Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Оптимизация процессов регенерации при размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши in vitro
ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство
Автореферат диссертации по теме "Оптимизация процессов регенерации при размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши in vitro"
На правах рукописи
МАТУШКИНА Ольга Васильевна
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ ПРИ РАЗМНОЖЕНИИ КЛОНОВЫХ ПОДВОЕВ И СОРТОВ ЯБЛОНИ И ГРУШИ IN VITRO
Специальность 06 01 07 - плодоводство, виноградарство
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук
"НИР
Мичуринск- 2008
Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства им. И В Мичурина» Россельхозакадемии
Научный руководитель:
кандидат сельскохозяйственных наук ^Туровская Нина Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор сельскохозяйственных наук, профессор
Деменко Василий Иванович
кандидат сельскохозяйственных наук Минаев Вадим Александрович
Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-
исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им И.В. Мичурина Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится 24 апреля 2008г. в_л£часов на заседании диссертационного совета Д 220 041 01 при Мичуринском государственном аграрном университете по адресу: 393760, Тамбовская обл, г Мичуринск, ул. Интернациональная, 101
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мичуринского государственного аграрного университета, а с авторефератом на сайте университета http //mgau, ru/
Автореферат разослан «¿¿У> cM^l/t^n^rZ^ 2008г
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д 220 041 01 кандидат сельскохозяйственных наук Соломатин Н.М
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы В условиях интенсификации садоводства и ухудшения экологической ситуации все большее значение приобретает разработка эффективных технологий производства оздоровленного высококачественного посадо1 ного материала и создания адаптивных форм и сортов растений с использованием биотехнологических приемов Внедрение этих приемов в садоводство позволяет не только повысить морфогенетический потенциал маточных и плодоносящих насаждений, значительно ускорить создание новых генотипов с хозяйственно - ценными признаками в короткие сроки и толерантных к неблагоприятным факторам среды, но и повысить эффективность отрасли в целом
В большинстве стран (США, Италии, Великобритании, Голландии, Новой Зеландии, Франции) производство по выпуску оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур с использованием метода кло-нальною микроразмножения поставлено на промышленную основу и очевидна тенденция по увеличению такого посадочного материала в дальнейшем Однако в нашей стране размножение многих видов растений остается в основном на лабораторной стадии К тому же индивидуальная реакция генотипов при размножении в культуре изолированной ткани проявляется значительно сильнее, чем при традиционных способах размножения Условия культиЕирования, разработанные для одних форм и сортов, не всегда могут быть использованы для размножения других
В связи с этим, совершенствование основных технологических приемов in vitro, поиск общих закономерностей морфогенеза плодовых растений с учетом их биологических особенностей, повышение уровня их регенерацион-ного потенциала, технологичности и эффективности цикла размножения позволит повысить практическую значимость метода клонального микрораз-множеиия и дает возможность использовать его, как в системе производства оздороЕ ленного посадочного материала, так и селекции
Целью исследований явилась оптимизация отдельных этапов технологии клонального микроразмножения клоновых подвоев и сортов яблони и груши и разработка эффективных методов регенерации из соматических тканей
В связи с этим решались следующие задачи
- разработать наиболее эффективные приемы регенерации из меристе-матичес ких верхушек,
- оптимизировать химические факторы культивирования in vitro, обеспечивающие максимальный уровень регенерации на этапе собственно микроразмножения,
- изучить роль сортовых и родовых особенностей при микроразмножении in vitro,
- эпределить возможность длительного хранения in vitro,
- оценить морфогенетический потенциал изучаемых подвоев и сортов яблони и груши и разработать эффективные способы индукции адвентивного органогенеза,
- дать оценку экономической эффективности выращивания клоновых подвоев яблони с использованием метода m vitro
Научная новизна Изучен регенерационный потенциал яблони и груши на протяжении 10 пассажей
Определено оптимальное сочетание регуляторов роста в питательной среде на этапах введения в культуру in vitro и собственно микроразмножения Предложены приемы, улучшающие качество микропобегов, значительно снижающие уровень витрификации и увеличивающие степень пролиферации Впервые установлено положительное влияние антиоксидантов, снижающее ингибирующее влияние фенолов на этапе собственно микроразмножения, улучшающее качество микропобегов
Показана возможность длительного (до 6 месяцев) хранения плодовых растений при пониженных температурах с последующим включением в технологическую цепочку размножения
Дана оценка морфогенетического потенциала соматических тканей подвоев и сортов яблони и груши и проведено сравнительное изучение реге-нерационной способности адвентивных и пазушных побегов
Практическая значимость работы Совершенствование приемов регенерации клоновых подвоев и сортов яблони и груши на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения, а также разработка эффективных способов индукции адвентивного органогенеза позволят успешно применять метод клонального микроразмножения, как в системе производства оздоровленного посадочного материала, так и в генной инженерии
Апробация работы. Материалы исследований представлены на International Symposium «VIII International Pear Symposium» (Италия, 2000), II Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, 2000), международной научно-практической конференции «Промышленное производство посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур» (Москва, 2001), Всероссийской научно-практической конференции «Повышение эффективности садоводства в современных условиях» (Мичуринск, 2003), VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), международной конференции «Мобилизация адаптивного потенциала садовых растений в динамичных условиях внешней среды» (Москва, 2004), международной научно-практической конференции «Современные проблемы технологии производства, хранения, переработки и экспертизы и качества сельскохозяйственной продукции» (Мичуринск, 2007)
Публикации результатов исследований. Всего опубликовано 38 научно-методических работ, из них по теме диссертации 25 работ
Реализация результатов исследований Результаты исследований внедрены в лаборатории биотехнологии ВНИИС им И В Мичурина Полу-
ченные методом in vitro растения высажены в маточники клоновых подвоев яблони и груши в ОПО ВНИИС
Разработаны (в соавторстве) учебное пособие «Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур» (Воронеж, 1998, 2003), предназначенное для студентов агрономических специальностей, и «Методика регенерации яблони и груши из пазушных меристем и вегетативных органов» (Мичуринск, 2006), рекомендованная для научно-исследовательских и промышленных лабораторий in vitro, получен патент «Способ укоренения побегов плодовых культур, полученных in vitro» (1996)
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, рекомендаций ,шя использования в науке и производстве, приложения, 27 таблиц, 32 рисунков Список используемой литературы включает 268 источников, в том числе 156 на иностранных языках
Методика, объекты и условия проведения исследований. Работа проводилась в лаборатории биотехнологии ГНУ ВНИИС им И В Мичурина Россел эхозакадемии, а также в ОПО института в течение 1986 - 2007гг
Объекты исследований - клоновые подвои яблони 54-118, 62-396, 57-491 57-195 (селекции МичГАУ), 2-46-77, 3-17-38, 3-5-44 (селекции ВНИИС им ИВ Мичурина), Р16, Р22, Р59, Р60 (польской селекции), ММ106, М26 (английской селекции), клоновые подвои груши - груша № 12, груша №10 (селекции ВНИИС им ИВ Мичурина), сорта яблони - Лобо, Вишневое, Спартан, Орлик, Синап Орловский, сорта груши - Осенняя Яковлева, Пхо-рун
Регенерация яблони и груши из пазушных меристем. Основными стерилизующими реагентами служили 6% раствор гипохлорита кальция в экспозиции 3-6 минут и 0,4% раствор нитрата ртути в течение 45-60 секунд с последующей тщательной промывкой эксплантов не менее 15 -20 минут авто-клавированным дистиллятом
На этапах введения в культуру m vitro и собственно микроразмножения использовали минеральную основу сред Мурасиге-Скуга, Кворина-Лепуавра, Гамборга, Ллойда-Маккауна с добавками, мг/л мезоинозит - 100, сахароза -30000, аскорбиновая кислота-1,5, тиамин HCl, пиридоксин HCl, никотиновая кислота по 0,5, агар - 8000, рН-5,8/
Растения культивировали при температуре воздуха 24±2°С, освещенности 2-3 тыс люксов, 16-часовом фотопериоде
Анализ этапа введения эксплантов в культуру проводили по 4 фазам 1 - слаэое увеличение апексов в размерах, 2- слабый линейный рост, раскрытие 2-3 примордиев, 3 -образование розетки с листьями и почками, 4 - формирование конгломератов почек и побегов длиной свыше 1 см
Этап пролиферации оценивали по количеству «клубочков», пригодных к клонированию, коэффициенту размножения, который подсчитывали путем деления количества побегов на количество исходных эксплантов, и количеству побггов >1,5 см
Адвентивный органогенез яблони и груши Эксплантами служили лист с поперек надрезанными жилками; сегмент стебля (междоузлие) и сегмент корня длиной 5-6 мм Культивирование проводили на средах Мурасиге-Скуга, Ллойда-Маккауна, Гамборга, №6 (Fasolo F et al 1989) Из регуляторов роста ислользовали, мг/л БАП - 1,0-3,0, TDZ - 0,5, ИМК - 0,1, НУК - 0,1, 2,4-Д-0,1
Первоначально, в течение первых 2 недель, экспланты культивировали в темноте, затем - при обычных условиях (16-часовой фотопериод, освещенность 2-3 тыс лк и температура воздуха 24±2°С)
У адвентивных новообразований отмечали начало формирования каллуса и побегов, по окончанию опыта - количество эксплантов с побегами, количество побегов на эксплант, расположение зон регенерации
Опыты проводили в трехкратной повторности по 10-15 эксплантов Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась методом дисперсионного анализа (Доспехов Б А, 1985) с оценкой по наименьшей существенной разнице и t-критерию Дункана
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оптимизация приемов регенерации клоновых подвоев и сортов яблони и груши из пазушных меристем
Регенерационная способность изолируемого экспланта в зависимости от морфологических и биологических особенностей растений. Первостепенным фактором, влияющим на введение в культуру in vitro эксплантов, является стерилизация Наиболее эффективно происходит стерилизация при использовании 0,4% раствора нитрата ртути в экспозиции 45-50 секунд, позволяющая не только на 22,5%, сократить контаминацию, но и достичь максимальной регенерации эксплантов (80,0%), по сравнению с 6% раствором гипохлорита кальция в течение 3-6 минут (20,0%)
Оптимальный срок введения в культуру in vitro яблони и груши, соответствует фазе активного роста побегов (июнь), при котором скорость разрастания эксплантов значительно опережает другие сроки (мартовский и августовский) При введении верхушечных и пазушных почек только у первых через 1 месяц культивирования все экспланты достигли 3 и 4 фаз развития
Лучшей регенерационной способностью обладают экспланты более крупного размера (до 1,5 мм), клонирование которых возможно уже в первом пассаже
Влияние химических компонентов питательной среды на меристе-матическую активность эксплантов. Сравнительное изучение сред Мура-сиге-Скуга (МС) и Кворина-Лепуавра (QL) на фоне БАП 0,5 мг/л при введении в культуру m vitro яблони и груши свидетельствует о наиболее эффективной регенерации меристематических верхушек через 3 месяца культивирования на среде Кворина-Лепуавра (рис 1)
100 Т
QL МС Лобо
QL МС Спартан
подвой, сорт яблони
QL М груша №10
си. мс си. мс сн. мс
Осенняя Пхорун Яковлева подвой,сорт груши
груша №12
регенерировало всего, % — *—коэффициент размножения, шт.
достигло 3-4 фаз, %
Рисунок 1 - Регенерация меристематических верхушек яблони и груши на разных средах (1- критерий Дункана рассчитан для каждого вида новообразований).
У большинства генотипов яблони и груши на этой среде наблюдалось увеличение на 13,4—46,7% количества эксплантов, достигших 3-4 фаз развития. Лишь у подвоя яблони 62-396, наоборот, это значение на среде Мураси-ге-Скуга было в 13,1 раз выше, но общий уровень регенерации на 52,5% ниже. Скорость дифференциации меристематической ткани эксплантов груши ниже, чем у яблони: максимальное количество эксплантов, достигших 3-4 фаз развитии у яблони составило 60,0%, а у груши - 33,3%.
Добавление к среде, содержащей 0,5 мг/л БАП ИМК (0,02 мг/л) или ИМК и ГК (по 0,02 мг/л) не стимулировало морфогенез яблони и груши
Особенности влияния биологически активных веществ на морфогенез плодовых культур на этапе пролиферации Цитокинины Из изучаемых цитокининов (БАП, кинетин, зеатин, ТЭ2) наиболее эффективным оказался БАП в концентрации 2,0 мг/л, обеспечивающий лучшее развитие побегов и максимальный коэффициент размножения до 7,2 (табл 1)
Подвой, сорт Цитокинины, мг/л Коэффициент размножения, шт Количество побегов, пригодных для укоренения, %
62-396 БАП 2,0 (контроль) 6,3 25,0 b
TDZ0 5 8,1 0,0
Кинетин 5,0 1,5 80,0а
Зеатин 5,0 5,3 35,5 b
57-195 БАП 2,0 (контроль) 7,2 12,0 с
TDZ0 5 7,4 0,0
Кинетин 5,0 1,2 58,3 а
Зеатин 5,0 4,9 51,1 ab
Вишневое БАП 2,0 (контроль) 1,3 0,0
TDZ0 5 4,0 0,0
Кинетин 5,0 1,6 44,4 b
Зеатин 5,0 2,8 73,3 а
Груша № 10 БАП 2,0 (контроль) 3,5 90,1 ab
TDZ0 5 5,6 0,0
Кинетин 5,0 1,7 100,0 а
Зеатин 5,0 4,5 69,9 b
Осенняя Яковлева БАП 2,0 (контроль) 3,9 35,7 b
TDZ0 5 2,9 0,0
Кинетин 5,0 1,0 85,0 а
Зеатин 5,0 3,8 50,7 b
НСР05 1,3
1- критерий Дункана рассчитан отдельно для каждой формы
Тидиазурон, как более сильный цитокинин, хотя и увеличивал коэффициент размножения (до 8,3), но способствовал образованию мелких побегов с видоизмененными листьями, которые не пригодны для укоренения
Повышение концентрации БАП от 1,0 до 3,0 мг/л приводило к увеличению коэффициента размножения в 1,4-1,7 раза и уменьшению на 9,1-31,4% количества микропобегов оптимальной для укоренения длины (рис 2)
Субкультивирование эксплантов на среду без гормонов позволило увеличить количество микропобегов, пригодных для укоренения, более чем в 2 раза по сравнению с вариантами, содержащими в среде БАП постоянно
Рисунок 2 - Влияние концентрации БАП и времени его воздействия на пролиферацию клоновых подвоев яблони и груши.
Пэстоянное присутствие в составе среды повышенных концентраций БАП вь зывает образование витрифицированных побегов. При этом нарушается технологический цикл получения растений-регенерантов, и теряется растительный материал in vitro. Наиболее подвержены обводнению тканей груша № 12 (51%), подвои яблони 62-396 (94%), Р59, Р60 (74%), 54-118 (47%). Исследования показали, что для устранения витрификации при культивировании подвоев яблони Р60, 62-396, груши № 12 целесообразно снижать содержание е среде БАП до 0,5 мг/л или вводить более слабый цитокинин — кине-тин в концентрации 5,0 мг/л (рис. 3). У подвоя яблони 54-118 решить эту проблему удалось только в присутствии кинетина.
В 5едение аденин-сулъфата в состав среды в концентрации 50,0 мг/л на фоне БлП 2,0 мг/л позволило не только увеличить в 1,2-2,0 раза, в зависимости от генотипа, коэффициент размножения, но и улучшить качество микропобегов подвоев яблони и груши за счет увеличения их длины и количества листьев на побег.
подвой
БАП 0,5 мг/л шэ кинетин 5,0 мг/л
Рисунок 3 - Влияние цитокининов на витрифицикацию побегов.
Цитокинины ауксины, гиббереллины. В наших исследованиях добавление к среде, содержащей 2,0 мг/л БАП 0,2 мг/л ГК и 0,1 мг/л ИМК не влияло ни на коэффициент размножения (рис. 4), ни на длину микропобегов яблони и груши и оказалось менее эффективным, чем снижение содержания БАП до 1,0 мг/л (рис. 5).
Р 59
рфакт < ртабл
57-195 62-396 подвой, сорт
Орлик
□ БАП 2,0 мг/л - контроль □ БАП 2,0 мг/л + ГК 0,2 мг/л
Ш БАП 2,0 мг/л + ИМК 0,1 мг/л
Рисунок 4 - Влияние регуляторов роста на коэффициент размножения яблони
и груши.
100-,
Р 59 57-195 62-396 Орлик груша Осенняя
N212 Яковлева
___сорт, подвой____
□ БАП 1,0 мг/л - контроль 1 Н БАП 2,0 мг/л - контроль 2
И БАП 2,0 мг/л + ГК 0,2 мг/л И БАП 2,0 + ИМК 0,1 мг/л
Рисунок 5 - Влияние регуляторов роста на удлинение микропобегов яблони
и груши.
Коэффициент размножения при этом зависел от генотипа. У яблони он варьировал от 1,1 (сорт Орлик) до 13,4 (подвой Р59), а у груши от 5,3 (сорт Осенняя Яковлева) до 9,0 (подвой груша № 12).
Увеличение концентрации ГК до 0,5 мг/л на фоне БАП 2,0 мг/л и кине-тина 5,0 мг/л также не влияло на коэффициент размножения и длину микропобегов.
Злияние состава питательной среды на регенерационные процессы этапа размножения. Минеральный состав. Сравнительное изучение, проведенное нами, наиболее часто рекомендуемых для плодовых культур сред Кворина-Лепуавра, Мурасиге-Скуга, Гамбурга, Ллоида-Маккауна свидетельствовало о явном преимуществе среды Кворина-Лепуавра (рис. 6).
ь
Э 10
н- 5 X
ж 4
s 3
■&
■& 2
о
° 1 1
НСР05=1,2
57-195 62-396 Лобо подвой, сорт
Кворина-Лепуавра Гамборга
груша № 12 Осенняя Яковлева
□ Мурасиге-Скуга - контроль Н Ллоида-Маккауна
Рисунок 6 - Влияние минерального состава питательных сред на пролиферацию клоновых подвоев и сортов яблони и груши.
Положительное влияние на процесс пролиферации побегов яблони и груши in vitro также оказывет снижение в 4 раза аммонийной формы азота в среде Мурасиге-Скуга, обеспечивающее увеличение коэффициента размножения в 1,3-1,5 раза, по сравнению с контролем.
Антиоксиданты. Введение в состав среды на фоне 2,0 мг/л БАП анти-оксидг.нтов: аскорбиновой (АК) или лимонной (ЛК) кислот, или поливинил-пирролидона (ПВП) позволило не только снизить ингибирующую активность полифгнолов на поверхности среза, особенно у сортов и подвоев яблони, но и актива зировать ростовую активность ткани. В результате чего улучшалось качество микрочеренков и, как следствие, увеличивалось количество побегов оптимальной для укоренения длины: у подвоя яблони 62-396 в присутствии ЛК, ссрта яблони Лобо и подвоя груши №12 - ПВП, сорта груши Пхорун -АК, а для подвоя яблони Р 59 - любого исследуемого антиоксиданта (рис. 7), но не оказывало влияние на коэффициент размножения.
Установлено, что источником углеводов наряду с сахарозой (30 мг/л) в питательной среде для размножения может служить и сахар пищевой в концентрации 30 мг/л.
подвой, сорт
□ контроль ВАК 20 мг/л ШЛК20мг/л ИЭПВП 30 мг/л
Рисунок 7 - Влияние антиоксидантов на удлинение микропобегов яблони
и груши.
Влияние длительности культивирования на процесс регенерации плодовых культур. При анализе регенерационного потенциала клоновых подвоев и сортов яблони и груши на протяжении 10 пассажей прослеживалась генотипическая реакция. Установлено увеличение коэффициента размножения к 5 - 7 пассажам у всех подвоев и сортов и последующее его снижение к 8 и 10 пассажам (табл. 2). Наибольшая степень пролиферации наблюдалась у клоновых подвоев яблони 62-396 и 54-118 и сорта груши Пхо-рун. При этом средний коэффициент размножения у них за 10 пассажей составил 6,1; 5,5 и 6,0, соответственно. Выявлено, что низким регенерационным потенциалом обладают сорта яблони Лобо и груши Осенняя Яковлева (коэффициент размножения варьировал от 1,0 до 5,3). При увеличении числа субкультивирований до 10 не было отмечено появление фенотипических отклонений.
Влияние ориентации микропобегов на коэффициент размножения.
Исследования показали, что у горизонтального побега без верхушки, по сравнению с горизонтальным и вертикальными побегами, за счет лучшего контакта со средой и удаления верхушки наблюдается увеличение в 1,2-1,6 раза коэффициента размножения вне зависимости от генотипа.
Изучение возможности длительного хранения in vitro. Сохранность эксплантов при беспересадочном хранении при пониженных температурах, а также уровень их регенерационной способности зависит как от генотипа, так и от времени депонирования и гормонального состава среды (табл. 3). Для увеличения времени беспересадочного хранения плодовых культур in vitro до 6 месяцев целесообразно культивировать экспланты на среде с БАП 1,0 мг/л в контролируемых условиях (температура +4° С, темновая фаза).
Таблица 2 - Коэффициент размножения клоновых подвоев и сортов яблони и груши в зависимости
от субкультивирований
Подвой, сорт ТТаг^амг V
п3 а, п5 Пб п7 "8 п9 Пю
3-17-38 3,8 3,2 7,5 5,5 4,8 4,7 3,2 3,5 4,5
62-396 4,8 5,8 6,9 6,8 6,7 6,5 6,0 5,9 6,1
57-491 3,7 3,8 5,0 10,0 6,4 4,2 4,5 4,0 5,2
57-195 2,0 4,0 5,3 7,0 8,0 4,0 5,6 5,3 5,1
54-118 3,3 4,7 5,9 6,0 6,8 6,0 6,8 4,8 5,5
Р59 4,5 4,8 4,5 6,3 7,9 4,4 6,3 4,9 5,4
Р60 4,1 2,5 5,0 5,0 4,8 3,7 3,7 4,2 4,1
Лобо 1,0 2,0 5,3 4,0 3,2 2,6 2,5 2,2 2,8
Груша№12 3,5 3,3 4,3 6,2 7,2 5,5 6,0 5,3 5,1
Груша№10 2,6 5,0 5,5 7,8 6,5 4,5 5,3 4,9 5,2
Пхорун 2,5 3,4 3,9 9,7 9,0 6,5 7,9 5,6 6,0
ОсенняяЯковлева 2,0 1,8 2,5 4,9 4,0 3,1 3,1 3,5 3,1
X 3,1 3,6 5,1 6,1 6,2 4,5 5,9 4,5 4,8
НСР 05 0,5
Таблица 3 - Влияние длительности хранения эксплантов на регенерационную способность подвоев и сортов яблони
и груши
Подвой, сорт Регуляторы роста, мЙ1 Через 4 месяца Через 5 месяцев Че зез 6 месяцев
Сохран- НОСТ1,% Коэффициент размножение шт Длина побегоц см Сохранности Коэффициент рзмножешщ шт Длина побегоц см Сохранностью/о Коэффициент размножение шт Длина побегоц см
Осетия Яковлева БАП 1,0 100,0а 3,5 2,5 75,0 Ь 1,0 1,4 500 с 1,0 3,7
БАП 1,0 + АБК 1,0 65,0 Ьс го 05 500 Ь 1,0 и 25,0(1 1,0 05
АБК 1,0 25,0 с 1,0 03 25,0с1 1,0 оз 0,0 - -
Груша №10 БАП 1,0 1000 а 25 26 75,0 Ь 1,0 1,1 25,0 а 1,0 02
БАП 1,0+ АБК 1,0 Щ0а 25 1,7 500 с Ю 25 25,0(1 1,0 1,7
АБК 1,0 25,0 с 1,0 03 00 - - - - -
Груша №12 БАП 1,0 100,0 а 7,2 2,1 1000а 4,3 1,1 100 а V 1,6
БАП 1, (И-АБК 1,0 100.0 а 7,0 1,7 75,0 Ь 1,0 07 1000 а 5,0 1,3
АБК 1,0 75,0 аЬ 1,0 03 75,0 Ь 1,0 и 500 с 1,0 1,0
62-396 БАП 1, 0 10(10 а 2,5 20 1000 а 1,7 1,2 1(Д0а 1,2 21
БАП 1, АБК 1, 0 100,0 а \г 1,7 75,0 Ь 1,3 1,5 75,0 Ь 1,0 1,4
АБК 1,0 75,0 аЬ Ю 02 500 с 1,0 1,2 25,0(1 1,0 02
3-17-38 БАП 1, 0 1000а 3,5 1,7 1000а 20 08 ЮООа Х0 19
БАП 1, 0+ АБК 1, 0 1000 а 1,2 29 Щ0а 1,5 и 1000 а и 22
АБК 1,0 75,0 аЬ 1,0 03 500 с 1,0 06 500 с 1,0 04
НСР05 У 05 Рфакт < Ртсорег 0,5 Рфакт < Ртеор 09
Особенности индукции адвентивного органогенеза плодовых культур Оценка морфогенетического потенциала клоповых подвоев и сортов яблони и груши в зависимости от химического состава питательной среды. Минеральный состав. При сравнительном изучении сред: Мурасиге-Скуга, Гамборга, Ллойда-Маккауна, №6 только на среде Мурасиге-Скуга наблюдал эсь формирование адвентивных структур у подвоев и сортов яблони и груши, поэтому эта среда выбрана основной в дальнейших исследованиях. На остальных средах происходило лишь каллусообразование.
Регуляторы роста. Эффективность регенерации плодовых культур в значительной степени определяется содержанием цитокининов и ауксинов в среде и их соотношением. Увеличение соотношения цитокинин : ауксин до 20:1 (БАП 2,0 мг/л и ИМК, НУК 0,1 мг/л) позволило повысить частоту побегообразования у подвоя яблони 62-396 в 5 раз при использовании НУК и в 7 раз при использовании ИМК, по сравнению с 3:1 (БАП 3,0 мг/л и ИМК, НУК 1,0 мг/л). При культивировании листовых пластинок клоновых подвоев и сортов яблэни и груши на среде с БАП и ИМК в соотношении 20:1 была выявлена геиотипическая реакция растений (рис. 8).
подвои и сорта яблони и груши
dl каллусообразование, % ГТП побегообразование, % -♦- коэффициент размножения, шт._
Рисунок 8 - Регенерация клоновых подвоев и сортов яблони и груши из листовых эксплантов (t-критерий Дункана рассчитан отдельно для яблони и груши и каждого вида новообразований).
