Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ И СОРТОВ ВИШНИ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ И СОРТОВ ВИШНИ"

с//МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ нмени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ОЛЕШКО Елена Владимировна

УДК 634.2:581.16

ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ И СОРТОВ ВИШНИ

03.00.12 — физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

1985

Работа выполнена в Научно-исследовательском зональном институте садоводства нечерноземной полосы.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор В. Г. Трушечкин.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН СССР, - ВАСХНИЛ, доктор биологиче-

ских наук, профессор Р. Г. Бутенко;

кандидат биологических наук, доцент Н. В. Пилыцикова. . . Ведущее учреждение: Государственный ботанический сад АН СССР.

Зашита диссертации состоится » . . 198^"г.

в « ¿У.*'. » часов на заседании Специализированного Совета ZT120.35.07 при Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 49. Ученый Совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан <

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

М. Н. Кондратьев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В проекте «Основные направления экономического и социального развития СССР на 1986—1990 годы и на период до 2000 года» предусмотрено дальнейшее увеличение производства плодов и ягод в соответствии с Продовольственной программой СССР. Для выполнения" поставленной задачи необходимо осуществить дальнейшую интенсификацию садоводства, которая включает в себя наряду с внедрением промышленной технологии возделывания плодовых д ягодных культур, обеспечение отрасли высококачественным посадочным материалом. В последнее время в связи с сокращением площадей, занимаемых вишней, вызванным поражением коккомикозом, уменьшением производства посадочного материала в питомниках, а также рядом других пр.ичин, возникла необходимость быстрого и эффективного размножения подвоев и сортов вишни новыми прогрессивными способамл, одним из которых является метод клонального микроразмножения.

В настоящее время метод клонального микроразмножения находит применение в практике сельскохозяйственного производства. Использование это* л метода имеет ряд преимуществ перед. традиционными способами размножения: достижение высоких коэффициентов'размножения, сокращение сроков получения посадочного материала, ускорение: селекционного процесса, освобождение растений от патогенных микроорганизмов и в ряде случаев от вирусов, выращивание растений круглый год.

Метод клонального микроразмножения для культуры вишни отработан на этапе регенерации изолированных верхушек побегов. Вопросы, связанные с разработкой системы микроразмножения вишни на этапах индукции Алиферации пазушных меристем, укоренения микропобегов, перенесения растений в нестерильные условия еще недостаточно изучены.

Цель исследований. Основными целями настоящей работы являются:.

1. Изучение физиологических особенностей роста и развития микропобегов вишни, лежащих в основе клонального микроразмножения подвоев и сортов при длительном культивиро-

вании эксплантатов

на: исадштвшзшия питательных средах. научная б;¡алПОТЕКА

Моск. ссль^сохсз ачадвмии им. К. А. Тимирязева

Инз. .

2. Разработка методов клональиого микроразмножения подвоев и сортов вишни на каждом из этапов культивирования, позволяющих получать в массовом количестве растения, пригодные для перенесения в нестерильные условия.

Научная новизна работы.-

1. Изучено влияние новых регуляторов роста (тиадиазуро-на и картолина) на индукцию пролиферации пазушных меристем сортов вишни."

2. Разработан способ повышения коэффициента размножения культивируемых микропобегов вишни путем использования в составе питательной среды одновременно с регулятором роста б-бензиламинопуридом, трийодбеизойной кислоты.

■3. Выявлена статистически значимая зависимость между коэффициентом размножения микропобегов подвоев и сортов вишни при длительном культивировании на искусственных питательных средах и числом проведенных пассажей.

4. Предложен способ получения привитого материала вишни в услозиях in vitro, позволяющий проводить микропрививку на ранних.этапах развития растений и этим преодолевать низкую укореняемость отдельных сортов. •

5. Прозедено анатомическое изучение микропобегов вишни, используемых при клональном микроразмножении, что позволило выявить происхождение ряда структур, закладывающихся при снятии эффекта апикального доминирования. Исследована органогенная способность каллусиой ткани микропобегов вишни.

Практическаяч ценность, работы. Полученные результаты дают возможность оптимизировать процесс клепального микроразмножения подвоев и сортов вишни за счет использования наиболее эффективного индуктора пролиферации:пазушных- меристем. В работе показано, что действие 6-бензилами-нопурина (6-БАП) в сочетании с трийодбеизойной кислотой (ТИБК) на микропббеги вишни определяется сортовой спецификой исходных форм.

Оптимизация условий культивирования на каждом из этапов клональиого микроразмножеиия позволила впервые разработать методы ускоренного получения растений подвоев и сортов вишни. Разработанные приемы могут быть использованы для производства посадочного материала, а также для размножения ценных перспективных форм и интродуциро-вакных сортов вишни.-

Внедрей'е-в практику. Растения вишни, полученные в результате проведенной работы, использованы в опытно-производственном хозяйстве Научно-исследовательского зонального института садоводства-нечерноземной полосы для создания маточных - насаждений. Разработана и передана. Куйбышевской зональной опытной станции. по садоводству Минплодо-

I

овощхоза РСФСР методика по форме 10 НИР «Методы кло-нального микроразмножеиия подвоев и сортов косточковых культур». В соавторстве с доктором с.-х. наук, профессором В. Г. Трушечкиным и кандидатом биологичесюич наук В. Л. Высоцким подготовлены и сданы в печать «Методические указания по клоналыгому микроразмиожеиию подвоев и сортов косточковых культур». ;

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Всесоюзной конференции «Культура клеток растении и биотехнология» (г. Кишинев, 1983 г.), на заседании Круглого стола «Рост растении и фнтогормоны» (1983 г.) и на научном семинаре лаборатории культуры тканей и морфогенеза (1985 г.) Института физиологии растении имени К. А. Тимирязева АН СССР, на заседании ученого Совета НИЗИСНП (1984 г.), на заседании кафедры физиологии растении ТСХА (1985 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 29 таблиц. Список литературы включает 198 источника, в том числе 131 работу иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, рекомендаций производству и списка литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В программу исследований были включены следующие сорта вишни: Владимирская, Любская, Молодежная, Шубинка, а также подвои П-3, П-7 и ВП-1. Эксперименты проводили с эксплантатами указанных подвоев и сортов, в качестве которых использовали верхушечные почки с участком стебля размером до 1 см и верхушечные меристемы с двумя—тремя при-мордиальными листьями размером 200—300 мкм. Все операции, связанные со стерилизацией растительного материала, вычленением эксплантатов, приготовлением питательных сред, культивированием эксплантатов проводили в соответствии с методическими указаниями Ю. Г. Попова (1979).

При культивировании эксплантатов подвоев и сортов вишни на этапе введения в культуру использовали модифицированную среду Мурасиге-Скуга (МС), на этапе размножения были испытаны среды Готре, Уайта, Хеллера, МС, на этапе укоренения кроме названных использовал)! половинную среду МС. Минеральные составы всех используемых сред были дополнены сахарозой в концентрации 3%, агаром 0,7%, тиамином, пиридоксииом, никотиновой кислотой по 0,5 мг/л, аскорбиновой кислотой 1 мг/л.

В ходе экспериментов были использованы следующие регуляторы роста: 6-БАП, тиадиазурон, картолин, р-индолил-

масляная кислота (ИМК), 0-нндолилуксусная кислота (ИУК), «-нафтилуксусная кислота (НУК), ТИБК, сочетание ТИБК и 6-БАП. Раствор питательной среды доводили до рН 5,5—5,6 0.1N NaOH или О,IN НС1.

Анатомические исследования проводили при консультации кандидата с.-х. наук, доцента кафедры плодоводства ТСХА В. В. Фаустова. Для проведения данных исследований использовали методические рекомендации М. Н. Прозиной (1960).

Основными регистрируемыми признаками при развитии эксплантатов в услозиях in vitro были: число развивающихся почек" и побегоз, количество формирующихся листьев, высота побега, процент укоренившихся побегов, число развившихся корней, их длина. Коэффициент корреляции, используемый для определения степени взаимосвязи между признаками, рассчитывали по стандартным методам Л. 3. Румшиского (1971).

В процессе культивирования эксплантаты помещали в све-токомнату, где создавали условия 16 часового дня, освещенности 3—5 тыс. люкс и температуры 22—26°. . Для обработки результатов исследований использовали методы дисперсионного анализа (Н. А.-Плохднский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Развитие эксплантатов на этапе введения в культуру.

На перзом этапе микроразмиожения при изучении регене-рационной способности эксплантатов подвоев и сортов вишни было отмечено, что более 74% изолированных верхушечных меристем развивалось в микропобеги. В этом случае снижение процента приживаемости было вызвано повреждением апикальных структур в процессе вычленения эксплантатов. Контаминации апикальных меристем не наблюдали. Главной причиной, вызывающей гибель изолированных почек, явилось заражение их сапрофитной микрофлорой. Однако окончательное количество прижившихся эксплантатов при введении в культуру изолированных почек и апикальных меристем существенно не различалось. В сзязи с этим дальнейшие исследования нами были проведены с эксплантатами, полученными из изолированных апикальных меристем, так как в этом случае возможно получение безвирусного посадочного материала..

2. Влияние минерального состава питательной среды на развитие эксплантатов вишни.

С целью, подбора питательной среды, имеющей оптимальный набор минеральных компонентов для микроразмножения эксплантатов вишни, были.испытаны, среды, которые, отличаясь между собой по минеральному составу, имели одинаковый набор органических добавок и физиологически активных веществ. • • 4:

Как показали результаты экспериментов, лучшее развитие эксплантатов было отмечено на.модифицированной среде МС. Микропобеги на ней развивались в крупные конгломераты, состоящие из хорошо развитых побегов с листьями и боковыми почками. Характерной особенностью развития эксплантатов на средах. Готре, Уайта, Хеллера явилась индукция пролиферации только тех пазушных меристем, которые имелись в пазухах листьев микропобега при помещении его на питательную среду. Заложения и развитая новых аксиллярных.меристем у микропобегов, культивируемых на этих средах, не было отмечено. У микропобегов, помещенных на среду МС, происходило интенсивное заложение новых пазушных меристем и развитие боковых побегов (табл. 1). Это нашло выра-

Таблица 1

Влияние минерального состава питательной среды на коэффициент размножения микропобегов вишни (НСР01 2,8) .

Среды П-3 П-7 Владимирская X

Готре 2,1 1,5 1,9 1.8

Уайта. 2,2 2,5 2,6 2,4

Хеллера 1.8 1,6 1,7 1,7

МС 14,2. £5,2 28,9 22.8

жение в повышении коэффициента - размножения, который имел максимальную величину на среде МС и существенно превышал значения, полученные на других средах у всех изученных форм. .

Таким образом, хотя все испытанные среды содержали идентичный набор органических добавок и 6-БЛП в одинаковой концентрации, пролиферации пазушных меристем на средах Готре,. Уайта и Хеллера не происходило. По-видимому, в появлении многочисленных побегов, развившихся в результате снятия эффекта апикального доминирования, помимо баланса между уровнем.цитокииинов и ауксшюв, существенную роль играет обеспечение развивающегося эксплантата минеральными веществамл. При достаточном снабжении минеральными веществами и одновременном введении экзогенного цнто-кишша в среду происходит индукция пролиферации пазушных меристем микропобега и образование разветвленной системы конгломерата почек и побегов.

3. Действие регуляторов роста на индукцию пролиферации пазушных меристем у подвоев и сортов вишни.

Сравнительная оценка индукторов пролиферации пазушных меристем, проведенная нами, выявила, что наибольшее

влияние на развитие аксиллярных меристем оказывал 6-БЛП. Количество образующихся боковых почек и побегов зависело от концентрации цитокинина (табл. 2).

Таблица 2

Влияние 6-БЛП на индукцию пролиферации пазушных почек у подвоев и сортов вишни (НСРс! 2,0)

......... Концентрация, мг/л

Подвои,

сорта. . 0 . 0,1: 0,5 1,0 2,0 5.0

П-3 .1 3.2 12,7 24.8 21,9 11,6

П-7 1 2.8 14.2 £6.8 19,6 10,1

ВП-1 ,1 2.4 9,1 19,7 15.6 9.8

Владимирская Д 2.6 20,3 27,8 19,1 3,0

Любская - ■1 3,9 13,8 12.3 8,4 4,9

Шубинха ■1. 3,2 Г- 11.9 ■ 14,7 10,4 5,8

5Г 3.3 14,0 20,1 14.8 8.2

6-БАП, примененный в интервале^ концентраций от 0,5 до 2,0 мг/л, в •зависимости от сортовой специфики вызывал раз^ витие максимального количества почек и побегов. Хотя 6-БАП в концентрации 2,0 мг/л вызывал уменьшение числа проросших почек, однако для большинства форм это снижение носило несущественный характер.

При изучении эффективности действия тиадиазурона с целью повышения развития пазушных меристем побегов сорта Владимирская достоверные различия в степени ветвления микропобега обнаружены в варианте, содержащем препарат в концентрации 0,1 мг/л. Коэффициент размножения в этом случае имел максимальное значение и был равен 2,7.

Картолин оказался неэффективным для стимуляции развития пазушных меристем у микропобегов сортов вишни.

ТИБК, как известно, является ингибитором транспорта ауксинов в растении и может вызывать пробуждение и рост боковых: почек. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что для вишни присутствия в среде одного ингибитора транспорта ауксинов (ТИБК) недостаточно, чтобы вызвать боковое ветвлением.микропобегов.

При отработке приемов, связанных с повышением эффективности процесса млкроразмножения было выявлено, что действие 6-БАП усиливается при совместном введении его с ТИБК в состав питательной среды. Макимальное количество почек и побегов развивалось на среде, содержащей ТИБК в концентрации 1,0 мг/л на фойе 6-БАП 1,0 мг/л (табл. 3).

; V Т а б л и ц а 3

Изменение коэффициента размножения у подвоев и сортов вишни -в зависимости от разной концентрации ТИБК на фоне 6-БАП (1 мг/л).

НСРС5 3,6

'Подвои, сорта- Концснтрадия ТИБК. мг/л

0 1,0 2.0 5,0 10,0

П-3 : 27,0 28.9 15,8 5.6 1,0 -

П-7 25,2 : 27,0 11,6 9,1 1,0 -

ВП-1 20,8 28,2 19,4 9.5 2,0 "

Владимирская - 14,6" 21,1- 16,8 13.6 12,0

Любская 14.7 19,8 11,9 8,0 6.2:

Шубинка: 12.8 13.9 11,1 10,4 5,7

"х 19,2 23,2 14,4 9,4 4,7'

В этом варианте коэффициент размножения в среднем по подвоям и сортам существенно превышал значения, полученные в контроле без ТИБК. Выявленный эффект связан с механизмом действия ТИБК, которая ннгибирует транспорт эндогенных аксннов и этим вызывает-относительное увеличенле содержания цитокининов, способствуя снятлю апикального доминирования совместно с 6-БЛП. Хотя механизм действия 6-БАП л ТИБК различен, но в данном случае они действуют в одном-направлении и вызывают повышение коэффициента размножения..'

Действие, оказываемое ТИБК в присутствии 6-БЛП на индукцию пазушных меристем, было эффективным для подвоя ВП-Ги сорта Владимирская.-Таким образом, сортовая специфика исходных форм вишни оказывала существенное влияние на эффективность действия примененных регуляторов.

4. Особенности развития микропобегов подвоев и сортов вишни в процессе клонального микроразмножения.

Процесс клонального млкроразмножения связан с периодическим перенесением формирующихся почек и микропобегов на свежеприготовленные среды. Для микропобегов вишни, как впервые нами показано, число проведенных пересадок оказывает существенное влияние на снятие эффекта апикального доминирования. В нервом пассаже, несмотря на присутствие в среде 6-БАП, эффекта снятия- апикального доминирования не наблюдали ни у одной из изучаемых форм, а коэффициент размножения для всех подвоев и сортов был равен 1 (табл.4).

Начиная со второго пассажа наблюдали боковое ветвление млкропобега, вызванное снятием апикального доминирования. Микропобеги. продолжали свой верхушечный рост и формиро-

- . Таблица 4

Пролиферация пазушных меристем:у микропобегов вишни в зависимости; - . от.числа проведенных пассажей (НСР01 1,8)

Подвоя, сорта № пассажа.

I II III IV V VI VII

П-3 1 10,7 10,1 13,7 22,1 14,4 • 13,1

ВП-1' 1 10,2 ш 14,0 23.8 20,3 10,5

Владимирская 1 11,8 11,8 . 14.1 19,5 11,5 ш.з.

Любская 1 5.1 6.5 10.8 14,4 6,8 . 8*7

Молодежная 1 9.6 8,6 14,6 13,4 16,8 11,5

Шубинка 1 5,4 7.3 8.6 20,2 6,5 9,5

1 8,9 9.3 12.6 18,9 12,7 10,9

вали:конгломераты почек. Характерной особенностью разви-' тия микропобегов в третьем пассаже явилось развитие отдельных: боковых- почек в побеги. Коэффициент размножения при этом-возрастает и достигает своей максимальной величниы-в пятом пассаже. В последующих пассажах было отмечено снижение пролиферации пазушных меристем до значений, близких, к начальному уровню культивирования. Процесс микро-размноження при эгом протекал в основном за счет формирования.боковых почек.

Таким образом, изучение особенностей развития микропобегов подвоев и сортов вишни в процессе размножения выявило их сходную реакцию на периодические пересадки. Степень ветвления микропобегов, связанная со снятием эффекта апикального доминирования, изменялась от пассажа к пассажу, несмотря на идентичность применяемых регуляторов и их сходные концентрации. Следовательно, для определения эффективности • действия регуляторов роста, применяемых для снятия эффекта апикального доминирования, необходимо использовать эксплантаты, прошедшие одинаковое число пересадок. • • .

5. Анатомические изменения строения микропобегов вишни в процессе клоиального микроразмноженля.

С: целью выявления происхождения структур, закладывающихся при снятии эффекта апикального доминирования, а также возможности формирования меристематических очагов в каллусной ткали, было проведено анатомическое изучение строения микропобегов вишни на' этапе микроразмножения.

Проведенное исследовалие -структуры эксплантатов свидетельствует о том, что микропобег перед очередным пассажем-имеет первичное анатомическое строение, характерное для иитактлой структуры. В его.верхней части расположена апикальная меристема, окруженная листовыми прлмордиями. Микропобег состоит из стебля, междоузлий и узлов с листьями, в пазухах которых находятся боковые почки. При помещении такого микропобега на питательную среду апикальная меристема.начинает функционировать, что приводит к его верхушечному росту. Заложение и развитие примордиальных почек происходит ниже верхушечной меристемы .побега, в результате чего сохраняется верхушечный конус нарастания. Апикальная меристема функционирует и продуцирует боковые примордии, дающие начало зачаточным листьям и в их пазухах боковым почкам. Формирующиеся боковые почки имеют все структурные элементы взрослого побега. Эти почки могут, развиваться в побег или вновь ветвиться, образуя таким образом симподиальную систему, которая слабо выражена из-за укороченных междоузлий.

Было отмечено, что в течение первого пассажа.у микропобегов наблюдали верхушечный рост без бокового ветвления. Однако во втором пассаже микропобеги не только росли в длину, но у них происходило активное пробуждение аксилляр-ных почек, с последующим формированием боковых побегов. Морфологическим выражением этого явилась система разветвленного конгломерата почек и побегов. Подтверждением бокового ветвления микропобега является, по нашимг данным, наличие непрерывной связи проводящих систем аксиллярных почек с центральным цилиндром стебля млкропобега в виде почечных (веточных) следов и мест их вхождения (почечных лакун) в стелу стебля.

При культивировании микропобегов на искусственных питательных средах на их базальной части в ответ на поранение развивалась каллусная ткань. По мнению некоторых авторов в ней может протекать процесс органогенеза, приводящий вследствие генетической нестабильности каллусной ткани к появлению неоднородного посадочного материала.

Как показали результаты анатомического исследования в образовании каллуса на базальном участке микропобегов вишни принимали участие живые клетки паренхимы коры, камбия, сердцевинных лучей, перимедулярной зоны и частично сердцевины. В результате их делений происходит разрастание базальной зоны, стебля в толщину, причем клетки покровных тканей не претерпевают столь частых делений. Следствием интенсивного образования каллусной ткани явилось вынесение покровных тканей, расположенных у основания побега, на поверхность каллуса..Боковые почки, расположенные

п базальной части-побега, оказывались таким образом; расположенными на поверхности каллуса.

Детальное изучение каллусной ткани выявило ее неоднородность. Помимо паренхимных каллусных клеток в ней наблюдали заложение раневого камбия, с функционированием: которого связано формирование так называемых гидроцитных тяжей (В. Г. Александров, 1966). Эта проводящая гидроцит-ная ткань, по нашим данным, не связана с проводящей системой центрального цилиндра, а ее формирование вызвано, вероятно, синтетическими регуляторами роста,- используемыми в составе питательной среды, или продуцированием иативных регуляторов роста развивающимися молодыми структурами микропобега. В каллусной ткани образования придаточных почек не было обнаружено. Раневой камбий продуцировал только гидроцитные элементы.-

Таким образом, использование метода культуры изолированных апексов для размножения подвоев и. сортов вишни приводит к пролиферации пазушных меристем за счет введения в питательную среду экзогенного цитокишша,-что обеспечивает в данных условиях культивирования генетическую однородность развивающихся побегов. Придаточные почки в первичных и вторичных тканях, а также в каллусе не закладывались. Каллус, развивающийся в базальной части микропобе-гоз вишни, не обладает органогенной способностью и в данных -условиях- культивирования, по-видимому, не может оказать отрицательного влияния на получение генетически однородного материала.

в. Изучение корреляционной связи между признаками у развивающихся in vitro микропобегов вишни.

Для того, чтобы количественно оценить материал, полученный на этапе микроразмножения без нарушения стерильных условий культивирования, была изучена корреляционная связь между рядом признаков, такими, как число листьев, побегов, их высота, масса конгломерата и коэффициентом размножения.

Высокий уровень связи был получен для следующих признаков:

между длиной побегов I группы-(с приростом менее 1 см) и числом листьев на них — 0,81**;

между длиной побегов II группы (с приростом более 1 см) и числом листьев на.них — 0,95**;

между длиной побегов I группы и массой — 0,55*; , между общим числом побегов и массой — 0,46*; между числом листьев на побегах I группы и массой — 0,47*;

между общей длиной побегов и числом листьев на них —

0у82**; . .

между числом: побегов I группы и массой — 0,54*.

Для каждой пары признаков, характеризующейся существенной связью, были получены уравнения регрессии, позволяющие практически рассчитывать величины интересующих признаков.

Поскольку число листьев на побеге соответствует числу аксиллярных меристем, которые могут быть" использованы как вторичные эксплантаты при последующем культивировании, то на основании полученной зависимости между длиной побегов и числом листьев на них можно оценить материал,.пригодный для размножения, не нарушая стерильных условий.

7. Укоренение микропобегов подвоев и сортов вишни на искусственных питательных средах.

На этапе укоренения процесс ризогенеза наиболее эффективно протекал па модифицированных средах МС и Уайта, при этом процент укоренившихся побегов достигал 90 и 84 соответственно. Однако заложение корней интенсивно проходило на всех испытанных средах, хотя среднее число образующихся корней существенно не различалось.

Среди индукторов корнеобразования (ИМК, ПУК и НУК) наибольшее число укоренившихся побегов было получено на среде, содержащей НУК. Однако при этом на базальном участке побегов наблюдали .интенсивное развитие каллусной ткани, которая затрудняла перенос пробирочных растений в нестерильные условия. Присутствие в среде ИМК." в концентрации 2,0 мг/л вызывало образование гипертрофированных корней. В связи с этим для укоренения побегов вишни целесообразно использовать ИМК в концентрации 1,0 мг/л.

В экспериментах, проведенных по изучению способа индукции корнеобразования, было показано, что обработка базаль-ных участков побегов водным раствором ИМК в концентрации 25,0 мг/л в течение 24 часов является более ■ эффективной, чем введение этого препарата.в состав питательной среды. Появление корней у основной части побегов при применении предварительной обработки индуктором ризогенезаг.было отмечено на 20-й день. При этом: у побегов формировалась, более сильиоразвитая корневая система. Присутствие в среде ауксиноподобного вещества замедляло развитие корней у ос новной части побегов до 40 дней, а у отдельных сортов (Мо лодежная) период укоренения составлял 50 дней.

Применение предварительной обработки побегов вишни концентрированным раствором ИМК сокращает этап, укоренения, дает высокий выход пробирочных растений,-имеющих хорошо развитую корневую систему. Однако этот способ индукции ризогенеза является более трудоемким,, а,, следовательно, менее приемлемым при массовом укоренении" побегов.

Эксперименты, проведенные по изучению процесса ризогенеза на искусственных питательных средах у побегов, под-

воев и сортов вишни выявили, что все изучаемые, формы имели высокий процент укоренения (табл. 5).

Таблица-5

Укореняемость (%) побегов вишни при различных способах индукции-

ризогенеза

Подвои, сорта Обработка раствором ИМК Введение ILMK в состав среды

П-7 97,3 77,8

ВП-1 83,3 74.3

Владимирская 96,0 84,6 "

Любская 78,0 76,9

Молодежная 74,7 80,0

Шубинка 95,0 83,3

Однако у побегов сорта Любская, несмотря на достаточно высокий процент укоренения, корни, развивались небольшой длины, со слабым развитием механических тканей. При перенесении таких пробирочных растений в нестерильные условия наблюдали их низкую приживаемость.

Для преодоления невысокой приживаемости' отдельных сортов, а также для получения привитого материала вишни in vitro нами были разработаны приемы микропрививки.

Получение привитого материала включало подготовку подвоя и привоя. Микрочеренок привоя получали от конгломерата почек и побегов. Он представлял собой верхушку, с 2—3 листьями и участком субапикальиой части стебля размером до 3 мм. В качестве подвоя использовали побеги трех типов: побеги, не имеющие корней, но предварительно обработанные раствором ИМК; побеги, не имеющие корней,.но после проведения микропрививки помещенные на среду, содержащую ИЛ1К; побеги с заложившимися зачатками корней.

Микропрививку проводили путем декапитации побега и нанесения на его апикальную часть клинообразного разреза. На такой побег, служащий подвоем, помещали микрочеренок привоя. Этот прием обеспечивал самозакрепление микрочеренков и хорошую совместимость тканей привоя и подвоя. Лучшие результаты были получены при микропрививке на побеги, имеющие корни, приживаемость которых достигала 80%'. В остальных случаях было отмечено неудовлетворительное срастание прививочных компонентов, однако процент приживаемости не превышал 15—20.

При проведении прививки на сорт Владимирская наблюдали хорошую совместимость прививочных компонентов-и их

\

приживаемость (83,3%). При использовании в качестве подвоя побегов ВП-1 процент приживаемости составлял 47,4.

Таким образом, используемые приемы проведения микропрививки обеспечивали хорошую совместимость прививочных компонентов подвоя и привоя, и способствовали получению привитого материала на ранних этапах развития растения. Это дает основание рекомендовать данный способ при массовом размножении особо ценных и трудноукореняемых сортов или в тех случаях, когда нежелательно получение корнесоб-ственного материала.

8. Перенесение пробирочных растений в нестерильные ус-ловля.

Растения вишни, полученные после проведения трех этапов клоналыюго микроразмножения, были перенесены в нестерильные условия. Наблюдения за развитием растений, высаженных в почву в середине декабря, показали, что они не возобновляли свой рост, несмотря на создание благоприятных условий. В том случае, когда перенесение пробирочных растений проводили в марте, то у них был отмечен верхушечный рост. В это время адаптация растений к новым условиях проходила удовлетворительно. Число прижившихся растений составляло 68...90%, исключение составил сорт Любская, для которого приживаемость не превышала 52%.

Наблюдения, проведенные за ростом и развитием растений в питомнике, выявили, что отличительной чертой растений, полученных через культуру изолированных апексов, является массовое образование боковых побегов (табл. 6).

Таблица 6

Особенности роста однолетних растений вишни в питомнике, полученных через культуру верхушечных меристем;

Подзон, сорт Высота, см Окружность штамба, см Побеги, шт. Длина побегов, см Сумма прироста см

I порядка II порядка I порядка II порядка

П-3 13(2,6 6,0 19,8 13,4 43,6 22,5 1232,4

П-7 133,0 &.0 17,0 7,0 42,5 27,2 903,2

Молодежная По, 2 5,0 15,0 21,2 41,1 20,0 1087,7

Одной из причин, вызывающих массовое ветвление побегов, является, по-видимому, последействие 6-ДДП. Образующиеся боковые побеги могут быть использованы при размножении вишни зеленым черенкованием, что значительно увеличит выпуск высококачественного посадочного материала при его массовом производстве.

выводы;

1. Коэффициент размножения микропобегов подвоев и сортов вишни, культивируемых на искусственныхпитательных средах, может достигать 5... 25 в зависимости от наследственных особенностей исходных форм.

2. Основным приемом, используемым при клональном микроразмножении подвоев и сортов вишни, является повышение пробудимости.и роста пазушных меристем микропобегов за счет введения в питательную среду 6-БАП, который не вызывает образования придаточных почек в первичных и вторичных тканях стебля, а также в каллусе. При этом в каллусе, развивающемся на базальном участке стебля, закладывается раневой камбий, который продуцирует отдельные элементы проводящей системы.

3. Из испытанных регуляторов роста, применяемых для индукции: пролиферации пазушных меристем микропобегов подвоев и сортов вишни, наиболее эффективным является 6-БЛП в концентрации 0,5... 2,0 мг/л в зависимости от сортовой специфики. Действие тиадиазурона на развитие боковых почек вишни существенно ниже. Картолин не эффективен для микроразмножения сортов вишнн. 6-БАП совместно с ТИБК вызывает существенное повышение коэффициента: размножения у сорта Владимирская и подвоя ВП-1.

4. Питательная среда, составленная на основе прописи Мурасиге-Скуга, является оптимальной для развития микропобегов испытанных форм вишни по сравнению со средами Готре, Уайта и Хеллера.

о. Изучение физиологических особенностей роста и развития микропобегов вишнн на искусственных питательных средах, с последующим перенесением микропобегов на свежую питательную среду, выявило статистически значимую зависимость между коэффициентом размножения микропобегов и числом проведенных пассажей.

6. Полученная корреляционная связь между длиной побегов н числом листьев на них позволяет оценивать количество растительного материала, пригодного для.клонального микроразмножения, без нарушения стерильных условий культивирования.

7. Процесс укоренения микропобегов подвоев и сортов вишни наиболее эффективно протекает на модифицированной среде Мурасиге-Скуга, с предварительной обработкой базаль-ных участков побегов раствором ИМК в концентрации 25 мг/л — 24*ч.

8. Разработанные приемы проведения микропрививки обеспечивают удовлетворительное срастание прививочных компонентов подвоя и привоя и дают возможность получать привитой

материал вишни в условиях in vitro, а также преодолевать низкую укореняемость отдельных сортов.

9. Растения вишни, полученные через культуру апикальных меристем, в первый год после посадки в питомник характеризуются сильным ростом и массовым боковым ветвлением.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Для размножения подвоев и сортов вишни методом кло-нального микроразмножения в качестве источника эксплантатов использовать изолированные почки с отрезком стебля и меристематические верхушки размером 200—300 мкм. Культивирование эксплантатов следует проводить на модифицированной среде Мурасиге-Скута, содержащей 6-БАП в концентрации 0,5... 2,0 мг/л. Для обеспечения на этапе микроразмножения увеличения коэффициента размножения в качестве добавки к питательной среде использовать ТИБК в концентрации 1,0 мг/л. Длительность всех пассажей при культивировании 3—6 недель. Для индукции процесса корнеобразования применять обработку базальных участков побегов раствором ИМК в конце^рации 25,0 мг/л 24 ч. Укоренение побегов проводить на разбавленной вдвое среде Мурасиге-Скуга.

Условия культивирования: длительность светового периода 16 ч., освещенность 3—5 тыс. люкс, температура.22—24°.

При перенесении пробирочных растений использовать субстрат, состоящий из смеси торфа и песка в соотношении 3: 1 по объему.

Разработанная система методов может быть использована для массового размножения безвирусных клонов вишни в системе производства здорового посадочного материала, а также для размножения ценных перспективных форм и новых интродуцироваиных сортов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации^

1. Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Микроразмкожение клоповых подвоев косточковых культур. — Краткие тезисы дохладов Всесоюзной научной конференции молодых ученых «Проблемы повышения эффективности современного садоводства». — Мичуринск, 1982 г., с. 71—72.

2. Олешко Е. В. Влияние минерального состава питательной среды на эффективность размножения вишни in vitro. Тезисы научно-практической конференции, посвяцшшсй 60-летию образования СССР.— Киев, 1082 г., с. 56.

3. Олешко Е. В., Трушечкин В. Г.. Высоцкий В. Л. Размножение клоповых подвоев вишни. — «Садоводство», 19S3 г., 3, с. 20—21.

4. Олешко Е. В. Особенности размножения вишни in vitro. Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции «Культура клеток растений и биотехнология».— Кишинев. Штиипца, 1983 г.. с, 114.

5. Трушечкин В. Г., Высоцкий В. Л., Олешко Е. В. Клональное микроразмножение подвоев и сортов вишни (информационный листок .W 66— 85). — М.: МОТЦНТИП, 1985 г., с. 11—4.

Подписано в печать 20.11.85 г. Тираж 100 экз. > Заказ 140

Типография -ВАСХНИЛ