Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося

Зарипова, Альфия Ануровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося"

На правах рукописи

¿V1

ЗАРИПОВА Альфня Ануровна РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КЛОНАЛЬНОГО

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПИОНА УКЛОНЯЮЩЕГОСЯ (PAEONIA ANOMALA L.)

03.00.23 - Биотехнология 03.00.12 - Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2006

Работа выполнена в лаборатории морфогенеза и биотехнологии растений Ботанического сада-института Уфимского научного центра РАН и на кафедре биохимии и биотехнологии биологического факультета Башкирского государственного университета

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук Байбурина Рима Кашафовна

доктор биологических наук Шаяхметов Изгам Фазлиахметович

доктор биологических наук Круглова Наталья Николаевна

доктор биологических наук Хайруллин Рамиль Магзинурович

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится 11 мая 2006 г. в 14— ч. на заседании Диссертационного Совета КМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 69.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 69.

Автореферат разослан апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических

наук

Р.В. Уразгильдин

¿LOMA

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Достижения в области культуры in vitro привели к созданию эффективных и экономически выгодных технологий клонального микроразмножения растений. В основе клонального микроразмножения лежит использование уникальной способности растительных клеток реализовать присущую им тотипотентность под влиянием экспериментальных воздействий и дать начало целому растительному организму. Реализация морфогенетического потенциала в культуре In vitro осуществляется путём как активации существующих в растении меристем, так и индукции возникновения почек или эмбриоидов (соматических зародышей) de novo непосредственно из тканей экспланта и из каллуса, образованного клетками экспланта. Используя в качестве объекта боковые почки, зародыши, молодые ткани, можно клонировать растения, т.е. получать растения, генетически идентичные исходному. Культивируемые "клетки и ткани растений можно выращивать в виде неорганизованной клеточной массы (каллус), способной к синтезу видоспецифичных биологически активных соединений, и заменять ими традиционное растительное сырьё.

Актуальным направлением клеточных технологий в настоящее время является сохранение и воспроизводство редких и исчезающих видов растений. Пион уклоняющийся, марьин корень (Paeonia anómala L„ семейство Paeoniaceaé) в Башкортостане чрезвычайно редок (Кучеров с соавт., 1987), включен в «Красную книгу Республики Башкортостан» (2001), отнесен к категории 1 - виду, находящемуся под угрозой исчезновения. Достоверно установлено, что общее число учтенных особей во всех известных популяциях не превышает 500-600 экз. (Мулдашев с соавт., 2004). Р. anómala представляет интерес как лекарственное растение, вошедшее в широкую медицинскую практику. Возрастающая потребность в сырье не может быть удовлетворена возобновлением вида в природных условиях.

Разработка технологии ускоренного размножения, основанная на изучении потенциальных возможностей культивируемых in vitro тканей Р. anómala, является актуальной для решения проблемы сохранения ценных и редких генотипов и в тоже время - расширения сырьевой базы. Возрастающий интерес к источникам альтернативного сырья для получения лекарственных препаратов обуславливает необходимость изучения вторичных метаболитов в культивируемых in vitro тканях Р. anómala.

Цель исследования состояла в выявлении особенностей морфогенеза

Р. anómala в культуре in vitro и разработке технологии клонального

микроразмножения вида. В соответствии с , этой целью были

, L ■ ''"«.«•"""••'•i'u.v.

сформулированы следующие задачи исследовнния£цБлиотЕКЛ Í

I СП«тер<шг ¿¡й Í

1) выделить перспективные типы эксплантов для клонального микроразмножения;

2) определить морфофизиологическую активность эксплантов в культуре in vitro для клонального микроразмножения;

3) изучить влияние трофических и гормональных факторов питательной среды при культивировании in vitro на процессы микроразмножения;

4) провести сравнительное изучение содержания вторичных метаболитов в корнях и корневищах дикорастущих, интродуцированных особей, а также в корнях клонированных растений и в каллусах.

Научная новизна. Выявлена высокая морфофизиологическая активность боковых почек Р. anómala в культуре in vitro, зависящая от места их расположения на побеге, эндогенного содержания фитогормонов и срока их изоляции. Показано, что оптимальными эксплантами для разработки технологии ускоренного размножения и увеличения выхода количества растений-регенерантов являются боковые почки и зародыши. Определены условия и получены растения-регенеранты путем экспериментального индуцирования эмбриоидов из каллуса зародыша, листовых пластинок и черешков листьев побега в период его внутрипочечного роста. Для эффективного микроразмножения разработаны следующие приёмы: а) активация боковых почек для мультипликации побегов; б) индукция эмбриоидов из тканей зародыша и каллуса; в) индукция морфогенного каллуса из листовых пластинок и черешков листьев побега в период его внутрипочечного роста. Результаты исследования вносят вклад в развитие современных представлений об особенностях морфогенеза и клонального микроразмножения Р. anómala. Показано, что экстракты, полученные из корней и корневищ растений-регенерантов и каллуса Р. anómala, не уступают по содержанию фенольных соединений экстрактам из дикорастущих и интродуцированных растений.

Практическая значимость работы. Впервые разработана технология клонального микроразмножения редкого вида Р. anómala методом культуры in vitro изолированных органов и тканей. Данная технология позволит успешно решить проблему сохранения этого редкого и исчезающего вида растения, сократив сроки получения массового посадочного материала. Биомасса каллуса Р. anómala может служить альтернативным источником синтеза фенольных соединений.

Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических факультетах ВУЗов.

Апробация работы. Материалы представлены на 14 международных, 2 всероссийских и 6 региональных конференциях и симпозиумах, в том числе на научных конференциях "Биология клеток

растений in vitro, биотехнология и сохранение растительного генофонда" (Москва, 1997), "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), "Биологическое разнообразие. Интродукция растений" (СПб., 1999). "Иммуноферментный анализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии" (Уфа, 2000), "Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений" (Москва, 2001, 2004). по анатомии и морфологии растений (СПб., 2002), "The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology" (Саратов, 2003), "Природное наследие России: изучение, мониторинг, охрана" (Тольятти, 2004), "Перспективы развития садоводства и овощеводства на Южном Урале" (Уфа. 2005), "Новые достижения химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2005), "Экология: от генов до экосистем" (Екатеринбург, 2005), "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Пущино, 2005), на I международной школе молодых ученых "Embryology and Biotechnology" (СПб., 2005), на конкурсах научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН (Уфа, 2003, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 181 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 258 работ, в том числе 94 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 71 рисунком и 15 таблицами.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом для работы служили растения Р. anómala генеративного возрастного состояния, произрастающие как в природных условиях, так и интродуцированные в Ботанический сад-институт УНЦ РАН из Татышлинского района республики Башкортостан. В качестве эксплантов использовали боковые почки, листовые пластинки, черешки листьев и стебли, изолированные с побега в период его внутрипочечного роста: лепестки, тычинки, цветоложе, изолированные с цветка в фазу бутонизации растения; зародыши Р. anómala на 26-50 сут после опыления. Для изучения содержания вторичных метаболитов. кроме дикорастущих и интродуцированных растений, использовались культивируемые in vitro каллусы и полученные из них растения-регенеранты.

В работе были использованы: метод культуры in vitro органов, тканей и клеток (Калинин с соавт.. 1980: Бутенко. 1999); анатомо-гистологический метод (Фурст, 1979); метод ичмуноферментного анализа

(Кудоярова с соавт., 1986): метод определения биологически активных веществ в тканях растений (Методы изучения фенольных соединен и П. 1997; Вторичные метаболиты растений и методы их исследования, 2004) Содержание вторичных метаболитов оценивали на основании прямого спектрофотометрирования экстрактов (Ferreira, Nogueira, 2000; Koide et al., 2002; Мальцева, 2003).

Статистическую обработку результатов вели с применением программы Excel, Statistica, учитывая основные статистические параметры.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности почки возобновления Paeonia anómala L. как исходного экспланта для культивирования in vitro

В естественных условиях почке возобновления Р anómala характерно внутрипочечное ветвление - формирование боковых почек на побеге в период его внутрипочечного роста. Боковые почки различаются размером, числом покровных чешуй, временем закладки и обладают различной морфофизиологической активностью. В связи с этим, выделены три группы боковых почек: спящие почки (1^4-я снизу - возобновляют растение в критические моменты), дочерние, или собственно почки возобновления (5-8-я снизу - дают начало новой почке возобновления) и резервные почки (9-12-я - обеспечивают восстановление куста при повреждении отрастающего побега, при нормальном развитии побега отмирают).

Клональное микроразмножение Paeonia anómala L. почками возобновления в культуре in vitro

Введение в культуру in vitro боковых почек. Стеришзация жстантов. На первом этапе клонального микроразмножения, когда необходимо получить стерильную, хорошо растущую культуру, большое значение имеет выбор способа стерилизации, от которого зависит инфицированность эксплантов. их состояние и уровень жизнеспособности. В связи с тем, что Р anómala является гемикриптофитом, получение стерильного материала при эксплантировании боковых почек для микроклонального размножения вида на этапе введения в культуру in vitro требовало специальной разработки.

Установлено, что наиболее эффективным приемом стерилизации почек Р. anómala являлось применение 0.1 %-ного раствора диацида (экспозиция 20 мин) с предварительной обработкой их 70 %-ным раствором этанола (1 мин) и 3 %-ной перекиси водорода (5 мин). По

разработанной схеме ступенчатой стерилизации получен достаточно высокий процент стерильного материала: максимальное число жизнеспособных почек (78 %), минимальное число инфицированных (12 %) и некротированных почек (10 %).

Втяние сроков изоляции экапантов на их развитие. Изолирование боковых почек в августе позволило достичь максимальной жизнеспособности (75 % для резервных почек и 81 % для боковых почек возобновления) и минимальной инфицированности боковых почек (10 и 14 % соответственно). Доля жизнеспособных спящих почек была очень низкой во все сроки изоляции (5-7 %) (табл. 1).

Морфофизиологическая активность, по-видимому, связана с физиологическим состоянием исходного растения в период изолирования экспланта, с изменением биохимических ритмов метаболизма веществ, в том числе и содержанием фитогормонов при прохождении растением периодов роста и покоя.

Таблица 1

Влияние сроков изоляции боковых почек Paeonia anómala L. на показатели их инфицированности и жизнеспособности в культуре in vitro

Боковые почки Доля эксплантов, %

Инфицированных Жизнеспособных Некротированных

Срок изоляции*

март май 1 август октябрь март 'I август октябрь март '¡5 а 1 август октябрь

Резервные 32 62 10 37 49 23 75 20 19 15 15 43

Возобновления 54 74 14 49 36 12 81 13 10 14 5 38

Спящие 62 59 34 71 6 5 7 7 32 36 59 22

Примечание * Срок ишляиии и фа>а рашитня растения в марте - м начала отрастания побегов. в wае - в период аиивного роста побегов в авлсте - в период окончания формирования почек boíoóhob кния в октябре - при переходе к псриол) покоя Жи »«.'способные и некротированные эксшантм относши к неинфицировакным

Влияние эндогенного содержания фитогор ионов в экстантах на морфофизиологическую активность почек. Учитывая большое значение баланса эндогенных гормонов в определении тотипотентности (Бутенко, 1999), естественно предположить, что компетентность клеток к регенерации в значительной степени обусловлена количеством и соотношением эндогенных гормонов. Сравнение содержания фитогормонов в эксплантах Р. anómala в годичном цикле его развития позволило учесть уровень эндогенных гормонов в почках и выбрать оптимальное время их изоляции. Высокое содержание ИУК и цитокининов, низкое содержание АБК в боковых почках приходится на март и с августа по октябрь.1 Логично вводить в культуру in vitro боковые почки именно в эти периоды времени.

Исследования показали влияние срока изоляции эксплантов и фазы развития маточного растения на их регенерационную активность: самая низкая у почек, изолированных в мае, в период отрастания побегов, и в октябре, при переходе к покою, высокая - в августе, в период окончания формирования почек возобновления текущего года. Наибольшей регенерационной способностью обладали боковые почки возобновления и резервные боковые почки Р. anómala, поэтому именно эти группы почек использовались нами для микроразмножения.

Зависимость развития жсплантов от источника уг!еводов и их концентрации в среде С целью выявления оптимального содержания углеводов в питательной среде испытаны сахароза, глюкоза, мальтоза, сорбит, маннит в концентрации от 20 до 60 г/л. По комплексу двух показателей (длине побега и количеству листьев у эксплантов) концентрация сахарозы 40 г/л была оптимальной (рис. I). При увеличении концентрации сахарозы (50 и 60 г/л) наблюдалось удлинение побега, однако количество листьев не возрастало.

Влияние минерспьного состава питательной среды на развитие боковых почек. На начальных этапах культивирования боковых почек были испытаны среды Мурасиге и Скуга, Уайта, Хеллера. Более высокие показатели выживаемости и темпов развития эксплантов отмечены на среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей (рис. 2).

1 Условные обозначения ЛБК - абсцизовая кистота. ИУК инло ш !-3-уксусная кис юта. МУК - а-нафтилуксусная кислота. 2.4-Д - 2.4-ди\лорфеиоксиуксусная кислота. БДП - б-бензиламинопурин. ГА; - гиббсрелловая кислота. МС -питательная срела Мурасиге и Скуга. 'Л МС -питательная срета Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей

S 40 с

л 30 g 20 ■5 ю

4,5 ¿

3,5 «

3 5

2,5 £

2 о 1,5

0,5 q 0 £

20 30 40 50 60 Концентрация сахарозы, г/л

■Н Длина побега, мм —♦—Количество листьев

Рис. I. Влияние концентрации сахарозы в питательной среде 'Л МС на длину побега и количество листьев Paeonia anómala L. через 30 сут культивирования in vitro

Продолжительность культивирования in vitro, сут

I □ Уайта й ИХеллера щ DMC ü □ 1/2 МС

Рис. 2. Влияние минерального состава питательной среды на рост побега Paeonia anómala L. в культуре in vitro

Влияние регуляторов роста на индукцию побегов Изучено действие различных комбинаций ауксинов, цитокининов и гибберелловой кислоты (ГА3) на регенерационную активность эксплантов. Выявлено, что оптимальной для роста и развития резервных боковых почек является среда Мурасиге и Скуга с половинным содержанием минеральных солей ('Л МС) и добавлением 1.0 мг'л БАП, 0.5 мг/л ИУК и 1.0 мг/л ГА-,: для боковых почек возобновления - 0.5 мг/л БАП, 1.0 мг/л ИУК и 1.0 мг/л ГА-, (табл. 2). Различия в развитии между почками возобновления и резервными почками сглаживались вследствие действия экзогенных регуляторов роста, введенных в питательную среду.

Таблица 2

Рост побегов Paeonia anómala L. в зависимости от концентрации регуляторов роста в питательной среде

Боковые почки Длина побегов, мм Концентрация ИУК, мг/л

Концентрация БАП, мг/л

0.1 0.5 1.0

Резервные 4.0 ± 1.5 17.1 ±3.3 13.4 ± 3.3 0.1

7.5 ±2.2 21.3 ± 2.3 25.7 ±5.4** 0.5

7.0 ± 1.5 11.2 ± 1.7* 23.1 ±2.6 1.0

Возобновления 2.3 ± 1.1 10.4 ±3.1 6.4 ± 0.5 0.1

3.1 ± 1.3 19.1 ± 1.5 16.4 ± 1.3** 0.5

4.6 ± 1.1 23.7 ±3.6* 17.1 ±3.3 1.0

Примечание Все варианты опыта содержали в питательной среле ГА в концентрации I 0 мг/ч *, ** Различия достоверны при 5 % уровне шачимости

Микроразмножение побегов. На этапе собственно микроразмножения совместное добавление в питательную среду БАП в концентрации 2.0 мг/л и ИУК - 1.0 мг/л увеличивало регенерационную способность эксплантов. при этом решающее значение принадлежало БАП.

Показано благоприятное воздействие низких положительных температур (4-6°С) на регенерационную активность эксплантов и мультипликацию побегов Р anómala. В течение месяца дифференцировалось и закладывалось в 5-7 почек на эксплант. из которых развивались побеги (рис. 3) Показано, что формирование дополнительных почек и образование побегов происходило путем развития пазушных меристем. In vitro боковые почки закладывались в пазухах листьев. Комплекс факторов при культивировании на питательных средах, содержащих ауксины и цитокинины в подобранных нами оптимальных концентрациях, позволил индуцировать морфогенез не характерный, для

пиона уклоняющегося в естественных условиях. Формирующиеся в пазухах листьев почки развивались в побеги. Этот процесс можно поддерживать непрерывно. При клональном микроразмножении Р anómala в культуре in vitro боковыми почками из одной почки возобновления можно получить 48 побегов за один месяц культивирования. Следовательно, культура изолированных боковых почек Р anómala является в несколько десятков раз более производительным методом размножения, чем наиболее эффективный из известных методов традиционного вегетативного размножения - почками возобновления.

Рис. 3. Формирование побегов из боковой почки Paeonia anómala за 30 сут культивирования на питательной среде Vi МС, дополненной БАП в концентрации 2.0 мг/л и ИУК в концентрации 1.0 мг/л

Укоренение размноженных побегов. На этапе укоренения побегов определены следующие условия: воздействие пониженных положительных температур (8-10°С) и внесение в питательную среду 'Л МС НУК в концентрации 0.1 мг/л. После укоренения растения переносили на подобранный субстрат из дерновой почвы и вермикулита в соотношении 1:1, который позволил достичь 92 % приживаемости растений.

Каллусообразование и регенерация растений в культуре зародышей Paeonia anómala L.

Стерилизация исходного материала. Жизнеспособность изолированных зародышей Р anómala зависела от условий стерилизации, размера при инокуляции. Комбинация стерилизующих растворов и последовательное выдерживание семян в 3 %-ном растворе перекиси водорода в течение 3 мин, 70 %-ном растворе этанола - 1 мин. 0.1 % растворе диацида - 15 мин, позволили достичь максимального количества жизнеспособных семян - 98 %.

Для культивирования были использованы зародыши Р anómala, изолированные на 26-50 сут после опыления. Культивирование зародышей проводили в темноте при температуре 26°С.

Каллусообразование на зародышах. Изолированные зародыши Р anómala использовали для индукции каллуса, поскольку получение морфогенного каллуса и последующая регенерация являются неотъемлемой частью технологий размножения растений (Бутенко, 1999).

Влияние размера зародыша на капусообразование. Оптимальными, дающими интенсивное каллусообразование, оказались зародыши размером 0.5-0.6 мм. Следует отметить, что в отдельных случаях зародыши как среди более крупных, так и среди мелких могли формировать каллус. Тем не менее, крупные зародыши давали более интенсивное каллусообразование.

Зародыши, изолированные через 26-35 сут после опыления, не были способны развиваться и образовывать каллус и чаше всего погибали. Зародыши, вычлененные на 35-38 сут и 38-40 сут после опыления, образовывали светлый рыхлый каллус с частотой 61 % и 98 % соответственно. Частота к&члусообразования на зародышах из зрелых семян составила 89 %.

Втяние регупяторов роста на капусообразование и рост биомассы Успех получения каллуса в большей мере зависит от удачного подбора регуляторов роста, которые индуцируют клеточные деления. Обязательным условием дедифференциаиии растительной клетки и превращения её в каллусную является присутствие в питательной среде ауксинов и цитокининов. Ауксины применяют в более высоких концентрациях, чем цитокинины (Калинин с соавт., 1980).

Для индукции каллуса на изолированных зародышах использовали питательную среду МС. содержащую регуляторы роста в разных комбинациях и концентрациях: 2,4-Д 0 3 2.0 мг/л с кинетином 0.1-0.5 мг'л; НУК 1.0-2.0 мг/л с БАП 0.5 мг'л; ИУК 2.0-3.0 мг/л с кинетином 0.2-0.6 мг'л. В качестве контроля использовали безгормональную питательную

среду МС. Экспланты на всех вариантах сред с регуляторами роста характеризовались высокой частотой каллусообразования, но отличались интенсивностью роста каллусов. На средах, содержащих 2,4-Д и кии^гин. рост биомассы каллуса был медленным, и к пятому пассажу масса сырого каллуса составила 403-426 мг. Нарастание каллуса на средах с НУК и БАП происходило более активно, по сравнению с 2.4-Д и кинетином. К пятому пассажу масса сырого каллуса на среде НУК 1.0 мг/л и БАП 0.5 мг/л составила 1174 мг. Наиболее благоприятным для поддержания роста каллусов было следующее соотношение гормонов: БАП 0.5 и НУК 1.0 мг/л.

Формирование эмбриоидов из каллуса. Каллусы, полученные с применением 2,4-Д и кинетина, пересаживали на питательные среды с исключением 2.4-Д и переносили в условия 16-часового фотопериода для регенерации растений. Морфогенетических изменений в каллусах при этих условиях не наблюдалось. Использование регуляторов роста НУК в сочетании с БАП показало высокую эффективность как для индукции каллуса, так и для формирования эмбриоидов при переносе каллуса в условия фотопериода. Каллусы, полученные на других вариантах сред, при пересадке на питательные среды, содержащие БАП в концентрации 0.5 мг/л и НУК в концентрации 1.0 мг/л или 2.0 мг/л, также становились морфогенными. В течение 4 недель рыхлый каллус становился глобулярным, светло-зеленого цвета, на поверхности которого формировались эмбриоиды. По мере развития эмбриоиды легко отделялись от каллуса. На каллусе, образованном из одного зародыша формировалось до 10-15 эмбриоидов.

Формирование эмбриоидов на зародышах. На среде, содержащей 0,5 мг/л БАП, на поверхности эксплантов-зародышей дифференцировались зародышеподобные структуры без образования промежуточного каллуса. Они имели центральную ось и напоминали эмбриоиды из семени in vivo и зиготические зародыши других двудольных растений (Брюхин, 1993; Брюхин, Батыгина. 1993). На поверхности одного исходного зародыша вновь возникало 2-4 эмбриоида. Образовавшиеся эмбриоиды способны были вновь образовывать эмбриоиды с коэффициентом размножения, равным 3.

Развитие растений из эмбриоидов. Эмбриоиды переносили на безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей, дальнейшее развитие которых приводило обычно к образованию нормальных проростков. Однако при принятых условиях выращивания (температура 26°С) верхушечная почка проростка оставалась в состоянии покоя.

Для выведения почки проростка из состояния покоя использовали влияние низких положительных температур, что ранее показа! о

благоприятный эффект на развитие боковых почек in vitro. В условиях воздействия низкими положительными температурами (5-6°) и присутствия в питательной среде гибберелловой кислоты в концентрации 1.0 мг'л первый лист побега появился через месяц культивирования in vitro. В дальнейшем происходило быстрое развитие растений-регенерантов (рис. 4), обеспечивался более гармоничный и сбалансированный рост их органов. Полученные растения-регенеранты переводили в условия ex vitro по технологии, разработанной для боковых почек. Приживаемость растений-регенерантов составила 90 %.

Рис. 4. Развитие растения-регеиеранта Paeonia anómala L. на питательной среде Vi МС, содержащей гибберелловую кислоту в концентрации 1.0 мг/л, в условиях низких положительных температур

Каллусообразование и регенерация растений в культуре тканей зачаточного побега и цветка Paeonia anómala L. Индукция каллусообразования. В качестве эксплантов для индукции каллуса использовали листовые пластинки, черешки листьев и стебли, изолированные с побега в период его внутрипочечного роста, а

также лепестки, тычинки и цветоложе, изолированные с цветка в фазу бутонизации Р. anómala.

Влияние срока ттяции жстантов на капусообразование. Эксггланты вводили в культуру in vitro весной и осенью. Листовые экспланты, изолированные осенью, характеризовались высокой частотой каллусообразования - 98 %. В апреле активность образования каллуса снижалась до 51 %. Возможно, способность к каллусообразованию связана с физиологическим состоянием растения: снижением каллусообразования весной при активации ростовых процессов и повышение осенью - при переходе растения к покою. Установлено, что осенний период наиболее благоприятен для получения каллусов у Р. anómala.

Влияние концентрации регуляторов роста на индукцию каллусообразования. Установлено, что в культуре тканей листовых пластинок, черешков листьев и стеблей зачаточного побега, лепестков, тычинок и цветоложа цветка в фазу бутонизации возможно получение каллуса. При исследовании роли регуляторов роста в индукции каллусообразования было испытано несколько комбинаций с применением НУК (0.1 мг/л), БАП (0.5 мг/л), 2,4-Д (1.0-3.0 мг/л) и кинетина (0.2 мг/л). На среде с 1.0 мг/л НУК совместно с 0.5 мг/л БАП на эксплантах наблюдалось каллусообразование, но частота его была невысокой, впоследствии отмечался некроз каллуса. Сочетание 2,4-Д с кинетином оказалось наиболее подходящим для образования каллуса на всех типах эксплантов, в отличие от НУК и БАП. Образование каллуса и его пролиферация зависели и от тканевой принадлежности эксплантов. Исследования показали, что в культуре in vitro наиболее отзывчивыми эксплантами для каллусообразования оказались листовые пластинки, черешки листьев зачаточного побега и цветоложе. Лепестки и тычинки образовывали каллусы на испытанных средах с низкой частотой (23 % и M % соответственно). Вероятно, это связано с уровнем эндогенных гормонов, различным в разных частях интактного растения. Зависимость частоты каллусообразования от типа экспланта показана на видах Crocus L. (Чуб и др., 1994) и Aconitum septentrionale К. (Мигранова. 2000). Время начала каллусообразования зависело от типа экспланта и варьировало в диапазоне от 5 до 21 суток. Наибольший выход каллуса был получен на листовых пластинках - 98 % и черешках листьев - 72 % на оптимальной среде, содержащей 2.0 мг/л 2,4-Д и 0.2 мг/л кинетина.

Влияние концентрации гидропчата казеина и дрожжевого экстракта на рост каиуса Для накопления сырой биомассы каллусов адекватной оказалась экспериментально подобранная среда с добавлением по 50 мг/л гидролизата казеина и дрожжевого экстракта Масса сырого каллуса после 4-го пассажа увеличилась с 598 до 2437 мг. Каллусы активно

росли, имели рыхлую структуру, желто-коричневый цвет (рис. 5) и запах эфирных масел, присущий интактному растению. Полученные таким способом каллусы Р. anómala использовались для изучения содержания в них вторичных метаболитов.

Рис. 5. Пролиферация каллуса, индуцированного на листовых пластинках Paeonia anómala L. на среде МС, содержащей 2,4-Д в концентрации 2.0 мг/л и кинетин 0.2 мг/л через 45 сут культивирования

Регенерация растений в каллусной культуре Р. anómala. Для

регенерации растений каллусы переносили в условия 16-часового фотопериода после исключения 2,4-Д из питательной среды. Через 2 недели культивирования каллусы, образованные листовыми пластинками, черешками листьев и стеблями, становились глобулярными и приобретали зеленую окраску. Каллусы распадались на отдельные кусочки и формировали эмбриоиды и почки.

Каллус, образованный листовыми пластинками, был способен формировать эмбриоиды и почки с большей эффективностью (62 %), чем черешки листьев и стебли. Морфогенеза на каллусе, полученном из лепестков, цветоложа и тычиночных нитей, не наблюдалось. На поверхности каллуса весом 200 мг через 2 недели культивирования развивалось 1-2 регенеранта.

Впияние нитрата серебра на регенерацию растении. Включение нитрата серебра в состав регенерационной среды в течение первых 10 сут в концентрации 10 0 мг/л стимулировало морфо генетическую способность каллуса и способствовало увеличению количества эмбриоидов и почек в 3 раза.

Образовавшиеся эмбриоиды переносили на безгормональную среду и в условия, оптимальные для развития растений из изолированных зародышей, почки - на среды подобранные нами для боковых почек с оптимальным содержанием регуляторов роста. Затем растения-регенеранты переводили в условия ex vitro.

Оценка содержания вторичных метаболитов в дикорастущих и интродуцированных растениях, каллусе и растениях-регенерантах Paeonia anómala L.

Культуры тканей и клеток являются перспективным источником получения вторичных метаболитов. В растениях Р. anómala содержатся биологически активные вещества, среди которых ведущую роль в фармакологической активности экстрактов играет моногерпеновый (пинановый) гликозид - пеонифлорин, по содержанию которого оценивается качество сырья согласно японской и китайской фармакопее (Koide et al., 2002). Российские фармакологи предлагают стандартизировать также содержание галлотанинов в настойке пиона (Мальцева, 2003). Возрастающий интерес к источникам альтернативного сырья для получения лекарственных препаратов обуславливает актуальность изучения наличия и состава вторичных метаболитов в культуре тканей Р. anómala. В связи с этим, проведена оценка содержания вторичных метаболитов в корнях и корневищах дикорастущих, интродуцированных растений, регенерантов и каллусе.

Сравнение эффективности двух различающихся по полярности экстрагентов - этанола и метанола - показало, что при использовании метанола оптическая плотность полученных экстрактов была на 30 % выше, чем в этаноле. Кривые светопоглощения сравниваемых экстрактов имели два четко выраженных пика при X = 232 и X = 275-290 нм (рис. 6), характерные для пеонифлорина и галлотаннинов (Koide et al., 2002; Мальцева, 2003). В трех образцах - корневищах и корнях интродуцированных растений, растений-регенерантов, а также каллусе содержание экстрагируемых фенольных соединений было в среднем на 80 % выше, чем в контрольных дикорастущих растениях. Высокое содержание фенольных соединений в корнях растений-регенерантов и каллусе можно объяснить тем, что именно эти образцы характеризуются самой высокой удельной поверхностью, где и сосредоточено максимальное количество фенольных соединений. Следует отметить, что способность более активно синтезировать танниновые производные пентагаллоилглюкозы в каллусной культуре, нежели в интактном растении, отмечена также у представителя кизиловых - Cornus officinalis (Jazaki, Okuda, 1989) Поскольку с медицинской точки зрения больший

210 220 230 240 250 280 270 280 290 300 310 320 330 340

Длина волны, нм А - метанол

230 245 260 275 290 305 320 335

Длина волны,нм В - этанол

Рис. 6. Спектры поглощения фенольных соединений в метанольных (А) и этанольных (В) экстрактах из корней и корневиш дикорастущих (контроль), интродуцированных, растений-регенерантов и каллусной ткани Paeonia anómala L.

интерес представляют растворимые танины, как более эффективные антиоксиданты, то можно считать, что каллусы и регенераты представляют собой не менее эффективный источник галлотанинов.

Определение наличия суммы иридоидов в исследуемых образцах Р. anómala показало, что в каллусных культурах они присутствуют в следовых количествах. По-видимому, это связано с отсутствием

морфологических структур, в которых протекает синтез иридоидов.

* * *

Таким образом, для клонального микроразмножения Р anómala (рис. 7) рекомендуем использовать следующие экспланты:

• боковые почки с побега в период его внутрипочечного роста - для мультипликации и укоренения побегов;

• листовые пластинки зачаточного побега - для индукции каллуса с высокой регенерационной способностью;

• изолированные зародыши - для регенерации растений путем эмбриоидогенеза непосредственно из тканей экспланта и из каллуса, образованного клетками экспланта.

Основными особенностями морфогенеза и микроразмножения Р anómala в культуре in vitro являются: а) возможность индукции морфогенеза in vitro, не характерного для Р. anómala в условиях in vivo, которая заключается в формировании дополнительных почек, что позволяет многократно увеличить количество растений; б) способность к образованию эмбриоидов и возможность их мультипликации.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что метод культуры изолированных органов и тканей in vitro способствует более полной реализации морфогенетических потенций Р anómala в сравнении с традиционными технологиями вегетативного размножения.

2. Выявлено, что лучшими эксплантами для микроразмножения путем мультипликации побегов являются боковые почки, путем эмбриогенеза - зародыши, листовые пластинки и черешки листьев зачаточного побега. Экспланты цветка в условиях выполненных экспериментов активно растущего каллуса морфогенного типа не образовывали.

3. Установлено, что степень морфофизиологической активности боковых почек в культуре in vitro зависит от места их расположения на побеге и срока изоляции экспланта. Подобраны условия для мультипликации побегов с высоким коэффициентом размножения, корнеобразования. а также условия для перевода растений-регенерантов ex vitro.

Индукция Эмбриоидогенеэ каллусогенеза

Рис. 7. Схема клонального микроразмножения Paeonia anómala L.

4. Разработаны способы получения растений-регенерантов путем формирования эмбриоидов из каллуса и непосредственно на эксплантах. Выявлена зависимость кагпусообразования и морфогенеза от состава питательной среды и размера зародыша.

5. Показано, что растения-регенеранты и каллус Р. anómala по содержанию вторичных метаболитов не уступают дикорастущим и интродуцированным растениям.

6. Разработанная технология клонального микроразмножения может быть использована для массового получения посадочного материала в короткие сроки, что способствует решению проблемы сохранения вида.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Байбурина P.KV Ишмуратова М.М., Зарипова A.A. Применение методов культуры in vitro для размножения лекарственных растений // Тез. докл. междунар. конф. "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение растительного генофонда". - М., 1997. - С. 393-394.

2. Зарипова A.A., Ахметова А.Ш., Байбурина Р.К., Жерновкова Т.В. Сохранение генофонда лекарственных растений и биотехнология // Тез. докл. Междунар. конф. IV съезда общества физиологов растений России "Физиология растений - наука III тысячелетия". - М., 1999. - С. 582-583.

3. Зарипова A.A., Байбурина Р.К. Содержание эндогенных гормонов у пиона уклоняющегося, валерианы лекарственной и синюхи голубой перед введением в культуру vitro // Материалы III конф. "Иммуноферментный анализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии". - Уфа, 2000. - С. 196-200.

4. Байбурина Р.К., Зарипова A.A., Жерновкова Т.В. Сохранение генофонда лекарственных растений методами биотехнологии // Науч. труды междунар. конф. "Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений". - М.: ВИЛАР, 2001. - С. 102-105.

5. Зарипова A.A., Байбурина Р.К. Начальные этапы культивирования Paeonia anómala L. in vitro II Науч. труды междунар. конф. "Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений". - М.: ВИЛАР, 2004. -С. 231-234.

6. Зарипова A.A., Шаяхметов И.Ф., Баширова P.M., Байбурина Р.К. Влияние экстрагентов на состав биологически активных веществ в экстрактах из корней и каштусной ткани Paeonia anómala L. II Вестник Башкирского университета. - 2004. - № 2. - С. 67-70.

7. Зарипова A.A., Байбурина Р.К. Микроклональное размножение Paeonia anómala L. (Paeoniaceae) in vitro II Раст. ресурсы. - 2005. - Т. 41. -Вып. 4. - С. 22-30.

8. Зарипова А.А., Баширова Р.М, Байбурина Р.К., Шаяхметов И.Ф. Содержание пеонифлорина в корнях и каллусной ткани Paeonia anomala L. // Мат-лы Всероссийск. конф. "Новые достижения химии и химической технологии растительного сырья". - Барнаул, 2005. - С. 96-99.

9. Zaripova А.А. Micropropagation of Paeonia anomala in culture in vitro И Abstr. I intern. School for Young Scientists "Embryology and Biotechnology" - Saint-Petersburg. - 2005. - P. 60.

10. Зарипова A.A., Баширова P.M., Шаяхметов И.Ф., Байбурина P.K. Сравнение содержания вторичных метаболитов в каллусной ткани и в корнях интактных растений Paeonia anomala L. // Раст. ресурсы - 2006. - Т. 42. - Вып. 3. (в печати).

Зарипова Альфия Ануровна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПИОНА УКЛОНЯЮЩЕГОСЯ (PAEONIA ANOMALA L.)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 04.04.2006 г. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл. печс jrl^Sb Уч.-изд. л. 1,58. Тираж 100 экз. Заказ 26а.

Редакционно-издательский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32.

Л OP 6 А

-7137

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зарипова, Альфия Ануровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЯ, КУЛЬТУРА IN VITRO И ВТОРИЧНЫЕ

МЕТАБОЛИТЫ PAEONIA ANOMALA L. (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

• 1.1. Биологические особенности P. anomala.

1.2. Размножение P. anomala.

1.3. Культура изолированных клеток и тканей in vitro.

1.3.1. Индукция развития пазушных меристем.

1.3.2. Эмбриоидогенез (соматический эмбриогенез).

1.4. Paeonia anomala L. - продуцент вторичных метаболитов.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Метод культуры in vitro.

2.2.2. Метод анатомо-морфологического исследования растительных тканей.

2.2.3. Метод иммуноферментного анализа растительных тканей.

2.2.4. Определение биологически активных веществ в тканях растений

2.2.5. Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ

PAEONIA ANOMALA L.

3.1. Биоморфологические особенности почки возобновления P. anomala как исходного экспланта для культивирования in vitro.

3.2. Клональное микроразмножение Paeonia anomala L. почками возобновления в культуре in vitro.

3.3. Каллусообразование и регенерация растений в культуре зародышей Paeonia anomala L.

3.4. Каллусообразование и регенерация растений в культуре тканей ф зачаточного побега и цветка Paeonia anomala L.

Глава 4. Оценка содержания вторичных метаболитов в дикорастущих и интродуцированных растениях, каллусе и растениях-регенерантах

Paeonia anomalah.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося"

Достижения в области культуры in vitro привели к созданию эффективных и экономически выгодных технологий клонального микроразмножения растений. В основе клонального микроразмножения лежит использование уникальной способности растительных клеток реализовать присущую им тотипотентность под влиянием экспериментальных воздействий и дать начало целому растительному организму. Реализация морфогенетического потенциала в культуре in vitro осуществляется путём как активации существующих в растении меристем, так и индукции возникновения почек или эмбриоидов (соматических зародышей) de novo непосредственно из тканей экспланта и из каллуса, образованного клетками экспланта. Используя в качестве объекта боковые почки, зародыши, молодые ткани, можно клонировать растения, т.е. получать растения, генетически идентичные исходному. Культивируемые клетки и ткани растений можно выращивать в виде неорганизованной клеточной массы (каллус), способной к синтезу видоспецифичных биологически активных соединений, и заменять ими традиционное растительное сырьё.

Актуальным направлением клеточных технологий в настоящее время является сохранение и воспроизводство редких и исчезающих видов растений. Пион уклоняющийся, марьин корень {Paeonia anomala L., семейство Paeoniaceae) в Башкортостане чрезвычайно редок (Кучеров с соавт., 1987), включен в «Красную книгу Республики Башкортостан» (2001), отнесен к категории 1 - виду, находящемуся под угрозой исчезновения. Достоверно установлено, что общее число учтенных особей во всех известных популяциях не превышает 500-600 экз. (Мулдашев с соавт., 2004). P. anomala представляет интерес как лекарственное растение, вошедшее в широкую медицинскую практику. Возрастающая потребность в сырье не может быть удовлетворена возобновлением вида в природных условиях.

Методы культуры изолированных органов, тканей и клеток растений in vitro в настоящее время широко используются для решения как теоретических, так и прикладных задач биотехнологии и физиологии растений (Бутенко, 1999; Носов, 1999; Razdan, 2003). Культивируемые клетки представляют собой пластичные системы, обладающие способностью менять процессы дифференциации под воздействием определенных физических и химических факторов. Это свойство дает возможность подобрать условия для максимальной реализации морфогенетического потенциала культивируемого экспланта, заканчивающейся формированием растений-регенерантов при разработке технологий размножения. Кроме того, регенерация растений в строго контролируемых экспериментальных условиях определяет и практическую значимость методов культуры in vitro.

Условия культивирования P. anomala in vitro изучены недостаточно. Сведения об экзогенной гормональной регуляции морфогенеза P. anomala в культуре ткани немногочисленны (Батыгина, Бутенко, 1981; Брюхин, 1993). Разработка технологии ускоренного размножения, основанная на изучении потенциальных возможностей культивируемых in vitro тканей P. anomala, является актуальной для решения проблемы сохранения ценных и редких генотипов и в тоже время - расширения сырьевой базы.

Как модельная система, культура клеток и тканей позволяет изучать такие вопросы, как соотношение между ростом и развитием клетки с одной стороны и образование, накопление в ней метаболитов - с другой. Культуры тканей и клеток являются перспективным источником получения вторичных метаболитов (Запрометов, 1981; Носов, 1999; Бутенко, 1999). В растениях Р. anomala содержатся специфические для этого вида биологически активные вещества: производные пеонифлорина, иридоиды и др. (Suzuki, 1984; Radix Paeoniae, 1998; Grayson, 1998; Koide et al., 2002; Tanaka et al., 2003). Возрастающий интерес к источникам альтернативного сырья для получения лекарственных препаратов обуславливает необходимость изучения вторичных метаболитов в культивируемых in vitro тканях P. anomala (Hattori, Shu, 1985; Ding, 2000; Takechi, Oh et al., 2001; Tanaka, 2003).

Цель исследования состояла в выявлении особенностей морфогенеза Р. anomala в культуре in vitro и разработке технологии клонального микроразмножения вида. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1) выделить перспективные типы эксплантов для клонального микроразмножения;

2) определить морфофизиологическую активность эксплантов в культуре in vitro для клонального микроразмножения;

Научная новизна. Выявлена высокая морфофизиологическая активность боковых почек P. anomala в культуре in vitro, зависящая от места их расположения на побеге, эндогенного содержания фитогормонов и срока их изоляции. Показано, что оптимальными эксплантами для разработки технологии ускоренного размножения и увеличения выхода количества растений-регенерантов являются боковые почки и зародыши. Определены условия и получены растения-регенеранты путем экспериментального индуцирования эмбриоидов из каллуса зародыша, листовых пластинок и черешков листьев побега в период его внутрипочечного роста. Для эффективного микроразмножения разработаны следующие приёмы: а) активация боковых почек для мультипликации побегов; б) индукция эмбриоидов из тканей зародыша и каллуса; в) индукция морфогенного каллуса из листовых пластинок и черешков листьев побега в период его внутрипочечного роста. Результаты исследования вносят вклад в развитие современных представлений об особенностях морфогенеза и клонального микроразмножения P. anomala. Показано, что экстракты, полученные из корней и корневищ растений-регенерантов и каллуса P. anomala, не уступают по содержанию фенольных соединений экстрактам из дикорастущих и интродуцированных растений.

Практическая значимость работы. Впервые разработана технология клонального микроразмножения редкого вида P. anomala методом культуры in vitro изолированных органов и тканей. Данная технология позволит успешно решить проблему сохранения этого редкого и исчезающего вида растения, сократив сроки получения массового посадочного материала. Биомасса каллуса P. anomala может служить альтернативным источником синтеза фенольных соединений.

Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических факультетах ВУЗов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Зарипова, Альфия Ануровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что метод культуры изолированных органов и тканей in vitro способствует более полной реализации морфогенетических потенций Р. anomala в сравнении с традиционными технологиями вегетативного размножения.

2. Выявлено, что лучшими эксплантами для микроразмножения путем мультипликации побегов являются боковые почки, путем эмбриогенеза -зародыши, листовые пластинки и черешки листьев зачаточного побега. Экспланты цветка в условиях выполненных экспериментов активно растущего каллуса морфогенного типа не образовывали.

3. Установлено, что степень морфофизиологической активности боковых почек в культуре in vitro зависит от места их расположения на побеге и срока изоляции экспланта. Подобраны условия для мультипликации побегов с высоким коэффициентом размножения, корнеобразования, а также условия для перевода растений-регенерантов ex vitro.

4. Разработаны способы получения растений-регенерантов путем формирования эмбриоидов из каллуса и непосредственно на эксплантах. Выявлена зависимость каллусообразования и морфогенеза от состава питательной среды и размера зародыша.

5. Показано, что растения-регенеранты и каллус P. anomala по содержанию вторичных метаболитов не уступают дикорастущим и интродуцированным растениям.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

Для клонального микроразмножения P. anomala рекомендуем использовать следующие экспланты:

• боковые почки с побега в период его внутрипочечного роста - для мультипликации и укоренения побегов;

• листовые пластинки зачаточного побега - для индукции каллуса с высокой регенерационной способностью;

Активно растущую каллусную ткань можно использовать для получения биомассы с целью экстракции биологически активных веществ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения - получения в условиях in vitro растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит уникальная способность растительных клеток реализовывать присущую им тотипотентность под влиянием экспериментальных воздействий и дать начало целому растительному организму (Бутенко, 1999; Лутова, 2003; Егорова с соавт., 2005).

Исследования выявили особенности почек возобновления P. anomala, использованных в качестве исходного материала для культивирования in vitro. Почкам возобновления P. anomala характерно внутрипочечное ветвление - формирование боковых почек на побеге в период его внутрипочечного роста. Боковые почки различаются размером, числом покровных чешуй, временем закладки и обладают различной способностью к пробуждению. В связи с этим, выделены три группы боковых почек: спящие почки (1—4-я снизу - возобновляют растение в критические моменты), дочерние, или собственно почки возобновления (5-8-я снизу - дают начало новой почке возобновления) и резервные почки (9-12-я - обеспечивают восстановление куста при повреждении отрастающего побега, при нормальном развитии побега отмирают).

Установлен наиболее эффективный прием стерилизации почек Р. anomala с применением 0.1 %-ного раствора диацида (экспозиция 20 мин) с предварительной обработкой их 70 %-ным раствором этанола (1 мин) и 3 %-ной перекиси водорода (5 мин), позволяющий достигнуть высокий процент неинфицированного материала: максимальное число жизнеспособных почек (78 %), минимальное число инфицированных (12 %) и некротированных почек (10 %).

Культивирование боковых почек in vitro показало, что только дочерние почки возобновления и резервные почки могут служить исходным эксплантом для клонального микроразмножения.

Морфофизиологическая активность боковых почек зависела от сроков их изоляции, фазы развития маточного растения и эндогенного содержания фитогормонов в эксплантах. Установлено, что оптимальным временем для введения в культуру in vitro боковых почек является август, период окончания формирования почек возобновления, когда они плотно укрыты чешуями и выявлен максимум жизнеспособных и минимум инфицированных эксплантов. Определение эндогенных гормонов в почках в годичном цикле их развития показало, что содержание цитокининов и ауксинов в августе было несколько ниже, чем в марте, до начала отрастания побегов, и октябре, при переходе к периоду покоя. Поэтому необходимо было дополнительное внесение в питательную среду экзогенных гормонов для индукции побегов.

Выявлены высокие показатели выживаемости и темпов развития почек на среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей ('Л МС), в сравнении со средами Хеллера и Уайта. В ходе культивирования боковых почек установлено, что оптимальными для роста и развития резервных боковых почек является среда Уг МС с добавлением 1.0 мг/л БАП, 0.5 мг/л ИУК и 1.0 мг/л ГАз; для боковых почек возобновления - 0.5 мг/л БАП, 1.0 мг/л ИУК и 1.0 мг/л ГА3. Показано, что формирование дополнительных почек и образование побегов in vitro происходит путем активации пазушных меристем на среде, содержащей БАП в концентрации 2.0 мг/л и ИУК - 1.0 мг/л. Выявлено влияние эффективности использования низких положительных температур на развитие эксплантов и мультипликацию побегов P. anomala. При клональном размножении этого вида боковыми почками из одной почки возобновления можно получить 48 микропобегов за месяц культивирования. Полученный нами коэффициент размножения свидетельствует о том, что культура изолированных боковых почек P. anomala является в несколько десятков раз более производительным способом размножения, чем при использовании наиболее эффективного способа традиционного вегетативного размножения P. anomala почками возобновления с частью корневища, с помощью которого можно получить одно растение за вегетационный период.

На этапе укоренения побегов определены следующие условия: воздействие пониженных положительных температур (8-10°С) и внесение в питательную среду МС НУК в концентрации 0.1 мг/л. Перенесение укоренённых растений на подобранный субстрат из дерновой почвы и вермикулита в соотношении 1:1 позволил достичь 92 % приживаемости растений.

В работах многих исследователей (Батыгина, Бутенко, 1981; Болтенков, 2002; Вечернина с соавт., 2004) показана возможность экспериментального индуцирования эмбриоидогенного каллуса с дальнейшим формированием эмбриоидов и прорастанием их до растений-регенерантов. Для получения каллуса из изолированных зародышей на начальном этапе культивирования достигнуты высокие показатели неинфицированных (100 %) и жизнеспособных эксплантов (98 %). Интенсивное каллусообразование наблюдалось на зародышах размером 0.5-0.6 мм, вычлененных из семян на 38-40 сут после опыления с частотой 98 % и зрелых семян с частотой 89 %.

Показана зависимость индукции каллусообразования от состава и концентрации регуляторов роста. Выявлено более интенсивное каллусообразование с использованием комбинации НУК и БАП, по сравнению 2,4-Д и кинетина. Результаты исследований подтвердили данные В. Б. Брюхина (1993) об эффективности использования гормонов НУК и БАП для индукции каллуса на зародышах. Установлено, что включение в питательную среду НУК 1.0 мг/л и БАП 0.5 мг/л эффективно как для активного роста каллуса, так и последующего формирования из него эмбриоидов при переносе каллусов в условия 16-часового фотопериода. На каллусе, образованном из одного зародыша формировалось до 10-15 эмбриоидов за 30 сут культивирования.

Известно, что у ряда цветковых растений в естественных условиях кроме половых могут образовываться и неполовые зародыши - эмбриоиды (Батыгина с соавт., 1978; Эзау, 1980). Т.Б. Батыгиной (2000) отмечена особенность полового зародыша P. anomala — тенденция к бесполому (вегетативному) размножению, проявляющаяся в способности к клонированию. Культивирование зародышей in vitro на питательной среде Уг МС, содержащей БАП в концентрации 0.5 мг/л выявило способность формировать эмбриоиды. На поверхности одного зародыша-экспланта формировались 2-4 эмбриоида за 30 суток культивирования без образования промежуточного каллуса. Образовавшиеся эмбриоиды способны были вновь образовывать эмбриоиды с коэффициентом размножения, равным 3.

Показано, что на безгормональной питательной среде Уг МС дальнейшее развитие эмбриоидов приводило к образованию нормальных проростков. При воздействии низкими положительными температурами (5-6°С) и присутствии в питательной среде гибберелловой кислоты в концентрации 1.0 мг/л первый лист побега появился через 30 сут культивирования in vitro. В дальнейшем происходило быстрое развитие растений-регенерантов. Приживаемость растений-регенерантов в условиях ех vitro составила 90 %.

Молодые эмбриональные ткани зачаточного побега (листовая пластинка, черешок листа, стебель) и цветка в период бутонизации, так же как зародыши P. anomala, являются подходящими эксплантами для вторичного образования адвентивных побегов и соматических зародышей из каллусной ткани.

Установлено, что осенний период наиболее благоприятен для получения каллусов у P. anomala. Возможно, способность к каллусообразованию связана с физиологическим состоянием растения: снижением образования каллуса весной при активации ростовых процессов и повышение осенью - при переходе растения к покою.

Образование каллуса и его пролиферация зависели и от тканевой принадлежности эксплантов. Исследования показали, что в культуре in vitro наиболее отзывчивыми эксплантами для каллусообразования оказались листовые пластинки, черешки листьев зачаточного побега. Лепестки и тычинки образовывали каллусы на испытанных средах с низкой частотой. Вероятно, это связано с уровнем эндогенных гормонов, различным в разных частях интактного растения. Зависимость частоты каллусообразования от типа экспланта показана на видах Crocus L. (Чуб и др., 1994) и Aconitum septentrionale К. (Мигранова, 2000). Наибольший выход каллуса был получен на листовых пластинках - 98 % и черешках листьев - 72 % на оптимальной среде, содержащей 2.0 мг/л 2,4-Д и 0.2 мг/л кинетина.

Для накопления сырой биомассы каллусов адекватной оказалась экспериментально подобранная среда с добавлением по 50 мг/л гидролизата казеина и дрожжевого экстракта.

Регенерация растений получена при перенесении каллусов в условия 16-часового фотопериода после исключения 2,4-Д из питательной среды. Каллус, образованный листовыми пластинками, был способен формировать эмбриоиды и почки с большей эффективностью (62 %), чем черешки листьев и стебли. Морфогенеза на каллусе, полученном из лепестков, цветоложа и тычиночных нитей, не наблюдалось. На поверхности каллуса весом 200 мг через 2 недели культивирования развивалось 1-2 регенеранта.

Включение нитрата серебра в состав регенерационной среды в течение первых 10 сут в концентрации 10.0 мг/л стимулировало морфогенетическую способность каллуса и способствовало увеличению выхода растений-регенерантов в 3 раза.

Активно растущие каллусные ткани P. anomala, которые имели желто-коричневый цвет и запах эфирных масел, присущий интактному растению использовались для изучения содержания в них вторичных метаболитов. Кривые светопоглощения сравниваемых экстрактов имели два четко выраженных пика при X = 232 и X = 275-290 нм, характерные для пеонифлорина и галлотаннинов (Koide et al., 2002; Мальцева, 2003). В трех образцах -корневищах и корнях интродуцированных растений, растений-регенерантов, а также каллусе содержание экстрагируемых фенольных соединений было в среднем на 80 % выше, чем в контрольных дикорастущих растениях. Высокое содержание фенольных соединений в корнях растений-регенерантов и каллусе можно объяснить тем, что именно эти образцы характеризуются самой высокой удельной поверхностью, где и сосредоточено максимальное количество фенольных соединений. Следует отметить, что способность более активно синтезировать танниновые производные пентагаллоилглюкозы в каллусной культуре, нежели в интактном растении, отмечена также у представителя кизиловых - Cornus officinalis (Jazaki, Okuda, 1989). Поскольку с медицинской точки зрения больший интерес представляют растворимые танины, как более эффективные антиоксиданты, то можно считать, что каллусы и регенеранты представляют собой не менее эффективный источник галлотанинов.

Определение наличия суммы иридоидов в исследуемых образцах Р. anomala показало, что в каллусных культурах они присутствуют в следовых количествах. По-видимому, это связано с отсутствием морфологических структур, в которых протекает синтез иридоидов. * &

Для клонального микроразмножения P. anomala (рис. 68) рекомендуем использовать следующие экспланты:

• боковые почки с побега в период его внутрипочечного роста - для мультипликации и укоренения побегов;

• листовые пластинки зачаточного побега - для индукции каллуса с высокой регенерационной способностью;

Индукция каллуса

Пролиферация каллуса ш

ЭмбрйОиЛОГОИС

Растение-регенерант

1 ш йя \ ^

Мультипликация побегов Укоре -нение рв пене ранге

Элонгация побега

Регенераты ь условиях теплицы

Ретенерфнты в грунта

Семя

Изолирование зародышей

Эмб ри оидо ге н еэ V

Икщукция каллуса

Эмбриоидогенез

Формирование Растение-репенерант Регенеранты в условиях проростка теплицы

Регэнерант а грунте

Рис. 68. Схема клонального микроразмножения Paeonia anomala L.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зарипова, Альфия Ануровна, Уфа

1. Алаторцева Т.А., Герасименко Н.В., Тырнов B.C. Возможность клонального размножения кукурузы через культуру in vitro зрелых зародышей. // Пробл. репродукт. биол. раст.: Тез. докл. симп. Пермь, 1996.- С. 36-37.

2. Алпысбаева С.А., Никонов Г.К. Фармакогностическое изучение пиона уклоняющегося // Успехи в изучении природных и синтетических лекарственных средств. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1982. - С. 16-17.

3. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦ и Г СО РАН, 1993.-242 с.

4. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений. Москва, 1976. - С.281.

5. Ахметова А.Ш., Байбурина Р.К. Клональное микроразмножение Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin in vitro II Раст. ресурсы. 2002. - Т. 38.- Вып. 4. С. 82-90.

6. Ахметова А.Ш., Байбурина Р.К. Размножение Lezpedeza bicolor Т. в культуре in vitro II Раст. ресурсы. 2003. - Т.39. - Вып. 1. - С. 115-122.

7. Байбурина Р.К. Микроклональное размножение взрослых гибридных деревьев Betula pendula Roth var Carelica Merckl. // Раст. ресурсы. 1998. - Т. 34. - Вып. 2. - С. 9-22.

8. Байбурина Р.К., Мухаметвафина А.А., Миронова JI.H. Опыт культивирования некоторых видов Lilium L. in vitro II Раст. ресурсы. 2004. -Т. 40.-Вып. 1.-С. 82-89.

9. Бартиш И.В., Меркулов С.М., Корховой В.И., Копань В.П. Микроклональное размножение груши {Pyrus communis L.) in vitro II Физиол. и биохимия культ, раст. 1994. - 26. - № 1. С. 84-90.

10. Барыкина Р.П. Жизненные формы пионов и возможные пути их структурной эволюции. // Вест. МГУ. Сер. биол. - 1979. - № 2. - С. 14-26.

11. Батукаев А.А., Смирнов К.В. Биотехнологические методы ускоренного размножения винограда {in vitro) // Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. Т. 2 / Под ред. B.C. Шевелухи. М.: Высшая школа, 2001 -С. 142-150.

12. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. JL: Наука, 1987. - 103 с.

13. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения новая категория способов размножения цветковых растений // Тр. БИН им. B.JI. Комарова. - 1993. - № 8.-С. 15-25.

14. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения новый тип вегетативного размножения // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3: Системы репродукции / Ред. Т.Б. Батыгина. - СПб.: Мир и семья, 2000. - С. 334-349.

15. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2: Семя / Ред. Т.Б. Батыгина. СПб.: Мир и семья, 1997. - С. 624-648.

16. Батыгина Т.Б., Бутенко Р.Г. Морфогенетические потенции зародыша покрытосеменных растений (на примере представителей рода Paeonia, сем. Paeoniaceae) // Ботан. журн. 1981. - Т. 66. - № 11. - С. 1531-1547.

17. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. СПб.: Изд-во Санкт-Петербургского университета, 2002. - 232 с.

18. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro. Эмбриогенез у покрытосеменных растений // Ботан. журн. -1978. Т. 63. - № 1.-С. 87-111.

19. Болтенков Е.В. Изучение особенностей культивирования in vitro тканей дальневосточных видов рода Iris L. (Iridaceae) для использования в биотехнологии: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Владивосток, 2002. - 24 с.

20. Боронникова С.В. Семенная продуктивность Lilium martagon L. subsp. pilosiusculum (Freyn) Miscz ex Iljin и Paeonia anomala L. (Пермская обл.) // Раст. ресурсы. 2002. - Т.38. - Вып.З. - С. 50-53.

21. Брюхин В. Б., Батыгина Т. Б. Эмбриоидогенез и органогенез в культуре Paeonia anomala L. // II междунар. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология": Тез. докл. Алма-Ата, 1993. - С. 48.

22. Брюхин В.Б. Развитие зародыша пиона in vivo и in vitro: Автореф. дис. . канд. биол. наук. СПб, 1993. - С. 1-21.

23. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Культуры трансформированных клеток растений как источник получения продуктов вторичного метаболизма // Успехи совр. биол. 1992. - Т. 112. - № 3. - С. 342-349.

24. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Получение каллусных культур ткани Aristolochia manshuriensis Кош. // Раст. ресурсы. 1989. - Т. 25. - Вып. 2. - С. 266-270.

25. Бургутин А.Б., Мусин С., Бутенко Р.Г. Сегрегация биохимических генетических детерминант у сомаклональных вариантов межвидового соматического гибрида картофеля // Физиол. раст. 1994. - Т. 41. - Вып. 6. -С. 843-852.

26. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

27. Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Наука, 1991.-280 с.

28. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

29. Бутенко Р.Г. Физиология клеточных культур, состояние и перспективы // Физиол. раст. 1978.-Т. 25.-Вып. 5.-С. 1009-1024.

30. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциацияв культуре клеток растений // XXXV Тимирязевские чтения. М.: Наука, 1975. -51 с.

31. Бутенко Р.Г., Воробьев А.С, Носов A.M., Князьков И.Е. Синтез, накопление и локализация стероидных гликозидов в клетках разных штаммов в Dioscorea deltoidea Wall. // Физиол. раст. 1992. - Т. 39. - Вып. 6. -С. 1146-1153.

32. Васильев А.Е., Воронин Н.С., Еленевский А.Г., Серебрякова Т.И. Ботаника. Анатомия и морфология растений. М.: Просвещение, 1978. - 478 с.

33. Васильева В.Е., Фрейберг Т.Е., Батыгина Т.Б. Развитие зародышей пиона в культуре in vitro // Тез. докл. VII Всес. симп. по эмбриологии растений. Киев, 1978. - Ч. 3. - С. 9-11.

34. Васильева М.Ю. Формирование органов возобновления у травянистых пионов. // Вопросы интенсификации декоративного садоводства. М., 1975. -С. 65-69.

35. Верещагина И. В. О морфологии подземных частей пиона. // Бюл. ГБС АН СССР. 1971. - Вып. 71. - С. 70-72.

36. Верещагина И.В. Культура пиона в Западной Сибири. Метод, указ. Новосибирск: Сибирское отд. ВАСХНИЛ НИИ сад-ва Сибири им. М.А. Лисавенко, 1982. -36 с.

37. Вечернина Н.А., Таварткиладзе O.K., Клементьева Л.А., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris in vitro // Раст. ресурсы. 2004. - Т. 40. - Вып. 4. - С. 56-64.

38. Воллосович Т.А., Пучинина Т.Н., Литунова Н.А. Оптимизация состава макросолей для культуры ткани Rauwolfia serpentine Benth. Сообщение 3. // Растит, ресурсы. 1982. - Т. 18. - Вып. 2. - С. 239-243.

39. Вторичные метаболиты растений и методы их исследования: учебное пособие / P.M. Баширова, Т.И. Плеханова, А.Ю. Касьянова, Н.В. Кудашкина. -Уфа: Здравоохранение Башкортостана, 2004. 168 с.

40. Высоцкий В.А., Поликарпова Ф.Я., Трушечкин В.Г. Использование 6-бензиламинопурина для размножения плодовых и ягодных культур. // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. I Всесоюз. конф. М., 1981.-С. 155-156.

41. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения. М.: Высшая школа, 1990. - 124 с.

42. Говорова Г.Ф. Закономерности формообразования селекционируемых признаков и свойств при межсортовой гибридизации земляники // Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. Т. 2 / Под ред. Шевелухи B.C. М., 2001. - С. 121-142.

43. Голубинская Е.С. Культура изолированных зародышей пиона // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970.-С. 36-41.

44. Горобец В. Ф. Строение и формирование почек возобновления у пионов // Интродукция и акклиматизация растений на Украине и в Молдавии. -Киев, 1974.-С. 49-51.

45. Государственная фармакопея СССР. М., 1989. - С. 330-331.

46. Государственный реестр лекарственных средств. М.: МЗРФ, 2000. -1079 с.

47. Дубовицкая Н.И., Кренке А.Н. Размножение пиона стеблевыми черенками. // Бюлл. ГБС. 1950. - Вып. 5. - С. 56-62.

48. Дубовицкая Н.И., Кренке А.Н. Регенерационная способность пиона в зависимости от возрастного состояния побегов. // Бюлл. ГБС. 1952. - Вып. 1.-С. 42-49.

49. Дударь Ю.Н. Годичный цикл морфогенеза пиона узколистного и возможности его размножения. // Тр. Ставропольского НИИСХ. 1966. -Вып. 2.-С. 191-197.

50. Дудик Н.М., Харченко Е.Д. Пионы: каталог-справочник. К.: Наукова думка, 1987.-128 с.

51. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. -М.: Академия, 2005.-208 с.

52. Жмылёв П.Ю., Алексеев Ю.Е., Карпухина Е.А., Баландин С.А. Биоморфология растений: иллюстрированный словарь. М., 2002. - 240 с.

53. Жукова Н.А. К анатомической характеристике Paeonia tenuifolia L. // Зап. Центр.-Кавказск. отд. Всесоюз. ботан. об-ва. 1967. - Вып. 2. - С. 41-45.

54. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М., 1981. - С. 37-50.

55. Здруйковская-Рихтер А.И., Орехова В.П., Тарасюк Т.М. Итоги селекции черешни с использованием эмбриокультуры in vitro II Бюлл. ГБС. 1997. -Вып. 175.-С. 137-141.

56. Зубкус Л.П. Культура зародышей и семян на искусственных питательных средах как метод интродукции декоративных растений Сибири. // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970.-С. 45-47.

57. Иванова А.Б., Анцыгина Л.Л., Ярин А.Ю. Современные аспекты изучения фитогормонов. Цитокинины // Цитология. 2001. - Т. 43. - № 6. -С. 537-543.

58. Иванова И.А. О биологии прорастания семян пионов // Бюлл. ГБС. -1969.-Вып. 74.-С. 34-35.

59. Иванова И.А. Особенности прорастания и сравнительно-гистохимическое изучение семян некоторых цветочно-декоративных растений. // Интродукция и селекция цветочно-декоративных растений. М.: Наука, 1978.-С. 131-153.

60. Игнатьева И. П. Онтогенетический морфогенез вегетативных органов пиона уклоняющегося (Paeonia anomala L.). // Изв. ТСХА. 1995. - Вып. 4. -С.108-134.

61. Игнатьева И. П. Онтогенетический морфогенез вегетативных органов пиона уклоняющегося {Paeonia anomala L.) // Изв. ТСХА. 1996. - Вып. 1. -С. 114-141.

62. Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии / Под ред. Г.Р. Кудояровой. -Уфа: АН РБ, 2000.-223 с.

63. Интродукция растений в Главном ботаническом саду им. Н.В. Цицина. К 50-летию основания / С.Е. Коровин, З.Е. Кузьмин, В.Н. Былов и др. М.: Наука, 1995.- 188 с.

64. Иоффе М.Д., Жукова Г.Я. Культура изолированных зародышей покрытосеменных растений на искусственной среде // Ботан. журн. 1965. -Т. 50. -№ 8. - С. 1157-1182.

65. Ипполитова Н.Я., Высоцкий В.А., Талалаева Г.А. Микроклональное размножение пионов // Цветоводство. 1984. - № 1. - С. 34.

66. Ишмуратова М.М. Клональное микроразмножение Rhodiola rosea L. и R. iremelica Boriss. in vitro II Раст. ресурсы. 1998. - Т. 34. - Вып. 1. - С. 12-23.

67. Ишмуратова М.М., Зарипова А.А. Особенности морфогенеза Polemonium caeruleum L. in vitro и in vivo // Раст. ресурсы. 2000. - Т. 36. -Вып. 3. - С. 106-114.

68. Калинин В.Ф., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. М.: Наук, думка, 1980. - 488 с.

69. Каранова C.JL, Носов A.M., Пауков В.Н, Шамина З.Б. Продуктивность различных линий диоскореи дельтовидной // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. - С. 83-87.

70. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. -М.: Наука, 1983.-96 с.

71. Кемулярия-Натадзе JI.M. Кавказские представители рода Paeonia L. // Тр. Тбилисского Ботан. ин-та. 1961. - Т. 21. - С. 3-51.

72. Колпакова М.В., Попов Д.М. Исследование количественного содержания иридоидов в пионе уклоняющемся // Хим.-фармацев. журн. М: Медицина, 1994. - С. 24-26.

73. Кравченко О.А. Интродукция дикорастущих видов пионов в лесостепи Башкирского Предуралья // Интродукция полезных растений в Башкирии. -Уфа, 1976.-С. 160-174.

74. Красная книга республики Башкортостан. Т. 1. Редкие и исчезающие виды высших сосудистых растений. Уфа, 2001. - 212 с.

75. Краснова Н.С. Пионы. М.: Колос, 1971. - 69 с.

76. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков // Успехи соврем, биологии. 1995. -Т. 115. - Вып. 6. - С. 692-705.

77. Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б., Горбунова В.Ю., Титова Г.Е., Сельдимирова О.А. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы. Атлас. М.: Наука, 2005. - 99 с.

78. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых тел // Физиол. раст. 1986. - Т. 33. - № 6. - С. 1221-1227.

79. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н. Иммуноферментная тест-система для определения цитокининов // Физиол. раст. 1989. - Т. 37. - № 1. -С. 80-89.

80. Куликов П.В. Экология и репродуктивные особенности редких орхидных Урала: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Екатеринбург, 1995. -24 с.

81. Кучеров Е.В., Мулдашев А.А., Галеева А.Х. Охрана редких видов растений на Южном Урале. М.: Наука, 1987. - 204 с.

82. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

83. Лекарственные растения: Справочное пособие / Н.И. Гринкевич, И.А. Баландина, В.А. Ермакова и др. / Под ред. Н.И. Гринкевич. М.: Высшая школа, 1991.-398 с.

84. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. -М. 1979. 548 с.

85. Лунева Л.С. Размножение ирисов методом культуры апикальных меристем. // Ботан. журн. 1977. - Т. 62. - № 3. - С. 416-421.

86. Лутова JT.А. Биотехнология высших растений. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2003.-228 с.

87. Малышева Р. М. Возрастные этапы в онтогенезе пиона уклоняющегося // Бюл. Сиб. бот. сада. 1976. - Вып. 10. - С. 31-36.

88. Малышева P.M. Особенности роста и развития интродуцированных пионов в Томске // Бюлл. Сиб. бот. сада. 1978. - Вып. 11. - С. 3-17.

89. Мальцева Е.М. Исследование и стандартизация дубильных веществ настойки пиона // Медицина в Кузбассе, 2003. № 3. - С. 21-25.

90. Махновская М.Д., Сечняк А.Л., Игнатова С.А. Разработка условий получения регенерантов из незрелых зародышей пшенично-ржаных гибридов // Физиол. и биохим. культ, растений. 1994. - Т. 26. - № 6. - С. 584-587.

91. Медведев С.С. Физиология растений. СПб.: изд-во Санкт-Петерб. унта, 2004. - 234 с.

92. Методы изучения фенольных соединений: методические указания / Н.В. Ломаченко, P.M. Баширова, И.Ю. Усманов. Уфа: БГУ, 1997. - 18 с.

93. Мигранова И.Г. Aconitum septentrionale К.: физиологические и генетические аспекты: Автореф. дис. канд. биол. наук. Уфа, 2000. -22 с.

94. Минаева В. Г. Пион марьин корень Paeonia anomala L. // Лекарственные растения Сибири. - Новосибирск, 1991.-С. 146-148.

95. Миронова О.Ю., Калашникова Е.А. Клональное микроразмножение редких и исчезающих луковичных растений, в том числе занесенных в Красную книгу // Сельскохозяйственная биотехнология. Т. 2 / Под ред. Шевелухи B.C. М., 2001. - С. 92-98.

96. Митрофанова И.В. Минимализация роста декоративных растений под воздействием химических факторов в культуре in vitro // The Biology of Plant

97. Cells in vitro and biotechnology: VII International conference. Saratov, 2003. -C. 203.

98. Молканова О.И., Беляева Ю.Е., Стахеева Т.С., Васильева О.Г. Использование биотехнологических методов для воспроизводства фиторесурсов // The Biology of Plant Cells in vitro and biotechnology: VII International conference. Saratov, 2003. - C. 209.

99. Молканова О.И., Коновалова JI.H. Клональное микроразмножение видов и сортов сирени // The Biology of Plant Cells in vitro and biotechnology: VII International conference. Saratov, 2003. - C. 207.

100. Москов И.В. О развитии зародыша у некоторых видов пионов // Ботан. журн. 1964. Т. 49. - № 6. - С. 887-894.

101. Мулдашев А.А, Кучеров Е.В, Галеева А.Х. Об охране и рациональном использовании флоры и растительности в северной зоне Башкортостана // Вопросы рационального использования и охраны растений в республике Башкортостан. Уфа, 1998. - С. 5-18.

102. Мулдашев А.А., Галеева А.Х., Маслова Н.В. Проблемы охраны пиона уклоняющегося {Paeonia anomala L.) в республике Башкортостан // Проблемы сохранения биоразнообразия на Южном Урале. Уфа, 2004. - С. 170-171.

103. Назарова Т. М. Формирование почек возобновления у травянистых пионов в условиях Новосибирской области. // Интродукция растений Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1983. - С. 148-152.

104. Некратова Н.А., Некратов Н.Ф. Лекарственные растения Алтае-Саянской горной области. Ресурсы, экология, ценокомплексы, популяционная биология, рациональное использование. Томск: Изд-во Том. Ун-та, 2005.-228 с.

105. Немирович-Данченко Е.Н. Семейство Пионовые (.Paeoniaceae) II Жизнь растений. -М.: Просвещение, 1981.-Т. 5 (2).-С. 16-18.

106. Николаева JI.A. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование. С-Пб: С-Пб. хим.-фарм. ин-т, 1992. — 60 с.

107. Николаева М.Г. Покой семян // Физиология семян. М.: Наука, 1982. -С. 125-183.

108. Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. / Ред. Данилова М.Ф. Л.: Наука, 1985. -С. 1-347.

109. Носов A.M. Культура клеток высших растений уникальная система, модель, инструмент // Физиол. раст. 1999. - Т. 46. - № 6. - С. 837-844.

110. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Наука, 1991.-С. 5-20.

111. Нухимовский Е.Л., Нухимовская Ю.Д. Экологическая морфология некоторых лекарственных растений в естественных условиях их произрастания. Сообщ. 5. Paeonia anomala L. // Растит, ресурсы. 1978. - Т. 14.-Вып. 1.-С. 347-355.

112. Онищенко Н.П. Размножение пионов почками возобновления // Вопросы декоративного садоводства. Барнаул, 1964. - С. 32.

113. Пилат Т.Л., Иванов А.А. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение). -М. Аваллон, 2002. -328 с.

114. Пиралов Г.П. Байдак Л.А., Абраимова О.Е. Влияние нитрата серебра на каллусогенез и регенерацию растений в культуре незрелых зародышей кукурузы. // Физиол. и биохимия культ, раст. 1994. - Т. 26. - № 6. - С. 567572.

115. Поздова Л.М., Разумова М.В. Покой семян // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2. Семя / ред. Т.Б. Батыгина, 1997. -С. 656-666.

116. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: ЛГУ, 1982. - 248 с.

117. Полевой В.В., Саламатова Т.С. Физиология роста и развития растений. -Л.: ЛГУ, 1991.-239 с.

118. Попович Е.А., Филипена В.Л. Влияние экзогенного цитокинина на жизнеспособность эксплантов голубики высокой in vitro // Физиол. раст. -1997. Т. 44. - № 1. - С. 104-107.

119. Путенихин В.П. Популяционная структура и сохранение генофонда хвойных видов на Урале: Автореф. дис. . докт. биол. наук. Красноярск, 2000.-48 с.

120. Рабинович A.M. Лекарственные растения России, обладающие противораковой активностью // Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений: науч. труды междунар. конф. М.: ВИЛАР, 2001. -С. 359-360.

121. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Л.: Наука. Ленингр. отд-ние, 1986. - 334 с.

122. Редкие и исчезающие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране / Под ред. А.Л. Тажтаджяна. Л.: Наука. Ленингр. отд-ние, 1981. -263 с.

123. Редкие и исчезающие растения Сибири. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1980.-224 с.

124. Репях С.М., Юшкова Е.В., Величко Н.А. Влияние химических и физических факторов на рост и развитие каллусных тканей левзеи сафлоровидной // Биотехнология. 1996. - № 8. - С. 45^49.

125. Родина Е.А. Экспериментальный морфогенез в культуре тканей хвойных пород (Pinus silvestris, Picea abies). Автореф. дисс. . канд. биол. наук. М., 1989. 22 с.

126. Рубцова М.А., Левенко Б.А., Тараненко Л.К., Шаповал А.И., Янчук Р.И. Получение межвидовых гибридов между гречихой обыкновенной и гречихой татарской с помощью эмбриокультуры // Физиол. и биохимия культурных раст. 1994. - Т. 26. - № 6. - С. 563-566.

127. Рысева И.Н., Музарук Т.И., Журавлев Ю.Н. Получение каллусных культур ткани Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino. // Раст. ресурсы. 1992. Т. 28. - Вып. 2. - С. 73-77.

128. Сабинин Д.А. Физиология развития растений. М., 1963. - 350 с.

129. Саркисова М., Бутенко Р.Г., Синюхин А. Культура тканей Dioscorea deltoidea Wall, как продуцент стероидных сапонинов и генинов. // Раст. ресурсы. 1971. - Т. 7. - Вып. 4. - С. 517-524.

130. Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. B.C. Шевелухи. М.: Высшая школа, 2003. - 469 с.

131. Семенова Г.П. Интродукция редких и исчезающих растений Сибири. -Новосибирск: Наука, 2001. 142 с.

132. Серебряков И.Г. Жизненные формы высших растений и их изучение. // Полевая геоботаника. Т. 3. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1964. - С. 146-205.

133. Сивакумар Г., Кришнамурти К.В. Органогенез Gloriosa superba в культуре in vitro. II Физиол. растений. 2004. - Т. 51. - № 5. - С. 790-798.

134. Смирнова О.В., Заугольнова Л.Б., Торопова Н.А., Фаликов Л.Д. Критерии выделения возрастных состояний и особенности хода онтогенеза у растений различных биоморф // Ценопопуляции растений (основные понятия и структура). М.: Наука, 1976. - С. 14-43.

135. Сосновец А.А. Ускоренное выращивание сеянцев пионов из семян. // Вопросы озеленения. М.: Изд-во МГУ, 1965. - С. 92-109.

136. Талалаева Г.А. Возможность размножения декоративных культур in vitro // Тез. докл. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов Московской обл. -М., 1984.-С. 83-84.

137. Талалаева Г.А., Поликарпова Ф.Я. Некоторые вопросы микроразмножения пиона травянистого // Тез. докл. Всесоюз. конф. «Культура клеток растений и биотехнология» Кишенев, 1983. - С. 133-134.

138. Талат М.М., Калинин А.В., Лапочкина И.Ф. Использование эмбриокультуры in vitro при межвидовой гибридизации // Бюлл. ГБС. 1997. -Вып. 175.-С. 127-132.

139. Тахтаджян A.JI. Система и филогения цветковых растений. М.-Л.: Наука, 1966.-610 с.

140. Тельпуховская А.Г. Многолетние декоративные растений Прибайкалья. Иркутск, 1974. - 206 с.

141. Турова А.Д., Сапожникова Э.Н. Лекарственные растения СССР и их применение. М.: Медицина, 1982. - С. 45-47.

142. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Регенерационная способность эксплантов рода Rubus в зависимости от длительности культивирования in vitro // С.-х. биол. Сер. биол. раст. - 1995. - № 1. - С. 85-89.

143. Уранов А.А. Онтогенез и возрастной состав популяций. // Онтогенез и возрастной состав популяций цветковых растений. М.: Наука, 1967. - С. 38.

144. Успенская М.С. Пионы. М.: ЗАО «Фитон +», 2003. - 208 с.

145. Фаулер М.В. Экономические аспекты промышленного культивирования клеток растений // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат. 1987. - С. 9-42.

146. Федоров Ал. А., Кирпичников М.З., Артюшенко З.Т. Атлас по описательной морфологии высших растений. Стебель и корень. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1962.-353 с.

147. Фитоэкдистероиды. СПб: Наука, 2003. - 293 с.

148. Фролов Ю.М. , Канев В.А., Нопина Л.Н., Жигарева О.М. Причины редкости Paeonia anomala L. на Европейском Северо-Востоке // Репродуктивная биология редких исчезающих видов растений. Сыктывкар, 1999.-С. 76-78.

149. Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М.: Наука, 1979. - 155 с.

150. Цингер Н.В. О причинах медленного прорастания семян пионов // Тр. Гл. Бот. сада. 1951. - Т. II. - С. 103-145.

151. Чеченева Т. H., Труханов В. А. Побеговый морфогенез и соматический эмбриогенез в культуре ткани // Экспериментальная генетика. Киев: Наукова думка, 1989.-С. 120-128.

152. Чуб В.В. Власова Т.А., Бутенко Р.Г. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов Crocus L. // Физиол. растений, 1994.-Т. 41.-№ 6.-С. 815-820.

153. Чулафич- Л., Грубишич Д., Вуиичич Р., Волкова Л.А., Попов А.С. Соматический эмбриогенез in vitro диоскореи кавказской и диоскореи балканской и криосохранение их органогенных каллусных тканей // Физиол. раст. 1994. Т. 41. - № 6. - С. 929-934.

154. Чурикова О.А., Румынии В.А., Барыкина Р.П., Слюсаренко А.Г. Морфогенетические процессы в луковичных чешуях некоторых видов лилий в условиях масс-клонального размножения in vitro. // Бюлл. ГБС. 1994. -Вып. 169.-С. 105-111.

155. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа: Гил ем, 2001. - 160 с.

156. Шаяхметов И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез: Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. СПб., 2001. 45 с.

157. Шаяхметов И.Ф. Соматический эмбриогенез и селекция злаковых культур. Уфа: БГУ, 1999. - 166 с.

158. Шипчинский Н.В. Paeonia anomala L. Марьин корень. // Флора СССР. Т. 7. - М. - Л.: Изд-во АН СССР, 1937. - С. 33.

159. Шорина Н.И., Михалевская О.Б. Почка // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3. Системы репродукции / ред. Т.Б. Батыгина, 2000. С. 310-314.

160. Эзау К. Анатомия семенных растений. Т. 1. М.: Мир, 1980. - 558 с. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 1: Генеративные органы цветка / Ред. Т.Б. Батыгина. - СПб.: Мир и семья, 1994. -508 с.

161. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2: Семя / Ред. Т.Б. Батыгина. СПб.: Мир и семья, 1997. - 830 с.

162. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3. Системы репродукции / Ред. Т.Б. Батыгина. СПб.: Мир и семья, 2000. - 640 с.

163. Юдакова З.С., Танашкина Т.В., Журавлев Ю.Н. Оптимизация условий получения in vitro фертильных растений из незрелых зародышей сои // С.-х. биол. Сер. Биол. раст. - 1994. - № 5. - С. 27-31.

164. Южаков В.И., Соловьева И.Ф. Морфобиологические особенности пиона уклоняющегося разного возрастного состояния в условиях культуры // Итоги интродукции и селекции травянистых растений на Урале. Екатеринбург, 2001.-С. 70-80.

165. Яковлев М.С. Принципы выделения основных эмбриональных типов и их значение для филогении покрытосеменных // Проблемы ботаники. Вып. 3. -Л., 1958.-С. 168-195.

166. Яковлев М.С. Семейство Paeoniaceae // Сравнительная эмбриология цветковых растений. Phytolaccaceae Thymelaeaceae. - Л.: Наука, 1983. - С. 70-77.

167. Яковлев М.С., Иоффе М.Д. Особенности эмбриогенеза рода Paeonia L. // Ботан. журн. 1957. - Т. 42. - № 10. - С. 1491-1502.

168. Яковлев М.С., Иоффе М.Д. Эмбриология некоторых представителей рода Paeonia L. // Морфология цветка и репродуктивный процесс у покрытосеменных растений / Ред. Яковлев М.С. M.-JL: Наука, 1965. - С. 140-176.

169. Яковлев М.С., Некратова Н.А., Гусева Л.И. Пион уклоняющийся, Марьин корень, чегна, шегня Paeonia anomala L. // Биологические особенности растений Сибири, нуждающихся в охране. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1986.-С. 148-179.

170. Avitia Garcia Е., Castillo Gonzalez A.M. Propagacion in vitro de cuatro cultivares de frambuesa (Rubus sp.) // Rev. Chapingo. 1992. - 16. - N 78. - P. 103-106.

171. Baker Charleen M., Wetzstein Hazel Y. Influence of auxin type and concentration on peanut somatic embryogenesis // Plan Cell, Tissue and Organ Cult. 1994. - 36. - N 3. - P. 361-368.

172. Banthorpe D.V., Njor V.C.O. Light-dependent monoterpene synthesis in Pinus radiata cultures // Phytochemistry. 1984. - V. 23. - № 2. - P. 295-299.

173. Banzel Maria L., Sankhla N., Joshi Sangeeta, Sankhla Daksha Induction of direct somatic embryogenesis and plant regeneration in pepper (Capsicum annuum L.) // Plant Cell Repts. 1996. - 15. - N 7. - P. 536-540.

174. Beattie L.D., Garrett R.G. Adventitious Shoot production from immature embryos of white clover // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1995. - 42. - N 1. -P. 67-72.

175. Bouvier F., Suire C., d' Harlingue A., Backhaus R.A., Camara B. Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells // Plant J. 2000. - 24. - P. 241-252.

176. Boxus Ph., Quoirin M., Laine J.M. La «micropropagation», precede industriel de multiple cation rapide du fraisier // Plant cell, tissue and organ culture. B. ect.: Springer-Verl., 1977.-P. 130-144.

177. Brukhin V.B., Batygina T.B. Embryo culture and somatic embryogenesis in culture of Paeonia anomala // Phytomorphology. 1994. - 44 (3-4). - P. 151-157.

178. Caplin S.M. Growth and morphology of tobacco tissue cultures in vitro // Bot. Gaz. 1946. - 108. -N 3. - P. 379-393.

179. Chen L., Luthe D.S. Analisis of proteins from embryogenic and nonembryogenic rice {Oryza sativa L.). // Plant Sci. 1994. - V. 48. - N 3. - P. 181-188.

180. Datta S.K. Androgenesis in cereals // Current trends in the embryology of Angiosperms. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Acad. Publ. - 2001. - P. 471— 488.

181. Ding Hsiou-Yu, Lin Hang-Ching, Teng Che-Meing, Wu Yang-Chang Phytochemical and Pharmacological studies on Chinese Paeonia species // J. of the Chinese chemical Society. -2000. -47. P. 381-388.

182. Ding Hsiou-Yu, Wu Yang-Chang, Lin Hang-Ching, Chan Yu-Yi, Wu Pei-Lin, Wu Tian-Shung Glycosides from Paeonia suffruticosa II Chem. Pharm. Bull. 1999. - V. 47. - N 5. - P. 652-655.

183. El-Morsy A.A., Millet B. Rhythmic growth and optimization of micropropagation: The effect of excision time and position of axillary buds on in vitro culture of Citrus aurantium L. // Ann. Bot. (USA). 1996. - 78. - N 2. - P. 197-202.

184. Feirer R.P., Conkey J.H., Verhagen S.A. Triglycerides in embryogenic conifer calli: a comparison with zygotic embryos // Plant Cell Repts. 1995. - V. 8.-N4.-P. 207-209.

185. Ferreira E. C., Nogueira A.R. Vanillin-condensed tannin study using flow injection spectrophotometry // Talanta. 2000. - 51. - P. 1-6.

186. Furini A., Jewell D.C. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature and mature embrios of tropical and subtropical Zea mays L. genotypes // Maydica. 1994. -39. -N 3. - P. 155-165.

187. Gershenzon J., Croteau R. Terpenoid biosynthesis: The basic pathway and formation of monoterpenes, sesquiterpenes and diterpenes // In TS Moore ed, Lipid Metabolism in Plants. CRC Press. - 1993. - P. 340-388.

188. Grayson D.H. Monoterpenoids // Natural product reports. 1998. - P. 439475.

189. Gribaudo I., Restagno M. Influence of sucrose concentration on axillary bud proliferation in micropropagated grapevine // Bull. Rech. Agron. Gembloux. -1995. -30.-N 1-2.-P. 55-57.

190. Harada M., Suzuki M., Ozaki Y. Effect of Japanese Angelicia root and Paeonia root on uterine contraction in rabbit in situ // J. of pharmacobiological dynamics. 1984. - N 7 - P. 304-311.

191. Hattori, M., Shu Y. Z. et al. Metabolism of paeoniflorin and related compounds by human intestinal bacteria // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1985. - 33 (9). - P. 3838-3846.

192. Hayashi Kazuyo, Oka Seibi Формирование множественных почек и регенерация растений шелковицы (Morus alba) // Nihon sanshigaku Zasshi = J. Sericult. Sci. Jap. 1995. - 64. - N 2. - P. 117-123.

193. Hayashi Т., Kurosawa S., et al. Studies on muscle relaxants in Paeoniae Radix: Effect of heat on stability of paeoniflorigenone // Shoyakugaku Zasshi. -1985.-39 (3).-P. 214-217.

194. Hutchinson Margaret J., Saxena Praveen K. Acetylsalicylic acid enhances and synchronizes thidiazuron-induced somatic embryogenesis in geranium (Pelargonium x hortorum Bailey) tissue cultures // Plant Cell Repts. 1996. - 15. N7.-P. 512-515.

195. Jazaki K., Okuda T. Gallotanin production in cell cultures of Cornus officinalis Sieb. Et Zucc. // Plant cell repts. 1989. - V.8. - P. 346-349.

196. Kang, S.S., Shin K.H., et al. Galloylpaeoniflorin, a new acylated monoterpene glucoside from Paeony root // Archives of Pharmacal Research. 1991. - 14 (1). -P. 52-54.

197. Kim Y.S., Lee B.K. Effects of plant growth regulators and culture temperature on embryo culture of Paeonia albiflora II J. of the Korean Society for Horticultural Science. 1995. - 36 (2). - P. 255-262.

198. Kim Y.S., Lee B.K. Somatic embryogenesis and plant regeneration in cotyledon culture of Paeonia albiflora II J. Korean Soc. Horticultural Science. -1996. V. 37. - N 6. - P. 827-830.

199. Koide T, Iwata M, Saito H, Tanimoto Paeoniflorin Reference Standard (Control Oil) of National Institute of Health Sciences // Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku. 2002. - V. 120. - P. 124-127.

200. Kumar Abha S., Kumar Anjani Plant regeneration from cultured embryonic axis in Thevetia peruviana L. // Indian J. Exp. Biol. 1995. - V. 33. - N 3. - P. 190-193.

201. Marcelis-van Acker C.A.M., Scholten H.J. Development of axillary bud of rose in vitro // Sci. hort. (Neth.). 1995. - 63. -N 1-2. - P. 47-55.

202. Meney Kathy F., Dixon Kingsley W. In vitro propagation of Western Australian Rushes (Restionaceae and related families) by embryo culture. Part 1. In vitro embryo growth // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1995. - 41. - N 2. - P. 107-113.

203. Murashige T. Clonal crops through tissue culture. // Plant Tissue Cult, and Its Bio-technol. Appl. -B. etc.: Spring.-Verl., 1977. P. 392-403.

204. Murashige T. Plant propagation through tissue cultures. // Annu. Rev. Plant Physiol.- 1974.-25.-P. 135-166.

205. Murashige Т., Scoog F. A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. - N 3. - P. 473 -497.

206. Myoung Gun Choung; Kwang Нее Kang; Young Nam An Isolation and determination of phenolic compounds in peony (Paeonia lactiflora Pall.) root // Korean J.Crop Sc. 2000. - Vol. 45. - N 2. - P. 83-87.

207. Mc Collouch M., Broffman M., Gao J. Chinese herbal medicine and interferon in the treatment of chronic hepatitis B: A meta-analysis of randomized, controlled trials // American J. of public health. 2002. - Vol. 92. - N 10. - P. 1619-1627.

208. Nguyen Tien Thinh, Katagiri Koitsu Induction of direct somatic embryogenesis in mulberry embryos cultured in vitro // Nihon sanshigaku zasshi = J. Sericult. Sci. Jap. 1995. -64. -N 1. - P. 72-74.

209. Oh G. S., Рае H.O., Oh H. In vitro antiproliferative effect of 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose on human hepatocellular carcinoma cell line, SK-HEP-1 cells // Cancer letters. 2001. - V. 174. - N 1. - P. 17-24.

210. Ohta H., Рае H.O., Oh H. Paeoniflorin attenuates learning impairment of aged rats in operant brightness discrimination task // Pharmacology, biochemistry and behavior. 1994. -49. - P. 213-217.

211. Orlikowska Т., Marasek A., Kucharska D. Regeneration of Paeonia mlokosewitschii Lom. and P. tenuifolia L. in vitro from different explants // Acta Soc. Botanicorum Poloniae. 1998. - V. 67. - N 3-4. - P. 223-227.

212. Padmaja G., Reddy Lattupaly R., Reddy G. Plant regeneration from synthetic seeds of groundnut. // Indian J. Exp. Biol. 1995. - 33. -N 12. - P. 967-971.

213. Paeony (Paeonia sp.) // Alternative medicine review. 2001. - Vol.6. - N 5. -P. 495-499.

214. Palmer C.E., Keller W.A. Pollen embryos // Pollen biothechnology for crop production and improvement. Cambridge: Cambridge Univ. Press. 1997. - P. 392-422.

215. Pandeva R., Simeonova N., Evtimova Z. Effect of thidiazuron on in vitro morphogenetic response of two Capsicum genotypes // Докл. Бълг. АН. 1996. -49. -№ 2. -P. 105-106.

216. Papandreou V., Magiatis P., Kalpoutzakis E., Skaltsounis F.-L., Harvala C. Paeonicluside, a new salicylic glycoside from the Greek endemic species Paeonia clusii IIZ. Naturforsch. 2002. - 57. - P. 235-238.

217. Pechan P.M., Smykal P. Androgenesis: affecting the fate of the male gametophite//Physiol. Plant. 2001. - V. 111.-N1.-P. 1-8.

218. Peixoto Paulo Henrique Pereira, Pasqual Moacir Micropropagacao da videira: Efeitos do pH e do agar // Rev. ceres, Univ. fed. Vicosa. 1995. - 42. - N 242. -P. 431-443.

219. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (English ed.). -Guangzhou, Guangdong Science and Technology Press, 1992. P. 34.

220. Radix Paeonia. WHO monographs Reports on selected medicinal Plants. -Geneva, 1998.-P. 195-201.

221. Raghavan V. Molecular embryology of flowering plants. Cambridge: Cambridge Univer. press. - 1997. - 565 p.

222. Rao M. Muralidhar, Sita G. Lakshmi Direct somatic embrioygenesis from immature embryos of rosewood (Dalbergia latifolia Roxb. // Plant Cell Repts. -1996. 15. -N 5. - P. 355-359.

223. Razdan M.K. Introduction to Plant Tisue Culture. Enfield: Science Publishers Inc. - 2003. - 375 p.

224. Reynolds Th. Plant embryogenesis // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 33. - N 1. -P. 1-10.

225. Rodojevic L., Subotic A. Plant regeneration of Iris setosa Pall, trough somatic embryogenesis and organogenesis // J. Phisiol. 1992. - V. 39, N 6. - P. 690-696.

226. Rokem I.S., Goldberg I. Secondary metabolites from plant suspension cultures: methods for yield improvement // Adv. in Biotech. Proc. 1984. - V. 4. -P. 241-274.

227. Ronn M., Andersson P.G., Backvall Jan-E. Paeonilactone A and В // Acta Chemica Scandinavica. 1998. - 52. - P. 524.

228. Sang Т., Pan J., Zhang D. et al. Origins of polyploids: an example from peonies (Paeonia) and a model for angiosperms // Biological Journal of the Linnean Society. 2004. - 82. - P. 561-571.

229. Shan S.-J., Waporin P., Fukuda et al. Elisa, Western Blotting, Immuonolocalization and Immunoaffinity Column for naturally occurring bioactive compounds using monoclonal antibodies // J.of food and drug analysis. -2000. V.8. - N4. - P. 258-269.

230. Singh Z., Brar S. J. S. In vitro plant regeneration in seedless grapes (Vitis vinifera L.) // Viris. 1993. - 32. - N 4. - P. 229-232.

231. Songstad D., Duncan D., Widholm J. Effect of i-aminocyclopropan-1-carboxylic acid, silver nitrat, and norbornadiene on plant regeneration from maize callus culture // Plant Cell Rep. 1988. - N 7. - P. 262-265.

232. Suzuki H. Standard compounds for quantitative determination of principles of crude drugs 1. Paeoniflorin, a major principle of peony (Paeonia albiflora var. trichocarpa) root // Shoyakugaku Zasshi. 1984. - 38 (2). - P. 144-148.

233. Takashi H., Michico A., Takehito K. In vitro propagation of herbaceous peony {Paeonia lactiflora Pall.) by a longitadi. // Plant Cell Repts. 1989. - V. 8. -N4.-P. 243-246.

234. Takayama S., Akuma M. The types of bioreactors used for shoots and embryos // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. - V. 39. - P. 147-156.

235. Takechi M., Tanaka Y. Antiviral substances from the root of Paeonia species // Planta med. 1985. - V. 45. - N 4. - P. 252-253.

236. Tanaka T, Fukumori M, Ochi T, Kouno I. Paeonianins A-E, new dimeric and monomeric ellagitannins from the fruits of Paeonia lactiflora // J Nat Prod. 2003. -66.-N6.-P. 759-63.

237. Teedrogen und Phytopharmaka. Paeoniae flos. Wissenschaftliche verlags-gesellschaft. Mbh Stuttgart, 1997. - P. 417-418.

238. The pharmacopoeja of Japan, XII. Tokyo, The society of Japanese Pharmacopoeia, 1996.-XXXXXX.

239. Tukey H.B. Artificial culture methods for isolated embryos of deciduous fruits. // Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 1934. - V. 32. - P. 75-78.

240. Turner G., Gershenzon J., Nielson E.E., Froehlich J.E., Croteau R. Limonene synthase, the enzyme responsible for monoterpene biosynthesis in peppermint, is localised to leucoplasts of oil gland secretory cells // Plant physiol. 1999. - 120. -P. 879-886.

241. Vain P., Flamennt P., Soudain P. Role of ethylene in embryogenic callus initiation and regeneration in Zea mays L. // J. Plant Physiol. 1990. - 135. - N 5. -P. 537-540.

242. Vain P., Yean H., Flament P. Enhancement of production and regeneration of embryogenic type 2 callus in Zea mays L. // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. -1989.- 18.-P. 143-151.

243. Vasil I. K., Vasil V. Clonal propagation. // Intern. Rev. of Cytol, Suppl. 11 A: Perspectives in Plant. Cell and Tissue Culture. -N. Y. etc.: Acad, press, 1980. P. 145-173.

244. Veselov S.U., Kudoyarova G.R., Egutkin N.L., Gyuli-Zade V.Z., Mustafina A.R., Kof E.M. Modified solvent patitioning schemeproviding increased specificity and rapidity of immunoassay for IAA // Physiol. Plantarum. 1992. -V. 86.-P. 93-96.

245. Wang L.-S., Shiraishi A., Hashimoto F., Aoki N., Shimizu K., Sakata Y. Analisi of Petal Anthocyanins to Investigate Flower Coloration of Zhongyuan (Chinese) and Daikon Island (Japanese) Tree Peony Cultivars // J. Plant Research. -2001.-114.-P. 33^3.

246. Wang Wen Cheng, Nguyen Henry T. A simple approach to isolate shoot competent cells from sorghum {Sorghum bicolor L. Moench) callus culture // Cereal Res. Commun. 1995. - 23. - N 1-2. - P. 87-93.

247. Widholm J.M. Selection and characterization of biochemical mutants // Plant tissue culture and its biotechnological application. Springer, 1977. - P. 112-122.

248. Wu C.Y. Outline of New China Herbals, Shanghai Science and Technology Press, Shanghai. 1990. - Т. I. - P. 210.

249. Yepes Luz Marcela, Aldwinckle Herb S. Micropropagation of thirteen Malus cultivars and rootstocks, and effect of antibiotics on proliferation // Plant Growth Regul. 1994. - 15. -N 1. - P. 55-67.

250. Yonova P.A., Vassilev G.N., Izvorska N.D. Action of unconventional cytokinins and auxins on the callusogenesis of plant tissue cultures // Докл. Бълг. АН. 1994. - 47. - № 1. - P. 61-64.

251. Zagaja S.W. Preliminary results of investigations on the effect of low temperatures on the development of seedlings from immature embryos of sweetand sour cherries. // Bull. L'acad. Polon. Sci. CI. 1961. - V. 9. - N 3. - P. 113115.

252. Zhang H.Y., Ge N., Zhang Z.Y. Theoretical elucidation of activity differences of five phenolic antioxidants // Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao. 1999. - 20 (4). -P. 343-346.

253. Zhao X., Sun Y. Analysis of Paeoniae radix by high-performated liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry // Analytical Sciences. -2003. V. 19. - P. 1313-1315.

254. Zhu Hong, Yun Xihe, Cui Zhanwu, Ma Changhe, Liu Dewen Культура тканей Rosa chienensis var. Floribunda // Dongbei linye daxue xuebao = J. NorthEast Forest. Univ. 1995. - 23. - N 6. - P. 40-46.

Информация о работе

Зарипова, Альфия Ануровна
кандидата биологических наук
Уфа, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зарипова, Альфия Ануровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося"

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Зарипова, Альфия Ануровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зарипова, Альфия Ануровна, Уфа

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии клонального микроразмножения пиона уклоняющегося
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология