interactions of sugars with membranes / J.H.Crowe, L.M.Crowe, J.F. Carpenter et al // Biochim. Biophys. Acta, Rev. Biomembr. 1988. - V.974. - № 2. - P. 367.

106. Dixon, R. Stress-indused phynylpropanoid metabolism / R. Dixon, N.Paiva // Plant cell, 1995. - Vol. 7. - P. 1085-1097.

107. Forkmann, G. Biosynthesis of flavonoids / G.Forkmann, W. Heller // Comprehensive natural products chemistry, Amsterdam, Elsevier, 1999. -P. 713-748.

108. Furmanowa, M. Biotechnology in agriculture and forestry. / Furmanowa M.,Guzewska J. // Spring- Verlag Berlin Heidelberg, 1989. - V.7. - P. 162-184.

109. Gage, T.B. Quantitative determination of certain Flavonol- 3-Glycoides / T.B. Gage, S.H. Wendei // Analitical chemistry. 1950. - V.22. - P. 708711.

110. Grotewold, E. Engineering secondary metabolism in maize cells by ectopic expression of transcription factors / E. Grotewold, M. Chamberlin // Plant cell, 1998. - Vol. 10. - P. 721-740.

111. Harborne, J.B. Do natural plant phenols play a role in ecology? / J.B. Harborne // Acta Hort. 1994. - № 281. - P.36-43.

112. Harborne, J.B. Plant phinolics / J.B. Harborne // Secondary plant products. Eds. Bell E.A., Charlwood B. V. Berlin, Heidlberg, New York. SpringerVerlag. 1980. -P. 329-402.

113. Hartmann, H. T. Plant propagation / H. T. Hartmann // Principles and practices. New Jersey, - 1975. - 450 p.

114. Hemplill, J. K. Rapid in vitro plant regeneration of cotton (Gossypium hirsutum L.) / J. K. Hemplill, C. G. A. Maier, L. D. Chapman // Plant Cell Repts. 1998. - 17, - № 4. - P. 273-278.

115. Hutzler, P. Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. / P. Hutzler, R. Fischbach, W. Heller / 1998. -Vol. 49.-I. 323.-P. 953-965.

116. Ishicura, N. Seasonal changes in contents of phenolic compounds and sugar in Phus, Eucnymus and Acer leaves eith special reference to anthocyanin formation in autumm / N. Ishicura // The botanical magazine. 1976. - V. 89.-N. 1016.-P. 251-258.

117. Joy, P.P. Medicinal plants / P.P. Joy, J. Thomas, S.Mathew // Tropical horticulture. 2001. - V. 2. - P. 449-632.

118. Juntheikki, M.R. Inhibition of glucosidase and esterase by tannins frombetula, Salix and Pinus species / M.R. Juntheikki, R. Julkenen-Thtto // J. Chemical Ecol. 2000. - V. 26. - P. 311-322.

119. Lajide, L. Antifeedant activity of metabolites of Aristolochia albida against the tobacco cutworm,Spodoptera litura / L. Lajide, P. Escoubas, J. Mizutani // J.agr.Food Chem, 1993. - Vol.41. - N 4. - P. 669-673.

120. Maries, S. New perspectives on proanthocyanidin biochemistry and molecular regulation / S. Maries, H.Ray // Phytochtmistry, 2003. - Vol. 64. - P. 867-383.

121. Marshall, J.G. Hormonal effects on diosgenin biosynthesis and growth in Dioscorea deltoidea tissue culture / J.G. Marshall, E.J. Staba // Phytochemistry, 1976. - Vol. 15. - P. 53.

122. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture / T. Murashige, F. Skoog // Physiol, plant. 1962. -Vol. 15. -№3.-P. 473-497.

123. Nagasawa, A. Plant regeneration from embryogenic suspension culture of Chinese Yam, Dioscorea oposita Thunb. / A. Nagasawa, J.J. Finer // Plant Sci.,- 1989.-V. 60.-№2.-P.263.

124. Onwueme, I.C. Food and agriculture organization of the United Nations. Rome. / I.C. Onwueme, W.B. Charles // Tropical root and tuber crops. Production,perspectives and future prospects / FAO. Rome, 1994. - XII, -228 p.

125. Osifo, E.O. Somatic embryogenesis in Dioscorea / E.O. Osifo // J. Plant Physiol. 1988. - V. 133. - № 3. - P.378.

126. Petricic, I. Saponie zweier in Yugoslawien vorkommender Dioscoreazeen / I. Petricic, R. Apostolovski, D.Bedenko // Acta. Phorm. Yugoslav, 1973. -Vol. 23.-P. 45-47.

127. Priestap, H.A. Investigation of the essential oils from Aristolochia triangularis / H.A.Priestap, A.L. Bandoni, M. Neugebauer, G. Rucker // J. ess. Oil Res, 1990. - T. 2. - N 3. - P. 95-98.

128. Rao, P. V., Lakshmana D„ De Deepesh N. // Plant Sei. 1987. - 51, № 2-3.-P. 263-267.

129. Rao, S.R. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites / S.R. Rao, G. Ravishankar // Plant Sei. 2002. - Vol. 20. -1. 2. - P. 101153.

130. Roca, W.M. Tissue culture research at CIP. / W.M. Roca // Am. Potato J. -1975.- 52(9). P. 281.

131. Rokem, S.J. Autoclaved fungal mycelia increase diosgenin production in cell suspension cultures of Dioscorea deltoidea / S.J. Rokem, J. Schwarzberg, J. Golderg // Plant cell reports, 1984. - Vol. 3. - P. 159- 160.

132. Shibi, R. A. In vitro multiplication of bitter almond (Prunus amygdalus) from North Jordan / R. A. Shibi, A. C. Jaradat, M.M. Ajloni, S. Aijanabi // In vitro Cell, and Dev. Biol. Anim. 1996. - 32. - № 3. - Pt. 2. - P. 74.

133. Singh, C. Hormone modification of X-ray and chemical mutagenesis. / C. Singh // Recent trends in botanical research, 1985. - P. 317-322.

134. Smith, C.C. In vitro development of adventitious shoots in Euonymus alatus (Celastraceae) / C.C. Smith, J.A. Jernstedt // Sc. hortic, 1989. - T. 41. -N 1/2. - P. 161-169.

135. Soukupova, J. Histochemical and biochemical approaches to the study ofphenolic compounds and peroxidanses in needles of Norway Spruce (Picea abies) / J. Soukupova, M. Cvikrova // Research new Phytology.- 2000. V. 146. - P. 403-414.

136. Stefanowska, M. Cytochemical localization of phenolic compounds in columella cells of the root cap during maturation of seeds of Brassica napus L. / M. Stefanowska, A.M. Zobel, M. Kuras // Plant biology. 2003. - Vol. 5.-I. 4. - P. 378-382.

137. Steward, F. S. Growth and organized development of cultured cells / F. S. Steward // Amer. J. Bot. 1958. - V. 45. - P. 120-125.

138. Suzuki, M. Relationship of berberine producing capability between Thalitrum plants and their tissue cultures callus culture and suspension cell culture / Suzuki M., Nakagawa K., Fukui H., Tabata M. // Plant Cell Rep. - 1987. - Vol. 6. - P. 260-263.

139. Swain, T. Chemistry and biochemistry of plant pigments. / T. Swain // Ed. Goodwin T.W. Academic Press. 1976. - V.l. - P.425- 442.

140. Swain, T., Hallis W.E. The phenolic constituents of Prunus domestica / T.Swain, W.E. Hallis // J. Sci. Food Agric. -1995. V.l0. - P. 63-68.

141. Tapia, R. Encapsulacion de semillas botanicas de tomate (Lycopersicum lycoperscum) / R. Tapia, C. Carvajal, M. Hernandez, J. Acosta, G. Rodriguez, H. Peralta, J. Gonzalez //Agr.Vergel, 1999. - An. 18. - N 211. -P. 483-485.

142. Wagner, H. Longitudinal leaf gradients of UV-absorbing screening pigments in barley / H. Wagner, M. Cilbert, C. Wulhelm // Physiol. Plantarum. 2003. - V. 117. - P. 383-391.

143. Wang, Maoliang. Adventitious Bud Regenerating System of Euonymus fortune. / Wang Maoliang, Zhao Liangjun, Ren Guifang, Wang Jianhong, Feng Hui. //Acta hortic.sinica, 2004. - Vol.31. - N 2. - P. 241-244.

144. Zbikowska, B. Phenolic acids in leaves of Eonymus latifolius Mill, and Euonymus hamiltonianus Wall / B. Zbikowska // Beitr.Zuchtungsforsch., -1996. Jg.2. - H.l. - S. 396-399.

145. Zlenko, V. A. In vitro propagation of grapevine. P. I.: Cultivation of shoot apexes and in vitro proliferation of axillary grapevine buds / V. A. Zlenko, L. P. Troshin, I. Kotikov // Vitis: Viticulat and Enol. Absir. 1999. - 38. -№3.-P. 11.

146. Vischi, M. Dispersal of wild sunflower by seed and persistant basal stalks in some areas of central Italy J M.Vischi, M.E.Cagiotti, C.A.Cenci, G.J.Seiler, A.M. Olivieri. // Helia / Univ. of Novi Sad, 2006. Vol.29.- N 45. - P. 89-94.

147. Claudia Ulisses. Somatic embryogenesis from zygotic embryos of Heloconia bihai (L.) L. cv. Lobster Claw Two / Claudia Ulisses, Cynthia Cavalcanti de Albuquerque, Lilia Willadino, Terezinha Rangel Camara // Rev.Ceres, 2011. T.58.- N 5. - P. 537.

148. Sang-Kuk Kim. Starch Properties of Chinese Yam, Dioscorea opposita Thunb./ Sang-Kuk Kim, Jae-Hee Won, Sang-Mo Kang, In-Jung Lee. // Korean J.Crop Sc., 2009. T.54.- N 2. - P. 198.

149. Yuh-Hwa Liu. Effects of Different Types of Yam (Dioscorea alata) Products on the Blood Pressure of Spontaneously Hypertensive Rats/ Yuh-Hwa Liu; Yin-Shiou Lin; Der-Zen Liu; Chuan-Hsiao Han; Ching-Tan

150. Chen; Mike Fan; Wen-Chi Hou // Biosc.Biotechnol.Biochem., 2009. -T.73.-N6. P. 1371-1391.

151. Mercel, F. Taxonomicka charakteristika Euonymus europaeus L. / F.Mercel. // Folia dendrol.- Bratislava, 1993.-N 20. P. 45-53.

152. Manjula, S. In vitro plant regeneration of Aristolochia indica through axillary shoot multiplication and organogenesis / S.Manjula, A.Thomas, B.Daniel, G.M. Nair.// Plant Cell Tissue Organ Cult., 1997,- Vol.51- N 2. -P. 145-148.

153. Kye-Taek Lim. Antioxidant activity of Dioscorea batatas Decne glycoprotein./Kye-Taek Lim.//European Food Research & Technology, Jan2008.- Vol. 226.- Issue 3. P. 507-515.

154. Lin.Determination of steroidal saponins in different organs of yam (Dioscorea pseudojaponica Yamamoto)./ Lin; Jau-Tien; Yang; Deng-Jye. // Food Chemistry, Jun2008. Vol. 108. Issue 3. - P. 1068-1074.

155. Basu, P.S. Relation of naphthalene acetic acid and 2,4-dichlorophenoxy acetic acid-induced growth of wheat coleoptile with IAA metabolism / P.S. Basu, K.K.Chattopadhyay, R.N., Bhattacharyya // Indian J.exper.Biol., 1998.-Vol.36.-N7.-P. 709-712.

156. Chen. Effects of pH on the total phenolic compound, antioxidative ability and the stability of dioscorin of various yam cultivars./ Chen, Yi-Tzu, Kao, Wen-Tzu, Lin, Kuo-Wei.// Food Chemistry, Mar2008.- Vol. 107. Issue 1. - P. 250-257

157. Takanari Sakai. Effects of Plant Growth Regulators, Light Conditions and Culture Media on Multiple Shoot and Microtuber Formation in the Tissue

158. Culture of Ise-imo(Dioscorea opposita) / Takanari Sakai, Katsu Imai. //Japan.J.Crop Sc., 2008,- T.77.- N 4. P. 481.

159. Lu. Phenanthrene derivatives from the stems and leaves of Dioscorea nipponica Makino./ Lu, Dan, Liu, Jin-Ping, Li, Hai-Jun, Li, Ping-Ya // Journal of Asian Natural Products Research, Jan2010. Vol. 12. -Issue 1. P. 1-6 .

Информация о работе

Доан Тху Тхуй
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы