Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда

Дорошенко, Наталья Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда
ВАК РФ 06.01.08, Виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда"

А -Зб'Ш

Всероссийский научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия им. Я.и. Потапенко

На правах рукописи

ДОРОШЕНКО НАТАЛЬЯ ПЕТРОВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ УСКОРЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ И ОЗДОРОВЛЕНИЯ, СЕЛЕКЦИИ БЕССЕМЯННЫХ СОРТОВ И СОЗДАНИЯ КОЛЛЕКЦИЙ ГЕНОФОНДА ВИНОГРАДА

Специальность 06.01.08 - виноградарство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

Новочеркасск - 1999

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте виноградарства и виноделия им. Я.И- Потапенко

Официальные оппоненты: доктор биологических кзук.

профессор л.П. Грошик доктор сельскохозяйственных наук, профессор К. А. Серпухсеишна доктор сельскохозяйственных наук В.А, Высоцкий

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский

институт селекции и генетики плодовых растений им. И. В. Мичурина

Защита состоится С" ^с^г^УЬ^ 1999 г. в 10 часов

на заседании диссертационного совета Л-020.78.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко по адресу: 346421. Ростовская область, г. Новочеркасск, проспект Баклановский, 166

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕШ'ЕИЗ мм. Я.И. Потапенко

Автореферат разослан 999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

В, С, Петров

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в биологической науке к в сельскохозяйственной практике, в т.ч. ив виноградарстве, на первый край выходит проблема адаптации, так как с ней связаны возможности реализации генотипа в онтогенезе, ареалы культур и, что особенно важно, получение максимального хозяйственного эффекта.

Усилению адаптации виноградарства в условиях интенсификации отрасли должно способствовать применение Ьовременных методов биотехнологии. Методы культуры органов, тканей и клеток in vitro должны занять прочное место в арсенале средств, определяющих значительный прогресс в селекции винограда и в деле производства посадочного материала этой древнейшей и широко распространенной сельскохозяйственной культуры.

Методы in vitro могут вносить ценный вклад на каждом этапе селекционного процесса. Использование клонального микроразкноже-ния позволяет сократить сроки размножения новых сортов по сравнению с традиционными методами в 4-5 раз. Преимущества микроразмножения in vitro заключаются а необходимости малого количества исходного материала, минимальной лабораторной площади для культур, в высоком коэффициенте размножения.

Клональное микроразмножение также является составной часть» интегрированной защиты виноградных насаждения, так как, благодаря высокому коэффициенту размножения, является наиболее вероятным способом массового размножения перспективных устойчивых, сортов винограда. Кроме- этого, небольшой размер экспланта. применяемого для клонального шкроразмноженкя, поверхностная стерилизация его. асептический перенос на питательную среду и субкультивирование в условиях, исключающих инфицирование, приводит к оздоровлению полученных растений от Филлоксеры, нематод, грибных патогенов.

В борьбе против вирусных болезней винограда не эффективно использование агротехнических или химических методов. Единственным способом борьбы является получение безвирусного посадочного материала. Наиболее надежным методом оздоровления посадочного материала винограда является использование культуры меристемы и последующее клональное микроразмножение оздоровленных растений.

Оздоровленный посадочный материал является базисным для создания маточных насаждений и перевода викпгряпярптва ня д.питнут

; ЦНБ МОХА

фонд научной литературы

основу, что обеспечит продление эксплуатации виноградников и повышение их продуктивности на 30-40%.

Особо актуальным является пополнение сортамента винограда новыми бессемянными сортами, так как бессемянность является ценным хозяйственным признаком для сортов винограда всех направлений использования - потребления в свежем виде, приготовления сушеной продукции. Кроме того, это прекрасное сырье для винодельческой промышленности. Во всем мире возрастает внимание к бессемянному винограду. Однако, группа бессемянных сортов пока еще малочисленна. Практически отсутствуют бессемянные сорта в существующем сортименте винограда России.

Перспективным направлением создания бессемянных сортов является использование культуры изолированных семяпочек (зародышей в семяпочке) in vitro. Метод основан на получении жизнеспособного потомства от скрещивания бессемянных сортов между собой с последующим культивированием зародышей семени в условиях in vitro. Это открывает принципиально новые перспективы - позволит сократить продолжительность селекции и увеличить бессемянность.

Важным вкладом в практику сельского хозяйства для вегетативно размножаемых культур является технология сохранения в культуре in vitro генофонда, используемого в селекции, в виде растущих коллекция - периодически су6клонируемых пробирочных растений, оздоровленных методом культуры меристем. Цель коллекций - обеспечить селекционера в любое время генотипом, несущим искомые признаки, нужные для его работы. Насущной необходимостью также является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения. В виноградарстве также существует потребность в надежных методах хранения генофонда in vitro.

В последние десятилетия опубликовано большое количество научных сообщений по культуре органов, тканей и клеток винограда. Однако многие вопросы применения биотехнологии в* виноградарстве остаются нерешенными. К ким следует отнести оздоровление растений от вирусов методом апикальных меристем размером менее 0,2 мм и регенерацию из них растений. В селекции бессемянных сортов недостаточно изучена и требует своего решения культура семяпочек винограда на искусственной питательной среде. Наименее изученным является вспрос создания коллекций ежограда in vitro. Цель и задачи исследований. Цель наших исследований: - разработать технологический процесс клональяого шкроразм-

Е0Ж8НИЯ и оздоровления посадочного материала ценных аборигенных, интродуцнрованных и новых высокопродуктивных, устойчивых к болезням, вредителям и.неблагоприятным внешним условиям сортов винограда. обеспечивающий ускоренное размножение их с сохранением генетических особенностей, биологических и агрономических свойств;

- разработать метод селекции винограда на бессемянность скрещиванием бессемянных сортов между собой, и с последующим культивированием изолированных семяпочек;

- разработать методы сохранения in " vitro коллекции сортов винограда для консервации генетических ресурсов, регионального и международного обмена коллекционным материалом.

Достижение поставленной цели осуществлялось на основе решения следующих задач:

1. Усовершенствовать стерилизацию исходных эксплантов и мероприятия, исключающие ингибирование ростовых процессов.

2. Разработать меры борьбы с хронической инфекций, проявляющейся при продолжительном культивировании пробирочных растений.

3. Подобрать питательную среду с тем. чтобы обеспечить оптимальные условия ввода в культуру тканей эксплантов малых (0,17-0,25 км) и предельно малых размеров (0,075-0.1 мм), обеспечивающих оздоровление растений, а также оптимальные условия на этапе кикрочеренкования.

4. Разработать способы оптимизации клонального микроразмно-жэния.

5. Усовершенствовать адаптацию пробирочных растений к нестерильным условиям":

6. Разработать способы создания сортоЕЫХ маточников интенсивного типа из саженцев, оздоровленных и размноженных in vitro.

7. Осуществить подбор родительских сортов и комбинаций скрещивания при селекции на бессемянность.

8. Определять сроки изолирования семяпочек и пересадки их на питательные среды.

9. Подобрать питательные среды,, способствующие образованию жизнеспособных эмбрионов.

10. Изучить морфологические и агробиологические особенности гибридных сеянцев, полученных из семяпочек в культуре тканей.

11. Былбить влияние покошённой положительной температуры па "шышализащго" роста пробирочных растений и разработать способ продолжительного хранения.

12. Изучить возможность депонирования винограда при добавлении в питательную среду ингибитора роста хло рхо линхл ор ида (ССС) и осмотических ингибиторов маннита и сорбита, уточнить их концентрации и способы применения.

13. Исследовать влияние естественных ингибиторов из размолотых семян на ингибирование роста растений и разработать способ продолжительного хранения винограда in vitro с их применением.

14. изучить возможность депонирования винограда m vitro при сочетании двух факторов культивирования - пониженной температуры и естественных ингибиторов, добавляемых в питательную среду.

Научная новизна. I. Разработаны и научно обоснованы некие биотехнологические приемы технологического процесса клонального микроразмножения и оздоровления растений:

1. Впервые разработан способ борьбы с хронической инфекцией, вызываемой медленно растущими патогенами.

2. Предложена схема регенерации растений из эксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0.1 мм) с разделением этапа ввода на два подэтапа,

3. Разработан способ укоренения побегов, полученных из меристем, патент N 1601117.

4. Доказана возможность применения среды Ли и де Фоссарда на этапе микрочеренкования побегов винограда.

5. Впервые разработаны способы оптимизации питательной среды на этапе микрочеренкования, основанные на вводе в ее состав 6-БАП или стимуляторов роста естественного происхождения из семян винограда, патент ГГ 2041609.

s. Выявлена возможность повышения регенерадионной способности меристем (патент II 2120739) и оптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования побегов (патент К 2077192) воздействием электромагнитного излучения низкой интенсивности.

7. Разработан способ адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям, патент N 1792269,

8. Предложены способы закладки интенсивных маточников из оздоровленного и размноженного In vitro посадочного материала.

9. Усовершенствован способ травянистых индикаторов для тестирования растения винограда на наличие вирусов.

П. Впервые в России разработан метод селекции винограда на Оессемянность скрещиванием бессемянных сортов с последующей культурой изолированных семяпочек in vitro.

III. разработаны способы увеличения продолжительности хранения для создания коллекций генофонда винограда in vitro:

1. Предложены новые условия хранения коллекционного генофонда винограда in vitro на среде для хранения при температуре 4®С.

2. Доказана возможность увеличения продолжительности хранения при добавлении в питательную среду хлорхолинхлорида, сорбита, 6-БАП при увеличении содержания сахарозы.

_3. Достигнуто, увеличение пр о до лжит ель но сти хранения пробирочных растений винограда за счет естественных ингибиторов из семян винограда, добавляемых в питательную среду, патент N 2110172.

Положения, выносимые на защиту.

1. Теоретическое обоснование новых биотехнологических приемов технологического процесса клонального микроразмножения и оздоровления растений:

- способ регенерации растений из эксплантов малых {0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров, повышение регенерационной способности меристем:

- состав питательных сред на всех этапах развития от Формирования меристематических зон, регенерации из них растений, укоренения регенераитов до высадки в грунт;

- способы оптимизации клонального микроразмножения;

- способ адаптации растений к нестерильным условиям.

Z. Научно-методические разработки:

- г;о селекдаи бессемянных сортов винограда;

- использование бессемянках родителей с последующей культурой изолированных семяпочек In vitro;

- приемы повышения эмбриогенеза при самоопылении и скрскиза-нии бессемянных сортов.

3. Метод создания коллекции генофонда in vitro путем минима-лизацди роста растений..

4. Практические рекомендации:

- по использованию технологии клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа;

- по использованию в селекции стеноспермокарпических бессемянных сортов винограда, обеспечивающих при самоопылении и скре-¡¡¡ивании высокий уровень эмСрио reite за а шлчучыше гибридных сеянцев;

- по созданию коллекций генофонда винограда in vitro с не-

пользованием разработанных способов ингибирования роста-пробирочных растений.

Практическая значимость и реализация результатов исследований работы. В результате проведенных исследований разработаны рекомендации "Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания сортовых маточников интенсивного типа" (Москва, .1991 г.).

В виноградарских хозяйствах Дона переданы оздоровленные саженцы винограда сортов Агат донской. Алан I. Восторг, Бианка. Дружба, Гечеи заматошь и др. Производственные испытания подтвердили высокую приживаемость саженцев, хорошее развитие растений и перспективность такого пути создания сортовых маточников интенсивного типа.

Разработан метод селекции с использованием обоих бессемянных родителей и последующей культуры изолированных семяпочек In vitro. Выявлены сорта и комбинации скрещивания с высоким уровнем эмбриогенеза и образования гибридных сеянцев, доказана возможность получения высокого эмбриогенеза у сортов и форм с функционально женским типом цветка. Установлена потенциальная возможность получения гибридных сеянцев в отдельных комбинациях скрещивания даже при образовании единичных эмбрионов и растений.

Для создания коллекций генофонда in vitro разработаны способы ингибирования роста растений, обеспечивающие увеличение продолжительности между пересадками на свежую питательную среду до 4-7-8 ми и даже 12 месяцев и, тем самым способствующие продолжительному хранению винограда.

Апробация работы и публикации. Основные положения и результаты исследований были доложены и представлены на международных, республиканских и региональных научных конференциях, научно-методических совещаниях и чтениях, посвященных важнейшим проблемам биотехнологии, .селекции и производства посадочного материала винограда: международные - Институт физиологии растений (Москва, 1997), Институт биохимической физики (Москва. 1995, 1998), тимирязевская сельскохозяйственная академия (Москва. 1997), Национальная академия наук Украины (Симферополь, 1993), Государственный аграрный университет республики Молдова (Кишинев. 1998) и региональные - КТО (Ленинград. 1S88), РГУ (Ростов-на-Доку. 1391, 1992), ВНВДГиСПР (Мичуринск. 1991, 1995. 1997. 1999), РАСХН (Нем-чиновка. 1994), ДонГАУ (Персиановка, 1994). ВЮШиВ (Новочер-

касск, 1993, 1996, 1998), Дагестанский НИИВиВ (Мамедкала, 1990).

Кроме того, во ВНИИВиВ им. Я.Й. Потапенко на базе наших исследований проведено заседание секции виноградарства ВАСХНИЛ с повесткой дня "Применение биотехнологии в виноградарстве" (1991).

Материалы демонстрировались на ВДНХ (1992) и ВВЦ (1994), где били отмечены двумя золотыми и серебряной медалями.

Основные результаты исследований опубликованы в 41 научной работе и,помещены в методических рекомендациях, сборниках и центральных журналах. Получено 6 патентов на изобретения.

На опубликованные работы получен запрос из Израиля (U. Leva-novy, 1989) из Великобритании. Twyford plant Laboratories (1989), из Испании (Pedro R. Ganego Veigas. Vmversidade de Vigo, 1999),

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 287 страницах машинописного текста, включает введение, б глав, выводы и рекомендации научным учреждениям и производству: список использованных литературных источников включает 230 наименование, в т.ч. 96 на иностранных языках. Экспериментальные данные приведены в 75 таблицах и 23 рисунках.

в работе участвовали: сотрудники отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН A.C. Попов, О.Н. Высоцкая, (разработка депонирования винограда in vitro при пониженной.положительной температуре}; сотрудники ВНИИ связи (г. Таганрог) Г.В. Лузгин, А.Ф. Карлов (исследование действия электромагнитного излучения в культуре тканей винограда); сотрудники лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко Т.В. Жукова, Н.В. Берникова. Г.В. Соколова, В.Г. Ячменева. Л.Н. Семенова, за что автор выражает им искреннюю благодарность.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, методика и условия проведения исследований. Работа выполнена во Всероссийском -НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко в 1983-1995 гг. в соответствии с программами НИР. При разработке и оптимизации клонального микроразмножения и оздоровления растения in vitro объектами исследований были 9 сортов винограда селекши института: Агат донской. Восторг, Грушевский белый. Дружба, Русвен, Русбол, Саперави северный. Степняк, фиолетовый ранний к 0 иптредуцирспанных ссртсБ: Алан I, Алая III, Бланка, Гечеи закатошь, Подарок Кагарача, Ромулус, Ритсн, подвой 16/3.

Для проведения исследований использовали методические рекомендации Ф.Р. Уайта (1949), Р.Г. Бутенко (1964), Ф.А. Калинина. В,В. Сарнацкой. В.Е. Полищука (1980). Н.с. Волосова (1988). В.В. Урманцевой (1988).

На основании анализа этих методов разработана технологическая цепочка, которая предусматривает стерильность методов получения исходных эксплантов и дальнейших манипуляций с ними в асептических условиях. Проведена реорганизация и создана лаборатории биотехнологии.

Исходным материалом были: зеленые побеги с вегетирующих кустов винограда; зеленые побеги, выращенные в лабораторных условиях из вызревших побегов; глазки побегов виноградных кустов, взятые в период активного роста и в период покоя, из которых вычленяли ме-ристеыатические верхушки и меристемы без листовых примордиев.

Экспланты вычленяли в асептических условиях в ламинарных боксах "Фатран" под бинокулярным микроскопом МБС-9 при 25-кратном увеличении.

Повторность при проведении исследований трехкратная, каждая повторность состоит из 14 пробирок.

Посевы проводили на среде Мурасиге и Скуга по прописи, на среде Мурасиге и Скуга в модификации П.Я, Голодриги (1985), на среде для укоренения, предложенной R. Е. Harris и I.H. Stewenson (1982), на среде R,A. Fossard (1977).

При разработке ввода в культуру меристематических тканей наблюдения за развитием растений проводили один раз в'10-15 дней. При этом отмечали: общее увеличение, фазу вытянутой точки роста. Фазу образования растений, рост стебля, гибель эксплантов.

Для регенерации растений из меристематических верхушек с од-ним-двумя листовыми гтримордиями размером 0,17-0.25 мм разработан способ, который состоит в том, что побеги получают па среде Мурасиге и Скуга с содержанием 6-БАП 0,1-0,2 кг/л. Базальные концы побегов перед укоренением обрабатывают В-индолилуксусной кислотой (0,1 мг/л), а укоренение побегов осуществляют на безгормональной модифицированной среде Мурасиге-Скуга с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов. Последующее микроразмножение'осуществляют на этой питательной среде с добавлением В-индолилуксусной кислоты в количестве 0,3 мг/л (патент К 1601117. 1350).

В исследованиях по микрочеренкованию учитывали: количество жизнеспособных растений, длину побегов, количество и длину кор-

ней. число узлов на побег, вес сухого вещества через 4 месяца культивирования.

Культивирование осуществляли при температуре 25-28°С. 16-часовом освещений люминисцентными лампами ЛЛ-40.

Модификация существующих методик адаптации растений к нестерильным условиям связана с применением индивидуальных пакетов из полиэтиленовой пленки, в которые помещают-торфоперегнойные горшочки с%высаженными в них пробирочными растениями. Адаптация проводится на стеллажах ускоренного выращивания растений {патент N 1792269 A3, 1990).

Для исследования действия в культуре тканей электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности использовали генератор высокочастотных сигналов с диапазоном частот 37.5-53,57 ГГц. Мощность сигнала - 20 мВт. Мощность определения длины волны - не менее 0,01 мм. Лазер применяли узкополо снш с тонким лучом.

При создании маточников из оздоровленного посадочного материала клонального микроразмножения руководствовались рекомендациями Е.И. Захаровой, В.И- Моногарова по интенсивному размножению ценных дефицитных сортов винограда (1977); инструкцией A.n. Дубо-венко (1980) по ускоренному размножению винограда одноглазковыми черенками с использованием теплиц; технологией производства привитого виноградного посадочного материала, Л.Н. Малтабара (1983): инструкцией по созданию маточников винограда интенсивного типа и уходу за ними (1988),

Учеты й наблюдения на'маточниках оздоровленного посадочного материала проводили в соответствии с методическими указаниями "Агротехнические исследования по созданию интенсивных виноградных насаждений на промышленной основе" (197S).

Закладку маточников интенсивного типа из оздоровленного посадочного материала проводили в виноградарских хозяйствах Дона: "Жемчужный". "Россия", "Первомайский", "Денисовский". "Прогресс", "Бедерники" различными способами: высадка в пленочную теплицу на постоянное место двух рядов саженцев по схеме посадки i.5-2,0 х 0,4 м; посадка саженцев по такой же схеме с последующим на второй год снятием теплицы и вегетированием растений з открытом грунте; высадка саженцев в пленочную теплицу по с^кмк 30 у. 3G см с последующей выкопкой. хранением и высадкой в открытый грунт на постоянное место; высадка в стационарную теплицу в два этапа; первый

год по уплотненной схеме посадки 15 х 30 см. пересадка их на второй год по схеме 90 х 90 см: высадка в открытый грунт в пределах тепличного комплекса весной с предварительной закалкой вегетирую-щих растений или осенью вызревших растений.

При разработке метода селекции бессемянных сортов винограда объектом исследования являлись семяпочки от самоопыления 14 сортов и 14 комбинаций скрещивания, сорта, включенные в программу исследований, отличались по категории бессемянности, срокам созревания; крупности гроздей и ягод, устойчивости к морозу, милдью, оидиуму и гнили.

Изучали следующие сроки изолирования семяпочек: 35. 50, 65, 80 и 100 дней после опыления. Ка каждую комбинацию скрещивания в каждый срок высевали по 28 семяпочек. При изучении родительских сортов и комбинаций скрещивания семяпочки изолировали через 70 дней после опыления и высевали на вариант по 42 семяпочки, которые высаживали каждую в отдельную пробирку.

При введении семяпочек в культуру проводили оценку их развития. Учитывали вес ягод, длину и ширину их по 30 объектам. Регулярно при культивировании проводили учеты их состояния: гибель от инфекции, набухшие, образовавшие каллус, тронувшиеся в реет, оставшиеся без изменений.

С целью подбора питательной среды для культивирования семяпочек испытали среды Уайта и Нича, которые, по литературным данным, используются при культивировании семяпочек и зародышей плодовых, ягодных культур и винограда, лучшие результаты были получены на среде Уайта. В связи с этим культивирование семяпочек осуществляли на этой питательной среде с добавлением в ее состав гиббереллиновой - 0,4 мг/л, индолилуксусной -0,1 мг/л кислот и кинетина - 0,1 мг/л.

Для прохождения стратификации пробирки с семяпочками в конце октября переносили в условия пониженной положительной температуры, где они находились в течение 2,5 месяцев, после чего их возвращали в культуральные условия. Непроросшие семяпочки вскрывали с целью проверки на наличие эмбриоподобных структур. Вырезанный эмбрионы помещали в пробирки с жидкой средой Мурасиге и Скуга, содержащей 2 мг/л 6-БАП с целью определения их жизнеспособности, Зародыши, которые увеличились и имели зеленке семядоли с распознаваемым гипокотилем, считались проросшими. Их пересаживали на среду Мурасиге и Скуга, свободную от регуляторов роста, для даль-

нейшего развития.

Полученные сеянцы в состоянии 3-4 настоящих листьев адаптировали к нестерильным условиям на СУБР и высаживали в пленочные теплицы, где их' выращивали по схеме ускорения селекционного процесса, принятой в селекцентре. За сеянцами проводились фенологические наблюдения, агробиологические учеты, определяли силу роста и вызревание побегов, морозостойкость и-продуктивность.

Методы создания коллекции винограда in vitro отрабатывались на сортах винограда селекции БНИИБиВ им. Я.И. Потапенко: Восторг, Агат донской. Дружба и перспективных интродуцнрозанных сортах Би-анка и Речей заматошь. Объект исследования - культура меристемы и последующее микрочеренкование с возможным ограждением выращиваемой культуры от действия фитогормонов и цитокининов для поддержания удовлетворительного уровня генетической стабильности.

Для того, чтобы приступить к депонированию, к вводу сортов в культуру приступали в июне предыдущего года и осуществляли его в несколько этапов: выделение меристем и посев их на твердую, а затем на жидкую питательную среду; пересев увеличившихся в размере меристем на среду пролиферации; укоренение образовавшихся побегов на жидкой питательной среде на "мостиках" из фильтровальной бумаги; черенкование развившихся растений и пересадка их на твердую питательную среду, размножение в нужном количестве для депонирования. Все этапы ввода и микроразмножения осуществляли на среде Мурасиге и Скуга, модифицированной для каждого этапа.

Депонирование осуществляли -при пониженной положительной температуре (10,5-16,9°СГ и бсвещенности (500 локс) и температуре +4°С на среде лля хранения. Для сохранения растений винограда in vitro при температуре +4°С изменяли в соответствии с рекомендациями О.Н. Высоцкой (1994) состав основной питательной среды Мурасиге к Скуга, из которой исключали стимулирующие рост компоненты (хлорид кальция) и вводили в нее ростовые ингибиторы - нитрат кальция в концентрации 8мМ.

Для торможения роста растений добавляли в питательную среду ССС в концентрации 1 мг/л; маннит в концентрации 5; 7/5; 10 мг/л: сорбит в количестве 5; 7,5; 10; 30: 60 мг/л при культивировании на твердой питательной среде на свету и в темноте, на жидкой питательной среде на свету и в темноте; 6-БАП в концентрации 0,01: 0,05; 0,1% при содержании сахарозы 2, 4, 6%. Естественные ингибиторы роста из тонкоразмолотых семян винограда добавляли в коли-

честве 0,1; 0,5: 1,0: 10% и S виде 10 и 20% вытяжки из семян. При комбинировании двух и более факторов исследовали: тип (жидкая, твердая) и состав среды (среда Мурасиге и Скуга и среда для хранения): оптимальную и пониженную температуру, добавление в питательную среду естественных ингибиторов из топкоразмолотых семян винограда.

В каждом варианте опыта было 3 повториости, в каждой 14 пробирочных растений.

Учеты проводили через 2 месяца. Учитывали: количество жизнеспособных растений, длину побегов, количество и длину корней, число узлов на побеге, вес сухого вещества (через 4 месяца культивирования), скорость роста, интервалы между пересадками.

Все опыты были повторены 2-3 раза и более. Результаты были воспроизводимы. В таблицах и на рисунках показаны средние значения.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятой методике (Б.А. Доспехов, 1985; В.Ю. Урбах, 1963; Э.И. Мсичер, А.Я. Земная. 1906) с использованием показателя наименьшей существенной разницы. При статистической обработке полученных данных использовали вычислительный комплекс ВНИИВИВ им. Я.И. Потапенко и ПЭВМ с пакетом прикладных программ. Доверительные границы средней были рассчитаны с уровнем значимости Р = 0,05.

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ Н ОЗДОРОВЛЕНИЕ РАСТЕНИЙ

Стерилизация исходных экегшантов. Самым важным обстоятельством при введении зкеплантов в культуру и культивировании растений In vitro является необходимость асептики. Б соответствии с этим уделяли особое внимание методам асептического получения исходных эксплантов и дальнейших манипуляций с ними в условиях, обеспечивающих стерильность.

Очень трудной задачей является получение стерильного растительного материала.

Начиная работу с каждым новым растительным объектом, предварительно изучали условия его стерилизации, для стерилизации эксплантов с зеленых вегетируккпх кустов были испытаны диацид, ги-лохлорит кальция, перекись водорода, аэрозольная стерилизация.

Наиболее эффективным стерилизатором оказался диацид, при применении которого отмечена наименьшая гибель исходных эксплантов от инфекции. При применении гипохлорита кальция в лучшем варианте (концентрация 10%, экспозиция 30 минут) погибло 53% эксплантов. Малоэффективным было применение перекиси водорода и аэрозольнсй стерилизации.

Более высокая эффективность гипохлорита в концентрации 10% и экспозиции 30 минут установлена для зеленых побегов, выращенных в лабораторных условиях из вызревшей лозы. При стерилизации эксплантов из маточных растений, выращенных на СУБР, лучшие результаты получены при концентрации гипохлорита кальция 10% и экспозиции 20 минут.

При вычленении меристем лучшая стерилизация также обеспечивается при обработке глазков 10% гмпохлоритом в течение 30 минут. Б этом варианте получен высокий выход здоровых эксплантов и их успешое дальнейшее развитие в культуре.

Некоторые ученые (Л.А. Гоззагй, 19*77) включакт в питательные среды препараты, обладающие бактериостатическим действием; рекомендуют вводить в состав среды антибиотики широкого спектра действия .

Нами установлено, что добавление в питательную среду бициллина в концентрации 0.1 мг/л снижает гибель эксплантов в 1,5-6 раз и не оказывает на растения фитотоксического действия.

Меры борьбы с хронической инфекцией. Все большее число литературных данных и результаты наших наблюдений свидетельствуют о том, что внутри эскплантов и полученных'из них культур могут проявиться инфекционные примеси, находящиеся внутри растения. При этом значительно снижается частота деления клеток и другие параметры роста культур.

Некоторые микроорганизмы (например, бактерии на стадии спор) могут оставаться неактивными в течение нескольких пересадок культуры и лишь затем начинают размножаться.

При появлении инфекции растительный материал рекомендуется отбраковывать. Нами разработан метод, позволяющий сохранить в культуре ценные формы и сорта винограда. Он заключается в обработке гипохлоритом кальция пробирочных растений перед очередной пересадкой их. В результате проведенной обработки снижается инфицирование растений до 2В,5-35,7%. лучший результат получен при концентрации 10% и экспозиции 5 минут, несколько хуже оздоровле-

- 16 -

ние было при концентрации 5% и экспозиции 25 минут.

Обработка растений перед пересадкой гапохлоритом кальция не оказала отрицательного влияния на развитие корней, их число и длину. Лучшей оказалась концентрация гипохлорита IOS при экспозиции 5 мин. как по числу корней, так и по степени их развития. Несколько хуже, но хорошо развивались корни при концентрации 5% и экспозиции 25 мин. С уменьшением экспозиции при этой концентрации развитие корней ухудшается, что можно объяснить слабым угнетением патогенов и их отрицательным влиянием на растение. Ухудшилось с увеличением экспозиции развитие корней при концентрации 10% в результате отрицательного действия дезинфектанта на растение.

Хуже всего было развитие при концентрации 7,5?!, что объясняется слабым воздействием стерилизующего агента на патогены и достаточно высоким на растения.

Эта же закономерность сохранялась и для развития побегов. Состояние побегов улучшалось при концентрации гипохлорита кальция 5% с увеличением экспозиции до 25 минут. При концентрации 10% наблюдалось обратное явление: с увеличением экспозиции состояние побегов ухудшалось.

После обработки дезкнфекталтом скорость роста растений резко снижалась, особенно при концентрации 10% и экспозиции 25 минут.

Таблица 1

Показатели развития растений при применении для дезинфекции гипохлорита кальция (Гечеи заматошь, 1991-1993 гг.)

Скорость Длина ¡ Число

роста побега,j лис-

побегов, см I тьев,

мм/сут. 1 шт.

5 7,4 11,6 2. 1 16.4 14. Э

5 15 9.2 18,0 2,4 18.4 16.2

25 8,7 13.3 2,6 19.8 18.6

5 9,7 13,8 2.4 19,3 18,1

10 15 7,0 17, 2 2.4 18,6 20,0

25 4,5 12.6 " 1,9 14,2 13,8

I гипохлорит Корни

j кальция

Iконцен-' 1трация, I %

экпози- i число,

ЦИЯ, МИН, I шт.

длина, см

*- образование пасынков

Оздоровленные от инфекции растения, вновь расчеренкованные и высаженные на питательную среду, имели обычную скорость роста. Они при различных способах обработки не отличались по числу корней и листьев, увеличивалась длина корней и побегов.

Если учитывать развитие растений после обработки гипохлоритом {прямое действие дезинфектанта) и развитие растений, полученных из обработанных (последействие гипохлорита). то по совокупности показателей развития следует выделить вариант - 25 мин. и 10% -5 мин.,- несколько уступают им способы обработки 10% -15S и 5 мин. - 15& (табл. 1).

Таким образом, по комплексу показателей (снижение инфицирования, удовлетворительное развитие растений после обработки и второй пересадки) лучшим способом обработки инфицированных растений является применение гипохлорита кальция в концентрации ЮЗЕ при экспозиции 5 минут и 5% при экспозиции 25 минут.

Изучение состава питательных сред. Большинство ученых, работающих в этом направлении, считают, что проблему оздоровления от вирусов можно рекить. культивируя меристематические верхушки на искусственных питательных средах, Первое, от чего зависит успех оздоровления - величина экспланта. Успех оздоровления тем выше, чем меньше размер вычленяемой верхушки, но при этом у них отмечается слабая регенерационная способность - около 10%.

Схема регенерации растений

из эксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0.075-0,1 мм) 1) Выделение меристем

2) Этап ввода эксплантов в культуру

Твердая питательная среда Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием (3/4) макроэлементов +^КНгР04-170 мг/л, б-БАЛ-l,0 мг/л.

Жидкая питательная среда Мурасиге-Скуга с уменьшенным содержанием (3/4) макроэлементов + КНгР04 - 170 мг/л. 6-БАП - 1,0 мг/л, косые мостики из фильтровальной бумаги, пробирки на вращающемся аппарате роллерпого типа. ^

3) Этап собственного микроразмножения образование новых побегов из пазушных почек и меристематических бугорков. Жидкая питательная среда Мурасиге и Скуга по прописи, 6-БАП в первом пассаже - 1,0 мг/л,. со второго пассажа -2,0 мг/л.

4) Этап укоренения - на жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием (1/4) макроэлементов + 10 г/л сахарозы + 0,1 мг/л ИУК или эта среда без ИУК. но с предварительной обработкой базальных концов побегов о,1 мг/л пук,

5) Этап микрочеренкования - получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов.

Выбрав для ввода в культуру и оздоровления от вирусов направление с использованием эксплантов малых СО, 17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм), провели исследования и разработали способы повышения их регенерационной способности.

Схема регенерации растений винограда включает оптимизацию всех этапов клонального микроразмножения от ввода в культуру до микрочеренкования полученных оздоровленных растений.

Сравнительное изучение развития меристем в течение месяца на жидкой и твердой питательной средах показало, что оно лучше проходит на твердой среде при концентрации 6-БАП - 1-2 мг/л (табл. 2).

Через 3-4 недели, когда на твердой среде меристемы увеличатся до 2-3 мм, необходимо пересадить их на жидкую питательную среду на косые мостики из фильтровальной бумаги, а пробирки поместить во вращающийся аппарат роллерного типа, чтобы акспланты все время омывались питательной средой.

Таблица 2

Развитие меристем сорта Грушевский белый

на жидкой и твердой питательных средах (1993-1994 гг.)

кон-центра-ция 6-БАП. мг/л

Показатель развития эксплантов, %

Прижи-I вае-

мость 1 —

мерис- крупные[средниеI мелкие Iнеразвив-1 слабой тем. Г I I ¡шеся I среды

% I

IЭксплакты со степенью развития.%

средняя и крупной

Жидкая питательная среЭа

0.5 100,0 20.0 80,0 0 0 0 ■ 100,0

1.0 90,0 44.4 44,4 11.0 0 11, 1 88,9

2.0 90,0 33,4 55,5 0 11. 1 0 88,9

3,0 90,0 22,2 22,2 44,4 11, 1 44,4 44,4

Твердая питателькая среда

0,5 90,0 33.4 55,5 11.1 0 11, 1 88,9

1.0 100.0 30,0 70,0 0 0 0 100,0

2.0 100,0 20,0 80,0 0 0 0 100,0

3,0 90,0 11,1 44,4 33,3 11,1 33,3 55,5

Преимущество ввода меристем в культуру в два приема {сначала

на твердой питательной среде в течение 3-4 недель, а затем на жидкой) очевидно (табл. 3). Наибольшее число псбсгоз у сорта Грушевский белый получено при содержании 6-БАП как в твердой, так и

в ЖИДКОЙ питательной среде - 2 мг/л.

Таблица 3

Культура меристем сорта Грушевский белый (1993-1994 ГГ.)

Концентрация 6-БАП, мг/л Высажено 1 меристем, 1 шт. 1 i Число 1 пассажей 1 1 1 Срезано побегов, шт. Побегов, . на пассаж 1на 1 шт. эксплант

ЖиОкая среза

0,5 10 2 1 0. 5 0,06

1.0 10 3 0 0 0

2,0 10 3 2 0,7 0.13

3,0 10 2 0 0 0

Твердая среда + даОкая среда

0.5/1,0 10 8 8 1,0 0.8

1, 0/2,0 10 А 8 2,0 0.8

2. 0/2, 0 10 7 18 2,6 1. 8

3, 0/2, 0 10 7 6 0.8 0.6

Приживаемость и дифференциация меристем как на первом, так и на втором этапах ввода зависит от содержания 6-ВАП в питательной среде. Оптимальное содержание его на первом этапе ввода для сортов Ритон, Лакхеди Мезешь, подвоя 16/3 - 1,0 мг/л; для сортов Фиолетовый ранний, Груцевский белый - 2., 0 мг/л: на втором этапе эта закономерность сохраняется (табл. 4).

Для повышения эффективности оздоровления следует использовать глазки пробирочных растений. При выделении меристемы снимается лишь верхняя кроющая чешуя. Апекс состоит из меристематичес-кого купола, покрытого нежной кроющей чешуей. Оптимальное содержание 6-БАП в питательной среде для разных сортов винограда колеблется при этом от 0,5 {Восторг) до 1,0 мг/л (Грушевский белый. Гечеи заматошь. Цветочный).

Для культивирования тканей виноградной лозы на этапе микрочеренкования различные авторы рекомендуют среду Гетре (Н.И. Абра-менко, о.Н. Султанова, 1977). Хеллера и Мурасиге-Скуга (Н.И. Гу-зун И др., 1983: П.Я. Голодрига. В.А. зленко, 1985; А.Б. Бургу-тин, Р.Г, Бутенко, 1983; й.Е. Harris, Т.К. Stevenson, 1302: Г.И. Русева, П. Георгиева, 1983 и др.),

Таблица 4

Дифференциация керистем на втором этапе ввода при различных концентрациях 6-бензиламинопурина (1994-1995 гг.)

Сорт

I Концентрации 6-БАП на первом и втором этапе, мг/л

Гибель, % |Степень развития меристем,%

инфек- |отсут-ция [ствие развития

Iудовлет-I слабая|вооит. 1 хорошая до 1 мм! 1-2 мм ( > г мм

0,1/0,1 0 ЮС, 0 0 0 V

О, 5/0, 5 0 8,7 43,4 26, 0 21,9

1,0/1,0 4.5 22,7 9,1 18,2 45,5

г. о/2, о 0 43,7 е. 2 31,2 18,9

3,0/3,0 0 75.0 0 25,0 0

5, 0/5, 0 0 100,0 0 0 0

4.0 1.8 4,8 3,5

Лакхеди 0,5/0.5 - - - - -

Мезешь 1, 0/1,0 0 0 38,9 5,5 55,6

2,0/2,0 0 33,3 25,0 25,0 16,7

3,0/3,0 0 40, 0 30,0 20,0 10,0

НСР0,9 5 8.1 4,8 7.0 7,1

Фиолетовый 0, 5/0, 5 0 25,0 75,0 0 0

ранний 0,5/1,0 14,3 28.6 42,8 0 14,3

1,0/1.0 0 10,0 70,0 0 ' 20,0

2. 0/2. 0 6,3 25.0 31,3 18,7 18,7

3, 0/2, 0 0 20,0 60,0 20,0 0

3, 0/3, 0 0 50.0 0 50,0 0

HCPo.ee 8.0 7,8 5.6 2,9

Подвой 16/3 0.5/0. 5 0 50,0 25,0 8,3 ■ 16,7

1,0/1,0 0 9,2 16,3 28,2 ■ 46,3

2,0/2.0 0 25.0 16,7 33.3 25,0

3, 0/3, 0 0 21.0 26,7 36,8 15,5

5,0/5, 0 0 26,7 40.0 20,0 13.3

НСР0.95 8.1 9.1 6, 1 5, 1

С учетом этого нами были испытаны питательные среды Готре, Хеллера и три модификации среды Мурасиге и Скуга. Лучшее развитие наблюдалось па стандартной среде мурасиге и Скуга. Сна послужила основной средой, применяющейся нами в следующих опытах.

Исследована возможность замены этой среды, благоприятной для роста каллусных тканей, на среду Ли и де Фоссарда. в меньшей степени склонной к этому. Полученные результаты подтвердили рекомендации В.А. Высоцкого (1986) и возможность культивирования на ней всех пяти испытанных нами сортов винограда: Алан I, Агат донской, Восторг, Ромулус. Русмол.

■ ■ - - Таблица 5 Развитие пробирочных растений на средах Мурасиге-Скуга, Ли и де Фоссарда (1990-1991 гг.)

Показатели

роста пробирочных растений

Алан 1

восторг

МурасигеЧЛи и де 1Мурасиге-|Ли и де Скуга [Фоссарда!Скуга IФоссарда

НСР

О .95

Через 15 дней

Число корней, шт. 1. 3 2,3 2,1 2,7 0,3

Длина корня, см 1, 1 1. ? 1,8 2,5 0.4

Длина побега, см 0,4 0.6 0,9 1,2 0,2

Число листьев, шт. 1,0 1.7 1, 2 1,3 0,5

Через 30 дней

Число корней, шт. 2,0 2,6 2, 1 2,6 0.4

Длина корня, см 2,0 5.4 3. 1 4,4 0,8

Длина побега, см 2,9 ■ 3.0 2,8 4,0 0,6

Число листьев, шт. 3.2 5,5 3.5 4.4 0,7

Через 45 дней

Число корней, шт. 2,9 2,7 2,4 2,8 0.6

Длина корня, см -.. .5.7 6,6 6, 1 7.4 1.3

Длина побега, см 6,1 9. 1 5.9 7.2 1.5

Число листьев, шт.. 6,5 8,7 7,7 8,8 1,2

Оказалось, что среда Ли и де фоссарда имеет преимущество перед средой Мурасиге и Скуга (табл. 5). Растения более интенсивного развивались на этой питательной среде, в связи с чем можно сократить период подготовки к адаптации до 30 дней, а повторное микрочеренкование проводить через 45 дней.

Оптимизация клонального микроразмножения. Для оптимизации питательной среды на этапе микрочеренкования мы впервые применили добавление в ее состав цитокинина 6-БАП на различном уровне углеродного питания. При этом мы основывались на данных К. Дерфлинга (1985), который отмечал, что 6-БАП индуцирует клеточное деление, в листьях - растяжение клеток, а также обладает способностью за-

n я

I I

h 6 Нонцешпрациа

сахарен* S

Рис. 1, Состояние вребирочкых раствикй сорта Биаиха л л 45-й двм* жульстоироеами* » эавясиностн ет различного содержании сахароаы и 6-бенэнлдонкоаурина в питательной г-р^до

т-\-Кактреи» ¿и

I_| ЛввШчш» ЗА ft

О,Of Mt/л

держивать старение путем стимуляции процессов биосинтеза. Это также замечено С.Ю. Дженеевым, А, И. Литваком, а.З. Насимовым (1990) при адаптации растений, полученных In vitro. В результате проведенных наш исследовшшй установлено, что 6-бензиламинопурин в составе питательной среды способствует оптимизации клонального микроразмножения винограда, осуществляемого микрочеренкованием пробирочных растений, добапяенпыЯ и питательную среду с содержанием сахарозы 2% в количестве 0,05 мг/л, обеспечивает оптимальное соотношение между длиной корней и побегов, стимулирует рост побе-

гов, образование более крупных листьев, увеличение массы растений, закладку большего числа узлов, повышение жизнеспособности растений, что, в конечном итоге, повышает выход микрочеренков более чем в два раза. Также установлено, что 6-БАП в концентрации 0.1 мг/л при 6%-ном содержании сахарозы в питательной среде способствует инициализации роста пробирочных растений, что можно использовать для длительного хранения коллекций винограда фис. 1), Французский ученый Д. Маскальер в 1979 г. впервые установил, что основным компонентом экстракта виноградных семян является ан-тиоксидант пикногенол или ОПЦ. Дополнительно было установлено,что семена винограда содержат gai Из esters - наиболее активный анти-оксидант. По данным болгарских ученых Е. Зсзиковой. Д. Лилова, А.Д. Москова (1989) в состав семян винограда входят вещества с ценными биологическими свойствами, в частности цитокинины, ауксины, рутины и т.д.

Мы исследовали добавление тонкоразмолотых семян винограда в питательную среду при микрсчеренкованяи побегов и установили, что это способствует увеличению числа корней в 1.0 раза и их массы з 4.1 раза. За счет лучшего развития корней улучшается рост побегов

Табл-ща 6

Влияние семян винограда, добавленных в питательную среду, на развитие растений (через 63 дня культивирования) (Восторг, 1990-1992 гг.)

Концентрация молотых семян винограда, в % от объема среды П о к а з а т е л и

число | сырая корней,1 масса шт. (корней, 1 мг [длина ■ ¡побега, 1 мм 1 I скорость ¡роста по-iбегов, 1мм/сутки (сырая 1 масса ¡побегов. 1мг 1 число (узлов 1на по-1 бег.шт

1. Контроль О,1 активир.

уголь 3.3 38,3 95,4 1.51 197,6 8.8

2. 0, 05 3.6 75,6 98,8 1,57 219,6 9, 1

3. 0, 1 4,2 101,4 108,2 1,72 255.4 10.3

4. 0.25 6.0 153,3 112,8 1,79 314.7 11.3

5. 0,5 5.4 156. 9 104,4 1,66 266, 1 11,2

6. 0,8 2.4 107,3 63,1 1,00 176,3 9,3

НСРв.95 0,7 7,4 4, 2 0.06 19,7 1,2

образование листьев и новых узлов, развитие листовой поверхности, увеличивается общая масса побегов (табл. 6).

■ Положительное действие растительной добавки наблюдали при концентрации 0, 1% от объема среды, максимальный положительный эффект был получен при концентрации 0,25%. Эффективность микроразмножения при этом увеличивается на 27.4% (патент N 2041609).

Таблица 7

Изменение показателей развития растений при добавлении в питательную среду растительной добавки (Восторг, 1990-1992 ГГ.)

Состав питательной среды

Площадь листьев км2

I Показатели I развития побегов

ниж- I сред-I верх-1длина,[сырая 1 число

него i него него 1 мм ¡масса,¡узлов,

I i I I мг I шт.

I I I ! I

Потенциальное

микроразмножение,

1. Контроль -Мурасиге

И Скуга 140,5 133.0 67,8 95,4 197,6 8,8 100

2. Мурасигс и Скуга + 0.25% размолотых семян винограда 131,7 199.5 88,3 112,8 314,7 11,3 127,4

НСР0.Э5 11,6 25,2 8,7 4,2 19,7 1.2

С целью оптимизации физических условий культивирования изучена освещенность и продолжительность фотопериода при шкроразмножении винограда. Установлено, что оптимальное развитие растений происходит при освещенности 2700-2900 лк, ухудшается при 3400 лк, нежелательно повышение освещенности до 5000 лк и выше (рис. 2).

При освещенности 2700-2900 лк корни и побеги имели большую длину и массу, листья были крупными и число их высоким. При повышении освещенности до 3400 лк отмечалось ухудшение роста пробирочных растений, но число листьев не уменьшалось. Наиболее значительное отставание в развитии корней и побегов отмечено при освещенности 6100 лк. В этом варианте резко уменьшилось число листьев, т.е. произошло снижение потенциального мккроразмножения.

Подтверждено преимущество фотопериода продолжительностью 16 часов. Не выявлена возможность повышения эффективности микроразмножения с использованием коррекшш ссзещения: замена фотопериода 16:8 на фотопериод 6:6 и 4:4.

I **

О»'

во

I 1

Я к а з<

Дл/ кмыпи$1/роЗа*шя

Рис. а. Дккамнка рост* оробмрочхвл растении сортл Восторг при рмтгнтА деяцишея (1991-1М2 гг.)

гтоо а к

лк

г - гш лк 5-6)00 лк

3-3*00 лк

Воздействие электромагнитного излучения в культуре тканей винограда. Перспективным направлением исследований является изучение действия ЭМИ миллиметрового диапазона низкой интенсивности на фот о синте зирующие организмы. Мембранология объясняет воздействие ЭМИ следующим образом. Лучи СВЧ, проникзя в клетку, модифицируют мембраны, производят их перестройку и подвергают разрыву двойные связи в непредельных жирных кислотах липидов, что приво-

дит к образовании в них свободных радикалов.

определенном

•уровне свободных радикалов происходит изменение проницаемости

клеточных мембран, усиливается приток питательных веществ, воды, кислорода и активизируются ферментные системы обмена вецеств.

Ведущие ученые в этом направлении (А.Х. Тамбиев, Ь,Н. Кири-кова. О.М. Лапшин, 1992) считают, что применение СВЧ явлштся новым биотехнологическим методом физиологической регуляции метаболизма клеток фотосинтезирующих организмов.

На основании этого нами разработан способ повышения регене-рационной способности меристем с применением комбинированной обработки их электромагнитным полем сверхвысокой частоты и узкополосным лазером. Изучена продолжительность облучения 60, 65. 75, 80 и 120 минут. Повышение регенерационной способности меристем отмечено при облучении их в течение 65 и 75 минут. В этих вариантах возрос средний и максимальный размер меристем, уменьшилась их гибель, увеличилось число срезанных микропобегов в расчете на одну меристему с 0.8 в контроле до 0.9 и 4,4 шт., т.е. при облучении в течение 75 минут регенерационная способность меристем возросла в 5. 5 раза.

Таблица 7

Регенерационная способность меристем при различной продолжительности комплексного облучения. Агат донской (1990-1992 гг.)

Показатели

I Продолжительность облучения, мин.

I 60 1 65 I 75 I 80 I 1201койт-~ТнСр" ¡1111 !роль 10.95

1. Средний размер ме-

ристем, мм 20,0 22,0 32.7 25,0 55,0 30,0 10,7

2. Максимальный раз-

мер меристем, мм 30,0 50,0 65,0 35,0 55,0: 30,0 14.7

3. Гибель меристем на первом этапе куль-

тивирования, ж 10,0 14,3 0 0 42,8 40,0 8,8

4. Гибель меристем на втором этапе культи-

вирования, % 50.0 42.8 20.0 20.0 42,8 40.0 16.8

5, Сохранилось мерис-

тем. % 10,0 42,9 80.0 80,0 14.2 20,0 6,5

6. Срезано микропобегов

всего, шт. 6.0 12.0 22,0 4.0 0 4,0 2,3

7. Срезано побегов с рас-

чете на одну меристе-

му, шт. 0,6 0,9 4.4 0,8 0 0.8 0,4

Нами также предложено применение ЭМИ низкой интенсивности миллиметрового диапазона для оптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования.

Положительное действие облучения наблюдали при различной плотности падающей мощности, которую регулировали расстоянием и способом расположения пробирок по отношению к источнику облучения. ......

результате проведенных исследований^выявлено положительное влияние ЭМИ (табл. 8) на образование и рост корней у пробирочных растений, на среднесуточную скорость роста их. способствующую увеличению длины, массы побегов, увеличению числа узлов на побег в 1,4 раза. Благодаря этому, можно сократить период культивирования до 50-60 дней, чаще проводить субкультивирование и тем самым повысить эффективность клонального микроразмножения винограда при высоком качестве микрочеренков (патент К 2077192, 1995).

Таблица 8

Состояние пробирочных растений в зависимости от способа размещения пробирок по отношению к источнику облучения (через 70 дней культивирования). Восторг {1990-1991 гг.)

Способ размещения 1 пробирок, характе-j -ризующй плотность!

Показатели

число 1 длина Г длина 1скорость

падающей мощности ¡корней, j корня, ¡побега, I шт. I см см I I I

роста побега мм/сут.

сырая Кисло масса,I узлов побег.1штук/ г I побег

Контроль(необлучен) 4, .5 . 4, 1 9, 1. 1,3 2,8 8.6

5 + 5 1 4.9 4.8 15,6 2.2 5,6 12,7

2 4,0 6.3 12,7 2,3 5,3 11,3

7 + 7 1 6,0 5,8 11,5 1,6 3.6 10. 1

2 5,0 5,8 13,9 2,0 4,4 11,0

11 + 11 1 . 4,5 4.4 11,4 1,6 4.3 9,2

2 3,7 4,4 13,2 1.9 4.3 11.4

14 1 4,7 4,1 14,3 2,0 4.6 12,2

НСР0.95 0,7 0,7 р 0.6 0,7 1, 1

Адаптация растений к нестерильным условиям. Важным условием

в технологии клонального микроразмножения любого растения, в том числе и винограда, является адаптация "пробирочных" растений, выращенных in vitro, к условиям теплицы, откуда после соответствующего доращивания их высаживают в открытый грунт. Это обусловлено

тем. что листовые пластинки пробирочных растеньиц лишены эпикути-кулярного слоя воска и подвержены очень быстрому обезвоживанию в обычных условиях теплицы.

Известно несколько способов адаптации растений к условиям открытого грунта (П.Я. Голодрига, В.А. зленко и др., 1986; G. Brendel. 1986; В.А. Зленко, 1991; С.Ю. Дженеев. А.И. Литвак и др., 1990).

На основании обобщения существующих методик и проведенных исследований, нами разработан способ адаптации пробирочных растений, который включает: выбор субстрата, отбор растений определенных размеров, обработку растений и субстратов, осуществление процесса адаптации на стеллажах ускоренного размножения растений (СУВР).

В результате предварительных испытаний еыявлен субстрат -торф; песок: почва - 1:1:1. который обеспечивал выход адаптированных растений у сорта Алан 1 - 63,3%, а у сорта Агат донской -76,5%. С целью повышения выхода адаптированных растений и улучшения их развития изучали шюлиты натуральные и искусственные, разное соотношение их с почвой, песком, биогумусом.

Таблица 9

Приживаемость и развитие адаптированных растений на различных субстратах (Сорт Восторг, 1989-1992 гг.)

Состав субстрата

IПриживаемость,

Высота I Листья

расте- I------------------

ний, см1 число, 1площадь,

I IUT I

шт.

СМ

Контроль

(почва:песок: торф = 1:1:1) 60, 0 18.0 7, 5 17.2

Почва:песок: цеолит натураль-

ный (1:1:1) + биогумус 70,0 21.0 7,7 17,6

Почва:песок:цеолит натураль-

ный (2:0,5:0,5) + биогумус 70,0 17,1 6,3 16.8

Почва:песок: цеолит искусст-

венный (1:1:1) + биогумус 60,0 15,8 5,8 .. 16,7

Почва; песок: цеолит искусст-

венный (2:0,5:0,5)+биогумус 50,0 12,2 5.8 9.9

НСР0>9д 5, 9 2,9 0,5 • 0,6

чен

Как видно из данных таблицы 9, положительный результат полу-при введении в состав субстрата натурального цеолита. Это

способствовало повышению приживаемости и улучшению развития адаптированных растений. Увеличивался их рост и число листьев, соотношение почва: песок: цеолит натуральный. равное 1:1:1, оказалось лучше, чем 2:0.5:0,5, при котором приживаемость была высокой, но показатели развития растений ухудшились.

Для адаптации отбирали пробирочные растения, имеющие 3-5 листьев, не менее 2-3 корней длиной 1,5-3.о см. Чтобы избежать инфицирования, их обрабатывали 1%-ным раствором марганцевокислого калия, для улучшения ризогенеза - индолилуксусной кислотой в концентрации ю-15 мг/л в течение 3-5 минут. Торфоперегнойные горшочки и субстрат автоклавировали и также обрабатывали 1%-ным раствором марганцевокислого калия. Растения высаживали в торфоперегнойные горшочки и помещали в пакеты из прозрачного пластикового материала, которые закрывали вверху для предотвращения от водного стресса. Пакеты устанавливали на СУВР, где поддерживали тем пературу 25-27°, освещенность 8-Ю тыс. лк, световой период составлял 16 часов, снимали пакеты через 10 дней, и растения подвергались интенсивному воздействию света, который является пусковым эффектом для выработки эндогенных ауксинов, обеспечивающих оптимальное соотношение и развитие надземной части и корневой системы растения. Адаптация считалась законченной при появлении нового листа.

Разработанный способ обеспечивает повышение выхода саженцев до 96,6-97,4% и улучшение их качества (патент 11 17922S9, 1993).

■Адаптированные растения тестировали на наличие вирусной инфекции. для этой цели нами усовершенствован метод травянистых индикаторов, Установлена возможность тестирования винограда на ви~ русоносительство.. используя в качестве травянистых индикаторов Cucumis satlvus и добавляя в инокулюм (для предотвращения ингиби-рованкя вирусов) тиосульфат и активированный уголь вместо никотин- основания. Уровень выявленного вирусного заражения составил при этом у сорта Цветочный - 2Q-403S, сорта Саперави северный -58,555. Основными симптомами вирусного заражения (короткоузлие в комплексе с желтой мозаикой и окаймлением жилок) были изменение формы первых настоящих листьев, просветление жилок и мезжилкового пространства, бугристость поверхности листьев (Н.Л. Дорошенко, 1997).

Тестированием на травянистых индикаторах доказана возможность оздоровления растений от вирусной инфекции методом апикаль-

- 30 -

ных меристем размером 0,075-0,1 мм (Н.П. Дорошенко, 1999).

Создание сортовых маточников интенсивного типа из саженцев, оздоровленных и размноженных in vitro. Оздоровленный посадочный материал является одним из источников создания сортовых маточников интенсивного и суперинтенсивного типа.

Известные рекомендации и инструкции (Е,И. Захаровой, Б,И. Моногарова. 1977: А.П. Дубовенко, 1980; Л.М. Малтабара, 1985. 1988 и др.) по созданию сортовых маточников винограда интенсивного типа были взяты за основу, учтены биологические особенности "инвитровых" саженцев и разработаны рекомендации по созданию сортовых маточников интенсивного типа из оздоровленного посадочного материала клонального микроразмножения (1991).

При проведении этой работы изучали особеннсти закладки маточников в пленочных и стационарных теплицах, в открытом грунте; способы писадки саженцев, сроки и схемы посадки, уход за растениями, организацию территории маточников. Закладку каждого нового маточника проводили с учетом накопленного опыта.

Сравнительные наблюдения за приживаемостью саженцев и развитием растений показали, что длина теплицы должна составлять не более 60 к ширина -3,5 м, высота - 2.5-3,0 м. В теплице такого размера можно разместить 1000 саженцев, а объем теплицы способствует поддержанию удовлетворительного уровня температуры и влажности воздуха.

Более оптимальным решением, как показал опыт, является создание комплекса из нескольких пленочных теплиц и участка земли, прилегающего к ним.

Установлено, что при посадке лучше приживаются растения высотой 20-30 см с 5-6 настоящими листьями. Определены оптимальные (первая декада июня) и допустимые (третья декада мая-вторгя декада июня) сроки посадки. Однако при ранней весне лучше высаживать растения в третьей декаде апреля и в течение мая.

Выделены основные моменты по уходу за маточниками: сроки и способы проведения поливов, регулирование режима проветривания теплиц, многократные подвязки растений в течение вегетации, удаление пасынков на растениях, чеканка побегов во второй половине августа, защита растений от милдью и особенно от оидиума. В конце октября до наступления заморозков необходимо провести короткую (на 1-2 глазка) обрезку лоз, а затем окучивание их, не допуская повреждения морозом.

В винсовхозе "Жемчужный" маточник сортов Алан I и Агат донской был заложен в пленочной теплице. Было высажено четыре ряда саженцев по схеме 1,5 м х 0,4. м на расстоянии 0,75 м от стенки теплицы. На этом маточнике трехлетнего возраста оптимальное развитие растений отмечено при 4 рукавах, нагрузке 15 побегов: увеличивалась длина побегов, суммарная длина вызревших побегов, что обеспечило высокий выход качественных, черенков. У сорта Агат Донской получены аналогичные данные.

В винсовхозе "Россия" вегетирующие оздоровленные растения были высажены в пленочную теплицу в два ряда по схеме 2,0 х 0,4-0,5 м. Весной следующего года теплицу сняли, и растения вегетировали на открытом воздухе.

Таблица 10

Характеристика маточных насаждений сорта Ллан 1 (совхоз "Россия", 1980-1003 гг.)

Число 1 Средняя Вызре- Суммар- Диаметр Длина 1 Выход черенков

побе- 1 длина вание ная побега. междо-1 с одного куста

гов. побега. побе- длина см узлий,1 --------- -------

шт. 1 см гов. вызрев- см 1 двух- шести-

1------ ------- % ших по- глазка-1глаз-

1 общая вы- бегов/ вых ковых

1 зрев- куст.

I шая , СМ

4.6 147,7 120.5 81,6 554,3 0,7 6,5 52,7 15,1

8.6 179, 1 146.4 81,7 1258,2 0.7 6.8 116,6 33,1

10,5 158,8 125,0 78.7 1324,5 0.6 7.0 120,7 34.1

14,5 151,6 106,2 70.0 1539,9 0.6 8.6 124.2 33.6

Как следует из данных, приведенных в таблице 10, на маточнике в открытом грунте с увеличением нагрузки до 10,5-14,5 побегов на куст несколько уменьшается прирост, вызревание и диаметр побегов, но суммарная длина Еызревших побегов увеличивается, что обеспечивает высокий выход черенков. Более высокую нагрузку применять не следует, так как на пятый год после высадки при этой нагрузке отмечается тенденция к снижению выхода черенков.

Высокая приживаемость (85-90%) и хорошее последующее развитие получены при посадке растений в пленочные теплицы по схеме 40 х 30 см с последующей выкопкой саженцев, хранением и закладкой маточника на постоянном месте (совхозы "Первомайский", "Россия").

Разработаны способы посадки адаптированных вегетирующих и

вызревших саженцев, полученных in vitro в открытый грунт в пределах тепличного комплекса. Необходимым условием при этом является защита места посадки от ветра и прямых солнечных лучей, предварительная закалка растений. Удовлетворительные результаты получены при схеме 40 х 30 см в кежтепличном пространстве (ОПХ ВНИИВиЕ) и при уплотненной посадке 15 х 30 см на территории тепличного комплекса винсовхоза "Прогресс". При осенней посадке вызревших растений на глубину 40 см по схеме 1,5 х 0,4 м (межтепличное пространство, внпсовхоз "Ведерники") отмечена удовлетворительная перезимовка и развитие опытных растений.

Разработан способ закладки маточников в стационарных теплицах. состоящий из двух этапов, В первый год растения, полученные In vitro, высаживают по уплотненной схеме 30 х 15 см в теплице или открытом грунте, что не только экономит площадь теплиц, но и обеспечивает лучшее развитие растений. Затем на второй год растения пересаживают в теплицу по схеме 90 х 90 см. При обрезке па t-2-глазковые рожки оставляют три побега, что обеспечивает' хорошее их развитие: длина каждого побега - 10,9 м. вызревание -91,635, диаметр - 0,8 см и получение высококачественных черенков.

Таким образом, оздоровленный посадочный материал клонального микроразмножения in vitro может быть использован для закладки маточников в производственных условиях, что подтверждает практическую значимость и перспективность этого метода ускоренного размножения новых ценных перспективных сортов винограда.

2. СОЗДАНИЕ БЕССЕМЯННЫХ СОРТОВ ВИНОГРАДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ СЕМЯПОЧЕК IN VITRO

Число исследований по культуре семяпочек бессемянных сортов винограда невелико. Однако ученые уделяют этому направлению серьезное внимание. Так, М. Barlass. D.w. Raming, Н. Р. Davis (1938) подчеркивают, что культура семяпочек In vitro при использовании двух бессемянных родителей способна сократить продолжительность селекции до 4 лет и повысить бессемянность до 85%. В программу исследований они включают извлечение семяпочек и оптимизацию их прорастания. Наши исследования также были направлены на оптимизацию всех этапов разрабатываемого метода.

Эмбриогенез при самоопылении бессемянных сортов винограда. К. Goldy, U. Arabern (1987) обращают внимание на выбор таких родительских сортов, у которых возможны жизнеспособные родительские

комбинации и превосходная возможность культи в и р у ем ос ти in vitro.

Наш изучен эмбриогенез при самоопылении у 14 форм л сортов винограда. Полное отсутствие эмбриогенеза отмечено у сортов Пер-лет. Коринка русская, Белградский бессемянный, формы 8-25-78. Отсутствовал или был низким эмбриогенез у сортов Розовый бисер, Бита, Кишмиш лучистый (2.3-3,8%) и повышенным у гибрида N 342, сорта Кишмиш новочеркасский, гибрида VI-4."......

.Рудбил единственный сорт из исследованных, у которого эмбриогенез отмечен во все годы наблюдения, уровень его достигал 59,5%. Этот сорт, являющийся донором бессемянности (Смирнов и др., 1996) рекомендован для использования в селекции бессемянных сортов.

Эмбриогенез практически отсутствовал при массе абортивных семяпочек 10 мг и меньше, был высоким при массе семяпочек 30 мг и выше. При средних размерах семяпочек 19-20 мг эта зависимость отсутствовала. На основании этого мы считаем, что успех культуры обусловлен генотипом бессемянного сорта.

Эмбриогенез при самоопылении бессемянных сортов зависит от сроков изолирования семяпочек. При изолировании семяпочек через 40 дней после самоопыления эмбриогенез практически отсутствовал. Наличие эмбриогенеза, хотя и незначительного, у гибрида N 342 является положительным и указывает на возможность получения раннеспелых сортов при работе в этом направлении.

При более поздних сроках изолирования образование эмбрионов у разных сортов происходит в разные сроки. Так, у сорта Русбол эмбрионы образуются при всех сроках изолирования семяпочек, но при изолировании через 110 дней после цветения.число их увеличивается вдвое и составляет 22,2%. У гибрида Н 342, наоборот,наибольшее число их образуется при изолировании семяпочек через 50 дней поело цветения, уменьшается вдвое через 2 недели и еще более чем в два раза - при поздних сроках изолирования, у сорта Мечта эмбрионы не образовались ни при одном сроке изолирования семяпочек.

Образование эмбрионов не зависело ни от массы, размерных характеристик. ни от индекса семяпочки. Существует тесная взаимосвязь между сортом и сроком изолирования.

Подбор пар и комбинаций скрещивания, в течение 6 лет изучено около 20 комбинаций скрещивания бессемянных сортов винограда с бессемянными. Комбинационную способность выбранных пар характери-

зовали следующими показателями: прорастание семяпочек при культивировании их in vitro, наличие эмбрионов и эмбрионоподобных структур при вскрытии непроросших семяпочек: получение сеянцев из проросших семяпочек и эмбрионов, выделенных при вскрытии семяпочек. Полученные результата отражены в таблице 11.

Непосредственное прорастание семяпочек на питательной среде наблюдалась в восьми комбинациях. Семяпочки проросли в тех комбинациях скрещивания, где материнскими формами были Кишмиш ЦГЛ. 1-15-7-1, 1-15-5-7, а отцовскими - Кишмиш уникальный, Русбол и Коринка русская. Причем большее число семяпочек проросло в комбинате! скрещивания Кишмиш ЦГЛ X Русбол - 26.2 и 52,

Таблица 11

Образование эмбрионов и сеянцев из семяпочек, полученных в различных комбинациях скрещивания бессемянных сортов винограда (1990-1995 гг.)

Комбинации скрещивания

Проросло семяпочек, %

Образовалось эмбрионов, %

Получено растений. %

в 1макси- I в 1макси- I в . сред-1мальное)сред-Iмальное!среднем I число ¡нем | число !ием

максимальное число

1 1 2 1 3 ) 4 1 5 1 6 1 7

1. Кишмиш ЦГЛ х

Кишмиш уникальный 8.4 16.4 44,6 48,2 9,2 22,8

2. Кишмиш ЦГЛ х

Коринка русская 2.8 16,4 36,7 52, 5 8,4 20.0

3. Кишмиш ЦГЛ х

Русбол £6.2 52,4 37,5 45,0 4.0 5.7

4. 1-15-7-1 X

Восторг 5,7 U.6 23,2 47,3 2.6 5,0

5. 1-15-7-1 х

Кишмиш уникальный 1.8 2,9 19,2 38.5 9,3 12, 5

6. 1-15-5-7 х

Русбол 0,3 0,9 17,7 46,4 0.9 2,8

7. 1-15-5-7 X

Кишмиш уникальный 1,4 2,8 11,2 17,2 0,4 1.2

8. 1-15-5-7 X

Коринка русская 0 0 7,4 8,8 1.0 2.0

Мечта х Русбсл гч •J 0 с; -5 -J, V- 15, S 0,3 2. 3

10. Кишиш лучистый X

Русбол 0,2 0.4 4.7 8.7 1.9 2.0

Продолжение таблицы 11

1 1 2 I 3 1 4 1 5 1 6 1 7

11.Белградский бессе-

мянный х Русбол 0 0 2,6 5,3 0 0

12.1-17-7-4 X

Коринка русская 0 0 .2,5 2,5 0 0

13.Кишмиш новочеркас-

ский 'х Русбол 0 0 1.8 - 1,8 0 0

14,11-2-5-12 X

Коринка русская 0 0 0 0 0 0

15.11-2-2-4 х Кишмиш

новочеркасский 0 0 0 0 0 0

Число эмбрионов и эмбрионоподобных структур, обнаруженных при вскрытии непроросших семяпочек, характеризует потенциальную способность комбинаций скрещивания к эмбриогенезу. Более высокий эмбриогенез отмечен в комбинациях скрещивания, где материнская Форма - Кишмиш ЦГЛ; средний, где материнские формы - 1-15-7-1 и 1-15-5-7. В тех комбинациях скрещивания, где материнская форма Мечта, Кишмиш лучистый, Белградский бессемянный, 1-17-7-4. Кишмиш новочеркасский, отмечен низкий эмбриогенез.

Растения из проростков получены в десяти комбинациях скрещивания. и число их было невысоким. По этому показателю можно выделить следующие комбинации: Кищмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный. Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская, 1-15-7-1 х Кишмиш уникальный. Кишмиш ЦГЛ х Русбол. В остальных комбинациях образовались единичные растения. Но образование даже единичных растений является положительным Фактором, так как указывает на потенциальную возможность получения сеянцев в данной комбинации скрещивания.

Более высокий уровень эмбриогенеза отмечен в тех комбинациях скрещивания, где масса абортивных семяпочек была более высокой -37. зз, 28 мг. Однако, при одинаковой массе семяпочек в комбинации скрещивания Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская (23 мг) и 1-15-7-1 х Восторг (28 мг) образование жизнеспособных эмбрионов было более высотам при скрещивании Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская.

Более жизнеспособные эмбрионы были и в комбинации скрещивания Кишмиш ЦГЛ х кишмиш уникальный (33 мг). чем в комбинации кишмиш ЦГЛ х Русбол (37 мг). Сравнительно невысоким был процент эмб риогенеза при самой высокой массе семяпочек 40-41 мг. Однако, в

пределах отдельных комбинаций скрещивания увеличение массы семяпочек приводит к увеличению числа жизнеспособных зародышей. Это типично для всех изученных комбинаций скрещивания. Это также относится и к размерпш характеристикам семяпочек.

Влияние сроков изолирования семяпочек на эмбриогенез и образование растений. По срокам изолирования семяпочек мнения ученых разделились. В то время как одни отдают предпочтение ранним срокам изолирования - 40-60 дней после опыления (Р. Spiegel-Roy и др., 1985; S. Canoellier и др., 1990), другие рекомендуют более поздние сроки ближе к сроку созревания (A. Bouquet, Н.Р. Davis. 1989), на 101-Й день после цветения (D.W. Cain, R,L. Emershad, R.E. TaraiLo, 1983).

В наших исследованиях в среднем по 10 комбинациям скрещивания число эмбрионов постепенно возрастает с увеличением сроков изолирования с 35 до 100 дней. Максимальное число эмбрионов обнаружено при изолировании семяпочек через 100 дней после опыления. Это характерно для комбинаций с высоким уровнем эмбриогенеза: Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская. Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный, I -15-7-1 х Кишмиш уникальный, N 342 х Кишмиш новочеркасский. Исключением является комбинация скрещивания 1-15-7-1 х Восторг, в которой более высокий уровень эмбриогенеза отмечен при культивировании семяпочек через 80 дней после опыления. Такой же результат получен в малопродуктивных комбинациях: 1-17-7-4 х Коринка русская. Мечта х Русбол. При скрещивании 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный большее число эмбрионов получено при изолировании семяпочек через 50 дней после опыления, а при скрещивании Кишмиш лучистый и Русбол - через 65 дней.

Таким образом, прослеживается тенденция увеличения уровня эмбриогенеза при более поздних сроках изолирования семяпочек: 80-100 дней после опыления. Однако, в некоторых комбинациях скрещивания эффективными оказались более ранние сроки изолирования -50-65 дней после опыления.

Как видно из данных таблицы 12, процент образовавших растений увеличивается с увеличением срока изолирования семяпочек до 80-го дня после опыления -10,1, а затем снижается до 9,0%. Число образовавшихся растений намного меньше, чем число эмбрионов.

По количеству образовавшихся эмбрионов и растений, полученных из них, оптимальными сроками изолирования семяпочек являются 80 и 100 дней после опыления.

Таблица 12

Образование растений из абортивных семяпочек при разных сроках их изолирования (1991-1995 гг.)

1 Получено растений (%).

Комбинации I дни после опыления

скрещивания 1 - 35 1 50 1 ~65 . L.80~ Т 100 1 0-100

Кишмиш ЦГЛ ..х. .

Коринка русская 1,8 8,3 14, 8 14.8 22,3 12,0

Кишмиш ЦГЛ X

Кишмиш уникальный 3,7 9, 1 32.1 36,7 25,9 21,5

1-15-7-1 X Восторг 0 0 1,9 13,7 1,8 5,8

1-15-7-1 X

Кишмиш уникальный О 3.6 14,8 18,1 18.0 10,9

1-15-5-7 X

Кишмиш уникальный 0 2,5 0 0 4.5 1. 4,

1-15-5-7 X

Коринка русская О 0 0 - - 0

N 342 х кишмиш

новочеркасский - 0 0 18,0 0 4.5

1-17-7-4 X

Коринка русская - 0 0 0 - 0-

Мечта х Русбол - 0 0 О 0 0:

Кишмиш лучистый X

Русбол - . 0 1,8 0 0 ■ 0.4

Всего: о.'э 2.3 6.7 10. 1 9.0

Установлена зависимость между уровнем эмбриогенеза и степенью развития гибридных семяпочек. Большее число зародышей и растений развивается из. семяпочек, имеющих массу 28 мг и выше. Оптимальными являются сроки изолирования, при которых семяпочки достигают такой массы.

На основании исследований ученых, работающих в этом направлении. и с учетом результатов собственных исследований, пришли к выводу, что успехи культуры в значительной степени обусловлены генотипом бессемянного сорта, использованного в качестве женского ■ родителя, и сроками изолирования семяпочек.

Влияние питательной среды на жизнеспособность семяпочек. Одним из оснозных факторов при культивировании семяпочек винограда in vitro являстся подбор питательной среды. Среди ученых нет единого мнения по этому вопросу. Испытывались различные питательные среды. Положительные результаты получены на средах Стеварда и Нь-юса с добавлением различных аминокислот, Нича. Орхид агара. Мура-

Таблица 13

Эмбриогенез при сочетании различных комбинаций скрещивания, питательной среды и сроков изолирования семяпочек (1989-1991 гг.)

Число жизнеспособных зародышей, шт. Жизнеспособные зародыши и

й сроки изолирования растекад

Комбинация Питательная среда По среде По комбина-

скрещивания 31 45 56 66 60 94 93 108 ции

Шт. * шт. . %■

1-15-7-1 х Уайта. 1 0 4 2 7 1 - - 15 8,9

Уайт + ПБП 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 6,0

Восторг Ли и де Фоссарда 0 0 2 3 0 - - 5 6Д

1-15-7-1 X Уайта 0 0 0 6 7 13 2 10 38 18,9

Кишмиш Уайт+ПБП 0 0 0 3 1 0 1 4 9 7,6 50 11,2

уникальный Ли и де Фоссарда 0 0 0 2 1 - 0 0 3 2,4

Кишмиш ЦГЛх 'Уайта ' 0 0 1 13 12 - 6 - 32 21,4

Кишмиш Уайг + ПЗП 0 0 1 1 5 - 4 - 11 13,1 45 19,3

уникальный Ли и де Фоссарда 0 0 0 0 2 - 0 - 2 2А

Кишмиш ЦГЛх Уайта 0 , СИ 7 12 б - 10 10 45 25,6

Коринка ' 1 1 Уайт + ПВП 0 3 0 0 1 - 3 2 9 7,6 63 15,6

русская Ли и де Фоссарда - - 0 0 2 - 7 - 9 8,0

Киштсш Уайта 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Лучистый (са- Уайт + ПВП 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Моопьгленкый) Ли и де Фоосарда 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Всею жизнеспособных

зародышей, шт. 1 3 13 41 47 14 33 26

Н 0,4 1А 4,7 14,7 16,8 10,1 16,1 14,3

сиге и Скуга с добавлением гиббереллина и индолилуксусной кислоты. Для культивирования семяпочек и зародышей плодово-ягодных культур и винограда рекомендована среда Уайта.

В связи с этим нами проведено сравнительное испытание среды нича и Уайта на двух комбинациях скрещивания (Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный. Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская); среды Уайта, среды Уайта с добавлением поливинилпирролидона (ПВП) и среды Ли и де Фоссарда на четырех комбинациях скрещивания (Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный, Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская, 1-15-7-1 х Кишмиш уникальный, 1-15-7-1 х Восторг) и при самоопылении сорта Кишмиш лучистый.

Влияние питательной среды на жизнеспособность семяпочек четко отмечено во всех комбинациях скрещивания.

Установлена более высокая результативность среды Уайта. Вс всех комбинациях скрещивания на этой питательной среде получено наибольшее число жизнеспособных зародышей (табл. 13).

Морфологическая характеристика сеянцев, полученных из семяпочек в культуре тканей. Полученные сеянцы отличались разнока-чествекностью в пределах отдельных комбинаций скрещивания. Полноценные сеянцы с развитым центральным и боковыми корнями, с достаточно развитым побегом получены в комбинациях скрещивания Кишмиш ЦГЛ к Коринка русская (при изолировании через 50 и 65 дней). Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный (при изолировании через 80 дней). Кишмиш ЦГЛ х Русбол (65 дней после опыления). 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный (сроки изолирования 50 и 100 дней). Помимо этого отмечены следующие аномалии развития: рост центрального корня, отсутствие роста боковых, гипокотиля,. эпикотиля, побега; рост центрального и боковых корней, отсутствие роста гипокотиля, эпикотиля > и побега; рост центрального и боковых корней и гипокотиля, от-

сутствие роста побегов; рост гипокотиля и эпикотиля и отсутствие роста корней и побега.

В комбинации скрещивания 1-15-7-1 х Кишмиш уникальный получены лишь аномальные сеянцы. Это можно сказать и о сеянцах, полученных при самоопылении сорта Русбол и гибрида М 342.

Аномальное развитие сеянцев, в основном, приводит к их гибели. в связи с этим необходимо наблюдать за их развитием и разработать способы их спасения. Одним из таких способов можеч' быть микрочеренкование сеянцев. Из расчеренкованного сеянца получены разнокачественные, но нормальные растения, пригодные для адапта-

- 40 -

ши и для дальнейшего микрочеренкования.

Сеянцы были адаптированы на СУВР и высажены в пленочные теплицы. К концу вегетационного периода они имели следующие средние размеры: длина побега - 97,7 см: вызревшая часть - 82.3 см; число листьев - 15 шт.; диаметр в нижней части побега - 6 мм, в верхней -3,7 мм.

4.6. Агробиологическая оценка сеянцев:- Наблюдения, проводимые за .54 сеянцами из четырех гибридны:', семей, показали следующее.

Цветение отмечено на третий год у 11 сеянцев из семей Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный (5 шт.), Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская (5 шт.) и 1-15-7-1 х Восторг ( 1 шт.). Десять сеянцев имели обоеполый тип цветка и белую ягоду, один сеянец из семьи Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный - с женским типом'цветка и черной ягодой.

По срокам распускания почек и начала цветения сеянцы практически не различались. Более раннее созревание ягод отмечено у сеянцев из семьи Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская (начало созревания -последняя декада июля), у остальных сеянцев - на 1-2 недели позже.

Высокий уровень морозостойкости отмечен у трех сеянцев из семьи Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный (V-15-7-1, v-is-7-ю, V-15-7-H). у одного сеянца из семьи Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская и из семьи 1-15-7-1 х Восторг. Распускание глазков после зимы 1993-1994 гг. с абсолютным минимумом температуры -26,7°С составило 75-91%.

Сеянцы, в основном, 'отличались слабой силой роста. Лишь отдельные растения имели средний (1-2 м) и сильный (2-3 м) прирост.

Коэффициент плодоносности сеянцев в основном низкий и лишь у двух сеянцев из семьи Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный он составил 0,8.

Наибольший урожай получен у сеянца V-15-7-10 (Ккшиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный), у него же были и самые большие, в сравнении с остальными, грозди (средний вес 62 г). Ягоды, в основном, мелкие (0,1-1,1 г) за исключением сеянца IV-2-1-6 (Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская), который имел ягоды среднего размера.

В 1995 г. выделен по первому плодоношению сеянец VI-15-1-2 (Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская), отнесенный предварительно к III-IV классу бессемянности (средняя масса семени 26,9 мг).

Адаптация полученных гибридных сеянцев к нестерильным уело-

виям, высадка в полевые условия более 200 сеянцев, нормальное их развитие в течение 5-7 лет указывает на то. что метод селекции с использованием обоих бессемянных родителей и культуры изолированных семяпочек In vitro в основном разработан. В будущем предстоит оптимизация отдельных его этапов с целью селекции бессемянных сортов винограда с заданными свойствами.

Положительным, на наш взгляд, является то, что наряду с комбинациями скрещивания с высоким уровнем эмбриогенеза, о которых мы упоминали выше, возможно получение единичных растений в таких комбинациях, как Мечта х русбол. 1-15-5-7 х Русбол. Кишмиш лучистый х Русбол и обнаружение зародышей в парах Белградский бессемянный х Русбол. 1-17-7-4 х Коринка русская и др., при оптимальных сроках изолирования, что указывает на возможность положительного результата при дальнейшей работе с этими сортами.

3. ТЕХНОЛОГИЯ СОХРАНЕНИЯ IH VITRO ГЕНОФОНДА ВИНОГРАДА

Для поддержания культуры винограда in vitro требуются регулярные пересадки на свежую питательную среду через 2-2.5 месяца, что оказывается довольно трудоемким процессом. Поэтому как в практическом, так и в научном отношении, необходимо найти альтернативные методы хранения, требующие меньше времени и-финансовых затрат.

Задача состоит в том, чтобы изменить кинетику роста культуры и увеличить временной интервал между пересадками.

Депонирование при положительной пониженной температуре. Наиболее очевидный путь замедления роста - снижение температуры культивирования.

В известной нам научной литературе сведения о длительном хранении винограда in vitro незначительны, tí депонировании пробирочных растений винограда, в т. ч. и при пониженных температурах, сообщали в ряде публикаций fR. Galzy, 1972. 1985, 1990; R, Galzy, D. Соврал. 1998; М. Barlass, K.G.Í!. Skene, 1983; M. lacob, A. Deloire. Tli. Caspar, 1989; o.H. Высоцкая, 1994). R. Galzy (1977, 1990) отмечено, что на развитие микрочеренков большое влияние оказывают минеральное питание, освещение, температура. Эксперименты по сохранению пробирочных растений без света проводили при у, 7 и 2°с. В результате были сделаны выводы о том. что растения винограда, культивируемые in vitro, не переносят отсутствия освещения и температуру ниже 8°С. R, Galzy считает, что минимальный

рост можно поддерживать при температуре от 9 до 15°.

Французские ученые М. Iacob и A, Deloire исследовали хранение винограда в культуре in vitro при 3°С в темноте в течение 1-8 месяцев и последующее поведение растений (1989),

Нашми исследованиями установлено, что при пониженной температуре (11-П°С) на свету у пробирочных растений уменьшается число корней и их длина, число листьев и высота побегов, т.е. наблюдается минимальный рост, что способствует увеличению продолжительности хранения. Интервалы между пересадками увеличиваются вдвое и становится возможным делать одну пересадку в полгода.

Состояние растений при пониженной температуре было хороши. Они имели плотные, темно-зеленые листья, подсыхания среды не отмечалось. Растения были расчеренкованы и выставлены в культураль-кую комнату для рекультивации. Проведенный учет показал, что сохранились живыми и удовлетворительно развиваются после хранения при пониженной температуре и освещенности 62, 5% растений.

Депонирование при температуре +4°С в условиях климатической камеры, ИФР им. К,А. Тимирязева. Изучение метаболизма растений винограда в культуре in vitro при нормальной и пониженной температуре привело к необходимости уточнения условий среды, используемой для хранения.. В этом направлении известны исследования по садовой землянике Е.К. Ульяновой (1990), О.Н. Самсоновой (1989, 1991). О.Н. Высоцкой (1994), результаты которых показывают, что продолжительность хранения пробирочных растений этой культуры на специальной среде можно увеличить до одного года при комнатной температуре и до 2-3 лет - при 4°С.

На оснований этого мы проверили как поведут себя растения винограда при длительном культивировании на питательной среде, предложенной для депонирования земляники.

Установили, что растения винограда in vitro на среде для хранения способны переносить температуру 4еС в течение десяти месяцев. В данных условиях растения сохраняют жизнеспособность, и микрочеренки, полученные из них, способны регенерировать при обычном режиме культивирования. Различные сорта винограда по-разному реагируют на такие условия депонирования. Из двух изученных сортов более устойчивым к пониженной температуре оказался Восторг, у которого регенерировало 79,7% растений, в то время как у сорта Агат донской - только 58, ож.

Максимально возможный срок хранения установлен для сорта

Восторг. При температуре 4°С и низкой освещенности сохранилось 76% растений в течение 12 месяцев (табл. 14).

Таблица 14

Развитие растений Восторга в различных условиях депонирования, 1992-1993 гг.

I Живые растения (Ж) Условия I при продолжительности

культивирования ! депонирования, мес.

I " з" Т 9 " Г 12

20°С. освещение 5-8 тыс. лк,

16 ч/сутки, среда Мурасиге-Скуга 100 23 13

20°С, освещение 5-8 тыс. лк.

16 ч/сутки, среда для хранения 100 35 28

4°С. освещение 0.3-0.5 тыс. лк.

24 ч/сутки, среда для хранения 100 80 76

Таким образом, проведенные исследования позволяют предложить новые условия хранения коллекционного генофонда винограда In vitro до 10-12 месяцев и более без пересадок за счет использования среды для хранения и температуры 4°С. Вероятно, для сохранения пробирочных растений некоторых сортов винограда больше подойдет температура 8-10°С. Даже если срок гарантированного хранения растеньиц будет несколько меньше, то и в этом случае экономия трудовых и материальных затрат окажется значительной.

Культивирование в присутствии регуляторов роста. Известны результаты исследований G. Alleweldt (1987) о том. что ретардант ССС оказывает влияние на замедление роста пробирочных растений сортов Бахус и Оптима. и увеличение продолжительности их хранения без пересадок до 5-7 месяцев. Однако, он отмечает, что этих данных недостаточно, чтобы выявить возможную сортовую реакцию на Ссс в культуре.

проведенные нами наблюдения на сорте Восторг показали, что через 2,5 месяца рост побегов значительно уменьшился: с 11-12 см на контроле до 7-8 см в варианте с добавлением в питательную среду хлорхолкнхлсрида (табл. 15). Аналогичное положение сложилось н по развитию листьев. В то время как при применении ССС большинство растений образовало от 2 до 7 листьев, без ингибитора растения имели по 16-18 листьев. Количество листьев на один побег- при добавлении в среду хлорхолинхлорида составило в среднем 5,5 шт., без применения ингибитора - 12,6 шт. То есть, под влиянием хлор-

- - 44 -

холинхлорида число листьев уменьшилось в 2.3 раза (табл. 15). Также уменьшилась длина междоузлия с 0,61 до Û.4 см.

Таблица 15

Рост побегов и образование листьев у пробирочных растений винограда сорта восторг при добавлении в питательную среду CGC (1990 г.)

Показатели I При добавлении в среду ССС 1 Без ССС

- побегов- ■ i--------------------------------1 (контроль)

пробирочных I через 3 месяца 1череэ 2,5 месяца¡через 2,5

растений I I I месяца

Высота побега, %

до 2 см 53,3 50,0 16,7

2-5 см 33,3 16,7 0

5-6.9 см 13.4 12.5 16,7

7-8 см 0 37.5 0

11-12 см 0 0 66,7

lecTBo листьев, %

2-4 шт. 60,0 31,2 0

5-7 шт. 0 31,2 16,7

8-12 шт. 40.0 0 0

14-15 шт. 0 37,6 0

16-18 шт. ' 0 0 83,3

Таким образом, добавляя в питательную среду хлорхолинхлорид, можно добиться уменьшения роста пробирочных растений, уменьшить число их пересадок и увеличить продолжительность хранения до 6 месяцев. '

Также установлено, что 6-БАП в концентрации 0,1 мг/л при 6% содержании сахарозы в питательной среде способствует минимализа-ции роста пробирочных растений: уменьшается число корней в 1,2 раза, длина одного, корня - в 5 раз, общая длина корней - в 6 раз, длина побега - в 3.4 раза, что можно использовать для более длительного (до 7-8 месяцев) хранения коллекция винограда без пересадок.

Продолжительность хранения винограда in vitro в присутствии осмотических ингибиторов. Рост растений можно задерживать, как отмечают Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко и др. (1990), Л.А. Уизерс (1957), добавлением к питательной среде осмотических ингибиторов роста - маннита и сорбита. В научной литературе данных о применении осмотических ингибиторов для торможения роста растений виног-

рада мы не нашли.

В наших исследованиях маннит в концентрации 5.0; 7,5 и 10.0 мг/л стимулировал скорость роста побегов, образование корней и листьев. При добавлении в питательную среду сорбита при этих концентрациях отмечена тенденция к уменьшению роста "инвитровых" растений. При более высоких концентрациях сорбита (Ю; 30; .60 мг/л) эта тенденция сохранилась и установлена возможность сохранения растений на твердой питательной среде при культивировании на свету до 4 месяцев. Число жизнеспособных растений при культивировании с сорбитом в темноте резко сократилось и через 123 дня сохранились лишь единичные растения при концентрации сорбита ю и 30 мг/л.

Отмечено торможение роста при культивировании растений на свету на жидкой питательной среде с добавлением 60 мг/л сорбита, что указывает на возможность длительного хранения растений в таких условиях при сохранении среды от высыхания.

Очень жесткими оказались условия хранения в жидкой питательной среде в темноте. Через 90 дней культивирования погибли растения контрольного варианта, и растения на питательной среде с до-банкой сорбита 10 мг/л. Сохранилось 14,3% растений на питательной среде с 30 мг/л сорбита и 18,5Ж растений на среде с 60 мг/л сорбита. Эти растения имели хорошо развитые корни, небольшие побеги, и могли бы храниться дольше, если бы не высохла культуральная среда.

Таким образом, сорбит, добавленный в питательную среду в количестве 60 мг/л, тормозит рост пробирочных растений и способствует более продолжительному хранению их без пересадок при культивировании как на свету, так и в темноте как на твердой, так и на жидкой питательной среде, Для повышения продолжительности хранения необходимо оградить питательную среду от высыхания.

Применение природных ингибиторов для депонирования растений винограда. Природные ингибиторы роста, главным образом соединения терпеноидной (абсцизовая кислота и ее аналоги) или фенольной (ок-сикумарины и их производные, салициловая кислота, нарингенин к др.) природы, подавляют рост стеблей и тормозят распускание почек. Абсцизовая кислота способна в очень малых концентрациях по-ДЗВЛЯТЬ рост, индуцирует К2.СТуПЛ$КЙ6 СОСТОЯНИЯ ПС коя у растэннГ По данным болгарских ученых Е. Зозиковой, Д, Лилова, А.Д. Москова (1989), в семенах винограда содержится значительное количество

абсцизсвой кислоты и фенолов - 5938 мкг/100 г воздушно-сухой массы, намного превосходящее суммарное содержание ауксинов, цитоки-нинов и рутина (37-54 мкг/ЮО), которые стимулируют развитие растений.

Нами исследовано добавление семян винограда в питательную среду в виде тонкоразмолотого порошка в концентрации 0,5; 1,0 и 10% от объема среды и 10%; 20% вытяжки. Торможение роста корней и побегов.отмечено уже при концентрации .семян в составе питательной среды - О, 53£, но большее замедление роста было при 20% вытяжке из семян и при концентрации 1.0%. При концентрации 10,0% развитие растений отсутствовало (табл. 16).

Таблица 16

Влияние различных способов применения и концентраций растительной добавки из семян винограда на развитие растений сорта Восторг in vitro (1990-1991 гг.)

Число Корни Лис- Длина 1СК0-

жизне- ------- тья. побега. IpOCTb

способ ЧИСЛО. длина. шт. мм ¡роста.

Вариант ных шт. мм IKM/Cyif

расте- (

ний, . % 1 i

Контроль (0, 1%

активнров. угля) 78.5 4,9 23, 6 6,4 53,9 0,8

СВ 0,5% 92,8 3.9 12,6 3.9 27.8 0.4

СВ 1.0% 78.5 3.5 12,8 2.4 i5,7 0,2

СБ 10,0% -0 ■ Развитие-отсутствует

НСРд 9 з 1.2 4.0 1,3 9,0 0, 1

Контроль (0.1%

актиЕйров. угля) 88.1 4.7 41,5 5.7 56,3 0,9

CBj - вытяжка 10% 83,7 3.1 43,6 5,3 59.2 1,0

СВ, - вытяжка 20% 97,6 2.6 20,6 2.6 24,2 0.4

НСР0Ч5 0,8 4,9 0,8 7.0 0,2

Примечание: СВ - тонкоразмолотые семена; СВ1 - вытяжка из семян

Добавление в питательную среду размолотых семян винограда в концентрации 1,0% или в виде 20%-ной вытяжки из семян ингибирует образование и рост керпей. При этом число образовавшихся корней уменьшается в 1,4-1,3 раза, длина корня в 1,8-2,0 раза, сырая масса корней - в 3,6 раза, это, в свою очередь, ингибирует рост

побегов, скорость роста которых уменьшается в 2,2-4 раза, а длина - в 2.3-3,4 раза, число листьев - в 2,1-2.6 раза, сырая масса побегов - в 2,9 раза.

Таким образом, при добавлении в питательную среду размолотых семян винограда в повышенных концентрациях (20% вытяжка и 1,0%) создает в ней такой уровень естественных ингибиторов, при котором уменьшается образование и рост корней, рост побегов и число образовавшихся узлов. Благодаря этому, можно в 4-5 раз увеличить промежутки времени между пересадками растений на свежую питательную среду, которые можно проводить не через 1,5-2 месяца, а через 6-10 месяцев. Зто повышает экономическую эффективность длительного хранения винограда in vitro, так уменьшается трудоемкость процесса, и замедление роста пробирочных растений достигается без дополнительных затрат (патент N 2110172, 1998).

Положительной стороной этого способа депонирования является высокая регенерацнонная способность растений после хранения (табл. 17).

Таблица 17

Регенерация растений сорта Алан 3 после четырех месяцев хранения маточных растений на питательной среде с добавлением размолотых семян винограда (1994 г.)

Концентрация СВ в питательной среде

Число корней, 1 Высота расте- 1 Число листьев, шт. I ний, мм I шт.

Даты учета: дней после посева 20 Т 40 I 60 I 20 | 40 ! 60 I 20 1 40 I 60

Контроль 3,8 6,0 7,5 5,9 36,0 43,5 1,2 4,0 4.5

СБ-вытяжка, 10% 7.9 10,4 12,2 9.5 69,0 154,0 1,4 6,9 14.1

СВ-вытяжка, 20% 4,7 4,5 7,6 13,3 81,0 133,7 2,2 7,7 12,6

КСР0Э5 1.7 1,8 1,7 1,5 19,8 20,6 0,6 1,0 2.4

Из микрочеренков растений после хранения их на питательной среде с добавкой измельченных семян винограда получены растения, превосходяще контрольные как по числу корней (в 1,6 раза), так и по высоте растений (в 3,0-3,5 раза) и, что особенно важно, по числу листьев (в 2,8-3,6 раза).

Совместное пшкхегсюй температуры и добавления в пи-

тательную среду ингибиторов на депонирование винограда. Существует мнение И.А. Уизерса (1987) о том, что при продолжительном хра-

Рис. 3.' Динамика роста побегов и жизнеспособности пробирочных рдстеннн сорт* Восторг при продолжительное , *удътивкрованик кд. различных питательных сре^лх

1) М- С, тВердая,

21 М-С,*(идко

3) М-С^ тХе^ая * (% С8, е-п-гг'

4) М-С,твердое,^ -//-/Г*

5) А1-С,Ш(рдае дяе Хранения, ¿-//-/Г* 1

нении монет оказаться полезной комбинация двух факторов, каждый из которых применяется в умеренных дозах. .

При осуществлении депонирования в течение 35 недель при оптимальной, пониженной температуре и освещенности на питательной среде Мурасиге и Скуга твердой и жидкой, модифицированной для хранения, с добавлением 1.0% семян винограда (рис. 3) лучшие результаты получены на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга при положительной пониженной температуре. Сохранилось 25% жизнеспособных растений с удовлетворительным развитием корней и побе-

гсв. Несколько хуже были результаты при добавлении к этой среде 1,0% тонкоразмолотых семян винограда - сохранилось 17.8% растений, которые уступали растениям предыдущего варианта по развитию корней, высоте побега, числу листьев, но превосходили их по массе стебля и листьев. То есть установлено, что возможно для длительного хранения сочетать эти Факторы: пониженную положительную температуру 11-17°С, освещенность 500 люкс и добавление в питательную среду 1,0" семян винограда.

На основании изучения способов оздоровления и клонального микроразмножения, способов минимализапии роста разработана технология создания коллекция генофонда винограда In vitro. Технологический процесс состоит из следующих последовательных этапов: отбор исходного материала с виноградных кустов без признаков вирусных и бактериальных заболеваний, ввод в культуру эксплантов размером до о,1 мм для оздоровления от латентных вирусов, регенерация из них растений и микроразмножение, тестирование на наличие вирусов, культивирование оздоровленных растений при пониженной положительной температуре или при добавлении в питательную среду ростового или осмотического ингибитора, проведение ежемесячного контроля за ходом хранения растений и по мере необходимости пересадка растений на свежую питательную среду.

ВЫВОДЫ

Проведенные исследования по применению методов биотехнологии в виноградарстве позволяют сделать следующие вывода и предложения:

1. При введении в культуру различных эксплантов установлен положительный результат применения в качестве дезифектанта гипох-лорита кальция в концентрации 10% при экспозиции 30 мин. Экспозицию можно уменьшить до 20 мин.. если в качестве эксплантов использовать побеги с оздоровленных растений. Уменьшить ингибирова-ние ростовых процессов и инфицирование при вводе эксплантов в культуру можно добавлением в питательную среду бициллина {О,1 мг/л).

2. Ввод в культуру эксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм) необходимо осуществлять, на питательной среда Мурасиге и скуга в два этапа: сначала на твердой питательной среде в течение 3-4 недель, а затем экспланты, увеличившиеся до 2 мм и более, переносить на жидкую питательную

среду на мостики из фильтровальной бумаги, пробирки помещать на аппарат роллерного типа для культивирования их во вращающемся состоянии. Оптимальное содержание цитокинина 6-БАП для большинство сортов как в твердой, так и в жидкой питательной среде составляет 1,0 мг/л.

3. Совместное воздействие СВЧ-лучей и лазера (тонкий луч) на меристемы, высаженные на твердую среду,, способствует ускоренному прохождению ими Фаз развития, увеличению размерных характеристик, снижает'гибель из-за некроза тканей й' обеспечивает, в конечном итоге, повышение регенерационной способности меристем в 5,5 раза.

4. Оптимальной средой на этапе микрочеренкования, обеспечивающей необходимое развитие пробирочных растений, является основная питательная среда Мурасиге и Скуга. для предотвращения вероятности возникновения генетических изменений возможна замена этой среды на среду Ли и де Фоссарда, в меньшей степени поддерживающую каллусный рост. Эффективность применения этой среды установлена для культивирования сортов: Алан 1, Агат донской, Ромулус, Рус-мол. Восторг.

5. Оптимизировать клональное микроразмножение на этапе микрочеренкования можно воздействием СВЧ-лучей на пробирочные растения, добавлением в питательную среду естественных стимуляторов из размолотых семян винограда в концентрации 0,25 мг/л, 6-БАП в количестве 0, 05 мг/л. ■ Исследованные способы оптимизации улучшают развитие пробирочных растений и обеспечивает закладку большего числа узлов на побеге, чем повышают эффективность клонального микроразмножения при высоком качестве микрочеренков.

6. Адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям состоит из следующих последовательных этапов; выбор и подготовка субстратов, последовательная обработка растений, извлеченных из пробирок, 1%-ным раствором мзрганцезокислого калия и раствором индолилуксусной кислоты (10-15 мг/л). высадка растений в торфоперегнойные горшочки с субстратом, помещение их в индивидуальные пакеты из прозрачного пластикового материала с последующим культивированием на стеллажах ускоренного выращивания растений при температуре 25-27аС. освещенности 8-10 тыс. люксов, световом периоде 16 час. в течение 21-30 дней. Приживаемость растений в процессе адаптации составляет Э6,0-97,4л.

7. Стеноспермокарпические бессемянные сорта винограда могут при самоопылении образовывать жизнеспособные зародыши и растения.

Однако уровень эмбриогенеза низкий. Успех культуры семяпочек при самоопылении обусловлен генотипом бессемянного сорта. Из 14 изученных сортов и форм жизнеспособные зародыши и растения получены лишь у Русбола, гибридов N 311, 342. VI-4. Среди них по уровню эмбриогенеза выделяется Русбол, у которого жизнеспособные эмбрионы обнаружены во все годы наблюдения. Учитывая это и то. что этот сорт является донором бессемянности. считаем перспективным использовать его в селекции бессемянных сортов In vitro.

8. Комбинационную способность выбранных пар бессемянных сортов винограда in vitro характеризуют следующие показатели; естественное прорастание семяпочек, наготе эмбрионов и эмбрионопо-добных структур при вскрытии непроросших семяпочек; получение сеянцев из проросших семяпочек и эмбрионов, выделенных при вскрытии семяпочек. Непосредственное прорастание семяпочек на питательной среде, более высокий эмбриогенез и образование сеянцев отмечены в тех комбинациях скрещивания, где материнскими формами были Кишмии ЦТ Л, 1-15-7-1, а отцовскими - Кишмиш уникальный, русбол и Коринка русская. Большее число семяпочек проросло в комбинации скрещивания Кишмиш ЦГЛ х Русбол - 26,2 и 52,4%.

9. Более высокий уровень эмбриогенеза отмечен в тех комбинациях скрещивания, где масса абортивных семяпочек была 28-35 г. Однако четкой зависимости между фенотипом и генотипом для эмбриогенеза не установлено, что■ указывает на важность родительских комбинаций. В пределах отдельных комбинаций скрещивания увеличение массы семяпочек приводит к образованию большего числа жизнеспособных зародышей,

10. На образование эмбрионов и развитие на них растений значительное влияние оказывают сроки изолирования семяпочек. Прослеживается тенденция увеличения числа эмбрионов и эмбрионоподпбннх структур при более поздних сроках изолирования семяпочек на 80-100-й день после оплодотворения до 26,5-31,8%. В комбинациях скрещивания кишмиш лучистый х Русбол и 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный эффективными оказались более ранние сроки изолирования - 65 и 50 дней после опыления.Число развившихся растений намного меньше числа образовавшихся эмбрионов, особенно при раннем изолировании семяпочек. При более поздних сроках образование растений увеличивается и максимальной величины достигает при изолировании в 80 дней - 10,1%, а затем снижается до 9.0% при 100 днях изолирования.

-sail. Установлена высокая степень взаимодействия между комбинацией скрещивания, средой и сроком изолирования семяпочек. Влияние питательной среда на жизнеспособность семяпочек четко прослеживается во всех комбинациях скрещивания. Наибольшее число жизнеспособных зародышей получено на среде Уайта, результативность которой резко снизилась - в 1,5-3,0 раза при добавлении полиеи-нилпирролидона. Еще хуже были результаты на питательной среде Ли и де Фоссарда.

12. Сеянцы, полученные от естественного прорастания семяпочек. отличались разнокачественностыо как в пределах отдельных комбинаций скрещивания, так и между ними. Полноценные сеянцы с развитым центральным и боковыми корнями, с достаточно развитым побегом получены в комбинациях скрещивания Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская при изолировании через 50 и 65 дней после опыления. Кишмиш 11ГЛ х Кишмиш уникальный (срок изолирования 80 дней), Кишка] ЦГЛ х Русбол (изолирование через 65 дней), 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный (сроки изолирования 50 и 100 дней). В комбинации скрещивания 1-15-7-1 х Кишмиш уникальный из проросших семяпочек получены лишь аномальные сеянцы. Это относится и к сеянцам, полученным при самоопылении сорта Русбсл и гибрида к 312. Аномальное развитие .сеянцев, в основном, приводит к их гибели, одним из способов их спасения может быть их микрочеренкование, в результате которого получены пробирочные растения, пригодные для адаптации и для дальнейшего микрочеренкования.

13. Пониженная положительная температура (10-17°С) и освещенность (500 люксов) способствуют ограничению роста растений в пробирках, более продолжительному культивированию их без пересадок и является одним из путей создания коллекции генофонда In vitro. Предложены новые условия хранения коллекционного генофонда винограда in vitro без пересадок в течение 10-12 мое? и более за счет использования среда для хранения и температуры 4°с, обеспечивающих значительную экономию трудовых и материальных затрат.

14. Рост пробирочных растений винограда можно замедлить добавлением к питательной среде гормональных или осмотических ингибиторов, повышением концентрации 6-БАП и сахарозы. Ретардант ССС в концентрации 1 мг/л оказывает влияние на замедление роста пробирочных растений и увеличение периода без пересадок до G месяцев. Сорбит, добавленный в питательную среду & количестве 30-60 мг/л тормозит рост пробирочных растений и способствует более про-

должительному хранению их без пересадок при культивировании как на свету, так и в темноте: как на твердой, так и на жидкой питательной среде. 6-БАП в концентрашш 0,1 мг/л при 6,0% содержании сахарозы способствует минимализацки роста пробирочных растений, что можно использовать для длительного хранения коллекций винограда.

15. Доказан ингибирующий эффект растительной добавки в питательную среду в виде тонкоразмолотых семян винограда или в виде вытяжки из них. Добавление в питательную среду семян винограда в виде тонкоразмолотого порошка в количестве 1,0% к объему среду уменьшает ростовые процессы в 3,4 раза, а в виде 2о%-ной вытяжки - в 2,3 раза, благодаря чему увеличивается продолжительность хранения растений без пересадок.

16. По степени ингибировакия роста растений и увеличению продолжительности хранения изученные способы минимализации роста характеризуются следующим образом: продолжительность между пересадками составляет 4 месяца - добавление в питательную среду сорбита; продолжительность между пересадками 6 месяцев - культивирование при положительной пониженной температуре и освещенности, добавление в питательную среду хлорхолинхлорида. добавление в питательную среду 6-БАП на утроенном содержании сахарозы; продолжительность между пересадками составляет 7-3 месяцев: добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда и культивирование при температуре 25-27°С. добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда и культивирование при пониженной положительной температуре и освещенности; продолжительность между пересадками составляет 12 месяцев: культивирование в климатической камере при температуре 4°С на питательной среде Мурасиге и скуга, модифицированной для хранения.

РЕКОМЕНДАЦИИ

Научным учреждениям рекомендуется:

ь 1. Технология клонального микроразмножения и оздоровления

посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа, которая включает:

а) организацию работы по клональному микроразмножению и оздоровлению винограда:

- создание технологической линии для асептического получения исходных эксплантов и дальнейшего их культивирования;

- характеристику необходимой химической посуды, оборудования, материалов и инвентаря;

- нормативно-технические данные, применяете для приготовления питательных сред;

- состав и приготовление питательной среды;

б) технологический процесс клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала; -

в) закладку временных маточников интенсивного типа, уход за ними. необходимую основную документацию.

2. Способ регенерации растений из меристематических эксплан-тов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малцх размеров (0,075-0,1 мм) с целью оздоровления их от вирусов. Предлагается схема регенерации растений из этих эксплантов.

3. для борьбы с хронической инфекцией, появляющейся при продолжительном культивировании, предлагается способ, позволяющий сохранить в культуре ценные формы и сорта винограда. Он заключается в обработке пробирочных растений перед очередной пересадкой их 10,0% раствором гипохлорита кальция в течение 5 мин., допустима также обработка 5,055 гипохлоритом кальция в течение Ю мин.

4. Рекомендуется применение.ЭМИ низкой интенсивности миллиметрового диапазона для повышения регенерационной способности меристем и оптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования побегов, Комбинированная обработка меристем лучами СБЧ и узкополосным лазером в течение 75 мин. способствует уведи -чени» регенерационной способности меристем более чем в 5 раз. СВЧ-лучи оказывают положительное влияние на увеличение скорости роста пробирочных растений, длины и массы побегов, числа микрочеренков, сокращение периода культивирования и, в конечном итоге, на повышение эффективности клонального микроразмножения.

5. Для повышения эффективности клонального микроразмножения рекомендуется добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда в концентрации 0,25% Добавление повышенного количества семян (1,0% или 205Е-ная вытяжка) термозит ростовые процессы пробирочных растений, увеличивает в 4-5 раз промежутки времени между пересадками растений и рекомендуется для длительного хранения винограда In vitro.

6. Метод селекции бечеемянннх порто« кинограда с игппль^пна-нием обоих бессемянных родителей, последующи изолированием гибридных семяпочек и культивированием их In vitro. Учитывая высокий

уровень эмбриогенеза и комбинационную способность выбранных пар бессемянных сортов, рекомендуются в качестве материнских форм Кишмиш ЦГЛ, 1-15-7-1, 1-15-5-7. а в качестве отцовских Кишмиш уникальный, Русбол и Коринка русская. Рекомендуются сроки изолирования семяпочек от 50 до 100 дней после оплодотворения с уточнением их для каждого конкретного сорта.

Рекомендации производству

Технология закладки сортовых маточников интенсивного типа оздоровленными саженцами винограда клонального микроразмножения. которая включает:

- создание комплекса из нескольких пленочных или стационарных теплиц и участка земли, прилегающего к ним:

- выбор участка под теплицы и подготовку его к закладке маточника;

- выбор способа закладки маточника: -

а) высадка растений в пленочную теплицу на постоянное место по схеме посадки 1.5-2 х 0,4 м;

б) высадка растений в пленочную теплицу по схеме 40x30 см с последующей выкопкой полученных саженцев, хранением их и высадкой в открытый грунт на постоянное место;

в) закладка маточников в стационарной теплице в два этапа: в первый год растения in vitro высаживают по уплотненной схеме (30x15 см) в теплице или в открытом грунте, а затем пересаживают в теплицу по схеме 90x90 см и при обрезке на 1-2-глазковые рожки оставляют три побега:

г) высадка растений в открытый грунт с предварительной за- • калкой их:

- оптимальные и допустимые сроки посадки растений:

- уход за маточными насаждениями: полив, проветривание, многократные подвязки побегов, удаление пасынков, чеканка побегов, защита растений в теплицах от мшшьв? и оидиума, подготовка растений к зимнему периоду.

- 56 -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Берникова Н.В., Дорошенко H.H. Использование зародышей и семяпочек, в селекции бессемянных сортов винограда /Сб. Совершенствование приемов возделывания винограда. - Новочеркасск. 1990. -С. 157-169.

2. Берникова Н. В., Дорошенко Н. П. Культура семяпочек "ии витро" в селекции бессемянных сортов 'винограда /Сб. проблемы оценки исходного материала и подбор родительских пар в селекции плодовых растений. - Мичуринск, 1996. - с. 128-130.

3. Берникова Н.В.. Дорошенко Н.П. Селекция бессемянных сортов винограда с использованием изолированных семяпочек la vitro /Материалы международного научного симпозиума. посвященного 90-летию со дня рождения Л. В. Колесника. Научно-технический прогресс в виноградарстве. - Кишинев. - 1998. - С. 16-17,

4. Дорошенко II.П. Биотехнологические методы в селекции винограда /Сб. Использование биотехнологических методов для "решения генетяко-селекциснных проблем. - Мичуринск. - 1998. - С. 42-46.

5. Дорошенко Н.П. Биотехнология в виноградарстве //Виноград и вино России. - 1992. -НЗ. - С. 40-42,

6. Дорошенко Н.П. Диагностика вирусных болезней винограда с помощью метода травянистых индикаторов //Виноград и вино России. - 1997. - N 3. - С. 2-4.

7. Дорошенко Н.П. Защита винограда от хронической инфекции яря его продолжительном культивировании "ин Еитро" //Виноград и вино России. - 1996. -II 7. - С. 6-8.

■8. Дороеенко Н.П. Испытание питательных сред при клональном мжреразмноженгвг винограда' //Виноградарство и виноделие СССР. -1990. - И 3. - С. 61-65.

9. Дорошенко Н.П. Клональное микроразмножение и оздоровление б:ш ограда: Тез докладов республиканской научно-практической конференция "Состояние и перспективы развития виноградарства". - Ки- < ШННев. - 1930. С. 26-27.

10. Дорошенко Н.П. Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания из него сортовых ма- ( точников интенсивного типа /Рекомендации. - М.. 1991. - 24 с.

П. Дорошенко Н.П. Метод апикальных меристем в борьбе против вирусной инфекции винограда //Виноград и вино России. - 1999. - М 2. - С. 6-9,

V?.. Дорошенко Н.П. Микроклональное размножение перспективных сортов Агат донской и Алан 1 /Виноградарство РСФСР в условиях переориентации отрасли. - Новочеркасск. - 1988. - С. 54-59.

13. Дорошенко Н.П. Микроклональное размножение перспективных сортов винограда: Тез. докладов Всесоюзной научно-технической конференция "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине". - я., 1988. - С. 163-164.

14. Дорошенко н.п. Новый способ ускоренного размножения ви-. нограда /Икформ. листок N 995-95.

15. Дорошенко Н.П. Оптимизация клонального микроразмножения винограда: Тез. докладов VII международной конференции по культуре клеток растений и биотехнологии. - М., 1997. - С. 417-418.

16. Дорошенко Н.П. Оздоровленные саженцы винограда /Буклет. -Новочеркасск. - 1983. - 4 с.

17. Дорошенко Н.П. Оптимизация условий клонального микроразмножения винограда //Сельскохозяйственная биология. - 1996, - N 5. - С, 76-81.

18. Дорошенко Н.П. Оптимизация физических условий культивирования винограда "ин витро" //Виноград и вино России. - 1994. - N 6. - С. 14-16.

19. Дорошенко Н.П. Перспективный метод вегетативного размножения винограда //Садоводство и виноградарство. - 1990. - К 3. -С. 19-21.

20. Дорошенко Н.П. Применение биоантиоксидантов при культивировании винограда 1п уКго: Тез. докладов V международной конференции "Биоантиоксидзнт". - М., 1998. - С. 282-283,

21. Дорошенко Н.П. Повышение регенерационной способности меристем при получении безвирусного посадочного материала винограда //Виноград и вино России, - 1997, - к 2. - С. 6-9.

22. Дорошенко Н.П. Производство оздоровленного посадочного материала винограда с использованием техники изолированных тканей и органов: Тез. докладов региональной научно-практической конференции "Биотехнология и производство экологически чистой продукции сельского хозяйства". Донской государственный аграрный университет. - Персиановка, 1994. - С. 73-74.

23. Дорошенко М.П. Сажеиш винограда клонального микроразмножения /Буклет. - 1988. - 4 с.

24. Дорошенко Н.П. Субстраты для оздоровленных растений винограда //Виноград и вино России. - 1994. - Н 5. - С. 14-16.

25. Дорошенко Н.П. Физиология и биохимия в селекции и повышении продуктивности виноградарства будущего; Тез. докладов на Всесоюзном координационном совещании по виноградарству. - Новочеркасск, 1984. - С. 20-22.

26. Дорошенко Н.П. Что может предложить в этом плане лабора-

тория биотехнологии? //Виноград и вино России. - 1999. - Н 1. -С. 11.

27. Дорошенко Н.П.. Берникова Н.В. Агробиологическая оценка сеянцев винограда бёссемянного направления, полученных нетрадиционным способом: Тез. докладов VII международной конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье". - Симферополь. 1998. - С. 282-283.

28. Дорошенко Н.П.. Берникова Н.В. Культура зародышей и семяпочек В' селекции ■ бессемянных сортов винограда /сб. Актуальные проблемы возделывания и переработки винограда. - Ялта, 1990. - С. 25-27.

29. Дорошенко Н.П,, Берникова Н.В., Соколова Г.в., Хохлова М. А. Применение биотехнологических методов для создания и размножения селекционного материала винограда: Тез. научно-методического совещания "Методы комплексной оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений. - Немчиновка, 1994. - С. 13.

30.Дорошенко Н. П.. Кострикин И.А. Клональное микроразмножение столового винограда сорта Агат донской //Садоводство и виноградарство. - 1989. - N 3. - С. 37-40.

31. Дорошенко Н.П.. Кострикин H.A. Селекция бессемянных сортов винограда с использованием культуры семяпочек "ин витро" //Виноград и вино России. - 1992. - N 1. - С. 14-18.

32. Дорошенко Н.П., Кострикин-И.А. Способ размножения винограда in vitro //Патент И 1601117. - 1990.

33. Дорошенко H.H.. Кострикин H.A.. Ячменева В.П. Способ адаптации растений к нестерильным условиям //Патент SU 1792269. -1990. ..... ...

34. Дорошенко Н. П., Лузгин Г.В., Карлов А.ф. Воздействие электромагнитного излучения на пробирочные растения при микрокло-нальном размножении винограда //Виноград и $ино России. - 1997. -N5. - С. 2-4.

35. Дорошенко Н,П.. лузгин Г.В., Карлов А.Ф. Действие электромагнитного излучения низкой интенсивности в культуре тканей и органов винограда ; Тез. 2 международного симпозиума "Механизм действия сверхмалых доз". - М.. 1995,. - С. 129.

36. Дорошенко-Н.П.. Лузгин Г.В., Карлов А.Ф. Метод повышения регенерационной способности меристем //Патент М 2120739. - 1999.

37. Дорошенко Н.П.. Лузгин Г.В.. Карлов А.Ф. Способ размножения винограда in vitro //Патент Ы 2077192. - 1995.

38. Дорошенко Н.П., Музыченко Б.А. Способ микроклонального размножения винограда in vitro //Патент Н 2041609. - 1995.

39. Дорошенко Н.П.. Музыченко Б.А. Применение растительной добавки для оптимизации клонального микроразмножения и длительного хранения винограда "ин витро": Тез. докладов IV международной конференции "Регуляторы роста и развития растений". - М.. 1997. -С. 290.

40. Дорошенко Н.П., Музыченко Б.А. Способ длительного сохранения In vitro растений винограда //Патент N 2110172. - 1998.

41.Дорошенко н.п.. Семенова Л. Н. Усовершенствование клонального микроразмножения винограда. Материалы международного научного симпозиума, посвященного 90-летию со дня рождения Л.В, Колесника "Научно-технический прогресс в виноградарстве". - Кишинев, 1998. - С. 70-71.

42. Дорошенко Н.П., Соколова Г.В. Длительное сохранение In vitro растений винограда. Материалы международного научного симпозиума. посвященного 90-летию со дня рождения Л.В. колесника "Научно-технический прогресс в виноградарстве". - Кишинев, 1998. - С. 33-34.

43. Дорошенко Н.П., Соколова Г.В. Способы создания коллекции генофонда винограда: тез. докладов vil международной конференции по культуре клеток растений и биотехнологии, - М.. 1997. - С. 521-522.

44. Дорошенко H.H.. Пойманов в.Е. Создание сортовых маточников интенсивного типа в Ростовской области //Садоводство и виноградарство. - 1991. - if 5. - С. 14-16.

45. Дорошенко H.H.. Полещук А.Ф. Создание маточника перспективных сортов винограда в совхозе "Россия" //Виноград и вино.России. - 1992. - N 3. - С. 21-22.

46. Дорошенко Н.П., Хохлова М. А. Способ создания коллекции генофонда "ин витро" //Виноград и вино России". - 1993. - N 6. -С. 18-21.

47. Дорошенко Н.П., Хохлова М.А., Высоцкая О.Н.. Попов A.C.. Баскакова О.ю. Храпение коллекция винограда "ин витро" при пониженной температуре //Виноград и bicho России. - 1994. - N 3. - с.

. со/Ч""........

с, О /

7<-.......7Л-<?\"\->>"

^ Г'-:;л-;., --Л" У/. ./

Подписано а печать ■ вЗ-%. Объем п.л.

Печать оперативнад. Тираж Заказ ^У^У

Южно-г оис и н (.- кий государственны;: те>;::ичгский уни&ереикгг "Ги по ¡рафия ЮРГТУ Адрес ун-та н типографии: 346428, Новочеркасск ул. Просвещения, 132

Содержание диссертации, доктора сельскохозяйственных наук, Дорошенко, Наталья Петровна

BBFJTFHHF

1.1. Клональное микроразмножение: достоинства, этапы, необходимые условия. IS

1.2. Оздоровление растений от вирусов через культуру меристемы.

1.3. Культура изолированных зародышей в селекции

1.4. Длительное хранение и создание коллекций in vitro

1.5. Резюме анализа литературных данных

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ РАСТЕНИЙ

3.1. Стерилизация исходных эксплантов и предотвращение ингибирования у них ростовых процессов.

3.2. Меры борьбы с хронической инфекцией, вызываемой медленно растущими патогенами при продолжительном культивировании.

3.3. Выбор питательных сред..

3.3.1. Испытание питательных сред на этапе ввода в культуру тканей эксплантов малых и предельно малых размеров..

3.3.2. Испытание питательных сред на этапе микрочеренкования побегов.

3.4. Оптимизация клонального микроразмножения

3.4.1. Оптимизация питательной среды добавлением

6-БАП на различном уровне углеродного питания

3.4.2. Оптимизация питательной среды добавлением в ее состав стимуляторов роста естественного происхождения .1иЗ

3.4.3. Оптимизация физических условий культивирования винограда in vitro.<.

- з

3=5= Воздействие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона нивкой интенсивности в культуре тканей винограда in vitro.

3.6. Адаптация растений к нестерильным условиям.

3.7. Создание сортовых маточников интенсивного типа из саженцев, оздоровленных и размноженных in vitro.

4. СОЗДАНИЕ БЕССЕМЯННЫХ СОРТОВ ВИНОГРАДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ СЕМЯПОЧЕК Ш VITRO

4.1. Эмбриогенез при самоопылении бессемянных сортов винограда.

4.2. Подбор пар и комбинаций скрещивания.

4.3. Выявление оптимальных сроков изолирования семяпочек

4.4. Подбор питательной среды.

4.5. Морфологическая характеристика сеянцев, полученных из семяпочек в культуре тканей

4.6. Агробиологическая оценка сеянцев.

5. ТЕХНОЛОГИЯ СОХРАНЕНИЯ IN VITRO ГЕНОФОНДА ВИНОГРАДА.

5.1. Депонирование при положительной пониженной температуре.

5.2. Депонирование при температуре +4°С в условиях климатической камеры ИФР им, К.А, Тимирязева.

5.3. Разработка депонирования винограда in vitro с применением ингибитора роста,.

5.4. Разработка метода хранения винограда in vitro с применением осмотических ингибиторов,.,,.,,,.,

5.5. Разработка депонирования растений с применением естественных ингибиторов роста.

5.6. Депонирование при пониженной температуре и освещенности с добавлением естественных ингибиторов.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда"

В настоящее время в биологической науке и в сельскохозяйственной практике; в том числе и в виноградарстве, на передний край выходит проблема адаптации; так как о ней связаны возможности реализации генотипа в онтогенезе, ареалы культур и, что особенно важно, получение максимаяь ного хозяйственного эффекта.

Усилению адаптации виноградарства в условиях интенсификации должно способствовать применение современных методов биотехнологии.

Появившийся относительно недавно, но уже прочно вошедший в жизнь термин "биотехнология" (биологическая технология) включает в себя два, казалось бы, несовместимых понятия - промышленность и биологию.

Наиболее всеобъемлюще функцию биотехнологии меняно охарактеризовать как целенаправленное превращение материи (и энергии) с помощью организмов иди продуктов их жизнедеятельности.

Термин "биотехнология" впервые использовал венгр Карл Эреки в 1919 г. для обозначения работ, в которых продукты получают о помощью живых организмов. В биологическом энциклопедическом словаре, изданном в 1986 г., биотехнологией называют использование живых организмов и биологических процессов в производстве. Европейская Федерация биотехнологии (ЕПЗ) определяет современную биотехнологию как использование наук о природе (биологии, химии, физики) и инженерных наук (например, электроники) применительно к биосистемам в биоиндустрии, а Европейская комиссия (ЕС) дополняет - для того, чтобы снабдить биологическое сообщество требуемыми продуктами и услугами. Будучи древней сферой производства, биотехнология представляет собой ультрасовременный этап научно-технического прогресса.

Биотехнология решает не только конкретные задачи науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача - она расширяет и ускоряет с помощью достижений научно-технического прогресса масштабы воздействия человека на живую природу и способствует приспособлению живых систем к условиям существования человека, выступая в роли нового мощного фактора, антропогенной адаптивной эволюции.

В прошлом влияние человека- на живые организмы было ограничено главным образом искусственным отбором. В настоящее время искусственный отбор входит в формирующуюся биотехнологию как одна из ее исторических предпосылок. Этот глобальный (общебиологический) и конкретный (научно-производственный) аспекты взаимоотношений биотехнологий с живой природой тесно смыкаются и стимулируют друг друга. Они представляют собой единую систему, которая на верхнем уровне смыкается с эволюцией, а на нижнем все больше "сращивает" живую природу с социальной и производственной сферами жизни человека,

Сегодня биотехнология включает практически все ветви биологии: классические - зоологию и ботанику как фундамент животноводства и растениеводства и экспериментальные - вирусологию, микробиологию, генетику, физиологию, биохимию и биофизику. Поскольку биотехнология имеет дело с организмами и продуктами их жизнедеятельности, она использует все уровни организации живого - молекулярный, клеточный, организменный и популяционный, Поэтому объектами ее изучения и применения служат отдельные молекулы, в особенности белки и нуклеиновые кислоты, культуры клеток и тканей, целостные одно- и многоклеточные организмы или их отдельные части (органы), сложные сообщества организмов разного уровня организации.

Особый успех выпал на долю клеточной биологии. Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов., тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений., могут облегчить и ускорить традиционный селекционный процесс,

Р.Г, Вутенко (1964)., Г.С. Муромцев, Р.Г. Вутенко и др. (1990) отмечают следующие клеточные технологии; оплодотворение in vitro, культура незрелых гибридных семяпочек и зародышей, регенерация растений ив тканей летальных гибридов;, экспериментальная гаплои-дия;, клональное микроразмножение новых сортов, гибридов, линий, криосохранение генофонда, Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании тестированного на отсутствие вирусов и других патогенов посадочного материала вегетативно размножаемых растений, Последнее особенно важно в виноградарстве,

В последние десятилетия опубликовано большое количество научных сообщений по культуре органов, тканей и клеток винограда in vitro. Обеор этих публикаций сделан А,И, Дитваком и А,Л, Кузьмен-ко (1982), Это позволило им отметить, что несмотря на то, что виноград является многолетним древесным растением, что, как известно, затрудняет и значительно усложняет работы in vitro, исследователям удалось преодолеть множество трудностей и четко .показать широкие потенциальные возможности метода,

На основании изучения имеющихся данных, их критического рассмотрения, учитывая быстрое возрастание количества работ по рассматриваемой проблеме, а также опыт, накопленный нашей лабораторией, можно с уверенностью заключить, что методы куль-туры органов, тканей и клеток in vitro должны занять прочное место в арсенале средств, определяющих значительный прогресс в селекции виноград,а и в деле производства посадочного материала этой древнейшей и широко распространенной сельскохозяйственной культуры.

Актуальность проблемы. Методы in vitro могут вносить ценный вклад на каждом этапе селекционного процесса. Использование кло-нального микроразмножения позволяет сократить сроки размножения новых сортов по сравнению с традиционными методами в 4-5 раз. Преимущества микроразмножения in vitro заключаются в необходимости малого количества исходного материала, минимальной лабораторной площади для культур,v в высоком коэффициенте размножения,

Клональное микроразмножение также является составной частью интегрированной защиты виноградных насаждений, тар: как., благодаря высокому коэффициенту размножения., является наиболее вероятным способом массового размножения перспективных устойчивых сортов винограда, Кроме этого, небольшой размер эксшганта, применяемого для клонального микроразмножения, поверхностная стерилизация его, асептический перенос на питательную среду и субкультивирование в условиях, исключающих инфицирование, приводит к оздоровлен!® полученных растений от филлоксеры, нематод, грибных и бактериальных патогенов,

Наиболее надежным методом оздоровления посадочного материала винограда является использование культуры меристемы in vitro и последующее клональное микроразмножение оздоровленных растений.

Оздоровленный посадочный материал является базисным для создания маточных насаждений и перевода виноградарства на элитную основу, что обеспечит продление эксплуатации виноградников и повышение их продуктивности на 30-40%.

Ееосемянность является ценным хозяйственным признаком для сортов винограда всех направлений использования - потребления в свежем виде, приготовления сушеной продукции. Кроме того., это прекрасное сырье для винодельческой промышленности. Однако, группа бессемянных сортов пока, еще малочисленна. Практически отсутствуют бессемянные сорта в существующем сортименте винограда России.

Перспективным направлением создания бессемянных сортов является использование культуры изолированных семяпочек (зародышей в семяпочке) in vitro. Этот метод основан на получении жизнеспособного потомства от скрещивания бессемянных сортов между собой с последующим культивированием зародышей семени в условиях in vitro. Это открывает принципиально новые перспективы; позволяет сократить продолжительность селекции и увеличить бессемянность.

Важным вкладом в практику сельского хозяйства для вегетативно размножаемых культур стала технология сохранения в культуре in vitro генофонда, используемого в селекции, в виде растущих коллекций - периодически субкяонируемых пробирочных растений, оздоровленных методом культуры меристем. Цель коллекций - обеспечить селекционера в любое время генотипом, несущим искомые признаки, нужные для его работы.

Достоинство сохранения генотипов в виде коллекций in vitro заключается в возможности разместить на 1 иА площади в камере для культивирования более тысячи пробирок с растениями.

Насущной необходимостью является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения.

Таким образом, в виноградарстве существует потребность в надежных методах хранения генофонда in vitro, также желательно участие в постоянном международном обмене материалом.

Цель и зядячи исследований. Цель исследований - разработать:

- технологический процесс клепального микроразмножения и оздоровления посадочного материала ценных аборигенных, интродуциро-ванных и новых высокопродуктивных, устойчивых к болезням, вредителям и неблагоприятным внешним условиям сортов винограда, обеспечивающий ускоренное размножение их с сохранением генетических особенностей, биологических и агрономических свойств;

- метод селекции винограда на бессемянность скрещиванием бессемянных сортов между собой и последующим культивированием изолированных семяпочек in vitro;

- методы сохранения in vitro коллекции сортов винограда для консервации генетических ресурсов, регионального и международного обмена коллекционным материалом.

Задачи исследований:

- усовершенствовать стерилизацию исходных эксплантов и мероприятия, исключающие ингкбирование ростовых процессов;

- разработать меры борьбы с хронической инфекций, вызываемой медленно растущими патогенами, проявляющимися при продолжительном культивировании пробирочных растений;

- подобрать питательную среду с тем, чтобы обеспечить оптимальные условия ввода в культуру тканей эксплантов малых (0,17-0,S5 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм), обеспечивающих оздоровление растений, а также оптимальные условия на этапе микрочеренкования;

- разработать способы оптимизации клонального микроразмноже

- усовершенствовать адаптацию пробирочных растений к нестерильным условиям;

- разработать способы создания сортовых маточников интенсивного типа из саженцев, оздоровленных и размноженных in vitro;

- осуществить подбор родительских сортов и комбинаций скрещивания при селекции на беосемянкость;

- определить сроки изолирования семяпочек и пересадки их на питательные среды;

-подобрать питательные среды, способствующие образованию жизнеспособных эмбрионов;

- разработать методы "минимализации" роста пробирочных растений для продолжительного хранения винограда in vitro.

Положения, выносимые на защиту.

1, Теоретическое обоснование новых биотехнологических приемов технологического процесса клонального микроразмножения и оздоровления растений:

- способ регенерации растений из зксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров, повышение регенерационной способности меристем;

- комплекс питательных сред на всех этапах развития от формирования меристематических зон, регенерации из них растений, укоренения регенерантов до высадки в грунт;

- способы оптимизации клонального микроразмножения;

- способ адаптации растений к нестерильным условиям,

2, Научно-методические разработки по селекции бессемянных сортов винограда:

- использование бессемянных родителей о последующей культу

- 11 рой изолированных семяпочек in vitro;

- приемы повышения эмбриогенеза при самоопылении и скрещивании бессемянных сортов,

3. Метод создания коллекции генофонда путем минимализации роста растений,

4, Практические рекомендации:

- по использованию в селекции стеноспермокарпических бессемянных сортов винограда, обеспечивающих при самоопылении и скрещивании высокий уровень эмбриогенеза и получение гибридных сеянцев.

Заключение Диссертация по теме "Виноградарство", Дорошенко, Наталья Петровна

- 244 -ВЫВОДЫ

Проведенные исследования по применению методов биотехнологии в виноградарстве позволяют сделать следующие выводы и предложения:

1, При введении в культуру различных эксплантов: зеленых побегов с вегетирующих кустов винограда;, зеленых побегов, выращенных в лаборатории из вызревшей лозы; зеленых побегов, полученных в лаборатории из оздоровленных и адаптированных к нестерильным условиям растений; меристем установлен положительный результат применения в качестве дезифектанта гипохлорита кальция в концентрации 10% при экспозиции 30 мин. Экспозицию можно уменьшить до 20 мин,, если в качестве эксплантов использовать побеги о оздоровленных растений, Уменьшить ингибирование ростовых процессов и инфицирование при вводе эксплантов в куль-туру можно добавлением в питательную среду активированного угля (0,1%) или бициллина (0,1 мг/л),

2, Ввод в культуру эксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых равмеров (0,075-0,1 мм) необходимо осуществлять на питательной среде Мурасиге и Окуга в два этапа: сначала на твердой питательной среде в течение 3-4 недель, а затем экспланты, увеличившиеся до 2 мм и более, переносить на жидкую питательную среду на мостики из фильтровальной бумаги, пробирки помещать на аппарат роллерного типа для культивирования их во вращающемся состоянии, Оптимальное содержание цитокинина 6-Б.АП для большинство сортов как в твердой, так и в жидкой питательной среде составляет 1,0 мг/л,

3, Совместное воздействие СВЧ-лучей и лазера (тонкий луч) на меристемы, высаженные на твердую среду, способствует ускоренному прохождению им фаз развития, увеличению размерных характеристик, снижает гибель из-за некроза тканей и обеспечивает, в конечном итоге, повышение регенерационной способности меристем в 5,5 pasa,

4, Оптимальной средой на этапе микрочеренкования, обеспечивающей необходимое развитие пробирочных растений, является основная питательная среда Мураоиге и Скуга. Для предотвращения вероятности возникновения генетических изменений возможна замена этой среды на среду Ли и де Фоссарда, в меньшей степени поддерживающую каллуоный рост. Эффективность применения этой среды установлена для культивирования сортов; Алан 1, Агат донской, Ромулуо, Рус-бол, Восторг,

5, Разработаны способы оптимизации клепального микроразмножения на этапе микрочеренкования, Под воздействием СВЧ-лучей у пробирочных растений увеличивается суточная скорость роста в 1,7-2,4 раза, число образовавшихся узлов на побеге - в 1,2-1,5 раза, что позволяет сократить период культивирования до 50-60 дней, Естественные стимуляторы роста из размолотых семян винограда в концентрации 0,25-0,5% способствуют значительному увеличению корневой системы пробирочных растений, лучшему росту побегов, развитию большей листовой поверхности, увеличению общей массы побегов. 6-БАП в количестве 0,05 мг/л обеспечивает оптимальное соотношение между длиной корней и побегов, стимулирует рост побегов, образование более крупных листьев, увеличение марсы растений, повышение жизнеспособности растений. Таким образом, исследованные способы оптимизации улучшают развитие пробирочных растений и обеспечивают закладку большего числа узлов на побеге, чем повышают эффективность клонального микроразмножения при высоком качестве микрочеренков,

6, Способ адаптации пробирочных растений к нестерильным ус

- 246 ловиям заключается в выборе и подготовке субстратов, последовательной обработке растений, извлеченных из пробирок, 1%-ным раствором маргандевокиолого калия и раствором индолилуксусной кислоты (10-15 мг/л), высадке растений в торфоперегнойные горшочки с субстратом, помещение их в индивидуальные пакеты из прозрачного пластикового материала с последующим культивированием на стеллажах ускоренного выращивания растений при температуре 25-27и0, освещенности 8-10 тыс, люксов, световом периоде 16 час. в течение 21-30 дней. Приживаемость растений в процессе адаптации составляет 96,6-97,4%.

7. Отеноопермокарпичеокие бессемянные сорта винограда могут при самоопылении образовывать жизнеспособные зародыши и растения, Однако уровень эмбриогенеза низкий. Эмбриогенез практически отсутствовал у сортов, имеющих массу семяпочек до 10 мг, и при ранних сроках изолирования (40 дней после цветения), что можно объяснить отсутствием в семяпочках полноценных зародышей. При массе семяпочек более 10 мг и более поздних сроках изолирования успех культуры семяпочек при самоопылении обусловлен генотипом бессемянного сорта, Из 14 изученных сортов и форм жизнеспособные зародыши и растения получены лишь у Русбола, гибридов N 311 и 342, Среди них по уровню эмбриогенеза выделяется Русбол, у которого жизнеспособные эмбрионы обнаружены во вое годы наблюдения. Учитывая это и то, что этот сорт является донором бессемянности, считаем перспективным использовать его в селекции бессемянных сортов in vitro,

8= Комбинационную способность выбранных пар бессемянных сортов винограда in vitro характеризуют следующие показатели: естественное прорастание семяпочек, наличие эмбрионов и змбрионопо-добных структур при вскрытий непророоших семяпочек; получение се

- 247 янцев кз проросших семяпочек и эмбрионов, выделенных при вскрытии семяпочек. Непосредственное прорастание семяпочек на питательной средеs более высокий эмбриогенез и образование сеянцев отмечены в тех комбинациях скрещивания, где материнскими формами были Кишмиш ЦТ Л, 1-15-7-1, 1-15-5-7} а отцовскими - Кишмиш уникальный, Русбол и Коринка русская, Большее число семяпочек проросло в комбинации скрещивания Кишмиш ЦГЛ х Русбол - 26,2 и 52,4%. Показатели эмбриогенеза увеличиваются в годы с теплым вегетационным периодом, когда сумма активных температур составляет 3500-3700°С и сопровождается выпадением повышенного количества осадков в мае (126 мм в 1991 г,) ив июне (86 мм в 1995 г.).

