Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Биологические свойства вирусов вегетативно размножающихся цветочных растений, картофеля, ресурсосберегающая технология оздоровления
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений
Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства вирусов вегетативно размножающихся цветочных растений, картофеля, ресурсосберегающая технология оздоровления"
- В ¿ПР
На правах рукописи
РЫБАЛКО Анатолий Евдокимович
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ВЕГЕТАТИВНО
РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ, КАРТОФЕЛЯ, РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ОЗДОРОВЛЕНИЯ
Специальность - 06.01.11 - защита растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
МОСКВА 1998
Работа выполнена в Филиале института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и научно-исследовательском центре "Меристемные культуры" Госстроя России
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Помазков Ю.И., доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, академик РАСХН Р.Г. Бутенко, доктор биологических наук, академик РАСХН B.C. Шевелуха.
Ведущее учреждение: Главный ботанический сад РАН.
Защита состоится 1998 г. в часов
на заседании диссертационного совета Д 120.35.09 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева по адресу 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 49, Ученый совет ТСХА.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской сельско-хозяйственной академии имени К.А. Тимирязева (ТСХА)
Автореферат разослан "
1998 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук
В.А. Шкаликов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Потери урожая в мире, вызываемые разнообразными болезнями, составляют около 50 млрд. долларов в год (James, 1981). Среди них одно из ведущих мест занимают вирусные заболевания, которые отличаются широким распространением и исключительной вредоносностью (Атабеков, 1986).
Особенностью вирусных болезней растений, определяющей сложность борьбы с ними, является гетерогенность вирусных популяций, представленных различными вирусами и их штаммами с разнообразными биологическими свойствами, что требует применения комплексных мер борьбы.
В системе борьбы с вирусными болезнями растений важное место занимает получение и применение здорового исходного материала. С целью наиболее эффективного использования разработок по борьбе с вирусными болезнями картофеля система семеноводства этой культуры в нашей стране в конце шестидесятых годов претерпела существенную организационную перестройку. В этом плане проведена концентрация товарного семеноводства в благоприятных по фитосанитарным условиям регионах. Основной их задачей было определено получение высококачественного семенного материала картофеля на основе серологических клоновых отборов (Онищенко с соавт., 1974). Однако в дальнейших исследованиях было установлено, что большинство сортов практически полностью заражены вирусами. Это потребовало применения активных методов получения исходных безвирусных растений. Показана полная зараженность вирусами и других вегетативно размножающихся растений, в частности плодово-ягодных (Вердеревская, 1971; Помазков, 1989), гвоздики ремонтантной (Петерсон и соавт., 1974; Oertel, 1974). В начале 70-х годов в нашей стране начаты работы по широкому применению для оздоровления растений активных методов лечения хронически зараженных сортов - культуры меристемы и термотерапии.
Отсутствие унификации и стандартизации технологических приемов и разработок по массовому применению оздоровленного материала в производстве даже для одной культуры стало причиной того, что метод культуры меристемы оставался достоянием отдельных лабораторий. Не были разработаны также принципы получения больших партий здорового материала, как исходного для получения элиты на безвирусной основе.
Решение проблемы получения безвирусного посадочного материала возможно при создании эффективной, унифицированной технологии оздоровления, отражающей системный подход в защите растений от вирусных эпифитотий.
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось идентификация и изучение биологических свойств вирусов на различных вегетативно размножающихся растениях, разработка, экспериментальное и теоретическое обоснование системы приемов получения исходного безвирусного посадочного материала, принципов внедрения ее в народное
хозяйство, организация производства иммунодиагностикумов.
Исследования велись в следующих направлениях:
1. Разработка, экспериментальное и теоретическое обоснование унифицированной технологии массового оздоровления растений от вирусов на основе двухфазного метода регенерации растений из апикальных меристем; изыскание приемов получения безвирусных растений из заведомо зараженных вирусом стеблевых верхушек;
2. Изучение и экспериментальное обоснование системы приемов ускоренного размножения оздоровленного материала, обеспечивающей защиту от реинфекции;
3. Усовершенствование массовой диагностики некоторых вирусов для применения в производственных условиях;
4. Испытание унифицированной технологии оздоровления на цветочных культурах, разработка общих принципов семеноводства этих культур на безвирусной осноье, внедрение в производство оздоровленного посадочного материала;
5. Изучение видового состава возбудителей вирусных заболеваний на широко распространенных сортах картофеля, цветочных, декоративно-лиственных культурах, анализ структуры вирусных популяций, изучение свойств возбудителей;
6. Разработка и новых способов получения высокоактивных антисывороток, пригодных для проведения иммуноферментного анализа;
7. Разработка концепции стандартизации биотехнологий в области клеточной инженерии и производства диагностических препаратов.
8. Проведение изысканий по созданию специализированного биотехнологического предприятия для массового производства безвирусного посадочного материала широкого спектра растений и высокоактивных сывороток.
Научная новизна результатов исследований.
На основе изучения вирусных популяций на различных культурах и выявления общих принципов их структуры делается вывод о целе сообразности унификации основных технологических приемов массового оздоровления. Установлена 100% зараженность промышленных насаждений вирусами в скрытой форме: на картофеле это вирусы X, М, Б, У, скручивания листьев, встречающиеся в смешанной инфекции; на гвоздике это вирусы крапчатости, латентный, прижилковой кралчатости; на хризантеме - В-вирус и аспермня томатов, хризантемный штамм вируса огуречной мозаики. Общим для этих культур является наличие вирусов, входящих в одну таксономическую группу. Это карлавирусы (М и Б-картофеля, латентный гвоздики, В-вирус хризантемы), потивирусы (У-картофеля и прижилковой крапчатости гвоздики), тобамовирусы (ВТМ на хризантеме, розах, фатсии и кольцевой пятнистости одонтоглоссума на растениях различных видов орхидей), потексвирусы (Х-вирус картофеля, вирус мозаики цимбидиума). На изучаемых культурах выявлены и микоплазмы, их поражает вирус
огуречной мозаики, вирус мозаики резухи, на картофеле и хризантеме выявлен вирус табачной мозаики в естественных условиях, а на картофеле и гвоздике - вирус мозаики люцерны. Метьюз (1973) относит эти культуры в одну группу по характеру вредоносности вирусов.
Разработаны и внедрены в массовое производство эффективные модификации серологического метода диагностики вирусов на основе радиальной иммунодиффузии и концентрирования антигена в нативном соке, а также повышения чувствительности метода электронной микроскопии путем увел1гчения адсорбции вирионов при помощи энергии СВЧ (заявка на патент № 04954358/13.) Организовано массовое производство высокоактивных антисывороток к вирусам, поражающих важнейшие цветочные культуры, и полифагам, имеющим значение при работе с различными растениями (цветочными, овощными, плодово-ягодными, техническим, лекарственными, эфиромасличными). Разработан способ повышения титра на основе полученного нового иммуномодулятора -камизола. Технологический процесс обеспечен нормативно-технической документацией.
Разработан, экспериментально и теоретически обоснован двухфазный метод регенерации растений из истинных меристем (0,1 мм). Путем кондиционирования условий питания изолггрованных меристем на разных этапах морфогенеза удалось сократить сроки получения безвирусных растений, по признакам идентичным данному сорту. Этот метод апробирован на картофеле, гвоздике ремонтантной, хризантеме, гербере, орхидеях, землянике и других культурах.
Выявлен феномен антивирусного кондиционирования питательных сред при помощи тканей-нянек, полученных от растений-продуцентов антивирусным веществ.
Разработан способ микроразмножения растений в культуре in vitro, обеспечивающий унификацию комплекса технолопгческих приемов для различных культур.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. В системе Минжилкомхоза РСФСР с 1980 г. по инициативе и при непосредственном участии диссертанта организовано крупномасштабное производство сертифицированного посадочного материала цветочных культур. Приказом министра жилищно-коммунального хозяйства РСФСР № 205 от 15.04.1985 г. преобразовано в Производственное предприятие меристемных культур. В первый год работы предприятия получено продукции на сумму 550 тыс. руб., балансовая прибыль составила 265 тыс. руб., уровень рентабельности - 109%. В ассортименте -высокоактивные иммуноднагностикумы для выявления различных вирусов и микоплазм, оздоровленный посадочный материал цветочных овощных, картофеля, земляники, киви, винограда, мандарин. В 1996 г. предприятие преобразовано в Научно-исследовательский центр "Меристемные культуры".
Эффективность применяемого метода оздоровления растений обеспечила возможность включения в процесс массового производства
оздоровленного посадочного материала клонального микроразмножения в стерильной культуре, обеспечивающего абсолютную защиту от всех видов реинфекции, увеличение на несколько порядков коэффициента размножения и экономию площади.
На основании материалов диссертации разработаны и утверждены Минжилкомхозом УССР "Методические рекомендации по борьбе с вирусными болезнями в маточных питомниках ремонтантной гвоздики" (1978г.),
За период работы Производственного предприятия меристемных культур произведено и реализовано многочисленным предприятиям СССР около 6 л нативных антисывароток к различным вирусам, поражающим цветочные и другие культуры. Получены высокоактивные сыворотки к микоплазмам гвоздики, цинерарии гибридной, гортензии, столбура пасленовых; различным хозяйствам реализовано более 7.5 млн. оздоровленных черенков гвоздики ремонтантной, 1,6 млн. - хризантемы, широкий ассортимент орнаментальных культур. Вновь созданному в 1990 г. Краснодарскому НИИ картофелеводства и овощеводства переданы технологические разработки и исходный материал 4 сортов картофеля.
Втечение 1980-1997 гг. материалы диссертации используются в научно-производственной деятельности Научно-исследовательского центра "Меристемные культуры".
В 1988-1995 гг. материалы диссертации использованы для чтения лекцш! по биотехнологии на кафедре физиологии растений Донецкогс государственного университета.
Апробация работы. Резу льтаты исследований доложены на заседанш Ученого совета Украинского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии, научно-технических советах Минжилкомхозг УССР в 1977 г. и Минжилкомхоза РСФСР - в 1981 г., заседании Президиумг ВАО.гШЛ по вопрос}' "Научно-организационные задачи получеши безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур' 22.08.1984 г. (протокол N 28).
Материалы диссертации были представлены на следующих съездах конференциях, симпозиумах: 1. IV Всесоюзном совещании по вирусным болезням растений - г. Киев, 1971 г., 2. VI конференции молодых учены> микробиологов Украины - г. Киев, 1972 г., 3. III Всесоюзном совещании пс применению препарата ТУР в растениеводстве - г. Москва, 1973 г., 4 Всесоюзном семинаре-совещании по вирусным болезням овощных культур - г. Ереван, 1974 г. 5. VI Всесоюзном совещании по иммунитету сельскохозяйственных растений - г. Одесса, 1975 г. 6. Всесоюзном совещанш по семеноводству картофеля - г. Чернигов, 1975 г. 7. Всесоюзное семинаресовещании "Современные методы получения безвирусногс картофеля" - г. Москва, 1975 г. 8. Республиканской школе-семинаре пс применению культуры тканей, органов, клеток в генетике и селекции - г Киев, Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР, 1977 г. 9 Юбилейной конференции Черниговского филиала Украинскогс
микробиологического общества - г. Чернигов, 1977. 10. Всесоюзной научно-практической конференции "Выращивание цветочных культур меристемным способом" - г. Рига, 1977 г. 11. VII Всесоюзном совещании по вирусным болезням сельско-хозяйственных растений -г. Ленинград, 1978 г. 12. На координационных совещаниях по проблеме "Усовершенствование системы семеноводства и разработка эффективных приемов и методов выращивания высококачественного семенного картофеля на безвирусной основе" - в 1975, 1976, 1977, 1978 гг. в Украинском научно-исследовательском институте картофельного хозяйства, пос. Немешаево, Киевской обл., 13. II Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых микробиологов. Ташкент, 1978 г. 14. VI конференции молодых ученых-ботаников Украины, г. Киев, февраль 1979 г. 15. Республиканской школе передового опыта по теме: "Передовые приемы выращивания цветочных культур в РСФСР" - г. Ростов на Дону, 1981 г. 16. Школе передового опыта по выращиванию цветочных культур меристемным способом - г. Рига, 1983 г., 17. IV Всесоюзном совещании "Культура клеток растений и биотехнология" - г. Кишинев, 1983 г., 18. VIII Всесоюзном совещании по вирусным болезням сельскохозяйственных растений - г. Вильнюс, 1984 г., 19. VI съезде Украинского микробиологического общества - г. Донецк, 1984 г., 20. Международном симпозиуме "Культура тканей и клеток растений -применение в улучшении урожая" - г. Оломоуц, ЧССР, 1984 г., 21. VIII региональном совещании "Биоценотические связи в насаждениях искусственных фитоценозов", г. Кишинев, 1986 г., 22. Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений", - г. Ташкент, 1986 г., 23. Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", г. Пущино на Оке, 1986 г., 24. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" - г. Новосибирск, 1988 г., 25. Международной конференции "Биометрические и генетические методы в селекции растений", г. Леднице, ЧССР, 1988 г., 26. Конференции по методам диагностики микоплазм, г. Махарадзе, 1988 г., 27. На международных выставках в 1989 г. в Чехословакии (Флора-Оломоуц), ГДР (Internationale Gartenbau Ausstellung) и Москве (Интербытмаш-89), в 1990 г. в Швеции (Советская Россия), неоднократно на ВДНХ СССР, 28. Научной конференции, посвященной 100-летию открытия вирусов Д.И. Ивановским (2-6 сентября 1992 г., г. Ростов-на-Дону), 29. Международном симпозиуме Breeding, propagaron, disease control of glassliouse flowers and otlier ornamental plants, Salaspils, Latvia, 3-5 - September, 1991. Salaspils, 1992, 30. Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995 г.), 31. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" - г. Москва, 25-28 ноября 1997 г.
Публикации. Материалы диссертации обобщены в 72 опубликованных научных работах, в т.ч. в монографии "Biotechnolog}' in agricultural and for-estiy", Vol. 20 "High-Tech and Micropropagation IV", Springer-Verlag, 1992 P. 427-447 (главе 26 "Micropropagation of virus-free ornamental in the USSR"); изданы 3 обзорные информации, получено четыре авторские свидетельства,
поданы три заяви! на выдачу1 патента Российской Федерации; разработаны и зарегистрированы в органах Госстандарта 7 нормативно-технических документов (технические условия, методики), создан научно-популярный фильм "Болезнь века".
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, анализа литературных источников по теме диссертации, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и рекомендаций производству. Библиографический указатель содержит 381 наименование, из них 183 на русском языке. Работа изложена на 265 страницах машинописного текста, содержит 62 таблицы и 46 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В первой главе ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ РАСТЕНИЙ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА (обзор литературы) приведен анализ состояния изученности распространения вирусных заболеваний на картофеле и важнейших цветочных культурах, методах диагностики, главным образом пригодных для проведения массовых анализов в условиях производства и ранней диагностики для обеспечения достоверности системы оздоровления в условиях комплексных инфекций и унификации для широкого спектра растений. Особое внимание уделено методам оздоровления от хронической вирусной инфекции. Дается анализ работ по применению методов культуры in vitro, а также критика технологий с применение термотерапии. Намечены пути устранения недостатков в построении унифицированной технологии оздоровления широкого спектра растений.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИИ. В качестве материалов настоящих исследований использовали методы оздоровления растений от вирусов и приемы ускоренного размножения, пораженные вирусами и безвирусные растения, вирусные препараты, антивирусные сыворотки, методы выявления вирусов и получение антивирусных сывороток, организационные формы производства безвирусного исходного посадочного материала.
Способы оздоровления и микроразлтожения in vitro изучали на растениях районированных сортах картофеля (около 20 сортов), цветочных растениях (около 30 сортов гвоздики ремонтантной, около 30 - хризантемы, 12 - герберы, 12 - орхидей, более 40 видов орнаментальных культур). В работе были использованы растения лилии, гладиолуса, фикусов, филодендронов, кордилины, земляники, винограда, киви, мандарина, анйнаса, стевии, инжира.
Растения оздоровленные. При разработке системы мероприятий, обеспечивающей получение больших партий здорового материала, применяли полученные нами безвирусные растения различных сортов картофеля, гвоздики ремонтантной, хризантемы, орхидей, герберы. В работе также
применяли растения лилии, гладиолу са, фикусов, филодендронов, кордишшы, земляники, винограда, киви, мандарина, ананаса, стевии, инжира.
Были испытаны технологии оздоровления, основанные на сочетании культуры стеблевых верхушек с термо- и химиотерапией и культуры истинных меристем.
Вирусные препараты, используемые в качестве объектов исследований, получали из инфицированных растений. Вирус крапчатости гвоздики (ВКГ) выделяли из различных сортов гвоздики ремонтантной (Вильям, Уайт, Скания, Шокинг и др.) с симптомами слабой крапчатости или без симптомов. В качестве сывороточного препарата использовали штамм ВКГ, выделенный из меристемных растений гвоздики, выбракованных по электронной микроскопии непосредственно в стерильной культуре. Идентификацию вируса осуществляли по морфологии частиц (были выявлены икосаэдрические частицы размером около 30 нм), серологическому анализу против сывороток производства кафедры вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова, проблемной лаборатории вирусных болезней растений и насекомых, Латвийской сельскохозяйственной академии, предприятия "Юнгпфлянце" (ГДР), института фитопатологии (Вагенлнген, Нидерланды), а также при помощи электронной имуноморфологии. Для работы были отобраны изоляты, соответствующие одному типу частиц по этим методам, а также по симптомам на листьях Chenopodium quinoa Willd., которые соответствовали вирусу крапчатости гвоздики. Указанные препараты были проанализированы на отсутствие вирусов кольцевой пятнистости, латентного, прижилковой крапчатости гвоздики сыворотками производства указанных учреждений, а также сывороткой на вирус кольцевой гравировки гвоздики производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды). В-вирус хризантемы (ВВХ) выделен из растений хризантемы сорта Монако в совхозе "Деснянский" (г. Чернигова). Вирус мозаики цимбидиума (ВМЦ) выделяли из массы бессимптомных растений орхидеи фаленопсис, и идентифицирован при помощи сывороток к вирусам кольцевой пятнистости одонтоглоссума (ВКПО) и ВМЦ производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды), что дало возможность установить моноинфекцию ВМЦ. Вирус желтой мозаики фасоли (ВЖМФ) выделяли из растений донника, произраставшего изолированно вблизи от лесного массива вдали от других посадок бобовых с симптомами сильной желтой пятнистости. Патоген идентифицирован при помощи сыворотки к вирусу желтой мозаики фасоли, производства предприятия "Юнгпфлянце" (ГДР). Другой штамм ВЖМФ выделяли из растений фрезии, произраставшей в Дагомысском чайном совхозе. Неидентифицированные вирусы: были выделены из растений пуансеттии, антуриума, герберы, лавра благородного. Вирус огуречной мозаики (ВОМ) выделен из хризантемы сорта Москвичка в совхозе "Деснянский" г. Чернигова и идентифицирован сывороткой к ВОМхр производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды). Моноинфекция была установлена по отсутствию реакции преципитации против ВВХ нашего производства и электронной микроскопии (выявлены
однородные икосаэдрические частицы размера 30 нм). Сферический вирус розы был выделен из розы сорта Куин Элизабет, завезенной из Болгарии. Сферический вирус лилии выделен из растений лилии. Нитевидный вирус лаванды был выделен из лаванды, полученной из Всесоюзного НИИ эфиромасличных культур (г. Симферополь). Латентный вирус гвоздики получен от академика ВАСХНИЛ ИГ. Атабекова. Чистые культуры микоплазм гвоздики, цинерарии гибридной, гортензии получены от кандидата биологических наук Л.П. Малиновской.
Для идентификации вирусов, поражающих изучаемые культуры, в настоящей работе были использованы диагностические антисыворотки производства различных научных учреждений (проблемная лаборатория вирусных болезней растений и насекомых Латвийской сельскохозяйственной академии, предприятие Юнгпфлянце (ГДР), Институт фитопатологии в Вагенингене (Нидерланды), кафедра вирусологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, полученная в Украинском НИИ с.х. микробиологии (г. Чернигов) и в Производственном предприятии меристемных культур г. Сочи (к 20 вирусам и 4 микоплазмам).
Структуру и функцию вирусных популяций определяли в различных фитоценозах изучаемых культур.
Чистые препараты вирусов выделяли из естественно инфицированных растений и при искусственном заражении соответствующих штаммовых растений. Накопление вирусов в растениях контролировали серологически и электронно-микропически. Для выделения вирусов растительную массу промывали проточной водой и замораживали в испарителе бытового холодильника, а затем измельчали на холоде в 1 /15 М фосфатном буфере рН 7,17. Вируссодержащий сок фильтровали через капроновое сито, эмульгировали с перегнанным хлороформом (1/5-1/6 объема), а затем центрифугировали при 5 тыс. об./мин. в центрифугах J2 -21 и L7-55 (BECKMAN) на холоде. Из частично очищенного сока выделяли чистые препараты вирусов гельфильтрацией на еэфарозе 4В и дифференциальным ультрацентрифугированием. Для изучения физических характеристик вирусов использовали седиментационный анализ (аналитическая ультрацентрифуга MOM 3170В, снабженная шлиреноптикой). Образцы исследовали в 12 мм ячейке при скорости вращения ротора (W) 26000 об/мин, утле наклона (а) 45° и температуре (t) 20°С. Коэффициенты седиментации определяли при концентрации вируса 0,28%, 0,21%, 0,14% и 0,056%, растворенного в 0,03М фосфатном буфере. Препараты вирусов исследовали в электронных микроскопах ЭМВ-ЮОЛ, JEM-7a, TESLA BS-500, при инструментальном увеличении 30-70 тыс. раз и ускоряющем напряжении 75-90 киловольт. Контрастирование препаратов проводили фосфорновольфрамовой кислотой и уранилацетатом в концентрации 1-2%. Иммуноэлекгронную микроскопию проводили методом декорирования и группирования вирусных частиц.
В полевых условиях при выращивании как первого, так и второго урожаев картофеля применяли профилактические приемы предупреждения
заноса и распространения вирусов (внесения системных инсектицидов, индивидуальная санитария, в полевых условиях пространственная изоляция, применение гербицидов, исключение междурядных обработок, ранняя уборка). Регулярно проводили вирусологическую оценку выращиваемых растений. В теплице проверяли каждое растение, а в полевых условиях в первую очередь анализировали среднюю пробу клона, а во вторую - каждое растение.
При разработке технологии оздоровления использовали рекомендации академика И.Г. Атабегова, а также многочисленных работ по использованию в этом аспекте культуры in vitro и результаты собственных исследований.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В третьей главе "ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ И ИХ РАСПРОСТРАНЕНИЯ В КУЛЬТУРНЫХ ФИТОЦЕНОЗ АХ" приведены результаты изучения пораженности вирусами ремонтантной гвоздики, хризантемы, орхидей, герберы, фрезии, лилии, нарцисса. В насаждениях гвоздики в большинстве случаев обнаружена крапчатая мозаика. При исследовании сока больных растений в электронном микроскопе выявлены сферические вирусные частицы размером около 30 нм. На листьях Chenopodium quinoa Willd. через 8 дней после инокуляции сока исследуемых растений появились светлые пятна. Вирус идентифицирован в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле против сыворотки к вирусу крапчатости, полученной от различных учреждений.
В процессе работ по оздоровлению сортов гвоздики от вирусов были выявлены растения, пораженные ВКГ. Моноинфекция В КГ в этих растениях нами доказана электронно-микроскопическим методом - выявлены однородные сферические частицы диаметром 30 нм и серологически против сывороток к вирусам кольцевой пятнистости, прижилковой крапчатости, латентному, кольцевой гравировки гвоздики и ВОМ. Полученный штамм, обозначенный нами как "Сочи КР" (депонирован в коллекции ВИЗР), пригоден для получения чистых препаратов ВКГ как для изучения его биологических свойств, так и в дальнейшей работе по получению иммунодиагностических препаратов к этому патогену'.
Выделение и очистку ВКГ штамм "Сочи КР" выполняли по следующей схеме:
-Замораживание растительной массы гвоздики при -10°С на протяжении 24-48 час.
-Гомогенизация вируссодержащего материала в фосфатном буфере рН
7,4 ;
-Отжим инфекционного сока через хлопчатобумажную ткань;
-Прибавление к вируссодержащему материалу р-меркаптоэтанола и тритона Х-100 в концентрации ОД-0,3%;
-Выдерживание в течение 1,5-2,0 часа;
-Прибавление в смесь бутилового спирта и ЭДТА до конечной концентрации 8,5% и 0,001 М соответственно;
-Выстаивание в течение 18-20 часов и осветление взвеси центрифугированием при 6 тыс. об/мин. 30 мин;
-Удаление осадка, центрифугирование супернатанта при 32 тыс. об/мин. в течение 100 -110 мин;
-Удаление супернатанта, ресуспендирование осадка в 0,01 -0,12 М трис-НС1 буфере, рН 7,5;
-Низкоскоростное центрифугирование при 5-7 тыс. об/мин;
-Удаление осадка, дополнительная очистка супернатанта (вирусный препарат кралчатости гвоздики) в градиенте плотности хлористого цезия 1,2-1,4 в бакетрогоре (Б\¥-28) при 20000 об / мин. в центрифуге Ь7-55 "ВЕСКМАЫ" на протяжении б часов.
После центрифугирования очищенную вирусную зону отбирали при помощи шприца. Для освобождения от С5С1 материал подвергали диализ}' против 0,01 М трис-НС1 буфер, рН 7,2-7,5 в течение 24 часов при 4-8°С. Очищенный препарат ВКГ штамм "Сочи КР" спекгрофотометрически имеет чистоту Е260/Е280>1,7. При скоростной седиментации обнаружен один неразмывающийся пик в течение 24 мин. Электронно-микроскопически в поле зрения обнаружены морфологически и структурно однородные вирионы около 30 нм в диаметре. При использовании электронной иммуноморфолоши (метод декорирования) были покрыты все имеющиеся в поле зрения частицы, что доказывает наличие только частиц ВКГ. Таким образом аналитическими исследованиями подтверждена моноинфекция ВКГ в полученном нами изоляте. Это послужило основой применения его в процессе получения высокоактивных антисывороток, пригодных для сертификации оздоровленного посадочного материала.
В растениях фаленопсиса электронно-микроскопически выявлена высокая концентрация вируса с нитевидной морфологией. По этом}' признаку патоген можно было отнести к потексвирусам. При помощи сывороток к вирусам мозаики цимбидиума и кольцевой пятнистости одонтогаоссума в препаратах идентифицирована моноинфекция вируса мозаики цимбидиума. Изучение биологических свойств указанного изолята позволило использовать его препараты для получения диагностической антисыворотки к вирус}' мозаики цимбидиума.
По нашим наблюдениям, сорта хризантемы в насаждениях цветоводческих хозяйств полностью заражены вирусами. Так, насаждения сорта Петер Уайт в совхозе "Деснянский" (г. Чернигов) оказались на 100% пораженными мозаикой. Электронно-микроскопическими исследованиями в соке испытуемых растений выявлены нитевидные частицы, которые по морфологии можно было отнести к карлавирусам. Патоген идентифицирован
при помощи сыворотки к В-вирусу хризантемы, полученной от К. Ортеля (ГДР). Необходимо отметить, что в указанном препарате отсутствовали сферические частицы (ВАТ, ВОМ и др.).
Наши исследования были расширены для паспортизации вирусов на различных культурам. В частности были проведены исследования на орнаментальных культурах. По предварительным данным, орнаментальные культуры поражены вирусами, относящимися к различным таксономическим группам. Выявлены вирусы: табачной мозаики, желтой мозаики фасоли, огуречной мозаики. Нами начато выделение вирусов из различных орнаментальных растений и их идентификация. Это позволит наметить пути ограничения их отрицательного экономического эффекта в цветоводческих хозяйствах, главным образом при выращивании оздоровленного посадочного материала гвоздики, орхидей, хризантемы, фрезии и др., как резерваторов инфекции для оздоровленных культур.
В четвертой главе "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МАССОВОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ В ОЗДОРОВЛЕННЫХ ФИТОЦЕНОЗАХ" приведены результаты исследования по разработке оптимальной технологии получения антисывороток.
Разработка способа получения антисыворотки к ВКГ (Авторское свидетельство N1596530, приоритет от 16 февраля 1989 г.). Суть его в следующем. Высокоочищенный антиген ВКГ, штамм "Сочи КР", предварительно агглютинируют эритроцитами того же животного (кролика), которого иммунизируют препаратом указанного антигена. Для этого из ушной вены кролика берут 2,0-2,5 мл крови (консервант - 2,5% лимоннокислый натрий), отстаивают, сыворотку удаляют, а эритроциты в течение 5 мин. отмывают при 5000 об/мин. стерильным 0,85% №С1. Затем к отмытым эритроцитам прибавляют антиген из расчета 5-10 мг белка на 1 кг массы кролика, смесь выдерживают при комнатной температуре 15 мин. Указанный антиген готовят перед каждой иммунизацией и вводят кроликам внутривенно с перерывом в 3 дня по предложенной схеме: 1,2 день - по 0,25-0,5 мг белка в 1 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 3 день - 0,5-1,0 мг белка в 1 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 4,5,6 дни - перерыв; 7 день-0,5-1,0 мг белка в 1,5 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 8 день - 1,0-2,0 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 9 день - 1,25-2,5 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного.
На 20 день животным вводят внутривенно 1,25-2,5 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов. На 30 день производят отбор крови и определяют титр антисыворотки в реакции преципитации в агаровом геле (табл. 1).
13
Таблица 1. Эффективность базовой схемы иммунизации кроликов антигеном ВКГ (на 8 кроликах)
Получено антисыворогки по отборам, мл Получено антисыворотки после реиммунизации, мл Итого мл
1 2 3 итого 1 2 итого
77 76 62 215 79 79 153 371
В среднем на 1 кролика 46,4± 10,8 мл На основе проведенных исследований разработан аналитический паспорт на ангасыворотки (табл. 2).
Таблица 2. Аналитический паспорт на антисыворотку к ВКГ_
Показатели Характеристика
1 Физические свойства Прозрачный,
(прозрачность, цвет) бесцветный
2 Величина рН 7,16
3 Электрофоретическая чистота 93,5%
4 Стерильность Стерильный
5 Пирогенность Апирогенен
6 Стабильность Стабилен
7 Безвредность Безвреден
8 Токсичность Не токсичен
9 Содержание белка 12,6%
10 Титр специфических антител 1:2048
Указанные исследования использованы для разработки "Технических условий" (ТУ) на новую продукцию - "Сыворотки диагностические к вирусам цветочных культур", которая является основным нормативно-техническим документом при производстве антисывороток к вирусам цветочных культу р.
Разработка способа повышения титра антнсыворотки (Авторское свидетельство N1448449, приоритет от 1 сентября 1986 г.).При работе с оздоровленным посадочным материалом как в процессе оздоровления, так и при массовом размножении в первичных звеньях семеноводства важно повышение чувствительности системы диагностики. В этом плане необходима разработка методов получение антисывороток высокого титра в процессе иммунизации животных, в частности с применением адьювантов, среди которых на первом месте адьювант Фрейнда (Гнутова, 1985). Результаты его использования показали выход 9090 относительных единиц в среднем из 7 кроликов.
Таблица 3. Выход сыворотки по 7 кроликам при иммунизации антигеном ВКГ, штамм "Сочи КР" с адьювантом Фрейнда (фирмы Б ЮМА-США)
1 отбор 2 отбор Выход антител в относительных единицах
мл титр мл титр 1 2
Всего 85 3136 67 2816 36160 29192 63632
Средняя 12,1 448 9,6 402 5165,7 4170 9090
С целью получения большего эффекта мы применили препарат из группы иммуномодуляторов - "бромид-2,3,5,6-тетрагидро-7-карбомошшетил-6-фенилими-дазо[2, 1-б]-тетразолия" - камизол (Б-58).
Таблица 4. Реакция животных на иммунизацию антигеном ВКГ, штамм "Сочи КР" в сочетании с различными дозами камизола (средняя из 4-х кроликов)_ _ _ _ _
N Доза 1 отбор 2 отбор Выход антител в
относительных единицах
Б-58 мл титр мл титр 1 2 Б
1 100 16 1024 14 1024 16384 14080 30464
2 120 14,8 2048 13 2048 30208 26624 56830
3 150 13 1024 13 1024 13384,5 13568 26956
Как видно из приведенных материалов при помощи камизола нам удалось в 3 - 5 раз увеличить выход диагностикума в расчете на 1 кролика для ВКГ.
Метод электронной микроскопии использовался в нашей работе как конечный тест отбора безвирусных линий, а также при паспортизации вирусов на многочисленных орнаментальных растениях находящихся в коллекции (Рыбалко, 1992).
Существующий способ повышения чувствительности этого метода -иммуноэлектроннуго микроскопию мы использовали в двух вариантах: для повышения чувствительности метода при отборе безвирусных линий за счет повышения адгезии вирусных частиц на опорной пленке-подложке, обработанной специфическими антителами и для доказательства моноинфекщш штамма ВКГ "Сочи КР" при разработке способа получения диагностической сыворотки (АС N1448449).
С целью выявления возможности неспецифического повышения чувствительности метода электронной микроскопии при выявлении вирусов нами разработан способ (заявка N4954353/13-051667), основанный на применении энергии электромагнитных волн сверхвысокочастотного диапазона (длина волны 12.6 см), обработка пленок-подложек этим излучением при мощности 20 ватт в течение 5 мин. достоверно увеличивала количество вирусных частиц в поле зрения электронного микроскопа.
Усовершенствование системы массовой диагностики вирусов в оздоровленных фитоценоз ах.
На основании известных и вновь разработанных методов определена система массовой диагностики вирусов на последовательных этапах технологического процесса производства оздоровленного посадочного материала различных культур.
В процессе исследований по получению оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики нами определены следующие методы в системе диагностики: электронная микроскопия, иммуноферментный анализ, радиальная иммунодиффз'зия.
Как показали наши исследования успех оздоровления определяет использование на первых этапах процесса производства товарного оздоровленного посадочного материала высокочувствительных методов диагностики вирусов. Разработанная нами система диагностики включена в "Типовую технологию получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики", утвержденную Научно-техническим Советом Главзеленхоза МЖКХ РСФСР в 1981 г (протокол N10). Указанная технология с 1981 г. применяется в производстве товарного оздоровленного посадочного материала многочисленных сортов ремонтантной гвоздики и других цветочных культур.
Получение реагентов для выявление мнкоплазмоподобных организмов.
Мы изучали возможности получения диагностических антисывороток к МПО столбура пасленовых, израстания гвоздики, а также выделенные из растений цинерарии гибридной и гортензии, хранящиеся в чистой культуре. Проведено получение на их основе реагентов для иммуноферментного анализа, а также изучение возможности увеличения специфичности антисывороток к этим патогенам путем иммунизации животных субклеточными структурами (мембранами), выделенными из МПО, поражающих различные растения (Рыбалко А.Е. с соавт., 19926).
На основе применения базовай схемы иммунизации получены первые партии антисывороток к указанным патогенам, и выделенным из них мембранам. Отработана методика получения иммуноглобулинов и пероксидазных конъюгатов для постановки иммуноферментного анализа на эти патогены.
В пятой главе "ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МАССОВОГО ОЗДОРОВЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ ОТ ВИРУСОВ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ МЕРИСТЕМЫ" изложены результаты исследования по разработке унифицированной технологии массового получения растений-регенерантов из эксплантатов конуса нарастания малого размера (100 мкм) В этом плане осуществлено кондиционирование условий питания изолированное ткани на разных этапах органогенеза с целью ускорения регенерации и увеличения выхода безвирусных растений, и с сохраняющими сортовые признаки исходных. В связи с тем, что имеется рад литературных источников, в которых сообщается о наличии вируса в меристеме, методом флуоресцирующих антител были изучены степени попадаемости вирусов в меристему. Использовали растения
картофеля сорта Черниговчанка, пораженного МВК. В зонах 300, 200, 100 Miar вирусы выявлены в 100, 80, 20% случаев. Электронной микроскопией при исследовании стеблевых верхушек (размером 300 мкм) картофеля сорта Искра вирионы МВК выявлены в 100% случаев. В препаратах, приготовленных из верхушек сорта Гатчинский размером 100 мкм, только в 4 из 20 выявлены единичные вирусные частицы. Следовательно, значительная часть меристем размером 100 мкм свободна от вирусов.
Разработка технологии оздоровления растений (Авторское свидетельство № N1608845 приоритет от 22.07.1990 г.) Для массового получения безвирусных растений мы провели исследования по разработке двухфазного метода регенерации их из истинных меристем (100 мкм). Двухфазность процессов органогенеза в культуре ткани выявлена Бутенко (1962). Суть ее заключается в подборе условий питания на различных этапах органогенеза. При испытании питательных сред Мореля, Мурасиге-Скуга и ВанГофа наилучшие результаты получены на последней (табл. 5). -
Изучение оздоровительного эффекта эксплантатов различного размера было проведено на растениях трех сортов картофеля (табл. 6). По данным электронной микроскопии оздоровительный эффект эксплантатов размера 100 мкм достигал 50,0-83,3% от числа регенерировавших. В тоже время выход свободных от вирусов растений из эксплантатов размера 250 мкм составил всего 4,7-28,5%. Данные таблицы свидетельствуют также и о сортовой разнице как в приживаемости эксплантатов, так и в выходе безвирусных растений по обоим размерам.
Таблица 5. Влияние состава питательной среды на регенерацию роствдв из меристем различных сортов гвоздики ремонтантной */_
Мурасиге-Скуга Ван-Гофа
Сорт образовало росток образовало росток
шт. % шт. %
Вильям 22 73,3 28 93,3
Уайт 19 63,3 26 86,7
Леди 23 76,7 22 73,6
Лена 18 60,0 28 92,3
Фламинго 22 73,3 26 86,7
Итого 104 69,2 130 86,6
*/ - посажено по 30 меристем.
Таблица 6. Влияние размера эксплантатов на выход безвирусных растений картофеля по даным электронной микроскопии*/
Размер экс- Регенерировало
Сорт плантатов, Всего безвирусных
мкм шт. % шт. %
Ранняя роза 100 12 40,0 10 83,3
Темп 100 6 20,0 3 50,0
Сафир 100 15 50,0 8 53,0
Ранняя роза 250 21 70, 6 28,0
Темп 250 21 70,0 1 4,7
Сафир 250 26 86,6 4 13,3
*/посажено по 30 меристем каждого сорта.
Изучение приемов антивирусного кондиционирования питательных сред
Для выявления возможности получения здоровых растений из стеблевых верхушек мы использовали ингибиторы вирусов, выделенные из дрожжей в Институте микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотнош АН Украины (канд. биол. наук А.Г. Коваленко), а также обнаруженный нами эффект антивирусного кондиционирования питательных сред тканями растений-продуцентов ингибиторов вирусов. Оценку действия изучаемых факторов проводили по данным электронной микроскопии.
Использование препаратов из дрожжей. При культивировании стеблевых верхушек картофеля сорта Приекульский ранний, пораженного ХВК выход здоровых растений составил в контроле 40%, 41-КЛ 70%,41-ВН, 2-ОДЭ-1 -76,6%.
При оздоровлении ремонтантной гвоздики от ВКГ наиболее эффективным было использование препарата 1-ОДЭ. По обоим препаратам дозы в 100 и 250 мг/л имели примерно одинаковое действие (табл. 7).
Таблица 7. Влияние ингибиторов из дрожжей на оздоровление ремонтантной гвоздики от вируса крапчатости в культуре стеблевых верхушек*/
Варианты опытов Концентрация препарата, мг/л Регенерировало растений
шт. безвирусных
шт. %
1. Среда Ван-Гофа - 14 4 28
2. То же + 1-ОДЭ1 100 15 12 78
3. То же + 1-ОДЭ 1 250 13 9 70
4. То же + 2-ОДЭ 100 15 7 47
5. То же + 2-ОДЭ 250 13 6 46
^/-посажено по 15 стеблевых верхушек размера 500 мкм в каждом варианте
Совместная культура стеблевых верхушек с тканями различных растений. Вещества, в различной степени проявляющие антивирусный эффект, выделены из многих растеннй (Рыбалко, 1984), причем некоторые из них получены в чистом виде (Лайейу, \Veintraub, 1962). Однако попытки использования этих веществ в терапевтических целях пока не увенчалось успехом, хотя в подавлении инфекционности вируса в соке положительные результаты получены (Бобырь, 1976). Известно кондиционирование питательных сред выращиваемой тканью; на этом основано применение тканей-нянек при выращивании растений из отдельно живущих клеток (Бутенш, 1971).
Мы изучали возможность антивирусного кондиционирования питательных сред тканями растений, из которых выделены ингибиторы вирусов (Рыбалко, Харута, 1977а). При подсадке ткани Б1апШш ЬагЬаШз Ь. длина стебля, масса растения картофеля сорта Приекульский ранний увеличилась в трои раза. Вирусологическими исследованиями выявлено, что при использовании подсадки различных тканей значительно увеличился выход здоровых растений из заведомо зараженных вирусом стеблевых верхушек (табл. 8). В этих опытах были использованы стеблевые верхушки размера 300 мкм.
Таблица 8. Сравнительное изучение эффективности тканей различных растений при оздоровлении картофеля сорта Юбель от Х+М+Б вирусов
Вариант Посажено верхушек, Регенерировало, В т.ч. безвирусных
ШТ. ШТ. ШТ. %
Контроль 100 22 2 9
Томаты 80 24 4 6
В1аШ1ш5 ЬагЬаШБ Ь. 100 43 23 52
01аШ1ш5 сапорЬуПш Ь. 100 20 18 90
СЬепоросНшп qшnoa Ь. 100 33 22 78
Для выявления возможности получения здоровых растеши"! из стеблевых верхушек размером 500 мкм испытывали ткань зверобоя обыкновенного в сравнении с ранее испытанными (табл. 9). В этом опыте в контроле не было получено здоровых растений. Ткань зверобоя обыкновенного превосходила по противовирусной активности ткани обоих видов гвоздики втрое. В этом варианте выход здоровых растений из стеблевых верхушек картофеля, пораженного вкусом X картофеля, составил 75%. Однако ткань зверобоя очень трудно вводить в стерильную культуру, так как только единичные культуры из многих десятков оставались неинфицированными. Эти культуры выдерживали лишь несколько пассажей. Такое же положение сложилось и с тканью лебеды гигантской, что свидетельствует о необходимости отработки режимов выращивания и поддержания указанных тканей для использования в практическом оздоровлении сортов, а также в широком изучении форм использования их в оздоровлении многочисленных растений, для которых
пока не отработаны режимы регенерации безвирусных растений из истинных меристем.
Таблица 9. Влияние различные тканей на оздоровление картофеля сорта Искра от ХВК в культуре стеблевых верхушек размера 500 мкм
Вариант Регенерировало ростков
Всего в т.ч. безвирусных
шт. шт. %
Контроль 11 0 0
Dianthus barbatus L. 8 2 25
Dianthus caryophyllus L. 10 2 20
Hypericum perforatum L. 12 9 75
*/ посажено по 30 стеблевых верхушек
Разработанная технология использована для осуществления сокращенной культуры картофеля в условиях Крайнего Севера, проведения опытов по разработке технологии получения растительных ферментов (продуцент Ficus carica), природных подсластителей (Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni) и душистых веществ (различные культивары дендратемы) в культуре in vitro.
В шестой главе ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПРИЕМОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА приведены материалы по разработке способов ускоренного размножения оздоровления от вирусов и микоплазм материала. Как известно, этот прием не сообщает растениям иммунитета к инфекции. Наличие широкого инфекционного фона ставит на первый план защиту семеноводческих посевов на всех этапах ускоренного размножения и в первую очередь при интенсивном первичном размножении исходных безвирусных растений (оригинальных меристемных растений).
В этом плане наиболее перспективным приемом является клональное микроразмножение в культуре in vitro.
Многолетние данные по ускоренному размножению картофеля в пробирочной культуре позволили нам определить коэффициент размножения, равный 1:5 в месяц. Это позволяет при наличии одного безвирусного растения в пробирке в течение 5 мес. получить 3000 растений, что определяет мощность работы модульного биоцентра. Это количество достаточно для посадки в оранжерее площадью 500 м2 или осуществления двухурожайной культуры картофеля на 1 га.
Для улучшения пргокиваемости микрочеренков подобрано сочетание ингредиентов питательной среды (АС СССР N1608845).
Изысканно приемов содержания коллекционных культур.
Актуальным является создание коллекций оздоровленных сортообразцов в культуре in vitro, обеспечивающей защиту от всех видов реинфекции. С1976 г. в лабораторной коллекции Укр. НИИ с.х. микробиологии мы поддерживали более 20 сортов различной скороспелости. Не вьмвлено сортовых различий в росте растений, выращиваемых в культуре in vitro. В дальнейшем была проведена контрольная электронномикроскопическая проверка растений некоторых сортов на вирусоносительство. Оказалось, что все проверяемые сорта были безвирусными.
Нами проведено изыскание приемов консервации коллекционных культур. Известно использование для этой цели низких температур (Шмыгая, 1974), а также ингибиторов роста (Трофимец с соавт., 1974; Фешша, 1975).
Для консервации коллекционных культур мы испытывали препарат ТУР (хлорхолинхлорид) и некоторые метаболиты почвенных микроорганизмов, в частности пиюлиновую (П) и феназин-1-карбоновую (ФК) кислоты (Линчук с соавт., 1979). Препараты в дозах на 1 л питательной среды: ТУР - 2 мл, П и ФК по 10 мг достоверно влияли на уменьшение длины стебля у двух сортов. В последействия не выявлено влияния этого приема на морфологические признаки и продуктивность растений.
Получение мнинклубией in vitro (туберизация) имеет важное значение в плане транспортировки на большие расстояния и при ведении коллекций, так как миниклубни могут сохраняться длительное время на ограниченной площади. Появление клубней мы нередко наблюдали при выдерживании растений без пересадок в течение 3-5 месяцев или при слабом освещении. Имеются сведения о кондиционировании условий туберизации у картофеля in vitro в нашей стране (Морозова, Мелик-Саркисов, 1978) и за рубежом (Palmer, Smith, 1969). Это позволяет считать вопросы клубнеобразования в стерильной культуре (туберизации) экспериментально обоснованными. Для планомерного получения клубней в стерильной культуре мы использовали методику Пальмера и Смита. Она заключается в следующем, черенки или кусочки ростков в сахарных стаканчиках по 5 шт. высаживают на питательную среду Murashige-Scoog с повышенным содержанием сахарозы (до 6%) и кинетина (до 2.5 мг/л). Культуры выдерживают в темноте при 20±2° С. Клубни образуются в пазухах листьев в течение 1-1.5 месяцев.
Разработка методики получения мшшчеренков. При пересадке пробирочных растений в почву наблюдается значительный отпад. Нами разработан прием, позволяющий избежать этих затруднений. При выращивании растений в пробирках в фазе 5-6 междоузлий от них в стерильныхусловнях отделяют миничеренки (верхушку с 2-3 междоузлиями). Их основания обрабатывают стимуляторами роста в (0.003% спиртовом растворе а-НУК в течение 15 сек.), высаживают в герметические камеры из оргстекла и выдерживают до укоренения.
В этих камерах размещается 250-350 миничеренков. Камеры с миничеренками мы выдерживали при освещенность около 10 килолюксов и 16 часовом фотопериоде и температуре 25±2°С. В этих условиях укоренение миничеренков ремонтантной гвоздики происходит в течение 20±3, хризантемы 12-15 дней. В опыте показаны преимущества миничеренков в сравнении с пробирочными растениями после пересадки в почву. Миничеренки быстрее приживаются и более интенсивно растут.
Размножение растений черепками и в двухурожайной культуре. Для
ускоренного размножения безвирусного картофеля мы использовали методы отводков и черенкования в сочетании с двухурожайной культурой. При этом первый урожай получали в весенние месяцы с использованием защищенного грунта, что обеспечивало защиту от заноса инфекций извне, поскольку вегетация растений протекает в период, когда нет посадок картофеля и других культур - резерваторов вирусов (временная изоляция). Отработка этой методики начата в 1971г. на примере сорта Приекульский ранний. Для получения первого урожая в период март - май использовали защищенный грунт, второй урожай получали на изолированном торфянике в пойме реки Замглай (Черниговская обл.), с начала июня по конец августа, используя проращенные в теплице клубни. Потомство каждого растения, выращенного в теплице, высаживали отдельно. Таким образом, можно считать выращиваемые в теплице растения как клоны первого, а на изолированном торфянике - второго года. Вирусологическими исследованиями установлено, что первичное размножение картофеля отводками, черенкованием интактных растений и делением пробирочных растений по количеству междоузлий (клональное микроразмножение) практически не влияет на пораженность потомства вирусами. Во всех случаях на последующих этапах размножения обнаруживали лишь единичные растения, пораженные X, У, Б - вирусами. При массовом размножении материала в различных опытах 1973 г. пораженность вирусами составила: ХВК -0.02%, БВК - 0.05%, МВК - 0.25% (по данным серологических анализов) и скручиванием листьев - 2% (по визуальной оценке). Инфекция МВК прогрессировала и в 1974 г. составила 3%. Между тем 28 безвирусных клонов 1971 г., размноженных индивидуально, были свободны от вирусов. Половина тех же клонов, размножаемых обезличенно в двухурожайной культуре, была поражена МВК на 0.036%. ИВК и ВТМ ни в одном случае не были обнаружены.
Пораженность вирусами меристемной и обычной элиты резко различалась как по уровню зараженности, так и по составу возбудителей. Если обычная элита была поражена ХВК и комплексной инфекцией, пораженных растений было 82-92%, то меристемная - в основном МВК, причем пораженных растений было всего 4-15%.
При полевом размножении сортов Гатчинский, Огонек и других также обнаруживали только единичные растения, пораженные X и Б -вирусами. Это свидетельствует о том, что тщательное соблюдение мер профилактики распространения вирусов позволяет сохранить материал в оздоровленном состоянии.
Оздоровление цветочных культур начато в 1976 г. Первым объектом исследования выбрана гвоздика. Основным патогеном на этой культуре является вирус крапчатости гвоздики, так как он первым поражает оздоровленные насаждения (Е5кепа/л' а!., 1983) и может служить критерием санитарного состояния насаждений (Роирй, 1975). При массовом производстве оздоровленного посадочного материала на базе безвирусных мериклонов, полученных из истинных меристем (100 мкм) и отобранных при помощи электронной микроскопии ежегодно формируется суперэлитный маточный питомник. В 1981 г. эти растения выращивали и изучали на продуктивность и пораженность ВКГ клоновым методом, т.е. анализировали каждое растение в рамках линии (потомство отдельной меристемы). В результате было установлено, что линии, полученные из истинных меристем (100 мкм) были свободны от этого патогена в течение года (срок использования насаждения для получения коммерческой продукции).
В целом же многолетними исследованиями установлено низкое поражение вирусами промышленных насаждений гвоздики на предприятии (рис. 1).
инфицированных растений
НШ - здоровых растений Рис. 1. Пораженность маточника гвоздики ВКГ по данным многолетних
исследовании
Седьмая глава. ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНИЗАЦИОННЫХ ФОРМ ВНЕДРЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В ПРОИЗВОДСТВО посвящена выбору стратегии использования достижений биотехнологии, в частности разработок диссертанта, в интересах народного хозяйства.
В системе коммунального хозяйства Российской федерации создано научнопроизводственное предприятие для разработки и внедрения ресурсосберегающих биотехнологий оздоровления растений от вирусных заболеваний и иммунодиагностикумов для выявления широкого спектра вирусов и микоплазм, поражающих цветочные и другие растения с целью создания интегрированной системы борьбы в оздоровленных фитоценозах.
С этой целью была разработана и утверждена Минжилюмхозом РСФСР "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики". Она включает нормативно-технические требования к материалам и оборудованию, применяемым при производстве оздоровленного посадочного материала и все звенья технологического процесса - от выделения меристем до получения элиты на меристемной безвирусной основе (рис. 2)
Рис. 2. Схема технологического процесса производства оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики
Указанный технологический процесс является базовым для оздоровления и других цветочных культур. Данные производства оздоровленного посадочного материала гвоздики и хризантемы приведены в табл. 10.
Таблица 10. Производство оздоровленных черенков гвоздики и
хризантемы за 1982-1989 гг.( в тыс. шт.)
Годы Гвоздика Хризантема
не укорененные укорененные не укорененные укорененные
1982 529,99 354,29 - -
1983 870,78 735,35 - -
1984 910,12 770,07 56,58 48,09
1985 1428,65 1104,8 14,64 12,47
1986 1110,09 910,05 149,23 134,57
1987 1670,47 1186,44 172,45 138,41
1988 1916,81 1314,32 221,70 191,37
1989 1026,64 279,95
Всего укорененных 7501,98 707,79
Разработка принципов стандартизации биотехнологий в цветоводстве (технологии оздоровления растений, оздоровленный посадочный материал, биопрепараты для диагностики возбудителей вирусных и вирусоподобных заболеваний). Требованиями управления качеством и необходимостью включения в номенклатуру новых видов продукции продиктована необходимость разработки нормативно-технических документов на продукцию, так как получаемая в процессе исследований продукция могла быть отнесена к новым видам.
Первым нормативно-техническим документом, узаконившим производство новой для народного хозяйства продукции - безвирусных мериклонов цветочных растений, была "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики", разработанная нами на основе собственных экспериментальных материалов и утвержденная Научно-техническим советом МЖКХ РСФСР в июне 1981г.
Указанная технология стала базовой для производства оздоровленного посадочного материала и других цветочных растений и обеспечила внедрение в производство новой для народного хозяйства продукции с высоким экономическим эффектом. Это послужило основанием для расширения работ, а также включением их в Общесоюзную научно-техническую программу 074-06 "Разработать биотехнологические методы получения ценных для медицины и сельского хозяйства продуктов и внедрить их в производство", Задание 03. "Осуществить клональное микроразмножение и оздоровление ценных сельскохозяйственных культур: создать исходные формы для получения новых сортов сельскохозяйственных растений с использованием методов клеточной инженерии", 03.01.т. Осуществить клональное микроразмножение и оздоровление ценных форм хозяйственно важных растений с помощью культуры клеток и тканей, в т.ч.: 03.01.08 - цветочно-декоративных растений". Для осуществления массового производства безвирусного посадочного материала и проведения исследований по
упомянутой теме Минжилкомхозом РСФСР по разработке диссертанта организовано Производственное предприятие меристемных культур.
В задач}' предприятия входит разработка и внедрение в производство ресурсосберегающих технологий оздоровления и микроразмножения ценных цветочных и продовольственных культур, производство иммунодиагностических препаратов к патогенам, поражающим цветочные и продовольственные культуры (вирусы, микоплазмы). Для производства новых видов продукции и управления качеством необходимо обеспечение нормативно-технической документацией (Рыбалко, 1988в).
С 1986 г. совместно с Краснодарским филиалом ВНИИстандартизации приступили к разработке нормативно-технической документации. Разработанная схема (рис. 3) предусматривает стандартизацию технологического процесса, готовой продукции на всех стадиях жизненного цикла, методов контроля (Рыбалю, 1988, Рудоминская с соавт. Л 988; Рыбалко, Рудоминская, 1988).
Концепция стандартизации биотехнологий в цветоводстве сформулирована с учетом специфики объектов стандартизации и современных требований государственной стандартизации к качеству
Рис. 3. Схема стандартизации биотехнологической продукции
26
В схеме представлены направления, объекты и уровни стандартизации производства меристемного посадочного материала и диагностических препаратов. В документах регламентируются требования к исходным растениям-донорам меристем, методам их отбора и контроля. Определена последовательность выполнения технологических операций культивирования меристем с момента извлечения из исходного растения до выхода готовой продукции. Требования к качеству готовой продукции дифференцированы в зависимости от технологической стадии ее получения. Стандартизации подвергнуты показатели качества биопрепаратов, используемых для тестирования оздоровленного материала на наличие вирусов и препаратов чистых культур вирусов, применяемых для получения соответствующих диагностических антисывороток. Разработанный комплекс документов по стандартизации способствует внедрению прогрессивной, высокоэффективной технологии в производство и организации широкомасштабного выращивания оздоровленного от вирусных инфекций высококачественного посадочного материала цветочных растений.
Практическая реализация научно-технических достижений через стандартизацию позволяет унифицировать методические подходы к решению вопросов по обеспечению производства высоко эффективными технологиями, а потребителя - продукцией высокого качества.
Опыт разработки комплекса нормативно-технических документов для биотехиолопгческой продукции в отрасли промышленного цветоводства может служить научно-методической базой для организации работ по стандартизации аналогичной продукции агропромышленного комплекса.
Массовое производство безвнрусного посадочного материала. С
самого начала исследований полученные результаты проходили производственную проверку. Так, с 1 кг безвирусных клубней сорта Приекульский ранний выращено: в 1971 г. -0,5 т; в 1972 г. - 3, 0 т; в 1973 г. -30,0 т; в 1974 г. - 2000,0 т (в различных хозяйствах Украины). До 1974 г. внедрение проводили в опытном хозяйстве Украинского НИИ с.х. микробиологии (г. Чернигов), а с 1974 г. начато испытание оздоровленного в культуре меристемы картофеля непосредственно в семеноводческих хозяйствах, а также в научно-исследовательских учреждениях. Результатом проведения этой работы было получение в 1975 г. опытным хозяйством института элиты на меристемной безвирусной основе. В ряде хозяйств доказаны преимущества этого материала в сравнении с полученным при помощи серологических клоновых отборов.
С 1981 г. начато массовое производство оздоровленного посадочного материала цветочных растений на примере гвоздики ремонтантной. С целью повышения производительности труда проведено изучение возможности унификации основных приемов оздоровления и микроразмножения для различных растений. Установлено, что для картофеля, гвоздики, хризантемы, орхидей, герберы, лилии, гладиолуса, фикусов, филодендронов, кордилины, земляники, винограда, киви, мандарина, ананаса, стевии, инжира,
папоротников, стевии, и др. возможно применение общего технологического процесса на этапах приготовления питательных сред, введения растительных тканей в стерильную культуру, регенерации, микроразмножения, акклиматизации. Это дало возможность расширить ассортимент растений, включенных в процесс массового размножения методом стерильной микрокультуры. Только за 1986-1990 гг. (в рамках выполнения общесоюзной научно-технической программы 074-06 "Разработать биотехнологические методы получения ценных для медицины и сельского хозяйства продуктов и внедрить их в производство") получено 175599 мериклонов различных культур (табл. 11).
Таблица 11. Производство безвирусных мериклонов для формирования оздоровленных маточников в различных хозяйствах СССР (1986-1990 гг.)
1986 1987 1988 1989 1990 Всего
Мериклоны переданные в производство
27200 31980 39600 | 46221 25618 170619
Мериклоны в пробирках
- 40 234 1 1626 3030^ 4930
Всего 27200 32020 39834 1 47847 28648 175549
Производство коммерческих препаратов иммунодиагностпкумов. В связи с широким внедрением методов массового оздоровления в практику производства коммерческого посадочного материала цветочных растений, мы провели работ}' по организации производства широкого ассортимента иммунодиагностпкумов (табл. 12). Это обеспечивает замкнутую систем}' безвирусного семеноводства (Рыбалко, 1988а; Харутас соавт., 1984, 1986).
В 1990-1991 гг. проведены работы по получению диагностических антисывороток к микоплазмоподобным организмам, выделенным из гвоздики, цинерарии гибридной, гортензии, а также столбура томатов. Проведены разработки по получению реагентов для иммуноферментного анализа : иммуноглобулинов и пероксидазных конъюгатов. Эти реагенты были получены к 14 антисыворткам, в т.ч. на ВЖМФ, ВКГ, ВЖМФ(фрезия), Реттл, вирусу антуриума, ВМЦ, ВВХр, ВТМ, ВАТ, ВМЛилии, ЛВГ, ВМНарцисса, ВОМХр, а также 4 антимикоплазменным сывороткам.
Таблица 12. Производство антисывороток диагностических за 19851990 гг. ( в мл)
1985 1986 1987 1988 Итого
Итого за год (мл) 1390 1457 1202 1845 5894
На базе указанного ассортимента полученных нами антисывороток НПО "Биолар" (г. Олайне, Латвия) в 1985-1988 гг. осуществило производство диагностических наборов для ИФА (Приказ N66/3126 от 25.07.1986 т.).
Экономический анализ производства безвпрусных мериклонов
Благодаря унификации технологического процесса для различных видов и больших объемов производства как видно из табл. 13, установлено, что себестоимость одного мериклона сравнительно небольшая и находится в пределах цены на оздоровленные черенки гвоздики (в ценах 1984 г.).
Таблица 13. Структура затрат по стадиям выращивания мериклонов
Виды затрат Себестоимость единицы, коп.
Лаборатория Доращивание Итого
коп. % коп. % коп. %
1. Оплата труда 17,6 36,9 11,3 39,4 28,9 37,8
2. Стоимость оборудования 13,8 28,9 03,3 11,5 17,1 22,4
3. Прочие затраты 16,3 34,2 14,1 49,1 30,4 39,8
Итого производственная себестоимость 47,7 28,7 0-76,4
% к полной производственной себестоимости 62,4 37,6 100,0
Анализ затрат на производство мериклонов свидетельствует том, что основная доля их приходится на лабораторную фазу - примерно 2/3 (62.4%), а 1/3 (37,70) - на фазу акклиматизации и доращивания в теплице. На обеих фазах наибольшая доля затрат приходится на оплату труда и лабораторного оборудования. В плане снижения затрат как на лабораторной фазе, так и при проращивании планируется разработка автоматизированной технологической линии, включающей автоматизацию технологических режимов по подготовке лабораторной посуды, приготовлению питательных сред, применению новых более эффективных методов клонального микроразмножения, инертных субстратов, автоматизации регулирования климатических факторов, передвижения материалов и культур в технологических узлах технологической линии (Рыбалко, 19916).
Обеспечение опытно-конструкторской разработки типовых технологических линий производства мериклонов н иммунодпагаостикумов
Материалы исследований по диссертации были использованы нами для разработки опытно-производственной базы предприятия и модульного биоцентра. Разработку технического задания на модульный быстроразвертываемый промышленный биоцентр в рамках МНПК "Биотехническая индустрия" проводили совместно с проектным инсттугом ГипроНИИмедбиопром Минмедмикробиопрома СССР. При этом нами были
разработаны и выданы технические условия, включающие опытно-промышленный регламент на производство безвирусных мериклонов широкого спектра растений по схеме, предложенной ГипроНИИмедбиопром, для чего была использована "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики".
ПРАКТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНАДАЦИИ
1. По материалам диссертации разработаны и утверждены в установленном порядке нормативно-технические документы:
а) "Типовая технология получения исходною безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики" (утверждена Минжилкомхозом РСФСР 1981 г.),
б) ТУ "Сыворотки диагностические к вирусам цветочных культур",
в) ТУ "Препараты вирусов растений",
г) ТУ 204 РСФСР 2.187-89 - "Миничеренки цветочных растений оздоровленные (технические условия)"
д) ТУ 204 РСФСР 2.186-89 - "Черенки цветочных культур оздоровленные, посадочный материал (технические условия)"
е) ТУ 427-975-86 - "Гвоздика горшечная оздоровленная (технические условия)"
ж) ТУ 427-970-86 - "Саженцы цимбидиума оздоровленные (технические условия)"
з) ТУ 427-969-86 - "Оригинальные меристемные растения (технические условия)"
и) Технологическая инструкция "Технология производства безвирусного посадочного материала"
к) ТУ 204-2-01-91 - "Технологическая инструкция производства препаратов вирусов цветочных культур",
2. Разработаны и изданы: Методические рекомендации по борьбе с вирусными болезнями в маточных питомниках ремонтантной гвоздики. -Киев: Минжилкомхоз УССР. 1978. 13 с. (авторы Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Козар Ф.Е., Сивере H.A., Копейченко М.И.).
3. НПО "Биолар" переданы ангисыворотки, которые использованы в производстве диагностических наборов для ИФА.
4. Совместно с Минжилкомхозом Российской Федерации в 1985 г. создано Производственное предприятие меристемных культур (приказ 205 от 15.04.1985 г.) В 1996 г. в преобразовано в федеральное государственное унитарное предприятие Научно-исследовательский центр "Меристемные культуры" Минстроя России (Устав №557, свидетельство о регистрации серия АДГ № 1336 от 12.07.1997 г.),
5. На протяжении 1983-1990 гг. произведено и реализовано многочисленным предприятиям СССР 7501,98 тыс. элитных черенков гвоздики ремонтантной и 707,79 хризантемы.
6. С 1986 по 1990 г. произведено для нужд собственного производства и реализовано различным предприятиям 5894 мл высокоактивных нативных антисывороток, специфичных к 15 вирусам и 4 микоплазмам.
7. Технология оздоровления и микроразмножения широкого спектра культур передана по договорам: Невскому карантинному питомнику Ленинградского объединения "Цветы", Краснодарскому НИИ картофелеводства и овощеводства, совхозам "Таугуль", "Жодинский", "Надымский".
8. Получены авторские свидетельства на 4 изобретения
9. Подано 3 заявки на выдачу патента Российской Федерации.
10. На все виды продукции разработаны технологические карты.
11. Втечение 1988-1995 гг. материалы диссертации использовались для чтения лекций по биотехнологии на кафедре физиологии растений Донецкого государственного университета.
12. Разработан проект и технико-экономическое обоснование строительства опытно-производственной базы федерального государственного унитарного предприятия Научно-исследовательский центр "Меристемные культуры".
13. Совместно с ГипроНИИмедбиопром Минмедмикробиопрома СССР по заданию междуведомственного научно-производственного комплекса "Биотехническая индустрия" разработан проект модульного быстро развертываемого биоцентра.
14. Создан учебный фильм "Болезнь века".
ВЫВОДЫ
1. Электронно-микроскопическими и серологическими анализами установлено полное заражение насалэдений вегетативно размножающихся растений вирусами. Большинство из них находится в скрытой форме. На картофеле в основном распространены X, М, Б, У - вирусы их комплексы. Зараженность растений ремонтантной гвоздики вирусом крапчатости в большинстве случаев сочетается с вирусами кольцевой пятнистости, латентным, прижилковой крапчатости. Исследованные сорта хризантемы полностью заражены В-вирусом, часто в смеси с вирусами табачной мозаики, аспермии томатов, огуречной мозаики. Сорта и виды орхидей заражены вирусами мозаики цимбиднума и кольцевой пятнистости одонтоглоссума.
2. Проведенные обследования изучаемых культур (герберы, пуансеттии, антуриума, лилии, гладиолуса, нарцисса, фрезии, розы, различных орнаментальных культур - 48 видов) привели к выяснению комплексного поражения вирусами относящихся к различным таксономическим группам. Определены наиболее часто встречаемые комбинации, биологические и физикохимические характеристики.
3. Разработаны методы получения высокоактивных диагностических антисывороток к некоторым вирусам, поражающим цветочные культуры, на
основе нового иммуномодулятора камизола.
4. В производственных условиях разработан прием повышения чувствительности реакции путем концентрирования вируса насыщением ПЭГ мм 6000 до конечной концентрации 8%. Применены прогрессивные методы диагностики вирусов: на основе радиальной иммуно-диффузии и иммуноферментного анализа. Разработан перспективный способ приготовления препаратов вирусов для электронной микроскопии, обеспечивающий неспецифическое повышение чувствительности метода (приоритетная справка N4954353/13-051667).
5. В комплексе защиты картофеля, гвоздики ремонтантной, хризантемы и других вегетативно размножающихся культур от вирусных заболеваний первостепенную роль играет получение и применение здорового исходного материала на основе культуры меристемы в сочетании с приемами ускоренного размножения и защиты от реинфекции.
6. На основе изучения локализации вирусов в стеблевых верхушках и усовершенствования методов ранней диагностики вирусов разработана и экспериментально обоснована унифицированная ресурсосберегающая технология получения безвирусных растений и клонального микроразмножения в культуре in vitro с учетом оптимального сочетания ингредиентов питательных сред для осуществления двухфазного метода регенеращш растений, позволяющего сократить сроки получения генетически однородных и одновозрастных растений в промышленных количествах.
7. Выход безвирусных растений ряда сортообразцов картофеля, гвоздики и хризантемы, полученных их эксплантов размера около 100 мкм без предварительной термотерапии составил у картофеля 50-83%,у гвоздики и хризантемы - около 60%.
8. Разработаны приемы повышения оздоровительного эффекта культуры стеблевых верхушек (300-500 мкм), альтернативные термообработке исходных растительных тканей. При использовании полисахаридов, выделенных из дрожжей получено до 70% здоровых культуру картофеля и гвоздики в результате подсадки к стеблевым верхушкам тканей-продуцентов антивирусных метаболитов (гвоздика турецкая и садовая, лебеда гигантская, зверобой обыкновенный) получено 50-75% здоровых растений картофеля.
9. Разработана и экспериментально обоснована система приемов массового производства безвирусного исходного материала. Клональное микроразмножение in vitro растений картофеля, гвоздики, хризантемы, орхидей и других культур обеспечивает не только защиту от всех видов реинфекции, но и позволяет получить коэффициент размножения 1:3000 и более в течение 5 мес. Для получения безвирусных растений и клонального микроразмножения в культуре in vitro растений, пригодных к пересадке в почву, разработана питательная среда со сбалансированным сочетанием макроэлементов (АС 1608845). Использование интенсивного размножения на первых этапах в комплексе с приемами защиты от реинфекции позволяет поддерживать насаждения различных культур в относительно здоровом состоянии.
10. Предложены принципиально новые приемы ускоренного размножения на основе применения регуляторов роста и физических факторов:
а) предпосадочное замачивание клубней в растворе препарата ТУР повышает урожай картофеля на 23% и коэффициент размножения - на 29%;
б) применение импульсного освещения при проращивании посадочного материала способствует получению более коротких ростков, чем при темновом.
11. Разработана концепция стандартизации биотехнологий в цветоводстве, которая сформулирована с учетом специфики объектов стандартизации и современных требований государственной стандартизации к качеству продукции.
12. Производственная проверка разработанной ресурсосберегающей технологии оздоровления растений позволила рекомендовать включение ее элементов в технико-экономическое обоснование проекта модульного биоцентра в рамках конверсии.
СПИСОК
работ, опубликованных по материалам диссертации:
1. Марченко В. А., Рыбалко А.Е. Вирусные болезни картофеля в Полесье УССР и мероприятия по борьбе с ними/Ютдел информации и прессы Выставки передового опыта в народном хозяйстве УССР. Киев. 1969. 4 с.
2. Марченко В. А., Рыбалко А.Е., Ющенко Н.И. Результаты применения комплекса методов при отборе безвирусных клубней картофеля// VI Всесоюзное совещание от вирусным болезням растений (Киев, 3-5 мая 1971 г.).- М.:ВАСХНИЛ. 1971. - С. 57.
3. Марченко В.А., Рыбалко А. Е., Ющенко Н.И. Пораженность вирусными болезнями некоторых сортов картофеля, распространенных в Полесье Украинской ССР/ЛЛ Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений (Киев, 3-5 мая 1971 г.). - М.: ВАСХНИЛ. 1971. - С. 58.
4. Рнбалко А. С. Вплив скручування листа (Ь-в1руса) на вмют хлорофЬу в лист! р!зних сорттв картоплУ/Бюлопчш особливосп мшрооргашзм1в. Материалы I Республиканской конференции молодых ученых микробиологов и вирусологов. Киев: Наукова думка, 1972. С. 67.
5. Рибалко А. С., Харута Л.Г. Прискорене розмноження картопл1, оздоровлено! вщ в1русно1 шфекцн методом культури ашкально! меристеми //Бюлопчт особливосп мкрооргатзм!в. Матер1али конференцп молодих учених-мпфобюлопв 1 в1русолопв. -Киев: Наукова думка, 1972. С. 67.
6. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е. Перспективы использования метода апикальных меристем в семеноводстве овощных кулыур//Тезисы докладов к Всесоюзному семинару-совещанию по вирусным болезням овощных культур. М.: ВАСХНИЛ, 1974а. С. 51.
7. Шелудько Ю.М., Рибалко А. С. Нов! методи одержання безв1русно'1
елгти картошп//Вюник сшьськогосподарсько1 науки. 19746. №10. С. 53-57.
8. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е. Пути повышения устойчивости растительных тканей для получения безвирусных растений/Л V Всесоюзное совещание по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям. М.: ВАСХНИЛ, 1975. С.62.
9. Шелудько Ю.М., Рибалко А. е., Харута Л.Г. До питания про д1агностику скручування листя та застосування термотерапп в боротьб! з ним //Картоплярство. Киев: Урожай, 1974а. С. 44-46.
10. Шелудько Ю.М., Рибалко А. е., Харуга Л.Г., Жук 1.П., Горбаренко M.I. Перспекгиви одержання 6e3BipycHOi' ели-и картопж// Картоплярство. Киев: Урожай, 19746. N5. С. 41-45.
11. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Использование метода культуры меристемы картофеля для создания исходного безвирусного материала в Украинской ССР//Современные методы получения безвирусного картофеля, тез. докл. кВсесоюз. семинару-совещанию. М.: ВАСХНИЛ, 1975. С. 25-26.
12. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Усовершенствование метода культуры меристем для оздоровления картофеля от вирусов/УСовременные методы получения безвирусного картофеля. Тез. докл. к Всесоюзн. семинару-совещанию. -М: ВАСХНИЛ, 1975. - С. 24-25.
13. Козар Ф.Е., Сивере H.A., Рыбалко A.C. Очистка ХВК, YBK, ВТМ та сферичного Bipyca гвоздики з застосуванням пол1етиленппколю та гельфшьтрацп/М1кробюлопчний журнал. - 1976. - Т. 38. Вип. 5. С. 637.
14. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Использование клубней разного размера при размножении безвирусного меристемного каргофеля/ЯСартофель и овощи. 1976а. N5. С. 19.
15. Рибалко A.C., Харута Л.Г. Застосування методу тультури меристеми для оздоровления промислових сорпв ремонтантно! гвоздики. Мшробюлолчний журнал. 19766. Т.38. Вип.6. С. - 645.
16. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Шелудько Ю.М. Применение ТУРапри ускоренном размножении безвирусного картофеля, полученного методом культу ры меристемы//Отдельное приложение к методическим указаниям по работе с препаратохМ ТУР в плодоводстве и овощеводстве по материалам 3-го Всесоюзного совещания. М.: МСХ СССР, 1976. С. 22-24.
17. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., ЖукИ.П., Горбаренко Н.И. Исходный материал для семеноводства картофеля на безвирусной основе//Вирусные болезни растений Дальнего Востока. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1976, новая серия, Т.25(128). С. 146-149.
18. Рибалко A.C., Харута Л.Г. Вивчення ефекту антив1русного кондищонування живильних середовищ ¿мунними няньками// Мшробюлопчний журнал. 1977а. Т.39. Вип.5. С. -667.
19. Рибалко A.C., Харута Л.Г. Про удосконалення метод1в оздоровления картошп вщ в1рус1в//В1сниксшьськогосподарсько! науки. 19776. N8. С. 108110.
20. Рыбалко А.Е. Получение исходного безвнрусного посадочного материала ремонтантной гвоздики и хризантемы в Украинской ССР//Научно-практическая конференция "Выращивание цветочных культур меристемным способом". Рига: Мин. ком. хоз. Лат. ССР, 1977. С. 26-27. '
21. ШелудькоЮ.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Ускоренное размножите меристемного безвирусного картофеля/ЛЗестник сельско-хозяйственной науки. 1977а. N7(250). С. 26-30.
22. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Использование метода культуры меристем для создания исходного безвирусного материала картофеля в УССР//Науч. тр. НИИКХ. М.: 19776. вып. 30. С. 51-57.
23. Рыбалко А.Е. Изучение условий массовой регенерации безвирусных растений в культуре меристемы//Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними. М.: ВАСХНИЛ, 1978. С. 10-11.
24. Рыбалко А.Е., Сивере H.A., Харута Л.Г. Изучение биологических свойства вируса, выявленного в промышленных насаждениях ремонтантной гвоздики/ЛЗирусные болезни сельскохозяйственных растений и меры борьбы с ними: Тез. докл. Всесоюзн. совещ. (Ленинград, сентябрь, 1978 г.). - М.: ВАСХНИЛ, 1978а. - С. 131.
25. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Применение метода культу ры меристемы для оздоровления от вирусов ремонтантной гвоздики// Физиология и биохимия культурных растений. 1978. Т. 10. Вып. 5. С. 535-540.
26. Харута Л.Г., Рыбалко А.Е., Козар Ф.Е., Сивере H.A., Фомин В.В. Идентификация вируса крапчатости гвоздики в промышленных посадках Киевского интродукционнокарантинного питомника декоративных растений //II республиканская научно-теоретическая конференция молодых ученых-микробиологов. Тез. докл. Ташкент: Фан. 1978. С. 126-127.
27. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Козар Ф.Е., Сивере H.A., Копейченко М.И. Методические рекомендации по борьбе с вирусными болезнями в маточных питомниках ремонтантной гвоздики. - Киев: Минжилкомхоз УССР. 19786. 13 с.
28. Ермолаева Н.Г., Латаш Л.М., Рыбалко А.Е., Коваленко А.Г. Использование препаратов из дрожжей для повышения оздоровительного эффекта культуры меристемы при получении безвирусных гвоздик//\Т1 конференция молодых ученых-ботаников Украины. Тезисы докладов. Киев: Наукова думка, 1979. С. 123.
29. Латаш Л.М., Ермолаева Н.Г., Рыбалко. Применение регуляторов роста при ускоренном размножении безвирусных гвоздик/ЛЛ конференция молодых ученых-багаников Украины. Тез. докл. Киев: Наумова думка, 1979. С. 131.
30. Пинчук И.Н., Рыбалю А.Е., Харута Л.Г., Патыка В.Ф. Изучение действия некоторых синтетических и природный ингибиторов роста на меристемный картофель//У1 конференция молодых ученых-ботаников Украины. Тез. докл. - Киев: Наукова думка. 1979. С. 155.
31. Рыбалко А.Е. Изучение условий массовой регенерации безвирусных растений в ку льтуре меристемы//Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1980. С. 94-99.
32. Рыбалко А.Е. Результаты многолетнего использования метода культуры меристемы в практическом семеноводстве//Культура клеток растений и биотехнология. Кишинев: Штиинца, 1983. С. 136-137.
33. Рыбалко А.Е. Организация производства безвирусного исходного материала для промышленного цветоводства в совхозе "Южные культуры" //Промышленное выращивание цветочных культур на юге СССР. Сочи: НИИ горного садоводства, 1984а. С. 32-34.
34. Рыбалко А.Е. Оздоровление растений от вирусных заболеваний (на примере цветочных растений)//Сельскохозяйственная биология. 19846. N4. С. 80-81.
35. Рыбалко А.Е. Оздоровление цветочных растений//3ащита растений. 1984в. N4, С.23.
36. Рыбалко А.Е. Экспериментальное обоснование и принципы внедрения в производство технологии оздоровления растений от вирусов// VIII Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений. Тезисы докладов. Вильнюс: ВАСХНИЛ, 1984г. С. 96-97.
37. Рыбалко А.Е. Вирусы цветочных культур и меры борьбы с ними. Обзорная информация. - М.: ЦБНТИ Минжнлкомхоза РСФСР, 1984д. - 42 с.
38. Rybalko A. On the improvement of large scale of meristem culture release from virus and clonal multiplication of plants//International symposium "Plant tissue and cell culture -application to crop improvement". Abstracts (Olomouc, Czechoslovakia, 24-29 September, 1984). Olomouc. 1984. (Appendix).
39. Rybalko A. On the improvement of large scale of meristem culture release from virus and clonal multiplication of plants//International symposium "Plant tissue and cell culture -application to crop improvement". Procedings. (Olomouc, Czechoslovakia, 24-29 September, 1984). Olomouc. 1984. P. 549550.
40. Кишко Я.Г., Рыбалко A.E., Харута Л.Г., Рубан В.И. Изучение стругауры вирусных популяций, как элемент общей программы оздоровления цветочных культур//VIII Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений. Тезисы докладов. - Вильнюс: ВАСХНИЛ, 1984.С. 158-160.
41. Рыбалю А.Е., Кишко Я.Г. Карлавирусы растений: распространение и меры 6opb6bi//VI съезд Украинского микробиологического общества. -Донецк: Нукова думка, 1984. С. 195.
42. Харута Л.Г., Рыбалко А.Е., Рындина Н.А. Массовая диагностика вирусных болезней в меристемных маточниках цветочных культур// Промышленное выращивание цветочных культур на Юге СССР. Науч. тр. НИИ горного садоводства и цветоводства. Сочи. 1984. С. 34-41.
43. Рыбалко А.Е. Профилактика вирусных болезней цветочных культур //Защита растений. 1985. N2. С. 22-23.
44. Рыбалко А.Е. Система оздоровления интродуцированных цветочных растений от фитопатогенных вирусов//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов. Тез. докл. региональн. совещ. Кишинев: Штиинца, 1986а. С. 125-126.
45. Воробьев Г.В., Харута Л.Г., Рыбалко А.Е. Унификация технологии получения безвирусного исходного материала для интродуцированных цветочных фитоценозов//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов. Тез. докл. регион, совещ. Кишинев, 25-26 июня 1986 г. Кишинев. Минжилкомхоз МССР, 1986. С. 125-126.
46. Рыбалко А.Е., Селиванова В.В., Коев Г.В. Опыт оздоровления хризантем от комплекса вирусов методом культуры тка1ш//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов. Тез. докл. регион, совещ. Кишинев 25-26 июня 1986 г. Кишинев: Минжилкомхоз МССР. 1986. С. 107-108.
47. Рыбалко А.Е. Ресурсосберегающая биотехнология оздоровления цветочных растений от вирусов/ЛГезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (13-15 октября 1986 г., Пущино) АН СССР. Научный центр биологических исследований. Пушлно. 19866. С. 198199.
48. Харута Л.Г., Рындина H.A. Рыбалко А.Е. Организация производства сывороток для массовой диагностики вирусов в оздоровленных цветочных фитоценозах//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов. Тез. докл. регион, совещ. Кишинев, 25-26 июня 1986 г. Кишинев, Минжилкомхоз МССР, 1986. С. 116 -117.
49. Рыбалко А.Е. Оздоровление и клональное микроразмножение цветочно-декоративных растений. Обзорная информация, М.: ЦБНТИ Минжилкомхоза РСФСР, 1987. -47 с.
50. Рыбалко А.Е. Организация массового производства иммунодиагностикумов для вирусологического контроля в цветочных фитоценозах/УБиология культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл. междунар. конфер. т.2. Новосибирск. 1988а. С. 308.
51. Рыбалко А.Е. Массовое производство безвирусных мернклонов цветочных культур//Биолоп[я культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл. междунар. конф. т.2. Новосибирск. 19886. С. 378.
52. Рыбалко А.Е. Клеточная инженерия - принципиально новый элемент технологии производства растительной продукции//Акгуальные проблемы повышения эффективности АПК, Тезисы докладов научной конференции Краснодарского филиала ВНИИС, Краснодар, 1988в, С. 50-51.
53. Рыбалко А.Е., Кишко Я.Г., Рубан В.И., Харута Л.Г., Ковтун Ю.П., Романов H.H., Толмачев А.И. Авторское свидетельство 448449, от 1.09.1988г. на изобретение "Способ получения антисыворотки к вирусам цветочных растений".
54. Коломиец Т.М., Харута Л.Г., Рыбалко А.Е. Биометрическая характеристика новых сортов ремонтантной гвоздики в культуре in vitroll
Biometricko-geneticke metody ve clechteni rostlin. Sbornik referatu IV. mezinarodniho vedeskeho symposia (Lednice 30.8-1.9 -1988). Brno, Lednice. 1988. P. 411-416.
55. Рудоминская С.И., Матюкова И.С., Рыбалко A.E. О нормативно-техническом обеспечении биотехнологий в растениеводстве/ЛТрограмма "Качество". Проблемы и опыт. Тезисы докладов Всесоюзного совещания. Москва, Госстандарт СССР, 1988. С. 116-117.
56. Рыбалко А.Е., Рудоминская С.И. Стандартизация растительной продукции, разработанной на основе клеточной биотехнологии/УАюуальные проблемы повышения эффективности АПК. Тезисы докладов научной конференции Краснодарского филиала ВНЙИС, Краснодар, 1988. С. 64-65.
57. Харута Л.Г., Рыбалко А.Е. Микроразмножение промышленных сортов роз//Биология культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл. междунар. конф. т.2. Новосибирск, 1988. С. 306.
58. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Киппсо Я.Г., Рубан В.И., Петухова Н.П. Авторское свидетельство N1596530 от 1.06.1990 г. "Способ получения сыворотки для диагностики вируса кралчатости гвоздики".
59. Рыбалко А.Е. Способ получения оздоровленного посадочного материала in vitro. Авторское свидетельство СССР N1608845 от 22.07.1990г.
60. Рыбалко А.Е, Способ размножения орхидей в культуре ткани. Авторское свидетельство СССР N1693736 от 1990 г.
61. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Оздоровление и микроразмножение орхидей//Экспресс информация, 1990, вып. 4(8), С. 10.
62. Рыбалко А.Е. Методическое обеспечение получения исходного материала для селекции на устойчивость гвоздики ремонтантной//Флора нижнего Дона и северного Кавказа: структура, динамика, охрана, проблемы использования. Тез. докл. науч.прак. конф. Ростов-на-Дону: Ростовский университет, 1991а. С. 124.
63. Рыбалко А.Е. Экономическая характеристика производства безвирусных мериклонов цветочных кул ьгу р//Б и о л о г ия культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 19916. С. 227-232.
64. Rybalko А.Е. Micropropagation of virus-free ornamentals in the USSR //Biotechnology in agriculture and forestry, Vol. 20 "High-Tech and Micropropagation IV", Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg, New-York, London, Paris, Tokyo, Hon Kong, Barcelona, Budapest, 1992 P. 427-447.
65. Kharuta L.G., Rybalko A.E. Promising selection of ornamental plants by in vitro techniques/ZBreeding, propagation, disease control of glasshouse flowers and other ornamental plants. Theses of the international symposium, Salaspils, Latvia, 3-5 -September, 1991. Salaspils, 1992, P. 24.
66. Рыбалко A.E., Караманян М.И., Харута Л.Г., Дворянинова И.Н. Размножение орнаментальных растений/Юбзорная информация. Институт экономики Академии коммунального хозяйства Госкомжилкомхоза России. 1992.
67. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Малюга Т.А., Малиновская Л.П., Скрыпаль И.Г., Раковская В.И., Сакалиева Д. Получение реагентов для выявления микоплазм в культурных фитоценозах//Материалы научной конференции, посвященной 100-летию открытия вирусов Д.И. Ивановским 2-6 сентября 1992 г. Ростов-на-Дону. 1992. С. 105-107
68. Рыбалко А.Е. Разработка систем массовой диагностики вирусов в оздоровленных цветочных фигоценозах/УМатерналы научной конференции, посвященной 100-летию со дня открытия вирусов Д.И. Ивановским 2-6 сентября 1992 г. Ростов-на-Дону. 1992. С. 104-105.
69. Рыбалко А.Е. Опыт разработки комплекса приемов по оздоровлению растений от вирусов и внедрения его в народное хозяйство. //В кн. Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тезисы докладов к Всероссийскому съезду по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995 г.) С. 81-82.
70. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Регенерация растений Ficus carica L. из стеблевых верхушек. //В кн. "Биология клеток культивируемых растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда." Материалы международной конференции, Москва, 25-28 ноября 1997а . С. 461.
71. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Исследования по оздоровлению и микроразмножению культиваров дендратемы с различным содержанием эфирных масел. //В кн. "Биология клеток культивируемых растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда." Материалы международной конференции, Москва, 25-28 ноября 19976. С. 504.
72. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Разработка метода микроразмножения Stevia rebavdiana для получения генетически однородного посадочного материала. //В кн. "Биология клеток культивируемых растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда." Материалы международной конференции, Москва, 25-28 ноября 1997в г. С. 459.
Отечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и ЮАОечннникова РАН Печать офсяиая. Уишл 1,5. Тираж120 зю. Заказ №118
-
Рыбалко, Анатолий Евдокимович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1998
-
ВАК 06.01.11
- БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ВЕГЕТАТИВНО РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ, КАРТОФЕЛЯ, РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ОЗДОРОВЛЕНИЯ
- Особенности технологии получения оздоровленного от патогенов семенного материала картофеля в условиях предгорной зоны Северного Кавказа
- Биологическое обоснование защиты от заражения вирусами оздоровленного семенного картофеля в Республике Татарстан
- Адаптивные особенности доминантных паразитарных комплексов на представителях порядка Liliales L.
- Научно-технологические основы оздоровления сортов картофеля от вирусов в условиях Приамурья