У яблони регенерационный потенциал в культуре изолированных тканей на 18,3% выше, чем у груши. Существенные генотипические различия на воздействие регуляторов роста наблюдались и внутри рода Malus. Высокая регенерационная способность отмечена у подвоев яблони 62-396, М26, часто-
та побегообразования которых составила 58,3 и 50,0%, соответственно, а у подвоя яблони 57-195 всего лишь 6,6 % Не удалось индуцировать адвентивный органогенез у подвоев яблони Р16, Р60, Р59, 3-5-44, 3-17-38 У Р16, 3-5-44 наблюдалось лишь нарастание каллусной массы, а у Р59 и 3-17-38 не происходило образования и каллуса У груши самая высокая регенерационная способность была у груши № 12 с частотой побегообразования 40,0%, значительно ниже у сорта Пхорун (6,6 %) и груши № 10 (1,0 %) Не наблюдался адвентивный органогенез у сорта Осенней Яковлева, но происходило формирование каллуса
Использование на фоне БАП наряду с ИМК других регуляторов роста (НУК, 2,4-Д) также в соотношении 20 1 оказалось менее эффективным и не позволило существенно повысить частоту побегообразования у подвоев яблони Р22, М26 и груши № 12
Введение тидиазурона (TDZ), в сочетании с ИМК увеличивает индукцию адвентивного органогенеза на 13,4% у подвоя яблони Р22, а у груши № 12, наоборот, уменьшает У остальных изучаемых генотипов увеличение частоты побегообразования не наблюдалось
Углеводы Исследования по изучению источника углеводов показали, что среды с сорбитом не стимулируют индукцию адвентивного органогенеза в культуре листовых пластинок клонового подвоя яблони 3-5-44 Максимальная регенерация (16,6%) была получена в варианте, содержащем 30 г/л сахарозы
Влияние типа экспланта и его ориентации на питательной среде на регенерационные процессы. Для индукции морфогенеза использовали лист с поперек надрезанными жилками (с пролиферации и укоренения in vitro), сегмент стебля (междоузлие) и сегмент корня длиной 5-6 мм Исследования показали, что самым высоким морфогенетическим потенциалом обладают листья с пролиферации и междоузлия (табл. 4)
Таблица 4 - Индукция адвентивного органогенеза в зависимости от типа экс-плантов
Частота, % Количество
Подвой Тип экспланта каллусообра- побегообразо- побегов на
зования вания эксплант, шт
лист с укоренения 40,0 d 0,0 -
57-491 лист с пролиферации 100,0 а 20,0 b 1,2
междоузлие 46,6 cd 33,3 a 9,0
сегмент корня 60,0 be 0,0 -
лист с укоренения 13,0 e 0,0 -
груша №12 лист с пролиферации 80,0 b 30,0 a 1,0
междоузлие 60,0 be 20,0 b 5,3
сегмент корня 60,0 be 0,0 -
НСР05 F факт < FTeop
У сегментов корней и листьев с укоренения наблюдалось лишь нарастание каллуса, индуцировать образование адвентивных побегов у этих экс-плантов не удалось
Уровень регенерации также зависит от ориентации листовых пластинок на среде Адаксиальное (верхней стороной) размещение листовых пластинок предпо1 тительнее вне зависимости от гормонального состава питательной среды и генотипа в отличие от абаксиального (нижней стороной) (табл 5)
Таблица 5 - Регенерационная способность листовых пластинок в зависимости от их ор иентации ________
Частота, % Количество
Подвой Ориентация Регуляторы роста, мг/л каллусообра-зования побегообразования побегов на эксплант,
шт
адаксиально 100,0 а 8,3 с 1,0
груша абаксиально БАП 2 50,0 Ь 0,0 -
№12 адаксиально БАП 2+ 91,6 а 25,0 Ь 5,3
абаксиально ИМК0,1 58,3 Ь 0,0 -
адаксиально БАП 2 0,0 58,3 а 1,4
62-396 абаксиально 0,0 0,0 -
адаксиально БАП 2+ 0,0 41,6 а 1,6
абаксиально ИМК 0,1 0,0 0,0 -
НСР05 Рфакт<Ртеор
Паи абаксиальном размещении листовых пластинок образование адвентивных побегов не было отмечено, а формирование каллуса наблюдалось только V подвоя груши №12
Наиболее часто образование адвентивных структур наблюдается у ос-нованш листа, вдоль центральной жилки и в местах поранения Это связано с тем, что морфогенетический потенциал не одинаков по длине листа, он увеличивается к основанию листа, тек растущей его части
Влияние фото- и термопериодов на морфогенез листовых эксплан-тов и юллусных тканей. Помещение листовых пластинок клоновых подвоев ябло-ш 57-491 и 62-396 на 2 недели в темноту при температуре +4°С в начальный период культивирования оказалось эффективным приемом стимули-рованш индукции адвентивного органогенеза и повысило частоту побегообразования на 10,0-13,4% Использование аналогичного приема, связанного с помещением каллуса подвоя яблони ММ106 в течение первых двух недель в темноту при температуре +4°С, также позволило на 40,0% повысить частоту побегос бразования, а количество побегов на эксплант в 4,4 раза
Сравнительная оценка регенерационной способности побегов из пазушные меристем и соматических тканей свидетельствует о генотипиче-кой реакции подвоев яблони и груши и не зависит от модели размножения, хотя у отдельных генотипов (57-491, 54-195) было отмечено явное преимущество адвентивных побегов, а у подвоя груши №12 - пазушных (рис 9)
Ь 12
3 of
I 10
s
g 8 Z n ro
I
0)
I 4 s €■
O ¿ О ¥
D
HCP0,5=1,7
62-396 M26 MM106 57-491 57-195 P22 rp №10 ф №12 ПОДВОЙ
адвентивные побеги
пазушные побеги
Рисунок 9 - Регенерационная способность адвентивных и пазушных побегов подвоев яблони и груши.
Экономическая эффективность выращивания подвоев яблони с использованием метода клонального микроразмножения
Включение метода клонального в систему производства оздоровленного высококачественного посадочного материала дает возможность значительно повысить рентабельность питомниководства и отрасли садоводства в целом. Несомненный экономический эффект методов in vitro обеспечивается как за счет оптимизации технологии клонального микроразмножения и получения большого количества растений-регенерантов (более 17000 адаптированных растений с учетом потерь на основных этапах микроразмножения и адаптации), так и высокого коэффициента размножения in vivo.
Проведенные исследований показали, что продуктивность маточных растений, размноженных с использованием метода in vitro, в 2,2 раза выше, чем у растений, полученных традиционным способом (табл. 6).
Отводки от таких растений имели высоту в среднем на 22,7 см выше, а длину корневого стержня в 1,7 раза больше. Достаточно высокий уровень рентабельности достигается повышенной продуктивностью маточных растений, полученных методом in vitro, а также высоким качеством отводков (табл.
Таблица 6 - Качественные показатели отводков подвоя яблони 62-396 (20042006 гг ) ____
Способ' размножения Продуктивность, отводков/куст Количество отводков по сортам,% Высота растений, см Диаметр условной корневой шейки, см Длина корневого стержня, см
I-II III
без in vilro 33 56,0 44,0 95,3 0,9 8,1
с использованием in vitro 15 46,8 53,2 72,6 1,0 4,6
HCPos 87 Рфакт<Ртеор 1 7
Таблица 7 - Экономическая эффективность производства подвоев яблони ь отводковом маточнике с использованием метода in vitro (в ценах 2007 г)__
Показатели Технология выращивания подвоев
с применением m vitro без применения in vitro
Выход укорененных отводков, тыс шт с 1 га 858,0 390,0
Всего затрат, тыс руб /га 1278,4 748,8
Себесто шость, руб /шт 1,49 1,92
Средняя цена реализации, руб /шт 7,7 7,4
Выручка, тыс руб /га 6606,6 2886,0
Прибыл 5, тыс руб /га 5328,2 2137,2
Уровень рентабельности, % 416,8 285,4
Таким образом, использование этого метода размножения позволяет не только 1ыпуекать конкурентоспособный посадочный материал высших категорий кгчества, но и в 2,5 раза увеличить прибыль от реализации высококачественного посадочного материала
ВЫВОДЫ
1 Оптимизированы основные этапы клонального микроразмножения (введение в культуру и собственно микроразмножения) клоновых подвоев и сортов яблони и груши с учетом генотипических особенностей и изучены особеннэсти адвентивного органогенеза их из соматических тканей
2 Высокая степень дифференциации меристематических тканей на этапе введения в культуру m vitro обеспечивается в оптимальный срок вычленения (фаза активного роста побегов) с предпочтительным использованием апикапьнах почек с размером эксплантов от 0,5 до 1,5 мм
3 Наиболее эффективной при введении в культуру in vitro яблони и груши я вляется среда Кворина-Лепуавра с добавлением БАП в концентрации
не более 0,5 мг/л Присутствие в питательной среде других регуляторов роста - ГК (0,02 мг/л) и ИМК (0, 02 мг/л) является не целесообразным
4 Высокий морфогенез яблони и груши на этапе пролиферации обеспечивается как при использовании среды Кворина-Лепуавра, так и среды Мура-сиге-Скуга с 1/4 содержанием аммонийной формы азота и введением БАП в концентрации 2,0 мг/л
5 Снижение уровня витрификации побегов обеспечивается, в зависимости от генотипа, за счет уменьшения концентрации БАП в среде до 0,5 мг/л или использования более слабого цитокинина - кинетина (5,0 мг/л)
6 Для улучшения качества микропобегов целесообразно непосредственно перед этапом укоренения содержание БАП в среде снижать до 1,0 мг/л, а также дополнять среду (на фоне БАП 2,0 мг/л) аденин-сульфатом, или, в зависимости от генотипа, антиоксидантом (АК, ЛК, ПВП) Введение ГК (0,2-0,5мг/л) и ИМК (0,1 мг/л) не обеспечивает получение стандартных для укоренения побегов и не влияет на коэффициент размножения
7 Длительное (до 10 пассажей) культивирование in vitro оказывает влияние на степень пролиферации, обеспечивая за счет реювенилизации тканей увеличение коэффициента размножения к 5-7 пассажу, при этом феноти-пических отклонений не выявлено
8 Использование пониженных температур (до +4° С) и концентрации БАП (до 1,0 мг/л) дает возможность продлить срок беспересадочного хранения растений яблони и груши m vitro до 6 месяцев
9 Оптимальной по минеральному составу средой для индукции адвентивных побегов является Мурасиге-Скуга с соотношением БАП к ИМК 20 1, обеспечивающая уровень регенерации побегов из листовых эксплантов у яблони до 58,3% (62-396) и у груши до 40,0% (груша № 12)
10 Морфогенетический потенциал соматических тканей зависит не только от типа эксплантов, но и ориентации листовых пластинок на питательной среде Более высокой регенерацией обладают ткани стеблей и листьев, которые целесообразно располагать адаксиально
11 Увеличению образования адвентивных побегов у плодовых культур на 10,0-40,0% способствует культивирование листовых пластинок и каллус-ных тканей в течение первых двух недель в темноте и при пониженных температурах (до +4° С)
12 Коэффициент размножения адвентивных и пазушных побегов подвоев яблони и груши в большей степени зависит от генотипа, чем от модели размножения in vitro
13 Включение метода клонального микроразмножения в технологию производства оздоровленного высококачественного посадочного материала позволяет не только выпускать конкурентоспособный посадочный материал высших категорий качества, но и повысить рентабельность производства подвоев яблони в 1,5 раза
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ НАУКИ И ПРОИЗВОДСТВА
Для включения биотехнологических приемов в технологию производства пос,точного материала высших категорий качества целесообразно
1 Оптимальный срок изоляции эксплантов в фазе активного роста растений
2 Культивирование эксплантов на этапе введения в культуру in vitro проводи гь на среде Кворина-Лепуавра с содержанием БАП не более 0,5 мг/л, постепенно доводя его концентрацию до 2,0 мг/л на этапе пролиферации
3 Для увеличения количества побегов, оптимальной для укоренения длины, перед этапом ризогенеза необходимо снижать содержание БАП в среде до 1,0 мг/л, или наряду с БАП 2,0 мг/л вводить производный цитокини-на-аденин-сульфат в концентрации 50,0 мг/л, или добавлять в зависимости от генотипе, антиоксидант (аскорбиновую кислоту и лимонную кислоту по 20,0 мг/л, погивинилпирроллидон- 30,0 мг/л)
4 Для снижения уровня витрифицикации целесообразно экспланты культивировать на средах с 0,5 мг/л БАП или вводить более слабый цитоки-нин - кинетин в концентрации 5,0 мг/л
5 Регенерацию яблони и груши в культуре листовых эксплантов рекомендуем осуществлять на среде Мурасиге-Скуга с БАП 2,0 мг/л в сочетании с 0,2 мг/л ИМК с предпочтительным культивированием в течение первых 2 недель в темноте и температуре +4° С
При размножении яблони и груши in vitro предлагаем руководствоваться разработанными в соавторстве методиками
- учебным пособием «Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур» - Воронеж ВГАУ, 2003 - 80 с ,
- « Методикой регенерации яблони и груши из пазушных меристем и вегетативных органов» - Мичуринск-наукоград РФ - 2006 - 20 с , предназначенными для научно - исследовательских и промышленных лабораторий биотехнологии, а также высших учебных заведений по агрономическому и агро-экологи1 ескому образованию
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Туровская, Н И Микроразмножение малины /НИ Туровская, О В Стрыгина//Садоводство и виноградарство - 1990 -№8 - С 26-28
2 Туровская, Н И Микроклональное размножение результаты опытов с яблоней, грушей, малиной, черной смородиной / НИ Туровская, О В Стрыгина, Л И Альшевцева // Сортоизучение и селекция плодовых и ягодных культур Сб науч тр ВНИИС им И В Мичурина - Мичуринск, 1992, - С 26-29
3 Гуровская, Н И Способ укоренения побегов плодовых культур, полученные in vitro / Н И Туровская, Н И Пронина, О В Матушкина//Патент РФ №20(>0646 МКПб А 01 Н4/00 -БИ№15 -27.05 96
4 Матушкина, О В Индукция адвентивного органогенеза у различных типов экгплантов в условиях in vitro / О В Матушкина, И Н Пронина // Со-
вершенствование технологии в промышленном садоводстве и овощеводстве Сб науч трудов ВГАУ - Воронеж, 1996 - С
5 Матушкина, О В Особенности микроразмножения груши / О В Матушкина, И Н Пронина // Совершенствование сортимента и технологии возделывания груши Тез докл ВНИИСПК - Орел, 1997 - С 55-57
6 Матушкина, О В Размножение новых перспективных клоновых подвоев яблони in vitro / О В Матушкина, И Н Пронина // Пути повышения устойчивости садоводства Сб науч трудов ВНИИС им И В Мичурина - Мичуринск, 1998 - С 78-83
7 Матушкина, О В Регенерация растений из изолированных соматических тканей у плодовых и ягодных культур в условиях in vitro / О В Матушкина // Пути повышения устойчивости садоводства Сб науч трудов ВНИИС им И В Мичурина - Мичуринск, 1998 - С 84-86
8 Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур Учебное пособие / Н М Круглов, О В Матушкина, И Н Пронина, Р Г Ноздрачева, Н И Туровская - Воронеж, ВГАУ - 1998 - 72с
9 Матушкина, О В Индукция адвентивного органогенеза в тканях плодовых и ягодных культур в условиях in vitro / О В Матушкина // Научные основы устойчивого садоводства в России Сб докл ВНИИС - Мичуринск, 1999 - С 368-370
10 Matuskina, О Peculiaties of pear cultivars rootstock regeneration in vitro / О Matuskina // VIII International Pear Symposium - Italy - 2000
11 Матушкина, О В Особенности микроклонального размножения перспективных клоновых подвоев яблони на этапе пролиферации / О В Матушкина // Новые сорта и технологии возделывания плодовых и ягодных культур для садов интенсивного типа Сб науч тр ВНИИСПК - Орел, 2000 -С 141-142
12 Матушкина, О В Индукция адвентивного органогенеза у различных типов эксплантов, культивируемых m vitro / О В Матушкина // Биология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии Тез докл II Междунар конф - М , 2000 - С 77-78
13 Матушкина, О В Особенности размножения перспективных клоновых подвоев яблони in vitro / О В Матушкина // Промышленное производство посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно- декоративных культур Материалы Междунар научно-практической конф 20-22 ноября 2001 г -М.ВСТИСП -2001 -С 128-129
14 Матушкина, О В Клональное микроразмножение и перспективы его использования / О В Матушкина, И Н Пронина // Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИС им И В Мичурина Сб науч тр -Тамбов -2001 -Т 2 - С 103-115
15 Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур Учебное пособие / Н М Круглов, О В Матушкина, И Н Пронина, Р Г Ноздрачева, Н И Туровская - 2-е изд доп, Воронеж, ВГАУ - 2003 - 80с
16 Матушкина, О В Адвентивный органогенез в культуре тканей / О В Матушкина // Повышение эффективности садоводства в современных условиях Материалы Всеросс научно- практич конф — Мичуринск, Мич ГАУ -2003 -Т 1 -С 155-159
17. Матушкина, О В. Регенерация груши in vitro / O.B Матушкина, И Н Пронина // Биология клеток растений in vitro и биотехнология Тез докл VIII Между нар конф - Саратов -2003 - С 197
18 Матушкина, О В Особенности размножения клоновых подвоев яблони in \ itro / O.B. Матушкина, И.Н. Пронина // Достижения науки и техники АПК.-2(ЮЗ.-№11.-С. 14-16
19 Матушкина, О.В. Влияние антиоксидантов на регенерацию микро-черенкоЕ, яблони и груши in vitro /ОВ Матушкина, И Н Пронина // Мобилизация адаптивного потенциала садовых растений в динамичных условиях внешней среды Сб. статей Междунар конф. - М, ВСТИСП. - 2004 - С 230233
20 Матушкина, О В. Будущее садов за клональным микроразмножением / О В Матушкина, И.Н. Пронина // Главный агроном - 2004. - №9 - С. 2729.
21 Пронина, И Н. Регенерационная способность яблони и груши в зависимости от длительности культивирования in vitro / И Н Пронина, О В Матушкина, // Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства: Матер конф ГНУ ВНИИВиВ им Я И Потапенко.-Новочеркасск Изд-воЮРГТУ(НПИ) -2005 -С 183-187
22 Матушкина, О В Особенности клонального микроразмножения яблони и гзуши / О В. Матушкина, И.Н. Пронина // Научные основы садоводства. Сб науч трудов ВНИИС им И В Мичурина. - Воронеж Кварта - 2005 -С 155-1(50.
23 Матушкина, О В Методика регенерации яблони и груши из пазушных меристем и вегетативных органов / О В. Матушкина, И Н. Пронина // ГНУ ВНИИС им. И.В. Мичурина. - Мичуринск-наукоград РФ - 2006 - 21с.
24 Матушкина, О.В. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур в системе производства высококачественного посадочного материала / О В. Матушкина, И.Н. Пронина // Научные основы эффективного са-доводстна Сб науч трудов ВНИИС им. И В Мичурина - Воронеж Кварта, 2006 -С 327-342
25 Матушкина, О В Влияние углеводов на морфогенез подвоев яблони и груши in vitro /ОВ Матушкина, И Н Пронина // Современные проблему техноло1 ии производства, хранения, переработки и экспертизы качества сельскохозяйственной продукции. Материалы мезвдунар. научн -практич конф 26-28 февраля 2007г - Мичуринск- Изд -во ФГОУ ВПО Мич ГАУ, 2007 -Т 1 -С 309-313
Отпечатано в издательско-полиграфическом центре МичГАУ
Подписано в печать 19 03 08г Формат 60x84 '/ Бумага офсетная № 1 Услпечл 1,0 Тираж 100 экз Ризограф Заказ N213277
Издательско-полиграфический центр Мичуринского государственного аграрного университета 393760, Тамбовская обл , г Мичуринск, ул Интернациональная, 101, тел +7(47545)5-55-12 E-mail vvdem@mgau ru
Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Матушкина, Ольга Васильевна
1. Модели клонального микроразмножения и факторы, влияющие на регенерационные процессы in vitro (Обзор литературы)
1.1. Особенности регенерации клоновых подвоев и сортов яблони и груши из пазушных меристем.
1.1.1. Генотипическая реакция растений in vitro.
1.1.2. Особенности введения экспланта в стерильную культуру.
1.1.3. Влияние солевого состава питательной среды и биологически активных веществ на процесс регенерации.
1.2. Особенности индукции адвентивного органогенеза из соматических тканей плодовых культур.
1.2.1. Морфогенетический потенциал в зависимости от типа и происхождения экспланта.
1.2.2. Роль солевого состава среды и регуляторов роста на органогенез-плодовых культур.
1.3. Морфологические и генетические отклонения растений in vitro.
2. Цель, задачи, объекты, методика и условия проведения исследований.
2.1. Цель и задачи исследований.
2.2. Объекты исследований.
2.3. Методика и условия проведения исследований.
2.3.1. Регенерация яблони и груши из пазушных меристем.
2.3.2. Адвентивный органогенез яблони и груши.
3. Результаты исследований.
3.1. Оптимизация приемов регенерации клоновых подвоев яблони и груши из меристематических верхушек.
3.1.1. Регенерационная способность изолируемого экспланта в зависимости от морфологических и биологических особенностей растений.
3.1.2. Влияние химических компонентов питательной среды на мери-стематическую активность эксплантов.
3.1.3. Особенности влияния биологически активных веществ на морфогенез плодовых культур на этапе пролиферации.
3.1.4. Влияние состава питательной среды на регенерационные процессы этапа размножения.
3.1.5. Влияние длительности культивирования на процесс регенерации плодовых культур.
3.1.6. Влияние ориентации побегов на коэффициент размножения.
3.1.7. Изучение возможности длительного хранения in vitro.
3.2. Особенности индукции адвентовного органогенеза плодовых культур.
3.2.1. Оценка морфогенетического потенциала клоновых подвоев и сортов яблони и груши в зависимости от химического состава питательной среды.
3.2.2. Влияние типа экспланта и его ориентации на питательной среде на регенерационные процессы.
3.2.3. Влияние фото - и термопериодов на морфогенез листовых эксплантов и каллусных тканей.
3.3.4. Сравнительная оценка регенерационной способности побегов из пазушных меристем и соматических тканей.
4. Экономическая эффективность выращивания подвоев яблони с использованием метода клонального микроразмножения.
Выводы.
Рекомендации для использования в науке и производстве.
Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Оптимизация процессов регенерации при размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши in vitro"
В условиях интенсификации садоводства и ухудшения экологической ситуации все большее значение приобретает разработка эффективных технологий производства оздоровленного высококачественного посадочного материала и создания адаптивных форм и сортов растений с использованием метода клонального микроразмножения. Этот метод можно рассматривать как наиболее перспективный и наиболее полно реализующий потенциал растительного организма к размножению. Исследования по культуре изолированных тканей и органов относятся к приоритетным направлениям науки XXI века, способным в короткие промежутки времени решать разнообразные научные, теоретические и практические проблемы, участвовать при решении конкретных задач сельскохозяйственного производства. Метод клонального микроразмножения, основанный на уникальной способности растительной клетки к тотипотентности, имеет преимущества перед существующими традиционными способами размножения:
- множественность, быстрота и высокий коэффициент размножения (105-10б) позволяют в 2-3 раза сократить сроки отбора и получения новых растений в селекционных исследованиях;
- выращивание растений в искусственных контролируемых условиях позволяет достигать элиминации вирусов и других микроорганизмов и получать оздоровленный посадочный материал;
- вероятность повторного заражения растений отсутствует, так как в процессе микроразмножения практически нет контакта с внешней средой;
- экономно используются площади закрытого грунта, маточников и коллекционных насаждений;
- большинство работ выполняется в лабораторных условиях, что позволяет получать растения к определенному сроку;
- возможность создания банка генов и легкость обмена между потребителями.
Среди плодовых культур ведущими, как у нас в стране, так в большинстве стран мира, являются яблоня и груша. Главным направлением в развитии мирового плодоводства - закладка садов интенсивного типа. Важнейшим фактором, определяющим, продуктивность, долговечность и рентабельность интенсивных насаждений является исходное качество посадочного материала. Уже доказано, что невозможно добиться высокой продуктивности насаждений такого типа, не используя для его закладки конкурентоспособный оздоровленный посадочный материал, соответствующий мировым стандартам.
Особая роль в этом отводится комплексу мероприятий, среди которых большое значение имеет внедрение в питомниководство современных технологий, в частности, метода клонального микроразмножения. Внедрение этого метода в сельскохозяйственное производство позволит повысить морфогене-тический потенциал маточных и плодоносящих насаждений и эффективность отрасли садоводства в целом.
Однако в условиях ухудшения экологической ситуации актуально* создание растений с необходимыми хозяйственно-ценными признаками, полученных с использованием биотехнологических методов, в частности, методов генной инженерии, позволяющих вносить изменения в конструкцию наследственного вещества организма. Решение этой проблемы, применительно к плодовым растениям, может стать реальным после разработки надежных методов регенерации растений из изолированных соматических тканей. Развитие этого направления является многообещающим, т.к. позволяет создать высокоадаптивные формы растений, значительно ускорить селекционный процесс, что особенно важно как для селекции, так и для питомниководства в целом.
Эффективность методов in vitro при выращивании безвирусного посадочного материала многолетних растений позволяет рассматривать- их серьезной альтернативой традиционным технологиям размножения (Высоцкий В.А., 1989). Метод клонального микроразмножения начинает постепенно вытеснять традиционные способы вегетативного размножения. В США, Италии, Великобритании, Голландии, Новой Зеландии,. Франции имеются производственные лаборатории, работа которых по выпуску оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур поставлена на промышленную основу, очевидна тенденция увеличения выпуска такого посадочного материала и в дальнейшем. По мнению И.М. Куликова, В.А. Высоцкого (2005), методика культивирования изолированных меристем достаточно разработана применительно к 2400 видам растений.
Однако метод клонального микроразмножения у нас в стране не получил такого широкого промышленного распространения в системе производства оздоровленного посадочного материала. Это связано с тем, что на практике воспроизводимость результатов весьма низка, а размножение многих видов растений in vitro остается в основном на лабораторной стадии. При размножении in vitro индивидуальная реакция генотипов проявляется значительно сильнее, чем при традиционных способах размножения. Условия?, культивирования, разработанные для одних форм и сортов, не всегда могут быть использованы для размножения других. Остаются нерешенными такие проблемы, как* низкая регерационная способность отдельных генотипов,„вит-рификация тканей, ингибирование ростовых процессов фенольными соединениями, борьба с микроорганизмами, особенно бактериями, паразитирующими в тканях, а также отсутствие знаний о закономерностях процессов регенерации. Большие капитальные и текущие расходы на оборудование и необходимость использования высококвалифицированного персонала являются также ограничивающим фактором использования этого метода размножения. Поэтому разработка эффективных способов регенерации из изолированных соматических тканей, повышение уровня регенерационного потенциала на основных этапах микроразмножения, поиск общих закономерностей морфогенеза актуальны в настоящее время и позволят повысить практическую значимость данного метода размножения, как в системе производства оздоровленного посадочного материала, так и селекции.
Заключение Диссертация по теме "Плодоводство, виноградарство", Матушкина, Ольга Васильевна
ВЫВОДЫ
1. Оптимизированы основные этапы клонального микроразмножения (введение в культуру и собственно микроразмножения) клоновых подвоев и сортов яблони и груши с учетом генотипических особенностей и изучены особенности адвентивного органогенеза их из соматических тканей.
2. Высокая степень дифференциации меристематических тканей на этапе введения в культуру in vitro обеспечивается в оптимальный срок вычленения (фаза активного роста побегов) с предпочтительным использованием апикальнах почек с размером эксплантов от 0,5 до 1,5 мм.
3. Наиболее эффективной при введении в культуру in vitro яблони и груши является среда Кворина-Лепуавра с добавлением БАП в концентрации не более 0,5 мг/л. Присутствие в питательной среде других регуляторов роста - ГК(0,02 мг/л) и ИМК (0, 02 мг/л) является не целесообразным.
4. Высокий морфогенез яблони и груши на этапе пролиферации обеспечивается как при использовании среды Кворина-Лепуавра, так и среды Мурасиге-Скуга с 1/4 содержанием аммонийной формы азота и введением БАП в концентрации 2,0 мг/л.
5. Снижение уровня витрификации побегов обеспечивается, в зависимости от генотипа, за счет уменьшения концентрации БАП в среде до 0,5 мг/л или использования более слабого цитокинина - кинетина (5,0 мг/л).
6. Для улучшения качества микропобегов целесообразно непосредственно перед этапом укоренения содержание БАП в среде снижать до 1,0 мг/л, а также дополнять среду (на фоне БАП 2,0 мг/л) аденин-сульфатом, или, в зависимости от генотипа, антиоксидантом (АК, ЛК, ПВП). Введение ГК (0,20,5 мг/л) и ИМК (0,1 мг/л) не обеспечивает получение стандартных для укоренения побегов и не влияет на коэффициент размножения.
7. Длительное (до 10 пассажей) культивирование in vitro оказывает влияние на степень пролиферации, обеспечивая за счет реювенилизации тканей увеличение коэффициента размножения к 5-7 пассажу, при этом феноти-пических отклонений не выявлено.
8. Использование пониженных температур (до +4° С) и концентрации БАП (до 1,0 мг/л) дает возможность продлить срок беспересадочного хранения растений яблони и груши in vitro до 6 месяцев.
9. Оптимальной по минеральному составу средой для индукции адвентивных побегов является Мурасиге-Скуга с соотношением БАП к ИМК 20:1, обеспечивающая уровень регенерации побегов из листовых эксплантов у яблони до 58,3% (62-396) и у груши до 40,0% (груша № 12).
10. Морфогенетический потенциал соматических тканей зависит не только от типа эксплантов, но и ориентации листовых пластинок на питательной среде. Более высокой регенерацией обладают ткани стеблей и листьев, которые целесообразно располагать адаксиально.
11. Увеличению образования адвентивных побегов у плодовых культур на 10,0-40,0% способствует культивирование листовых пластинок и каллус-ных тканей в течение первых двух недель в темноте и при пониженных температурах (до +4° С).
12. Коэффициент размножения адвентивных и пазушных побегов подвоев яблони и груши в большей степени зависит от генотипа, чем от модели размножения in vitro.
13. Включение метода клонального микроразмножения в технологию производства оздоровленного высококачественного посадочного материала позволяет не только выпускать конкурентоспособный посадочный материал высших категорий качества, но и повысить рентабельность производства подвоев яблони в 1,5 раза.
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ НАУКИ И ПРОИЗВОДСТВА
Для включения биотехнологических приемов в технологию производства посадочного материала высших категорий качества целесообразно:
1. Оптимальный срок изоляции эксплантов в фазе активного роста растений.
2. Культивирование эксплантов на этапе введения в культуру in vitro проводить на среде Кворина-Лепуавра с содержанием БАП не более 0,5 мг/л, постепенно доводя его концентрацию до 2,0 мг/л на этапе пролиферации.
3. Для увеличения количества побегов, оптимальной для укоренения длины, перед этапом ризогенеза необходимо: снижать содержание БАП в среде до 1,0 мг/л; или наряду с БАП 2,0 мг/л вводить производный цитоки-нина-аденин-сульфат в концентрации 50,0 мг/л; или добавлять в зависимости от генотипа, антиоксидант (аскорбиновую кислоту и лимонную кислоту по 20,0 мг/л, поливинилпирроллидон- 30,0 мг/л).
4. Для снижения уровня витрифицикации целесообразно экспланты культивировать на средах с 0,5 мг/л БАП или вводить более слабый цитоки-нин - кинетин в концентрации 5,0 мг/л.
5. Регенерацию яблони и груши в культуре листовых эксплантов рекомендуем осуществлять на среде Мурасиге-Скуга с БАП 2,0 мг/л в сочетании с 0,2 мг/л ИМК с предпочтительным культивированием в течение первых 2 недель в темноте и температуре +4° С.
При размножении яблони и груши in vitro предлагаем руководствоваться разработанными в соавторстве методиками:
- учебным пособием «Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур». - Воронеж: ВГАУ, 2003.- 80 е.;
- «Методикой регенерации яблони и груши из пазушных меристем и вегетативных органов». - Мичуринск-наукоград РФ. - 2006.- 20 е., предназначенными для научно - исследовательских и промышленных лабораторий биотехнологии, а также высших учебных заведений по агрономическому и агроэкологическому образованию.
Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Матушкина, Ольга Васильевна, Мичуринск
1. Абраменко, Н.М. Укоренение в нестерильных условиях побегов плодовых, размноженных in vitro / Н.М. Абраменко, Р.В. Стаканова, A.M. Чернец // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. науч. конф. -Кишинев: Штиица, 1983. С. 112.
2. Бартиш, ИВ. Микроклональное размножение груши (Pyrus communis L.) in vitro / И.В. Бартиш, C.M. Меркулов, В.И. Корховой, В.П. Копань // Физиология и биохимия культурных растений. 1994.- №1. - С. 84-90.
3. Бартиш, И.В. Состав культуральной среды и эффективность образования побегов in vitro из листовых эксплантов яблони / И.В. Бартиш, В.И. Корховой // Физиология растений.- 1997. Т. 44, №1. - С. 440-444.
4. Бленда, В.Ф. Фитогормональная оптимизация сред при регенерации черешни in vitro / В.Ф. Бленда, Ф.Л. Калинин, Е.Д. Кириленко // Культура клеток и биотехнология: Тез. науч. конф. Кишинев: Штиица, 1983. - С. 116.
5. Бурдасов, В.М. Особенности микроклонального размножения яблони / В.М. Бурдасов, Е.И. Ильина, Н.В. Коннова // Биология-культивируемых клеток и,биотехнология: Тез. докл. междун. конф. Новосибирск, 1988. С. 360.
6. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза/ Р.Г. Бутенко.- М.: Наука, 1964. 272 с.
7. Бутенко, Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений / Р.Г. Бутенко // Гормональная регуляция онтогенеза растений. М.: Наука, 1984.-С. 42-54.
8. Бутенко; Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике / Р.Г. Бутенко, С.Г. Муромцев, Т.И. Тихоненко; М.И. Прокофьев // Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Агропромиздат, 1990. — 379'с.
9. Вердеревская, Т.Д. Получение и ускоренное размножение безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур / Т.Д. Вердеревская, Н.М. Абраменко // Садоводство, виноградарство и-виноделие Молдавии. 1984. - №6: - С. 26-28.'
10. Верзилин, А.В. Оздоровление и клональное микроразмножение слаборослых подвоев яблони: монография / А.В. Верзилин, В. А. Минаев, А. М. Тарасов. Мичуринск: МГПИ, 2007. - 146 с.
11. Вовк, В.В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение межвидовых, ремонтантных форм малины методом in vitro: Авто-реф. дис. канд. с.-х. наук. Брянск, 2000. - 20 с.
12. Волгина;, М.А. Микроклональное размножение подвоев яблони и груши / М.А. Волгина, К.Г. Карычев, Г.Ю. Ковальчук // Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве: Сб. науч. тр. Алмалы, 1977.-С. 11-15.
13. Высоцкий В.А. Действие некоторых регуляторов роста на изолированные меристематические верхушки черной смородины / В.А. Высоцкий// Плодоводство и ягодоводство Нечерноземной зоны: Сб. науч. тр. НИЗИСНП. -М, 1976.-С. 101-107.
14. Высоцкий, В.А. Морфогенез и клональное микроразмножение растений / В:А. Высоцкий // Культура клеток растений и биотехнология: Сб. науч тр. М.: Наука, 1986. - С. 91-102.
15. Высоцкий, В!А. Клональное микроразмножение некоторых форм груши / В.А. Высоцкий // Биология-культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. междун. конф. Новосибирск, 1988. - С. 318.
16. Высоцкий, В.А. Биотехнологические методы в садоводстве / В.А. Высоцкий // Современные проблемы плодоводства: Тез. докл. междунар. конф., посвящ. 70-летию Белорус. НИИ плодоводства (Самохваловичи, 9-13 октября 1995г.). Самохваловичи, 1995. С. 16.
17. Высоцкий, В.А. О генетической стабильности при-клональном*микроразмножении плодовых и ягодных культур / В:А. Высоцкий // С.-х. Било-гия. 1995.-№5.- С. 57-63.
18. Высоцкий; В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений: Автореф. дис.доктора с.-х. наук. М., 1998. -44 с.
19. Высоцкий, В.А. Клональное микроразмножение в системе производства оздоровленного посадочного материала малины / В.А. Высоцкий, Н.В. Герасимова // Ягодоводство в Нечерноземье: Сб. науч. тр. ВСТИСП. -М., 1989. С. 65-74.
20. Высоцкий,' В.А. Клональное микроразмножение пиона травянистого / В.А. Высоцкий, H.JI. Ипполитова, Ф.Л. Поликарпова, Г.А. Талалаева // Озеленение населенных мест: Экспресс информация. 1985. - Вып. 2, №24.6 с.
21. Высоцкий, В.А. Микроклональное размножение яблони / В.А. Высоцкий, О.А. Леонтьев-Орлов // Садоводство. 1983. - №7. - С. 20-21.
22. Геринг, X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при клональном микроразмножении. / X. Геринг // Биология культивируемых клеток и биотехнология- растений.- М.: Наука, 1991. -С. 197-200.
23. Гудвин, Т. Введение в биохимию растений / Т. Гудвин, Э. Мерсер.-Пер. с англ.- М.: Мир, 1986. Т. 2. - 312 с.
24. Деменко, В.И. Хранение растений земляники / В.И. Деменко, В.Г. Трушечкин // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: Тез. Докл. Международной конференции 2-6 августа. Новосибирск, 1988. - С. 393.
25. Дерфлинг, К. Гормоны растений. Системный подход / К. Дер-флинг.- Пер. с англ. М.: Мир, 1985. - 304 с.
26. Докл. VIII Международной конференции 9-13 сентября. Саратов, 2003. -С. 109.
27. Дмитриева, Н.Н. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей / Н.Н. Дмитриева // Культура клеток растений.-М., 1981. С. 113.
28. Долгих, С.Г. Размножение и выращивание яблони в корнесобствен-ной культуре / С.Г. Долгих // Садоводство и виноградарство. 2004. - № 5. -С.14-17.
29. Еремин, Г.В. Продуктивность суперэлитного черенкового маточника подвоев косточковых культур / Г.В. Еремин // Садоводство и виноградарство. 1995.-№ 4. - С. 14-15.
30. Заузолкова, Н.П. Микроразмножение алычи / Н.П. Заузолкова // Проблемы интенсификации современного садоводства: Тез. докл. науч. конф. молодых ученых. Мичуринск, 1990. - С. 165-166.
31. Змушко, А.А. Сомаклональная вариабельность в культуре in vivo/ А.А. Змушко // Плодоводство. Институт Национальной академии наук Беларуси.- Самохваловичи, 2004. Т. 16. - С. 289-293.
32. Змушко, А.А. Цитологическое изучение самоклональной вариабельности клоновых подвоев яблони в условиях in vitro и in vivo / А.А. Змушко // Плодоводство. Институт Национальной академии наук Беларуси.-Самохваловичи, 2007. Т. 19. - С. 40-45.
33. Иванова К. Нова техника на работа във фаза мултипликация при микроразмножаване на ябълкови подложки / К. Иванова // Растен. Науки.-1987.-Т. 24, №7.-С. 15-19.
34. Иванова, К. Влияние БАП на развитие пазушных меристем подвоя яблони МАК 9 / К. Иванова // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. междун. конф. Новосибирск, 1988. - 4.2. - С. 374-375.
35. Ильина, Е.И. Опыт ускоренного размножения яблони in vitro / Е.И. Ильина // Ускорение научно-технического прогресса в плодоводстве и вино-градастве и задачи молодых ученых.- Алма-Ата, 1987.- С. 27-28.
36. Калинин, Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений / Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая.- Киев: Наукова Думка, 1992.-213с.
37. Карычев, К.Г. Корнесобствееные деревья сливы (из in vitro) в саду / К.Г. Карычев, А.И. Янкова // Садоводство и виноградарство. 2004. -№ 1. -С.11-12.
38. Катаева, Н.В. Клональное микроразмножение трудноразмножаемых сортов яблони / Н.В. Катаева // С.-х биология.- М.: Агропромиздат, 1986. -№4.-С. 18-22.
39. Катаева, Н.В. Значение гормонов в формировании витрифициро-ванных побегов яблони при микроразмножении / Н.В. Катаева, И.Г. Александрова, Е.В. Драгавцева // Биология культивируемых клеток и биотехнология.- М.: Наука, 1991. С. 189-192.
40. Катаева, Н.В. Клональное микроразмножение растений / Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1983. - 96 с.
41. Кашин, В.И. Научные основы российского питомниководства / В.И. Кашин // Вестник с/х науки. 2000. - №2. - С. 10-15.
42. Кефели, В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны / В.И. Кефели. М.: Наука, 1974. 253с.
43. Кефели, В.И. Рост растений / В.И. Кефели.- М.: Колос, 1984. 175с.
44. Кефели В.И. Фитогормоны и поиск новых регуляторов продуктивности растений / В.И. Кефели // Сельскохозяйственная биология.- 1987. -№12. -С. 81-85.
45. Кравяж, К. Взаимодействие абсцизовой кислоты и цитокинина в регуляции роста и позеленения семядолей тыквы / К. Кравяж, Н.Н. Каравайко, Э.М. Коф, О.Н. Кулаева // Физиология растений. 1977.-Т. 24, вып. 1. -С. 160-166.
46. Корнацкий, С.А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздоровленного посадочного материала: Автореф. дис.канд. с.-х. наук.- М., 1991. -24с.
47. Кулаева, О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка / О.Н. Кулаева. М.: Наука, 1982. -82 с.
48. Кулаева, О.Н. Достижения и перспективы в исследованиях фито-гормонов / О.Н. Кулаева, М.Х. Чайлахян // Агрохимия. Материалы XI Меж-дунар. конф. по ростовым веществам. 1984. - №1. - С. 106-128.
49. Куликов, И.М. Биотехнологические приемы в садоводстве: экономические аспекты / И.М. Куликов, В.А. Высоцкий, А.А. Шипунова // Садоводство и виноградарство. 2005. - № 5. - С. 24-27.
50. Куликов, И.М. Биотехнологические приемы в садоводстве и развитие идей И.В. Мичурина / И.М. Куликов, В.А. Высоцкий // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. тр. ВСТИСП, 2005. Т. 13. - С. 3-17.
51. Лебедев, В.Г. Регенерация адвентивных побегов из листовой ткани груши обыкновенной (P. communis L.) / В.Г. Лебедев, В. И. Деменко, С.В. Долгов // Сб. тр. науч. конф. мол. уч. и спец. М., 1999. - С.142-146.
52. Лебедев, В.Г. Потенциальные возможности адвентивного органогенеза у различных сортов груши / В.Г. Лебедев, В. И. Деменко, С.В. Долгов // Известия ТСХА. 2004. - № 4. - С 81-87.
53. Лейке, Г. Использование культуры тканей и органов в селекции растений и производстве посадочного материала / Г.Лейке, Р. Лобес, К. Эртель.-М.: Колос, 1990.-77 с.
54. Леонтьев-Орлов, О.А. Разработка клонального микроразмножения яблони: Автореф. дис.канд. с.-х. наук. М., 1986.- 24 с.
55. Леонтьев-Орлов, О.А. Особенности культивирования изолированных апексов яблони in vitro / О.А. Леонтьев-Орлов, В.Г. Трушечкин, В.А. Высоцкий // Плодоводство в Нечерноземной полосе: Сб. науч. тр. М., 1988. -С. 21-30.
56. Ломовская, Л.В. Методы оздоровления и размножения перспективных форм груши in vitro / Л.В Ломовская // Достижения науки и техники АПК. 2004. - № 3. - С. 13-15.
57. Ломовская, Л.В Особенности размножения перспективных форм груши в культуре in vitro / Л.В Ломовская // Селекция и сортовая агротехника плодовых культур: Сб науч тр. Орел, 2004. - С. 107-113.
58. Марченко, А.О. Гормональная регуляция морфогенетических процессов в культуре соматических тканей винограда / А.О. Марченко // Физиология и биохимия культурных растений. 1997. - Т. 29, №5. - С. 356-362.
59. Меркулов, С.М. Регенерация адвентивных побегов из листовых тканей груши (Pyrus communis L.) / С.М. Меркулов, И.В. Бартиш, Ю.Ю. Глеба // Физиология и биохимия культурных растений. 1993. - Т. 25, №4. - С. 376379.
60. Минаев, В.А. Клональное микроразмножение слаборослых клоновых подвоев яблони селекции Мич. ГАУ / В.А. Минаев, А.В. Верзилин, В.А. Высоцкий // Садоводство и виноградрство. 2003. - №5. - С. 12-13.
61. Михальчик, JI.C. Ускоренное выращивание посадочного материала яблони для интенсивных насаждений Нечерноземной зоны РСФСР: Автореф. дис.канд. с.-х. наук. М., 1990. - 25 с.
62. Моисеева, Н.А. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений / Н.А. Моисеева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 166-185.
63. Муратова, С.А. Индукция морфогенеза в культуре соматических тканей сливы домашней (Prunus domestica L.): Автореф. дис.биол. наук. -М., 2002.-23 с.
64. Муратова, С.А. Особенности введения в культуру in vitro плодовых и ягодных растений / С.А.Муратова, М.Б. Янковская, Д.Г. Шорников, Н.В. Соловых, В.М. Тюленев // Плодоводство: Научные труды, Самохваловичи, 2005.-Т. 17, ч. 2. С.182-184.
65. Муромцев, Г.С. Гиббереллины / Г.С. Муромцев, В.Н. Ангистикова. -М.: Наука, 1984.-208 с.
66. Неделчева, С. Установяване на подходящи компонента на хранитесь на среда през фаз пъпкова пролиферация при размножаване in vitro на круша / Славка Неделчева // Растениевъд. Науки., 1990.- Вып. 27, №8. С. 3031.
67. Огольцева, Т.П. Апробация сортов земляники при микроклональ-ном размножении / Т.П. Огольцева, М.И. Джигадло // Садоводство и виноградарство.- 1988. №11. - С. 26-29.
68. Олешко, Е.В. Особенности клонального микроразмножения подвоев и сортов вишни / Е.В. Олешко. М., 1985.- 15 с.
69. Острейко, С.А. О полифункциональности регуляторов роста и развития растений / С.А. Острейко, Э.М. Дроздовский // Сельскохозяйственная биология.-1981.-Т. 16.- №5.- С. 702-712.
70. Острейко, С.А. Роль естественного отбора в онтогенезе растений (основы цитоклональной теории онтогенеза) / С.А. Острейко // Физиология растений.- 1985. Т. 32, вып.З. - С. 585-604.
71. Острейко, С.А. О генетической и фенотипической стабильности при культуре растений in vitro / С.А. Острейко, Э.М. Дроздовский // Плодоовощное хозяйство. 1987. №12. - С. 30-31.
72. Полевой, В.В. Фитогормоны / В.В. Полевой.- Д.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1982. 248 с.
73. Попов, Ю.Г. Культура in vitro меристематических верхушек стебля как метод оздоровления и размножения растений / Ю.Г. Попов // Биологические науки. 1976. - №6. - С. 13-24.
74. Попов, Ю.Г. Культура изолированных стеблевых верхушек вишни / Ю.Г. Попов, В.А. Высоцкий // Физиология растений. 1976. - Т. 23, вып. 3. -С. 513-518.
75. Радилова, Л.Д. Видовые и сортовые особенности ризогенеза плодовых и ягодных в культуре-тканей / Л.Д. Радилова, B.C. Бленда // Проблемы интенсификации современного садоводства: Тез. докл. ВНИИС им. И.В. Мичурина. -Мичуринск, 1990. С.159-160.
76. Рункова, Л.В. Действие цитокининов на декоративные растения / Л.В. Рункова // Стимуляторы и ингибиторы ростовых процессов. М.: Наука, 1988.-С. 110-123.
77. Самусь, В.А. Предварительные результаты инициации культуры in vitro районированных подвоев яблони / В.А. Самусь, С.Э. Семенас, А.П. Ко-ноплева // Плодоводство: Научные труды, Самохваловичи, 2003. Т. 14. -С.22-28.
78. Свитайло, A.M. Клональное микроразмножение подвоев и сортов плодовых культур / Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. междун. конф. Новосибирск, 1988. - С.346.
79. Семенас, С.Э. Клональное микроразмножение подвоя яблони ПБ-4 / С.Э. Семенас // Плодоводство: Научные труды, Самохваловичи, 2005. Т. 17,, ч. 1. - С.67-70.
80. Сидоров, В.А. Биотехнология растений / А.В. Сидоров // Клеточная селекция. Киев: Наукова думка, 1990. - 279 с.
81. Сковородников, Д.Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины: Автореф. дис.канд. с.-х. наук. Брянск, 2004. -20 с.
82. Созинов, А.А. Генетика и урожай / А.А. Созинов, Ю.П. Лаптев. -М.: Наука, 1986.- 167 с.
83. Стаканова, Р.В. Ускорение размножения подвоев яблони в асептических условиях / Р.В. Стаканова, Н.М. Абраменко // Садоводство и виноделие Молдавии. 1984. - №6. - С. 29-31.
84. Татаринов, А.Н. Вредоносность гутаперчивости и вирусных болезней яблони / А.Н. Татаринов // Садоводство и виноградарство. 1994. - №5-6. -С. 10-11.
85. Трушечкин,.В.Г. Предпосылки для микроклонального размножения подвоев и скелетообразователей груши / В .Г. Трушечкин, В.А. Высоцкий // Шодоводство Нечерноземной полосы: Сб. науч: тр. М., 1984: - с. 8-15.
86. Трушечкин, В.Г. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур / В.Г. Трушечкин, В:А. Высоцкий // Плодоовощное хозяйство.-1985.-№1.-С. 43-46.
87. Тюленев, В.М. Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур: Методические рекомендации / В.М; Тюленев. Мичуринск, 1996. - 74с.
88. Упадышев, М.Т. Клональное микроразмножение и особенности регенерации ежевики и малины черной in vitro: Автореф. дис.канд. с.-х. наук. М., 1991. -21 с.
89. Упадышев, М.Т. Регенерационная способность эксплантоврода Rubus в зависимости- от длительности: культивирования in vitro / М.Т. Упадышев, В.А. Высоцкий // С.-х. Биология. 1995. - №1. - С. 85-88.
90. Уэринг, Ф.Ф. Физиология клубнеобразования и роль фитогормо-нов/Ф.Ф. Уэринг // Гормональная регуляция онтогенеза растений. М.: Наука, 1984. - С. 55-70.
91. Фартзинова, И.М. Пат. 2141524 Россия МПК с 12№ 5/04 А 01 Н 4/00 Горек, гос. аграр. ун-т- № 96116867/13/ И.М. Фартзинова.- 20.11.99, Бюл. №32.
92. Хромова, JI.M. Влияние регуляторов роста на морфогенез в культуре апикальной меристемы / JI.M. Хромова, JI.H. Трофимец, В.А. Князев // Защита картофеля от вирусных болезней в семеноводстве: Науч. тр. 1977. -Вып. XXX.-С. 19-25.
93. Чайлахян, М.Х. Регуляторы роста в жизни растений и в практике сельского хозяйства / М.Х. Чайлахян // Вестник АН СССР.- 1982.-№ 1.- С. 1126.
94. Чайлахян, М.Х. Пол растений и его гормональная регуляция / М.Х. Чайлахян, В.Н. Хрянин. М.: Наука, 1982. - 173 с.
95. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник / B.C. Шевелуха, Е.А.Калашникова, С.В. Дегтярев и др.: Под ред. B.C. Шеве-лухи. М.: Высш. шк., 1998. - 416 с.
96. Ancherani, M. Adventitious Shoot Formation from in vitro Leaves of MM 106 Apple Clonal Rootstock / M Ancherani, P. Rosati, S. Predieri // Asta Hor-tic.-1990. V. 280.-P. 95-98.
97. Angiboust, A. La multiplikation vegetative « in vitro « une nouvelle nouvelle technigue de point au service de 1' arboriculture / A.Angiboust // A.R.B. FRUIT. AN.-1980. - V. 27, № 322. - P. 39-46.
98. Antonelli, M. The use of a brief 2,4Д treatment to induce leaf regeneration of Prunus canescens / M. Antonelli, P. Druart // Bois Asta Hortic. 1990. -V. 280. - P. 45-50.
99. Arena Miriam, E. Factores and afectan la multiplication in vitro de los brotes de portainjertos de Prunus / E. Arena Mirian, H. Caso Osvaldo // Fyton. -1992.-V. 53, №1.- P. 29-39.
100. Banno, K. Plant regeneration fromleaf segments cultured in vitro in Ja-panse pear / К Banno, F. Famura, K. Tanabe // Abstracts of contributed papers 1 Oral: XXIII Inter. Hort Congres, Firenze (Italy Aug.- Sept.) 1990. - P. 122.
101. Baumann, G. Van Olfers Influence of increased nitrogen supply on mineral composition and growth sour cherry trees in the-acute and the chronic course of Steck len berg disease / G. Baumann // Acta Hortic. 1976. - P. 11-12.
102. Befazi, M. Direct organogenesis from internal segments of in vitro grown shoots of apple of Golden Delicius / M. Befazi, H. Tani, B.S. Sagwan, R.S. Norrel // Plant Cell Repts. 1991. - V. 9, № 9. - P. 471-474.
103. Belmares, F.A. In vitro shoot proliferation of MM 106 apple and* Marianna 26 "24' pluru / F.A-. Belmares, M.A. Bustamante // Hort. Sci. 1987. -V. 22, №5.-P. 11-12.
104. Borkowska, B. Activity of thidiazuron in vitro shoot cultures of Prunus sp. and Moms alba / B. Borkowska, W. Litwinczuk // Biol. Plantarum. 1993. - V. 35, №1.- P. 63-67.
105. Bottcher, I. Induction and reversion of vitrification of plants cultured in vitro / I. Bottcher, K. Loglauer, H. Goring // Physiol plant. 1981. - V. 72. -P. 556-564.
106. Boxus, P. La micropropagation in vitro du fraisier / P. Boxus // Proc. XIX intern hortic congr. 1974. - V. 1.- P. 65.
107. Boxus, P. Chapter / P. Boxus, P. Druart // Virus-Free Trees Through Tissue Culture Biotechnology in Agriculture and Forestry.- 1986.-V.1.- P. 24-30.
108. Broome, O.C. In vitro propagation of blackberry / O.C.Boomt, R.H. Zimmerman//Hort/Sci., 1978. V. 13, № 2. - P. 151-153.
109. Callow, P. In vitro shoot regeneration of leaf tissue from mikropropaga-tion highbuch blueberry / P. Callow, K. Haghighi, M. Giraux // Amer. Soc. Hort Sci. 1988. - V. 23(3), S. 2.-P. 807-808.
110. Capelle, S.C. Efects of thidiazuron on cytokinin autonomy and metabolism of N6- (Д2 isopentenyl) 8-14C. adenosine in callus tissue of Phasceolus lu-natus Ь / S.C. Capelle, D.W.S. Мок, S.C. ICirchner // Plant Physiol. - 1983. -V. 73. - P. 796-802.
111. Carr, D.J. Metabolitic and hormonal regulation of growth and development / D.J.Carr // Trends in Plant. Morphogenesis. 1966. P. 253-283.
112. Casas, A. Multiplication «in vitro» en remolacha azucarera (Betatvulgaris L.) Tipo de cxplante y, sistema de estericion / A. Casas, J.M. Lasa // An. Etac. exp. Aula Dei. 1986. - V. 18, № 1.-2. - P: 51-56. ■
113. Cheng, T.Y. Micropropagation of fruit tree rootstocks Proc of the con-verence on Nursery Pro-duction of fruit plants through tissue culture / T.Y. Cheng // Applicat and Feasibility. - 1980. -V. 11. - P. 53.
114. Chervrau, E. Adventitious shoot regeneration from leaf tissue of trae pear (Pyrus Sp.) cultivars in vitro / E. Chervrau, R.M. Skirvin, H'.A. Abu-Quoud // Ibid. 1989. - V. 7, № 12. - P. 688-691.
115. Chong, C. Carbon nutrition of Ottawa-3 apple rootstock during stages of in vitro propagation / C. Chong, E. Pya // J. Hortic. Sc. 1985. -V. 60, № 3. -P. 285-290.
116. Chu, C.C. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments nitrogen sourus / C.C. Chu, C.C. Wang, C.S. Sun, C. Hsu, K.C. Jin, C.Y. Chu, F.Y. Pi // Sci Sinica. 1975. - V. 18. - P. 659688.
117. Chvajka, L. Influence of Stimulating Doses of 6-Benzylaminopurine on Awakening Apple Buds and on their. Consumption of Oxygen / L. Chvajka, M. Travnicek, M. Lakoufiilova // Biologia plantarum (Praha). 1962. - V. 4, № 3. -P. 203-206.
118. Cornu, D. Bacteria contaminants in shoot cultures of Prunus avium L. Choice and phytotoxicity of antibiotics / D. Cornu, M. F. Michel // Acta Hortic. -1987.-№212.-P. 83-86.
119. Czynczyk, A. Influence of mikropropagation on the herformance and guality of P 22 rootstock in mother plantation / A. Czynczyk, G Hodun, P. Bielich // J. Fruit, ornamental Plant. Res. 1994. - V.2, № 3. - P. 91-100.
120. Diaz, T. Effect of culture media and tupe of propacation of Vitus vinif-era L. cv Alvarino / T. Diaz, M.V. Mosguera, M.C. San Jose, E. Gonzalen // Vitus Viticulat and Absin. 1999. - V. 38, № 3. - P. 6-7.
121. Druart, H.H. Plantlet regeneration from calus of different. Prunus species / H.H. Druart // Sci. Hort. 1980. - V. 12, № 4. - P.339-342.
122. Druart, P. C-source and growth response of Prunus glandulosa «Sinensis» Thund and Malus pumila Mill M 26 and M9 Clone 29 during in vitro propagation / P. Druart // Bull Rech agron. Gembloux.- 1995.-V. 30, № 1/2. P. 29-37.
123. Dolset-Sanjuan, R. In vitro manipulations of Pyrus shecies and Cydonia oblonga / R. Dolset-Sanjuan, D.W.O. Мок, M;S. Мок // Abstracts of coutibuted papers 1 Oral: XXIII, Intern. Hort. Congress, Firenze (Italy) August 27-Sept.l 1990.-P. 121.
124. Dulset-Sanjuan^ R. Plantlet regeneration from cultured leaves of Cy-donid oblonga L. guince/ R. Dulset-Sanjuan, D.W.S. Мок, M.S. Мок// Ihid.-1992,- V. 10, № 5.-P. 240-242.
125. Dunstan, D.propagation in vitro of the apple rootstock M4 effect of phytormonesvjn shoot guality / D. Dunstan, K.Turner, W.Lazaraff// Plant Cell Tissue Cult.-1985. V. 4. - P. 55-60.
126. Durham, M.E. Explant Size, Pretreament, and Light Intensity on shoot Regeneration from in vitro- Grown Apple Leaves / M.E. Durham, S.S. Korban, H. Schmidt, M. Kellerhals // Dordrecht Kluwer Acad. Publ. 1994. - P. 355-359.
127. Einset, J.W. Cytokinin consumption by micropropagated shoots / J.W. Einset// Comb. Proc: Intern Plant Propagators Soc. 1987. - V. 36. - P: 635-640.
128. Embree, O.L. Pield perforance and micropropagation of a hardy apple rootstock candidate KSC 3 / C.L. Embree, L.S. Kicks // Can. J. Plant. Sci.- 1985. -V. 65, № 2. - P. 459-464.
129. Famiani, F. Effect of Leaf Excision Time and Age, B.A. Concentration: and Dark Areatment on in vitro Shoot Regeneration of M26 Apple Rootstock / F.
130. Famiani; N. Fertadini, P. Stujfolani, A. Standarti // J. Hort. Sci.- 1994. V. 69, № 4. - P. 679-685.
131. Fasolo, F. Cultivar Dependent Responses to Regeneration from Leaves in Apple / F. Fasolo, S. Predieri // Acta Hort. 1990. - V. 280. - P. 61-68.
132. Fasolo, F. Adventitious Shoot Formation on Excised leaves of. in vitro Grown Shoots of Apple Cultivars / F. Fasolo, R.H. Zimmerman, I. Fordham // Plant Cell Tussue Organ Cult. 1989. - V. 16, № 2. - P. 75-87.
133. Fiorono, P. Propagation of apple cultivars / P. Fiorino//Acta Hort. -1983 .-V. 131.-P. 95-100.159; Fiorino,' P. Propagation! of Fruit; Frees by Tissue Culture in Italy / P. Fiorino, F. Loreti // Hort. Science. 1987. - V. 22 .- P. 353-358.
134. Fossard, R.A. Tissue culture Laboratories overseas / A.K. Fossard // A. seminar directed by Dr. R.A. Fossard // A. seminar for N.S.W. Association of Nurserymen Ltd: University of Sydney, 3-4 December 1977. 1977. - P. 15-53.
135. Golosin, B. Uticaj floroglucinola na razmnozanje in vitro podloge М27/ B. Golosin, L. Radojevic// Jugosl. Vocarstva:-. 1985.- V. 19, № 73-74. S. 371378. ' ■
136. Hanke, V. Untersuchungen zur Regeneratoin an somatischem Gewebe in vitro / V. Hanke, A. Rohpe, C. Grafe // 1. Zur Adwentives prossbildung an Blat-texplanten bei Apfel (Malus domestica Borcka): Gartenbauwissenschaft. 1991. -V. 256, № 5. - S.214-220.
137. Hanke, V. Plant Regeneration from Tissue Cultures of Malus Species: The Importance of the Genotype / V. Hanke, H. Schmidt, M. Kellerhals // Progress in Temperate Fruit Breeding: Kluwer Acad. Publ. 1994. - P. 365-369.
138. Hirabayashi, T. In vitro propagation of Pyrus Shoot Tips / T. Hirabaya-shi, T. Moriguchi, I. Kozaki // Bull Fruit Tree Res Stat Ser A. Yatabe, Ibaraki.-1987.-T. 14.-P. 9-16.
139. Hogue, E.J. Rapid production method for Ottawa-3 rootstock and branched apple nursery stock / E.J. Hogue, D.Neilsen // Hort. Sci.-V. 26 (11). P. 1416-1419.
140. Howard, B.H. Growth characteristics of apparenyly rejuvenated plum shoots / B.H. Howard, O.P. Jones, J. Uasek // Hortic. Sci. 1989. - V.2. - P. 157162.
141. Hussey, G. In vitro propagation of horticultural and agricultural crops / G. Hussey, S.H. Mantell, H. Smith // Plant biotechnology: Cambridge University Press. 1983.-P. 111-138.
142. Hussey, G. Vegetative propagation of plants by tissue culture / G. Hussey // Plant Cell culture technology. 1986.- P. 29-66.
143. Hutchinson, J.F. Micropropagation of «Northern Spy» apple rootstock/ J.F. Hutchinson, // Comb. Proc Intern. Plant Propagators Soc. 1985. - V. 34.-P. 38-48.
144. Ishihara, A. Propagation of apple cultivars and rootstocks by shoot-tip culture / A. Ishihara, M. Katano // Plant Tissue culture. 1982. - P. 733-734.
145. James, D.J. Organogenesis in callus derived from stem and leaf tissues of apple and Cherry rootstocks / D.J. James, A.J. Pasey, S.B. Mathotra // Plant Ceil Tiss Org Cult. 1984. - V. 3. - P. 333-341.
146. James, D.J. In vitro regeneration in apple leaf tisues and its use for transformation via Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes / D.J. James, A.J. Passey, E. Rugini // Moet-Hennessy Conference Fruit Tree Biotechnology. -1986.-P. 53.
147. James, D.J. Affecting High Freguency Plant Regeneration from Apple leaf Tissues Cultured in vitro / D.J. James, A.J. Passey, E. Rugini // J. Plant Physiol:- 1988. V. 132, №1. - P. 148-154.
148. James, D.J. Stoot and root initiation in vitro in the apple rootstock M9 and the promotive effects of phloroglucind / D.J. James, I.J. Thurbon // J. Hort. Sci.- 1981.-V. 56,№ l.-p. 15-20.
149. Jones, O.P. Effect of phloridzin and phloroglucinol on apple shoots I O.P. Jones //Nature. 1976. - V. 262. - P. 392-393.
150. Jones, O.P. Plant regeneration from callus tissue cultures of cherry root-stock Colt (Prunus avium x.p. pseudocerasus) and the apple rootstock M25 (Malus pamila) / O.P. Jones, J.A. Gayner, R. Watkins // J. Hort. Sci. 1984. - V. 59. -P. 463-467.
151. Jones, O.P. Propagation in vitro of M26 apple rootstockes / O.P. Jones, M.E. Hopgood, D.O.1 FarrellV/ Hort. Sci. 1977. - V. 52. - P. 235-238. ,
152. Jones, O.P. Propagation in vitro of five apple scion cyltivars / O.P. Jones, C.A. Pontikis, M.E. Hopgood // Hort. Sci. 1979. - V. 54, № 2. - P. 155158.
153. Kaul, R. Morphogenetic studies on Haworthia: effectis of inositol on growth and differentiation. / R. Kaul, P.S. Sabharwai // Amer. J. Bot. 1975. -V. 62, № 6. - P. 655-659.
154. Kevers, C. Vitrification of carnation in vitro: changer in water content extracellular Space, air volume, and ion levels / C. Kevers, T. Gespar // Physiol. Veg. 1986. - V. 24, № 6. - P. 647-653. .
155. King, S.M. Tissue culture of osage-orange / S.M. King, A.L. Morehart // Hort. Sci.- 1988.- V. 23, № 3.- P. 613-615.
156. Kohen, D. Micropropagation of Fruit Trees / D. Kohen, S.S. Bhojwani // The International Plant Propagators Society (Combined Proceedings). 1980. -V. 30. - P. 142-144.
157. Korban, S.S. Effects of Thidiazuron, Naphtalenacetic Acid, Dak Incula-tion and Genotype on Shoot Organogenesis from Malus Leaves /S.S. Korban, P.A. O' Connor, A. Elobeidy // J. Hort. Sci. 1992. - V. 67, №3. - P. 341-349.
158. Korban, S.S. In vitro shoot regeneration from an infact and a sectioned embryo-axis of apple seeds / S.S. Korban, R.M. Skirvin // Plant Sci. 1985. -V. 39. - P. 61-66.
159. Kouider, M. Influence of embryonic dominance and polarity on adventitious shoot regeneration from apple cotyledons in vitro / M. Kouider, S:S. Korban, R.M. Skirvin, M'.C.Chu // J. Amer Soc. Hortic. Sci. 1984. - V. 109, №3. -P. 381-385.
160. Kouider, M. Adventitions shoot formation from Red Delicious apple cotyledons in vitro / M'. Kouider, R.M. Skirvin, S.S. Korban // J. Hort. Sci. 1984.- V. 59.' -P. 295-302.
161. Lane, W.D. Meristem-tip culture of pear breding prospects / W.D. Lane // Proceedings of Eucarpici fruit section symposium.- Angers. - 1979. -P. 181-188.
162. Lane, W.D. Shoot tissue culture of apple: comparative response on five cultivars to cytokinin and auxin / W.D. Lane, J. M. McDougald // Can. J. Plant Sci.- 1982.-V. 62(3).-P. 689-694.
163. Laimer, M. In vitro kultur zur virusfreimachung alter Apfel sor ten / M. Laimer, A. dac. Machado, V. Hanzez // Mitt Klos terneu burg Rebe Wein: Obstbau Fruchteverwectung. - 1988. - V. 38, №6. - P. 247-249.
164. Le, C.L. Multiplication clonale in vitro du pommier (Malus domestica Borkn, varGarvenstein / C.L. Le // Rev. suisseVitic Arboric. Hortic. 1985. -V. 17, №5.-P. 311-315.
165. Linsmaier, E.M. Organic growth factor reguirements of tobacco tissue cultures / E.M. Linsmaier, F. Skoog // Physiol. Plant. 1965. - V. 18. - P. 100-127.
166. Litz, R.E. Organogenesis and Somatic Ymbriogenesis / R.E. Litz, DJ. Gray, E.A. Hammerschlad // Biotechnology of Perennial Fruit Crops. 1992. -P. 3-34.
167. Liu, Z.R. Regeneration and Genetic Transformation of Apple and Strawberry / Z.R. Liu // M. Sc. Thesis Cornell University. 1987. - P. 106.
168. Liu, J.R. Plant regeneration from apple seedling explants and callus cultures / J.R. Liu, K.C. Sink, F.G. Dennis // Plant Cell Tiss Org Cult. 1983. - V. 2. -P. 293-304.
169. Liu, Y. Hebei nongye daxue xuebao / Ying Liu, Ji-zhong Xu, Jian-zhu Shao, Yi Gao // J. Agr. Univ. Htbti. 2006. - .V. 29, № 3. - P. 10-12.
170. Lloyd, G.B. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture / G.B. Lloyd, B.H. McCown // Comb Prec. Intl. Plant Propagators Soc. 1980. - V. 30. - P. 421-427.
171. Lundengan, C.A. Regulation of apple plants propagation and growth in vitro / C.A. Lundengan, J. Janiek // Horticult Research.- 1980.- V. 20, № 21.-P. 19-24.
172. Luo, Ya Guoshu xuebao / Ya Luo, Haoru Tang, Xiumei Li // J. Fruit Sci. 2005.- V. 22, № 1. - P. 66-68.
173. Machnik, B. Porownanie jakosci podklader czeresni i jabioni z kultur tkankowych w zalernosci od sposobu ich uprawy / B. Machnik, Z.S. Grzyb // Prace Ints Sadown Kwiac Skierniewice. 1994. - T. 31. - P. 119-122.
174. Machnik, B. In vitro propagation of P22 Malus Clonal rootstock // B. Machnik, T. Orlikowska // Fruit Sci. Repts. 1981. - V. 8, № 4. - P. 173-177.
175. Maheswaran, G. Transformation of Apple Rootstock M26 with Agro-bacterium tumefaciens / G. Maheswaran, M. Welander, J.F. Hutchinson, M.W. Graham, D. Richards // J. Plant Physiol. 1992. - V. 139, № 5. - P. 560-568.
176. Mante, S. Plant regeneration from cotyledons of Prunus cerasus / S. Mante, R. Scorza, J. M. Cordts // Plant Cell. Tissue Org. Cult. 1989. - V. 19. -P.1-11.
177. Masuda, Т. Studies on cell tissue and shooptip culture in apple / T. Ma-suda, Y. Yoshida, H. Bessho // 1 Relation ship between abnormal shoot formation and plant hormones: Bull Fruit Tree Res Stat Ser, Morioka, Iwate. 1988. - № 15. -P. 21-28.
178. Mehra, R.N. In vitro morphogenetic studies in pear (Pyrus communis) / R.N. Mehra, Kanchan Jaidka // Phytomorphology. 1979. - V. 29, № 3-4. - P. 268298.
179. Мок, M.C. The metabolism of 14C-thidiazuron in callus tissue of Phaseolus Junatus / M.C. Мок, D.W.S. Мок // Physiol plant. 1985. - V. 65, № 4. - P. 427-432.
180. Мок, M.C. Biological and biochemical' effects of cytokinin active phenylurea derivatives in tissue culture systems / M.C. Мок, D.W.S. Мок. J.E. Turner, C.V. Mujer // Hort Sci. 1987. - V. 22, № 6.- P. 1194-1197.
181. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobaceo tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol Plant.- 1962. V. 15, № 95. - P. 473-497.
182. Nieuwkerk, J.P. Thidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro / J.P. Nieuwkerk, R.H. Zimmerman, J. Fordham // Hort. Sci. 1986. - V. 21, №3.-P. 516-518.
183. Nitsch, J.P. Haploid plant from pollen grains / J.P. Nitsch, C. Nitsch // Scienel. 1969. - V. 163, № 3862. - P. 85-87.
184. Ochalt, S.J. Plant regeneration from mesophyl protoplasts of Willianus Bon Chretien (sin Bartlett) pear (Pyrus communis L.) /S.J. Ochalt, J.B. Power // Plant Cell Repts. 1988. - V. 7, № 12. - P. 587-589.
185. Ognjanow, V. Regeneracija biljaka jabuks kulturom lista in vitro / V. Ognjanow // Jugost Vocarstvo.- 1988. V. 22, №. 86. - S. 423-426.
186. Pagues, M. «Vitrification»: Review of literature / M. Pagues, Ph. Boxus // Acta Hort. 1987. - V. 212. - P. 155-166.
187. Pasgualetto, P.L. Gelling agent and growth regulator effects, on shoot vitrification of Gala apple in vitro / P.L. Pasgualetto, R.H. Zimmerman, R.H. Gelling // Amer. Soc. Horrt. Sci. 1986. - V. 111. - P. 976-979.
188. Pennel D. Micropropagation in Horticulture 3 Essentials of Micro-propagation / D. Pennel / Grower Guide. London, 1987. - № 29. - P. 14-24.
189. Pierik, R.L.M. Vegetative propagation of Freesia through the isolation of shoots in vitro / R.L.M. Pierik, H.H.M. Stoegmans // Neth. J. Agr. Sci. 1976. -V. 24, № 4. - P. 274-277.
190. Piccioni, E. Riduzione dei di lavoro nei processo organogenetico in vitro dei pertainnesto dei melo M26 / E. Piccioni, A. Standandi // Anne Fac agr. Univ. Studi Perugia. 1995. - V. 49. - P. 361-369.
191. Prasad, R.N. Effect of season of collection of explants on micropropagation of Chrysanthemum morifalium / R.N. Prasad, H.C. Chaturvedi // Biol. Plant.- 1988. V. 30, № 1. - P. 20-24.
192. Predieri, S. Shoot Regeneration from Leaves of the Apple Rootstock M26 ( Mallus pumila Mill) / S. Predieri, F.M.F. Fasolo, High-Freguency // Plant Cell Tissue Organ Cull.- 1989. V. 17, № 3,- P. 133-142.
193. Predier, S. Rereneration from in vitro leaves of «Conferense» and other pear cultivars / S. Predier, F.F. Malavasi, A.J. Passey // J. Hort. Sci. 1989. - V. 64, № 5.- P. 553-559.
194. Pua, E.C. In vitro propagation of Ottawa -3 apple rootstock / E.C. Pua, Calvin Chohg, G.L. Rousselle // Can. J. Plant. Sci. 1983. - V. 63, № 1. - P. 183188.
195. Qiaochun, Wang Phenol induced browning and estabilishment of shoot-tip explants of "Fuji" apple and "Jinhua" pear culured in vitro / Wang Qiaochum,
196. Tang Haoru, Quan Yin, Zhou Guangrong // J. Hortic. Sci. 1994. - V. 69, № 5. -P. 833-839.
197. Quoirin M., Lehoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. // Acta. Hortic. 1997. - V. 78. - P. 437-442.
198. Rakoczy-Trojanowska, M. Wplyw czynnikow genetycznych, na regen-eraji roslin w kylturach in vitro / M. Rakoczy-Trojanowska, S. Malepszy // Post, boil, komorki. 1990. - V. 17, № 3. - P. 247-257.
199. Reich, B. The genetic control of bud formation from callus cultures of diploid alfalfa / B. Reich, E.T. Bingham // Plant Sci. Lett. 1981. - V. 20. - P. 7177.
200. Reuther, G. Comparative anatomical and physiological studies with ornamentals plants under in vitro and greenhouse conditions / G. Reuther // Acta Horticulture. 1988. - № 216. - P. 91-98.
201. Rich, A.E. Influence of capple apple and stem pitting viruses- on tree growth and fruit yields over a fourteen year period / A.E. Rich // Plant Dis. Reptr.-1967. V. 51, № 4. - P. 293-295.
202. Rubos, A.C. Morphogenesis in embryonic tissues of apple / J. Hort Sci. V. 59. P. 469-475.
203. Satop, T. Hokkaido ringyo shikenyo kenkuju hokoku / T. Satop // Bull. Hokkaido Forest. Res. Inst. 1994. - № 31. - P. 77-86.
204. Schimmelpfeng, H. Himbeerpflanzen aus Gewebekulturen Erfahrun-gen bei der Weiterkultur und im praktischen Anbau / H. Schimmelpfeng // Obstbau (Bonn).- 1983. - V. 8. - № 7. - S. 321-324.
205. Shen, X-S. Propagation in vitro of, pear, Pyrus communis L., cultivars, Willian's Bon, Chretien, Paackham's Friumph and Beurre Bosc / X-S. Shen, M.G. Mullins // Sc. Hortic. 1984. - V. 23, № 1. - P. 51-57.
206. Shristiansen, J. Prevention by, polyvinylpyrolidone of growth inhibition of Hamamelis shoot tips in vitro and browning of the agar medium / J. Shristiansen, M. Fannesbech // Acta Hort. 1975. - V. 54. - P. 101-104.
207. Singha, S. Skoot proliferation of pear cultures on medium containing thidiazuron and benzylaminopurine / S. Singha, S.R. Bhatia // Amer. Soc. Hort. Sci. 1988. - V. 23(3). - S. 2. - P. 803.
208. Sinska, I. Callus formation and plant regeneration capacity of apple embryonic axes and caiyledons in relation to seed dormancy / I. Sinska // Plant. Sci. 1988. - V. 54, № 2. - P. 147-152.
209. Singha, S. In vitro propagation of Crabapple cultivars / S. Singha // Hort. Sci. 1982. - V. 17, № 2. - P. 191-192.
210. Singha, S. Changes in nutrient composition and pH of the culture medium during in vitro shoot proliferation of crabapple and pear / S. Singha, G.H. Oberly, E.C. Townsend // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1987. - V. 11, №3.-P. 209-221.
211. Skoog, F. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro / F. Skoog, C.O. Miller // The Biological Action of Growth Substances: Symp. Soc. Exp. Biol, Cambridge Univ. Peress. 1957. - V. 11. - P. 118-131.
212. Sriskandarajah, S. Micropropagation of apple scion cultivars / S. Sris-kandarajah, M.G. Mullins // Comb. Proc: Intun Plant Propagators Soc. 1982. -V. 31.-P. 209-213.
213. Sriskandarajah, S. Factors involved in shoot elongation and growth of adventitious and axillazy shoots of three apple scion cultivars in vitro / S. Sriskandarajah, R.M. Skirvin, H. Abu-Qaoud // Jour. Hort. Sci.- 1990. V. 65 (2). - P. 113-121.
214. Swartz, H.J. The Effect of in vitro Prerteatments on Subseguent Shoot Organogenesis From Excixed Rubus and Malus Leaves / HJ. Swartz, R. Bors, F. Mahamed, S.K. Naess // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1990. - V. 21, № 3.-P. 179-184.
215. Steward, F.C. Growth and organized development of cultured cells III Interpretation of the growth from free cells to carrot plants / F.C. Steward // Amer. J. Bot. 1958. - V. 45. - P. 709-713.
216. Tang, Hao-ru Guoshu xuebao / Hao-ru Tang, Cui-giong Liu,Ya Luo // J.Fruit Sci. 2005. - V. - 22, № 6. - P. - 706-708.
217. Theiler-Hedtrich, C. Influence of TDZ and BA an Adventitious Shoot Regeneration from Apple Leaves / C. Theiler-Hedtrich, R. Theiler- Hedtrich // Acta Hort. 1990. - V. 280. - P. 195-199.
218. Thimann, K.V. Hormone action in the whole life ef plants/ K.V. Thi-mann// Amer. Univ. Massachusets press. 1977. - 447p.'
219. Tellman, C.D. Effect of thidiazuron and Cr PPU on meristem formation and shoot proliferation / C.D. Tellman, P.E. Read, M.A. Hosier // Hort. Sci.- 1987. V. 22, №6. -P. 1197-1200.
220. Tetu, T. Hormonal control of organogenesis and somatic embryogene-sis in Beta vulgaris callus / T. Tetu, R.S. Sangwan, B.S. Sangwan-Norreel // J. Exp. Bot. 1987. -V. 38, № 188. -P. 506-517.
221. Van Nieuwkerk, J.P. Thidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro / J.P. Van Nieuwkerk, R.H. Zimmerman, I. Fordham // Hort. Sci.- V. 21.-P. 516-518.
222. Viligas, A.N. Aplication del cultivo de tejiodos en la obtencion de plantas libres de patogenos/ A.N. Viligas, F.P. Barrientos, F.P. Jose, M. Mijia// Symp. Nacional de Parasitologic 1983. - P. 295-300.
223. Walkey, D. Production of apple plantiets from axillarybud meristems / D. Walkey// Canad J. Plant Sci. 1972. - V. 72, № 6. - P. 1085-1087.
224. Watanabe, К. The growth promoting effect of phytic aid on callus tissue of rice seed / K. Watanabe, К. Tanaka, K. Asada, Z. Kasai // Plant and Cell Physiol. 1971. - V. 12, № 1. - P. 161-163.
225. Welander M. Plant regeneration from Leaf and Stem Segments of Shoots Raised in vitro from Mature Apple Trees / M. Welander // Plant Physiol.-1988. V. 132, № 6. - P. 738-744.
226. Welsh, F. Necrotic stem pitting and decline two bud-transmissible diseases, affecting Malus robusta №5 apple rootstock in British Columbia / F. Welsh, L.P.S. Spangelo //Phytopathology. 1971. - V. 52. - P. 2.
227. Werner, E. In vitro propagation of Mailing 7 apple rootstock / E. Werner, A. Boc //Hort. Sci. 1980. - V. 15, № 4. - P. 509-510.
228. White Ph., R. The cultivation of animal and plant cells / Ph. R. White // New York. 1954.-23 9p.
229. Yae, B.W. Influence of photoperiod apical meristem and explant orientation on axillaryshoot proliferation of apple cultivars in vitro / B.W. Yae, R.H. Zimmerman, I. Fordham, K.C. Ко // J. Am. Soc. Hortic. Sci. 1987. - V.l 12, № 3. - P. 588-592.
230. Yepes, L.M. Fastors that Affect Leaf Regeneration Effeciency in Apple, and Effect of Antibiotics in Morphogenesis / L.M. Yepes, H.S. Aldwinckle // Plant Cell. Tissue Organ Cultur. 1994. - V. 37, № 3. - P. 257-269.
231. Young, P.M. Use of antibiotics to control bacteria in shoot cultures of wody plants / P.M. Young, A.S. Hutchins, M.L. Cantield // Plant Sci Litt. 1984. -V. 34. - P. 203-209.
232. Zhang, Xiafang. Dongbei linge daxu xuebao / Xiafang Zhang, Xichun Zhang, Hongwei Liu, Qingya Yao, Qishi Li // I. Nortn: Eaet Forest Unis. 1992. -V. 20, №4.- P. 18-21.
233. Zimmerman, R.H. Fruit plants micropropagation at Beltsville Fruit Laboratory and in North America / R.H. Zimmerman // Rev. Ortoflorofruit. I.t.-1980. V. 64, № 3. - P. 241-256.
234. Zimmerman, R.H. Apple. Handbook of plant cell culture / R.H. Zimmerman // Crop, species New York, 1984. V.2. - P. 369-395.
235. Zimmerman, R.H. Explant orientation affuts axillary shoot proliferation of apple cutivars in vitro / R. H. Zimmerman, I. Fordham // Hot. Sci. -1989.-№2.-P. 251-252.
236. Zimmerman, R.H. Cultivar, planting density, and growth, regulator effects on growth and fruiting of tissue cultured apple trees / R.H. Zimmerman, G.L. Steffens // J. Am. Soc. Hortic. Sci. - 1995. - V. 120, №2. - P. 183-188.
-
Матушкина, Ольга Васильевна
-
кандидата сельскохозяйственных наук
-
Мичуринск, 2008
-
ВАК 06.01.07
- Оптимизация технологии размножения клоновых и семенных подвоев и подбор сорто-подвойных комбинаций плодовых культур для интенсификации садоводства Центрального района России
- Эффективные способы выращивания саженцев груши и яблони на основе черенкования
- Способы размножения клоновых подвоев яблони в условиях юго-запада БССР
- Пути повышения продуктивности маточников клоновых подвоев яблони с использованием горизонтально ориентированных растений и органического субстрата
- Ускоренное выращивание посадочного материала плодовых и ягодных культур в условиях Волгоградской области
