Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оптимизация этапов клонального микроразмножения гибридов вишни на основе применения новых биологически активных веществ

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация этапов клонального микроразмножения гибридов вишни на основе применения новых биологически активных веществ"

На правах рукописи

003474009

МАЙОРОВА ЮЛИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ ЭТАПОВ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ГИБРИДОВ ВИШНИ НА ОСНОВЕ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальность 06.01.07 - плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 ШЭ!5 7.399

Краснодар - 2009

Работа выполнена в Северо-Кавказском зональном научно-исследовательском институте садоводства и виноградарства Россельхозакадемии

Научный руководитель:

кандидат сельскохозяйственных наук Подорожный Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук Дорошенко Наталья Петровна

кандидат биологических наук Звягин Андрей Сергеевич

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский НИИ цветоводства и

субтропических культур» РАСХН (г. Сочи)

Зашита диссертации состоится 2 июля 2009 г. в час. на заседании

диссертационного совета Д 220.038.04 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, главный корпус, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета (350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13).

Автореферат разослан «¿Л 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета профессор

Матузок Н. В.

производству, списка использованной литературы из 154 наименований, в том числе 9 на иностранных языках, содержит 30 таблицу, 31 рисунков.

2. ОБЪЕКТЫ, УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнены в лаборатории биотехнологии СКЗНИИСиВ в 2004 -2007 гг. в соответствии с планом научных исследований ГНУ РАСХН СКЗНИИСиВ (номер регистрации 01200309461).

Объектами исследований являлись следующие подвои вишни и черешни: BCJI-2 и ВЦ-13, а также межвидовые гибриды p. Cerasus Mill, селекции института (Вишня №70,71, 73, 74,92) (таблица 1).

Таблица 1 - Характеристика межвидовых гибридов в 1-м поле питомника, 2004 г.

№ Происхождение Высота гибридов, см Поражение коккомикозом в течение вегетации, балл

7.07.04 4.08.04 20.08.04 15.09.04

70 Молодежная х C.lannesiana №2 88 0,1 0,1 0,5 2,5

71 Молодежная х C.lannesiana №2 55 0 0,1 0,25 1,5

73 Молодежная х C.lannesiana №2 116 0 0,1 1 1

74 Молодежная х C.lannesiana №2 151 0 0,1 1,5 2,5

78 Молодежная хИ5! (C.lannesiana №2 х Франц Иосиф 150 2 2 2 2,5

92 Молодежная х C.lannesiana №2 121 1 1 2 3

Клональное микроразмножение подвоев проводили по методике: Высоцкого В.А. и др. (1986, 1989); Поликарповой Ф.Я. и др. (1986); Трушечкина В.Г. и др. (1986); Попова Ю.Г. (1979); Жукова О.С. и др. (1994); Тюленева В.М. (1996); Коломиец Т.М. и др. (2000); Джигадло E.H. (2005). Обработку статистических результатов исследования проводили с

использованием дисперсионного анализа по методике Доспехова Б.А. (1972), а также с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Statistica 6.0.

Повторность опытов трехкратная (20 пробирок в повторности). Межпассажный период от 20 до 30 дней.

Экспланты культивировали при постоянном освещении в специальной светокомнате с верхним освещением 2-3 тыс люкс (расстояние между колбой лампы и растениями в пробирках не менее 15-20 см), температура +23°С, и относительная влажность в помещении 70%.

Апикальные почки вводили в культуру in vitro в ранне-весенний срок (март) - фазу выхода из покоя.

Поверхностную стерилизацию апексов от сапрофитной микрофлоры осуществляли в 0,1% водном растворе сулемы и диацида.

В качестве основной питательной среды на всех этапах кпонального микроразмножения использовали модифицированную среду Мурасиге и Скуга (М.С.) (1962), обогащенную сахарозой (30,0 г/л), агаром (7,0 г/л), глицином (2,0 мг/л), аскорбиновой кислотой (1,0 мг/л) и витаминами: В, (0,5 мг/л), В6 (0,5 мг/л) и РР (1,0 мг/л).

На различных этапах культивирования эксплантов in vitro испытывали регуляторы роста растений ауксиновой и цитокининовой групп. На этапе размножения in vitro: 6-БАП в диапазоне концентраций от 0,1 до 2,0 мг/л; янтарную и биоянтарную кислоты: 0,1, 0,5 и 1,0 мг/л каждой. Контроль -среда М.С. (1962) с 6-БАП (0,5 мг/л). На этапе элонгации: Гиббереловую кислоту (ГК) и Калий-УНИ (К-УНИ) в концентрациях 2,0 и 5,0 мг/л на фоне 0,1 мг/л 6-БАП. На этапе укоренения - индолилмасляную кислоту (ИМК) и индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации от 0,5 до 2,0 мг/л. В качестве минеральной основы питательной среды для укоренения использовали половинный состав солей по М. С. (1962), сахароза-20,0 г/л, агар-агар-8,0 г/л.

Проводилось изучение влияния комплексных антибиотиков: цефотаксима, клафорана, канамицина, тетрациклина, нистатина, амфотерицина В. Контролем служила среда без антибиотиков. Основа -среда М.С. (1962) с 0,5 мг/л 6-БАП.

Адаптацию in vivo осуществляли согласно разработанному нами способу (гл. 3.6)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Выбор стерилизующего вещества

В качестве стерилизующих веществ для апексов от сапрофитной микрофлоры, мы использовали диацид (контроль) и сулему. Придерживаясь в работе мнения, что стерилизующий раствор всегда токсичен для растительных тканей и в той или иной степени угнетает дальнейший рост и развитие эксплантов, мы задались целью точно определить время, необходимое для эффективной стерилизации. В связи с этим концентрация водного раствора стерилизующих веществ в наших опытах была постоянной - ОД %, а экспозиция варьировала от 5 до 10 мин.

Анализируя полученные данные (таблица 2), мы пришли к выводу, что для раствора сулемы оптимальной является экспозиция 8 мин., при которой наблюдался низкий процент инфекции и губительного действия. При этом не отмечена зависимость количества «чистых» эксплантов от вида подвоя. Экспозиция 9 мин., увеличивала процент поверхностно стерильных эксплантов, но в таком случае фитотоксический эффект стерилизующего вещества на растительные ткани был сильно выражен, что приводило к гибели эксплантов.

Таблица 2 - Влияние времени обработки 0,1 % растворами диацида и сулемы на выход стерильных эксплантов, 2004-2006 гг.

Количество эксплантов

Экспо- Обработано растворами

зиция, Высажено, диацида сулемы

мин. шт. Инфицир. Нежизнесп. Инфицир. Нежизнесп.

шт. % шт. % шт. % шт. %

5 75 67 89,3 - - 52 69,3 L - -

7 75 32 42,6 - - 10 13,3 - -

8 75 12 16,0 - - 3 4,0 1 1,3

9 75 7 9,3 - - 2 2,7 9 12,0

10 75 8 | 10,7 5 6,7 4 5,3 16 21,3

В результате экспериментов нами определена как оптимальная 9-минутная экспозиция диацида (таблица 2). Однако его использование позволяло получать не более 91 % чистых эксплантов, пригодных к дальнейшему культивированию, а сулемы 96 %, кроме того неудобством при работе с диацидом являлось то, что раствор не был персистентен и мог храниться очень непродолжительное время и его необходимо было готовить заново, тогда как раствор сулемы сохранял эффективность действия в течение полугода.

Проведенная работа позволила сделать вывод о целесообразности использования раствора сулемы в 0,1 % концентрации, с экспозицией 8 минут в качестве поверхностно - стерилизующего вещества в работе с культурой ткани косточковых плодовых культур.

3.2. Оптимизация концентрации 6-БАП в питательной среде на этапе пролиферации

Микропобеги культивировали на пяти средах на основе прописи М. С. (1962) с различным содержанием 6-БАП: 6-БАП 0,1 мг/л (среда №1), 6-БАП 0,5 мг/л (среда №2), 6-БАП 1,0 мг/л (среда №3), 6-БАП 1,5 мг/л (среда №4) и 6-БАП 2,0 мг/л (среда №5). В качестве контроля использовали среду без БАП.

Объектами исследования являлись микропобеги карликовых гибридов вишни и черешни Вишня №70, 71, 74,92, а также подвои ВСЛ-2 и ВЦ-13.

В процессе культивирования эксплантов подсчитывали количество микропобегов на эксплант, длину побегов и площадь листовой поверхности.

Анализируя результаты опытов, мы отметили, что контрольная среда без 6-БАП относительно влияния на длину побегов и площади листовой поверхности на всех сортах имеет очень низкие показатели. Коэффициент размножения на данной среде у всех сортов также самый низкий и составляет 1,2-1,4 в зависимости от подвоя. Исходя из этого, нами был сделан вывод, что данная среда является наименее благоприятной для развития пробирочных растений из всех анализируемых. Поэтому было решено в математическом анализе ее не использовать.

В результате опыта установлено, что коэффициент размножения зависит от особенностей сорта, от концентрации цитокинина в питательной среде и от номера пассажа, отмечена также сортоспецифичность подвоев на действие 6-БАП (таблица 3).

Таблица 3 - Влияние концентрации 6-БАП в зависимости от пассажа на

коэффициент размножения гибридов и подвоев вишни, 2005-2006 гг.

Сорт Коэффициент размножения в зависимости от пассажа

1 2 L. 3. 4 5

6-БАП 0,1 мг/л

Вишня №70 1,3 1,5 1,7 2,0 2,2

Вишня №71 1,2 1,5 1,5 2,4 2,8

Вишня №74 2,2 1,8 1,8 2,0 2,2

Вишня №92 1,2 1,5 1,2 1,6 1,8

ВСЛ-2 1,1 1,1 1,3 2,2 2,2

ВЦ-13 1,1 1,2 1,7 1,3 1,5

6-БАП 0,5 мг/л

Вишня №70 3,3 6,7 7,4 7,6 8,0

Вишня №71 1,5 2,8 3,6 6,4 8,8

Вишня №74 2,2 3,7 5,3 7,4 9,5

Вишня №92 2,1 2,2 5,2 6,3 7,5

ВСЛ-2 4,7 9,3 12,4 14,1 15,4

ВЦ-13 2,3 4,2 5,1 6,2 8,2

6-БАП 1,0 мг/л

Вишня №70 4,5 3,8 5,2 9,5 9,7

Вишня №71 1,7 3,0 3,7 4,5 9,2

Вишня №74 1,6 2,0 3,5 4,2 5,1

Вишня №92 1,6 2,3 5,3 3,5 12,3

ВСЛ-2 5,2 12,3 15,5 17,2 22,3

ВЦ-13 2,0 2,2 3,2 5,3 6,5

6-БАП 1,5 мг/л

Вишня №70 3,7 4,8 6,0 6,8 7,5

Вишня №71 4,1 5,8 7,3 8,2 9,0

Вишня №74 2,8 3,5 4,9 6,1 6,8

Вишня №92 2,4 3,5 5,1 5,7 6,5

ВСЛ-2 3,5 6,2 9,7 11,3 14,8

ВЦ-13 2,3 4,2 5,1 5,8 7,0

6-БАП 2,0 мг/л

Вишня №70 3,2 5,9 7,1 8,2 10,0

Вишня №71 2,9 4,8 6,4 7,3 9,2

Продолжение таблицы 3

Вишня №74 2,4 3,1 4,7 5,1 6,5

Вишня №92 3,3 6,5 8,7 10,9 7,8

ВСЛ-2 4,1 7,5 10,8 12,7 14,5

ВЦ-13 2,5 2,8 3,2 4,2 6,3

Определение степени влияния средовых и сортовых условий на длину

побега и площадь листовой поверхности по проведении дисперсионного анализа (таблица 4) позволяет сделать вывод, что фактор "сорт" достоверно влияет как на изменчивость длины побега, так и на изменчивость площади листовой поверхности. Причем, доля изменчивости, связанная с действием указанного фактора составляет для длины побега 16,0 %, а для площади листовой поверхности - 1,8%. Влияние среды для площади листовой поверхности составило 10,1%, а для длины побега - 0,7%. Эффект взаимодействия изучаемых факторов наблюдался у обоих признаков, но в разной степени - 11,5% для длины побега и 10,0% для площади листовой поверхности.

Таблица 4 - Результат двухфакторного дисперсионного анализа

изменчивости длины побега и площади листовой поверхности с факторами "сорт"и"среда"

Изменчивость шБ Р о2 Доля в общей изменчивости

Длина побега

Межсортовая 5 116,07 23,21 *67,8 0,0765 16,0%

Межсредовая 4 5,93 1,48 *4,3 0,0032 0,7%

Взаимодействие "сорт*среда" 20 39,73 1,99 *5,8 0,0548 11,5%

Остаточная 1764 604,33 0,34 - 0,3426 71,8%

Площадь листовой поверхности

Межсортовая ' 5 2,99 0,60 *8,1 0,0018 1,8%

Межсредовая | 4 13,77 3,44 *46,5 0,0096 10,1%

Взаимодействие , ^ "сорт*среда" 7,19 0,36 »4,9 0,0095 10,0%

Остаточная 1764 130,75 0,07 - 0,0741 | 78,0%

Примечание: знаком "*" отмечены значения критерия Фишера, превосходящие стандартное для 5 %-ного уровня значимости.

Анализируя зависимость коэффициента размножения от количества пересадок на свежие питательные среды с одним и тем же содержанием цитокининов мы отметили тенденцию к постепенному увеличению коэффициента размножения всех изучаемых форм к пятому пассажу (рисунок 1).

12,0

БАП 0,1 мг/л БАП 0,5 мг/л БАП 1,0 мг/л БАП 1,5 мг/л БАП 2,0 мг/л

ЕЭ1 -й пассаж ш 2-й пассаж в 3-й пассаж □ 4-й пассаж ■ 5-й пассаж

Рисунок 1 - Зависимость коэффициента размножения от концентрации 6-БАП и числа пассажей (в среднем по формам), 2005-2006 гг.

В результате проведенных исследований установлено, что для успешной пролиферации подвоев и гибридов вишни и черешни необходимо учитывать их биологические особенности и для каждой формы следует подбирать определенную концентрацию цитокинина.

Оптимальная концентрация 6-бензиламинопурина в составе среды М.С. (1962) для всех изученных растений лежит в пределах 0,5 - 1,0 мг/л.

12 i 3.3. Использование антибиотиков в культуре in vitro В опытах изучали влияние антибиотиков (цефотаксим, клафоран, канамииин, тетрациклин, нистатин, амфотерицин В) на средовую инфекцию, посадочную инфекцию и на рост растений.

В процессе культивирования пробирочных растений осуществляли контроль за наличием бактериального и вирусного заражения, за развитием растений. В качестве источников эксплантов в опыте использовали <~ терминальные и латеральные почки.

Контролем служила среда без антибиотиков. Основа - среда М.С. (1962) с 0,5 мг/л 6-БАП. Антибиотики растворяли в стерильной воде и добавляли в питательную среду до и после автоклавирования. Антибиотик 1 после автоклавирования добавляли в охлажденную до 45°С питательную среду. Инфекция в среде проявлялась в течение месяца.

Проанализировав все полученные данные по влиянию антибиотиков на посадочную инфекцию и как следствие этого на рост и развитие растений, г мы выделили в качестве оптимальных: канамицин в концентрации 10 мг/л и тетрациклин в концентрации 200 мг/л (рисунок 2). ¡-

0.8 -

Рисунок 2 - Результаты влияния антибиотиков в культуре in vitro на инфицированность среды и эксплантов и на рост микропобегов, 2005-2006 гг.

Проведенная статистическая обработка результатов опыта достоверно показала, что результаты применения канамицина 10 мг/л стабильны и наиболее достоверны и данный антибиотик не оказывает существенного негативного воздействия на микропобеги. Тетрациклин в концентрации 200 мг/л показал слишком широкий разброс значений (рисунок 3).

1.4

е- о.<

о 0,4

-0,2

ю о о о о о о см ю о о

2 s о г S и м га h- 2 S о Ь! 2 S о ьс X § X § S

СО л ш S 5 S

о ■в <н ZT о ■в-(V =Г о £ =Г о в ф zr я X 5 ш а: ё

о О о

о о СЧ1 О см

X X X

& & s й

5 5= я

га га га я

2 £ ь £ н £

? го

в

S

X

е

S

X

Рисунок 3 - Влияние антибиотиков на инфицированность среды и эксплантов и на рост микропобегов в культуре in vitro (вертикальные линии -95% доверительный интервал), 2005-2006 гг.

Математический анализ данных позволил с высокой степенью уверенности утверждать, что перспективным антибиотиком является канамицин в концентрации 10 мг/л, при этом вводить его необходимо в питательную среду непосредственно перед автоклавированием.

3.4. Оценка эффективности применения биологически активных веществ (БАВ) в культуре in vitro

Действие янтарной и биоянтарной кислот испытывали в концентрациях 0,1 (№1); 0,5 (№2) и 1,0 мг/л (№3), без БАВ (К.). Основа среда М.С. (1962) с 6-БАП (0,5 мг/л).

В процессе культивирования эксштантов подсчитывали количество микропобегов на эксплант, облиственность побегов и их длину, площадь листовой поверхности

Янтарная кислота.

В наших опытах мы наблюдали постепенное повышение коэффициента размножения к четвертому пассажу на средах с янтарной кислотой, а затем его снижение. На контрольной среде происходило постепенное повышение коэффициента размножения к пятому пассажу (рисунок 4).

10,0

0,0 -1-

1 2 3 4 5

пассаж

- - - 0.1 мг/л — ~ 0,5 мг/л ■ 1,0 мг/л контроль

Рисунок 4 - Динамика изменения коэффициента размножения побегов на средах с янтарной кислотой в культуре in vitro (в среднем по формам), 2006 г.

В третьем и четвертом пассаже на средах с янтарной кислотой в концентрации 0,5 и 1,0 мг/л коэффициент размножения был выше, чем в контроле, однако к пятому пассажу на контрольной среде коэффициент размножения больше, чем на опытных средах (таблица 5).

Относительно физиологического состояния микропобегов можно отметить, что после четвертого пассажа у Вишни №71 и 74 на среде с янтарной кислотой в концентрации 0,1 мг/л наблюдалось побледнение

побегов и завядание, а в пятом пассаже - витрификация и активный рост каллуса на всех опытных средах.

Таблица 5 - Влияние питательных сред на коэффициент размножения

гибридов и ВСЛ-2,2006 г.

Сорт, гибрид Коэффициент размножения в зависимости от пассажа

1 | 2 | 3 | 4 | 5

6-БАП 0,5 мг/л + янтарная кислота 0,1 мг/л

Вишня №70 3,7 5,9 7,0 7,4 6,8

Вишня №71 3,5 6,5 7,5 7,0 7,0

Вишня №74 4,1 5,6 6,0 6,2 5,3

Вишня №92 3,6 4,9 6,7 7,0 6,6

ВСЛ-2 3,7 6,8 8,9 10,1 9,7

6-БАП 0,5 мг/л + янтарная кислота 0,5 мг/л

Вишня №70 4,3 6,5 7,2 7,2 6,6

Вишня №71 4,6 7,1 8,6 8,3 7,2

Вишня №74 5,2 6,9 8,6 8,5 7,6

Вишня №92 3,8 5,1 6,9 7,2 6,5

ВСЛ-2 4,9 7,4 10,7 12,8 11,3

6-БАП 0,5 мг/л + янтарная кислота 1,0 мг/л

Вишня №70 5,2 6,9 7,8 7,7 7,5

Вишня №71 4,2 6,7 7,6 7,2 7,0

Вишня №74 5,4 7,2 9,3 8,7 8,4

Вишня №92 4,0 5,2 7,3 7,4 7,0

ВСЛ-2 4,2 6,7 9,7 11,6 10,8

6-БАП 0,5 мг/л

Вишня №70 3,3 6,7 7,4 7,6 8,0

Вишня №71 1,5 2,8 3,6 6,4 8,8

Вишня №74 2,2 3,7 5,3 7,4 9,5

Вишня №92 2,1 2,2 5,2 6,3 7,5

ВСЛ-2 4,7 9,3 12,4 14,1 15,4

Проанализировав все полученные данные, мы пришли к выводу, что оптимальной для вытягивания побегов в высоту можно считать среду без БАВ - контроль. Хотя коэффициент размножения на опытных средах с БАВ в третьем и четвертом пассаже больше, но при этом побеги низкие, а к пятому пассированию и количество и качество микропобегов в контроле значительно превышает таковые на опытных средах.

Таким образом, результаты этой части исследований дают основания сделать вывод о нецелесообразности использования янтарной кислоты для ускоренного клонального микроразмножения изученных форм вишни.

Биоянтарная кислота. При анализе результатов данного опыта нами отмечена также прямая зависимость коэффициента размножения от концентрации биоянтарной кислоты в питательной среде и числа субкультивирований (таблица 6).

Таблица 6 - Влияние питательных сред на коэффициент размножения

гибридов и ВСЛ-2, 2006-2007 гг.

Сорт, гибрид Коэффициент размножения в зависимости от пассажа

11 2 3 4 5

6-БАП 0,5 мг/л + биоянтарная кислота 0,1 мг/л

Вишня №70 3,7 7,5 7,9 6,2 5,4

Вишня №71 2,8 5,2 7,5 7,1 6,5

Вишня №74 5,1 6,6 13,6 10,2 9,8

Вишня №92 4,2 5,8 7,5 6,9 5,4

ВСЛ-2 4,7 . 8,5 9,7 9,5 8,6

6-БАП 0,5 мг/л + биоянтарная кислота 0,5 мг/л

Вишня №70 4,3 8,3 9,5 8,4 7,0

Вишня №71 3,2 5,4 8,6 7,2 7,1

Вишня №74 5,0 5,6 16,6 , 13,8 11,2

Вишня №92 4,5 6,9 8,4 7,6 6,6

ВСЛ-2 6,5 12,3 14,8 11,3 10,6

6-БАП 0,5 мг/л + биоянтарная кислота 1,0 мг/л

Вишня №70 4,5 6,5 7,7 7,0 5,9

Вишня №71 3,6 7,0 10,1 8,3 7,5

Вишня №74 4,3 5,0 10,6 8,4 7,9

Вишня №92 5,1 7,8 10,3 9,1 8,5

ВСЛ-2 9,2 15,6 20,4 15,2 13,8

6-БАП 0,5 мг/л

Вишня №70 3,3 6,7 ! 7,4 7,6 8,0

Вишня №71 1,5 2,8 3,6 6,4 8,8

Вишня №74 2,2 3,7 ; 5,3 7,4 9,5

Вишня №92 2,1 | 2,2 ! 5,2 6,3 7,5

ВСЛ-2 4,7 : 9,3 12,4 14,1 15,4

На средах с биоянтарной кислотой постепенное увеличение коэффициента размножения идет до третьей пересадки, а после наблюдается его резкое снижение. На контрольной среде коэффициент размножения растет вплоть до пятого пассажа. Однако все варианты опыта превосходят контроль (рисунок 5).

пассаж

" '0,1 мг/л — — 0,5 мг/л 1,0 мг/л - контроль

Рисунок 5 - Динамика изменения коэффициента размножения побегов на средах с биоянтарной кислотой (в среднем по формам) в культуре in vitro,

2006-2007 гг.

После четвертого пассажа культивировать растения на среде с биоянтарной кислотой нецелесообразно, так как это приводит к побледнению, ослаблению, а в дальнейшем к их виггрификации и гибели. При этом ингибируются ростовые процессы и снижается коэффициент размножения, длительное культивирование на средах с биоянтарной кислотой является токсичным для эксплантов.

Таким образом, биоянтарная кислота показала себя в качестве синергиста 6-БАП, стимулируя образование большого количества микрорастений на конгломерат. Для получения максимального количества хорошо развитых микропобегов мы рекомендуем следующие среды: для Вишни №70 и 74 - М. С. (1962) с БАП 0,5 мг/л и 0,5 мг/л биоянтарной кислоты, для Вишни №71, 92 и ВСЛ-2 - М. С. (1962) + 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0

мг/л биоянтарной кислоты. При этом сокращается этап пролиферации с пяти до трех пассажей и увеличивается коэффициент размножения.

Калий-УНИ.

В связи с тем, что калий-УНИ является аналогом ГК, то и испытывали их в концентрации 2,0 и 5,0 мг/л с 0,1 мг/л БАП в среде М.С. (1962). При этом ГК была использована как контроль.

В результате проведенных исследований установлено, что К-УНИ в концентрации 2,0 мг/л с 0,1 мг/л 6-БАП во всех опытах показал себя в качестве синергиста 6-БАП и ГК, стимулируя образование большого количества вытянувшихся в высоту микрорастений на конгломерат, по сравнению с ГК. Коэффициент размножения составлял 4,4, размер эксплантов через две недели культивирования достигал 20-25 мм.

Увеличение концентрации К-УНИ в среде до 5,0 мг/л на фоне 0,1 мг/л 6-БАП снижает способность растений вытягиваться и уменьшает процент пригодных для укоренения. Более того к концу культивирования экспланты становились слабыми, наблюдался хлороз листьев и побегов, верхушка микропобегов начинала отмирать. Однако, при этом такое сочетание стимулировало вытягивание стеблей у растений до 18-25 мм.

Сочетание 0,1 мг/л 6-БАП + 2,0 мг/л ГК у контрольных сортов ВСЛ-2 и ВЦ-13 ускоряло вытягивание стеблей микропобегов, и через две недели их размер достигал 20-25 мм. Степень влияния препаратов данного сочетания зависела от сортовых особенностей.

Таким образом, проведенные нами эксперименты позволяют рекомендовать к применению К-УНИ и ГК в концентрациях 2,0 мг/л с 0,1 мг/л 6-БАП для удлинения побегов перед этапом укоренения.

3.5. Укоренение микропобегов

В данном опыте испытывали ИМК и ИУК в концентрации 0,5; 0,8; 1,0; 1,5 и 2,0 мг/л.

Наиболее трудноукореняемыми in vitro были гибриды Вишни №70, 71 и 74. Процесс образования корней у них достаточно длителен и растянут на 2-2,5 месяца.

Поскольку подвои ВСЛ-2 и ВЦ-13 одинаково реагировали на присутствие ауксинов в питательной среде, поэтому они были объединены в одну группу. Гибриды Вишни №70, 71 и 74 также одинаково реагировали на присутствие ауксинов и были соответственно объединены во вторую группу.

На средах с ИУК в оптимальных концентрациях 0,5 и 0,8 мг/л у всех форм согласно полученным данным формировалась более слабая корневая система, чем на средах с ИМК в тех же концентрациях, однако процент укоренившихся побегов был практически одинаковым (рисунок 6).

100,0 90,0

И- 80,0

о

| 70,0

к 60,0

0

1 50.0

I 30'° I 20,0 10,0 0,0

ИI - ВСЛ-2 и ВЦ-13 ■ II - гибриды Вишни №70, 71 и 74

Рисунок 6 - Влияние ауксинов на процент укоренения микропобегов, 2006-2007 гг.

Увеличение концентрации в средах ИМК и ИУК в наших опытах выше 1,0 мг/л вызывало чрезмерное каллусообразование на месте среза побега, в результате которого микропобеги в базальной части интенсивно образовывали каллус. Корни, образовывались в таких случаях из каллуса, а не из тканей побега, что препятствовало образованию сосудистых соединений между ним. Такие растения в дальнейшем при высадке на адаптацию неизбежно погибали. На средах с ИМК в концентрации 1,5 и 2,0

ИМК ИМК ИМК ИМК ИМК ИУК ИУК ИУК ИУК ИУК 0,5 0,8 1,0 1,5 2,0 0,5 0,8 1,0 1,5 2,0 мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л

мг/л у всех форм наблюдалось отмирание листьев, а затем апикальные некрозы. На данных средах происходило также образование единичных, гипертрофировано толстых и укороченных корней. При этом замедлялся рост побегов.

Таким образом, эффективность ризогенеза микропобегов зависела, прежде всего, от вида растения и от типа используемого ауксина. В наших исследованиях наиболее эффективным для укоренения всех форм оказалось применение ИМК в концентрациях от 0,5 до 0,8 мг/л.

3.6. Адаптация микрорастений in vivo

Адаптация растений к нестерильным условиям произрастания является последним и наиболее сложным этапом клонального микроразмножения.

В ходе испытания субстратов, когда нами использовался нестерильный субстрат, приживаемость растений независимо от сорта и подвоя составляла 20-25%. В данном случае основная причина гибели таких растений - бурное развитие грибной микрофлоры вокруг нежных корневых тканей, приводящее к загниванию корней и корневой шейки с последующей их гибелью.

При использовании стерилизованного субстрата приживаемость была лучше и достигала 35-50% от числа высаженных на адаптацию растений.

Но в этом случае на 2-3 недели останавливался рост надземной части растения. Остановка роста в данный период, по нашему мнению, связана со стрессом, переживаемым растением после трансплантации и переключением питания с гетеротрофного на автотрофный. В процессе клонального микроразмножения растения получали сахара экзогенно в количестве трех процентов из культуральной среды. По нашему предположению, хотя пробирочные растения и выглядят физиологически активными, а листовой аппарат имеет зеленый пигмент - процесс фотосинтеза протекает в незначительной степени, так как у растений нет в этом необходимости. Корни у таких экземпляров были лишены корневых волосков и всасывание питательных веществ осуществлялось всей поверхностью.

Это предположение получило подтверждение при использовании нами комбинированного способа для перевода растений из культуры на фототрофный способ питания.

Для этого стандартные торфоперегнойные горшочки на две трети заполнялись нестерилизованным почвенным субстратом. Оставшаяся треть наполнялась стерильным перлитом, увлажненным водным раствором минеральных солей среды М.С. (1962) без витаминов, ростовых веществ и сахарозы. Растения высаживались в перлит таким образом, что корни не касались основного субстрата. Затем горшочки с высаженными растениями, накрывали полиэтиленовым пакетом.

При этом происходил интенсивный рост всего растения - как надземной части, так и корневой системы (таблица 7). Корневая система разрастаясь в длину, входила в нестерильный субстрат и адаптировалась в нем. Наиболее активный прирост надземной части в этот период отмечен нами у подвоя ВСЛ-2.

Таблица 7 - Развитие растений подвоя ВСЛ-2 в различных почвенных субстратах, 2007 г.

Вариант субстрата Доля адаптированных растений 4 недели после высадки

Прирост корней, см Прирост побега, см

Нестерилизованный 25,0 12,3 3,4

Стерилизованный 36,7 10,4 2,9

Стерильный перлит + нестерилизованный субстрат 84,2 16,7 5,3

НСР05 - 1,7 1,2

При таком способе, процент полностью адаптированных растений в наших опытах повышался до 80-90%, и в этом случае на уровне 95% значимости разница в количестве прижившихся растений в зависимости от сорта и подвоя была несущественной.

Повышение процента адаптированных растений и лучшее их развитие при использовании комбинированного субстрата объясняется уменьшением стресса переживаемого растением сразу после посадки. В данном случае

происходит постепенная перестройка характера питания пересаживаемого растения в сторону автотрофности, так как окружающая корни среда аналогична по основному составу солей предыдущей, но не имеет экзогенных Сахаров. Развитие грибной микрофлоры вокруг корней до входа их в нестерильный субстрат также не отмечалось. В результате работы получено авторское свидетельство №2335119 «Способ адаптации in vivo плодовых и ягодных культур в двухслойном субстрате».

ВЫВОДЫ

1. Определено, что фаза выхода из покоя для меристематического апекса, вычлененного из верхушечной почки, является оптимальной при успешной индукции in vitro гибридов вишни.

2. Выявлено, что 0,1% раствор сулемы в экспозиции 8 минут следует использовать в качестве поверхностно стерилизующего вещества при работе с культурой ткани вишни.

3. Установлено, что для стимуляции образования побегов в культуре не следует использовать комбинацию цитокинина и ауксина, так как такое сочетание стимулирует индукцию побегов, но приводит к образованию каллуса и в дальнейшем вызывает фенотипические изменения культивируемого растения. Оптимальная концентрация 6-БАП в состав среды М. С. (1962) для исследованных нами растений, 0,5-1,0 мг/л.

4. Цефотаксим в концентрации от 0,1 до 0,5 мг/л и канамицин в концентрации 10 мг/л исключает из питательной среды средовую и посадочную инфекцию.

5. Рекомендуется использовать биоянтарную кислоту в концентрации 0,5 и 1,0 мг/л повышающую коэффициент размножения до 20,4 и сокращающую количество пересадок на свежую питательную среду до трех пассажей.

6. На этапе элонгации предполагается применять К-УНИ, который повышает коэффициент размножения до 4,4.

7. В качестве индуктора ризогенеза косточковых ^льтур целесообразно использовать ИМК в концентрации от 0,5 до 0,8 мг/л. Ее применение вызывает высокий процентуюренения.

8. Дня постепенного переключения растения с гетеротрофного на автотрофный способ питания в период адаптации in vivo необходимо высаживать его в стерильный перлит, уатажненный водным раствором минеральных солей культуральной среды, расположенный над нестерильным почвенным субстратом, под пленочноеукрьпие(авт. св. №2335119).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

1. При производстве посадочного материала ценных исходных растений косточковых культур рекомендуется использовать способ клонального миьроразмножения. Еще более усюрить процесс внедрения таких растений в практическое использование можно используя в качестве добавок в питательную среду новых БАВ: биоянтарную кислоту в концентрации от0,5 до 1,0 мг/л и К-УНИ2,0 мг/л.

2. Для производственного испытания в качестве легко размножаемых гибридов и подвоев in vilro рекомендовать: гибриды Вишни №70, 74 и 92, а также ВСЛ-2.

3. При клонатьном ми1форазмножении подвоев и гибридов вишни:

- Вычленение апексов проюдить из верхушечных почек в начале марта;

- Стерилизацию апексов осуществлять в сулеме (экспозиция 8 мин);

- Использовать 6-БАП на этапе пролиферации в концентрации от 0,5 до 1,0 мг/л в течение 5-ти пассажей;

- Антибиотик канамицин в концентрации 10 мг/л добавлять в питательную среду непосредственно перец авгоклавированием;

- На этапе пролиферации использовать биоянтарную кислоту в концентрации 0,5 и 1,0 мг/л на фоне 0,5 мг/л 6-БАП;

- Пересадку растений из пробирок в нестер ильные у слови я проюдить в зимние месяцы.

4. Адаптировать in vivo микрорастения способом «Способ адаптации in vivo плодовых и ягодных культур в двухслойном субстрат©). (А. С. №2335119).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Денисенко Ю. А. Размножение форм подвоев косточковых культур in vitro / Ю.А. Денисенко, АЛ. Кузнецова, Л.Л. Бунцевич // Основные итоги научных исследований СКЗНИИСиВ за 2004 год / Краснодар, 2005. - С. 94-97.

2. Бунцевич Л. Л. Фитосанитарный мониторинг плодовых насаждений по поводу инфекций вирусной и фитоплазменной этиологии, оздоровление и селекция садовых растений in vitro / Л.Л. Бунцевич, Г.К. Киселева, Ю.А. Денисенко, A.M. Дьяконова // Основные итоги научных исследований СКЗНИИО)В за2004 год / Краснодар,2005,- С. 111 - 115.

3. Бунцевич Л. Л. Оздоровление и селекция растений in vitro, вирусологический мониторинг насаждений // Л.Л. Бунцевич, Г.К. Киселева, ЮЛ. Денисенко, A.M. Дьяконова // Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства: материалы конференции.- Новочеркасск, 2005. - С. 104 - 107.

4. Майорова ЮА. Размножение подвоев вишни в культуре in vitro / ЮЛ. Майорова, Л.Л. Бунцевич //Научноеобеспечение агропромышленного комплекса: материалы науч. - пракг. конф. / КубГАУ. - Краснодар, 2005. - С 138- 139.

5. Еремин Г. В. Оптимизация технологии размножения отдаленных гибридов вишни в культуре in vitro / Г. В. Еремин, Ю. А. Майорова // Тр. КубГАУ,-2008.-Вып. №2(11).-С. 101-103.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Майорова, Юлия Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Клональное микроразмножение косточковых культур.

1.2. Использование биологически активных веществ (БАВ) в культуре in vitro

1.3. Клоновые подвои.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Характеристика объектов исследований.

2.2. Лабораторное оснащение и инструментарий.

2.3. Методика проведения исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Жизнеспособность почек в зависимости от срока их вычленения.

3.2. Выбор стерилизующего вещества.

3.3. Оптимизация концентрации 6-БАП в питательной среде на этапе пролиферации.

3.4. Использование антибиотиков в культуре in vitro.

3.4.1. Анализ воздействия антибиотиков цефотаксима и клафорана на различные типы инфекции

3.4.2. Влияние комплексных антибиотиков на степень заражения среды и эксплантов сапрофитной микрофлорой.

3.4.3. Воздействие антибиотиков на пробирочные растения.

3.5. Оценка эффективности применения биологически активных веществ (БАВ) в культуре in vitro.

3.5.1. Янтарная кислота

3.5.2. Биоянтарная кислота.

3.5.3. Калий-УНИ.

3.6. Определение оптимальных сроков пассирования в культуре in vitro

3.7. Укоренение микропобегов

3.8. Адаптация микрорастений in vivo.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Оптимизация этапов клонального микроразмножения гибридов вишни на основе применения новых биологически активных веществ"

Краснодарский край, обладающий благоприятными почвенными и климатическими условиями, является самым крупным регионом России по производству плодовой и ягодной продукции. Однако в 90-е годы здесь как в целом по России произошло сокращение площадей промышленных насаждений косточковых культур и валового производства плодов. Так общая площадь косточковых снизилась с 23,7 тыс. га в 1999 году, до 18,6 тыс. га в 2004 году [35, 50]. Одной из основных причин сокращения площадей косточковых культур является недостаток оздоровленных подвоев, которые бы полностью отвечали требованиям современного производства.

Дальнейшая интенсификация плодоводства на современном этапе невозможна без увеличения ассортимента подвойного материала, в том числе и косточковых культур. Клоновые подвои позволяют резко сократить варьирование силы роста и урожайности деревьев, ускорить промышленное плодоношение садов, увеличить их урожайность, улучшить качество плодов и снизить затраты ручного труда [128]. Актуальность использования традиционных способов, таких как окулировка, прививка или черенкование, для получения подвоев не может быть подвергнута сомнению, однако по производительности показатели размножения in vitro несоизмеримо выше [78]. Поэтому эффективность клонального микроразмножения при выращивании посадочного материала позволяет рассматривать его как серьезную альтернативу традиционным технологиям.

В настоящее время в Европе и США клональное микроразмножение постепенно вытесняет традиционные способы вегетативного размножения. В США, Италии, Франции, Великобритании, Голландии, Новой Зеландии имеются производственные лаборатории, работа которых по выпуску оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур поставлена на промышленную основу [92].

Способ культивирования меристем in vitro имеет значительный потенциал для совершенствования — химическими лабораториями синтезируются новые ростовые вещества. Их эффективность нуждается в детальных исследованиях и проверке на современном сортименте косточковых культур.

Актуальность работы обоснована необходимостью ускоренного клонального микроразмножения посадочного материала вегетативно размножаемых косточковых культур для быстрого внедрения их в производство и совершенствования методики микроразмножения с учетом видовых особенностей конкретных растений.

Новизна работы заключается в исследовании активности и специфики влияния ростовых веществ последнего поколения, на сорта и гибриды косточковых при культивировании их in vitro, и совершенствовании его отдельных этапов. Впервые предложен и запатентован способ адаптации пробирочных растений in vivo в комбинированном субстрате.

Практическая значимость работы заключается в первичном размножении гибридов вишни и черешни селекции СКЗНИИСиВ.

Цель работы - совершенствование способа клонального микроразмножения гибридов вишни и черешни с помощью БАВ нового поколения.

Ставились задачи:

1. Модифицировать питательные среды для культивирования in vitro эксплантов гибридов вишни и черешни для получения микрорастений оптимального качества.

2. Изучить специфичность реакции эксплантов на ростовые вещества и БАВ в культуре in vitro в зависимости от сорта и вида.

3. Существенно увеличить выход адаптированных in vivo пробирочных растений.

Заключение Диссертация по теме "Плодоводство, виноградарство", Майорова, Юлия Алексеевна

выводы

1. Определено, что фаза выхода из покоя для меристематического апекса, вычлененного из верхушечной почки, является оптимальной при успешной индукции in vitro гибридов вишни.

2. Выявлено, что 0,1% раствор сулемы в экспозиции 8 минут следует использовать в качестве поверхностно стерилизующего вещества при работе с культурой ткани вишни.

3. Установлено, что для стимуляции образования побегов в культуре не следует использовать комбинацию цитокинина и ауксина, так как такое сочетание стимулирует индукцию побегов, но приводит к образованию каллуса и в дальнейшем вызывает фенотипические изменения культивируемого растения. Оптимальная концентрация 6-БАП в состав среды М. С. (1962) для исследованных нами растений, 0,5-1,0 мг/л.

4. Цефотаксим в концентрации от 0,1 до 0,5 мг/л и канамицин в концентрации 10 мг/л исключает из питательной среды средовую и посадочную инфекцию.

5. Рекомендуется использовать биоянтарную кислоту в концентрации 0,5 и 1,0 мг/л повышающую коэффициент размножения до 20,4 и сокращающую количество пересадок на свежую питательную среду до трех пассажей.

6. На этапе элонгации предполагается применять К-УНИ, который повышает коэффициент размножения до 4,4.

7. В качестве индуктора ризогенеза косточковых культур целесообразно использовать ИМК в концентрации от 0,5 до 0,8 мг/л. Ее применение вызывает высокий процент укоренения.

8. Для постепенного переключения растения с гетеротрофного на автотрофный способ питания в период адаптации in vivo необходимо высаживать его в стерильный перлит, увлажненный водным раствором минеральных солей культуральной среды, расположенный над нестерильным почвенным субстратом, под пленочное укрытие (авт. св. №2335119).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

1. При производстве посадочного материала из единичных, ценных исходных растений косточковых культур рекомендуется использовать способ клонального микроразмножения. Еще более ускорить процесс внедрения таких растений в практическое использование можно используя в качестве добавок в питательную среду новых БАВ: биоянтарную кислоту в концентрации от 0,5 до 1,0 мг/л и К-УНИ 2,0 мг/л.

2. Адаптировать in vivo микрорастения способом «Способ адаптации in vivo плодовых и ягодных культур в двухслойном субстрате». (А. С. №2335119)

3. Для производственного испытания в качестве легко размножаемых подвоев in vitro рекомендовать: гибриды вишни №70, 74 и 92, а также ВСЛ-2.

4. При клональном микроразмножении подвоев и гибридов вишни:

- Вычленение апексов проводить из верхушечных почек в начале марта;

- Стерилизацию апексов осуществлять в сулеме (экспозиция 8 мин);

- Использовать 6-БАП на этапе пролиферации в концентрации от 0,5 до 1,0 мг/л в течение 5-ти пассажей;

- Антибиотик канамицин в концентрации 10 мг/л добавлять в питательную среду непосредственно перед автоклавированием;

- На этапе пролиферации использовать биоянтарную кислоту в концентрации 0,5 и 1,0 мг/л на фоне 0,5 мг/л 6-БАП;

- Пересадку растений из пробирок в нестерильные условия проводить в зимние месяцы.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Майорова, Юлия Алексеевна, Краснодар

1. Агеев Б. Н. Методические рекомендации по размножению клоновых подвоев в интенсивном одногодичном маточнике / Б. Н. Агеев. Ялта, 1986. -24 с.

2. Артамонов В. И. Биотехнология — агропромышленному комплексу / В. И. Артамонов. М.: Наука, 1989. - 156 с.

3. Астахов А. А. Изучение в питомнике вегетативно размножаемых подвоев для вишни и черешни / А. А. Астахов // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве: материалы Междунар. науч.- метод, конф. / ГНУ ВНИИСПК. Орел, 2003. - С. 18-19.

4. Барабаш Т. Н. Биологические особенности клоновых подвоев вишни и черешни / Т. Н. Барабаш // Садоводство и виноградарство. 2000. - № 2. - С. 910.

5. Барабаш Т. Н. Выращивание саженцев вишни на клоновых подвоях / Т. Н. Барабаш // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве: материалы Междунар. науч.- методич. конф. / ВНИИСПК. Орел, 2003. - С. 2931.

6. Барабаш Т. Н. Засухоустойчивость клоновых подвоев черешни в условиях южной степи Украины / Т. Н. Барабаш // Садоводство и виноградарство. 2003. - № 3. - С. 14-16.

7. Барабаш Т. Н. Клоновые подвои черешни / Т. Н. Барабаш // Садоводство и виноградарство. 2003. - № 6. - С. 11-13.

8. Барабаш Т. Н. Оценка клоновых подвоев косточковых культур в условиях южной степи Украины / Т. Н. Барабаш, Г. А. Кинаш // Научныеосновы устойчивого садоводства в России: докл. конф. / НИИ Садоводства им. И. В. Мичурина. Мичуринск, 1999. - С. 190-193.

9. Белошапкина О. О. Система оздоровления земляники садовой от вирусов: автореф. дис. . д. с.-х. наук / О. О. Белошапкина; ВСТИСП. М., 2006. - 40 с.

10. Биология. Большой энциклопедический словарь / под ред. М. С. Гилярова. М.: Большая Российская энциклопедия, 1999. - 864 с.

11. Биология. Толковый словарь (с английскими эквивалентами) / В. П. Андреев, А. Г. Марков, Г. И. Дубенская, Е. Ф. Сороколетова. СПб.: Лань, 1999.-448 с.

12. Бунцевич Л. Л. Регенерация in vitro и клональное микроразмножение черешни и вишни новых сортов селекции СКЗНИИСиВ / Л. Л. Бунцевич // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем. Мичуринск, 1998. - С. 66-68.

13. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: учеб. пособие / Р. Г. Бутенко. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.- 160 с.

14. Бутенко Р. Г. Жизнь клетки вне организма / Р. Г. Бутенко. М.: Знание, 1975.-63 с.

15. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. — М.: Наука, 1964. 270 с.

16. Бутенко Р. Г. От свободноживущей клетки к растению / Р. Г. Бутенко. -М.: Колос, 1971.-93 с.

17. Валиханова Г. Ж. Культура клеток и биотехнология растений / Г. Ж. Валиханова, И. Р. Рахимбаев. Алма-Ата, 1989. — 80 с.

18. Высоцкий В. А. Использование методов культуры изолированных тканей и органов для оздоровления и ускоренного размножения плодовых и ягодных растений / В. А. Высоцкий // Селекция плодовых и ягодных культур. -Новосибирск, 1989. С. 132-138.

19. Высоцкий В. А. Клональное микроразмножение в системе производства оздоровленного посадочного материала малины / В. А. Высоцкий, Н. В Герасимова // Ягодоводство в Нечерноземье. М., 1989. - С. 65-74.

20. Высоцкий В. А. Клональное микроразмножение плодовых растений и декоративных кустарников / В. А. Высоцкий // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве. -Мичуринск: ВНИИС им. И. В. Мичурина, 1989. С. 3-8.

21. Высоцкий В. А. Перспективы внедрения микроразмножения в производство / В. А. Высоцкий // Садоводство и виноградарство. 1988. - №. 2. -С. 14-17.

22. Высоцкий В. А. Применение методов культуры изолированных тканей и органов для размножения плодовых и ягодных растений / В. А. Высоцкий // Ягодоводство в Нечерноземье. М.: НИЗИСНП, 1982. - С. 30-41.

23. Высоцкий В. А. Производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда методом клонального микроразмножения / В. А. Высоцкий, Н. П. Туровская. М.: Агропромиздат, 1989. - 8 с.

24. Высоцкий В. А. Регенерация побегов косточковых культур из корневого и листового каллусов / В. А. Высоцкий, Е. В. Данькова // Плодоводство в Нечерноземье. -М.: ВСТИСП, 1993. С. 70-75.

25. Высоцкий В. А. Совершенствование питательной среды для клонального микроразмножения вишни / В. А. Высоцкий, Е. В. Олешко // Агротехника и сортоиучение плодовых культур. М.: НИЗИСНП, 1985. - С. 7376.

26. Гамбург К. 3. Ауксины в культурах тканей и клеток растений / К. 3. Гамбург, Н. И. Рекославская, С. Г. Швецов. Новосибирск: Наука, 1990. - 243 с.

27. Гегечкори Г. Б. Экономическая эффективность производства плодов в плодовом подкомплексе АПК (по материалам Прикубанской зоны Краснодарского края) / Г. Б. Гегечкори. Краснодар: КубГАУ, 2005. - 217 с.

28. Горбачева Н. Н. Оценка и размножение клоновых подвоев косточковых культур в условиях северо-запада России: автореф. дис. . канд. с.-х. наук /Н. Н. Горбачева; Пушкин. СПб., 2000. - 16 с.

29. Гродзинский А. М. Краткий справочник по физиологии растений / А. М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. Киев: Наукова Думка, 1973. - 591 с.

30. Грязев В. А. Выращивание саженцев для высокопродуктивных садов /

31. B. А. Грязев. Ставрополь: Кавказский край, 1999. - 208 с.

32. ДерфлингК. Гормоны растений. Системный подход: Пер. с англ. Н.

33. C. Гельман.- М.: Мир, 1985. 304 с.

34. Джигадло Е. Н. Микроклональиое размножение сортов и подвоев вишни / Е. Н. Джигадло, М. И. Джигадло // Плодоводство. Самохваловичи, 2005. - Т. 17. - Ч. 2. - С. 200-202.

35. Джигадло М. И. Некоторые вопросы микроклонального размножения плодовых и ягодных культур / М. И. Джигадло // Пути интенсификации садоводства и селекция плодовых и ягодных культур. Тула, 1989. - С. 129-134.

36. Джигадло М. И. Размножение вишни методом верхушечных меристем / М. И. Джигадло, Е. Н. Джигадло // Улучшение сортимента и прогрессивные приемы возделывания плодовых и ягодных культур. Тула, 1988. - С. 65-68.

37. Доспехов Б. А. Планирование полевого опыта и статистическая обработка его данных / Б. А. Доспехов. М.: Колос, 1972. - 207 с.

38. Дубовский Н. В. Меристемные методы размножения плодовых и ягодных культур / Н. В. Дубовский, Н. И. Туровская, А. М. Чернец // Садоводство и виноградарство. 1988. - № 1. - С. 27-29.

39. Егорова Т. А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. М.: Академия, 2005. - 208 с.

40. Егоров Е. А. Экономическая эффективность производства и сбыта плодов / Е. А. Егоров, П. Ф. Парамонов, Ж. Г. Синяговская. Краснодар: КГАУ, 2005. - 179 с.

41. Еремина О. В. Некоторые особенности выращивания саженцев черешни на адаптивном подвое BCJI-2 / О. В. Еремина // Проблемы экологизации современного садоводства и пути их решения: материалы Междунар. конф. / КубГАУ. Краснодар, 2004. - С. 463-467.

42. Еремин Г. В. Новые клоновые подвои вишни и черешни / Г. В. Еремин,

43. A. В. Проворченко // Садоводство и виноградарство. 1997. - № 5-6. - С. 12-14.

44. Еремин Г. В. Новые клоновые подвои косточковых культур / Еремин Г. В., А. В. Проворченко // Сад1вництво. Кшв, 1998. - № 47. - С. 207-209.

45. Еремин Г. В. Новый тип универсального маточника клоновых подвоев косточковых культур / Г. В. Еремин, Ю. В. Соколова // Садоводство и виноградарство. 2005. - № 4. - С. 11-12.

46. Еремин Г. В. Перспективы создания насаждений косточковых культур интенсивного типа / Г. В. Еремин, А. В. Проворченко, В. Ф. Гавриш, В. Г. Еремин // Тр. / СКЗНИИ садоводства и виноградарства.- 2001. Ч. 1. - С. 150153.

47. Еремин Г. В. Подбор клоновых подвоев косточковых культур для адаптивного садоводства / Г. В. Еремин, В. Г. Еремин // Проблемы экологизации современного садоводства и пути их решения: материалы Междунар. конф. / КубГАУ. Краснодар, 2004. - С. 371-377.

48. Еремин Г. В. Пути совершенствования сортимента косточковых культур в садах России / Г. В. Еремин // Плодоводство и ягодоводство России. -М., 1996. Т. 3.-С. 26-30.

49. Еремин Г. В. Селекция клоновых подвоев для черешни / Г. В. Еремин,

50. B. Н. Подорожный // Экологическая оценка типов высокоплотных плодовых насаждений на клоновых подвоях: материалы II Междунар. симпозиума / Институт плодоводства. Минск, 2003. - С. 162-165.

51. Жуков О. С. Методические рекомендации по получению растений-регенерантов плодовых пород в культуре пыльников / О. С. Жуков, О. Я. Олейникова, Н. И. Савельев. Мичуринск: ВНИИГиСПР им. И. В. Мичурина, 1994. - 35с.

52. Избасаров Д. С. Технология оздоровления и размножения ягодных культур в Казахстане /Д. С. Избасаров, Н. П. Клоконос. Алматы: Мектеп, 2002. - 200 с.

53. Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур (методические рекомендации) / под ред. В. М. Тюленева. Мичуринск: ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И. В. Мичурина, 1996. - 74 с.

54. Каверзнева Г. Д. Меры борьбы с вирусными болезнями плодовых культур и винограда: обзорная информация / Г. Д. Каверзнева. -М.:ВНИИТЭИСХ, 1980. 53 с.

55. Карабанов И. А. Витамины и фитогормоны в жизни растений / И. А. Карабанов. Мн.: Ураджай, 1977. - 112 с.

56. Егоров Е. А. Экономическая эффективность производства и сбыта плодов / Е. А. Егоров, П. Ф. Парамонов, Ж. Г. Синяговская. Краснодар: КГАУ, 2005. - 179 е.

57. Катаева Н. В. Клональное микроразмножение растений / Н. В. Катаева, Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1983. 96 с.

58. Киселева Н. С. Методические рекомендации по выращиванию растений чая на основе изолированного зародыша в условиях in vitro / Н. С. Киселева. Сочи, 2001. - 29 с.

59. Климкина Н. П. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур / Н. П. Климкина // Садоводство, виноградарство и виноделие. -Ташкент, 2001. Т.50. - С. 205-208.

60. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур / Н. М. Круглов, О. В. Матушкина, Р. Г. Ноздрачева, И. Н. Пронина, Н. И. Туровская. -Воронеж: ВГАУ, 1998. -12 с.

61. Клоновые подвои для интенсивных садов вишни Нечерноземья России (рекомендации) / сост. Н. Т. Ревяткина, Г. Ю. Упадышева, А. М. Михеев. М.: ВСТИСП, 2000. - 20 с.

62. Клоновые подвои косточковых культур (методические указания) / сост. А. Н. Татаринов.- М., 1989. 66 с.

63. Корнацкий С. А. Проблемы клонального микроразмножения косточковых культур / С. А. Корнацкий, В. А. Высоцкий, В. Г. Трушечкин // Достижения в плодоводстве в нечерноземной зоне РСФСР. М., 1991. - С. 104116.

64. Косточковые культуры. Выращивание на клоновых подвоях и собственных корнях / Г. В. Еремин, А. В. Проворченко, В. Ф. Гавриш, В. Н. Подорожный, В. Г. Еремин. Ростов-на-Дону: Феникс, 2000. - 256 с.

65. Красинская Т. А. Микроразмножение различных форм Cerasus Mill, in vitro / Т. А. Красинская, H. В. Кухарчик // Плодоводство. Самохваловичи.-2004.-Т. 16.-С. 26-31.

66. Красинская Т. А. Совместное влияние феруловой, гибберелловой кислот и 6-бензиладенина на процесс микроразмножения регенерантов вишни в культуре in vitro / Т. А. Красинская // Плодоводство. Самохваловичи, 2005. -Т. 17.-Ч. 1.-С. 72-76.

67. Кретович В. JI. Биохимия растений: учебник для биол. факультетов унтов / В. J1. Кретович. М.: Высшая школа, 1980. - 445 с.

68. Кухарчик Н. В. Роль экспланта при инициации культуры in vitro некоторых плодовых и ягодных растений / Н. В. Кухарчик, С. Э. Семенас, М. С. Чиковани, Р. М. Пугачев // Плодоводство. — Беларусь, 1999. Т. 12. - С. 25-28.

69. Либберт Э. Физиология растений: Пер. с нем. Д. П. Викторов, Н. С. Гельман.- М.: Мир, 1976.- 580 с.

70. Мазин В. В. Изучение природных цитокининов / В. В. Мазин, Л. С. Шашкова // Рост растений и природные регуляторы. М.: Наука, 1977. - С. 122142.

71. Матушкина О. В. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур и перспективы его использования / О. В. Матушкина, И. Н. Пронина // Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИС им. И. В. Мичурина. Тамбов, 2001. - С. 103-105.

72. Машковский М. Д. Лекарственные средства: пособие по фармакотерапии для врачей. В 2 ч. Ч. 2. / М. Д. Машковский. М.: Медицина, 1977.-560 с.

73. Методические рекомендации по выращиванию гибридных растений тюльпанов в культуре зародышей in vitro / сост. Т. М. Коломиец, В. С. Мохно. -Сочи: ВНИИЦиСК, 2000. 20 с.

74. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / сост. Е. Н. Джигадло, М. И. Джигадло, JI. В. Голышкина. Орел: ГНУ ВНИИСПК, 2005.-51 с.

75. Методические рекомендации по клональному микроразмножению панкрация морского (Pancratium maritimum L.) в культуре in vitro / сост. А. А. Тибилов, В. И. Болгов, Т. В. Евсюкова. М., 2003. - 19 с.

76. Методические указания по выращиванию сеянцев вишни из зародышей, изолированных на ранних стадиях развития / сост. В. А. Высоцкий, Г. А. Плотникова. М.: НИЗИСНП, 1988. - 16 с.

77. Методические указания по клональному микроразмножению черной и красной смородины / сост. Ф. Я. Поликарпова, В. А. Высоцкий, 3. Т. Тарашвили. М.: НИЗИСНП, 1986. - 16 с.

78. Методические указания по технологии производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур высших категорий / сост. В. Г. Трушечкин, Ф. Я. Поликарпова, В. А. Высоцкий, А. А. Борисова, И. С. Литвиненко М.: ВАСХНИЛ, 1986. - 44 с.

79. Минаев В. А. Эффективность клонального микроразмножения и качество оздоровленного по двойного материала яблони / В. А. Минаев, А. В. Верзилин, В. А. Высоцкий // Садоводство и виноградарство. 2005. - N. 4. - С. 12-14.

80. Митрофанова О. В. Диагностика вирусных болезней и биотехнологические приемы получения безвирусного посадочного материала косточковых плодовых культур / О. В. Митрофанова, Л. Е. Славгородская-Куприева, И. В. Митрофанова. Ялта: Крымпресс, 2000. - 45 с.

81. Всерос. науч. — практ. конф. / ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И. В. Мичурина. Мичуринск, 2003. - С. 130-135.

82. Муромцев Г. С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г. С. Муромцев, Р. Г. Бутенко, Т. И. Тихоненко. М., 1990. - 383 с.

83. Негрука В. И. Биотехнология растений: культура клеток / В. И. Негрука; пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1989. - 280 с.

84. Негрука В. И. Биотехнология сельскохозяйственных растений / В. И. Негрука; пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1987. - 301 с.

85. Неделчева Славка. Значението на рН на хранителната среда за развитието на микроразмножени култури от вишна // Почвозн., агрохим. иекол. 1999.-34, №2-3.-С. 83-86.

86. Оздоровление и размножение плодовых и ягодных растений методом культуры меристематических верхушек / сост. Ю. Г. Попов. М.: ВАСХНИЛ, 1979.-29 с.

87. Олешко Е. В. Размножение клоновых подвоев вишни / Е. В. Олешко, В. Г. Трушечкин, В. А. Высоцкий // Садоводство. 1983. - №. 3. - С. 20-21.

88. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г. С. Муромцев, Р. Г. Бутенко, Т. И. Тихоненко, М. И. Прокофьев. М.: Агропромиздат, 1990. - 384 с.

89. Пат. 2128430 Российская федерация, МПК6 А 01 Н 4/00. Питательная среда для микроклонального размножения черешни / И. М. Фардзинова; заявитель и патентообразователь Горе: гос. аграр. ун-т. № 96116868 / 13; заявл. 09.08.96; опубл. 10. 04. 99., Бюл. №10.

90. Петрова А. Д. Оздоровление и размножение садовых культур in vitro / А. Д. Петрова, М. Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство. 2000. - № 4. -С. 12-13.

91. Подвои плодовых пород (рекомендации) / сост. В. А. Алферов, Т. С. Ивашкова, Г. М. Дей, Р. В. Кальгина. Краснодар, 1989. - 23 с.

92. Полевой В. В. Фитогормоны: Учебное пособие / В. В. Полевой. -СПб.: изд-во Ленингр. ун-та, 1982. 248 с.

93. Попов Ю. Г. Оздоровление и размножение плодовых и ягодных растений методом меристематических верхушек (методические указания) / Ю. Г. Попов. М.: ВАСХНИЛ, 1979. - 30 с.

94. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / под ред. А. И. Нетрусова. М.: Академия, 2005. - 608 с.

95. Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур / под ред. Е. Н. Седова. Орел: ВНИИСПК, 1995. - 502 с.

96. Пронина И. Н. Микроразмножение перспективных сортов вишни / И. Н. Пронина // Научные основы устойчивого садоводства в России: докл. конф. / ВНИИС им. И. В. Мичурина. Мичуринск, 1999. - С. 370-373.

97. Рождественский В. И. Управляемое культивирование растений в искусственной среде / В. И. Рождественский, А. Ф. Клешни. М.: Наука, 1980. - 199 с.

98. Сидоров В. А. Биотехнология растений. Клеточная селекция / В. А. Сидоров. Киев: Наукова думка, 1990. - 280 с.

99. Смирнов А. М. Некоторые итоги и задачи исследований по культуре изолированных корней / А. М. Смирнов // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970. — С. 51-56.

100. Тайдмен X. М. Селекция подвоев плодовых деревьев / X. М. Тайдмен.- М.: Колос, 1966. 62 с.

101. Тарр С. Основы патологии растений / Пер. с англ. Jl. М. Дунина и Н. Л. Клячко.- М.: Мир, 1975.- 587 с.

102. Татаринов А. Н. Садоводство на клоновых подвоях / А. Н. Татаринов.- Киев: Урожай, 1988. 208 с.

103. Ташматова Л. В. Методы культуры in vitro при размножении и депонировании форм груши / Л. В. Ташматова, В. Е. Джафарова // Сад1вництво.- Кшв: СЕРЖ, 2005. Вип. 57. - С. 205-212.

104. Трушечкин В. Г. Методические указания по клональному микроразмножению подвоев и сортов яблони / В. Г. Трушечкин, В. А. Высоцкий, О. А. Леонтьев-Орлов. -М.: ВАСХНИЛ, 1985. 19 с.

105. Туровская Н. И. Влияние аденин-сульфата на регенерацию подвоев яблони in vitro / Н. И. Туровская, И. Н. Пронина // Тезисы докл. Международ, конф. Алма-Ата, 1993. - С. 249-261.

106. Туровская Н. И. Микроклональное размножение малины / Н. И. Туровская, О. В. Стрыгина // Садоводство и виноградарство. — М., 1990. № 8. - С. 26-29.

107. Туровская Н. И. Микроклональное размножение: перспективы его использования и направление дальнейших исследований / Н. И. Туровская // Проблемы интенсификации современного садоводства. Мичуринск, 1990. - С. 157-159.

108. Упадышев М. Т. Клональное микроразмножение ежевики и малины черной / М. Т. Упадышев, В. А. Высоцкий // Новое в ягодоводстве Нечерноземья. М., 1990. - С. 56-65.

109. Упадышев М. Т. Клональное микроразмножение некоторых нетрадиционных культур рода Rubus / М. Т. Упадышев // Ягодоводство в Нечерноземье. М.: ВСТИСП. - 1993. - С. 10-18.

110. Упадышев М. Т. Проблемы оздоровления и размножения in vitro растений рябины обыкновенной / М. Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России. М.: ВСТИСП. - 1994. - С. 70-75.

111. Упадышев М. Т. Совершенствование процесса клонального микроразмножения ежевики и малины черной / М. Т. Упадышев, В. А. Высоцкий // Совершенствование технологии выращивания ягодных культур в Нечерноземье. М.: НИЗИСНП. - 1992. - С. 42-53.

112. Фомина Е. Г. Клональное микроразмножение районированных в Беларуси сортов Cerasus / Е. Г. Фомина, Н. Г. Жук // Плодоводство. Минск, 1994.-Т. 9. -Ч. 1. - С. 64-71.

113. Чеботарева М. С. Перспективы использования дикорастущих видов в селекции на устойчивость к коккомикозу / М. С. Чеботарева // Науч.— техн. биол. ВИР. -М., 1985. Вып. № 155. - С. 62-63.

114. Шипунова А. А. Повышение укореняемости побегов миниатюрной розы при размножении in vitro / А. А. Шипунова, В. А. Высоцкий // Плодоводство и ягодоводство России. М.: ГНУ ВСТИСП. - 2006. - Т. 15. - С. 13-15.

115. Щеглов С. Н. Применение биометрических методов для ускорения селекционного процесса плодовых и ягодных культур / С. Н. Щеглов. -Краснодар: СКЗНИИСиВ; Кубанский гос. ун-т, 2005. 106 с.

116. А1 Sabbagh Muna, Abdul - Kader Ahmad. In vitro propagation of a semi - dwarfing cherry rootstock // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1999. - №. 59. -P. 203-208.

117. Cornu D. Michel M. F. Bacteria contaminants in shoot cultures of Prunus avium L. Choice and phytotoxicity of antibiotics // Acta Hortic. 1987. - N 212.-P. 83-86.

118. Grout B. W. W. Wax development on leaf surbaces of Brassica olaracea var. Currawong regenerated from meristem culture // Plant Sci. Lett. — 1975. №5. — P. 401-405.

119. Haberlandt G. Kulturvermuche mit isolierten Pflanzenzollen. -Sitzungaber Akad. Wiss. Wien Nath-naturw., 1902, Bd III, S. 69-92.

120. James D. Mikropropagion of red raspberry and the influence of phloroglurino. / Sc Hortic., 1980, N 12. p. 313-319.

121. Morel G. Recherches sur la culture associee de parasiten obligatoives et de tissues vegetaux. These, Paris, 1948, 112 p. Ann. Epiphyt. 5, t. 14, p.'123-234.

122. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant.- 1962.- Vol.15.- N 3.- P. 473497.

123. Reuther G. Current status and future prospects of large scale micropropagation in commercial plant production // Food Biotechnol.- 1990.- V.4, N.I.- P. 445-459.

124. Young P. M., Hutchins A. S., Cantield M. L. Use of antibiotics to control bacteria in shoot cultures of woody plants // Plant Sci. Lett. 1984. - V. 34. -P. 203-209.