Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР"

/(-28520

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ОДИНЕЦ Лея Григорьевна

УДК 635.9 : 632.38А/г : 616.07

ч РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

06.01.11 — Защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1987

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель — академик ВАСХНИЛА доктор биологических наук, профессор И. Г. Атабеков.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Ю. И. Помазков; кандидат биологических наук, доцент В. А. Шмыгля.

Ведущее учреждение — Главный ботанический сад АН СССР.

Защита диссертации состоится « & » &4А£сСе#. . . . 1987 года в <е/У> час. на заседании Специализированного совета К 120?35.03 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан «А» . *_*8АеА'А<,е2-. . . 1987 г.

Ученый секретарь ' У

Специализирован •••. о совета — кандидат ссиАс.со.хочяГ'ственных наук,

доце;, '.-7,7 / Н. К. Торянская.

, - I -ОШАЯ ХАРАКТШЕША РАБОТЫ-

Актуальность проблемы. Вирусные болезни нанося? немалый ушерб цветоводству. Они вызывают снижение урожайности, ухудшают. декоративные качества сортов, приводя их к вырождению, а иногда и к полной гибели растений.

Заражение часто косит комплексный.характер;, взывается группой вирусов и может привести к нерентабельности,той"или иной культуры.

Для-оздоровления.хронически зараженных вирусами культур применяются различные методы:- термотерапия, химиотерапия, • селекция-устойчивых сортов-и т.д. Наиболее широкое распространение в нашей стране получил метод культуры апикальной.меристемы. Однако, на практике не вое полученные из меристем растения свободны от вирусов.

Для полной элиминации вирусов в культурах.и достижения экономического эффекта в промышленном производстве безвирусного посадочного материала необходимо осуществлять надежный вирусологический контроль.

В последние годы широкое применение для диагностики. фитови-русов нашел метод иммуноферментного анализа (И8А). Достоинствами ША являются высокая чувствительность и специфичность. Современная автоматизация, хорошая наглядность результатов.делает данный метод чрезвычайно удобным для практики.

Получение; необходимых» •иымунодиагносгических реагентов для ША - антител к-вирусам цветочных культур, их конъгагатов с ферментами, поиск оптшильнкх условий для: тестирования растений - ак-тальные задачи на пути создании цветоводства'на безвируснсй основе.

^''г-ё» Еиблготекг .'"• • <чсчсЛ орагка "г:::;*а с .и .Лз>?£."аБ83. «анемия у-ч. К. Д. Ткяирязеса

. -'. Цель к задача работы. В задачу Исследования входило: "' I. Отработать методы выделения и очистки вирусных препаратов," получить" антисыворотки к наиболее распространенны и вредоносным ,;. • вирусам гвоздики ремонтантной, фр.езпи, хризантемы, тюльпанов, нарциссов и гладиолусов.

"•-; 2. Отработать условия проведения ИЕА с применением иммуно—,- ; перокснаазных конъюгатов для диагностики этих вирусов в растениях,' полученных из меристемы, на ранней стадии выращивания.

"'.; 3. Выявить оптимальные условия длл тестирования вирусов в различных органах растений.

,.,4.. Поставить' ряд производственных опытов для выявления возможностей USA при оздоровлении цветочных культур.

.'•' Научная новизна работы. Получены антисыворотки к вирусу пест-. ролепестности тюльпанов,, мозаики нарциссов и мозаики фрезии. ймму-'ноферментный анализ с применением пероксидазы из хрена в качестве фермента - маркёра "и субстрата - 5-аминосалициловой кислоты впервые :применен для диагностики вирусов цветочных культур. Оптимизированы условия для одновременного тестирования нескольких вирусов / .в одной пробе.

Практическая ценность -работы. Проведенные исследования показали, что чувствительность,'-специфичность"и надепнооть результатов ША позволяют осуществлять эффективный вирусологический контроль. Поэтому IBA может быть использован в работе меристемных"лаборато- . рий и цветоводческих хозяйств, • занимающихся,получением безвкусного посадочного материала.'

. . Метод одновременного тестированиях лсмопью-ИФА нескольких • вирусов в одной пробе, предложенный в работе, позволяет ускорить отбраковку растений, зараженных группой вирусов, а такие сэкономить затраты на проведение анализов. IBA может быть использован в качест-

ве экспресс-метода в работе карантинных организаций я в работе селекционеров при выведении новых гортов,устойчивых к вирусным заболеваниям.

Апробация работы . Материалы диссертации доложены на заседании кафедоы вирусологии МГУ им.М.В.Ломоносова 12.06.36.,на заседании кафедры фитопатологии и лаборатории защиты растений Московской с.-х.'академии им.К.А.Тимирязева 20.11.83 и на Всесоюзной конференции "Вирусы растений и микроорганизмов" в г.Ташкенте 10.10.86. •',"• Публикации. По материалам диссертации опубликовано. 6 работ. "";; Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста,включает 14 таблиц, 23 рисунка и состоит из введения,3 глав обзора литературы,5 глав собственных исследований' выводов и списка цитируемой литературы'включающего 182 работы отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДА

Вирус крапчатости гвоздики (ВКГ) выделяли из зараженных листьев гвоздики УаМ/ыИ, catetctpty&Qлметодом,описанным в работе ( Мо£&па£, $и»г& ,1965). Для выделения очищенных препаратов вируса желтой мозаики фасоли (Е\Пй) из листьев системно инфицированных конских бобов 1/2е-1а. /"аба. £. использовали модифицированную методику ( НиЫЛоа, ,1973). Вирус мозаики фрезии (ВМФ) выделяли из зараженных растений фрезии сорта Винтерголд, вирус мозаики нарциссов (ВШ) из нарциссов сорта Иатряа по методу (Новиков, 1982) . Для получения очищенного препарата вируса дестролепестности тюльпанов (ВШ1Т) использовали модифицированный метод Деркса { 0<2я&л 1982).

При выделении -шстого препарата вируса погремковостя табака из . литъез нерциссов сорта Голден Харвест использовали модифицированную методику (f/amigm' ,1970). Очищенный препарат вируса огуречной мозаики (ВОМ) выделяли из зараженных растений <0со£а*ъа, Ж&пс%а, & по методу Лота (1Л., 1972). Вирус аспермии томатов . (ВАТ) выделяли из листьев'заракенных растений лёо&ллл- £eJ&««M.i£. 5/шъи*ь 47/10' по методике, описанной в работе (Дзлркале, Родионов а, 1977). В-вирус-хризантем СК8Х) выделяли из листьев зараженных растений t/Kco&&*A, e&*w^asu&: &саи.. используя модифицированный метод Ортеля ( &леС ,1939).

Чистоту полученных вирусных препаратов определяли спектрофото-метрически по отношению',поглощения при длинах волн 230 л 280 нм, а . также методом электронной микроскопии. Препараты контрастировали IjS-ным уракилацетатом рН 5,0 и исследовали под электронный микро-' окопом " Hitachi, " (Япония), при инструментальном увеличении X 50 000.

• Антисыворотки к вирусам получали иммунизацией кроликов, используя различные схемы. В .большинстве случаев животным вводили подкожно г- 10 точек вдоль хребта 0,25 мг вируса в 0,01 К калий-фосфатном буфере, рН 7,4 (ФБ), смешанном с равным объемом адъю-• ванта Орейнда. Повторно через месяц вводили 0,1 мг антигена, после чего"на 7-11-е сутки брали кровь. Титр полученных антисывороток . определяли методом двойной иммуподифсЕузии (ДВД) и непрямым методом ВЗА, схема которого представлена на рис.1.

. фракцию иммуноглобулинов из антисыворотки выделяли методом двухкратного осагдения 20л-ным.водным раствором ГОГ 6000. Кояъюгат иммунно'глобулинов с пероксидазой хрена (ШО "Биолар", г.Олайне.Лавт. ССР) получали методом периодатного окисления ( И4&&*и1 \/%£алс- ,1978),

I ^ Адсорбция антигена Отмывка

Адсорбция специфических антител Отмывка

Взаимодействие антивидсвкх-меченных ферментов антител с антителами, связанными с антигеном

Отмывка

Взаимодействие кояыогага о субстратом

Ш

17 о« • Е°1

Рис.1. Схема непрямого метода ИВА:

J&L Адсорбция антител. Отмывка

П Взаимодействие антител с

антигеном.

Отмывка

Взаимодействие антигена о конъюгатом

Отмывка

Взаимодействие конгагата с субстратом

?ис . 2 . Схема " "сэндвич" - метеда -К5А-

'Для проведения иммуноферментиого анализа использования микроплаты Ссокэ J.29, AR (ngW&c4 ".Швейцария). Вирусы в очищенных препаратах и растительных экстрактах определяли.в соответствии' с "сэндвич" - вариантом ША (рис.2)._Адсорбцию иммуноглобулинов на . поверхности микроплат проводили в течение 18 ч при 4°С. Несвязав-шиеся иммуноглобулины отмывали триады ФБ с 0,05« тритона Х-ЮО(ФБТ).

Анализируемые образцы - вирусные препараты и растительные_экс-тракты - разводили в ФБТ и сорбировали в лунках микроплат в течение I ч при 37°С. После отмывки в лунки добавляли по 0,2 мл конъгагата, :. 'растворенного в ЖГ и инкубировали I ч при 37°С. Затем мккроплаты отмывали ФЕТ и вносили субстрат - смесь 0,0015/5 Н202 и 0,08$ 5-ами- .-носалицилозой кислоты. Оптическую плотность продукта пероксидазно- ,,, го окисления оценивали на вертикальном абсорциометре п PynaJec/i " (Швейцария) при 4S0 нм через 30 мин после добавления субстрата. • • ..Чувствительность ISA - теста определяли по калиброзочной кривой, отражающей изменение оптической плотности продукта ферментативной реакции при уменьшении концентрации определяемого объекта Ц (вируса илл антител) в растворе. Уровнем фона реакции считали усредненное значение оптической плотности ферментативной реакции нес-. кольких отрицательных контрольных проб.' •

\ При анализе растений методом ША больными считались те, у которых оптическая плотность в образцах превышала фон более чем в 2 раза.

•При постановке.теста на растениях использовали экстракты из литьев, цветков, луковиц, растертых с СЙТ в отношении 1:10 (вес: . . обьем). Для анализа пробирочных керистемных растений экстракт получали следующим образом. Лист пробирочного растения осторожно отламывали пинцетом в стерильных условиях и помещали в лунку мккроплаты. Затем его раздавливали стеклянной палочкой и добавляли 0,2 мл СБТ. ".

Производственные опыты по выявлению.возможностей ISA при оздо-

ровленкЕ щхишшленно важных цветочных культур - гвоздики, фрезии и хризантемы, проводили на с/х предприятии "Меристемные культуры" Г.Огре Латв.ССР совместно с сотрудниками предприятия - А.М.Уюка-уре, Л.Ф.Вилцане, И.Я.Жолой.

•['■ РЕЗУЛЬТАТЫ К 0БСУ2ДЗНИВ

I. Выделение очищенных препаратов вирусов декоративных культур и получение к ним антисывороток

Результаты выделения: и очистки вирусов декоративных культур показали, что в «наибольших количествах выделяются те вирусы, которые были накоплены на растениях - накопителях. Так, например, валовый выход ЕВХ составлял 50-140 мг из I кг листьев Жсо^йпси с&ъб&я-кЖ'л (§t&tf. , для вируса асперыии томатов, выделенного из листьев JH'cokcwO- c&t&ftfSu- "% • - 25 иг, валовый выход вируса желтой мозаики фасоли - 10-25 мг из I кг листьев л й л уэ/д £

'Вирусы, выделенные непосредственно из листьев поражаемых ют : цветочных культур; были получены в гораздо меньших количествах. Валовый выход ЕМС составил 4 мг из I кг листьев $резкп, ВШТ был выделен из I кг листьев тюльпанов в количестве 2,5 кг, BNH - 1,5мг из I кг листьев нарциссов. Исключением,был ВКГ, выделенный из I кг • зараяенных листьев гвоздики в количестве 100 кг. V Характеристика очищенных препаратов вирусов с по\:ощыо спектре— фотометрии и электронной микроскопии показала, что полученные препараты не содержат посторонних примесей и гомогенны по морфологии. частиц. Величины Д230/280 д л я в с е х вирусов хорошо согласуется с литературными данным. '

Использование для иммунизации животных высокоочшцеиных вирус -ных препаратов позволило нак получить высококачественные иу.яунпые сыворотки для диагностики вирусов ВКГ, ВАТ, ВОТ, ВПГГ, ВГ,;5, ВИТ,

ВШ, ЕВХ методом иммуноферментного анализа. Полученною антиснво-ротки обладали высокий титрами - от 3-10° до 3*10 (по данным непрямого анализа и&А) и не давали перекрестной реакции о гетеро-логичными антигенами и экстрактами пз здоровых растений, что доказывает их высокую специфичность.

2. Разработка и оптимизация условий индикации вирусов декоративных культур методом ША

. При разработке и оптимизации условий индикации вирусов методом ША нами были подобраны оптимальные концентрации иммуноглобулинов для сенсибилизации микроплат и концентрации конъюгатов для выявления вирусов в пробах. Было показано, что для чувствительного определения антигенов достаточно покрывать-мЕкроплаты раствором иммуноглобулинов с концентрацией 1-3 мкг/мл. Оптимальными концентрациями конюгатов для большинства вирусов были концентрации 2,5-5 мкг/мл (рис.3).

Увеличение концентрации конъюгата выше 10' мкг/мг отрицатель. но сказъшалось на результаты ША, так как при этом резко возрастал уровень Оона в реакции .с экстрактом из листьев, здоровых растений • • '.(рис.4). . ;

Сравнение двух субстратов-для пЛроксидазы - ортофенилен-диамина и 5-аминосалициловой кислоты, показало, что чувствительность "сзндвич"-варианта Шк повышается о использованием ортофе-нилендиамина примерно в 10 раз, однако, фон также возрастает примерно в 3 раза. По этой причине, а также из-за отсутствия достаточных количеств высокоочищенного ортофенилевдиамина, для массовых анализов нами использовалась 5-аминосалЕциловая кислота отечественного производства. При выборе оптимального способа блокировки свободных, не занятых С/у& участков твердой фазы, с целью ски-

1,2 1,0

0,8

0,3

0.4

0,2

0,3

1,2

5,0

20

Концентрация конъгагата

» - ч Р и о. З . Определение оптимальной концентрации конъгагата при разных дозах антигена в пробе I -3 мкг/кл (концентрация антигена), :'•.' "; . 2"'- I мкг/мл;- S - 0,3 мкг/мл; 4 - 0,1 мкг/мл

жения фона ферментативной реакции было установлено, что оптимальным способом является добавление 0,2% бычьего сьшороточного альбумина в раствор кон'шгата.

;i; .: Сравненир.трех методов ША ("прямой", "непрямой", "СЭНДВЕЧ") показало; что наибольшей чувствительностью обладает "сэндвич" -вариант (рис.5). Чувствительность "сэндвич" - варианта Шк при Определении большинства вирусов декоративншс культур з очищенных препаратах составила 10 нг/мл.

При определении вирусов в экстрактах из листьев различиях декоративных культур было установлено, что кошонентк адоровюс

• -разведение экстракта из листьев здорового растения

,Рис.4. Влияние • концентрации коныэгата на величину фона. ."•" Концентрация кокъвгата: 1-20 ккг/мл; 2-10 мкг/мя; 8-5 ккг/мл; 4 - 2,5 мкг/мл; 5 - 1,2 ?,жг/мл "*Ч90 м ,0'' .,'■; '■'

концентрация вируса (кг/мл) •PsicvS. Сравнение прямого, непрямого и'"сэндвич" -методом IBA при определении ВКГ в очищенном препарате: I - "сэндвич" - метод; 2 -непрямой метод;-3 - прямой метод; 4 - контроль (ВТМ)

клеток тестируемых растений, прпсутствующЕе в яеосветленных экстрактах несущественно влияют на чувствительность "сэндвич" - варианта ИА (рис.6).

0*490 1.4

1,2 . 1.0 0,8 0,6

0,4 0.2

разведение листового экстракта Рис6. Определение ЕКГ в листьях гвоздики "сэндвич". - методом

4 ЖА I - осветленный низкоскоростным центрифугированием , экстрскт; 2 - неосветлённый экстракт; 3 - контроль

Величина предельного разведения для разных культур при индикации в них вирусов методом ША различалась в заБксигости от определяемого вируса. Так, например, ЕАТ и КМ определяли в листьях хризантем в разведениях экстракта до Ю-4. ЕЕХ определяли в тех же листьях в разведениях экстракта до 10 , это свидетельствует о более высокой концентрации ВЕХ в листьях хризантем. ВПЛТ, ВШ.ЕПТ,: : ЕКФ и ВИФ присутствуют в листьях поражаемых или культур в.очень низких концентрациях, так как предельное раззедение экстракта при

их определении - 10 .

С целью тестирования меристемных растений гвоздики, фрезии и хризантем на стадии их выращивания в пробирках была проверена возможность использования,для их анализа грубых растительных экстрактов, полученных растиранием листьев с буфером непосредственно в лунках мккроплат для ИЕА При тестировании контрольных выборок пробирочных растений гвоздики и хризантем отдельные листья одногЪ и того же растения не. тлели существенных различий в оптической " плотности.Табл.1. На основе этого был сделан вывод, что использо-више груйого листового экстракта в качестве образца не влияет на

достоверность метода. • „_,'•• •'«.

• • Таблица I

Результаты проверки на зараженность ВКГ контрольной выборки пробирочных растений методом ША

Номер растении Оптическая плотность при 0Д490

I лист (верхний) П лист (средний) Ш лист ( НИЖНЕЙ!)

I 0,03 0,03 0,00

. 2 0,08 0,08 0,07 .

3 0,41 0,31 0,34

4 0,04 0,03 о.о8 ;'.

5 0,22 0,22 0.15

6 0.88 0,51 . 0,30

7 0,39 .0,17 0,20-

8 0,27 0,19 0,17

9 0,33 0,29 0,22

10 0,03 0,07 0,03

Были установлено, что ВКГ одинаково успешно определяется в верхних, 'средних и нижних листьях пробирочных растении. Для опре-

деления вирусов хризантем (ВВХ, ВАТ, ВОМ)лучше использовать верхние листья, так как было установлено, что в них более высокая концентреция вирусов.

; , ., О неравномерном распределении вирусов в органах растений фреэии и тюльпанов свидетельствовали результаты анализа 1МФ в листьях и цветах фрезии'в0 время цветения, а. также результаты определения ВПЛТ в различных органах,тюльпанов. Было установлено, ч?го найбольпая концентрация БМ8 во время цветения фрезия наблюдается в лепестках,цветов. Перед цветением наибольшая концентрация вируса в листьях..Следовательно, оптимальными сроками для вы-'Й-раковки больних рестениЗ будут сроки их выращивания перед, цветением. . ' . '

Определение ВПЛТ показало,- что во время цветения тюльпанов концентрация вируса в'листьях.ниже, чем в лепестках и пестиках. • Вцсокая концентращш ВПЛТ отмечена в луковицах. При анализе, луковиц было замечено, что использование свежеприготовленных экстрак-. тов в невысоких разведениях приводит к ложноотрицательным реах-. циям. По-видимому, это объясняется икгибиругащим влиянием слизистых веществ, присутствующих в луковицах на реакцию антиген-антитело в ходе ХБА Ранее было показано, что добавлениемферменгоя, разрушающих слизистые вещества, таких как целлюлаза, гемицелдалаза и • -пектпназа мояно добиться успешного определения бессимптомного вируса лилий в луковицах тюльпанов ( лгу.е,гЗ&гасп-г филе , ' • ,1980).

Нами такяе было установлено, что добавление целдюлазы к луковичным экстрактам способствует определению ЗГИТ. Было замечено.что в контрольно:! реакции, когда экстракты инкубировали без добавления фермента в течение такого же.времени (18 ч), пнгибирутащий эффект слизистых веществ исчезает.. ' • '

8. Практическое применение метода ША в производстве без- V .вирусного*посадочного материала гвоздики, Фрезии и : • хризантем. .-ч/.-'- V

На базе с/х предприятия "меристемные культуры" г.Огре за;'". период с ,1982 по 1984 гг. для определения зараженности пробирочных растений гвоздики было проведено 17 тысяч анализов. В табл.2 представлены результаты трех последовательных проверок растений

Таблица 2

Результаты проверки меристекной гвоздики поколения МО из безвирусных" (I группа) и вирусных по ДВД Ш группа) .'.'..'. черенков методом ГОЛ

• Время проверки ч Число проверенных растении Процент больных растений

I П группа группа I П группа группа

В пробирочной стадии,перед высадкой в горшки Спустя месяц после пересадки в горшки, перед первое прищипкой •, Через 3... 5 месяцев, перед пересадкой в горшки большего размера 3583 238 3387 94 3544 56 20,4 53,4 1,1 15,9 0,27 2,8

поколения Мо, полученных при резке меристемы из вирусных и безвирусных (по данным двойной иммунодиффузии) черенков. Данные таблицы 2 свидетельствуют об эффективности проверти черенков перед вычленением меристем. Процент больных растений среди меристемной гвоздики поколения Мо более чем в 2 раза ниже в группе растений, полученных из предварительно проверенных черенков. При повторных проверках процент зараженности в этой группе растений снижается от 20,4/5 до 0,27$. Полученные данные свидетельствуют об эффективности использования метода ИА при оздоровлении гвоздики меристем-

, '"-.'•: . - 15 -

ним способом. Незначительное количество больных растений (0,27>) в повторннх проверках, по-ввдимоку, объясняется тем, что часть ака-' лизов на данном предприятии вначале проводилась визуально. По на' тему мнения, тщательная выбраковка слабозараженных растение методом ША возможна только при использовании фотометров.

Метод И5А применяли также для индикации ЕМФ к В2МФ в расте-. ниях фрезии, полученных в культуре апикальной керистеья. Проверку растений фрезии "на зараженность ВЕМФ и ВШ& проводили в производственных условиях в течение пяти месяцев (декабрь-апрель).

Оценивая зараженность • 1МФ растеши фрезпн внутри одного клона (потомства от одной луковицы), мы проверили каздое растение в 103 •: клонах сорта Маттерхон. Результаты ISA позволили разделить весь

материал на две группы: зараженные клоны (все без исключения рас... тения этой группы содержали вирус) и здоровые, клоны (во всех растениях этой группы вирус не обнаруживался). Из 103 клонов 30 было л заражено. Однозначность результатов проверки всех растений внутри •каадого клона дает основание полагать, что при массовой диагностике .достаточно проверять по одному растения от-каждого клона.

Определение зараженности ВВХ растений хризантем на стадии их пробирочного размножения показало, что процент зараженности растений на этой стадии невелик- 5,8-14,755. При сценке зараженности •хризантем в возрасте I года, выращенных из непроверенных ША мери; стемных пробирочных растений, процент зараженности гораздо выше и для отдельных сортов достигает 100*.'Это свидетельствует о том,что метод культуры апикальной меристемы'без сочетания с системой диагностики не дает'желаемого эффекта оздоровления от вирусных болезней.

4. Применение имцуноФерметаиого анализа для выявления устойчивых к впрусним болезням сортов декоративных ' культур

,0 помощью И$А на с/х предприятии "Мерпстемные культуры"* : Г.Огре Латв.ССР были,проанализированы 27 сортов фрезси. не приоут-; ствие ВМ я ВЖФ. Оказалось, что в зависимости от окраски цветка,

сорта по-разному поражены вирусами. Еелтые сорта: Винтерголд,»Тол-• ден Мелоди, Амазон и белый сорт Диана сильно поражзнн БМ (80-90$), в то'время как синие и красные сорта заражены в меньшей степени " .(2-15Й). ШМФ обнаружили только'на пяти"сортах. Практически пол- ' ностью поражен пурпурный сорт Рубина,, другие же: фэнтази, Адонис, , Кзарда, Розалпвда'-' только на 1-2$. Некоторые сорта фрезии совсем „ не"содержали вирусов. К ним относятся: Мойя, Миранда,"Блу Океан,. гПрошненс. ..;.:•;:,.• • "'л. :'C-''-"\.L •" ":\v; ';ч:'Ч\>;'. "',.'• Нами был проведен анализ на зараженность. ЮМ листьев разных .сортовгладиолусов, присланных из Ботанического сада АН БССР.Из-вестко, что сорта гладиолусов делятся по своей поражаемое™ ВОМ .на;три группы: cHffi>Hcno-pojEae.vKe (пораяенность от Ы до 100$). сред-.., непораяаемые (от 21 до Ь0%) и слабопоражаемые (от 0 до 20%) (Вой-нило,1984).

Результаты проверки сортов гладиолусов из этих трех групп показали, что существует корреляция медцу поражаёмостьш сорта и концентрацией. вируса в листьях. Так, наибольшая концентрация ВОМ была. 'отмечена при анализе сильнопоражаемых сортов Флос Флориум и Джон Мэисфидд (величина 0Д 490 достигла 1,32 о*.е1). При анализе слабо-пораженных сортов Помпеи и Эрне россе значения ОД450 были близки к величине фона (0,1 о.е.), что свидетельствует об отсутствии ви- ' руса и устойчивости этих сортов к ВОМ.' : ." ;

; :: В Ботаническом саду АН Лат.ССР среди сортов,.нарциссов без приз- -

наков мозаики были отобраны по данным ША два здоровых сорта: Данте и Инглескомби, так как в результате их анализа 0Д490 0, 18 о.е. Остальные сорта: Пассионале, Балликастель, Леди Бед, Рембрант, несмотря на отсутствие признаков шзаики все гее содержали ВШ в низких концентрациях (ОД4эо 0,4-0,5 о.е.).

При изучении зараженности тюльпанов в коллекционных посадках НИИ Горного садоводства и цветоводства г.Сочи нами были отобраны сорта без проявления.пестролепестности, такие как Орпентал Быоги и Аппельдорн Элит. Данные ИМ подтвердили отсутствие БШТ в листьях тюльпанов этих сортов.

Обследование с помощью ША 175 сортов хризантем в Ботаническом саду АН МЕР позволило выявить следующие вирусы: ВВХ, ВАТ, ВОМ, ХВК. Среди 83 проверенных сортов крупноцветных хризантем безвирусными оказались только 2 сорта - Вестланд Дарк, Роз Адер. Из 83 сортов мелкоцветных хризантем не содержали определяемых вирусов .сорта: Пошита, Белая Ромашка, Сумерки, Невеста. .

.Несомненно, требуются дальнейшие эксперименты для доказательства устойчивости к вирусной инфекции отобранных нами сортов $ре-зии, нарциссов, тюльпанов, хризантем, гладиолусов. Однако, становится очевидным, что метод ИФА, благодаря высокой чувствительности, экспрессности и надежности результатов может бьпь чрезвычайно полезен в ускорении решения проблемы поиска устойчивых к вирусным болезням сортов. " •

5. Оптимизация условий для комплексного (одновременного) тестирования растений на несколько вирусов

Нами были проведены эксперименты по оптимизации условий для одновременного определения нескольких.вирусов на одном растении с помощью ИФА. Сущность метода состоит в том, что при поста-

• ••"-18 -'„ " о

л новке "сэндвич" - варианта, ША на поверхности микроплат адсорбируют смесь антител к определяемым вирусам. Концентрация каэдого .;.' .типа антител равны. Затем вносится образец, представляющий собой • • набор вирусов.

Обрезовавшиеся не поверхности микроплат комплексы антигенов о антителами взаимодействуют с соответствующими им'мечеными анти.' телами (конъюгатами), также добавленными в смеси в равных долях. После внесения в лунки микроплат субстрата по развитию окраски можно судить о наличии одного или нескольких вирусов, а также об их отсутствии, если окраска не развивается. •;';.'.' ; '

При проверке растений таким способом нельзя узнать какими . именно вирусами они заражены, но можно отобрать не содержащие определяемых вирусов растения.

На вопрос о том, как будут зависеть результаты Шк от числа .определяеашх вирусов мы попытались ответить.при помощи следующего Л эксперимента с вирусами хризантем: ВВХ, ВАТ, BOM, ХВК.Л

. Для этого на поверхности микроплат -. сорбировали четыре воз-/-'' ыожные комбинации и;л"луношобулиноз (И) к этим вирусам, то есть • HJ,'.HJ,+ Kj, Kj + llj + 1Л; Hj + И> + Ил + И4. Далее, в лунки пок-рытые.такими кабораул антител вносили следующие комбинации вирусов (В): Bj, Bj + Вз, Bj + Bg + 33, 3j * Bg + Bg + B4. Кояыогаты иммуноглобулинов с пероксидазой (К) такхэ добавляли в комбинациях: Кх, Kj + iij, Кт + Ко + Ко, Кт + Kg + Ко + К*.

::; Максимальная суммарная концентрация иммуноглобулинов была рав-'на 4 мкг/мл, так как для каэдого вирусе в отдельности оптимальная концентрация составляла I л:кг/мл. Было решено добавить конъго-

•гаты в максимальной суммарной концентрации не более 5 мхг/мл, тек как ранее было показано, что с увеличением дозы коньпгата возрас-

':•••; - 19 -

тает фон (рис.4). Вирусы смешивали перед нанесением в лунки в трех концентрациях - 0,5. 0,05.и 0,005 икг/мл.

В результате такой постановки эксперимента наиболее интенсивная окраска развивалась в тех случаях, когда Б] определяли в системы I: %, К] и когда Б] + Bg + В3 +'В4 определяли в системе ЗУ: % + 1^2 + т + И4, К + К? + Кё +К4-

Для концентрации Б] - 0,5 мкг/кл 0Д 49 0 была равна 1.07 о.е. в системе I, и для концентрация Б].- 0,005 гжг/мл -.0,25 о.е.; в системе 1У - 1,9 и 0,47 о.е.- соответственно.

:. Оптическая плотность при определении одного вируса 13ц в тех зе концентрациях в .системе ЗУ резко снизалось до 0,37 о.е. и 0,08 о.е.

. Результаты проверки в системе ЗУ нескольких отобранных нами ранее сортов хризантем, различающихся по количеству выявленных в них вирусов, представленные в табл.3, теклсе показали, что определение-одного вируса в системе ЗУ мозг.ег быть затруднено.

.. . , . Таблица 3 Результаты одновременного тестирования четырех вирусов в растениях хризантем методом КМ

ш1 пп Сорт' . Количество выявленных нами вирусов ^ д0 при определении каждого виоуса в отдельности од4эо "Р" одновременном определении вируса

ВЗХ ЗАТ ВОК ХВК

I. 1-1еллсу Спайдер • 4 ;•' 1.1' 0,84 0,7 0,47 0,33

2 . Делайт 3. , 1,0 '0,95 0,35 0,13 0,58

3 . .Меф белый 2 0,95 0,75 0,2 0, '17 0,51

4 . Ледрссть I 1,3 0,2 0,15 0,17 0,73

5. Вестланд Дарк ' • С / 0,18 0,13 0,17 0,08 0,09

• . _ 20 -''••: ' Из результатов, представленных в- табл.3 видно, что для определения вирусов в сортах хризантем, зараженных четырьмя, тремя к двумя вирусами вышеописанный способ одновременного тестирова- . ния четырех вирусов мокет успешно применяться. Безвирусное рас-: тение Вестлакд Дарк в результате, анализа дает такое же низкое показание 0Д,£ф, как и при тестировании его в системах, рассчитанных для определения одного вируса. Однако, растение сорта Мадам Альберт. Лебрук, зараженное только одним вирусом ВАТ, хотя ив высокой концентращш (0Д49Л = 1,1 о.е.) при использовании для его проверки смеси Улб и конъюгатов к четырем вирусам стало трудно отличимо от здоровых, так как оптическая плотнооть в результате анализа стала 0,24 о.е.

Причиной этого, по-видимому, явилось то, что концентрация коныэгата к ВАТ, в приготовленной смеси конъюгатов к какому вирусу с суммарной концентрацией 5 мкг/мл стала 1,25 мкг/мл, то есть ниже, оптимальной (5 мкг/мл для ВАГ).:

В случае использования более активного коньюгата к ВЕХ с оптимальной концентрацией 2,5 мкг/мл, то есть близкой к той, которая имеется в смеси, растение сорта Щедрость также зараженное.одним вирусом - BBS в высокой концентрации (0Д490 = 1,5 о.е.) успешно определяется как больное, так как оптическая: плотность в результате его анализа остается высокой (0,73 о.е.);';,\.

Для того, чтобы узнать как влияет число иммуноглобулинов и конъюгатов в диагностических смесях на определение одного вируса мы проделали вышеописанный эксперимент увеличив число компонентов : реакции до 8. При определении одного вируса ВКГ в системах с уве-. 'личивагащимся количеством конъюгатов,и антител в смеси было уста-* !-• новлено, что при смешивании высокоактивных конъюгатов в концентрациях ниже их оптимальной в 2 раза (1,25 мг/мл) возможно исполь-

- 21 - "

зовать смеси всех 8 компонентов. В случав смешивания конъюга-тов в их оптимальных концентрациях (2,5 мкг/мл) и выше,увеличивается фон в контрольной реакции о гетерологичным вирусом ВПТ.и это мешает определения ВКГ в низких концентрациях. Наибольшим числом компонентов для этого случая является 4,так как суммарная концентрация хонютатоъ тогда не превышает 10 мкг/мл.

Возможно,для массовых анализов в условиях производства .безвирусного посадочного материала рационально было бы вначале определять зараженность смесью конногатов к наиболее распространенным 2-3 вирусам, а затем отобранные свободные от этих вирусов растения подвергать дополнительному анализу используя смеси пмууногло-булинов и конъюгатоз к более редким вирусам.

ВЫВОДЫ

I. Выделены очищенные препараты вирусов: ВКГ,ВАТ,ВОМ,В«Э, ВЖФ,ВПЛТ,ВМН,БПТ,ВВХ, поражающих цветочные культура и получены высокоспецифичные антисыворотки для их определения.

. 2 . Получены иммунопероксидазные конътагаты для диагностики ряда вирусных болезней цветочных культур методом JE5A

3. Найдены оптимальные условия для индикации вирусов методом ША в растительном материале: листьях, луковицах, цветках и определены оптимальные сроки тестирования.

. 4. Показана возможность применения ША для отбраковки зараженных растений,полученных из меристем,на стадии их размножения в пробирках.

5. Применение IBA для осуществления вирусологического контроля в условиях промышленного производства безвирусного посадочного материала позволя ет быстро достичь почти полной элиминации вирусов в культурах. •

6. Установлено, что метод Шк может быть полезен для выявления устойчивых к вирусным болезням сортов цветочных культур."-

7. Найдены оптимальные условия для одновременного тестировав -ния нескольких вирусов в одной пробе. ••- .

Список работ, опубликованных по материалам диссертации: .-•'. •

:: I. Сравнительное испытание иммунологических методов для мае-., совой диагностики вируса крапчатости гвоздики / Одинец А.Г., Ку-Ч линия А.В., Чирков С.Н., Козкцкгй Ю.Н., Атабеков И.Л/Сельскохозяйственная биология. - 1983. - И 5. - С.37-41. ,

' ', 2. Еола И., Ушкауре А., Одинец А..Применение иммуноферментно-го анализа для ранней диагностики вируса крапчатости меристемной гвоздики в пробирках/'Труды ЛСХА - 1985. - Вкп.222. - С.39-45.

. 3. Диагностика вирусов яелтой мозаики фасоли и мозаики фрезии методом иммунолеру.ентного анализа/Одпнец А.Г., Бойков СБ., Вилца-неЛ.Ф., Атабеков И.ГЛ'Сельскохозяйственная биология. - 1985. -№ П . — С.39-42.

4. Одинец А.Г., Атабекова Т.Н.," Атабеков И.Т. Диагностика вируса огуречной мозаики методом пммуноферментного анализа/доклады ВАСШСТ. - 1984. - Я 7. - С.19-21.

5. Одинец А.Г., Копылов С.С. Диагностика вируса пестролепест-ности.тюльпанов методом иммуноферментного аначиза/УСельскохозяйст-венная биология. - 1983. - № 9. - С.55-60.

6. Одинец А.Г. Диагностика вируса мозаики нарциссов и вируса погремковости табака в нарциссах методом иммуноферментного анализа/' Тезисы докладов на региональном совещании "Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозев", Кишинев, ' !98в. - С.88-89.

\

Л-57612 26/1-87 г. Объем 1'/г п. л. Зак. 316. Тир. 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., д. 44