Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация B вируса хризантем и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация B вируса хризантем и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала"

На правах рукопш ГРАНДА ХАРАМИЛЬО РОБЕРТО КАРЛОС

ИДЕНТИФИКАЦИЯ В ВИРУСА ХРИЗАНТЕМ И СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ IN VITRO ОЗДОРОВЛЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА

Специальность 03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003472651

Работа выполнена на кафедре Сельскохозяйственной биотехнологи Российского государственного аграрного университета - МСХА имен: К.А.Тимирязева.

Научный руководитель Доктор биологических наук, профессо

Калашникова Елена Анатольевн

Официальные оппоненты: Доктор биологических нау

Соловьев Александр Ллександрови

Кандидат биологических нау Мартиросян Юрий Цатурови

Ведущая организация: Главный Ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Защита состоится «23» июня 2009г. в 13-00 на заседани диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственно аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу: 127551 г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49; тел./факс. (495) 976-24-92

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научно библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан мая 2009 г. и размещен на сайт

университета: www.timacad.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Н.В. Загоскш

«Перестав быть спорной, мысль перестанет быть интересной»

У. Хэзлитт

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хризантемы сегодня входят в список наиболее популярных цветочных культур, которые распространены по всему миру. Для потребителя предлагаются как срезочные, так и горшечные, садовые и тепличные растения. По объему продаж хризантемы уступают только розам. Более чем за 2000-летнию историю культуры создано около 7000 сортов хризантем, часть из которых используют в кулинарии, в фармацевтической промышленности, а также в качестве инсектицидов.

Вегетативное размножение хризантем связано с существенным накоплением в их искусственных популяциях различных заболеваний. Основной урон цветочной продукции наносят в этом случае вирусные заболевания, которые не поддаются химическому контролю. Наибольшее распространение в растениях хризантем получил В вирус хризантем (ВВХ), который приводит к снижению качества товарной продукции и привлекательности для покупателя. По прогнозам ученых в XXI веке роль вирусных заболеваний будет возрастать, поэтому обнаружение, идентификация, изучение строения и экспрессии генома вирусов, а также получение оздоровленного посадочного материала является актуальной проблемой не только для цветоводства, но и для всего растениеводства.

Цели и задачи исследований: идентификация в растениях хризантем ВВХ и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала.

В задачи сследований входило:

1. Подбор оптимального метода выделения тотальной РНК из тканей хризантем.

2. Подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.

3. Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в тепличных условиях.

4. Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro.

5. Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем in vitro.

6. Изучение зависимости микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания.

7. Создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала и тестирование пробирочных растений на наличие вируса.

Научная новизна и значимость. Оптимизирована методика диагностики ВВХ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода PCR. Выявлены сорта (Помпон сиреневый и Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем. Установлена степень гомологии между штаммом ВВХ, распространенным на территории ГБС, и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 94%-95% соответственно. В результате проведенных экспериментов усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс. растений в год с одного узла независимо от сроков введения в культуру in vitro. Выявлено, что распространение В вируса хризантем в пробирочных растениях неравномерное, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений. Проведенные исследования показали, что использование в качестве транспланта при клепальном микроразмножении хризантем только верхней части пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) возможно получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение или осуществлять оздоровление посадочного материала.

Практическая ценность исследований. Полученные данные свидетельствуют о том, что подобранная методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного географического происхождения. Обнаружены два сорта (Помпон сиреневый, Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем, которые являются перспективными для дальнейшего их применения в селекционном процессе. Усовершенствованная технология клонального микроразмножения хризантем направлена на повышение эффективности их производства. Разработанная схема получения оздоровленных растений хризантем может быть применена для производства качественного посадочного материала, а также при проведении селекционных работ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), на Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008), на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), на Международной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие инноваций в аграрной науки» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе статья в журнале «Известия ТСХА», включенном в перечень

ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Объем работы составляет ЗЬ страниц. В диссертации содержится 22 рисунка и 11 таблиц. Список использованной литературы содержит JZ2. источников, в том числе \0Ь работ иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили интактные растения хризантем из коллекции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и Главного Ботанического Сада РАН (г. Москва).

Выделение РНК. Выделение РНК проводили из тканей хризантем массой 50-100 мг. Дня выбора оптимальной методики сравнивали препараты РНК, полученные с использованием трех методов (Хомчинский, Тризольный метод и на основе LiCl). Определение качества полученных препаратов РНК из тканей хризантем осуществляли электрофоретическим методом, а также по результатам RT-PCR.

Проведение RT-PCR. Использовали праймеры, синтезированные фирмой «Syntol». Подбор праймеров и определение их Тпл (температура плавления) осуществляли с помощью программ Vector NTI и Primer3.

Обратную транскрипцию проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV. Смесь, содержащая РНК из тканей хризантем и праймер (0,5 мкг/мл oligo(dT)i8 или 0,2 мкг/мл Random hexamer), подвергалась денатурации в течение 5 минут при +70°С. Затем добавляли нуклеозидтрифосфаты (5 мМ каждого), 10-кратный буфер для M-MLV, воду до конечного объема 50 мкл. Смесь инкубировали при +37°С или +25°С в зависимости от используемого праймера. Далее в реакционную смесь добавляли M-MLV обратную транскриптазу (50 единиц). Синтез кДНК осуществлялся в течение 1 часа при +37°С. Затем с целью инактивации фермента смесь выдерживали в течение 5 минут при +70°С.

Амплификацию синтезированной кДНК проводили с использованием Taq-полимеразы. 2 мкл смеси, образовавшейся в ходе обратной транскрипции и содержащей кДНК, вносили в PCR-смесь, которая содержала прямой и обратный специфические праймеры (0,5 мкМ каждого), нуклеозидтрифосфаты (0,2 мМ каждого), 2 единицы Taq-полимеразы, 10-кратный буфер для Taq-полимеразы (2.5 mM MgCl2) и воду до конечного объема 50 мкл. Для предотвращения испарения в смесь добавляли равный объем минерального масла.

Для проведения PCR использовали следующие температурные условия: 1. предварительная денатурация +94°С - 3 мин; 2. (35 циклов)

денатурация +94°С - 1 мин, отжиг Тпл - 1 мин, синтез +72°С - 1 мин; 3. заключительная элонгация - 4 мин.

Продукты RT-PCR разделяли электрофорезом в 2-% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (0,25-0,5 мкг/мл). В качестве маркера молекулярной массы использовали маркер Gene Ruler™ 1 и 3 kb DNA Ladder («СибЭнзим»). Продукты электрофореза визуализировали на УФ-трансилюминаторе («Биоком») и фотодокументировали.

Секвенирование продукта ПРЦ, содержащего фрагмент ВВХ. Вирусспецифичный фрагмент ДНК длиной 701 bp, полученный в результате RT-PCR из РНК тканей хризантем, элгоировали из продукта ПЦР модифицировании методом Fermentas. Элюированый продукт использовали для секвенирования («Евроген»). Полученную нуклеотидную последовательность сравнивали со всеми вирусными последовательностями РНК, имеющимися в банке генов (с использованием программы BLAST и BioEdit).

Технику культивирования изолированных тканей в условиях in vitro осуществляли в соответствии со стандартными методами, описанными в Практикуме по сельскохозяйственной биотехнологии (Калашникова и др., 2006). В качестве первичного экспланта использовали сегменты изолированных листовых пластинок, лепестков, черешков и междоузлий. Для культивирования хризантем применяли минеральную основу питательной среды Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) в сочетании с агаром и сахарозой (1 - 3%). В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли БАП, кинетин (К), НУК, ИУК, в различных концентрациях и комбинациях. Растения культивировали при t - +20-25 °С и 16-ч световом фотопериоде.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с применением программы Excel 2007. При этом учитывали основные статистические параметры: среднее арифметическое вариационного ряда, ошибка среднего арифметического, критерий достоверности разности средних. Повторность опытов трехкратная.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Методы выделения тотальной РНК

Выделение тотальной РНК из растений является необходимым этапом при диагностике РНК, содержащих вирусы методом ПЦР. Клетки хризантемы содержат большое количество полисахаридов и фенолов, которые могут затруднять выделение РНК и ингибировать ферменты РНК-зависимую ДНК-полимеразу (ревертазу) и ДНК-полимеразу, участвующие в реакциях обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР.

Выделение нуклеиновых кислот хризантем представляет собой весьма длительный и сложный процесс. Полученные препараты РНК из тканей

хризантем могут быть загрязнены различными примесями, характеризоваться значительной степенью деградации, и как следствие, невозможностью их дальнейшего применения для проведения анализа.

С целью подбора наиболее оптимального метода выделения РНК из тканей хризантем проводили сравнение различных методов (Хомчинский, Тризольный метод и на основе 1лС1). Эффективность методов оценивали по качеству полученных препаратов, и она показана на рис. 1, 2.

Рис. 1 Электрофоретический Рис. 2 Электрофоретический

анализ РНК ВВХ в агарозном геле: треки анализ РНК ВВХ в агарозном геле: треки 1-4 - РНК, выделенная 1-2 - РНК, выделенная методом на модифицированным методом основе 1ДС1, треки 3-4 - РНК выделенная

Хомчинского, треки 5-7 - РНК модифицированным методом

выделенная тризольным методом, 8 - Хомчинского, 5-маркер ЮО-ЗООО Ьр, маркер 50-1000 Ьр.

Данные, представленные на рис. 1-2, свидетельствуют о том, что наиболее качественные образцы РНК были получены при использовании тризольного метода (треки 5-7, рис.1) и метода экстракции на основе 1лС1 (треки 1-2, рис.2). Используемый метод Хомчинского оказался не эффективным для идентификации вируса в исследуемых сортах.

2. Характеристика праймеров, используемых для идентификации ВВХ методом ИТ-РСИ

С целью подбора праймеров, подходящих для анализа любых штаммов ВВХ, был проведен анализ нескольких нуклеотидных последовательностей РНК, кодирующих ген белка оболочки.

В работе были использованы 16 праймеров, из которых только 6 выявили вирус (табл. 1).

Олигонуклеотидные последовательности праймеров подбирали к наиболее консервативным участкам нуклеотидной цепи РНК проанализированных изолятов. Поэтому праймеры способны одинаково

хорошо взаимодействовать с последовательностями гена белка оболочки наиболее распространенных штаммов вируса. Это позволяло ожидать синтеза вирусспецифичных ампликонов при инфекции, вызванной любыми изолятами ВВХ.

Таблица 1. Характеристика праймеров, используемых для анализа ВВХ в тканях хризантем

Название праймера 5'-3' последовательность Длина, OCII. Т„л., °с

CVBF1 GCTATGGGCTTTCATCCAAA 20 50

CVBR1 TCGAAATTGCCGAAGGTATC 20 50

CVB-PCP-F ACAACAGACCCCACCTTCTGATTGG 25 59

CVB-PCP-R GACACCTGGCTGTACATATTAGTTG 25 56

CVB-POLY-F5 CCATGGATGGATGTGTTTGTAAAGATTTTGA 30 58

CVB-POLY-R5 TCTAGATCAGGTGGAGGTGTAAGAGGCATCA 30 63

Температура плавления праймеров, используемая при проведении RT-PCR, рассчитана по одной из общепринятых формул (Тш. =AT*2+GC*3) и с помощью программы Oligocalculator. Специфичные праймеры характеризовались разницей в температуре плавления не более чем в 5°С.

3. Влияние концентрации РНК хризантем для обратной транскрипции на протекание RT-PCR

Важной характеристикой методики обнаружения любого вируса является возможность ее использования в определенных пределах варьирования концентрации суммарной РНК, содержащей некоторые количества нуклеиновых кислот вирусов. Слишком низкая концентрация снижает количество кДНК, образующейся на РНК матрице, вследствие недостаточного количества копий вирусной РНК в исследуемом препарате. В свою очередь, применение слишком высоких концентраций РНК ограничено наличием примесей (белков, полифенолов, полисахаридов), затрудняющих протекание обратной транскрипции.

С целью определения оптимального количества тотальной РНК из растений хризантем для анализа ВВХ использовали препараты РНК, выделенные методами с применением Trizol Reagent и на основе LiCl, для обратной транскрипции в различных концентрациях (из исходного образца готовили серию разведений от 0,5 до 3 мкг).

Результаты анализа серии разведений РНК представлены на рис. 3. Для проведения КТ-РСК применяли пару праймеров СКВ-^У и СУВ-Ш.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рис.3 Электрофореграммы продуктов ПЦР, показывающие влияние концентрации РНК, выделеной из тканей хризантем, для обратной транскрипции на протекание RT-PCR: треки 1-7 - РНК, выделенная Тризольным методом, треки 9-14 - РНК, выделенная на основании LiCl, 8 - маркер 100-3000 Ьр.

Амплификация фрашентов ожидаемой длины была менее интенсивной при содержании РНК в смеси в количестве 0,5-1,5 и 3 мкг (рис.3, треки 1-3, 6, 9-11, 14), Это связано с тем, что слишком низкая концентрация РНК с небольшим количеством вирусного компонента не обеспечивала протекание обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с достаточной интенсивностью. Высокое содержание РНК в количестве 3 мкг на пробу приводило к иншбированию ферментов RT-PCR примесями, к уменьшению интенсивности свечения полос на электрофореграмме (рис. 3, трек 6 и 14), а, следовательно, к неправильному результату. В дальнейших исследованиях для проведения обратной транскрипции использовали 2 мкг РЖ на пробу (конечный объем реакционной смеси - 50 мкл).

4. Анализ ВВХ в растениях некоторых форм хризантем, выращиваемых в условиях теплицы

С целью выявления резистентных и толерантных к ВВХ растений хризантем с использованием, разработанной нами ранее методики, проанализированы 13 сортов из коллекции Главного ботанического сада (г. Москва). В полевых условиях на растениях сортов Академик Жеримунский, Аметист, Лучистая и Помпон сиреневый симптомов поражения вирусом не обнаружено. Кроме того, проанализировано 9 сортов из коллекции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Из тканей растений каждого сорта готовили усредненную пробу суммарной РНК, которую использовали для постановки RT-PCR.

Экспериментально установлено, что независимо от степени выраженности симптомов поражения ВВХ, 11 из 13 проанализированных сортов хризантем из коллекции ГБС были инфицированы вирусом. Так при электрофорезе обнаружено наличие вирусспецифичных ампликонов длиной 701 bp у сортов Умка, Радость моя, Академик Жеримунский и Снежка,

которые были слабо поражены вирусом. У сортов Помпон сиреневый и Лучистая вирус не был обнаружен. Результаты анализа усредненной пробы сортов приведены на рис. 4 и 5.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.4 Электрофореграммы продуктов ПЦР с использованием праймеров CVB-POLY-F5 и CVB-POLY-R5 (маркер 50-1000bp). 1-Аметист, 2- Вадирев, 3- Royal purple, 4- Маркер, 5- Счастье, 6- Лучистая, 7- Умка, 8- К+.

1 2 34 567 89 10

Рис.5 Электрофореграммы

продуктов ПЦР с использованием праймеров СУВ-РОЬУ-К и С\'В-Р01Л'-!{5 (маркер 50-1000Ьр). 1- Помпон сиреневый, 2-Лебединая песня, 3- Радость моя, 4-Оранжсвый закат, 5- Маркер, 6- Академик Жсримунский, 7- Надежда, 8- Снежка, 9- К-, 10- К+.

Растение сорта Аметист из коллекции РГАУ-МСХА также было поражено ВВХ (рис.6).

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.6 Электрофореграммы продуктов ПЦР с использованием праймеров CVB-PCP-F и CVB-PCP-R (маркер 50-1000bp). 1- Yellow sun, 2- Октябрь, 3- Белый снег, 4- Маркер, 5- Аметист, 6- Светлица, 7- Вочиска, 8- К+.

Таким образом, только два сорта (Помпон сиреневый и Лучистая) способны подавлять влияние В вируса хризантем. Возможно, в этих сортах синтезируются определенные соединения, способные защитить растение от

инфекции. ВВХ был обнаружен и в растениях сорта Аметист, отобранных из двух различных источников (коллекции ГБС и РГАУ-МСХА). Можно предположить, что этот сорт легко поражается В вирусом хризантем. Исследуемые сорта Помпон сиреневый и Лучистая являются перспективными для дальнейшего их вовлечения в селекционном процессе, а сорт Аметист - для изучения причин распространения В вируса хризантем в растениях.

Для определения штамма ВВХ, распространенного в растениях in vivo хризантем, вирусспецифичный фрагмент ДНК длиной 701 bp пяти сортов (Аметист, Валирев, Счастье, Лебединая песня, Оранжевый закат) был элюирован из продукта PCR модифицированым методом Fermentas.

5. Анализ пуклеотидиой последовательности изолята ВВХ, распространенного в растениях хризантем

Определена степень гомологии элюированных фрагментов изолята ВВХ, распространенного в посадках хризантем на территории ГБС, с геном белка оболочки всех штаммов ВВХ, последовательности которых имеются в банке генов (табл. 2). Степень гомологии элюированных фрагментов с последовательностью РНК изолятов Chail и Bangalore составляла 95% и 94% соответственно.

Таблица 2. Степень гомологии элюированных фрагментов ВВХ с последовательностями гена белка оболочки некоторых распространенных штаммов

№ Штамм Степень гомологии, %

Аметист Валирев Счастье Лебединая песня Оранжевый закат

1 Chail 94 95 87 94 95

2 Bangalore 93 95 87 93 95

3 Guwahati 90 91 84 89 91

4 Hisar 89 91 84 88 89

5 Punjab 89 91 84 . 89 90

6 Ludhiana 89 91 84 89 90

7 Haryana 89 91 84 88 89

8 Gwaliar 89 91 84 89 90

9 Srinagar 89 91 84 88 90

10 Calcutta 89 90 83 88 89

11 Dehradoon 88 90 82 87 89

12 Jaipur 87 89 82 86 87

13 Leh 82 83 78 81 80

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что подобранная методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения.

6. Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro

В процессе воспроизводства исходного материала сортов хризантем в результате комплексного тестирования на присутствие В вируса хризантем в растениях, и полевой оценки были выделены перспективные сорта хризантем для использования в производственных селекционных программах, для которых были применены методы клеточной биотехнологии для создания коллекции оздоровленного посадочного материала.

6.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов

Начиная работу с растительным объектом в культуре in vitro, необходимо предварительно найти удовлетворительные условия для его стерилизации (Катаева, Бутенко, 1983). В качестве стерилизующего вещества использовали 0,1% раствор сулемы (хлорид ртути). Установлено, что для листовых эксплантов и лепестков оптимальное время стерилизации составляет от 60 до 120 секунд; для побегов - 3 - 4 минуты в период март-апрель.

Коррекция времени стерилизации зависит от качества первичного экспланта и его физиологического состояния (стадии развития). Экспериментально доказано, что для введения в культуру in vitro непригодны старые и очень молодые листья и побеги. Прежде всего, это связано с низким морфогенегаческим потенциалом данных растительных тканей.

Стерильные листовые пластинки и побега были нарезаны на сегменты для подбора оптимального размера первичного экспланта с целью быстрого индуцирования прямой регенерации и получения растений - регенерантов с высокой жизнеспособностью. Изучали влияние размера эксплантов на первичную регенерацию: листовых пластинок - от 0,5x0,5см до 2,5x2,5 см; побегов - от 1 до 4 междоузлий. Экспериментально установлено, что оптимальный размер первичных эксплантов составил: для побегов - черенок с 2 узлами, а для листовых эксплантов - сегмент размером 1,0x1,0 - 1,5x1,5 см.

Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать первый этап клонального микроразмножения, который заключается в получении хорошо растущей стерильной культуры.

6.2.Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем

Для разработки технологии клонального микроразмножения были использованы в качестве первичного экспланта изолированные листовые пластинки, лепестки, черешки и сегменты междоузлий, которые

культивировали в чашках Петри на среде МС, содержащей различные концентрации БАП, ИУК, НУК.

Экспериментально установлено, что листовые пластинки обладают тремя типами морфогенеза: каллусогенез, прямая регенерация из первичного экспланта, регенерация растений из первичной и пересадочной каллусной ткани. Так, прямая регенерация на листовых пластинках у основания листа происходила на среде МС с добавлением 5 мг/л НУК и в присутствии комплекса гормонов (БАП 1 мг/л и ИУК 1 мг/л).

При культивировании изолированных листовых пластинок на средах, содержащих ИУК 1 мг/л в сочетании с БАП 0,1 мг/л, приводило к образованию плотной каллусной ткани, зеленеющей на свету, из которой в дальнейшем были получены растения-регенеранты. Однако последующие визуальные исследования выявили отклонения у растений по морфологии от исходного материала. Добавление в питательную среду НУК в сочетании с БАП стимулировало процесс ризогенеза.

Культивирование изолированных междоузлий побегов (не содержащих меристематических зон) на питательных средах, используемых для листовых эксплантов, приводило к образованию адвентивных почек, каллусной ткани или корней.

Культивирование лепестков на питательных средах, содержащих различные концентрации БАП и ИУК, стимулировало образование рыхлой каллусной ткани, реже плотной, в которой не происходила дифференциация меристематических очагов, дающих начало развитию побегов. Однако в вариантах, где ИУК присутствовала без сочетания с БАП, наблюдали процесс ризогенеза.

Исходя из полученных данных, было сделано заключение о нецелесообразности использования лепестков в качестве первичного экспланта с целью сохранения и размножения ценных генотипов методом клонального микроразмножения.

б.З.Культивнрование черенков хризантем in vitro

Для отработки технологии клонального микроразмножения хризантем в культуру in vitro было введено 10 сортов (Валирев, Надежда, Академик Жеримунский, Хамелеон, Снежка, Лебединая песня, Радость моя, Оранжевый закат, Белый снег, Аметист). Черенки хризантем помещали на питательные среды, содержащие БАП в концентрации 0,1- 1,5 мг/л, ИУК -0,12,5 мг/л, ИМК - 0,1-2,5 мг/л, кинетин - 0,1-1,5 мг/л в различных комбинациях, а также на безгормональную среду.

Культивирование черенков на средах, содержащих один ауксин (ИУК 0,5 мг/л), приводило к активации развития в растении существующих меристем (пазушных почек), из которых к концу пассажа формировались активно растущие побеги высотой 15-20 см.

Таким образом, питательной средой на этапе первичной регенерации хризантем являлась среда МС с добавлением 0,5 мг/л ИУК и 20 г/л сахарозы.

6.4. Зависимость микроразмножения хризантем т укго от состава питательной среды и условий выращивания

Как известно из литературных данных, на клональное микроразмножение, наряду с гормонами, оказывают влияние минеральные соли и сахароза.

В наших исследованиях в качестве питательных сред для клонального микроразмножения хризантем использовали среду Мурасиге и Скуга (1962), а также среды Уайта и Хеллера с целью подбора альтернативной питательной среды для увеличения скорости роста и коэффициента размножения, а также удешевления микрокультуры. В комплексные смеси были добавлены сахароза в концентрации 15 г/л и ИУК - 0,5 мг/л.

Темпы роста и развития побегов при культивировании их на испытанных средах были практически одинаковыми. При дальнейшем культивировании наблюдалась тенденция более высокой выживаемости пазушных почек на средах с невысокой общей концентрацией солей по прописи Уайта и Хеллера (рис. 7) по сравнению с выживаемостью эксплантов на среде МС.

100

Питательные среды

Рис. 7 Жизнеспособность боковых побегов Chrysanthemum в первые 7 еут культивирования in vitro в зависимости от минерального состава питательной среды

Однако при последующих субкультивированиях невысокие концентрации минеральных солей в средах Уайта и Хеллера не обеспечивали высоких темпов роста побегов хризантем (рис. 8). Очевидно, причиной этого явления был недостаточно полный набор элементов питания. Более высокие

показатели выживаемости и темпов развития эксплантов отмечены лишь на среде Мурасиге и Скуга.

20 г ,' I ¡8 лтж I i

5

5

Е

6

0 с га

1

s

5

Рис. 8 Влияние минерального состава питательной среды на рост побегов хризантем в культуре in vitro

Изучено влияние различных концентраций сахарозы от 10 до 30 г/л на клональное микроразмножение хризантем. Исследования показали, что оптимальная концентрация источника углеродного питания для массового размножения растений составила 15 г/л. При данной концентрации растения достаточно быстро развивались и образовывали хорошо развитую корневую систему, что дает возможность отбирать микрорастения для адаптации их к почвенным условиям.

Изучали влияние температурного режима на рост и развитие микрокультуры хризантем. Обнаружено, что оптимальный температурный диапазон - + 21 - 25°С. При пониженных температурах наблюдался замедленный рост и развитие надземной части микропобегов, а при высоких (выше +26°С) - элонгация междоузлий.

Таким образом, в результате многоплановых экспериментов нами была оптимизирована питательная среда для культивирования микрочеренков хризантем, которая была использована нами в дальнейших экспериментах по идентификации вируса в пробирочных растениях.

7. Оздоровление посадочного материала от ВВХ

Пробирочные растения хризантем, инфицированные (сорта Аметист, Лебединая песня и Оранжевый закат) и не инфицированные ВВХ (Лучистая и Помпон сиреневый), полученные в результате клонального микроразмножения были повторно проанализированы по ярусам на наличие вирусного патогена методом RT-PCR. Экспериментально установлено, что наличие вируса отмечено лишь в эксплантах, изолированных с нижних

иУайта в Хеллера □ МС

10 15 20 25 30 Продолжительность культивирования in vitro, сут

ярусов растений, в то время как, в верхнем ярусе пробирочных растений он обнаружен не был (рис. 9,10).

I

I

1234567 89 10 11

Рис. 9 Электрофореграммы продуктов ПЦР (маркер 50-1000Ьр). 1-Сорт Аметист (верхний ярус), 2- Сорт Аметист (средний ярус), 3- Сорт Аметист (нижний ярус) 4- Сорт Лебединая песня (верхний ярус) 5- Сорт Лебединая песня (средний ярус) 6- Сорт Лебединая песня (нижний ярус) 3- Маркер мол. веса 50Ьр+1КЬ, 8 - Сорт Лучистая (нижний ярус), 9 - Сорт Лучистая (верхний ярус), 10 - Положительный контроль, 11 -Отрицательный контроль

Рис. 10 Электрофореграммы продуктов ПЦР (маркер 50-1000Ьр). 1-Сорт Оранжевый закат (нижний ярус), [ 2- Сорт Оранжевый закат (верхний ярус), 3- Маркер мол. веса 50Ьр+1КЬ, 4 -Сорт Аметист (нижний ярус), 5 - Сорт Аметист (верхний ярус), 6 - < Положительный контроль, 7 Отрицательный контроль.

Таким образом, для получения оздоровленного посадочного материала мы брали только верхний ярус со всех исследуемых сортов.

Для идентификации ВВХ в пробирочных растениях хризантем нами была применена следующая схема отбора (рис. 11).

Как следует из схемы эксперимента отбор эксплантов для получения оздоровленного посадочного материала осуществляли только из верхнего яруса пробирочных растений (1-2 междоузлия), которые размножали в условиях in vitro в течение 3 пассажей путем микрочеренкования, по окончании которого провели исследования по выявлению ВВХ в изучаемых сортах пробирочных растений хризантем (рис. 12).

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 12 Электрофореграммы продуктов ПЦР (маркер 50-1000Ьр). 1- Помпон сиреневый, 2- Лучистая, 3- Оранжевый закат, 4- Аметист, 5- Лебединая песня, 6-Маркер мол. веса 50Ьр+1КЬ, 7- К+.

Проведенные исследования показали, что использование в качестве экспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхнего яруса пробирочных растений (2 междоузлия), возможно, позволяет получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение, или, как в случае с сортом Лебединая песня (рис. 12, трек №5), осуществлять оздоровление посадочного материала. Однако, данное предположение требует дальнейших исследований.

Выводы

1. Оптимизирована методика диагностики ВВХ на основе метода ЯТ-РСЯ, позволяющая идентифицировать вирус в интактных и пробирочных растениях хризантем. Оптимизация заключалась в подборе оптимального метода выделения тотальной РНК из тканей хризантем, в подборе праймеров и температурных условий для проведения ЯТ-РСК, а также в определении оптимальной концентрации РНК для проведения обратной транскрипции. Методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного географического происхождения.

2. Из 13 исследуемых сортов хризантем ВВХ обнаружен в 11, среди которых симптомы поражения вирусом в полевых условиях не проявлялись у двух сортов (Академик Жеримунский и Аметист). Исследуемые сорта Помпон сиреневый и Лучистая являются перспективными для дальнейшего их включения в селекционном процессе, так как вирус в них не идентифицирован.

3. В результате изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей ДНК установлена степень гомологии между обнаруженными в исследованых сортах штаммах ВВХ и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 95% и 94% соответственно.

4. Усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс.растений в год с одного узла, независимо от сроков введения в культуру in vitro при выращивании растений в условиях теплицы. Оптимальной питательной средой на этапе размножения хризантем была среда Мурасиге и Скуга с добавлением 0,5 мг/л ИУК, 15 г/л сахарозы, и культивирование при температуре 20-25°С.

5. Выявлено, что распространение В вируса хризантем в пробирочных растениях имеет выраженный ярусный характер, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

6. Проведенные исследования показали, что использование в качестве экспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхнего яруса пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) возможно получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение, или, как в случае с сортом Лебединая песня, осуществлять оздоровление посадочного материала.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Гранда Р., Миронова О.Ю., Калашникова Е.А. Экспериментальный морфогенез в культуре изолированных тканей и органов растений in vitro И Материалы Междунар. конф. «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», 27-28 ноября 2007г. М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007. с 51-53.

2. Гранда Роберто, Калашникова Е.А. Сохранение биоразнообразия хризантем методами клеточной биотехнологии.//Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): материалы Междунар. науч. конф., Саранск, 15-18 мая 2008 г.- Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2008. С. 361-362.

3. Гранда Роберто, Калашникова Е.А. Создание коллекции безвирусного посадочного материала хризантем in vitro // Материалы Междунар. конф. молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» 10-11 августа 2008 г. Брянск, 2008. с 14-18.

4. Гранда Роберто. Микроклональное размножение хризантем. Известия ТСХА, 2009. №1, с 145-148.

5. Гранда Роберто. Методы идентификации вируса в растениях хризантем. // Материалы Междунар. конф. молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие инноваций в аграрной науки» 23-24 апреля 2009 г. РГАУ-МСХА, с. 38-39.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60X84'/,6. Объем 1,25 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 304.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550,Москва, ул. Тимирязевская,44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гранда Харамильо Роберто Карлос

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Промышленное Цветоводство 9 1.1.1 Хризантема

1.2. Размножение декоративно-цветочных культур в условиях in vitro

1.3. Культивирование хризантем в условиях in vitro

1.4. Оздоровление посадочного материала от вирусов

1.5. Карлавирусы

1.5.1. Морфология и физико-химические свойства вирусных частиц

1.5.2. Симптоматика и круг хозяев

1.5.3. Цитопатология

1.6. В Вирус хризантемы

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследования

2.2. Культура изолированных тканей хризантемы

2.2.1. Техника культивирования in vitro

2.2.2. Условия культивирования

2.2.3. Статистическая обработка результатов

2.3. Выделение тотальной РНК из растительной ткани 44 2.3.1 .Выделение тотальной растительной РНК тризольным методом

2.3.2. Выделение тотальной растительной РНК по модифицированному методу Хомчинского

2.3.3. Выделение тотальной растительной РНК на основе LiCl

2.4. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

RT-PCR)

2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот

2.6. Выделение амплифицированных фрагментов из продукта PCR

2.7. Секвенирование продуктов PCR

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Методы выделения тотальной РНК

3.2.Идентификация В вируса хризантем методом RT-PCR 54 3.2.1 .Характеристика праймеров, используемых для выявления

ВВХ методом RT-PCR 54 3.2.2. Влияние концентрации РНК хризантем для обратной транскрипции на протекание RT-PCR

3.3. Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в условиях теплицы

3.4. Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВВХ, распространенного в растениях хризантем

3.5. Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro

3.5.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов

3.5.2. Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем

3.5.3. Культивирование черенков хризантем in vitro IS

3.5.4. Зависимость микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания

3.6. Оздоровление посадочного материала от ВВХ 83 3.6.1. Схема получения оздоровленных растений хризантем

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация B вируса хризантем и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала"

Хризантемы сегодня входят в список наиболее популярных цветочных культур, которые распространены по всему миру. Для потребителя предлагаются как срезочные, так и горшечные, садовые и тепличные растения. По объему продаж хризантемы уступают только розам. Более чем за 2000-летнию историю культуры создано около 7000 сортов хризантем, часть из которых используют в кулинарии, в фармацевтической промышленности, а также в качестве инсектицидов.

В настоящее время существует много различных сортов хризантем отечественной и зарубежной селекции, которые являются перспективными для использования их в озеленении, особенно в южных районах Российской Федерации. Для выращивания в средней полосе европейской части России предпочтение отдают финским, немецким, английским, голландским и местным сортам; французские и китайские используют на юге.

Выращивание хризантем часто связано с физиологическими проблемами. Например, культивирование растений в условиях ограниченного пространства питания часто приводит к угнетению роста, нарушению образования бутонов и развитию дегенеративных цветков, поражению листьев. Данные физиологические отклонения могут привести к гибели растения (Миронова, 2006).

Вегетативное размножение хризантем связано с существенным накоплением в их искусственных популяциях различных заболеваний. Основной урон цветочной продукции наносят в этом случае вирусные заболевания, которые не поддаются химическому контролю. Наибольшее распространение в растениях хризантем получил В вирус хризантем (ВВХ), который приводит к снижению качества товарной продукции и привлекательности для покупателя. По прогнозам ученых в XXI веке роль вирусных заболеваний будет возрастать, поэтому обнаружение, идентификация, изучение строения и экспрессии генома вирусов, а также получение оздоровленного посадочного материала является актуальной проблемой не только для цветоводства, но и для всего растениеводства.

Цели и задачи исследований: идентификация в растениях хризантем ВВХ и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала. В задачи исследований входило:

1. Подбор оптимального метода выделения тотальной РНК из тканей хризантем.

2. Подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.

3. Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в тепличных условиях.

4. Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro.

5. Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем in vitro.

6. Изучение зависимости микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания.

7. Создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала и тестирование пробирочных растений на наличие вируса.

Научная новизна и значимость. Оптимизирована методика диагностики ВВХ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода PCR. Выявлены сорта (Помпон сиреневый и Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем. Установлена степень гомологии между штаммом ВВХ, распространенным на территории Главного Ботанического сада, и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 94%-95% соответственно. В результате проведенных экспериментов усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс. растений в год с одного узла независимо от сроков' введения в культуру in vitro. Выявлено, что распространение В вируса хризантем в пробирочных растениях неравномерное, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

Проведенные исследования показали, что использование в качестве транспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхней части пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) возможно получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение или осуществлять оздоровление посадочного материала.

Практическая ценность исследований. Полученные данные свидетельствуют о том, что подобранная методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения. Обнаружены два сорта (Помпон сиреневый, Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем, которые являются перспективными для дальнейшего их применения в селекционном процессе. Усовершенствованная технология клонального микроразмножения хризантем направлена на повышение эффективности их производства. Разработанная схема получения оздоровленных растений хризантем может быть применена для производства качественного посадочного материала, а также при проведении селекционных работ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), на Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008), на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), на Международной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие инноваций в аграрной науке» (Москва, 2009).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гранда Харамильо Роберто Карлос

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована методика диагностики ВВХ на основе метода RT-PCR, позволяющая идентифицировать вирус в интактных и пробирочных растениях хризантем. Оптимизация заключалась в подборе оптимального метода выделения тотальной РЕК из тканей хризантем, в подборе праймеров и температурных условий для проведения RT-PCR, а также в определении оптимальной концентрации РЕК для проведения обратной транскрипции. Методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения.

2. Из 13 исследуемых сортов хризантем ВВХ обнаружен в.Ы:, среди которых симптомы поражения вирусом в полевых условиях не проявлялись у двух сортов (Академик Жеримунский и Аметист). Исследуемые сорта Помпон сиреневый: и Лучистая являются перспективными для дальнейшего их включения в, селекционном процессе, так как вирус в них не идентифицирован.

3. В результате изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей ДНК установлена степень гомологии между обнаруженными в исследованных сортах штаммах ВВХ и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 95% и 94% соответственно.

4. Усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс.растений в год с одного узла, независимо от сроков введения в культуру in vitro при выращивании растений в условиях теплицы. Оптимальной питательной средой на этапе размножения хризантем была среда Мурасиге и Скуга с добавлением 0,5 мг/л ИУК, 15 г/л сахарозы, и культивирование при температуре 20-25°С.

5. Выявлено, что распространение В вируса^ хризантем в пробирочных растениях имеет выраженный ярусный характер, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

6. Проведенные исследования показали, что использование в качестве экспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхнего яруса пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) позволяет получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение, или, как в случае с сортом Лебединая песня, осуществлять оздоровление посадочного материала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гранда Харамильо Роберто Карлос, Москва

1. Ахметова, А.Ш. Размножение in vitro клонов гибридных форм тюльпанов / А.Ш. Ахметова, Р.К. Байбурина, JI.H. Миронова // Биотехнология. 2007. - № 2. - С. 3-7.

2. Байбурина, Р.К. Клональное микроразмножение гетерозисных гибридов сосны и тополя / Р.К. Байбурина, Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко, Н.В. Старова //Бюл.Гл.ботан.сада. 1992. - Т. Вып.163. - С. 83-86.

3. Байбурина, Р.К. Эндогенный гормональный статус растений и культивирование in vitro / Р.К. Байбурина // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях. 2001. - С. 138.

4. Байбурина, Р.К. Сохранение и воспроизводство флористического разнообразия методами биотехнологии / Р.К. Байбурина, A.A. Зарипова, А.Ш. Ахметова, A.A. Мухаметвафина // Роль ботан. садов в сохранении биоразнообразия. Ростов-на-Дону, 2002. - С. 7-9.

5. Барабаш, Т.Н. Термотерапия при микроклональном размножении / Т.Н. Барабаш, Л.Д. Радилова, В.Ф. Бленда // Соврем.пробл.плодоводства. -Самохваловичи, 1995. С. 128.

6. Бутенко, Р.Г Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Р.Г. Бутенко Г.С. Муромцев, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. М.: ВО Агропромиздат, 1990. - 384 с.

7. Высоцкий, В. А. Клональное микроразмножение растений. Культура клеток растений и биотехнология / В.А. Высоцкий. Под ред. Бутенко Р.Г. М.: ВО Агропромиздат, 1987. 360с.

8. Гаврикова, Л.И. Продуктивность микропобегов хризантем в культуре in vitro / Гаврикова, В.Н. Андрианов // Известия ТСХА. 1994. - № 4. - С. 240-244.

9. Горинг, X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при микроклональном микроразмножении / X. Горинг. Интродукция растений. Ростов-на-Дону, 1993. - 64с.

10. Дьянченко, Н.Г. Хризантемы корейские./ Н.Г. Дьянченко. М.: издательский дом МСП, 2004. 48 с.

11. Захарова, O.A. Каллусная культура как альтернативный источник микроклон / O.A. Захарова, JI.A. Любаковская, Н.С. Турина, Е.В. Спиридович // Всерос. науч.-исслед. ин-т охотничьего хоз-ва и звероводства им. проф^ Б.М.Житкова. Киров, 2004. - С. 54-55.

12. Иддагода, Н. Особенности получения асептической культуры и клональное микроразмножение взрослых растений чая (Camellia sinensis L.) / Н. Иддагода, H.B. Катаева, Р.Г. Бутенко // С.-х. биология. Сер. Биология растений. 1990. - Т. 5. - С. 98-104.

13. Калашникова, Е.А. Использование изолированных тканей и органов взрослых растений сосны обыкновенной и ели обыкновенной для клонального микроразмножения / Е.А. Калашникова // Науч.тр./Моск.ун-т леса, 1993. Вып.265. - С. 96-100.

14. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии / Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева, О.Ю. Миронова*. М.: КолосС, 2006. - 144 с.

15. Канюка, К.В. Структура 3'- концевой области РНК М вируса картофеля и возможные механизмы экспрессии генома вируса: автореф. дис.канд. биол/К.В. Канюка.- М.\ 1991. -19с.

16. Катаева, Н.В. Клональное размножение растений / Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1983. - 97с.

17. Катаева, Н.В. Значение гормонов в формировании верифицированных побегов яблони при микроразмножении / Н.В. Катаева, И.Г. Александрова, Е.В. Драгавцева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М, 1991. С. 189-192.

18. Ковалева, И.С. Усовершенствование методики микроклонального размножения малино-ежевичного гибрида Тайберри / И.С. Ковалева, Н.В.Дицина, Т.В. Данилова, О.И. Молканова // Бюл.Гл.ботан.сада, 2000.1. Вып.179. С. 136-144.

19. Лапшин, П.В. Клеточная селекция яровой мягкой пшеницы на устойчивость к действию УФ-Б радиации / П.В. Лапшин, Р.Г. Бутенко B.C. Шевелуха // Изв.Тимирязев.с.-х.акад. 2001. - Вып.2. - С. 136-144.

20. Левай, К.Э. Структурная организация генома карлавирусов: М вирус картофеля и В вирус хризантемы: автореф. дис.канд. биол./ К.Э. Левай.- М.:, 1991.-18с.

21. Миронова, О.Ю. Разработка и совершенствование технологийfклонального микроразмножения декоративно-цветочных культур: автореф. дис.канд. биол./ О.Ю. Миронова.- М.:, 2004. -18с.

22. Миронова, О.Ю. Микроклональное размножение хризантем, для промышленного цветоводства / О.Ю. Миронова // Овощеводство и теплич. хоз-во, 2006. N 7. - С. 58-59.

23. Митрофанова О.В. Вирусные болезни промышленных культур и биотехнологические приемы их оздоровления: автореф. докт. диссертации./ О.В. Митрофанова. -М.:, 1992. 42с.

24. Молканова, О.И. Клональное микроразмножение интродуцированных сортов Syringa vulgaris L. / О.И. Молканова, O.A. Чурикова, Л.Н. Коновалова, И.Б. Окунева // Вестн.Моск.ун-та.Сер.16, 2002. -№4.-С. 8-14i