Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ВЕГЕТАТИВНО РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ, КАРТОФЕЛЯ, РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ОЗДОРОВЛЕНИЯ
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений
Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ВЕГЕТАТИВНО РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ, КАРТОФЕЛЯ, РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ОЗДОРОВЛЕНИЯ"
А-ЗШ8
На правах рукописи
РЫБАЛКО Анатолий Евдокимович
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ВЕГЕТАТИВНО
РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ, КАРТОФЕЛЯ, РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ОЗДОРОВЛЕНИЯ
Специальность - 06.01.11 - защита растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
МОСКВА 1998
Рабша выпотн^на в Фитиапе инститхтабиоорганическои химии им М М Шемякина и Ю \ Овчинникова Р<\Н и на\чно-исстидовательском центре ' Меристсмные кл 1ыл ры' Госстроя России
Официальные оппоненты доктор сельскохозяйственных на\к, профессор Помазков Ю И доктор биотогических на\к, чтен-коррсспондент РАН академик РА.СХН Р Г Бчтенко доктор биотогических на\к академик РАСХН В С Шевепла
Ведмдее учреждение Главный ботанический сад РАН
Защита состоится _Н98 г в часов
на заседании диссертационно! о совета Д 120 35 О1) в Московской сетьскохо $яйственнои академии им К А. Тимирязева по адрес\ 127550 Москва И-550 Тимирязевская 49 Ученый совет ТСХА
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской ее гьеко-козяйственнои академии имени К А. Тимирязева (ТСХА)
Автореферат разослан // " 'г | ццц г
\ ■ ш ш секретарь
Д.-е^ертационного совета ""^р < ют тич' нал к
В А Шкаликов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Потери урожая в мире, вызываемые разнообразными болезнями, составляют около 50 млрд. долларов в год (James, 1981). Среди них одно из ведущих мест занимают вирусные заболевания, которые отличаются широким распространением и исключительной вредоносностью (Атабеков, 1986).
Особенностью вирусных болезней растений, определяющей сложность борьбы с ними, является гетерогенность вирусных популяций, представленных различными вирусами и их штаммами с разнообразными биологическими свойствами, что требует применения комплексных мер борьбы.
В системе борьбы с вирусными болезнями растений важное место занимает получение и применение здорового исходного материала. С целью наиболее эффективного использования разработок по борьбе с вирусными болезнями картофеля система семеноводства этой культуры в нашей стране в конце шестидесятых годов претерпела существенную организационную перестройку В этом плане проведена концентрация товарного семеноводства в благоприятных по фитосанитарным условиям регионах. Основной их задачей было определено получение высококачественного семенного материала картофеля на основе серологических клоновых отборов (Оншценнэ с соавт., 1974). Однако в дальнейших исследованиях было установлено, что большинство сортов практически полностью заражены вирусами. Это потребовало применения активных методов получения исходных безвирусных растений. Показана полная зараженность вирусами и других вегетативно размножающихся растений, в частности плодово-ягодных (Вердеревская, 1971; Помазков, 1989), гвоздики ремонтантной (Петерсон и соавт., 1974; Oertel, 1974). В начале 70-х годов в нашей стране начаты работы по широкому применению для оздоровления растений активных методов лечения хронически зараженных сортов - культуры меристемы и термотерапии.
Отсутствие унификации и стандартизации технологических приемов и разработок по массовому применению оздоровленного материала в производстве даже для одной культуры стало причиной того, что метод культуры меристемы оставался достоянием отдельных лабораторий. Не были разработаны также принципы получения больших партий здорового материала, как исходного для получения элиты на безвирусной основе.
Решение проблемы получения безвирусного посадочного материала возможно при создании эффективной, унифицированной технологии оздоровления, отражающей системный подход в защите растений от вирусных эпифитотий.
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось идентификация и изу ¡ение биологических свойств вирусов на различных вегетативно размножг .ощихся растениях, разработка, экспериментальное и теоретическое обоснованно системы приемов
безвирусного посадоч югр
НАУЧНАЯ БИЁЛИОТЕ Моск. сг-1>ь>.охз>з академм им. Н. А, Тщлир
Йни. NQÍ
получения исходного шедрения ее в народное
\о >'Ч1Ство организация производства иммунодиагностикумов
Исследования велись в след\ ющи\ направленилх
1 Р1*раоотка э^перимента 1ьное и теоретическое обоснование \ ш'фишфованнои технологии массового о здоровлсния растений от вир\сов на основе дв\ чфазного мешда регенерации растении из апикальных чсрлльм, изыскание приемок получения бе звир\сных растении из заведомо ир ькенных вир\сом стсб левых верхушек
2 Изучение и эксперимента 1ьное обоснование системы приемов некоренного размножения оздоровленного материала обеспечивающей зашилл от реинфекции
1 Усовершенствование массовой диагностики некоторых вирусов для пр1!менения в прои зводственныч четовиях
4 Испытание унифицированной технолопш о здоровления на цветочных к\ 1ы\рах разработка общих принципов семеноводства этих к\лкпр на бе 'вирусной основе внедрение в прои зводство оздоровленного посадочного магериала,
5 Изучение видового состава возбузителеи вирленых заболеваний на широко распространенных сортах картофеля цветочных декоративно-шетвенных к\ плтрах анализ стрчкгуры В1ф\сны\ поттяции изучение свойств возб\дителеи,
6 Разработка и новых способов пол\чения высокоактивных антисывороток пригодных для проведения имм\ноферментного анализа
7 Разработка концепции стандартизации биотехнологии в области клеточной инженерии и прои зводства дн шюстических препаратов
8 Проведение изыскании по созданию специализированного онотехното[ ического предприятия для массового прои зводства бе звирченого посадочного материала иифокого спектра растений и высокоактивных сывороток
Научная повита реп и,>папюп исс-тдовании
На основе изучения вир\сных попмяшш на различных к\льтурах и выявления общих принципов их стр\кт\ры делается вывод о целесообразности унификации основных технологических приемов массового о з мровления Остановлена 100% > фаженность промышленныхнасаждений В1ф\с 1ми в скрытой форме н I картофеле это вирчеы X М Б У, скручивания шетьев встречающиеся в ^мешанной инспекции, на гвоздике это В1ф\сы \ р 1ПЧЛТОСТИ л 1тснтный прижилковоикрапчатости на хризантеме - В-вир\с и 1ииермн1 гочагов хргаанлхчныиштамм вир\с Iогуречной мозаики Общим для этих к\1ьт\р гвллется наличие вирусов входящих в одн\ такч.ономичс~к\к> гр\ппл Это карлавир\сы (М и Ь-карлофеля мгентнын гво'шки В-вир\<_ хризантемы) иотивир\сы (\'-каргофеля и прилшлковои кр шчатости гво здики) тоба\говирл«,ы (ВТМ на хри зантсме ро зах, фатсии и юльцевои пятнистости одонтогло^чма на растениях различных видов орхидеи) потексвир\сы (\-BHpvv, картофеля вир\ч_ момики нимииднуча) На из\чаемых к\ хьтчрач выявлены и чикопызмы их поражает вир\с
огуречной мозаики, вирус мозаики резухи, на картофеле и хризантеме выявлен вирус табачной мозаики в естественных условиях, а на картофеле и гвоздике - вирус мозаики люцерны. Метьюз (1973) относит эти культуры в одну групп}' по характеру вредоносности вирусов.
Разработаны и внедрены в массовое производство эффективные модификации серологического метода диагностики вирусов на основе радиальной иммунодиффузии и концентрирования антигена в нативном соке, а также повышения чувствительности метода электронной микроскопии путем увеличения адсорбции вирионов при помощи энергии СВЧ (заявка на патент № 04954358/13.) Организовано массовое производство высокоактивных антисывороток к вирусам, поражающих важнейшие цветочные культуры, и полифагам, имеющим значение при работе с различными растениями (цветочными, овощными, плодово-ягодными, техническим, лекарственными, эфиромасличными). Разработан способ повышения титра на основе полученного нового иммуномодулятора -камизола. Технологический процесс обеспечен нормативно-технической документацией.
Разработан, экспериментально и теоретически обоснован двухфазный метод регенерации растений из истинных меристем (0,1 мм). Путем кондиционирования условий питания изолированных меристем на разных этапах морфогенеза удалось сократить сроки получения безвирусных растений, по признакам идентичным данному сорту. Этот метод апробирован на картофеле, гвоздике ремонтантной, хризантеме, гербере, орхидеях, землянике и других культурах.
Выявлен феномен антивирусного кондиционирования питательных сред при помощи тканей-нянек, полученных от растений-продуцентов антивирусным веществ.
Разработан способ микроразмножения растений в культуре in vitro, обеспечивающий унификацию комплекса технологических приемов для различных культур.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. В системе Минжилкомхоза РСФСР с 1980 г. по инициативе и при непосредственном участии диссертанта организовано крупномасштабное производство сертифицированного посадочного материала цветочных культур. Приказом министра жилищно-коммунального хозяйства РСФСР №205 от 15.04.1985 г. преобразовано в Производственное предприятие меристемных культур. В первый год работы предприятия получено продукции на сумму 550 тыс. руб., балансовая прибыль составила 265 тыс. руб., уровень рентабельности - 109%. В ассортименте -высокоактивные иммунодиагностикумы для выявления различных вирусов и микоплазм, оздоровленный посадочный материал цветочных овощных, картофеля, земляники, киви, винограда, мандарин. В 1996 г. предприятие преобразовано в Научно-исследовательский центр "Меристемные культуры".
Эффективность применяемого метода оздоровления растений обеспечила возможность включения в процесс массового производства
о иоровленного посадочного материала клонального микроразмножения в стернльнои кл льтлре, обеспечивающего абсолютнлю !аЩ1т от всех видов репнфекции л величение на несколько порядков коэффициента размножения и экономию плошади
На основании материалов диссертации разработаны и утверждены Минжичкомхозом УССР "Методические рекомендации по борьбе с вирлеными болешями в маточных питомниках ремонтантной гвоздики" (1978г)
За период работы Прои родственного предприятия меристемных кл тыур произведено и реализовано многочисленным предприятиям СССР около б т нативных антисывароток к различным вирусам, иор.ькаюишм цветочные и др\гие клльтуры Получены высокоактивные сыворотки к микоплазмам гвоздики цинерарии гибридной гортензии столоура пасленовых, различным \о ;чиствам реализовано более 7 5 млн оздоровленных черенков гвоздики ремонтантной 1,6 млн - хризантемы широкий ассортимент орнаментальных клльтлр Вновь со ¡данномл в 1990 г Краснодарское НИИ картофелеводства и овощеводства переданы технологические разработки и исходный материал 4 сортов картофехч
В течение 1980-1997 гт матери,ты диссертации испо ль ¡ллотся в на\ чнепроизводственно и деятельности Налчно-исследовательского центра "Мернстемные кл тьтл-ры"
В 1988-1995 гг материалы диссертации использованы для чтения лекции по биотехнологии на кафедре физиотогии растении Донецкого государственного \ нивероитета
4прпбацин работы Ре ¡\ тьгаты исследований доложены на ¡аседании Ученого совета Украинского на\чно-исследовательского инститлта сельсно-хозяист венной микробиотопш нал чно-технических советахМютжилкомхоза УССР в 1977 г и М и нж и л ко м \о з л РСФСР - в 1981 г заседании Президилма ВА.СХНИЛ по вопросл ' Налчно-органи ¡ационные ¡адачи поллчения бе !вир\ сного посадочного материала сьльскохо {лиственных кл тьтл р" 22 08 1984 г (протокол N 28)
Материалы диссертации быти представлены на следующих съездах, конференциях, симпози\гмах 1 IV Всесою том совещании по вирленым болешям растений - г Киев 1971 г 2 VI конференции молодых ученых микробиологов Украины - г Киев 1972 г > III Всесою зном совещании по применению препарата ТУР в растениеводстве - г Москва, 1973 г 4 Бессоюзном семинаре-совещании по вирленьш болезням овощных к\тьт\р - г Ереван 1974 г 5 VI Всесоюзном совещании по иммлнитетл сельскохозяйственных растений - г Одесса 1975 г 6 Всесоюзном совещании по семеноводствл картофеля - г Чернигов, 1975 г 7 Всесоюзном семинаресовещании "Современные методы поллчения безвир\ сного картофеля" - г Москва 197* г 8 Республиканской школе-семинаре по применению клльтуры тканей органов клеток в генетике и селекции - г Киев Институт молекллярнои биологии и генетики АН УССР 1977 г 9 Юбилейной конференции Черниговского филиала Украинского
микробиологического общества - г. Чернигов, 1977. 10. Всесоюзной научно-практической конференции "Выращивание цветочных культур меристемным способом" - г. Рига, 1977 г. 11. VII Всесоюзном совещании по вирусным болезням сельско-хозяйственных растений -г. Ленинград, 1978 г. 12. На координационных совещаниях по проблеме "Усовершенствование системы семеноводства и разработка эффективных приемов и методов выращивания высококачественного семенного картофеля на безвирусной основе" - в 1975, 1976, 1977, 1978 гг. в Украинском научно-исследовательском институте картофельного хозяйства, пос. Немешаево, Киевской обл., 13. II Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых микробиологов. Ташкент, 1978 г. 14. VI конференции молодых ученых-ботаников Украины, г. Киев, февраль 1979 г. 15. Республиканской школе передового опьгга по теме: "Передовые приемы выращивания цветочных культур в РСФСР" - г. Ростов на Дону, 1981 г. 16. Школе передового опьгга по выращиванию цветочных культур меристемным способом - г. Рига, 1983 г., 17. ^Всесоюзном совещании "Культура клеток растений и биотехнология" - г. Кишинев, 1983 г., 18. VIII Всесоюзном совещании по вирусным болезням сельскохозяйственных растений - г. Вильнюс, 1984 г., 19. VI съезде Украинского микробиологического общества - г. Донецк, 1984 г., 20. Международном симпозиуме "Культура тканей и клеток растений -применение в улучшении урожая" - г. Оломоуц, ЧССР, 1984 г., 21. VIII региональном совещании "Биоценотические связи в насаждениях искусственных фитоценозов", г. Кишинев, 1986 г., 22. Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений", - г. Ташкент, 1986 г., 23. Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", г. Пущино на Оке, 1986 г., 24. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" - г. Новосибирск, 1988 г., 25. Международной конференции "Биометрические и генетические методы в селекции растений", г. Леднице, ЧССР, 1988 г., 26. Конференции по методам диагностики микоплазм, г. Махарадзе, 1988 г., 27. На международных выставках в 1989 г. в Чехословакии (Флора-Оломоуц), ГДР (Internationale Gartenbau Ausstellung) и Москве (Ингербытмаш-89), в 1990 г. в Швеции (Советская Россия), неоднократно на ВДНХ СССР, 28. Научной конференции, посвященной 100-летию открытия вирусов Д.И. Ивановским (2-6 сентября 1992 г., г. Ростов-на-Дону), 29. Международном симпозиуме Breeding, propagation, disease control of glasshouse flowers and other ornamental plants, Salaspils, Latvia, 3-5 - September, 1991. Salaspils, 1992, 30. Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995 г.), 31. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" - г. Москва, 25-28 ноября 1997 г.
Публикации. Материалы диссертации обобщены в 72 опубликованных научных работах, в т.ч. в монографии "Biotechnology in agricultural and for-estiy", Vol. 20 "High-Tech and Micropropagation IV", Springer-Verlag, 1992 P. 427-447 ( главе 26 "Micropropagation of virus-free ornamental inthe USSR"); изданы 3 обзорные информации, получено четыре авторские свидетельства.
поданы три иявки на выдач\ патента Российской Федерации разработаны н мрегистрированы в органах Госстандарта 7 нормативно-технических документов (технические условия методики) со*дан научно-популярный ||)1пьм ' Болезнь века"
Стт ктура и объем работы. Диссертационная работа состоит ш введения, анатиза игтературных источников по теме диссертации 6 пав собственных исследований обсуждения ре лтьтатов выводов и рекомендаций проишодству Библиографический \казатель содержит "5X1 наименование, и! них 18" на р\сском языке Работа изложена на 2о5 страницах машинописного текста, содержит о 2 таблицы и 46 рисунков
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В первой илаве ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ РАСТЕНИЙ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА (обзор титсратхры) приведен анати $ состояния и i\ченности распространения вирусных иболевании на картофеле и важнейших цветочных к\ тьтурах методах диагностики навным обр^гзом пригодных для проведения массовых анализов в условиях производства и ранней диагностики для обеспечения достоверности системы оздоровления в условиях комплексных инфекции и унификации дтя широкого спектра растении Особое внимание уделено методам оздоровления от хронической вир\сной инфекции Дается анализ работ по применению методов ку ibivpbt in \itra а также критика технологий с применение термотерапии Намечены пути устранения недостатков в построении у инфицированной технологии о иоровления широкого спектра растений
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В качестве материалов настоящих исстедований испотьювати методы о иоровления растений от вир\сов и приемы ускоренного размножения пораженные вирусами и ое¡вирусные растения вирусные препараты антивирусные сыворотки методы выявления вирусов и получение антивиру сных сывороток организащтонные формы производства безвиру сного исходного посадочного материала
Способы озОорови.нич и \шкроразлтож.енич т \itro из\чати на растениях районированных сортах картофеля (около 20 сортов) цветочных растениях (около 30 сортов гво $дики ремонтантной, около 30 - хризантемы 12 - гсрберы 12 - орхидей более 40 видов орнаментальных kv льтур) В работе были использованы растения лилии гладиолуса фикусов, филодендронов, кордитнны земляники, винограда киви, мандарина ананаса стевии, инжира
Растения озаоропенные При разработке системы мероприятий, обеспечивающей получение больших партии здорового материала применяли полученные нами безвирусные растения различных сортов картофеля, гвоздики ремонтантной хризантемы орхидей герберы В работе также
применяли растения лилии, гладиолуса, фикусов, филодендронов, кордилины, земляники, винограда, киви, мандарина, ананаса, стевии, инжира.
Были испытаны технологии оздоровления, основанные на сочетании культуры стеблевых верхушек с термо- и химиотерапией и культуры истинных меристем.
Вирусные препараты, используемые в качестве объектов исследований, получали из инфицированных растений. Вирус крапчатости гвоздики (ВКГ) выделяли из различных сортов гвоздики ремонтантной (Вильям, Уайт, Скания, Шокинг и др.) с симптомами слабой крапчато сти или без симптомов. В качестве сывороточного препарата использовали штамм В КГ, выделенный из меристемных растений гвоздики, выбракованных по электронной микроскопии непосредственно в стерильной культуре. Идентификацию вируса осуществляли по морфологии частиц (были выявлены икосаэдрические частицы размером около 30 нм), серологическому анализу против сывороток производства кафедры вирусологии МГУ им. М. В. Ломоносова, проблемной лаборатории вирусных болезней растений и насекомых, Латвийской сельскохозяйственной академии, предприятия "Юнгпфлянце" (ГДР), института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды), а также при помощи электронной имуноморфологии. Для работы были отобраны изоляты, соответствующие одному типу частиц по этим методам, а также по симптомам на листьях Chenopodium quinoa Willd., которые соответствовали вирусу крапчато сти гвоздики. Указанные препараты были проанализированы на отсутствие вирусов кольцевой пятнистости, латентного, прижилковой крапчато сти гвоздики сыворотками производства указанных учреждений, а также сывороткой на вирус кольцевой гравировки гвоздики производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды). В-вирус хризантемы (ВВХ) выделен из растений хризантемы сорта Монако в совхозе " Деснянский" (г. Чернигова). Вирус мозаики цимбидиума (ВМЦ) выделяли из массы бессимптомных растений орхидеи фаленопсис, и идентифицирован при помощи сывороток к вирусам кольцевой пятнистости одонтоглоссума (ВКПО) и ВМЦ производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды), что дало возможность установить м оно инфекцию ВМЦ. Вирус желтой мозаики фасоли (ВЖМФ) выделяли из растений донника, произраставшего изолированно вблизи от лесного массива вдали от других посадок бобовых с симптомами сильной желтой пятнистости. Патоген идентифицирован при помощи сыворотки к вирусу желтой мозаики фасоли, производства предприятия "Юнгпфлянце" (ГДР). Другой штамм ВЖМФ выделяли из растений фрезии, произраставшей в Дагомысском чайном совхозе. Неидентифицированные вирусы: были выделены из растений пуансеттии, антуриума, герберы, лавра благородного. Вирус огуречной мозаики (ВОМ) выделен из хризантемы сорта Москвичка в совхозе "Деснянский" г. Чернигова и идентифицирован сывороткой к ВОМхр производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды). Моноинфекция была установлена по отсутствию реакции преципитации против ВВХ нашего производства и электронной микроскопии (выявлены
однородные икосаэдрические частицы размера 30 нм) Сферический вир\с ро5ы был вылечен и 5 ро«л сорта Куии Элизабет мвеюнной ш Болгарии Сферический вирус литии выделен из растений тнтии Н|ггевидныи вир\с иванды быт выдетен и$ лаванды, поточенной из Всесокнного НИИ лфиромасличных кллил-р (г Симферополь) Латентный вирус гвоздики получен от академика ВАСХНИЛ И Г Атабекова Чистые к\ льлуры микоплазм гвощики, цинерарии гибридной, гортензии поточены от кандидата биологических наук Л П Малиновскои
Для идентификации вир\сов поражающих и ¡у чаемые кл тьтлры в настоящей работе были испоть юваны диагностические антисыворотки производства различных на\чных учреждений (проблемная лаборатория вир\ сных болезней растений и насекомых Латвийской се тьскохо шлственнои 1кадемии, предприятие Юнгпфлянце (ГДР), Инстшлт (фитопатологии в Вагенингене (Нидерланды), кафедра вирусологии Московского государственного университета им МВ Ломоносова полеченная в Украинском НИИ с ч микробиологии (г Чернигов) и в Производственном предприятии меристемных к\ льтор г Сочи (к 20 вирусам и 4 микоплазмам) Структуру и функцию вирусны\- пот тяшгй определяли в различных фитоценозах изучаемых к\ тьт\р
Чистые препараты кирхсон выделяли из естественно инфицированных растений и при иск\ сственном заражешм соответствующих иггаммовых растений Накопление вирусов в растениях контролировали сероюгически и электронно-микропически Дтя выделения вирусов растительною массу промывали проточной водой и замораживали в испарителе бытового холодильника а затем измельчали на холоде в 1 /15 VI фосфатном буфере рН 7,17 Вир\ссодержащии сок фильтровали через капроновое сито, эм\льгировали с перегнанным хлороформом (1/5-1/6 объема), а итем центрифугировали при 5 тыс об /мин в центрифугах J2 -21 и L7-5* (BECKMAN) на холоде Из частично очищенного сока выделяли чистые препараты вирусов гельфильтрациен на сэфарозе 4В и дифференциальным \ льтрацентриф\гированием Для изучения фишческих характеристик вирусов использовали седиментационныи анали$ (аналотическая тльтрадангрифу гаМОМ 3170 В, снабженная иингреноптикой) Образцы исследовали в 12 мм ячейке при скорости вращения ротора (W) 26000 об/мин угле наклона (а) 45° и температуре (t) 20°С Коэффициенты седиментации определяли при концентрации вируса О 28% О 21% О 14% и о 0*6% растворенного в О 0~М фосфатном буфере Препараты вирусов исследовали в электронных микроскопах ЭМВ-100Л, JEM-7a TESLA BS-МЮ при инструментальном \ветичении 30-70 тыс раз и ускоряющем напряжении 75-90 киловольт Контрастирование препаратов проводили фосфорновольфрамовой кислотой и уранилацетатом в концентрации 1-2% Hmmv ноэлектроншло микроскопию проводили методом декорирования и гру ппирования вирусных частиц
В полевых условиях при выращивании как первого так и второго урожаев картофеля применяли профилактические приемы предупреждения
заноса и распространения вирусов (внесения системных инсектицидов, индивидуальная санитария, в полевых условиях пространственная изоляция, применение гербицидов, исключение междурядных обработок, ранняя уборка). Регулярно проводили вирусологическую оценку выращиваемых растений. В теплице проверяли каждое растение, а в полевых условиях в первую очередь анализировали среднюю пробу клона, а во вторую - каждое растение.
При разработке технологии оздоровления использовали рекомендации академика И.Г. Атабекова, а также многочисленных работ по использованию в этом аспекте культуры in vitro и результаты собственных исследований.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В третьей главе "ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ И ИХ РАСПРОСТРАНЕНИЯ В КУЛЬТУРНЫХ ФИТОЦЕНОЗАХ" приведены результаты изучения пораженности вирусами ремонтантной гвоздики, хризантемы, орхидей, герберы, фрезии, лилии, нарцисса. В насаждениях гвоздики в большинстве случаев обнаружена крапчатая мозаика. При исследовании сока больных растений в электронном микроскопе выявлены сферические вирусные частицы размером около 30 нм. На листьях Chenopodium quinoa Willd. через 8 дней после инокуляции сока исследуемых растений появились светлые пятна. Вирус идентифицирован в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле против сыворотки к вирусу крапчатости, полученной от различных учреждений.
В процессе работ по оздоровлению сортов гвоздики от вирусов были выявлены растения, пораженные В КГ. Моноинфекция В КГ в этих растениях нами доказана электронно-микроскопическим методом - выявлены однородные сферические частицы диаметром 30 нм и серологически против сывороток к виру сам кольцевой пятнистости, прижилковой крапчатости, латентному, кольцевой гравировки гвоздики и ВОМ. Полученный штамм, обозначенный нами как "Сочи КР" (депонирован в коллекции ВИЗР), пригоден для получения чистых препаратов В КГ как д ля изучения его биологических свойств, так и в дальнейшей работе по получению иммунодиагностических препаратов к этому патогену.
Выделение и очистку В КГ штамм "Сочи КР" выполняли по следующей схеме:
-Замораживание растительной массы гвоздики при -10°С на протяжении 24-48 час.
-Гомогенизация вируссодержащего материала в фосфатном буфере рН
7,4;
-Отжим инфекционного сока через хлопчатобумажную ткань;
-Прибавление к вир\ссодержащему материал} р-меркаптоэтанола и тритона Х-100 в концентрации О 1-0,3%, -Выдерживание в течение 1 5-2,0 часа,
-Прибавление в смесь бутилового спирта и ЭДТА до конечной концентрации 8 5% и О 001 М соответственно,
-Выстаивание в течение 18-20 часов и осветление взвеси центрифугированием при 6 тыс об/мин 30 мин
-Удаление осадка, центрифугирование супернатанта при 32 тыс об/мин в течение 100-110 мин,
-Удаление с\пернатанта, реслспендирование осадка в0 01-0,12 Мтрис-НС1 буфере, рН 7,5,
-Низкоскоростное центрифугирование при 5-7 тыс об/мин, -Удаление осадка, дополнительная очистка супернатанта (вир\сный препарат крапчатости гвоздики) в градиенте птотности хлористого цезия 1,2-1,4 в бакетроторе (Б\¥-28) при 20000 об / мин в центрифуге 1-7-55 "ВЕСКМАЫ" на протяжении 6 часов
После центрифугирования очищенную виру сную зон\ отбирали при помощи шприца Для освобождения от СяС1 материал подвергали диализу против 0,01 М трис-НС1 б\ фер рН 7,2-7 5 в течение 24 часов при 4-8°С Очищенный препарат ВКГ штамм "Сочи КР" спектрофотометрически имеет чистоту Е,ю/Е 80>1 7 При скоростной седиментации обнаружен один неразмываюиишся пик в течение 24 мин Элекгронно-микроскопически в поле зрения обнаружены морфологически и стру ктлрно однородные вирионы около 30 нм в диаметре При использовании электронной иммуноморфологии (метод дeкopIqx>вaння) были покрыты все имеющиеся в поле зрения частицы что доказывает наличие только частиц В КГ Таким образом аналитическими исследованиями подтверждена моноинфекция ВКГ в полученном нами и ¡от мте Это послужило основой применения его в процессе получения высокоактивных антисывороток, пригодных для сертификации оздоровленного посадочного материала
В растениях фаленопсиса электронно-микроскопически выявлена высокая концентрация вируса с нитевидной морфологией Поэтому признаку патоген можно было отнести к потексвир\сам При помощи сывороток к вирлсам мозаики цимбидиума и кольцевой пятнистости одонтоглоссума в препаратах идентифицирована моноинфекция вируса мозаики цимбидиума Изучение биологических свойств % качанного изолята позволило использовать его препараты для получения диагностической антисыворотки к вирусу мозаики цимбидиума
По нашим наблюдениям, сорта хртантемы в насаждениях цветоводческих хозяйств полностью заражены вирусами Так насаждения сорта Петер Уайт в совхозе "Деснянскии" (г Чернигов) оказались на 100% пораженными мозаикой Электронно-микроскопическими исследованиями в соке испытуемых растений выявлены нитевидные частицы которые по морфологии можно было отнести к карлав1фу сам Патоген идентифищфован
при помощи сыворотки к В-вирусу хризантемы, полученной от К. Ортеля (ГДР). Необходимо отметить, что в указанном препарате отсутствовали сферические частицы (ВАТ, ВОМ и др.).
Наши исследования были расширены для паспортизации вирусов на различных культурам. В частности были проведены исследования на орнаментальных культурах. По предварительным данным, орнаментальные культуры поражены вирусами, относящимися к различным таксономическим группам. Выявлены вирусы: табачной мозаики, желтой мозаики фасоли, огуречной мозаики. Нами начато выделение вирусов из различных орнаментальных растений и их идентификация. Это позволит наметить пути ограничения их отрицательного экономического эффекта в цветоводческих хозяйствах, главным образом при выращивании оздоровленного посадочного материала гвоздики, орхидей, хризантемы, фрезии и др., как резерваторов инфекции для оздоровленных культур.
В четвертой главе "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МАССОВОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ В ОЗДОРОВЛЕННЫХ ФИТОЦЕНОЗАХ" приведены результаты исследования по разработке оптимальной технологии получения антисывороток.
Разработка способа получения антисыворотки к ВКГ (Авторское свидетельство N1596530, приоритет от 16 февраля 1989 г.). Суть его в следующем. Высокоочищенный антиген ВКГ, штамм "Сочи КР", предварительно агглютинируют эритроцитами того же животного (кролика), которого иммунизируют препаратом указанного антигена. Для этого из ушной вены кролика берут 2,0-2,5 мл крови (консервант - 2,5% лимоннокислый натрий), отстаивают, сыворотку удаляют, а эритроциты в течение 5 мин. отмывают при 5000 об/мин. стерильным 0,85% NaCl. Затем к отмытым эритроцитам прибавляют антиген из расчета 5-10 мг белка на 1 кг массы "" кролика, смесь выдерживают при комнатной температуре 15 мин. Указанный антиген готовят перед каждой иммунизацией и вводят кроликам внутривенно с перерывом в 3 дня по предложенной схеме: 1,2 день - по 0,25-0,5 мг белка в 1 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; Здень-0,5-1,0 мг белка в 1 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 4,5,6 дни - перерыв; 7 день-0,5-1,0 мг белка в 1,5 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 8 день - 1,0-2,0 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 9 день - 1,25-2,5 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного.
На 20 день животным вводят внутривенно 1,25-2,5 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов. На 30 день производят отбор крови и определяют титр антисыворотки в реакции преципитации в агаровом геле (табл. 1).
13
Таб'иша 1 Эффективность базовой схемы иммунизации кроликов антигеном ВКГ (на 8 кроликах)
Поточено антисыворотки Получено антисьшоротки
по отборам, мл , после реимм\ ни зации мл
1 I _2_ 3 итого Т I_ 2 | итого
77 ^ 76 62 215 79 " 79 [ В среднем на 1 кролика 46 4±10,8 мл На основе проведенных исследований разработан аналитический паспорт на аитисыворотки (табл 2)
Таблица 2. Аналитический паспорт на <иггисыворотк\ к ВКГ
Итого 1 мл
Т71
1
^
4
5
6 / 8
9,
Характеристика
Прозрачный,
бесцветный
7,16
93,5%
Стерильный А пирогенен Стаоилен Безвреден Не токсичен 12,6°/« 1 2048
Показатели Физические свойства (прозрачность, цвет) Величина рН
Электрофорегическая чистота Стерильность Ппрогенность С габильность Безвредность Токсичность Содержание белка 10 I Титр специфических антител
Оказанные исследования использованы для разраоотки "Технических условий" (ТУ) на новую продукцию - 'Сыворотки диагностические к вир\сам цветочных к\ льтхр", которая яаляетсч основным нормативно-техническим документом при производстве антисывороток к вир\сам цветочных к\льтур
Разработка способа повышении титра антисыворотки (А.вторское свидетельство N1448449 приоритет от I сентября 1986 г) При работе с о здоровленным постдочным материалом как в процессе оздоровления так и при массовом размножении в первичных звеньях семеноводства важно повышение чувствительности системы диагностики В этом плане необходима разработка методов получение антисыворсгток высокого титра в процессе им\п шпации животных в частности с применением адьювантов среди которых на первом месте иьювант Фрейнда (Гнутова 1985) Рез\ льтаты его использования показали выход 9090 относительных единиц в среднем из 7 кроликов
Гай ища 3. Выход сыворотки по 7 кроликам при иммунизации антигеном ВКГ штамм "Сочи КР" с адьювантом Фрейнда (фирмы БЮМА-США)
, _ Выход антител в .
I 2 отоор
1 отбор
относительных единицах
| мл 1 титр мл титр 1 1 2 1 v
Всего . 85 1 3136 67 2816 36160 | 29192 Г 63632
Средняя 1 12,1 448 9 6 402 5165 7 1 4170 9090
С целью получения большего эффекта мы применили препарат из группы иммуномодуляторов - "бромид-2,3,5,6-тетрагидро-7-карбомоилметил-6-фенилими-дазо[2, 1-6]-тетразолия" - камизол (Б-58).
Таблица 4. Реакция животных на иммунизацию антигеном В КГ, штамм "Сочи КР" в сочетании с различными дозами камизола (средняя из 4-х кроликов)_
N Доза 1 отбор 2 отбор Выход антител в
относительных единицах
Б-58 мл титр мл титр 1 2 Б
1 100 16 1024 14 1024 16384 14080 30464
2 120 14,8 2048 13 2048 30208 26624 56830
3 150 13 1024 13 1024 13384,5 13568 26956
Как видно из приведенных материалов при помощи камизола нам удалось в 3 - 5 раз увеличить выход диагностикума в расчете на 1 кролика для В КГ.
Метод электронной микроскопии использовался в нашей работе как конечный тест отбора безвирусных линий, а также при паспортизации вирусов на многочисленных орнаментальных растениях находящихся в коллекции (Рыбалко, 1992).
Существующий способ повышения чувствительности этого метода -иммуноэлекгронную микроскопию мы использовали в двух вариантах: для повышения чувствительности метода при отборе безвирусных линий за счет повышения адгезии вирусных частиц на опорной пленке-подложке, обработанной специфическими антителами и для доказательства моноинфекции штамма ВКГ "Сочи КР" при разработке способа получения диагностической сыворотки (АС N1448449).
С целью выявления возможности неспецифического повышения чувствительности метода электронной микроскопии при выявлении вирусов нами разработан способ (заявка N4954353/13-051667), основанный на применении энергии электромагнитных волн сверхвысокочастотного диапазона (длина волны 12.6 см), обработка пленок-подложек этим излучением при мощности 20 ватт в течение 5 мин. достоверно увеличивала количество вирусных частиц в поле зрения электронного микроскопа.
Усовершенствование системы массовой диагностики вирусов в оздоровленных фитоценоза*.
На основании известных и вновь разработанных методов определена система массовой диагностики вирусов на последовательных этапах технологического процесса производства оздоровленного посадочного материала различных культур.
В процессе исследований по получению оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики нами определены следующие методы в системе диагностики: электронная микроскопия, иммуноферментный анализ, радиальная иммунодиффузия.
Как покапли наши исследования успех оиоровлення определяет испольшванис на первых этапах процесса производства товарного оиоровленного посадочного материала высокочувствительных методов диагностики виру сов Разработанная нами система диагностики включена в 'Типовую технологию получения исходного безвирусного посадочного материата ремонтантной гвоздики", утвержденную Научно-техническим Советом Гив5еленхои МЖКХ РСФСР в 1981 г (протокол \10) Указанная технология с 1981 г применяется в проишодстве товарного оздоровленного посадочного материала ушогочисленных сортов реуюнтантной гвоздики и дру гих цветочных ку льлхр
Получение реагентов для выявление микоплазмонодобиых организмов.
Мы ил-чаги возуюжности получения диагностических антисывороток к МПО стотбура пасленовых, израстания гвошпот а также выделенные из растений цинерарии гибридной и гортензии хранящиеся в чистой ку тьтуре Проведено по течение на и\ основе реагентов для имму ноферментного анаипа, а также и ¡учение вошожности увеличения специфичности антисывороток к этим патогенам путем иммунизации животных субклеточными структурами (У1еУ1бранами), выделенными из МПО поражающих различные растения (Рыбалко А Е с соавт, 19926)
На основе применения баюваи схелш иммунимции получены первые партии антисывороток к указанным патогенам и выделенным из них ушушранам Отработана методика получения иммуногтооутпнов и пероксида шых конъюгатов для постановки иммуноферугентного анализа на эти патогены
В лигой 1лавс "ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МАССОВОГО ОЗДОРОВЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ ОТ ВИРУСОВ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ МЕРИСТЕМЫ" изложены ре ¡у льтаты исследования по разработке унифицированной технологии массового получения растений-регенерантов из экептантатов конура нарастания малого разУ1ера (100 мкм) В этоу! плане осуществлено кондиционирование у с ловий питания изотированное ткани на разных этапах органогенеза с целью ускорения регенерации и увеличения выхода безвирусных растений, и с сохраняющими сортовые признаки исходных В связи с теУ1, что имеется ряд литературных источников, в которых сообщается о наличии вируса в меристеме методом флуоресцирующих антител были изучены степени попадаеушети вирусов в меристему Исполь ювалп растения
картофеля сорта Черниговчанка, пораженного МВК. В зонах 300, 200, 100 мкм вирусы выявлены в 100, 80, 20% случаев. Электронной микроскопией при исследовании стеблевых верхушек (размером 300 мкм) картофеля сорта Искра вирионы МВК выявлены в 100% случаев. В препаратах, приготовленных из верхушек сорта Гатчинский размером 100 мкм, только в 4 из 20 выявлены единичные вирусные частицы. Следовательно, значительная часть меристем размером 100 мкм свободна от вирусов.
Разработка технологии оздоровления растений (Авторское свидетельство № N1608845 приоритет от 22.07.1990 г.) Для массового получения безвирусных растений мы провели исследования по разработке двухфазного метода регенерации их из истинных меристем (100 мкм). Двухфазность процессов органогенеза в культуре ткани выявлена Бутенко (1962). Суть ее заключается в подборе условий питания на различных этапах органогенеза. При испытании питательных сред Мореля, Мурасиге-Скута и ВанГофа наилучшие результаты получены на последней (табл. 5). -
Изучение оздоровительного эффекта эксплантатов различного размера было проведено на растениях трех сортов картофеля (табл. 6). По данным электронной микроскопии оздоровительный эффект эксплантатов размера 100 мкм достигал 50,0-83,3% от числа регенерировавших. В тоже время выход свободных от вирусов растений из эксплантатов размера 250 мкм составил всего 4,7-28,5%. Данные таблицы свидетельствуют также и о сортовой разнице как в приживаемости эксплантатов, так и в выходе безвирусных растений по обоим размерам.
Таблица 5. Влияние состава питательной среды на регенерацию ростков го меристем различных сортов гвоздики ремонтантной */
Мурасиге-Скуга Ван-Гофа
Сорт образовало росток образовало росток
шт. % шт. %
Вильям 22 73,3 28 93,3
Уайт 19 63,3 26 86,7
Леди 23 76,7 22 73,6
Лена 18 60,0 28 92,3
Фламинго . 22 73,3 26 86,7
Итого 104 69,2 130 86,6
*/ - посажено по 30 меристем.
Таблица 6. Влияние размера эксплантатов на выход безвирусных растении картофеля по даным электронной микроскопии*/
Размер экс- Регенерировало I
Сорт плантатов > Всего ' беширусных
У1КМ шт о о шт %
Ранняя роза " 100 1 12 ! 40 0 10 83 3
Темп 100 1 6 1 20 0 3 50 0
Саф1ф 100 1 15 1 50,0 8 <53 0
Ранняя роза 250 21 70, 6 28 0
Теуш 250 21 70 0 1 4,7
Саф1ф 250 26 86 6 4 13 3
'/посалсено по 30 угеристем каждого сорта
Изучение приемов антивирусного кондиционировании шмагсльнму сред
Дтч выявления возможности получения здоровых растений из стеблевых верхушек мы использовали ингибиторы вирусов, вьшеленные из дрожжей в Институте микробиологии и вирусологии им Д К Заболотного АН Украины (клнд биол намс А Г Коваленко) а также обнаруженный нами эффект антивирусного кондициошфования питательных сред тканями растении-продуцентов ингибиторов вирусов Оценку действия изучаемых факторов проводили по данным электронной ушкроскопии
Использование препаратов из дрожжей. При культивировании стеблевых верхушек картофеля сорта Приекульский ранний пораженного ХВК выход иоровыч растений составил в контроле 40% 41-КЛ 70% 41-ВН 2-ОДЭ-1 -76 6%
При оздоровлении ремонтантной гвоздики от ВКГ наиболее эффективным бьшо использование препарата 1-ОДЭ По обоим препаратам дош в 100 и 250 У1г/л имели гримерно одинаковое действие (табл 7)
Таблица 7. Влияние ингибиторов иг дрожжей на оздоровление реуюнтантнои гвоиики от виру ел крапчатости в кулылре стеблевых верху шек*/
Концентрация Регенерировало растении
Варианты опытов препарата I безвкусных
yir/л I шт %
L Среда Ван-Гофа - 14 ' 4 28
2 Тоже 1- 1-ОДЭII 100 15 12 78
"5 Тоже - 1-ОДЭ 1! 250 13 9 70
4 То же - 2-ОДЭ , 100 15 7 47
5 То же ~ 2-ОДЭ I 250 П 6 46
*/-гок.ькено по 15 стеблевых верхушек размера эОО и км в каждом варианте
Совместная культу ра стеблевых верхушек с тканями различных растений. Вещества, в различной степени проявляющие антивирусный эффект, выделены из многих растеши! (Рыбалко, 1984), причем некоторые из них получены в чистом виде (Т^сИу, ЭДетйгаиЬ, 1962). Однако попытки использования этих веществ в терапевтических целях пока не увенчалось успехом, хотя в подавлении инфекционности вируса в соке положительные результаты получены (Бобырь, 1976). Известно кондиционирование питательных сред выращиваемой тканью; на этом основано применение тканей-нянек при выращивании растений из отдельно живущих клеток (Бутенко, 1971).
Мы изучали возможность антивирусного кондиционирования питательных сред тканями растений, из которых выделены ингибиторы вирусов (Рыбалко, Харута, 1977а). При подсадке ткани 01аШЬи5 ЬагЬаШБ Ь. длина стебля, масса растения картофеля сорта Приекульский ранний увеличилась в трои раза. Вирусологическими исследованиями выявлено, что при использовании подсадки различных тканей значительно увеличился выход здоровых растений из заведомо зараженных вирусом стеблевых верхушек (табл. 8). В этих опытах были использованы стеблевые верхушки размера 300 мкм.
Таблица 8. Сравнительное изучение эффективности тканей различных растений при оздоровлении картофеля сорта Юбель от Х+М+Б вирусов
Вариант Посажено верхушек, Регенерировало, В т.ч. безвирусных
шт. шт. шг. %
Контроль 100 22 2 9
Томаты 80 24 4 6
В1ап0ш5 ЬагЬаШБ Ь. 100 43 23 52
01ат1шз сапорЬуПиБ Ь. 100 20 18 90
СЬепоросИит qvlinoa Ь. 100 33 22 78
Для выявления возможности получения здоровых растений из стеблевых верхушек размером 500 мкм испытывали ткань зверобоя обыкновенного в сравнении с ранее испытанными (табл. 9). В этом опыте в контроле не было получено здоровых растений. Ткань зверобоя обыкновенного превосходила по противовирусной активности ткани обоих видов гвоздики втрое. В этом варианте выход здоровых растений из стеблевых верхушек картофеля, пораженного вирусом X картофеля, составил 75%. Однако ткань зверобоя очень трудно вводить в стерильную культуру, так как только единичные культуры из многих десятков оставались неинфицированными. Эти культуры выдерживали лишь несколько пассажей. Такое же положение сложилось и с тканью лебеды гигантской, что свидетельствует о необходимости отработки режимов выращивания и поддержания указанных тканей для использования в практическом оздоровлении сортов, а также в широком изучении форм использования их в оздоровлении многочисленных растений, для которых
пока не отработаны режимы регенерации бе ширченыч растений из истинных меристем
Taujinua 9. В зияние различные тканей на о иоровление картофеля сорта Ич,кра от ХВК в кчльглре стебтевыч верхмнек размера 500 мкм
Регенерировало ростков
Вариант Всего в тч бе mttpvcHbrx
ШТ [ шт 0 о
Контро Ib il T 0 0
Dianthus barbatus L 8 2 25
Dianthus cary oph\ llus L 10 2 1 20
H\pericum perforatum L 12 9 1 75
*' посажено по 30 стебтевыч вер\\ шек
Разработанная течнотогия испотьзована дтя осуществления ^окрашенной кутктчры картофеля в \ ставнях Крайнего Севера, проведения опытов по разработке гечнотогии пот\ чения растительных ферментов (продуцент Ficus сапса) природных подсластителей (Ste\ îa rebaudiana (Bert ) Bertom) и душистых вешеств (pa 'личные кчльтиварыдендратемы) в к\ тытре in i ¡tro
В шее гон главе ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПРИЕМОВ ПОУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО M ЧТЕРИАЛА приведены материаты по разработке способов \скоренного р имноженияоиоровтенияот вир\сов имишплазм материала Какишестно ¡тог прием не сообщает растениям нмм\нитета к инфекции Начичие широкого инфекционного фона ставит на первый тан !ащит\ ^м^новодчеекич посевов на всечэтапахускоренного размножения и в первую очередь при интенсивном первичном размножении исчодныч бе?вир\ч-ныч р Астении (оригинальныч меристемныч растении)
В этом тане наибоче^ перспективным приемом являетст клона 1ьное \1икрора!Множение в kv теп-ре ¡n Mito
Много ieTHiie данные по \екоренном\ рашножению картофетя в прооирочнои kv тылре по îboih iii нам определить ко )ффшшент ра ;мно.кения р шныи I s в месяц Это по шотяет при на шчииодною ôe шир\сного растения в пробирке в течение ^ мес. по пчить "ООО растении чго определяет мощность рааоты мольного биоцентра Это котичество достаточно для посадки в оршжере^ тощадью ?00 м >гш о^л ш^ствтенич дв\ члро/каинои кл зыуры каргофе тя на 1 га
Д14 \ гигшения приживаемости микрочеренков по юорано сочетание ингредиентов питательной среды ( АС СССР N lbOSX4^)
Изыскание приемов содержания коллекционных кчльтлр.
Актуальным является создание коллекций оздоровленных сортообращов в к\ льтлре in vi ti о обеспечивающей защиту от всех видов реинфекшш С 1976 г в лабораторной коллекции Укр НИИ с \ микробиологии мы поддерживали более 20 сортов различной скороспелости Не выявлено сортовых различий в росте растений выращиваемых в кл лыхре in vitro В дальнейшем была проведена контрольная электронномикроскопическая проверка растений некоторых сортов на вир\соносительство Оказалось что все проверяемые сорта были безвирусными
Нами проведено изыскание приемов консервации коллекционных kv тктхр Известно использование для этой цели низких температур (Шмыгля, 1974) а также ингибиторов роста (Трофимец с соавт, 1974, Фенина, 1975)
Для консервашш коллекционных kv льлур мы испытывали препарат ТУР (хлорхолинхлорид) и некоторые метаболиты почвенных микроорганизмов, в частности пиюлиновуло (ГГ) и феназин-1-карбоновуло (ФК) кислоты (Пинчук с соавт, 1979) Препараты в дозах на 1 л питательной среды ТУР - 2 мл, П и ФК по 10 мг достоверно влияли на уменьшение длины стебля \ двух сортов В последействия не выявлено влияния этого приема на морфологические признаки и проду ктивность растений
Получение минпклубнсн in vitro (тлбернзация) имеет важное значение в плане транспортировки на большие расстояния и при ведении коллекций гак как ушниклуони могут сохраняться длительное время на ограниченной площади Появление клутжеи мы нередко наблюдали при выдерживании растений без пересадок в течение 3-5 месяцев или при слабом освещении Имеются сведения о кондиционировании условии туберизации у картофеля in vitro в нашей стране (Морозова Мелик-Саркисоп 1978) и за рубежом (Palmer Smith 1969) Это позволяет считать вопросы кдубнеобразования в стерильной kv льгчре (тчтЗеризашш) экспериментально обоснованными Для планомерного потучения клубней в стерильной культуре мы использовали методику ПальУ!сра и Счпгга Она заключается в следующем черенки или кусочки ростков в сахарных стаканчиках по 5 шт высаживают на питате льнуло среду Murashige-Scoog с повышенным содержанием сахарозы (до 6° о) и кинетина (до 2 5 yir/л) Ку лыуры выдерживают в темноте при 20^2° С К тони образуются в паз\хах листьев в течение 1-1 5 месяцев
Разработка методики получения миничеренков При пересадке пробирочных растений в почву наблюдается значительный отпад Нами разработан прием позволяющий избежать этих затруднении При выращивании растении в пробирках в фазе 5-6 У1еждо\ злий от них в стьрильныхус ювняхотделяютминичеренки(Bepwшку с2-Ч мелсат злиями) Их основания обрабатывают стимуляторами роста в (О 00"*% спиртовом растворе и-НУК в течение 1 5 сек ) высаживают в герметические камеры и з оргстекла и выдерживают до укоренения
В этих камерах размещается 250-350 миничеренков. Камеры с мииичеренками мы выдерживали при освещенность около 10 килолюксов и 16 часовом фотопериоде и температуре 25±2°С. В этих условиях укоренение миничеренков ремонтантной гвоздики происходит в течение 20±3, хризантемы 12-15 дней. В опыте показаны преимущества миничеренков в сравнении с пробирочными растениями после пересадки в почву. Миничеренки быстрее приживаются и более интенсивно растут.
Размножение растений черенками и в двухурожайной культуре. Для ускоренного размножения безвирусного картофеля мы использовали методы отводков и черенкования в сочетании с двухурожайной культурой. При этом первый урожай получали в весенние месяцы с использованием защищенного грунта, что обеспечивало защиту от заноса инфекций извне, поскольку вегетация растений протекает в период, когда нет посадок картофеля и других культур - резерваторов вирусов (временная изоляция). Отработка этой методики начата в 1971г. на примере сорта Приекульский ранний. Для получения первого урожая в период март - май использовали защищенный грунт, второй урожай получали на изолированном торфянике в пойме реки Замглай (Черниговская обл.), с начала июня по конец ав1уста, используя проращенные в теплице клубни. Потомство каждого растения, выращенного в теплице, высаживали отдельно. Таким образом, можно считать выращиваемые в теплице растения как клоны первого, а на изолированном торфянике - второго года. Вирусологическими исследованиями установлено, что первичное размножение картофеля отводками, черенкованием интакгных растений и делением пробирочных растений по количеству междоузлий (клональное микроразмножение) практически не влияет на пораженность потомства вирусами. Во всех случаях на последующих этапах размножения обнаруживали лишь единичные растения, пораженные X, У, 5- вирусами. При массовом размножении материала в различных опытах 1973 г. пораженность вирусами составила: ХВК -0.02%, БВК - 0.05%, МВК - 0.25% (по данным серологических анализов) и скручиванием листьев - 2% (по визуальной оценке). Инфекция МВК прогрессировала и в 1974 г. составила 3%. Между тем 28 безвирусных клонов 1971 г., размноженных индивидуально, были свободны от вирусов. Половина тех же клонов, размножаемых обезличенно в двухурожайной культуре, была поражена МВК на 0.036%. ИВК и ВТМ ни в одном случае не были обнаружены.
Пораженность вирусами меристемной и обычной элиты резко различалась как по уровню зараженности, так и по составу возбудителей. Если обычная элита была поражена ХВК и комплексной инфекцией, пораженных растений было 82-92%, то меристемная - в основном МВК, причем пораженных растений было всего 4-15%.
При полевом размножении сортов Гатчинский, Огонек и других также обнаруживали только единичные растения, пораженные X и Б -вирусами. Это свидетельствует о том, что тщательное соблюдение мер профилактики распространения вирусов позволяет сохранить материал в оздоровленном состоянии.
Оздоровление цветочных кл тьтчр начато в 1976 г Первым объектом исследования выбрана гвоздика Основным патогеном на этой культуре является вир\с крапчатости гвоздики, так как он первым поражает оздоровленные насаждения (Езкепа/л е1 а1 , 198"?) и может служить критерием санитарного состояния насаждении (Роире! 1975) При массовом производстве о шоровленного посадочного материала на базе безвирусных мериклонов полученных из истинных меристем (100 мкм) и отобранных при помощи этектронной микроскопии ежегодно формируется суперэшггный маточный питомник В 1981 г эти растения выращивали и изучали на продуктивность и пораженность В КГ клоновым методом, те анализировали каждое растение в рамках линии (потомство отдельной меристемы) В ре !\ тьтате было установлено, что тинии подученные из истинных меристем (100 мкм) бьпи свободны от этого патогена в течение года (срок использования насаждения для получения коммерческой продукции)
В целом же многолетними исследованиями \становлено низкое поражение вирусами промышленных насаждений гвоиики на предприятии (рис 1)
Тыс растении
38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 Ч б 4
1981 1982
1983
1984
198^
1986
1987
инфицированных растении
"иоровьгх растении
Рис 1 Пораженность маточника гво иики ВКГ по данным многолетних исследовании
Седьмая глава. ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНИЗАЦИОННЫХ ФОРМ ВНЕДРЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В ПРОИЗВОДСТВО посвящена выбору стратегии использования достижений биотехнологии, в частности разработок диссертанта, в интересах народного хозяйства.
В системе коммунального хозяйства Российской федерации создано научнопроизводственное предприятие для разработки и внедрения ресурсосберегающих биотехнологий оздоровления растений от вирусных заболеваний и иммунодиагностикумов для выявления широкого спектра вирусов и микоплазм, поражающих цветочные и другие растения с целью создания интегрированной системы борьбы в оздоровленных фитоценозах.
С этой целью была разработана и утверждена Минжилгомхозом РСФСР "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики". Она включает нормативно-технические требования к материалам и оборудованию, применяемым при производстве оздоровленного посадочного материала и все звенья технологического процесса - от выделения меристем до получения элиты на меристемной безвирусной основе (рис. 2)
Рис. 2. Схема технологического процесса производства оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики
Указанный технологический процесс является базовым для оздоровления и других цветочных культур. Данные производства оздоровленного посадочного материала гвоздики и хризантемы приведены в табл. 10.
Таблица 10. Проишодство спдоровтениыч черенков гвоздики и хризантемы за 1982-1989 гг( в тыс шт )
Годы Гвоздика Хризантема
не у корененные у корененные 1 не у корененные' укорененные
1982 \ 529 99 | 354129 -
1983 870 78 735 3S i - 1 -
1984 i 910,12 "70 07 56 58 48 09
1985 1428 65 1 1104,8 14 64 i 12 47
1986 1 1110 09 910.05 149 23 134 57
1987 1670 47 1186,44 . 172,45 13841
1988 1916 81 1314,32 1 221,70 191,37
1989 1 1 1026 64 279,95
сего укорененных 7501,98 ~ 707,79
Разработка принципов стандартизации биотехнологий в цветоводстве (технологии оздоровления растений, оздоровленный посадочный материал биопрепараты для диагностики возбудителей вирхсных и вирусоподобных заболеваний) Требованиями управления качеством и необходимостью включения в номенклатуру новых видов проду кции продиктована необходимость разработки нормативно-технических документов на продукцию так как получаемая в процессе исследований продукция хюгла быть отнесена к новым видам
Первым нормативно-техническим доку ушитом, узаконившим производство новой для народного хозяйства продукции - бе '.вирусных ушрнклонов цветочных растений, была "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного умтериала реуюнтантной гвоздики", разработанная нами на основе собственных экспериментальных уштериалов и утвержденная Научно-техническим советом МЖКХ РСФСР в июне 1981г Указанная технология стала базовой для производства оздоровленного * посадочного уюгериала и других цветочных растений и обеспечила внедрение
в производство новой для народного хозяйства продукции с высоким экономическиУ! эффектом Это послужило основанием для расширения работ, а также включением их в Общесоюзную научно-техническуло программу 074-06 "Разработать биотехнологические методы получения ценных для медицины и сельского хозяйства продуктов и внедрить их в производство". Задание 03 "Осуществить клональное угакроразмножение и оздоровление ценных сельскохозяйственных культур создать исходные формы для получения новых сортов сельскохозяйственных растений с использованием У1етодов клеточной инженерии", 03 01 т Осуществить клона льное ушкроразушожение и оздоровление ценных форм хозяйственно важных растений с похгошью культуры клеток и тканей в т ч 03 01 08 - цветочно-декоративных растений" Для осуществления массового производства безвирусного посадочного уюгериала и проведения исследований по
упомянутой теме Минжилкомхозом РСФСР по разработке диссертанта организовано Производственное предприятие меристемных культур.
В задачу предприятия входит разработка и внедрение в производство ресурсосберегающих технологий оздоровления и микроразмножения ценных цветочных и продовольственных культур, производство иммунодиагностических препаратов к патогенам, поражающим цветочные и продовольственные культуры (вирусы, микоплазмы). Для производства новых видов продукции и управления качеством необходимо обеспечение нормативно-технической документацией (Рыбалко, 1988в).
С 1986 г. совместно с Краснодарским филиалом ВНИИстандартизации приступили к разработке нормативно-технической документации. Разработанная схема (рис. 3) предусматривает стандартизацию технологического процесса, готовой продукции на всех стадиях жизненного цикла, методов контроля (Рыбалко, 1988, Рудоминская с соавт., 1988; Рыбалю, Руцоминская, 1988).
Концепция стандартизации биотехнологий в цветоводстве сформулирована с учетом специфики объектов стандартизации и современных требований государственной стандартизации к качеству
Рис. 3. Схема стандартизации биотехнологической продукции
26
В схеме представлены направления, объекты и уровни стандартизации производства меристемного посадочного материала и диагностических препаратов В документах регламентируются требования к исходным растениям-донорам меристем методам их отбора и контроля Определена последовательность выполнения технологических операции культивирования меристем с момента извлечения из исходного растения до выхода готовой продукции Требования к качеству готовой продукщш дифференцированы в зависимости от технологической стадии ее получения Стандартизации подвергнуты показатели качества биопрепаратов используеушх для тестирования оздоровленного уитериала на наличие вирусов и препаратов чистых культур вирусов применяеу1ых для получения соответствующих диагностических антисывороток Разработанный коуишекс документов по стандартизащшспособствуетвнедрению прогрессивной высокоэффективной технологии в производство и органгоации широкомасштабного выращивания оздоровленного от вирусных инфекций высококачественного посадочного материала цветочных растений
Практическая реали5ация научно-технических достижений через стандартизацию позволяет унифицировать методические подходы к решению вопросов по обеспечению производства высоко эффективными технологиями, а потребителя - продукцией высокого качества
Опыт разработки комплекса нормативно-технических документов для биотехнологическои продукции в отрасли проугышленного цветоводства может стужить научно-методической базой для организации работ по стандартизации аналогичной продукции агропроушшленного комплекса
Массовое производство безвирусиого посадочного умгеридлл. С
самого начала исследований полученные резллыаты проходили производственную проверку Так, с 1 кг бе ¡вирусных клубней сорта Приекульский ранний выращено в 1971 г -0 5 т, в 1972 г - 3, О т, в 1973 г -">0 0 т в 1974 г - 2000 0 т (в различных хозяйствах Украины) До 1974 г внедрение проводили в опытном хозяйстве Украинского НИИ с х микробиологии (г Чернигов) ас 1974 г начато испытание о иоровленного в культу ре меристемы картофеля непосредственно в семеноводческих хозяйствах а также в научно-исследовательских учреждениях Результатом проведения этой работы было получение в 1975 г опытным хозяйством института элиты на меристемной безвируснои основе В ряде хозяйств доказаны преимущества этого материала в сравнении с полученньм при помощи серологических клоновых отборов
С 1981 г начато уиссовое производство оздоровленного посадочного уттериала цветочных растений на примере гво шиси ремонтантной С целью повышения производитетьности труда проведено изучение возможности унификации основных приелюв оздоровления и микроразмножения для различных растении Установлено, что для картофеля гво ¡дики хризантемы орхидеи герберы лилии гладиолуса фикусов филодендронов, кордилины, ¡еУ1ляники винограда киви У1андарина ананаса стевии, инжира,
папоротников, стевии, и др. возможно применение общего технологического процесса на этапах приготовления питательных сред, введения растительных тканей в стерильную культуру, регенерации, микроразмножения, акклиматизации. Это дало возможность расширить ассортимент растений, включенных в процесс массового размножения методом стерильной микрокультуры. Только за 1986-1990 гг. (в рамках выполнения общесоюзной научно-технической программы 074-06 "Разработать биотехнологические методы получения ценных для медицины и сельского хозяйства продуктов и внедрить их в производство") получено 175599 мериклонов различных культур (табл. 11).
Таблица 11. Производство безвирусных мериклонов для формирования оздоровленных маточников в различных хозяйствах СССР (1986-1990 гг.)
1986 1987 1988 1989 1990 Всего
Мериклоны переданные в производство
27200 , 31980 39600 46221 25618 170619
Мериклоны в пробирках
- 40 234 1626 3030 4930
Всего 27200 32020 39834 47847 28648 175549
Производство коммерческих препаратов иммуноднагностикумов.
В связи с широким внедрением методов массового оздоровления в практику производства коммерческого посадочного материала цветочных растений, мы провели работу по организации производства широкого ассортимента иммуноднагностикумов (табл. 12). Это обеспечивает замкнутую систему безвирусного семеноводства (Рыбалко, 1988а; Харута с соавт., 1984, 1986).
В 1990-1991 гг. проведены работы по получению диагностических антисывороток к микоплазмоподобным организмам, выделенным из гвоздики, цинерарии гибридной, гортензии, а также столбура томатов. Проведены разработки по получению реагентов для иммуноферментного анализа : иммуноглобулинов и пероксидазных конъюгатов. Эти реагенты были получены к 14 антисыворткам, в т.ч. на ВЖМФ, ВКГ, ВЖМФ(фрезия), Реттл, вирусу антуриума, ВМЦ, ВВХр, ВТМ, ВАТ, ВМЛилии, ЛВГ, ВМНарцисса, ВОМХр, а также 4 антимикоплазменным сывороткам.
Таблица 12. Производство антисывороток диагностических за 1985 1990 гг. ( в мл)_
1985 1986 1987 1988 Итого
Итого за год (мл) 1390 1457 1202 1845 5894
На базе указанного ассортимента полученных нами антисывороток НПО "Биолар" (г. Олайне, Латвия) в 1985-1988 гг. осуществило производство диагностических наборов для ИФА (Приказ N66/3126 от 25.07.1986 г.).
Экономический анализ производства безвирусных мерыклопов
Благодаря у нификации технологического процесса для различных видов и больших объемов производства как видно из табл 13 установлено что себестоимость одного мериклона сравнительно небольшая и находится в пределах цены на оздоровленные черенки гвоздики (в ценах 1984 г)
Таблица 13. Стр\ ктура затрат по стадиям выращивания мериклонов
Себестоимость единицы, коп
Виды затрат
1 Оплата тр\да '2 Стоимость оборудования 3 Прочие затраты"
коп % коп % коп %
17,6 36,9 11,3 39,4 28,9 , 37,8
13 8 28 9 03 3 115 , 17,1 22 4
16,3 34,2 14,1 49,1 30,4 39,8
Итого производственная себестоимость % к полной производственной себестоимости
47,'
62,4
28,7
37,6
0-76.4
100 О
Анализ $атрат на производство мериклонов свидетельств\ет том, что основная доля их приходится на лабораторную фаз\ - примерно 2/3 (62 4%) а 1/3 (37 70) - на фаз\ акклиматизации и доращивания в теплице На обеих фазах наибольшая доля итрат приходится на оплату труда и лабораторного оборудования В плане снижения ¡атрат как на лабораторной фазе, так и при проращивании планир\ ется разработка автоматизированной технологической линии включающей автоматизацию технологических режимов по подготовке лабораторной посуды приготовлению питательных сред применению новых более эффективных методов клонального микроразмножения, инертных с\бстратов автомат»;ании регулирования климатических факторов, передвижения материалов и культур в технологических узлах технологической линии (Рыбалко, 19916)
Обеспечение опытно-конструкторской разработки типовых технологических линий производства мериклонов н иммунодиагностику мов
Материалы исследовании по диссертации были исполь юваны нами для разработки опытно-производственной базы предприятия и модульного биоцентра Разработкл технического задания на мод\льный быстроразвертываемый промышленный биоцентр в рамках МНПК "Биотехническая индустрия" проводили совместно с проектным институтом ГипроНИИмедбиопром Минмедмикробиопрома СССР При этом нами были
разработаны и выданы технические условия, включающие опытно-промышленный регламент на производство безвирусных мериклонов широкого спектра растений по схеме, предложенной ГипроНИИмедбиопром, для чего была использована "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики".
ПРАКТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНАДАЦИИ
1. По материалам диссертации разработаны и утверждены в установленном порядке нормативно-технические документы:
а) "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики" (утверждена Минжилкомхозом РСФСР 1981 г.),
б) ТУ "Сыворотки диагностические к вирусам цветочных культур",
в) ТУ "Препараты вирусов растений",
г) ТУ 204 РСФСР 2.187-89 - "Миничеренки цветочных растений оздоровленные (технические условия)"
д) ТУ 204 РСФСР 2.186-89 - "Черенки цветочных культур оздоровленные, посадочный материал (технические условия)"
е) ТУ 427-975-86 - "Гвоздика горшечная оздоровленная (технические условия) "
ж) ТУ 427-970-86 - "Саженцы цимбидиума оздоровленные (технические условия)"
з) ТУ 427-969-86 - "Оригинальные меристемные растения (технические условия)"
и) Технологическая инструкция "Технология производства безвиру сного посадочного материала"
к) ТУ 204-2-01-91 - "Технологическая инструкция производства препаратов вирусов цветочных ку льтур",
2. Разработаны и изданы: Методические рекомендации по борьбе с вирусными болезнями в маточных питомниках ремонтантной гвоздики. -Киев: Минжилкомхоз УССР. 1978. 13 с. (авторы Рыбалко А.Е.,Харута Л.Г., Козар Ф.Е., Сивере H.A., Копейченно М.И.).
3. НПО "Биолар" переданы антисыворотки, которые использованы в производстве диагностических наборов для ИФА.
4. Совместно с Минжилкомхозом Российской Федерации в 1985 г. создано Производственное предприятие меристемных культур (приказ 205 от 15.04.1985 г.) В 1996 г. в преобразовано в федеральное государственное унитарное предприятие Научно-исследовательский центр "Меристемные культуры" Минстроя России (Устав №557, свидетельство о регистрации серия АДГ № 1336 от 12.07.1997 г.),
5. На протяжении 1983-1990 гг. произведено и реализовано многочисленным предприятиям СССР 7501,98 тыс. элитных черенков гвоздики ремонтантной и 707,79 хризантемы.
6 С 1986 по 1990 г произведено для нужд собственного производства и pea та зовано различным предприятиям 5894 мл высокоактивных нативных антисывороток специфичных к 15 вирусам и 4 микопчазмам
7 Технология оздоровления и микроразмножения широкого спектра kv зьт\ р передана по договорам Невскому карантинном\ питомнику Ленинградского объединения "Цветы", Краснодарскому НИИ картофелеводства и овощеводства, совхозам "Таугуль", "Жодинскии", "Надымский"
8 Получены авторские свидетельства на 4 изобретения
9 Подано 3 заявки на выдачу патента Российской Федерации
10 На все виды продукции разработаны технологические карты
11 В течение 1988-1995 гг материалы диссертации испо ль зовались для чтения лекций по биотехнологии на кафедре физиологии растений Донецкого государственного университета
12 Разработан проект и технико-экономическое обоснование строительства опытно-производственной базы федерального государственного у нитарного предприятия Научно-исследовательский центр "Меристемные ку льтуры"
13 Совместно с ГипроНИИмедбиопром Минмедмикробиопрома СССР по заданию междуведомственного научно-производственного комплекса "Биотехническая индустрия" разработан проект уюдульного быстро развертываемого биоцентра
14 Создан учебный фильУ! "Болезнь века"
ВЫВОДЫ
1 Электронно-ушкроскопическими и серологическими анализами установлено полное заражение насаждении вегетативно размножающихся растений вирусами Большинство из них находится в скрытой форме На картофеле в основном распространены X, VI S Y - вирусы их комплексы Зараженность растений рехюнтантной гвоздики вирусом крапчатости в большинстве случаев сочетается с вирусами кольцевой пятнистости, латентным, прижилковой крапчатости Исследованные сорта хризантемы полностью заражены В-виру сом часто в смеси с виру сами табачной мозаики аспермии томатов огуречной мо заики Сорта и виды орхидей заражены виру сами мозаики цимбидиума и кольцевой пятнистости одонтоглоссума
2 Проведенные обследования изучаемых ку льтур (гсрберы, пуансетпш, антурихма. лилии гладиолуса, нарцисса фрезии, розы, различных орнаментальных культур - 48 видов) привели к выяснению комплексного поражения вирусами относящихся к различным таксономическим группам Определены наиболее часто встречаемые комбинации биологические и физикохтисческие характеристики
3 Разработаны методы получения высокоактивных диагностических антисывороток к некоторым виру сам поражающим цветочные культуры, на
основе нового иммуномодулятора камизола.
4. В производственных условиях разработан прием повышения чувствительности реакции путем концентрирования вируса насыщением ПЭГ мм 6000 до конечной концентрации 8%. Применены прогрессивные методы диагностики вирусов: на основе радиальной иммуно-диффузии и иммуноферментного анализа. Разработан перспективный способ приготовления препаратов вирусов для электронной микроскопии, обеспечивающий неспецифическое повышение чувствительности метода (приоритетная справка N4954353/13-051667).
5. В комплексе защиты картофеля, гвоздики ремонтантной, хризантемы и других вегетативно размножающихся культур от вирусных заболеваний первостепенную роль играет получение и применение здорового исходного материала на основе культуры меристемы в сочетании с приемами ускоренного размножения и защиты от реинфекции.
6. На основе изучения локализации вирусов в стеблевых верхушках и усовершенствования методов ранней диагностики вирусов разработана и экспериментально обоснована унифицированная ресурсосберегающая технология получения безвирусных растений и клонального микроразмножения в культуре in vitro с учетом оптимального сочетания ингредиентов питательных сред для осуществления двухфазного метода регенерации растений, позволяющего сократить сроки получения генетически однородных и одновозрастных растений в промышленных количествах.
7. Выход безвирусных растений ряда сортообразцов картофеля, гвоздики и хризантемы, полученных их эксплантов размера около 100 мкм без предварительной термотерапии составил у картофеля 50-83%,у гвоздики и хризантемы - около 60%.
8. Разработаны приемы повышения оздоровительного эффекта культуры стеблевых верхушек (300-500 мкм), альтернативные термообработке исходных растительных тканей. При использовании полисахаридов, выделенных из дрожжей получено до 70% здоровых культуру картофеля и гвоздики в результате подсадки к стеблевым верхушкам тканей-продуцентов антивирусных метаболитов (гвоздика турецкая и садовая, лебеда гигантская, зверобой обыкновенный) получено 50-75% здоровых растений картофеля.
9. Разработана и экспериментально обоснована система приемов массового производства безвирусного исходного материала. Клональное микроразмножение in vitro растений картофеля, гвоздики, хризантемы, орхидей и других культур обеспечивает не только защшу от всех видов реинфекции, но и позволяет получить коэффициент размножения 1:3000 и более в течение 5 мес. Для получения безвирусных растений и клонального микроразмножения в культуре in vitro растений, пригодных к пересадке в почву, разработана питательная среда со сбалансированным сочетанием макроэлементов (АС 1608845). Использование интенсивного размножения на первых этапах в комплексе с приемами защиты от реинфекции позволяет поддерживать насаждения различных культур в относительно здоровом состоянии.
10 Предложены принципиально новые приемы ускоренного размножения на основе применения регу ляторов роста и физических факторов
а) предпосадочное замачивание клтоней в растворе препарата ТУР повышает урожаи картофеля на 23% и коэффициент размножения - на 29° □
б) применение имт льсного освещения при проращивании посадочного материата способствует получению более коротких ростков, чем при тем новом
11 Разработана концепция стандартизации биотехнологий в цветоводстве, которая сфоруп тирована с учетом специфики объектов стандартизации и современных требовании государственной стандартизации к качеству продукции
12 Прои шодственная проверка разработанной ресурсосберегающей технологии оздоровления растений позволила рекомендовать включение ее элементов в технико-экономическое обоснование проекта уюдутьного биоцентра в раУ1ках конверсии
СПИСОК
работ опубликованных по материалам диссертации
1 Марченко В А , Рыбалко А Е Вирусные боле знн картофеля в Полесье УССР и У1еропрнятия по борьбе с нимп//Отдел информации и прессы Выставки передового опыта в народном хозяйстве УССР Киев 1969 4 с
2 Марченко В А Рыбалко А Е , Ющенко НИ Ре л льтаты применения комплекса методов при отборе безвирусных клубней картофеля// VI Всесоюзное совещание от вирусным болезням растений (Киев, 3-5 У1ая 1971 г) - М ВАСХНИЛ 1971 -С 57
3 Марченко В А , Рыбалко А Е , Ющенко Н И Пораженность вирусными болезнями некоторых сортов картофеля распространенных в Полесье Украинской ССР//VI Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений (Киев 3-5 угая 1971 г) -М ВАСХНИЛ 1971 -С 58
4 Рибалко А С Вплив скручу вання листя(Ь-вфУса) на вмют хторофщу в лисп р1зних сорпв картон л1//Бюлопчн1 особливост1 упкрооргашзупв Материалы I Республиканской конференции уюлодых ученых микробиологов и вирусологов Киев Наукова думка, 1972 С 67
5 Рибалко А С , Харута Л Г Прискорене розушоження картопл!, оздоровлено1 вщ В1русн01 шфекцп методом ку лыури ашкально1 меристеми //Бюлопчш особливосп упкрооргантив Матер1али конференци уюлодих учених-упкробюлопв 1 вфусолопв -Киев Нагеова думка 1972 С 67
6 Шелудько Ю М Рыбалко А Е Перспективы использования У1етода апикальных меристеУ! в сеУ1еноводстве овощных кульлур//Тезисы докладов к Всесоюзному сеушнару-совещанию по вирусным болезням овощных культур М ВАСХНИЛ 1974а С 51
7 Шелудько Ю М Рибалко А С Нов1 метода одержання безвфуснот
елгги KapToruiiZ/BicfiitK алъськогосподарсько! науки. 19746. №10. С. 53-57.
8. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е. Пути повышения устойчивости растительных тканей для получения безвирусных растений/Л V Всесоюзное совещание по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям. М.: ВАСХНИЛ, 1975. С.62.
9. Шелудько Ю.М., Рибалко А. С., Харута Л.Г. До питания про даагностику скручування листя та застосування термотерапп в 6oporb6i з ним //Картоплярство. Киев: Урожай, 1974а. С. 44-46.
10. Шелудько Ю.М., Рибалко А. €., Харута Л.Г., Жук 1.П., Горбаренко M.I. Перспективи одержання безв1русно! елгги картошй// Картоплярство. Киев: Урожай, 19746. N5. С. 41-45.
11. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Использование метода культуры меристемы картофеля для создания исходного безвирусного материала в Украинской ССР//Современные методы получения безвирусного картофеля, тез. докл. кВсесоюз. семинару-совещанию. М.: ВАСХНИЛ, 1975. С. 25-26. ,
12. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Усовершенствование метода культуры меристем для оздоровления картофеля от вирусов//Современные методы получения безвирусного картофеля. Тез. докл. к Всесоюзн. семинару-совещанию. -М.: ВАСХНИЛ, 1975. - С. 24-25.
13. Козар Ф.Е., Сивере H.A., Рыбалко A.C. Очистка ХВК, YBK, ВТМ та сферичного Bipyca гвоздики з застосуванням штетиленппколю та гельфшьтрацГь'/Млкробюлопчний журнал. - 1976. - Т. 38. Bim. 5. С. 637.
14. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Использование клубней разного размера при размножении безвируснош меристемного каргофеля//Картофель и овощи. 1976а. N5. С. 19.
15. Рибалко A.C., Харута Л.Г. Застосування методу культури меристеми для оздоровления промислових сорт1в ремонтантно* гвоздики. Гуйкробюлопчний журнал. 19766. Т.38. Внп.6. С. - 645.
16. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Шелудько Ю.М. Применение ТУРа при ускоренном размножении безвируснош картофеля, полученного методом культуры меристемы//Огдельное приложение к методическим указаниям по работе с препаратом ТУР в плодоводстве и овощеводстве по материалам 3-го Всесоюзного совещания. М.: МСХ СССР, 1976. С. 22-24.
17. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Жук И.П., Горбаренко Н.И. Исходный материал для семеноводства картофеля на безвирусной основе//Вирусные болезни растений Дальнего Востока. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1976, новая серия, Т.25(128). С. 146-149.
18. Рибалко A.C., Харута Л.Г. Вивчення ефекту антив1русного кондишонування живильних середовищ ¡мунними няньками// Мжробюлопчний журнал. 1977а. Т.39. Вип.5. С. -667.
19. Рибалко A.C., Харута Л.Г. Про удосконалення метощв оздоровления картошй вад BipyciB//Bicmnc сшьськогосподарсько! науки. 19776. N8. С. 108110.
20 Рыбалко АЕ Получение исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики и хризантемы в Украинской ССР//Научно-практическая конференция "Выращивание цветочных культур меристемным способом" Рига Мин ком хоз Лат ССР, 1977 С 26-27
21 Ше лудько Ю M, Рыбалко А Е , Харута Л Г Ускоренное размножение У1еристеУ1ного бе (вирусного картофеля/ЛЗесгник сельско-хозяиственной науки 1977а N7(250) С 26-30
22 Шелудько Ю M , Рыбалко А Е , Харута Л Г Использование метода культуры У1еристеУ1 для создания исходного безвирусного материала ьаргофеля в УССР//НаУЧ тр НИИКХ M 19776 вып 30 С 51-57
23 Рыбалко А Е Изучение условий массовой регенерации безвирусных растений в ку тьтуре У1еристемы//Вирусные боле îhh растений и У1еры борьбы сними M ВАСХНИЛ, 1978 С 10-11
24 Рыбалко А Е Сивере H А , Харута Л Г Изучение биологических свойства виру са выявленного в промышленных насаждениях реугонтантной гвоздики//Виру сные болезни сельскохозяйственных растений и меры борьбы с ними Тез докл Всесоюзн совещ (Ленинград, сентябрь, 1978 г) - M ВАСХНИЛ 1978а - С 131
25 Рыбалко А Е , Харута Л Г Применение У1етода культуры меристемы для оздоровления от вирусов ремонтантной гвоздики// Физиология и биохимия ку твпрных растений 1978 Т10 Вып 5 С 535-540
26 Харута Л Г, Рыбалко А Е , Козар Ф Е , Сивере H А , Фоупш В В Идентификация вируса крапчатости гвоздики в промышленных посадках Киевского интроду кционнокарантинного питомника декоративных растении //II республиканская научно-теоретическая конференция уюлодых ученых-ушкробио логов Тез докл Ташкент Фан 1978 С 126-127
27 Рыбалко А Е Харута Л Г, Козар Ф Е , Сивере H А , Копеиченко МИ Методические рекомендации по борьбе с вирусными болезнями в маточных питомниках реушнтантной гвоздики - Киев Минжилкомхоз УССР 19786 13 с
28 Ермолаева H Г, Латаш ЛМ, Рыбатко АЕ, Коваленко А Г Исполь зование препаратов из дрожжей для повышения оздоровительного эффекта культуры У1еристеУ1ы при получении безвирусных гвоиик//\Л1 конференция мо лодых ученых-ботаников Украины Тезисы докладов Киев Hayкова думка 1979 С 123
29 Латаш Л M Еруюлаева H Г Рыбалко Применение регуляторов роста при ускоренном размножении безвирусных гвозди к//VII конференция уюлодых ученых-ботаников Украины Тез докл Киев Нлукова думка, 1979 С 131
30 Пинчук И H Рыбалко АЕ, Харута Л Г, Патыка ВФ Изучение действия некоторых синтетических и природный ингибиторов роста на угеристеушый картофель//У1 конференция уюлодых ученых-ботаников Украины Тез докт - Киев Hay кова дум к» 1979 С 155
31. Рыбалко А.Е. Изучение условий массовой регенерации безвирусных растений в культуре меристемы/ЛЗирусные болезни растений и меры борьбы с ними. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1980. С. 94-99.
32. Рыбалко А.Е. Результаты многолетнего использования метода культуры меристемы в практическом семеноводстве//Культура клеток растений и биотехнология. Кишинев: Штиинца, 1983. С. 136-137.
33. Рыбалко А.Е. Организация производства безвирусного исходного материала для промышленного цветоводства в совхозе "Южные культуры" //Промышленное выращивание цветочных культур на юге СССР. Сочи: НИИ горного садоводства, 1984а. С. 32-34.
34. Рыбалко А.Е. Оздоровление растений от вирусных заболеваний (на примере цветочных растений)//Сельскохозяйственная биология. 19846. N4. С. 80-81.
35. Рыбалко А.Е. Оздоровление цветочных растенийУ/Защита растений. 1984в. N4, С.23.
36. Рыбалко А.Е. Экспериментальное обоснование и принципы внедрения в производство технологии оздоровления растений от вирусов// VIII Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений. Тезисы докладов. Вильнюс: ВАСХНИЛ, 1984г. С. 96-97.
37. Рыбалко А.Е. Вирусы цветочных культур и меры борьбы с шага. Обзорная информация. - М.: ЦБНТИ Минжилкомхоза РСФСР, 1984д. - 42 с.
38. Rybalko A. On the improvement of large scale of meristem culture release from vims and clonal multiplication of plants//International symposium "Plant tissue and cell culture -application to crop improvement". Abstracts (Olomouc, Czechoslovakia, 24-29 September, 1984). Olomouc. 1984. (Appendix).
39. Rybalko A. On the improvement of large scale of meristem culture release from virus and clonal multiplication of plants//Intemational symposium "Plant tissue and cell culture -application to crop improvement". Procedings. (Olomouc, Czechoslovakia, 24-29 September, 1984). Olomouc. 1984. P. 549550.
40. Кишко Я.Г., Рыбалко A.E., Харута Л.Г., Рубан В.И. Изучение структуры вирусных популяций, как элемент общей программы оздоровления цветочных культур/Л/Ш Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений. Тезисы докладов. - Вильнюс: ВАСХНИЛ, 1984.С. 158-160.
41. Рыбалко А.Е., Кишко Я.Г. Карлавирусы растений: распространение и меры борьбы//У1 съезд Украинского микробиологического общества. -Донецк: Нукова думка, 1984. С. 195.
42. Харута Л.Г., Рыбалко А.Е., Рындина Н.А. Массовая диагностика вирусных болезней в меристемных маточниках цветочных культур// Промышленное выращивание цветочных культур на Юге СССР. Науч. тр. НИИ горного садоводства и цветоводства. Сочи. 1984. С. 34-41.
43. Рыбалко А.Е. Профилактика вирусных болезней цветочных культур //Защита растений. 1985. N2. С. 22-23.
44 Рыбалко А Е Система оздоровления интродуцированных цветочных растении от фитопатогенных виру сов//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов Тез докл региональн совеш Киипшев Шгиинца 1986а С 125-126
45 Воробьев Г В Хару-та JIГ, Рыбалко А Е Унификация технологии позу меняя безвирусного исходного материала дтя интродуцированных цветочных фитоцено зов//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственныхфнтоценозов Тез докл регион совеш Кишинев 25-26июня 1986 г Кишинев Минжилкомхоз МССР, 1986 С 125-12о
46 Рыбалко АЕ Се шванова ВВ, Коев Г В Опыт оздоровления хризантем от комплекса виру сов У1етодом культуры ткани//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов Тез докл регион совеш Кишинев 25-26 июня 1986 г Кишинев Минжилкомхоз МССР 1986 С 107-108
47 Рыбалко А Е Ресурсосберегающая биотехнология оздоровления цветочных растений от виру сов//Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (13-15 октября 1986 г, Пущино) АН СССР Научный центр биологических исследований Пущино 19866 С 198199
48 Харута Л Г, РындинаН А Рыбалко А Е Организацияпроизводства сывороток для У1ассовои диагностики виру сов в оздоровленных цветочных фитоцено зах//Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов Те з докл регион совещ Кишинев 25-26 июня 1986 г Кишинев Минжилкомхоз МССР, 1986 С 116-117
49 Рыбалко А Е Оздоровление и клональное ушкроразмножсние цветочно-декоративных растений Обзорная информация, М ЦБНТИ Минжилкомхоза РСФСР, 1987 - 47 с
50 Рыбалко А Е Организация угассового производства имУ1Унодиагностикууюв для вирусологического контроля в цветочных фитоценозах//Биология культивируемых клеток и биотехнология Тез докл между нар конфер т2 Новосибирск 1988а С 308
51 Рыбалко А Е Массовое производство безвиру сных угериклонов цветочных культур//Биология культивируемых клеток и биотехнология Тез докл между нар конф т2 Новосибирск 19886 С 378
■>2 Рыбалко А Е К легочная инженерия - принципиально новый элемент технологии производства растительной продукции//Актуальные проблемы повышения эффективности АПК Тезисы докладов научной конференции Краснодарского филиала ВНИИС Краснодар 1988в С 50-51
53 Рыбалко Л Е , Кишко Я Г Рубан В И , Xapvra Л Г, Ковлун Ю П , Романов Н Н Толмачев А И Авторское свидетельство 448449, от I 09 1988г на изобретение "Способ полу чеши антисыворотки к вирусам цветочных растении"
"54 КоломиецТМ ХархтаЛГ Рыбалко А Е Биоуштрическая характеристика новых сортов рехюкгтантнои гвоздики в культуре irt vitro//
Biometricko-geneticke metody ve clechteni rostlin. Sbornik referatu IV. mezinarodniho vedeskeho symposia (Lednice 30.8-1.9 -1988). Brno, Lednice. 1988. P. 411-416.
55. Рудоминская С.И., Матюкова И.С., Рыбалко A.E. О нормативно-техническом обеспечении биотехнологий в растениеводстве//Программа "Качество". Проблемы и опыт. Тезисы докладов Всесоюзного совещания. Москва, Госстандарт СССР, 1988. С. 116-117.
56. Рыбалко А.Е., Рудоминская С.И. Стандартизация растительной продукции, разработанной на основе клеточной биотехнологии//Актуальные проблемы повышения эффективности АПК. Тезисы докладов научной конференции Краснодарского филиала ВНИИС, Краснодар, 1988. С. 64-65.
57. Харута Л.Г., Рыбалко А.Е. Микроразмножение промышленных сортов роз//Биология культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл. междунар. юнф. т.2. Новосибирск, 1988. С. 306.
58. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Кишио Я.Г., Рубан В.И., Петухова Н.П. Авторское свидетельство N1596530 от 1.06.1990 г. "Способ получения сыворотки для диагностики вируса крапчатости гвоздики".
59. Рыбалко А.Е. Способ получения оздоровленного посадочного материала in vitro. Авторское свидетельство СССР N1608845 от 22.07.1990г.
60. Рыбалко А.Е. Способ размножения орхидей в культуре ткани. Авторское свидетельство СССР N1693736 от 1990 г.
61. Рыбалко А.Е., Харута Л. Г., Оздоровление и микроразмножение орхидей//Экспресс информация, 1990, вып. 4(8), С. 10.
62. Рыбалко А.Е. Методическое обеспечение получения исходного материала для селекции на устойчивость гвоздики ремонтантной//Флора нижнего Дона и северного Кавказа: структура, динамика, охрана, проблемы использования. Тез. докл. науч.прак. конф. Ростов-на-Дону: Ростовский университет, 1991а. С. 124.
63. Рыбалко А.Е. Экономическая характеристика производства безвирусных мериклонов цветочных культур//Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 19916. С. 227-232.
64. Rybalko А.Е. Micropropagation of virus-free ornamentals in the USSR //Biotechnology in agriculture and forestry, Vol. 20 "High-Tech and Micropropagation IV", Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg, New-York, London, Paris, Tokyo, Hon Kong, Barcelona, Budapest, 1992 P. 427-447.
65. Kharuta L.G., Rybalko A.E. Promising selection of ornamental plants by in vitro techniques//Breeding, propagation, disease control of glasshouse flowers and other ornamental plants. Theses of the international symposium, Salaspils, Latvia, 3-5 -September, 1991. Salaspils, 1992, P. 24.
66. Рыбалко A.E., Караманян М.И., Харута Л.Г., Дворянинова И.Н. Размножение орнаментальных растений/Юбзорная информация. Институт экономики Академии коммунального хозяйства Госкомжилкомхоза России. 1992.
67 Pi,юл i ко А Е XapvTj Л Г Молю га ТА Малиновская Л П Скрыпаль И Г Раковская В И Сакалнева Д Получение реагентов для выявления ушкоплаш в культурных фитоценозах//Материалы научной конференции посвященной 100-летию открытия вирусов Д И Ивановским 2-о сентября 1992 г Ростов-на-Дону 1992 С 105-107
68 Рыбалко А Е Разработка систеу! массовой диагностики вирусов в
0 ¡лоров ленных цветочных фитоценозах//Материалы научной конференции, посвященной 100-летию со дня открытия в!фус0в ДИ Ивановским 2-6 сентября 1992 г Ростов-на-Дону 1992 С 104-105
69 Рыбалко А Е Опыт разработки комплекса приемов по оздоровлению растении от вирусов и внедрения его в народное хозяйство //В кн Защита растении в условиях реформирования агропромышленного комплекса экономика эффективность экологичность Тезисы докладов к Всероссийскому съезду по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995
1 ) С 81-S2
70 Рыбалко А Е , Харута Л Г Регенерация растений Ficus carica L из стеблевых верхушек //В кн "Биология клеток к\ льтивируеушх растений m vitro биотехнология и сохранение генофонда " Материалы международной конференции Москва 25-28 ноября 1997а С 461
71 Рыбалко АЕ Харута Л Г, Исстедования по оздоровлению и чикроразушожению культиваров дендратемы с различным содержанием эфирных масел //В кн "Биология клеток культивируемых растений m vitro, биотехнология и сохранение генофонда " Материалы международной конференции Москва 25-28 ноября 19976 С 504
72 Рыбалко А Е Харута Л Г, Разработка метода микроразмножения Steyia rebaydiana для получения генетически однородного посадочного умтериала //В кн "Биология клеток культивируемых растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда " Материалы международной конференции, Москва 25-28 ноября 1997в г С 459
Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической им. ММШемякит и ЮАОвчммииэва РАН Печать офсетная. Усл.пл 1,5. Тираж 120 эк». Заюэ №118
-
Рыбалко, Анатолий Евдокимович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1998
-
ВАК 06.01.11
- Биологические свойства вирусов вегетативно размножающихся цветочных растений, картофеля, ресурсосберегающая технология оздоровления
- Особенности технологии получения оздоровленного от патогенов семенного материала картофеля в условиях предгорной зоны Северного Кавказа
- Биологическое обоснование защиты от заражения вирусами оздоровленного семенного картофеля в Республике Татарстан
- Адаптивные особенности доминантных паразитарных комплексов на представителях порядка Liliales L.
- Научно-технологические основы оздоровления сортов картофеля от вирусов в условиях Приамурья
