Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Клональное микроразмножение и депонирование перспективных форм груши

ВАК РФ 06.01.01, Общее земледелие

Автореферат диссертации по теме "Клональное микроразмножение и депонирование перспективных форм груши"

005009899

Ташматова Лариса Владимировна

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ДЕПОНИРОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ФОРМ ГРУШИ

Специальность 06.01.01 - общее земледелие

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Орёл-2012

005009899

Диссертация выполнена в государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур Россельхозакадемии в 2001-2004 гг.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Высоцкий Валерий Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Корнацкпй Сергей Аркадьевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений имени И. В. Мичурина

г. (у

Защита диссертации состоится —------------- на заседании диссерта-

ционного совета ДМ 220.05.01. в Орловском государственном аграрном университете по адресу: 302019 г. Орел, ул. Генерала Родина, 69.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ОГАУ (г. Орел, Бульвар Победы 19)

Автореферат разослан « 2012г. и размещен

на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» http://www.orelsau.ru и сайге ВАК при Минобрнауки РФ http://vak.ed.gov.ni.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета ДМ 220.052.01.

Факс 8 (486-2) 43-13-01, e-mail: dissovet-orelsau@vandex.ru

Ученый секретарь диссертационного /'у

совета доктор с.-х. наук, профессор / —Степанова Л. П.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Груша является одной из важнейших плодовых культур средней полосы России. Однако в последние годы наблюдается резкое сокращение площадей данной культуры. Главные причины такого положения связаны, в основном, с отсутствием высокозимостойких сдерживающих рост подвоев, плохой фитосанитарной обстановкой, недостатком посадочного материала современных сортов, отсутствием маточно-сортовых насаждений и технологий получения оздоровленного привойного материала. Решению этих проблем может помочь применение методов размножения in vitro, которые широко используются при размножении и оздоровлении ягодных культур (Al Maanri, Duson, Amand, Mlgimal, 1986, Туровская, О. В. Стрыгина, 1990, Свирвденко, Бурдалов, Дудченко, 1991, Семенас, Кухарчик, 2000).

В связи ускорением темпов селекционного процесса по созданию новых генотипов, а также создания коллекций ценных форм растений важной задачей является разработка эффективных способов сохранения генетических ресурсов. Депонирование при пониженных положительных температурах позволяет поддерживать жизнеспособность микрорастений в течение длительного времени. В результате этого на сравнительно небольшой площади можно разместить большое количество ценного генетического материала.

У ряда культур, в том числе и у груши, этапы укоренения и адаптации связаны с определенными трудностями. Так, при инду кции ризогенеза отдельные генотипы образуют недоразвитую корневую систему либо не образуют вовсе и наблюдается массовая гибель микрорастений. Особый интерес при решении проблем укоренения и адаптации к нестерильным условиям представляет изучение эффективности методов иммуностимуляции и прививки микропобегов из культуры in vitro на сеянцы груши, выращенные в условиях in vivo.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка эффективных приемов клонального микроразмножения и длительного депонирования пробирочных растений груши.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1) найти наилучший стерилизующий агент для груши;

2) подобрать минеральную основу питательных сред;

3) определить тип, концентрацию и сочетание регуляторов роста

для каждого этапа культивирования;

4) изучить способы адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям;

5) изучить возможность прививки материалом in vitro трудноуко-

реняемых форм на семенные подвои;

3

6) изучить состав сред и условия культивирования для длительного

хранения пробирочных растений.

Научная новизна исследований

Впервые в условиях региона проведено детальное изучение клонального микроразмножения сортов и форм груши различного генетического происхождения. Выявлены оптимальные способы стерилизации эксплан-тов груши. На всех этапах микроразмножения показано и обосновано влияние на рост и развитие микрорастений груши химического фактора и сортовых особенностей. С учетом этих факторов подобран оптимальный состав питательных сред для этапов введения в культуру, пролиферации и укоренения эксплантов груши. Прослежено изменение коэффициента размножения и развития груши в зависимости от концентраций БАП и от комбинаций ауксинов, цитокининов и гибберелловой кислоты (ГК). На этапе укоренения исследован процесс образования корней и влияние сортовых особенностей на интенсивность корнеобразования. На этапе адаптации к нестерильным условиям показана возможность применения препаратов группы элиситоров - Экост 1/3 и Эль-1, и их сочетания. Изучен процесс прививки микропобегов груши на семенные подвои в системе ускорения производства посадочного материала некоторых сортов и трудноукореняемых форм груши. Впервые проведено изучение длительного депонирования эксплантов груши при пониженных температурах. Определены оптимальные сроки хранения и состав питательных сред для данного процесса, подобраны концентрации БАП и сахарозы.

Практическая значимость исследований

Создана теоретическая база для разработки технологии хранения и ускоренного получения оздоровленного посадочного материала груши.

Разработан способ депонирования сортов и форм груши in vitro в виде микропобегов для сохранения генетических коллекций.

Определены возможности использования микропобегов в качестве привойного материала для производства оздоровленных саженцев груши.

Разработан способ ускорения производства оздоровленного посадочного материала трудноразмножаемых сортов груши.

Определено влияние различных биологически активных веществ на адаптацию растений груши при выводе из условий in vitro и особенности их применения.

Апробация паботы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-методической конференции «Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве», Орел, 28-31 июля 2003, на научно-методической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы садоводства в России и пути их решения», Орел, 2-5 июля 2007 года, на международной научно-практической конферен-

ции «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве», Москва, 22-23 июня 2011, на заседаниях лаборатории биотехнологии, отдела селекции семечковых культур, ученого совета ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, ученом совете ГНУ ВНИИСПК Россельхо-з академии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в рецензированных изданиях, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах, стоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследований, главы, содержащей результаты исследований и обсуждений, выводов, рекомендаций для практического использования, акта о внедрении в производство, списка литературы и приложений.

Работа содержит 35 таблиц и 30 рисунков. Список использованной литературы состоит из 213 наименований, в том числе 84 - на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сортовая реакция эксплантов груши на обработку стерилизующими агентами на этапе введения культуру in vitro и на минеральный состав питательных сред на этапе введения культуру in vitro и на этапе микроразмножения;

- ризогенез микропобегов груши в зависимости от минерального состава сред, типа индуктора корнеобразования и способа его аппликации;

- эффективность применения препаратов элиситорного действия при адаптации растений груши к нестерильным условиям;

- технологические приемы получения посадочного материала груши методом микропрививки;

- оптимизация способов депонирования побегов груши в условиях минимального роста.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2 Объекты, методика и условия проведения экспериментов

Исследования проводили на базе ГНУ ВНИИСПК в рамках программы фундаментальных и приоритетных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской федерации. Растительный материал для выполнения работы был предоставлен сотрудниками лаборатории селекции груши и нетрадиционных семечковых культур доктором с.-х. наук Долматовым Е. А. и кандидатом с.-х. наук Сидоровым А. В.

Для более полной характеристики рода Pyrus L. в качестве объектов исследований взяты сорта и формы селекции ГНУ ВНИИСПК и Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева, в происхож-

5

дении которых участвовали 4 вида (Р. communis L., P. ussuriensis Maxim., P. betulifolia Bunge, P. bretschneideri Rehd.), условно объединённые по происхождению на группы:

1. P. communis L.: Орловская летняя, Восковка, сеянцы 1, 2, 4;

2. Р. communis L. х p. ussuriensis Maxim.:

F2- Лада;

F3 - Есенинская, Муратовская, 15-10-110;

F4 - Тютчевская, Аннушка

3. P. ussuriensis Maxim. - Груша уссурийская

4. P. betulifolia Bunge - Груша берёзолистная

5. Р. communis L. х р. bretschneideri Rehd.: 40-4 (Бретфелпс-апомикт).

Для стерилизации эксплантов использовали растворы 0,1%-го мер-тиолата, 0,1%-й сулемы, 0,01%-го йода, а так же сочетание перекиси водорода и сулемы. Экспланты брали с однолетних побегов в период начала активного роста. Длительность субкультивирования - 3-4 недели. Учеты проводили по окончании данного срока.

Стерилизацию эксплантов проводили в 2 этапа: 1) промывка эксплантов под проточной водой в течение двух часов; 2) обработка 70% этанолом (5-10 секунд) и стерилизующим агентом в течение 8-10 минут с последующей промывкой в стерильной воде три раза по пять минут.

Стерилизацию перекисью водорода проводили по следующей схеме: промывка эксплантов под проточной водой в течение двух часов, обработка смесью 30% перекиси водорода и 96% этанола в соотношении 1:1 в течение 10 секунд, обработка 0,1%-м раствором сулемы 8-10 минут с последующей промывкой в стерильной воде три раза по пять минут.

На этапах введения и микроразмножения использовали среды Мура-сиге-Скуга, Ли и де Фоссарда, Гамборга, Пиерика и Мак Коуна. На этапе пролиферации использовали концентрации БАП - 0,5 мг/л, 1,0 мг/л,

2,0 мг/л, 3,0 мг/л., сочетания БАП и ИМК, сочетания БАП и ГК, и БАП, ИМК и гибберелловой кислоты (ГК).

Для этапа укоренения были апробированы все выше перечисленные питательные среды, а также среда Уайта и среда Мурасиге-Скуга с разбавленной вдвое минеральной основой.

Были испытаны сочетания различных ауксинов (ИМК, ИУК, НУК) и способы их аппликации: введение в питательную среду, замачивание в стерильном спиртовом и водном растворах ИМК, обработка пудрой на основе талька с последующим переносом микропобегов на питательную среду без регуляторов роста.

Было испытано влияние препаратов элиситорного действия (Экост 1/3 и Эль-1) на приживаемость растений груши in vitro в период адаптации к нестерильным условиям.

Для изучения длительного хранения груши in vitro использовали среду МС с разбавленной минеральной основой в 2, 4, 8 раз, пониженной концентрацией сахарозы в 2, 4, 8 раз, а также на фоне различных концентраций маннита (1; 2; 5 мг/л) и цитокинина (БАП - 0,1; 3; 5; 10 мг/л).

Форма хранения - единичные побеги.

В экспериментах по разработке приемов микропрививки в качестве привоя использовали побеги сортов Лада и Тютчевская и гибрида 40-4, выращенные в условиях in vitro. В качестве подвоя брали сеянцы груши, выращенные в нестерильных условиях. Способ прививки - в расщеп. Подвой брали в возрасте одного года, толщина которого не менее 3 мм в диаметре. Для лучшего срастания срезы подвоя обрабатывали антиоксидантами - аскорбиновой кислотой в концентрации 50 мг/л и диэтилдитио-карбоматом натрия (ДИЕКА) - 2 г/л, а так же ИМК в концентрации 25 мг/л.

Статистическую обработку данных проводили по методикам Б. А. Доспехова (1985), В. А. Потапова и др. (1997) и Ф. А. Волкова (Высоцкий, 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3 Влнянне режимов стерилизации на этапе введения эксплантов груши в стерильную КУЛЬТУРУ

Эффективность освобождения эксплантов от инфекции и их дальнейшее развитие зависят от типа стерилизующего агента, а также сортовых особенностей.

При введении в культуру эксплантов груши минимальный средний процент заражения был получен при использовании 0,1%-го раствора мертиолата и составил 5,7. Максимальный уровень инфицированности апексов отмечали при обработке меристем 0,01%-м раствором йода -23,6%. При стерилизации смесью перекиси водорода и 96%-ного этанола с последующей обработкой 0,1 %-м раствором сулемы заражение составило 8,3%. Использование 0,1%-го раствора сулемы дало 12,8% заражения.

Средняя приживаемость эксплантов колебалась от 57,6% до 72,4%. Устойчивостью к действию всех стерилизующих препаратов отличались экспланты сортов Лада, Тютчевская и Аннушка. Низкую жизнеспособность апексов независимо, от применяемого агента отмечали у подвоев Восковка и груши 1, вида уссурийская, сортов Муратовская и Есенинская, гибрида 15-11-110.

Применение смеси перекиси водорода (30%) и 96%-ного этанола с последующей обработкой раствором сулемы (0,1%), а также 0,1%-го раствора мертиолата обеспечивает практически полное освобождение эксплантов от инфекционного начала и не вызывает некроза тканей, что дало возможность получить больше материала для этапа микроразмножения.

4 Определение наилучшей минепальиой основы сред на этапе введения эксплантов груши в стерильную культуру

На этапе введения в культуру среды Мурасиге-Скуга (МС) и Пиерика оказались более эффективными для развития эксплантов большинства сортов и форм, где приживаемость достигала 74,5% и 72,2% соответственно. На среде Ли и де Фоссарда приживаемость составила 68,4%. Данная среда вызывала также быстрое развитие апексов. Минимальное количество эксплантов выжило на среде Мак Коуна - 42,7%.

При подборе питательных сред были выявлены проявления генетических особенностей форм груши. Так, экспланты сортов Тютчевская, Аннушка, гибрида 15-10-110 и подвоя груша 4 отличались высоким уровнем приживаемости практически на всех средах. Сорт Орловская летняя, подвои Восковка и груша 1, груша уссурийской были избирательны к составу питательных сред. Так, у груши уссурийская только на среде МС был получен лучший результат - 41% развившихся апексов.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что на этапе введения в культуру следует использовать среды Мугасиге-Скуга, Пиерика и Ли и де Фоссарда с учетом требований различных генотипов к элементам питательной среды.

5 Влияние минерального состава питательных сред на микроразмножение груши

На коэффициент размножения побегов груши оказали влияние два фактора - состав питательных сред и генотип. На контрольной среде Мурасиге-Скуга максимальный коэффициент размножения был получен у сортов Тютчевская (7,8), Орловская летняя (3,7) и у груши березолистной (5,3). На среде Ли и де Фоссарда высокая степень пролиферации отмечена у сортов Лада (3,2), Тютчевская (7,2), гибрида 40-4 (3,7) и груши Березолистная (5,1). На среде Пиерика коэффициент размножения у подвоя груши 4 составил 4,2, у гибрида 15-10-110 - 4,8, у сорта Аннушка - 5,2 (табл. 1).

На росте побегов груши в длину также сказались генетические особенности каждой формы. Так, у сорта Тютчевская, груши березолистной и у подвоя груша 4 на среде Гамборга была получена максимальная длина побегов. Среда Ли и де Фоссарда стимулировала рост побегов в длину у

сортов Лада, Аннушка, Тютчевская, у груши березолистной, у груши 4 и гибрида 15-10-110 (таб. 2).

Таблица 1 - Коэффициент размножения у эксплантов различных сортов и форм груши в зависимости от минерального состава питательных сред

11итательная среда

Сорт, форма Г амборга Пиерика Ли и де Фоссарда Мак Коуна Мурасн- ге-Скуга (кон- троль)

Тютчевская 6,6±1,3 6,7±1,1 7,2±2,7 4,2±0,4 7,8±1,9

Орловская летняя 3,1±0,3 3,0±0,3 3,0±0,4 2,1±0,3 3,7±0,6

Лада 3,2±0,3 2,6±0,2 3,2±0,3 2,2±0,4 2,4±0,4

Аннушка 4,4±0,6 5,2±0,8 4,5±0,7 2,9±0,4 4,8±1,2

40-4 2,9±0,3 3,1±0,3 3,7±0,б 1,5±0,2 3,3±0,9

1 'руша березолистная 3,7±0,6 4,0±0,4 5,1±1,0 3,2±0,3 5,3±1,2

Груша 4 2,8±0,3 4,2±0,5 2,9±0,5 2,б±0,3 2,6±0,5

15-10-110 3,8±0,7 4,8±0,8 3,9±0,б .* 2,8±0,7

НСРо5=1,5 для гибрида 15-10-110 между средами. ДЛЯ ДРУГИХ СОРТОВ И форм К^<Ко5

* - здесь и далее отсутствие данных.

Таблица 2 - Длина побегов, сформированных эксплантами груши различных сортов и форм в зависимости от минерального состава питательных сред (мм).

Сорт, форма Питательная среда

Г амборга Пиерика Ли и де Фоссарда Мак Коуна Мурасиге- Скуга {контроль)

Тютчевская 7,1 ±4,8 3,4±0,7 6,б±3,б 2,4±0,6 5,9±2,8

НСРо5—3,3 для сорта Тютчевская между средами

Орловская летняя 2,0±0,5 2,5±0,7 2,4±0,9 3,7±2,3 5,9±0,2

Лада , 10,5±5,6 4,9±2,3 12,3±6,5 4,4±1,4 4,4±1,8

НСРо5=5,3 для сорта Лада между средами

Аннушка 4,4±1,3 3,8±0,8 5,6±2,7 2,1±0,5 5,5±2,8

40-4 3,6±2,8 3,6±,16 4,3±1,7 1,2±0,1 6,5±1,1

Груша березолистная б,7±3,2 5,5±1,3 6,7±5,5 3,0±0,4 4,8±2,3

Груша 4 13,4±10,3 8,5±3,4 12,5±3,4 8,0±6,4 15,5±1,7

15-10-110 б,4±2,3 5,7±2Д 8,9±4,3 4,9±4,2

НСРо5=3,05 для гибрида 15-10-110.

Для других сортов И форм НСР05 не ВЫЧИСЛЯЛИ, Т. К. Рф<Р05

На среде МС рост побегов в длину был отмечен у сортов Орловская летняя, Аннушка, у гибрида 40-4 и груши 4.

По количеству листьев на побег лучшие результаты показали среды Гамборга, Ли и де Фоссарда и МС.

Таким образом, для большинства сортов и форм груши среды МС и Ли и де Фоссарда оказались оптимальными. На питательной среде МС были получены лучшие результаты по таким показателям, как коэффициент размножения и длина побегов у большинства форм груши. Эта среда была пригодна для культивирования побегов без частых пересадок. Среды Пиерика и Ли и де Фоссарда пригодна для культивирования форм груши с низким коэффициентом размножения (сорт Лада и гибрид 40-4, груша 4).

6 Влияние регуляторов поста на характер развития эксплантов грунт

6.1 Влияние различных концентраций б-бензиламинопурина (БАП) на развитие эксплантов груши

У микропобегов сорта Тютчевская наибольшая способность к пролиферации проявилась при введении БАП в концентрации 2 мг/л и где коэффициент размножения составил 7,8. Низкий коэффициент размножения наблюдали при содержании цитокинина в концентрации 0,5 мг/л (не более 3,0). Концентрация БАП 2 мг/л способствовала росту побегов в длин\ч При низком содержании БАП (0,5 мг/л) образовывались мелкие, хлоротичные побеги. У побегов, выросших на средах с высокой концентрацией БАП (3 мг/л), часто наблюдали фасциации. Количество листьев аппарата колебалось от 9,0 до 11,9 штук на побег.

Концентрация БАП 0,5 мг/л у эксплантов сорта Аннушка вызывала слабую пролиферацию и активный рост каллуса, 1 мг/л стимулировала рост побегов в длину (до 6,5 мм).

Введение в состав питательной среды 2 мг/л БАП обеспечивало максимальный коэффициент размножения у сорта Орловская летняя - 3,7, а также рост побегов в длину (до 5,9 мм). При концентрации регулятора роста 0,5; 1 и 3 мг/л хорошо развивался листовой аппарат.

У груши березолистной на средах Мурасиге-Скуга и Ли и де Фоссарда максимальный коэффициент размножения (5,3 и 5,1 соответственно) получили в присутствии в среде 2,0 мг/л БАП. Лучший рост побегов в длину' отмечали при введении БАП 0,5 мг/л в состав среды Ли и де Фоссарда. Длина побегов в среднем составил 9,8мм со средним количеством листьев - 15,5 шт. на микропобег.

У сорта Лада наибольший коэффициент размножения обеспечивала концентрация БАП 2 мг/л - 3,2. Лучший рост побегов в длину вызывало введение в среду БАП в количестве 1 и 2 мг/л (13,1 мм). При использовании концентрации 3 мг/л длина несколько снижалась до 12,8 мм. Хорошее развитие листьев наблюдали при всех концентрациях БАП. Количество листьев на побегах колебалось в среднем от 9,1 до 13,1 штук,

У гибрида 40-4 концентрация БАП 2 мг/л отличалась образованием наибольшего количества адвентивных побегов. Использование этой концентрации способствовало росту побегов в длину. Количество листьев было практически одинаковым при всех используемых концентрациях и колебалось от 8,1 до 11,1 штук.

Таким образом, в результате экспериментов показано, что для массового размножения груши в культуре in vitro целесообразно использовать концентрацию БАП - 2 мг/л. Концентрация БАП 2 мг/л способствовала не только повышению степени пролиферации, но и росту побегов в длину (сорт Тютчевская, Орловская летняя, гибрид 40-4). Концентрация 6-БАП 1 мг/л также вызывала вытягивание побегов (сорта Аннушка, Лада).

6.2 Влияние сочетания 6-БАП п ИМК на развитие п микроразмножение эксплантов груши

У сорта Тютчевская при введении в состав среды Мурасиге-Скуга сочетания БАП 3,0 мг/л и ИМК 0,05 мг/л наибольший коэффициент размножения составил 5,0. Сочетание БАП 0,5 мг/л и ИМК 0,2 мг/л позволило несколько повысить длину побегов в среднем до 6,3 мм (таб. 3).

Таблица 3 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на средах с

различным сочетанием концентраций БАП и ИМК на питательной среде МС

Сочетание регуляторов роста (мг/л) Показатели развития

Коэффициент размножения Длина побега, мм Число листьев, шт.

БАП 2 7,8±1,9 5,9±2,7 10,0±1,8

БАП 0,5+ИМК 0,05 2,9±0,4 3,3±2,1 8,3±6,1

БАП 0,5+ИМК 0,2 3,3±0,3 6,3±3,2 10,0±5,3

БАП 1,(Н-ИМК 0,05 3,5±0,5 3,3±1,4 10,5±4,7

БАП 1,(Н-ИМК 0,2 3,7±0,5 4,0±2,3 9,8±3,3

БАП 2,0+ИМК 0,05 2,4±0,3 5,4±0,6 13,4±9,0

БАП 2,0+ИМК 0,2 3,6±0,4 5,2±0,5 10,7±5,2

БАП 3,0+ИМК 0,05 5,0±0,7 5,1±2,9 12,1±3,5

БАП 3,0+ИМК 0,2 4,4±0,5 3,4±0,9 11,1±1,8

НСР„,5 1.3 1,9 3,8

В присутствии в питательной среде БАП 2 мг/л и ИМК 0,05 мг/л в первых пассажах наблюдали слабое вытягивание побегов в длину. В чет-

11

вертом и пятом пассажах у сорта Тютчевская встречались побеги длиной до 36 мм. Видимо, для того, чтобы получить побеги пригодные для укоренения на питательной среде с БАП и ИМК, необходимо проводить не менее четырех субкультивирований.

У сорта Аннушка при всех вариантах концентраций БАП и ИМК коэффициент размножения был значительно ниже, чем в контрольном варианте. Однако добавление в среду БАП 1,0 мг/л и ИМК 0,2 мг/л способствовало росту побегов в длину, которая достигала в среднем 7,5 мм (табл. 4).

Таблица 4 - Развитие эксплантов груши сорта Аннушка на средах с различным сочетанием концентраций БАП и ИМК на питательной среде МС

Сочетание рауляторов роста (мг/л) Г ¡оказатели развития

Коэффициент размножения Длина побега, мм Число листьев, шт.

БАП 2 мг/л 4,8±1,2 5,5±2,9 8,8±2,2

БАП 0,5+ИМК 0,05 1,6±0,1 4,8±1,5 8ДЫ,8

БАП 0,5+ИМК 0,2 2,0±0,4 5,7±0,8 5,4±0,8

БАП 1,0+ИМК 0,05 2,2±0,3 4,8±1,5 8,9±6,9

БАП 1,<НИМК 0,2 2,7±0,3 7,5±1,0 9,3±3,9

БАП 2,frf ИМК 0,05 2,2±0,3 4,0±0,4 9,0±5,9

БАП 2,0+ИМК 0,2 2,8±0,3 3,1±1,4 6,2±3,6

БАП 3,(Н-ИМК 0,2 2,5±0,3 4,2±2,8 10,6±2,2

БАП 3,0+ИМК 0,05 2,1±0,2 3,5±1,5 8,4±2,3

НСР„5 1,0 3,6 3,8

Хороший рост побегов наблюдали только в первых пассажах (до 14 мм). Растения были крепкие с темно-зелеными листьями. При последующих пассажах длина побегов снижалась до 4 мм.

Таким образом, сочетания БАП и ИМК малопригодно для культивирования эксплантов. Однако применение таких комбинаций регуляторов роста, как БАП 1,0 мг/л ИМК 0,2 мг/л и БАП 0,5 мг/л ИМК 0,2 мг/л, возможно на этапе элонгации.

6.3 Влияние сочетания БАП и гибберелловой кислоты (ГК) на развитие эксплантов груши

При добавлении в среду Мурасиге-Скуга сочетания БАП и ГК коэффициент размножения также был ниже почти в два раза по сравнению с контрольным вариантом, но по длине побегов и количеству листьев получили лучшие результаты, что очень важно для укоренения микропобегов груши (табл. 5). Максимальная длина - 10,3 мм и максимальное число листьев отмечали при введении БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л, что свидетельствует о возможности использования подобного сочетания на этапе элонгации.

Таблица 5 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на средах с различным сочетанием концентраций БАП и ГК на питательной среде МС

Сочетание регуляторов роста (мг/л) Показатели развития

Коэффициент размножения Длина побега, мм. Число листьев, шт.

БАП 2,0 (контроль) 7,8 ±1,2 5,9±2,8 10,0±1,8

БАП 0,5+ГК 0,1 1,8±0,1 6,5±5,7 12,3±8,0

БАП 0,5 + ГК 0,5 2,3±0,2 5,6±4,0 11,7±7,5

БАП 0,5 + ГК 2,0 2,7±0,3 8,2±7,5 13,3±7,5

БАП 1,0 + ГК 0,1 2,4±0,3 8,0±5,6 14,5±7,8

БАП 1,0 + ГК 0,5 3,2±0,3 10,3±0,9 15,6±б,4

БАП 1,0 + ГК 2,0 3,6±0,5 7,2±5,5 13,2±7,0

БАП 2,0 + ГК 0,1 2,5±0,3 7,0±0,6 14,8±7,7

БАП 2,0 + ГК 0,5 3,2±0,4 5Д±2,7 10,6±8Д

БАП 2,0 + ГК 2,0 4,4±0,6 6,2±0,9 12,0±7,3

НСР„5 0,8 9,8 5,2

6.4 Влияние сочетания БАП, ГК и ИМК на развитие эксплантов груши

Среди использованных сочетаний регуляторов роста наибольшую степень пролиферации (6,6) отмечали в присутствии в среде сочетания БАП 3,0 мг/л + ГК 2,0мг/л + ИМК 0,2 мг/л. Минимальная степень пролиферации проявилась при сочетании регуляторов роста БАП 1,0 мг/л + ГК

0,5 мг/л + ИМК ОД мг/л (3,3). На рост побегов в длину существенное влияние оказало сочетание БАП 1,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л. Данный вариант обеспечивал развитие длинных побегов, пригодных к укоренению. Средняя длина побегов в варианте составила 9,3 мм (табл. 6).

Таблица 6 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на средах с различным сочетанием концентраций БАП, ГК, ИМК

Сочетание регуляторов роста (мг/л) Показатели развития

Коэффициент размножения Длина побега, мм Число листьев, шт.

БАП 2,0 7,8±1,2 5,9±2,8 10,0±1,8

БАП 1,0 +ГК 0,1+ИМК 0,05 3,8±0,2 6,2±1,2 12,1±2,0

БАП 1,0+ГК 0,5+ИМК 0,1 3,3±0,2 6,3±0,8 12,8±2,0

БАП 1,0+ГК 2,0+ИМК 0,2 4,5±0,3 9,3±1,8 13,3±2,4

БАП 2,0+ГК 0,1+ИМК 0,05 5,2±0,3 5,4±1,0 10,4±1,8

БАП 2,0+ГК 0,5+ИМК 0,1 5,4±0,9 8,4±1,7 11,5±2Д

БАП 2,0+ГК 2,0+ИМК 0,2 4,5±0,4 6,1±1,3 12,0±2,3

БАП 3,0+ГК 0,5+ИМК 0,1 5,6±0,8 8,6±1,6 10,0±2Д

БАП 3,0+ГК 2,0+ИМК 0,2 6,6±0,4 7,4±1,7 10,01:2,0

Таким образом, введение в среду БАП+ГК+ИМК не привело к увеличению коэффициента размножения (по сравнению с контрольным вариантом), но сочетание БАП 1,0+ГК 2,0+ИМК 0,2 можно использовать на стадии элонгации.

7 Определение минеральной основы питательной среды для этапа укоренения

Известно, что на процесс укоренения оказывает влияние состав питательной среды и сортовые особенности растений.

Испытанные пять форм груши отличались по ризогенной способности. Наибольшая частота корнеобразования была отмечена для побегов груши сорта Тютчевская. На всех испытанных средах, кроме среды Гамборга, побеги данного сорта образовывали корни (табл. 7). У единичных растений наблюдали рост корней первого порядка. На питательной среде Ли и де Фоссарда отмечали интенсивное образование каллусной ткани.

Таблица 7 - Интенсивность образования корней у экспланов груши

на питательных средах с различным минеральным составом

Варианты Показатели Тютчевская Лада Аннушка

1/2 МС Число эксплантов 16 28 30

% укоренения 12,5 21,4 20

Среднее число корней, шт. 2,7±1,3 0,8 ±0,5 0,3 ±0,02

Средняя длина корпя, мм 5,6±3,4 2,2 ±1,7 1,8±0,7

Ли и де Фоссарда Число эксплантов 25 25 *

% укоренения 16,7 0 *

Среднее число корней, шт. 0,3±0,04 0 *

Средняя длина корня, мм 3,9 ±1,0 0 *

Уайта Число эксплантов 32 29 *

% укоренения 15,6 0 *

Среднее число корней, шт. 0,5±0Д 0 *

Средняя длина корня, мм 1,8 ±0,9 0 *

Г амборга Число эксплантов 9 12 *

% укоренения 0 0 *

МС 0 мг/л ИМК, после среды Ли и де Фоссарда Число эксплантов 36 25 *

% укоренения 0 0 *

* - нет данных

Максимальное количество укоренившихся побегов сорта Тютчевская было получено на среде Ли и де Фоссарда. По количеству корней на одно растение и по дайне корней лучшей оказалась среда МС, разбавленная вдвое минеральной основой.

У сорта Лада образование корней отмечали лишь на среде МС, разбавленной вдвое. Средний процент укоренения составил 21,4. У подвоя груша 4 и вида груша березолистная ни в одном из предложенных вариантов сред укоренения не отмечали

На всех испытанных средах у всех форм груши отмечали гибель укорененных и неукорененных побегов, которая начиналась с апикального некроза.

Поэтому оптимальным сроком культивирования микропобегов на питательной среде для укоренения было четыре недели. Появление корней начинается через 1-3 недели и если в этот срок корни не образовывались, то происходило подсыхание среды и некроз тканей экспланта.

8 Определение типа, концентрации и способов аппликации препаратов с аукенновой активностью на ризогенез микрорастенин

В результате экспериментов было установлено, что у побегов сорта Тютчевская наибольшую ризогенную активность вызывало введение в среду НУК в концентрации 1,0 мг/л. Средний процент укоренения составил 66,7. В основании побегов наблюдали рост небольшого количества каллуса. Образование максимального количества корней на одно растение вызывало введение в состав питательной среды 1,0 мл/л ИМК (2,7 шт.) и

0,5 мг/л НУК (2,9 шт.). Рост наиболее длинных корней отмечали в присутствии в среде 0,5 мг/л НУК, длина которых составила в среднем 16,2 мм. При добавлении сочетания ИМК и ИУК по 0,5 мг/л средняя длина корней достигала 21,2 мм. Введение сочетания НУК и ИУК (по 0,5 мг/л) приводило к образованию корней первого порядка. Введение ИУК в концентрации 0,5 и 1,0 мг/л укоренения побегов не стимулировало.

При изучении способов аппликации лучшие результаты были получены при обработке микрорастений груши сорта Тютчевская ИМК-содержащей пудрой. Замачивание в спиртовом растворе ИМК (50 мг/л) в течение 10 секунд не приводило к образованию корней.

У сорта Лада при всех испытанных способах индукции образования корней наибольшее среднее количество укоренившихся побегов получили при введении в питательную среду сочетания ИМК и ИУК в концентрации 0,5 мг/л - 48,6%. Введение в среду тех же препаратов в концентрации

1,0 мг/л образования корней не вызывало. При замачивании микропобегов груши в растворах ИМК и после обработки ауксинсодержащей пудрой процент укоренения был ниже и колебался от 1,5 до 29,4.

У подвоя груша 4 из восьми вариантов стимуляторов корнеобразова-ния и четырех способов аппликации наибольший процент укоренения (41,2%) дало введение в питательную среду 1,0 мг/л НУК. В этом же варианте образовывалось наибольшее количество корней - 2,1 штук и самые длинные корни - до 7,7 мм.

У груши березолистной укоренения не наблюдали ни в одном из испытанных вариантов.

Замачивание микропобегов сорта Орловская летняя в спиртовом растворе ИМК в течение 10 секунд обеспечивало корнеобразование в 52,9% случаев.

Таким образом, из всех испытанных способов стимуляции корнеоб-разования наиболее существенное влияние на интенсивность ризогнеза оказали введение в питательную среду' НУК (1,0 мг/л) и ИМК (1,0 мг/л), а также сочетаний ИМК и НУК (по 0,5 мг/л), НУК и ИУК (по 0,5 мг/л), ИМК и ИУК (по 1,0 мг/л). Процесс замачивания в водном растворе ИМК и обработка ауксинпудрой также положительно сказались на процессе укоренения.

9 Адаптация пробирочных растений груши к нестерильным

условиям

С целью повышения приживаемости пробирочных растений груши in vitro в нестерильных условиях изучали влияние двух препаратов элиси-торного действия - Эль-1 (аналог эмистима) и Экост 1/3. Контролем служили адаптация микрорастений без элиситоров (табл. 8).

Таблица 8 - Приживаемость микрорастений груши на этапе адаптации (%)

Форма Элиситоры Без элиситоров (контроль)

Эль-1 Эль-1+Экост 1/3

Тютчевская 43,7 37,5 26,6

Лада 25,0 * 20,0

Орловская летняя 15,3 * 10,0

Груша 4 53,8 69,2 0

Fd^Fpi

* - нет данных

Показано, что у сорта Тютчевская наибольшая приживаемость растений в нестерильных условиях была при внесении в субстрат препаратом Эль-1 - 43,7%. Контрольный вариант показал наименьшую приживаемость - 26,6%.

У подвоя груша 4 при совместном воздействии элиситоров успешно адаптировались к нестерильным условиям наибольшее число растений -69,2%, в то время как в контрольном варианте не прижилось ни одного растения.

У сортов Лада и Орловская летняя препарат Эль-1 оказал положительное влияние на адаптацию растений in vitro к нестерильным условиям.

В результате эксперимента были получены корнесобственные растения груши изучаемых сортов и форм.

Таким образом, применение иммуностимулирующих препаратов на этапе адаптации оказало положительное влияние, повысив выход адаптированных растений груши и тем самым увеличив выход посадочного материала.

10 Метол микпопппвивки в процессе клонального микпопазмножепия rnviini

Для повышения выхода растений груши в процессе клонального микроразмножения был использован метод микропрививки. Для лучшего срастания привоя и подвоя срезы последнего обрабатывали растворами аскорбиновой кислоты (50 мг/л), ДИЕКА (2 г/л) и ИМК (5 мг/л). У сорта Тютчевская при обработке срезов подвоя аскорбиновой кислотой наблюдали максимальную приживаемость прививки - 91,7% (табл. 9).

У сорта Лада при использовании раствора аскорбиновой кислоты (50 мг/л) выход жизнеспособных растений был выше в два с лишним раза по сравнению с этапом адаптации - 55%.

При использовании микропрививки у гибрида 40-4 наибольший выход растений (65%) получили при обработке срезов подвоев раствором аскорбиновой кислоты.

Признаком срастания привоя и подвоя было начало роста привоя. В течение месяца формировались побеги длиной до 2-4 см. Полученные растения высаживали в весенние теплицы.

Таблица 9 - Выход растений при различных способах выращивания (%)

Сорт, форма Микро прививка Адаптация укорененных in vitro мнкропобегов

Обработка срезов аскорбиной кислотой Обработка срезов ИМК Обработка срезов ДИЕКА

Тютчевская 91,7 83,3 80,0 43,7

Лада 55,0 10,0 * 25,0

40-4 65,0 20,0 * 0

F corrra^F 01 F гтшвнвкіг>Т'о5

* - нет данных

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность применения метода микропрививки на груше. С помощью этого метода можно получить жизнеспособные растения тех форм, которые плохо укоренялись и проходили этап адаптации (например, гибрид 40-4).

11 Депонирование изолированных микпоиобегов груши т уНго

Влияние концентрации минерального состава питательной среды. При изучении влияния концентрации минерального состава среды Му р ас иге - С ку га было показано, что максимальный срок хранения у сорта Тютчевская - шесть месяцев обеспечивали среды с разбавленной минеральной основой в 4 и 8 раз. Минимальный срок - 5 месяцев на среде, разбавленной в 2 раза. В процессе хранения микропобегов пролиферации не наблюдали. После хранения микропобеги высаживали на среду Мура-сиге-Скуга стандартного минерального состава и культивировали в течение четырех недель в условиях свекомнаты, где получили коэффициент размножения 5,9. Растения были жизнеспособны.

У побегов груши березолистной максимальный срок хранения составил 16 месяцев на среде с разбавленной в 4 раза минеральной основой. В процессе депонирования коэффициент размножения составил 7,3. Минимальный срок хранения 5 месяцев при разбавлении минеральной основы в два раза. Микропобеги также пролиферировали и коэффициент размножения составил 4,1. После пересадки в условия светокомнаты растения были способны к дальнейшему развитию. У этиолированных побегов отмечали некроз тканей, однако у основания образовывались дополнительные побеги, и коэффициент размножения достигал 2,6.

У сорта Аннушка наибольший срок хранения побегов 6 месяцев отмечен на средах с разбавленной минеральной основой в 4 и 8 раза. Первые признаки хлороза появились уже через 2 месяца. Пролиферации во время хранения не было. После пересадки на обычную среду Мурасиге-Скуга в условия свекомнаты растения остались жизнеспособны и продолжали образовывать дополнительные побеги. Максимальный коэффициент размножения был у тех растений, которые хранили 6 месяцев на среде с разбавленной в 4 раза минеральной основой.

У гибрида 40-4 максимальный срок хранения (4 месяца) зарегестри-рован на среде Мурасиге-Скуга с разбавленной в 2 раза минеральной основой. Затем у микропобегов начинался некроз тканей. Изъятые из хранения растения высаживали на среды Мурасиге-Скуга и Ли и де Фоссарда. Развитие растений на среде Ли и де Фоссарда было более интенсивным, особенно со среды с разбавленным в 4 раза минеральным составом.

Исследования показали различную реакцию микропобегов груши изучаемых сортов и форм во время депонирования на уменьшение концентрации макро- и микросолей. Однако, при культивировании в условиях светокомнаты все они были способны к дальнейшему развитию.

Действие различных концентраций сахарозы на процесс хранения микропобегов груши. При хранении микропобегов сорта Тютчевская на среде МС с уменьшенным содержанием сахарозы, пролиферации

побегов не было отмечено в течение всего периода хранения (5 месяцев). После пересадки на среду МС с обычным минеральным составом наблюдали дальнейшее развитие. Наибольший коэффициент размножения при этом составил 5,7 (табл. 10).

Таким образом, снижение концентрации сахарозы в питательной среде МС можно использовать как один из способов депонирования побегов груши.

Таблица 10 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская в условиях светокомнаты после депонирования на среде МС с уменьшенным количеством сахарозы

Срок хранения Показатели развития Разбавление минеральной основы

В 2 раза В 4 раза В 8 раз

3 месяца Коэффициент размножения 3,9±0,6 5,7±2,1 3,7±1,6

Длина побега, мм 10,4±3,2 4,9±1,2 9,0±0,5

Число листьев, шт. 10,1 ±4,8 9,6±1,6 7,8±0,6

5 месяца Коэффициент размножения 5,2±1,0 4,5±1,0 5,2±1,8

Длина побега, мм 8,2±1,1 5,1±3,4 4,7±1,0

Число листьев, шт. 9,1±3,8 9,6±2,8 9,7±2,1

Реакция микропобегов груши па замену сахарозы машштом.

Наибольший срок хранения (14 месяцев) у сорта Тютчевская был отмечен при добавлении маннита в концентрации 3 г/л. При концентрации 1 г/л наблюдали 100% обводненность побегов, поэтому все растения изъяли из хранения через 3 месяца. После пересадки на среду Мурасиге-Скуга в условия светокомнаты наблюдали низкий коэффициент размножения. Образовывались неодномерные, тонкие и нежизнеспособные побеги.

У груши березолистная микрорастения были изъяты из хранения в два этапа - в 6 месяцев, когда начался некроз и в 14 месяцев при содержании маннита 5 г/л. В процессе хранения пролиферации не наблюдали, но растения остались зелеными. При культивировании в светокомнате у тех микропобегов, которые депонировали 6 месяцев отмечали пробуждение латеральных почек. Те, что изъяли из хранения через 14 месяцев, погибли. Эксперименты показали, что использование маннита вместо сахарозы вызывает гибель побегов груши, как во время хранения, так и во время выращивания в культивационной комнате.

Депонирование груши при различных концентрациях БАП. При хранении побегов груши in vitro максимальный срок хранения у сорта Тютчевская (14 месяцев) отмечали при введении в среду 3,0 мг/л и 10,0 мг/л БАП. Минимальный период хранения - 4 месяца, при концентрации 0,1

мг/л. В процессе депонирования побеги образовывали дополнительные почки и побеги. Отмечено, что чем выше концентрация цитокинина, тем больше образовывалось дополнительных побегов. После хранения растения высаживали на сред}7 Мурасиге-Скуга в светокомнату. Через месяц культивирования после депонирования побеги продолжали расти и были способны к дальнейшему развитию. Наибольший коэффициент размножения отмечен у побегов, хранившихся на среде с 5,0 мг/л БАП в течение 13 месяцев - 4,0. Отмечали также образование побегов пригодных к укоренению, длина которых достигала в среднем 16,8 мм (табл. 11).

Микропобеги груши березолистной хранили на среде МС, содержащей 10 мг/л БАП в течение 14 месяцев (табл. 12).

Таблица 11 - Развитие эксплантов груши сорта Тютчевская на питательной среде МС после депонирования МС с различной концентрацией БАП

Варианта депонирования Показатели развития

Коэффициент размножения Длина побега, мм Число листьев, шт.

3 мг/л БАП 14 месяцев хранения 3,0±0,2 16,8±1,1 15,8±4,8

5 мг/л БАП 13 месяцев хранения 4,0±0,7 14,1 ±4,0 14,5±3,8

10 мг/л БАП 14 месяцев хранения 2,7±0,5 15,0±2,1 15,5±3,4

Таблица 12 - Развитие эксплантов груши сорта березолистная в период хранения на питательных средах с различной концентрацией БАП

Варианты Показатели

Коэффициент размножения Длина побега, мм Число листьев, шт.

10 мг/л БАП 5 месяцев хранения 4,0±0,2 4,2±1,1 11,6±4,0

10 мг/л БАП 14 месяцев хранения 7,3±3,2 20,0±7,8 17,8±5,2

Восстановление развития побегов груши после хранения у этой формы было чрезвычайно медленно.

Срок хранения побегов сорта Лада на среде МС, содержащей 5 мг/л БАП - 6 месяцев. Пролиферации не наблюдали. Для дальнейшего развития

их пересаживали на среду Ли и де Фоссарда с добавлением 2 мг/л БАП. Растения успешно развивались, давая адвентивные побеги. Коэффициент размножения составил 2,7.

Таким образом, в результате исследований показано, что хранение микрорастений груши при пониженной положительной температуре возможно. Растения в большинстве своем остаются жизнеспособными и могу т быть использованы для дальнейшего микроразмножения. Необходимым условием остается индивидуальный подбор условий хранения, т. к. каждый генотип по-разному реагировал на состав питательной среды. Для депонирования лучше использовать среды с повышенным содержанием цитокинина и с разбавленной минеральной основой. При создании коллекций груши можно чередовать депонирование в холодильных камерах и культивирование в условиях светокомнаты.

10 Экономическая эффективность

Расчёт экономической эффективности производства посадочного материала груши проводили путем сравнения двух методов: обычная схема in vitro, включающая в себя все этапы клонального микроразмножения и метод микропрививки, где экспланты груши прошли всего два этапа -введения и микроразмножения, а затем микропобеги были привиты на семенные подвои, выращенные в нестерильных условиях.

В первом случае выход полноценных растений груши зависел от коэффициента размножения, % укоренившихся и адаптированных растений.

Во втором случае выход растений зависел от коэффициента размножения и от успешного срастания привоя и подвоя.

Метод микропрививки является более трудоемким, но требует меньше материальных затрат, обеспечивает окупаемость через 1 год и 3 месяца (табл. 13). В результате использования микропрививки значительно увеличивается прибыль (в 4,2 раза).

Как показали расчёты, технология выращивания посадочного материала груши с помощью метода микропрививки более выгодна, так как рентабельность производства повысилась на 51,9%.

Таблица 13 - Расчет экономической эффективности получения посадочного материала груши при использовании двух методов из расчета на 1000 штук

Статьи затрат Растения, полученные по стандартной методике in vitro Растения, полученные с помощью микропрививки

Реактивы 1302 1026

Зарплата 25620 33420

Начисления на зарплату 35,3% 9043 11797

Электроэнергия 10000 8000

Отопление 5700 5700

Ящики 360 360

Пленка полиэтиленовая 800 800

Стаканы, 200 мл. 1300 1300

Вода 10 10

Подвой, привой - 14700

Амортизация и ремонт основных средств 4200 4200

Накладные расходы 10% 5833 6661

Итого затрат 641668 87974

Выход растительного материала (шт.) 473 917

Себестоимость 1 растения (руб.) 135,66 95,94

Цена реализации (руб.) 135,66 95,94

Сумма выручки (руб.) 80410 155890

Прибыль (руб.) 16242 67916

Рентабельность (%) 25,3 77,2

Окупаемость 4 года 1,3 года

выводы

1. В результате проведенных исследований показана принципиальная возможность клонального микроразмножения груши перспективных сортов, гибридов, подвоев и дикого вида груши березолистная.

2. В процессе клонального микроразмножения груши продемонстрировано превалирующее влияние особенностей генотипа для каждого этапа клонального микроразмножения (введение, пролиферация, укоренение).

3. Применение в качестве стерилизующего агента смеси перекиси водорода (30%) и 96% этанола с последующей обработкой 0,1%-м раствором сулемы, а также 0,1% раствора мертиолата практически полностью исключает контаминацию, не вызывая некроза тканей.

4. На этапе введения в стерильную культуру для большинства испытанных форм груши наиболее эффективными оказались среды Мурасиге-Скуга и Пиерика.

5. Питательные среды Мурасиге-Скуга и Ли и де Фоссарда на этапе микроразмножения обеспечивают максимальную степень пролиферации и наилучший рост микрорастений большинства формы груши.

6. Для повышения коэффициента размножения неоходимо использовать концентрацию БАП 2 мг/л (для сортов Тютчевская, Орловская летняя, Аннушка, гибрида 40-4, груши березолистная) и 3 мг/л (для сорта Лада). Концентрация БАП 1 мг/л способствует росту побегов в длину. Поэтому данное количество цитокинина можно использовать на этапе элонгации.

7. Присутствие в питательной среде на этапе элонгации сочетаний регуляторов роста: 1,0 мг/л БАП + 0,2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л БАП + 2,0 мг/л ГК,

3,0 мг/л БАП + 0,5 мг/л ГК +0,1мг/л ИМК, 1,0 мг/л БАП + 2,0 мг/л ГК +

0,2 мг/л ИМК усиливает рост побегов в длину.

8. Укореняемость побегов испытанных форм груши варьирует в зависимости от генотипа, состава питательной среды, типа индуктора ризоге-неза и способа его аппликации:

- наибольшей укореняемостью побегов характеризуются сорта Тютчевская и Лада, Орловская летняя, подвой груша 4;

- оптимальной для этапа укоренения является питательная среда МС, разбавленная в два раза по минеральному составу;

- введение в среду НУ К (1 мг/л) и сочетания ауксинов 0,5 мг/л НУК+0,5 мг/л ИУК, 0,5 мг/л ИМК+0,5 мг/л ИУК, а также обработка ИМК-содержащей пудрой и кратковременное замачивание в спиртовом растворе ИМК (50 мг/л) способствует повышению частоты укоренения.

9. Использование иммуностимулирующих веществ (Эль-1 и Экост 1/3) способствует повышению приживаемости микрорастений груши в нестерильных условиях до 69,2% по сравнению с контролем.

10. Применение метода микропрививки побегов груши in vitro на семенные подвои значительно повышает выход растений трудноукореняю-щихся и неукореняющихся в процессе клонального микроразмножения форм груши, тем самым повышая эффективность данного процесса.

11. Микропобеги груши березолистная характеризуются наибольшим сроком хранения при пониженных положительных температурах - 14 месяцев при замене сахарозы на манит в концентрации 5 г/л и 16 месяцев на среде МС, разбавленной в 4 раза по минеральному составу.

12. После хранения растения большинства испытанных форм остаются жизнеспособными и в условиях in vitro возобновляют рост и пролиферацию побегов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА

1. Разработанные приемы клонального микроразмножения сортов и форм груши могут быть применены для производства посадочного материала этой культуры.

Для введения в культуру in vitro и размножения эксплангов груши рекомендуется использовать среды Мурасиге-Скуга, Ли и де Фоссарда и Пиерика. Где для усиления пролиферации побегов груши необходимо использовать БАП в концентрации 2,0 мг/л и 3,0 мг/л. А для получения побегов груши пригодных для укоренения использовать концентрации БАП 1,0 мг/л и 2,0 мг/л, а так же сочетания регуляторов роста БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л и БАП 1,0 мг/л + ГК 2,0мг/л + ИМК 0,2 мг/л.

2. В качестве индукторов корнеобразования рекомендуется использовать введение в состав среды МС с разбавленной в два раза минеральной основой НУК (1, 0 мг/л) и ИМК (1, 0 мг/л) и замачивание микропобегов груши в спиртовом растворе ИМК (50 мг/л) в течение 10 сек.

При адаптации груши рекомендуется обрабатывать субстрат препаратом Эль-1. Для увеличения выхода посадочного материала неукореняющихся или плохоукореняющихся в процессе клонального микроразмножения сортов и форм применять метод микропрививки на семенной подвой с обработкой срезов последних раствором аскорбиновой кислоты (50 мг/л).

3. Для длительного хранения микропобегов сортов и форм груши (14 месяцев) рекомендуется использовать способ депонирования при температуре +3...5°С с использованием среды МС, разбавленной в четыре раза по минеральному составу и среду МС, содержащую 10 мг/л БАП.

12. Список опубликованных работ

1. Ломовская, J1. В. Особенности клонального микроразмножения сортов и перспективных форм груши / Л. В. Ломовская // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве : материалы к междунар. науч.-метод. конф. (Орел, 28-31 июля 2003 г.) - Орел: ВНИИСПК, 2003. -С. 204-205.

2. Ломовская, Л. В. Методы оздоровления и размножения перспективных форм груши in vitro I Л. В. Ломовская // Достижения науки и техники АПК. - М., 2004. - №3 . - С. 13-15.

3. Ломовская, Л. В. Особенности размножения перспективных форм груши в культуре in vitro / Л. В. Ломовская // Селекция и сортовая агротехника плодовых культур: сб. науч. тр. - Орел, 2004. - С. 107-113.

4. Ташматова, Л. В. Методы культуры in vitro при размножении и депонировании форм груши / Л. В. Ташматова // Садівництво : міжвідомчий тематичний науковий збірник. - Киів.: СЕРЖ, 2005. - Вип. 57. - С. 205212.

5. Ташматова, Л. В. Депонирование груши in vitro / Л. В. Ташматова // Актуальные проблемы садоводства России и пути их решения : материалы всерос. науч.-метод. конф. молодых ученых (Орел, 2-5 июня 2007 г.). -Орел: ВНИИСПК, 2007. - С.310-313.

6. Ташматова, Л. В. Возможность клонального мнкроразмноже-ния н депонирования сортов н форм груши. / Л. В. Ташматова, В. А Высоцкий // Плодоводство н ягодоводство России : сб. науч. работ ГНУ ВСТИСП. - М.: ВСТИСП, 2008. - Т. XVIII. - С. 385-389.

7. Ташматова, Л. В. Способ прививки груши микропобегами in vitro /

Л. В. Ташматова, В. Е. Джафарова // Совершенствование сортимента и технологий возделывания плодовых культур : сб. науч. тр. - Орел:

ВНИИСПК, 2010. - С.228-229.

8. Ташматова, Л. В. Длительное сохранение пробирочных растений груши / Л. В. Ташматова // Садівництво. - Киів.: СЕРЖ, 2011 - Вип. 64. (в печати)

9. Ташматова, Л. В. Размножение и депонирование груши в условиях in vitro /Л. В. Ташматова // Плодоводство и ягодоводство России : сб. науч. работ - М.: ВСТИСП, 2011. - Т. XXVI. - С. 130-137.

Издательство ВНИИСПК, 2012. Орловская обл., Орловский р-н, д. Жилина Заказ №28. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Ташматова, Лариса Владимировна, Орел

61 12-6/251

Россельхозакадемия

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт селекции

плодовых культур

На правах рукописи

ТАШМАТОВА ЛАРИСА ВЛАДИМИРОВНА

КЛОНАЛЫЮЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ДЕПОНИРОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ФОРМ ГРУШИ

Специальность 06.01.01. - общее земледелие

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор с.-х. наук, профессор В. А. Высоцкий

ОРЕЛ

-2012 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................4

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................10

1.1. Биотехнологические методы в плодоводстве.........................10

1.2. Основные этапы клонального микроразмножения..................13

1.3. Факторы, влияющие на эффективность клонального микроразмножения плодовых культур.......................................................13

1.3.1. Стерилизация инициальных эксплантов и эффективность процесса введения в культуру...............................................................13

1.3.2. Основные композиции минеральных составов питательных сред этапа введения в культуру и микроразмножения..............................16

1.3.3. Регуляторы роста, контролирующие коэффициент размножения.......................................................................................23

1.3.4. Состав питательных сред для этапа укоренения....................25

1.3.4.1. Минеральная основа питательных сред...................................25

1.3.4.2. Регуляторы роста и способы аппликации............................26

1.3.5. Методы микропрививки в процессе клонального микроразмножения..........................................................................................30

1.3.6. Адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям...32

1.3.7. Основные принципы и методы создания коллекций садовых растений для длительного хранения..................................................37

1.3.8. Использование биотехнологических приемов в работе с грушей

.............................................................................................41

1.3.9. Физические факторы культивирования и их влияние.............46

ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ, ЗАДАЧИ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ ОПЫТОВ..........................................................

2.1. Цель и задачи.....................................................................49

2.2. Исследуемые формы и их характеристика.................................49

2.3. Отработка режимов стерилизации...........................................54

2.4. Подбор минеральной основы питательных сред для этапов введения в культуру, микроразмножения и укоренения, а также для длительного хранения эксплантов груши........................................................54

2.5. Методика проведения микропрививки......................................58

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...............................59

3.1. Влияние режимов стерилизации на этапе введения эксплантов в стерильную культуру..........................................................................

3.2. Определение наилучшей минеральной основы на этапе введения эксплантов груши в стерильную культуру...........................................63

3.3. Влияние минерального состава питательных сред на микроразмножение груши............................................................................68

3.4. Влияние регуляторов роста на развитие и микроразмножение экс-плантов груши.........................................................................75

3.4.1. Влияние различных концентраций 6-БАП на развитие и микроразмножение эксплантов груши.......................................................75

3.4.2. Влияние сочетания 6-БАП и ИМК на развитие и микроразмножение эксплантов груши.....................................................................82

3.4.3. Влияние сочетания 6-БАП и гибберелловой кислоты (ГК) на развитие и микроразмножение эксплантов груши....................................85

3.4.4. Влияние сочетания 6-БАП, гибберелловой кислоты (ГК) и ИМК на развитие и микроразмножение эксплантов груши.............................88

3.4.5. Определение минеральной основы питательной среды для этапа укоренения, обеспечивающей максимальный выход пробирочных растений........................................................................................91

3.4.6. Определение типа, концентрации и способов аппликации препаратов с ауксиновой активностью на ризогенез микропобегов.........................................................................................94

3.4.7. Адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям......................................................................................101

3.4.8. Метод микропрививки в процессе клонального микроразмножения груши..................................................................................104

3.4.9. Изучение состава сред для длительного хранения груши in vitro......................................................................................108

3.5. Экономическая эффективность.............................................121

ВЫВОДЫ..................................................................................123

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА............................... 125

Список использованной литературы.............................................126

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................150

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Интенсификация современного садоводства и повышение требований к качеству посадочного материала ставят задачу применения новых технологий оздоровления растений. Кроме того, важной задачей является сокращение сроков создания новых генотипов с хозяйственно ценными свойствами, ускорение их внедрения в производство, создание и содержание коллекций ценных форм.

Применение нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения позволит решить эти проблемы. Среди преимуществ этого метода можно выделить следующие: получение генетическиоднород-ного посадочного материала, освобождение растений от вирусных, грибных и бактериальных заболеваний, высокий коэффициент размножения и как следствие этого возможность быстро и в большом количестве получить трудноразмножаемые в обычных условиях формы растений, возможность проведения работ круглый год, экономя площади для выращивания посадочного материала, возможность длительного хранения целых растений и их органов без контакта с внешней средой.

В результате многолетних наблюдений было отмечено, что полученные in vitro растения имеют ряд преимуществ по сравнению с размноженными традиционными способами. В частности, древесные и кустарниковые виды дают больше материала для черенкования. Причем, черенки, заготовленные с таких растений, обладают большей способностью к укоренению. Аналогичная ситуация просматривается и с растениями земляники (Высоцкий, 2002).

Оздоровленные экземпляры размножают как традиционными способами, так и путем клонального микроразмножения, который представляет собой способ вегетативного размножения, отсутствующий в естественных условиях и базирующийся на тотипотентности растительных клеток с использованием асептических приемов культивирования на специальных пита-

тельных средах для массового тиражирования генетически идентичных копий растений за относительно короткое время. Эти приемы в настоящее время широко используются в производстве посадочного материала овощных (Shin-ichi, Shigreri, Toshiro, 1991), цветочно-декоративных (Кудина, Довбыш, 1990, Кузьмина, Потапова, 2000, Karhu, Hakala.,1990, Natali, San-chen, Cavatlini, 1990), лесных (Civinora, Stadki, 2000), цитрусовых (Omura, Matguto, Morigchu, 1987, Tisserat, Galletta, 1987), плодовых и ягодных растений (Осипова, Тюленев, 1986, Свириденко, Бурдалов, Дудченко, 1991, Си-дорович, Кутас, 1991, Al Maanri, Duson, Arnand, Mlgimal, 1986).

Само размножение может осуществляться несколькими путями: получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или сома-клонального эмбриогенеза (Rodrigues, 1982, Гладышева, 1984, Новикова, 1987), индукция развития побегов непосредственно из ткани эксплантов (Foucault, Letoure, 1987, Predieri, Maabovasi, 1989), пролиферация пазушных побегов. Разные виды растений могут быть размножены по одной или нескольким перечисленным моделям, в зависимости от их биологических особенностей или поставленных целей.

Большую помощь питомниководам может оказать создание коллекций генотипов ценных оздоровленных клонов плодовых и ягодных растений. Использование методов культуры изолированных тканей и органов для этих целей идет по нескольким направлениям. Можно хранить пробирочные растения в условиях нормального роста, которые затем используют для крио-сохранения (Wilkins, Dodds, 1983). Другим методом депонирования является хранение растений и органов при пониженных положительных температурах (Высоцкая, 1994).

Ещё одним перспективным, но пока малоизученным этапом в технологическом процессе ускорения клонального микроразмножения плодовых культур, и в частности семечковых является метод микропрививки in vitro. Этот метод рекомендуется, например, для оздоровления сортов семечковых культур от стеблевой вирусной инфекции (вирус бороздчатости древесины

яблони), а также для трудноукореняющихся при размножении сортов плодовых культур (Долгих, 2001).

Методы микроразмножения древесных культур отработаны для очень узкого списка видов, хотя такой подход представляется весьма актуальным. В значительной степени это связано с тем, что работать с ними в условиях in vitro гораздо труднее, чем со многими другими ценными сельскохозяйственными культурами. В частности, следует выделить высокую степень окисления тканей эксплантов на этапе введения в культуру in vitro, необходимость подбора питательных сред для размножения и укоренения побегов, сложность переноса укоренённых растений в нестерильные условия для до-ращивания их до стадии стандартного посадочного материала (Sausavini, Neri, Lane, 1985, Шелифост и др., 1993). В тоже время, большие возможности этого метода широко известны, в том числе и для груши (Бартиш и др., 1994, Lane, 1979).

Научная новизна. Впервые в условиях региона проведено детальное изучение клонального микроразмножения перспективных форм груши. Были выявлены оптимальные способы стерилизации эксплантов груши. На всех этапах клонального микроразмножения было показано и обосновано влияние на рост и развитие микрорастений груши химического фактора и сортовых особенностей. С учетом этих факторов подобран оптимальный состав питательных сред для этапов введения в культуру, пролиферации и укоренения эксплантов груши. Прослежено изменение коэффициента размножения и развития груши в зависимости от изменения концентрации 6-бензиламинопурина (БАП) и от комбинаций ауксинов, цитокининов и гиб-берелловой кислоты (ГК). На этапе укоренения исследован процесс образования корней и влияние сортовых особенностей на интенсивность корнеоб-разования. На этапе адаптации к нестерильным условиям показана возможность применения препаратов группы элиситоров - Экост -1/3 и Эль-1 (д. в. - арахидоновая кислота), и их сочетания. Доказано преимущество их применения по сравнению с адаптацией без элиситоров. Изучен процесс при-

вивки микропобегов груши на семенные подвои в системе ускорения производства оздоровленного посадочного материала некоторых сортов и трудно-укореняющихся форм груши. Впервые проведено изучение длительного депонирования эксплантов груши при пониженных температурах. Определены оптимальные сроки хранения и состав питательных сред для данного процесса, подобраны концентрации ауксинов и сахарозы, а также показаны отрицательные результаты замены сахарозы на маннит.

Практическая значимость Создана теоретическая база для разработки технологии хранения и ускоренного получения оздоровленного посадочного материала груши:

Разработан способ депонирования сортов и форм груши in vitro в виде микропобегов для сохранения генетических коллекций.

Определены возможности использования микропобегов в качестве привойного материала для производства оздоровленных саженцев груши.

Разработан способ ускорения производства оздоровленного посадочного материала трудноразмножаемых сортов груши.

Определено влияние различных биологически активных веществ на адаптацию растений груши при выводе из условий in vitro и особенности их применения.

Положения, выносимые на защиту:

- сортовая реакция эксплантов груши на обработку стерилизующими агентами на этапе введения в культуру in vitro и на минеральный состав питательных сред на этапе введения в культуру in vitro и на этапе микроразмножения;

- ризогенез микропобегов груши в зависимости от минерального состава сред, типа индуктора корнеобразования и способа его аппликации;

- эффективность применения препаратов элиситорного действия при адаптации растений груши к нестерильным условиям;

- технологические приемы получения посадочного материала груши

методом микропрививки;

- оптимизация способов депонирования побегов груши в условиях минимального роста.

Апробация

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-методической конференции «Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве», Орел, 28-31 июля 2003, на научно-методической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы садоводства в России и пути их решения», Орел, 2-5 июля 2007 года, на международной научно-практической конференции «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве», Москва, 22-23 июня 2011, на заседаниях лаборатории биотехнологии, отдела селекции семечковых культур, ученого совета ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, ученом совете ГНУ ВНИИСПК Россельхозакадемии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 статей из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

1. Ломовская, Л. В. Особенности клонального микроразмножения сортов и перспективных форм груши /Л. В. Ломовская // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве : материалы к междунар. науч.-метод. конф. (Орел, 28-31 июля 2003 г.) - Орел: ВНИИСПК, 2003. - С. 204205.

2. Ломовская, Л. В. Методы оздоровления и размножения перспективных форм груши in vitro / Л. В. Ломовская // Достижения науки и техники АПК. - М., 2004. - №3 . - С. 13-15.

3. Ломовская, Л. В. Особенности размножения перспективных форм груши в культуре in vitro / Л. В. Ломовская // Селекция и сортовая агротехника плодовых культур: сб. науч. тр. - Орел, 2004. - С. 107-113.

4. Ташматова, JI. В. Методы культуры in vitro при размножении и депонировании форм груши /Л. В. Ташматова // Caдiвництвo : м1Жвщомчий те-матичний науковий зб1рник. - Кшв.: фирма «СЕРЖ»., 2005. - В. 57. - С. 205212.

5. Ташматова, Л. В. Депонирование груши in vitro / Л. В. Ташматова // Актуальные проблемы садоводства России и пути их решения : материалы всерос. науч.-метод. конф. молодых ученых (2-5 июня 2007 г., г. Орел). -Орел: ВНИИСПК, 2007. - С.310-313.

6. Ташматова, Л. В. Возможность клонального микроразмножения и депонирования сортов и форм груши. / Л. В. Ташматова, В. А Высоцкий // Плодоводство и ягодоводство России : сб. науч. тр. ГНУ ВСТИСП. - М.: ВСТИСП, 2008. - Т. XVIII. - С. 385-389.

7. Ташматова, Л. В. Способ прививки груши микропобегами in vitro / Л. В. Ташматова, В. Е. Джафарова // Совершенствование сортимента и технологий возделывания плодовых культур : сб. науч. тр. - Орел: ВНИИСПК, 2010. - С.228-229.

8. Ташматова, Л. В. Длительное сохранение пробирочных растений груши / Л. В. Ташматова // Сад1вництво. - КиТв.: фирма «СЕРЖ»., 2011 -Вип. 64. (в печати)

9. Ташматова, Л. В. Размножение и депонирование груши в условиях in vitro /Л. В. Ташматова // Плодоводство и ягодоводство России : сб. науч. тр. - М.: ВСТИСП, 2011. - Т. XXVI. - С. 130-137.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биотехнологические методы в плодоводстве

Большинство сельскохозяйственных растений размножается семенами и вегетативно. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую неоднородность получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако существуют трудности при вегетативном размножении многих древесных плодовых культур: низкая укореняемость зеленых черенков, трудоёмкость и сложность операции при размножении взрослых растений с помощью прививок, накопление и передача инфекционного начала. Перевод питомников на безвирусную основу требует ускоренного получения большого количества посадочного материала, незара-женного вирусной и фитоплазменной инфекцией, паразитическими нематодами и другими вредителями и болезнями. Всё это влечёт за собой включение в технологические схемы оздоровления и размножения посадочного материала новых эффективных приёмов, позволяющих решить эти проблемы (Трушечкин, Высоцкий, 1985).

В последние годы внимание питомниководов всё больше привлекают методы оздоровления и ускоренного размножения растений с использованием техники культуры изолированных тканей и органов на искусственных питательных средах в стерильных условиях.

В последние 30 лет технология культуры тканей широко применяется при размножении плодовых и ягодных культур. В настоящее время в ряде стран, таких как Германия, США, Италия, Великобритания для закладки современных садов используют корнесобственный посадочный материал, а

также растения, привитые на подвоях, полученных с использованием методов культуры изолированных тканей и органов (Zuccherelli, 2000.).

Корнесобственная культура плодовых пород представляет безусловный интерес для интенсивного садоводства, так как снижает отрицательное воздействие несовместимости подвоя и привоя на рост и плодоношение. Кроме того, корнесо