9, Более высокий уровень эмбриогенеза отмечен в тех комбинациях скрещивания, где масса абортивных семяпочек была 28-35 г. Однако четкой зависимости между фенотипом и генотипом для эмбриогенеза не установлено, что указывает на важность родительских комбинаций. В пределах отдельных комбинаций скрещивания увеличение массы семяпочек приводит к образованию большего числа жизнеспособных зародышей. Не обнаружено четкой закономерности между уровнем эмбриогенеза и размерными характеристиками семяпочек, уровнем эмбриогенеза и индексом семяпочек. Можно лишь отметить, что при низких показателях индекса (22,6) и при высоких (219,0) образование жизнеспособных эмбрионов было минимальным, а лучшие показатели эмбриогенеза отмечены при индексе семяпочек в пределах 80-95 единиц,

10. Сроки изолирования семяпочек оказывают значительное влияние на образование эмбрионов и развитие на них растений, Прослеживается тенденция увеличения числа эмбрионов и эмбрионоподоб-кых структур при более поздних сроках изолирования семяпочек на 80-100-й день после оплодотворения до 26,5-31,8%, Однако в комби

- 248 нациях скрещивания Кишмиш лучистый х Русбол и 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный эффективными оказались более ранние сроки изолирования - 65 и 50 дней после опыления,Число развившихся растений намного меньше числа образовавшихся эмбрионов, особенно при раннем изолировании семяпочек. При более поздних сроках образование растений увеличивается и максимальной величины достигает при изолировании в 80 дней - 10«1%, а затем снижается до 9,01 при 100 днях изолирования,

И, Установлена высокая степень взаимодействия между комбинацией скрещивания, средой и сроком изолирования семяпочек. Влияние питательной среды на жизнеспособность семяпочек четко прослеживается во всех комбинациях скрещивания. Наибольшее число жизнеспособных зародышей получено на среде Уайта, результативность которой резко снизилась - в 1,5-3,0 раза при добавлении поливи-нилпирролидона, Еще хуже были результаты на питательной среде Ли и де Фоссарда.

12, Сеянцы, полученные от естественного прорастания семяпочек, отличались разнокачественноотью как в пределах отдельных комбинаций скрещивания, так и между ними. Полноценные сеянцы о развитым 'центральным и боковыми корнями, с достаточно развитым побегом получены в комбинациях скрещивания Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская (50 и 65 дней), Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный (80 дней), Кишмиш ЦГЛ х Русбол (65 дней), 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный (50 и 100 дней), В комбинации скрещивания 1-15-7-1 х Кишмиш уникальный из проросших семяпочек получены лишь аномальные сеянцы. Это относится и к сеянцам, полученным при самоопылении Русбола и гибрида N 342, Аномальное развитие сеянцев, в основном, приводит к их гибели, Одним из способов их спасения может быть их микрочеренкование, в результате которого получены пробирочные растения, пригодные для адаптации и для дальнейшего микрочеренкования.

13, Пониженная положительная температура (среднемесячная температура 10,5-12,0°С, 12,6-16,9°С о минимумом 4-8°С и освещенность (500 люксов) способствуют ограничению роста растений в пробирках, более продолжительному культивированию их бее пересадок и является одним из путей создания коллекции генофонда in vitro. Предложены новые условия хранения коллекционного генофонда, винограда in vitro без пересадок в течение 10-12 мес. и более за счет использования специальной среды и температуры 4°0, обеспечивающих значительную экономию трудовых и материальных затрат,

14, Рост пробирочных растений винограда можно замедлить добавлением к питательной среде гормональных или осмотических ингибиторов, повышением концентрации 6-БАП и сахарозы. Ретардант 000 в концентрации 1 мг/л оказывает влияние на замедление роста пробирочных растений и увеличение периода без пересадок до 6 месяцев. Сорбит, добавленный в питательную среду в количестве 30-60 мг/л тормозит рост пробирочных растений и способствует более продолжительному хранению их без пересадок при культивировании как на свету, так и в темноте; как на твердой, так и на жидкой питательной среде, 6-БАП в концентрации 0,1 мг/л при 6,0% содержании сахарозы способствует минимализации роста пробирочных растений, что можно использовать для длительного хранения коллекций винограда,

15, Доказан ингибирующий эффект растительной добавки в питательную среду в виде тонкоразмолотых семян винограда или в виде вытяжки из них. Добавление в питательную среду семян винограда в виде тонкоразмолотого порошка в количестве 1,0% к объему среду уменьшает ростовые процессы в 3,4 раза, а в виде 20%-ной вытяжки -в 2,3 раза, благодаря чему увеличивается продолжительность хранения растений без пересадок.

- 250

16, По степени ингибирования роста растений и увеличению продолжительности хранения изученные способы минимализации роста характеризуются следующим образом: продолжительность между пересадками составляет 4 месяцев - добавление в питательную среду сорбита; продолжительность между пересадками 6 месяцев - культивирование при положительной пониженной температуре и освещенности, добавление в питательную среду хлорхолинхлорида, добавление в питательную среду 6-БАП на утроенном содержании сахарозы; продолжительность между пересадками составляет 7-8 месяцев: добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда и культивирования при температуре 25-27°0, добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда и культивирование при пониженной положительной температуре и освещенности; продолжительность между пересадками составляет 12 месяцев: культивирование в климатической камере при температуре 4°С на питательной среде мураоиге и Скуга, модифицированной для хранения,

РЕКОМЕНДАЦИИ

Научным учреждениям рекомендуется:

1, Технология клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа, которая включает: а) организацию работы по клональному микроразмножению и оздоровлению виног рада:

- создание технологической линии для асептического получения исходных зксплантов и дальнейшего их культивирования;

- характеристику необходимой химической посуды, оборудования , материалов и инвентаря;

- нормативно-технические данные, применяемые для приготовления питательных сред;

- состав и приготовление питательной среды; б) технологический процесс клонального микроравмножения и оздоровления посадочного материала; в) закладку временных маточников суперинтеноивного типа, уход за ними, необходимую основную документацию,

2. Способ регенерации растений из меристематнчеоких эксплан-тов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм) с целью оздоровления их от вирусов. Предлагается схема регенерации растений из этих зкоплантов,

Окема регенерации растений из зксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм) а) ВЫДЕЛЕНИЕ МЕРИСТЕМ I б) ЭТАП ВВОДА ЗКСПЛАНТОВ В КУЛЬТУРУ

Твердая питательная среда Мурасиге и Скуга - 3/4 макроэлементов + Р0д - 170 мг/л, б-ЕАП - 1,0 мг/л, в) Жидкая питатель-ная среда Мурасиге-Скуга - 3/4 макроэлементов + РО4 170 мг/л, 5-ВАЛ - 1,0 мг/л, косые мостики из фильтровальной бумаги, пробирки на вращающемся аппарате роллерного типа, I в) ЭТАП СОБСТВЕННО ММКРОРАЗМНОЖЕНИЯ - образование новых побегов из пазушных почек и меристематичеоких бугорков. Жидкая питательная среда Мурасиге и Скуга по прописи, б-ЕАП в первом пассаже - 1,0 мг/л, со второго пассажа - 2,0 мг/л, I г) ЭТАП УКОРЕНЕНИЯ - на жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга - 1/4 макроэлементов + 10 г/л сахарозы +0,1 мг/л ЙУК, I д) ЭТАП МИКРОЧЕРЕНКОВАНЙЯ - получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных зксплантов для повторения цикла размножения,

3, для борьбы с хронической инфекцией, вызываемой медленно растущими па,тогенами, появляющимися при продолжительном культивировании, предлагается способ, позволяющий сохранить в культуре ценные формы и сорта винограда, Он заключается в обработке пробирочных растений перед очередной пересадкой их 5,0% раствором ги-похлорита кальция в течение 35 мин,, допустима также обработка 10,0% гипохлоритом кальция в течение 5 мин,

4, Рекомендуется применение Шй низкой интенсивности миллиметрового диапазона для повышения регенерационной способности меристем и оптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования побегов. Комбинированная обработка меристем лучами ОВЧ и узкополосным лазером в течение 75 мин. способствует увеличению регенерационной способности меристем более чем в 5 раз, ОВЧ-лучи оказывают положительное влияние на увеличение скорости роста пробирочных растений, длины и массы побегов, числа микрочеренков, сокращение периода культивирования и, в конечном итоге, на повышение эффективности клонального микроразмножения,

5, Добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда в концентрации 0,35-0,5% обеспечивает повышение эффективности клонального микроразмножения более чем на 35%:, а в концентрации 1-2% или 20%-ной вытяжки тормозит ростовые процессы пробирочных растений, увеличивает в 4-5 раз промежутки времени между пересадками растений и рекомендуется для длительного хранения винограда in vitro,

6, Метод селекции бессемянных сортов винограда с использованием обоих бессемянных родителей, последующим извлечением гибридных семяпочек и культивированием их in vitro. Учитывая высокий уровень эмбриогенеза и комбинационную способность выбранных пар бессемянных сортов, рекомендуются в качестве материнских форм Кишмиш ЦГЛ, 1-15-7-1, 1-15-5-7, а в качестве отцовских Кишмиш уникальный, Русбол и Коринка русская. Рекомендуются сроки изолирования семяпочек от 50 до 100 дней после оплодотворения с уточнением их для каждого конкретного сорта.

ПРОИЗВОДСТВУ РЕКОШЩУЕТСЯ

1, Технология закладки сортовых маточников интенсивного типа оздоровленными саженцами винограда клонального микроразмножения, которая включает;

- создание комплекса из нескольких пленочных или стационарных теплиц и участка земли, прилегающего к ним;

- выбор участка под теплицы и подготовку его к закладке маточника;

- выбор способа закладки маточника; а) высадка растений в пленочную теплицу на постоянное место по схеме посадки 1,5-2 х 0,4 м; б) высадка растений в пленочную теплицу по схеме 40x30 ом с последующей выкопкой полученных саженцев, хранением их и высадкой в открытый грунт на постоянное место; в) закладка маточников в стационарной теплице в два этапа; в первый год растения in vitro высаживают по уплотненной схеме (30x10 ом) в теплице или в открытом грунте, а затем пересаживают в теплицу по схеме 90x90 см и формируют три побега; г) высадка растений в открытый грунт с предварительной закалкой их;

- определение оптимальных и допустимых сроков посадки растений;

- уход за маточными насаждениями; полив, проветривание, многократные подвязки побегов, удаление пасынков, чеканка побегов, защиту растений в теплицах от милдью и оидиума, подготовку растений к зимнему периоду.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Дорошенко, Наталья Петровна, Новочеркасск

1. Берникова Н.В., Дорошенко Н.П. Использование зародышей исемяпочек в селекции бессемянных сортов винограда /Сб. Совершенствование приемов возделывания винограда. Новочеркасск, 1990, -С, 157-169«

2. Девятков Н.Д., Голант М.Б., Бецкий О.В. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности. М,, 1991.

3. Дорошенко Н.П. Перспективный метод вегетативного размножения винограда //Садоводство и виноградарство. 1990, - N 3. -С. 19-21.

4. Дорошенко Н.П. Применение биоантиокоидантов при культивировании винограда in vitro: Тез. докладов V международной конференции "Биоантиоксидант". М., 1998. - С, 282-283,

5. Дорошенко Н.П., Полешук А.Ф. Создание маточника перспективных сортов винограда в совхозе "Россия" //Виноград и вино России, 1993, - N 3. - С, 31-23,

6. Дорошенко Н.П., Хохлова М.А. Способ создания коллекции генофонда "ин витро" //Виноград и вино России", 1993, - N 6, -С, 18-21.

7. Дорошенко Н.П., Хохлова М.А., Высоцкая О.Н., Попов A.C., Баскакова О.Ю. Хранение коллекции винограда "ин витро" при пониженной температуре //Виноград и вино России, 1994, - N 3, - О, 24-27,

8. Дженеев С.Ю., Литвак А.И., Насимов А.З. Использование стимуляторов роста при адаптации растений, полученных ин витро (Рукопись деп, во ВНИИТЭИагропром (31,10,90 г.).

9. Дубовенко А,П. Инструкция по ускоренному размножению винограда одноглазковыми зелеными черенками с использованием теплиц, Ялта, 1980,

10. Евсеева Р.П., Кравцов П.В, Влияние гиббереллиновой кислоты на прорастание изолированных зародышей яблони и груши в условиях стерильной культуры /Труды ЦГЛ им. И,В,Мичурина, 1977. -Вып, 18, - С, 39-42,

11. Еремин Г.В., Плеханова М.Н., Царенко В.П. В садах и питомниках США, Садоводство и виноградарство, 1991, 11; 42-44,

12. Жакоте А,Г. Обратная связь //Энциклопедия виноградарства, Кишинев, 1986, - С, 306,

13. Жученко A.A. Адаптивный потенциал культурных растений.

14. Кишинев, 1988= С. 238-253.

15. Кравцов П.В. и др. действие регуляторов роста на дифференциацию и органогенез зародышей плодовых растений в стерильной культуре // Применение физиологически активных веществ в садоводстве. 1974« - N 2, - G, 87-94,

16. Кравцов П.В. Опыт применения культуры изолированных зародышей в селекции плодовых растений //Культура изолированных органов, тканей и клеток растений /Тр. 1-й Всесоюзн. конф. М.,1970, С. 41-44.

17. Кравцов П.В., Кравцова Л.В. Рост изолированных зародышей и семян плодовых растений в условиях стерильной культуры при добавлении в среду дрожжевого экстракта /Тр. Центр, генетической лаборатории им. И.В.Мичурина. 1971« - Вып. 12= - С. 241-244,

18. Крылова Н.В., Степаненко В,И, Проникают ли вирусы в апикальную меристему растений /Труды биолого-почвенного института.1971. С. 4.

19. Культура изолированных зародышей и некоторые другие приемы выращивания растений "ин витро". Методические рекомендации. -М., 1974, 60 с.

20. Куроаков Г.А. Применение культуры изолированных зародышей при отдаленной гибридизации сливы //Культура изолированных органов, тканей и клеток растений /Труды 1-й Всесоюзной конф. М., 1970, - и, 47-50,

21. Литвак А.И., Кузьменко А.П. Культура клеток, тканей и органов винограда In vitro //Селекция устойчивых сортов винограда. Кишинев, 1982. - С, 116-139.

22. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Гусев М.В. Изменение ростовых характеристик при воздействии на микроводоросли электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности //Вестник МГУ. 1990, - N 16, - С. 42,

23. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. Изменение Фотосинтетической активности микроводорослей под влиянием электромагнитного излучения //Физиология растений, 1992, - Вып. 39, - N 5, - 0, 1004,

24. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. и др. Некоторые закономерности взаимодействия ЗМН ММ диапазона с микроводорослями //Применение КВЧ излучения низкой интенсивности в биологии и медицине. - М,, 1989, - 84 с,

25. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. и др. Стимулирующее действие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности на рост микроводорослей. Вестник МГУ,-1990. - Вып. 16. - N 1, - 32 с,

26. Трошин Л.П. VI Международный симпозиум по селекции винограда //Виноградарство и виноделие. 1995, - К 1. - С, 5-12,

27. В кн.: Вирусные болезни ягодных культур и винограда. 1975, -М. - С. 264-265,

28. Штеренберг П.М., Милкус Б.Н., Березовский. Вирусные болезни винограда на Украине //Вирусы и вирусные болезни растений,- Киев, 1974, С. 262-265,

29. Adwinckle (H.S.) et Buturao (Т) Culture of grape cultivara from apical meristems., 1980, Prao, 7-Conf I.C. Septembre. 8-12, Niagara Tails (Canada); 339-341,

30. Barlass M. Micropropagation of temperate fruits-application and limitation. Acta Horticulturas, 1989, - 240, - P. 373-379,

31. Barlass M., Ramming D.W., Davis H.P. In ovulo embryo culture: a breeding technigue to rescue seedless x seed1esstable grape. Australian Grapegrowes Winkmaker. Adelaide. - 1988. 292, - P, 123-125,

32. Barlass, M, and Skene, K.G.M.: Clonal propagation through tissue culture. Austral Grapegrower and Winemaker. 1979, 16/191, - P= 12-13=- 274

33. Barlass, M. and Skene, К.G.M., In vitro propagation of grapevine (Yitis vinifera L.) from fragmented shoot apices. Vi-tis. - 1978. - 17. - F. 335-340.

34. Barlass M. et Skene К.G.M. Long Term storage of grape in vitro. Fao/I.B.P.G.R. Plant Genetic Resources News letter. -1983. 53. - P. 19-El.

35. Barlass M., Skene, K.G.M., Lee, Т.Н. Tissue culture and disease control. Proceeding of the 6 the Australian Wine Industry Technical Conference, 14-17, luly, 1986,

36. Bhulhar J.S., Dhillon B.S., Gibberellin like naturty in berries of seeded and seedless grapes. Indian J. Hort.- 1977.31. - P. 36E-371.

37. Bini G. Prove di colture in vitra di meristemi apicali di Vitis vinifera L. Rw. Ortoflorofruttio Ital. 1976. - 60. - P. 285-295,

38. Blaich R. Investigation on meristem and organ cultures in vitro for selection and conservation of genotypes of the grapevine. Bulletin de Li 0.I.V. 1985. - 58, - P. 391-395.

39. Bouquet A., Davis H.P. Culture in vitro d'ovule et de vigne (vitis vinifera) appliquée a la selection de variétés de raisin de table sans pépins //Agronomie. 1989. - 9/6. - P. 565-574,

40. Bower D. lane. Genetic resources worldwide //Trends Bio-technol. 1989. - 7/5, - P. 111-116.

41. Brendel G. Einsatz der in vitro Kultur von Reben zur Produktion von Verstufenplanzqut in der Zuchtung//Wein-Wissenschaft 1986. - 41/4. - P. 264-270,

42. Tomorrow. Ed.O.H. Franfel I.G. Hawkes, p.p. Cambridgi University Press, 1975,

43. Fanizza G., Ricciardi L. The response of a range of genotypes of Vitis vinifera to sequential shoot tip cultures at high temperatures //Euphytioa, 1988, - 39/1. - P. 19-23,

44. Forsline, P.Z. Progress in developing a nations program for mal us and vitis germplasm maintenance and evaluation in the USA //Acta hortic. Hrades Kralove. 1988. - 224, - P. 33-38,

45. Fossard R.A. The horizons of tissue culture propagation. A seminar directed by Dr. Fossard for N.S.W. Association of Nurserymen Ltd., University of Sydnea, 3-4 December, 1977; 1-14,

46. Galzy (Rose) Culture in vitro des apex de Vitis rupest-ris. C.R. Acad, So, Paris, Serle D, 1972, - 274, - P, 210-213,- 277

47. Sil, Galzy R. Les possibilités de conservation in vitro d'une collection de clones de vignes //Bulletin de 1:0.I.V. 1985, -550, - P. 378-890,

48. Kusïïianovio Slobodan, Gavran Mira, Problem viroza u vinog-radarstvu //lugosl, vinogr. i vinor, 1989. - 3-4. - P. 29-31,

49. Latuoo, I.M.; Molnar. I. Preliminary results on the in vitro mass propagation of grapes from shoot-tip meristem //Fruit Science Reports. 1985= - 12. - P. 83-85.

50. Lee N., Wsetzstein H.Y. In vitro propagation of Muscadine grape by axillary shoot proliferation //Journal of the American Society for Horticultural Science, 1990= - 115. - P, 324-329=

51. Lehoesky I., Luntz 0,, Lazarl,, Kolber M., Mikulas I., Farkas Q. Production of virus-free grape propagation maternal in Hungary, Univ, Gent, - 1992, - 57/2A, - P. 333-339,

52. Lewandowski, V.T. Rooting and acclimatization of micropropagated Vitis labrusca Delaware //Hortsoienoe. 1991. - 26.- P, 586-589,

53. Li. J.-R.; Eaton, G.W. Growth and rooting of grape shoot apices in vitro //Horticultural Science, 1984= - 19, - P. 64-65=

54. Martin C. et al. Vignes et techniques de cultures "in vitro". Quelques résultats d'une collaboration entre recherche publiques et entrefris privel //Bulletin de L'O.I.V. 1987=- 675-676, P, 447-458=

55. Martinez M,0,, î.L. Mantilla. Morphological and Yield

56. Spiegel-Roy p., Sahar N. and I. Baron. Seedless x seedless grape prageny; Technigue results and perspectives. Proceedings of the 5 th International Symposium on Grape Breeding, 1989. P. 432-438.

Информация о работе

Дорошенко, Наталья Петровна
доктора сельскохозяйственных наук
Новочеркасск, 1999
ВАК 06.01.08

Диссертация

Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы