Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ростовые и биосинтетические характеристики клеточных популяций Dioscorea Deltoidea при различных режимах культивирования

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ростовые и биосинтетические характеристики клеточных популяций Dioscorea Deltoidea при различных режимах культивирования"

РТБ О® . 8 №

На правах рукописи

КАНДАРАКОВ

Олег Феофанович

РОСТОВЫЕ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ОЮБСОИЕА ВЕЬТОША ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева

Российской Академии наук Научный руководитель - доктор биологических наук.

A.M. НОСОВ

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

B. Е. СЕМЕНЕНКО

кандидат биологических наук O.A. ГОРЕЛОВА

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский

проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

Защита диссертации состоится " "..... 1995 г. в " " часов .на

заседании специализированного совета К.053.05.14 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.

Адрес: 119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им.А.М.Горького Биологического факультета МГУ.

«К

Автореферат разослан "¿Л '^члГл1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук ^¿^^ 0. Г. Полесская

Актуальность темы. Клеточные культуры высших растений in vitro обладают рядом особенностей и спектром уникальных признаков (Бутенко 1986, Tatlcek et all.. 1991. Носов 1994 ). Специфика этих искусственно созданных клеточных популяций заключается в том. что они обладают рядом свойств, характерных и для исходного организма. Таким образом возникает вопрос - в какой мере на популяционные характеристики влияют эти частные свойства, которыми обладают составляющие популяцию клетки, а также степень необходимости в них для всей популяции в целом. Одно из этих свойств - способность к синтезу вторичных соединений, свойственных как растению в целом, так и клеткам растений in vitro. Однако вопрос о роли и степени необходимости вторичного метаболизма для суспензионных клеточных культур до настоящего времени остается открытым (Носов 1994).

Понимание причин активности вторичного метаболизма клеточных популяций in vitro будет способствовать дальнейшему развитию технологий получения различных вторичных соединений на основе биосинтетического потенциала растительных клеток in vitro. Особое внимание в этом случае уделяют стабильности и прогнозируемости процесса вторичного обмена в клеточных культурах растений (Dougall 1985, Shuler and Hallsby 1985. Бутенко 1986).

Наиболее эффективным подходом к решению изложенных проблем является исследование клеточных культур в режиме проточного культивирования. Направленное изменение гетерогенности популяции при проточном культивировании и ее реакции на эти условия можно изучить по совокупности интегральных популяционных характеристик. В качестве одного из популяционных признаков можно использовать содержание вторичных соединений. При этом наиболее целесообразно сопоставить при эквивалентных экспериментальных условиях реакции двух разных штаммов-продуцентов, различающихся по физиологическим признакам, но синтезирующих одни и теже вторичные соединения. Это даст возможность более полного анализа закономерностей, протекающих в растительных клеточных популяциях in vitro.

Цель настоящей работы - исследовать взаимосвязь синтеза вторичных соединений штаммами культуры клеток Dioscorea deltoidea с изменчивостью интегральных популяционных характеристик при чередовании периодического и проточного культивирования.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать систему проточного культивирования растительных клеток с целью изучения закономерностей вторичного метаболизма

и изменчивости интегральных характеристик клеточных популяций.

2. Оценить стабильность цитофизиологических характеристик клеточных популяции (рост, синтез фуростаноловых гликозидов. мито-тическая активность, плоидность и жизнеспособность) при проточном культцвировании и охарактеризовать возможные связи между ними.

3. Сопоставить выявленные закономерности вторичного метаболизма и диапазон изменчивости интегральных популяционных характеристик двух штаммов тоэсогеа йеИо1йеа при культивировании.

4. Проанализировать на основе экспериментальных данных роль вторичного метаболизма' в клеточных популяциях обоих штаммов О1озсогеа йе1£огйеа, а также оценить возможность прогноза и управления биосинтетической активностью этих популяций.

5. На основе полученных экспериментальных данных разработать алгоритм оптимального режима культивирования растительных штаммов-продуцентов вторичных соединений.

Научная новизна. Установлены закономерности изменения содержания фуростаноловых гликозидов при комбинации проточного и периодического режимов культивирования. Впервые показана активизация синтеза фуростаноловых гликозидов для изучаемых клеточных популяций при проточном культивировании. Установлены условия, характер и различия этой интенсификации для штаммов ИФР-Д-1 и ИФР-ДМ-0.5. Как существенный и воспроизводимый факт установлено, что при приближении содержания фуростаноловых гликозидов к экстремальному значению (максимуму) при проточном культивировании, наблюдается быстрое снижение жизнеспособности популяций обоих изученных штаммов Бгозсогеа йеИо1йеа. Активизация вторичного метаболизма сопряжена с подавлением митотической активности обоих штаммов, уровень которой при проточном культивировании достигал максимально возможных значений, детерминированных длительностью митотического цикла каждого штамма. Установлено значительное преобразование уровня плоид-ности штаммов при проточном культивировании.

Практическая ценность. Предложен алгоритм культивирования высокопродуктивного штамма ДМ-0.5, оптимальный для синтеза фуростаноловых гликозидов. Разработана схема культивирования (комбинация периодического и проточного культивирования), которая дает возможность оценить диапазон, продуктивность и стабильность синтеза вторичных соединений штаммов-продуцентов. Получена воспроизводимая Физиологическая реакция клеточных популяций Бгоэсогеа йеИо1йеа, выраженная в закономерных изменениях активности вторичного метабо-

лизма при проточном культивировании с высокими скоростями разбавления. Последнее не только значительно расширяет экспериментальные возможности в дальнейших исследованиях (известный ответ популяции). но и дает возможность прогноза и управления биосинтетической активностью клеточных популяций.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на: VII Международной конференции по культуре клеток и биотехнологии. Алма-Ата. (Казахстан), 1993; Института женьшеня и табака. Тайд-жон.(Южная Корея) 1994; расширенном семинаре Естественно-Математического факультета Гумбольд Университета. Берлин (Германия). 1994; ежегодных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР и отчетах кафедры Физиологии растений Биологического факультета МГУ.

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 2 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ... страницах машинописного текста, содержит ... рисунков и 2 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (..... наименований).

Сокращения, условные обозначения и термины: N - число клеток (кл/мл); М<3 - сухая масса клеток (сухая биомасса). г/л; М - биомасса (сырая биомасса клеток), г/л; Г - фуроста-ноловые гликозиды процент от М<3; Ру - концентрация фуростаноловых гликозидов, мг/л; Б - общее содержание Сахаров (%); V- процент живых клеток; ПНЙ и Пг . продуктивность по сухой биомассе (г/л/сут.) и фуростаноловым гликозидам (мг/л/сут.) соответственно. МЦ - мито-тический цикл; удельная скорость роста по Ш (сут."1).

ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯ

Как отмечено выше, при исследовании клеточных культур наиболее целесообразно изучать клеточные штаммы с дискретными характеристиками. В исследованиях подобного рода культуры - продуценты вторичных соединений дают возможность совместить проведение фундаментальных и прикладных исследований.

Объектами исследования служили два штамма культуры клеток ОгоБсогеа йеНогйеа. Штамм ИФР-Д1 получен в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФР АН СССР из корневища растения Моэсогеа йеНо1йеа в 1969 г. М. А. Саркисовой и Р. Г. Бутенко (Саркисова 1973). Штамм ИФР-ДМ-0.5 получен в 1972 г. С.Л. Карановой после обработки клеток штамма ИФР-Д-1 мутагеном Н-нитрозо-И-метилмочевиной

(Каранова и др.. 1975). В дальнейшем изложении для краткости аббревиатура "ИФР" в названии штаммов будет опускаться.

Оба штамма стабильно поддерживают активность вторичного метаболизма в условиях in vitro, однако диапазон изменения удельного содержания фуростаноловых гликозидов при субкультивированиях может варьировать (Носов 1992).

Штаммы содержат гликозиды в фуростаноловой форме. Фермент, катализирующий превращение фуростаноловых гликозидов в спиростано-ловые: олигофуростанозид-специфичная (5-глюкозидаза (Гуриелидзе и др.. 1986. 1987). не активен у штамма ДМ-0.5 (Воробьев 1991). В экстрактах, полученных из клеток штамма Д-l активность этого фермента выявлена, однако в интактных клетках эта реакция не осуществляется (Бутенко и др.. 1992).

Максимальное количество фуростаноловых гликозидов (до 12% от сухой массы клеток) отмечено для штамма ДМ-0,5, минимальное - для штамма Д-1 (1 + 2%) (Носов 1992).

Существенные различия между штаммами Д-1 и ДМ-0.5 наблюдали по пролиферативной активности популяций в цикле выращивания (Смоленская 1993):

- по уровню митотической активности (первый пик - 4.6%, второй 3.2% у штамма Д-1, 6.3% и 4.8% соответственно для штамма ДМ-0.5).

- по кинетике включения в клетки 3Н-тимидина ( 60- 70% ядер клеток штамма ДМ-0,5 включают 3Н-тимидин уже ко 2 + 3 суткам культивирования, для штамма Д-1 этот процесс происходит существенно медленнее).

- по длительности периодов МЦ: штамм Д-1; Gx- 7.6 часа; S -8.1 часа; Gz - 9-10.5 часа ; М - 1.5 часа. Штамм ДМ-0.5; Gt- 12.6 часа; S - 5.8 часа ; G2- 2.2 часа; М - 3.8 часа.

Штаммы различались также по цитогенетическим и физиологические показателям (число хромосом в клетках, агрегированность. размер клеток, индекс роста, продуктивность и т.д.) ( Воробьев 1991, Носов 1992).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы поддерживали при температуре - 26°С, на основной среде Мурасиге и Скуга с добавлением 0,1 мг/л кинетина и 3% сахарозы. Кроме того среда для штамма Д-1 содержала витамины по Стаба, 2,4-Д -1.0 мг/л. Штамм ДМ-0,5 поддерживали на среде без витаминов, концентрация 2,4-Д - 0,25 мг/л.

В работе использовали биореакторы двух типов: АК-210 (СКБ БП, Пущине) и Ml'-107 (Now Brunswick, CIIIAi.

Подачу свежей среды производили непрерывно, отбор суспензии осуществляли также непрерывно l>. биороакторе АК-210 и дискретно (один раз в сутки) - в биореакторе MF-107. Величину скорости протока D при культивировании в АК-210 рассчитывали как D=AV/V, а в экспериментах, проводимых в MF-107 как D = (Dmax + Dmin)/2 . где Dmax =AV/V ; DmIn = AV/(V+AV); V - объем суспензии в биореакторе. AV - объем среды поданной в биореактор за сутки, равный объему отобранной суспензии. Скорость вращения мешалки - 100 об/мин, бар-ботаж 0.5 л/л мин. Эти параметры оставались неизменными при культивировании в биореакторе АК-210. Для биореактора MF-107 при достижении плотности культуры 5 г/л сухой биомассы скорость вращения увеличивали до 360 об/мин, барботаж до 1.2+0.2 л/л мин. При переходах с проточного режима культивирования на периодический клетки осаждали и часть безклеточной культуральной жидкости заменяли на свежую питательную среду.

Концентрацию сухой и сырой биомассы, число клеток, плоидность и митотический индекс определяли по общепринятым методикам (Бутен-ко 1964. Паушева 1988).

Жизнеспособность популяции оценивали как процентную долю клеток, неокрашенных 0.1% водным раствором феносафранина.

Содержание фуростаноловых гликозидов определяли спектрофото-метрически (Васильева и др. 1987). Для химического анализа использовали лиофильно высушенные образцы биомассы.

Содержание Сахаров в среде определяли фенольным методом (Dubois 1956).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Интегральные характеристики клеточной популяции штамма Д-1 при проточном режиме культивирования.

Первый эксперимент был посвящен исследованию реакций клеточной культуры, штамма Д-1 на малые и большие скорости разбавления при проточном культивировании (рис.1).

При скорости разбавления D=0.10 сут."1 культуру поддерживали в течении 10 суток. Содержание фуростаноловых гликозидов в клетках постепенно снизилось за этот период с 2.4% до 1.6%. Жизнеспособность популяции в течении этого периода находилась в диапазоне 60 * 75%. На 29 сутки культивирования скорость разбавления увеличили до D=0.25 сут."1. Содержание фуростаноловых гликозидов при данной

СУТКИ

Рис.1. Характеристики штамма Д-1 при культивировании.

(Условные обозначения см.стр.5). Пунктирные линии - время

включения и выключения протоков, цифры - скорости разбавления.

-1 -1 1- 0=0.10 сут. ; 2 - БЮ.25 сут.

скорости разбавления было на уровне 1.4%, жизнеспособность снизилась до 45%.

В этом эксперименте реакции клеточной популяции были различны при культивировании со скоростью разбавления 0=0.10 сут."1 и 0=0.25 сут."1 как по синтезу фуростаноловых гликозидов так и по жизнеспособности.

Поскольку различия в реакциях растительных клеточных популяций на малые и большие скорости разбавления при проточном культивирование могут оказаться весьма значительными, в дальнейших исследованиях штамма Д-1 было решено применять скорости разбавления выше 50% от максимальной зарегистрированной для данного штамма (0.25 сут."1) и не модифицировать состав питательной среды.

2. Интегральные характеристики клеточной популяции Д-1 при комбинации периодического и проточного режимов культивирования.

Исходя из изложенных выше результатов, была разработана новая схема эксперимента для биореактора МР-107, главной особенностью которой явилось применение комбинации периодического и проточного режимов культивирования. Это позволило более детально исследовать штамм Д-1 по признаку "синтез фуростаноловых гликозидов" при изменении одного фактора - скорости протока (рис.2 А-В). Цитогенети-ческие параметры дали возможность более полно охарактеризовать состояние клеточной популяции при культивировании (рис.3.4).

Особый интерес представляет закономерность синтеза фуростано-

ловых гликозидов клеточной популяцией при проточном культивировании со скоростями разбавления 1)-0. 14 пут."1 и 1)=0. 23 сут."1. при которых содержание фуростаноловых гликозидов имело минимальное и максимальное значение. Минимальное содержание фуростаноловых гликозидов наблюдалось примерно через промежуток времени Т=1Л). За это время из системы удаляются преимущественно непролиферирующие клетки, время покоя которых превышает время удержания биомассы в биореакторе Т=1Д) (рис.2). Далее, в обоих случаях происходит постепенно е увеличение содержания фуростаноловых гликозидов. По мере приближения к максимальному значению по содержанию фуростаноловых гликозидов наблюдается снижение жизнеспособности популяции при данных скоростях разбавления. Поскольку скорости протока были различны, изменения жизнеспособности популяции и содержания фуростаноловых гликозидов при 0=0.14 сут."1 оказались растянутым во времени, тогда как при 0=0.23 сут."1 - сжатым (рис.2).

Из полученных результатов следует, что количественное содержание фуростаноловых гликозидов может служить мерой биосинтетической активности популяции и, следовательно, определенного физиологического состояния.

Наблюдаемые явления можно объяснить следующей гипотезой. Снижение содержания фуростаноловых гликозидов после включения двух указанных протоков, вероятно, связано с уменьшением спектра возможных физиологических состояний до минимума (широта спектра непосредственно определяется скоростью разбавления). После этого происходит постепенное смещение спектра физиологического состояния клеток в популяции в направлении наиболее оптимального для данных условий (рис.2). В данном эксперименте указанные изменения начали происходить с 45 и с 80 суток культивирования. Учитывая условия в которых находится клеточная популяция и характер изменения содержания вторичных соединений с вышеупомянутых моментов времени можно предположить, что наблюдаемое смещение связано с постепенным увеличением доли клеток в популяции, находящихся в этом физиологическом состоянии. Последнее может привести к потере жизнеспособности популяции в целом (как следствие двухэтапного снижения гетерогенности популяции).

Уменьшение содержания фуростаноловых гликозидов в последующих, после проточного культивирования со скоростями разбавления 0= 0.20 сут."1, 0= 0.15 сут."1; 0= 0.23 сут."1 периодических режимах культивирования (рис.2Б.) также подтверждает, что состав популяции

5 С/.)

з

2.5 2 1.5 1

В.5 8

28

4в

еа

88

168

Н (*4.8*10«кл/мл)

У ш

г-!"-;.....;•••«■ • • * .-I; 1 Г 1 1 .................. 3 ... ..........Г" 1 1 ...........п 1

1 к 1 \ 1 « 1 «

у /¡\ ; : * х .. / V \\ 1 \\

х • V \ * 11 * \| ./С 1 / / • V

' ! 1 Л. 1 : •......: : .......... / \ 1 /; • \ I / Т ; ' \ • /: < V/ \ :

м ;!: „ 4 ...........:......!......ЦУ

4.2 3.7 3.2 2.7 2.2 1.7 1.2

128 СУТКИ

1вз 128

СУТКИ

Рис.2 (А-Б). Изменение интегральных популяционных характеристик при комбинации проточных и периодических культирирований штамма Д-1. (Условные обозначения см.стр.5)

Стрелками указаны Еремя включения и выключения

протокое. цифрами - скорости разбавления. 1 - 0=0.20 -1 -1 -1 сут. : 2 0=0.15 сут. ; 3 - 0=0.14 сут. ; 4 -

ь=0.23 сут."1.

подвергается определенному преобразованию при проточном культивировании. Следовательно в зависимости от скорости протока и длительности его воздействия на клеточную популяцию каждое физиологическое состояние популяции может быть представлено в различных соотношениях (различными частотами) в последующем периодическом культивировании (рис. 2).

Вышеизложенная интерпретация экспериментальных данных сформулирована с точки зрения преобразования клеточной культуры при проточном культивировании на основе изменения содержания фуростаноло-вых гликозидов. Оценить возможность предполагаемых событий, проходящие в клеточной популяции, также возможно на основе динамики изменения митотической активности клеточной культуры (рис. 4).

При проточном культивировании с заданными скоростями разбавления происходит отбор пролифелирующих клеток в популяции, который постепенно приводит к максимальной митотической активности клеточной популяции. Митотическая активность определяется по величине митотического индекса. Следовательно, максимум этой величины де-терменирован вероятностью нахождения клеток в этой фазе НЦ. последнее непосредственно зависит от общей продолжительности митоза. В целом, доля клеточной популяции находящейся в той или иной фазе МЦ будет определяться непосредственно продолжительностью каждой фазы цикла (условие асинхронного деления всех клеток в популяции).

Для штамма Д-1 продолжительность отдельных фаз МЦ следующая: С,- 7.6 часа; Б - 8.1 часа; - 9-10.5 часа ; М - 1.5 часа (Смоленская 1993). Отсюда максимальная митотическая активность штамма Д-1 при проточном культивировании не должна превысить ~6%. Превышение этой величины при любом режиме культивирования будет указывать на синхронизацию делений клеток в популяции. С другой стороны. митотическая активность ниже этой величины будет указывать на существование фазы покоя - С0 - в периодическом культивировании и возможность существования этой фазы у некоторой доли клеток в популяции при проточном.

Из полученных результатов следует, что на 43 сутки культивирования при 0=0.14 сут.клеточная популяция достигает максимума митотической активности (митотический индекс -6%) (рис.3). Характер изменения и максимальная величина митотической активности популяции при проточном культивировании (0=0.14 сут."') подтверждают вышеизложенный анализ экспериментальных данных, основанный на хи.на-мике изменения содержания вторичных соединений при проточном куль-

В:0.23су;1

4 13 17 2 5 30 36 43 51 59 64 78 76 79 85 88 93 100194108112

врш кушищюа&ник (сутки) Рис.3. Изменение митотической активности штамма

Д-1 при комбинации культивирования.

проточного и периодического

Вголэси?1 »=0.14 су;1 ВзО.гзсиг1

4 13 17 2 5 30 36 43 51 59 64 70 76 79 85 88 93 100104108112

время культивирования (сутки) ВЯн Цгм ЕЗзн £53 «н СЗнм

Рис.4. Изменение уроьня плоидности штамма Д-1 при комбинации проточного и периодического культивирования.

тивировании. Важно, что активизация синтеза вторичных соединений при проточном культивировании (0=0.14 сут."1) сопровождалась подавлением митотической активности клеточной популяции. Отметим также постепенное увеличение частот полиплоидных клеток при этом режиме культивирования (рис. 2;3:4).

3. Интегральные характеристики клеточной популяции ДМ-0.5 при комбинации периодического и проточного режимов культивирования.

В данном эксперименте при всех периодических режимах культивирования удельное содержание фуростаноловых гликозидов всегда увеличивалось, за исключением небольшого снижения содержания фуростаноловых гликозидов в периодическом культивировании после проточного (0=0.23 сут."1) (рис.5 А-В). Последнее, по видимому, связано с падением жизнеспособности популяции, которое продолжалось в этот период (рис.5 Б,В). При скорости разбавления 0=0.23 сут."1 характер изменения содержания фуростаноловых гликозидов штамма ДМ-0.5 был аналогичен изменению данного параметра при скоростях разбавления 0=0.14 сут."1 и 0=0.23 сут."1 исходного штамма Д-1 (рис. 2,5). Однако, при меньших скоростях разбавления 0=0.14 сут."1 и 0=0.11 сут."1 удельное содержание фуростаноловых гликозидов продолжало увеличиваться и после перехода с периодического на проточное культивирование. Закономерности изменения содержания фуростаноловых гликозидов при 0=0.14 сут."1 и 0=0.11 сут."1 у штамма ДМ-0.5 отличались в целом как от изменения данного параметра при аналогичных условиях для штамма Д-1. так и между собой. Только при скорости разбавления 0=0.11 сут."1 клеточная популяция дважды активизировала синтез вторичных соединений, содержание которых стремилось к некоторому критическому для популяции значению. Различие в изменение данного параметра при разных скоростях разбавления, вероятно, обусловлен как минимум двумя причинами: пфвая - увеличение скорости вторичного метаболизма при больших скоростях разбавления, при этом регистрации изменения не происходит в силу быстроты данного процесса во времени: вторая - уровень жизнеспособности популяции после максимальной интенсификации вторичного метаболизма данной клеточной популяцией при проточном культивировании. Следовательно, возможно, что при 0=0.25 сут."1 - Д-1 и 0=0.23 сут."1 - ДМ-0.5 основная причина - первая (рис.1.5). а при 0=0.14 сут."1 в длнном эксперименте - вторая (рис.5).

,лк и при проточном культивировании штамма Д-1. при достижении критического значения по содержанию вторичных соединений быст-

- 1А -

И (г/л)

ее

50 40 38 20 10 0

2.8 2.4 2 1.6 1.2 0.8

20

48

68

68

20

1 40

60

60

20

40

60

80

МШл)

г-!........... 1 :2 .„&\........1.з..............|..........А...и

ь # * 1 • "

I ! 1 См

К 1 1 ! ГЦ !■

: | | : ;

18

а

в

А

2

188

128 СУТКИ

5 (X) 1 С/.)

* :\ • V • : > '"Т"в...........3..... • ; /\ П • гГ 1 | / *Л \ )* г в и

. : v 17 1. • а • с» ГЧП'» ц[ \ V / \ 1И \ Я • / \ • ш V/ \ : тЛ * х *гГ 0 к : Г|| !

• X '-и • • ■: н , : : 1 : I \» . !Х X 3

• ■: , 1) 1 Л л : V • ■: , : .у • г : • с | »1 ■ : ь5 П

100

120 СУТКИ

К (*4.8*104) Их)

400 ......Ж...... "■уЬ •г.............. 1 Ч , V. .........¡3................ ......... ........|— п 100

300 А !; Л П 1 Й—[К •VI Л • и в 80

Ж И *'. Ш • /| : )

200 дъ ..и 1\.т;1..... / • ' Т ' ГЯ • 1 1 7 ♦ • 1 /Г : 60

у 1 лд: 1 Г • тс "л ( 1 1 1 с®7 : ш I л • : 40

100 пт .....1.....г*** I с • • 1 • I • • < • • .........*.................. ........ ........ 20

0 : 1 1 ! • • • • • • • 0

100

120 СУТКИ

Рис.5 СА-В). ' Изменение интегральных популяциоыных

характеристик штамма ДМ-0.5 при культивировании. (Условные

обозначения см. стр.5). Стрелками указаны время включения и

выключения протоков, цифры - скорости разбаЕ-шния.'

-1 -1 -1 1 - 0-0.23 сут. ; 2 - 0=0.14 сут. ; 3 - 0=0.11 сут. .

ро начинает снижаться жизнеспособность популяции и у мутантного штамма ДМ-0.5, вплоть до разрушения клеточной культуры на 101 сутки при 0=0.11 сут. (рис. 5).

В целом, максимальная величина митотического индекса штамма ДМ-0.5 также детерменирована вероятностью нахождения клеток в этой фазе МЦ. Следовательно, максимальная митотическая активность штамма ДМ-0.5 при культивировании не должна превышать -16% (при упомянутых выше условиях), поскольку продолжительность фаз МЦ штамма №1-0.5 составляет С^ 12.6 часа: Б - 5.8 часа ; 2.2 часа; М -3.8 часа (Смоленская 1993).

При 0=0.11 сут."1 популяция клеток достигла максимальной ми-тотической активности (-15,3%). на 80 сутки (рис.6). Последующее снижение митотической активности также было сопряжено с активизацией синтеза вторичных соединений. Отметим, что частота полиплоидных клеток в этот период быстро падала (рис.7).

Выше были обсуждены закономерности изменения содержания фу-ростаноловых гликозидов при проточном культивировании для штамма ДМ-0.5. Сопоставляя их с результатами, полученными для штамма Д-1, можно отметить следующие различия:

- В периодическом культивировании удельное содержание фурос-таноловых гликозидов у штамма ДМ-0.5 всегда постепенно увеличивалось. тогда как для штамма Д-1 было отмечено как увеличение, так и уменьшение. В частности, удельное содержание фуростаноловых гликозидов снижалось в периодических режимах, следующих за проточными культивированиями с 0=0.20 сут."1, Б= 0.15 сут."1 и 0= 0.23 сут..

- После перехода на проточное культивирование (0=0.14 сут."1, 0=0.11 сут."1) у штамма ДМ-0.5 содержание вторичных соединений продолжало увеличиваться , тогда как у штамма Д-1 это происходило после промежутка времени равным примерно Т=1/0 (0=0.14 сут."1, 0=0.23 сут."1).

Однако, несмотря на ряд частных различий, наблюдавшихся между штаммами при культивировании, можно отметить общие закономерности:

- Стабильность (неисчезаемость) синтеза фуростаноловых гликозидов в клеточных популяциях обоих штаммов при культивировании.

- Активизация синтеза вторичных соединений клеточными популяциями начинается после достижения максимальной митотической активности при 0=0.11 сут."1 для ДМ-0.5 (-80 сутки) и 0=0.14 сут."1 для штамма Д-1 (-43 сутки).

-16-

9=0.23 сут ^ 6:0.14 си?1

6=0.11 суГ1

5 13 16 19 26 34 38 50 И 57 И 72 80 99 38 160

время культивирован« (сутки)

Рис.6. Изменение митотической активности штамма ДМ-0.5 при комбинации проточного и периодического культиЕ-ироЕания.

6:0.23 су т^- 6:0.14 сы?1 I-1

5:0.11суг1

5 13 16 13 26 34 38 50 54 576472 60 90 98 160

вреия купыиифовакия (суш)

■ и ШЗп ^4п Е3>4п

Рис.7. Изменение уровня плоидности штамма ДМ-0.5 при комбинации проточного и периодического культивирования.

- Жизнеспособность популяции падает при приближении к критическому значению по содержанию фуростаноловых гликозидов при проточном культивировании. Это может быть следствием предельного увеличения доли клеток в популяции в одной из фаз клеточного цикла, нахождение в которой сопряжено с синтезом Фуростаноловых гликозидов (сужение гетерогенности популяции), а не негативное воздействие этих соединений на жизнедеятельность клеток. Последнее маловероятно. поскольку, во-первых, содержание фуростаноловых гликозидов не превышает диапазона их накопления для данных штаммов в периодическом культивировании. Во-вторых, эти соединения не токсичны для клеток (Носов 1992).

- Сходность условий культивирования, при которых возникает необходимость в интенсификации вторичного метаболизма (рост культур при проточном культивировании не был лимитирован источником углерода, и, вероятно, иным компонентом питательной среды, поскольку в обоих случаях достигнута максимальная пролиферативная активность популяций).

- Клетки обоих штаммов не в состоянии интенсивно пролифериро-вать длительное время.

Совокупность экспериментальных данных дает основу для анализа возможных причин интенсификации синтеза фуростаноловых гликозидов для изучаемых клеточных популяций. Некоторые авторы связывают изменение активности вторичного метаболизма со смещением плотности клеток (Deus and Zenk 1982, Chaprin and Ellis 1984, Zamman 1988, Кунах 1994, Федосеева 1995).

Как следует из экспериментальных данных, клеточные популяции обоих штаммов претерпевают значительные изменения в распределении плоидности (рис.4;7). Однако жесткой связи между увеличением синтеза фуростаноловых гликозидов и увеличением частоты клеток определенной плоидности при проточных культивированиях не было зарегистрировано. Это можно проследить, например, по распределению гаплоидных клеток в популяции штамма ДМ-0.5. Увеличение частоты гаплоидных клеток более чем в два раза при проточном культивировании (на 64 сутки доля гаплоидных клеток - 17.8%, содержание фуростаноловых гликозидов -7.8%; на 100 сутки доля гаплоидных клеток -54.8%, содержание фуростаноловых гликозидов -7.3%) не влечет за собой изменения содержания фуростаноловых гликозидов в клеточной популяции (рис.5,6). Аналогичный вывод можно сделать и по экспериментальным данным полученными со штаммом Д-1 (рис.2;4).

Учитывая изложенное выше, следует принять, что интенсификация синтеза фуростаноловых гликозидов непосредственно не связана со смещением модального класса плоидности в клеточной популяции.

Как было отмечено, экспериментально зарегистрированные величины мптотического индекса при проточном культивировании обоих штаммов (0=0.14 сут."1 - Д-1, Б=0.11 сут."1 - ДМ-0.5) совпадают с теоретически ожидаемыми максимальными величинами этого параметра при условии асинхронного деления всех клеток в популяции. В этот момент времени происходит выпадение или максимальное сокращение фазы покоя - в обоих штаммов, что равносильно снижению частоты клеток в популяции, находящихся в этой фазе, до минимума. Линейный характер изменения митотического индекса до и после достижения его максимального значения при проточном культивировании (Б=0.11 сут."1) штамма ДМ-0.5 может, в частности, отражать изменение доли клеток в популяции находящихся в одной из фаз клеточного цикла, включая фазу покоя - С0 (поскольку доля клеток находящихся в фазе митоза падает). Это предположение исходит из характера активности вторичного метаболизма при различных режимах культивирования.

В целом, из приведенных экспериментальных данных можно предположить, что интенсификация синтеза вторичных соединений обоих клеточных популяций Мозсогеа йеНогйеа при проточном культивировании является физиологической реакцией клеточной популяции на сужение ее гетерогенности в целом, и снижения доли клеток, находящихся в фазе покоя С0. в частности.

4. Продуктивность и алгоритм оптимального культивирования штаммов Д-1 и ДМ-0.5.

В целом продуктивность по биомассе штамма Д-1 при проточном культивировании выше, чем у штамма ДМ-0.5 (рис.8А; 9А). При скорости разбавления 0=0.14 сут."1 продуктивность штамма Д-1 находилась на уровне 1 г/л/сут. и 0.8 г/л/сут. у штамма ДМ-0.5 при Б=0.11 сут."1. Продуктивность штамма Д-1 по фуростаноловым глико-зидам постепенно увеличилась до 23 мг/л/сут. при скорости разбавления 0=0.14 сут."1 и варьировала около 50 мг/л/сут. у штамма ДМ-0.5 при Б=0.И сут."1 (рис.8Б; 9Б). При переходе на скорость разбавления 0=0.23 сут."1 продуктивность штамма Д-1 как по биомассе так и по фуростаноловым гликозидам вначале резко увеличилась, затем также резко снизилась. Аналогичную картину по этим характеристикам наблюдали и у штамма ДМ-0.5 при скорости разбавления 0.14 сут."1. Отрицательная продуктивность по вторичным соединениям

70 60 50 40 30 20 10 0

0 10 20 30 40 50 60 70 ВО 90 100 110 120

СУТКИ

Пг<МГ/71/СУТ.)

3 • А4

Б : : 1 1

т » • , 1 , 1

• а 1 1 • 1 / \

/\ 1 / \

7 v »т ■ • * • » \ • / \ v

' 1 v. :, : 1, 1 1 1 1*1 1 1 1 1 1

Рис.8 (А-Б). Изменение продуктивности штамма Д-1: А - по сухой биомассе; Б - по синтезу Фуростанолосых глпкозидог.. (Условные обозначения см. стр.5 ). Обозначения Бремени включения и выключения протоков и скорости разбавления те же что на рис.2.

СУТКИ

СУТКИ

Рис.9 СА-Б). Изменение продуктивности штамма ДМ-0.5: А - по сухой биомассе; Б - по синтезу фуростаноловых гликозидов. (Условные обозначения см. стр.5 Обозначения времени включения и выключения протоков и скорости разбавления те же что на рис.5.

СУТКИ СУТКИ СУТКИ

Рис.10 СА-6). Характеристики штамма Д-1 при культивировании по разработанному алгоритму. (Условные обозначения см. стр.5 ).

Пунктирная линия - время включения протока, цифра - скорость

—^

разбавления. 1 .- 0=0.10 сут.

при скорости разбавления В=0.23 сут."1 (ДМ-0.5) указывает на резкое снижение содержания фуростаноловых гликозидов в клетках.

При проточных культивированиях зарегистрирована высокая продуктивность клеточных штаммов по фуростаноловым гликозидам 67 мг/л/сут. для Д-1 и 85 мг/л/сут. для ДМ-0.5. Следовательно, проточное культивирование можно эффективно использовать для достижения и поддержания высокой продуктивности клеточных культур.

Учитывая закономерности синтеза фуростаноловых гликозидов клеточными популяциями, изменения продуктивности культур по биомассе и синтезу данных вторичных соединений можно предложить алгоритм оптимального культивирования изучаемых штаммов по биосинтезу фуростаноловых гликозидов:

1. Комбинация периодического и проточного режима культивирования с малыми скоростями разбавления (О не больше 40-50% от максимальной удельной скорости роста популяции).

2. Переход с периодического режима культивирования на проточный в стадии экспоненциального роста клеточной популяции.

3. Время удержания клеточной популяции при проточном культивировании с заданными скоростями разбавления не менее Т=1*(Мма-0)"1• и не более 2Т, где Т- время удержания клеточной популяции при проточном культивировании, -максимальная удельная скорость роста клеточной популяции, Б - применяемая скорость разбавления при проточном культивировании (не более 40%-50% от ^д).

По разработанному алгоритму был поставлен эксперимент, подтвердивший его эффективность (рис. 10 А-В). Была установлена определяющая роль первого шага алгоритма, от которого зависела эффективность всей предложенной схемы культивирования. Продуктивность штамма Д-1 при таком режиме культивировании достигала 2.5 г/л/сутки по биомассе и 100 мг/л/сутки по вторичным соединениям. В этих условиях продуктивность штамма Д-1 по фуростаноловым гликозидам достигла продуктивность мутантного штамма-сверхпродуцента.

При культивировании штамма-сверхпродуцента по данному алгоритму продуктивность клеточной культуры по синтезу фуростаноловых гликозидов, по всей видимости, превысит значение в 100 мг/л/сутки в несколько раз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе была исследована роль и степень необходимости активности вторичного метаболизма для популяций культуры клеток ОгоБСОгеа йеНогйеа - признака который характерен как для

- 23 -

исходного растения, так и для культуры клеток in vitro.

Как показало проведенное исследование, активность вторичного метаболизма поддерживается в культуре в условиях максимальной пролиферации популяции, что указывает на существенную необходимость этого процесса для изученных популяций растительных клеток in vitro. Более того, оказалось, что условия, обеспечивающие длительную максимальную пролиферацию клеточных популяций опасны и разрушительны для культуры. Интенсификация вторичного обмена клеточными популяциями, вероятно, каким-то образом способствует ее сохранению в данных условиях, в течении предельно возможного времени.

Анализируя вышеизложенные закономерности вторичного метаболизма в клеточных популяциях Dioscorea deltoidea в условиях in vitro, можно предположить, что вторичный метаболизм - один из механизмов, обеспечивающий существование клеточной культуры в экстремальных условиях in vitro.

Полученные знания о закономерностях вторичного метаболизма клеточных популяций Dioscorea deltoidea позволили нам разработать новый алгоритм культивирования, который поможет вовлечь в биотехнологические процессы низкопродуктивные по вторичным соединениям штаммы.

ВЫВОДЫ

1. Изучены особенности физиологических реакций клеточных популяций исходного и мутантного штамма Dioscorea deltoidea при чередовании периодического и проточного культивирования. Показаны различия между штаммами в характере накопления фуростаноловых гли-козидов:

- в течении периодических культивирований следующих за проточным.

- при переходе с периодического культивирования на проточный.

- при проточном культивировании.

2. Изучена совокупность интегральных популяционных характеристик, при этом установлена:

- стабильность (неисчезаемость) процесса вторичного метаболизма при изученных режимах культивирования.

- активизация синтеза фуростаноловых гликозидов при изученных режимах проточного культивирования для каждого штамма.

- отсутствие взаимосвязи между активизацией синтеза фуростаноловых гликозидов и изменением частоты клеток определенной плоидности.

- воспроизводимая взаимосвязь между активизацией вторичного метаболизма и максимальной митотической активности.

3. Установлено, что проточное культивирование приводит к значительному повышению пролиферативной активности популяций, уровень которой для исследуемых штаммов (15.3% у штамма ДМ-0.5 и 6% у штамма Д-1) был максимально возможным исходя из продолжительности митотического цикла каждого штамма при условиях асинхронного деления всех клеток в популяции. Показано, что клетки обоих штаммов не могут существовать длительное время в условиях, обусловливающих интенсивную пролиферировацию.

4. На основе полученных данных сделано предположение, что интенсификации синтеза фуростаноловых гликозидов при культивировании является физиологической реакцией клеточных популяций на сужение ее гетерогенности в целом, и снижения доли клеток, находящихся в фазе покоя - G0, в частности.

5. Разработана схема культивирования (комбинация периодического и проточного режима культивирования ) , которая дает возможность оценить:

- диапазон продуктивности культур клеток растений по вторичным соединениям.

- стабильность синтеза вторичных соединений.

- возможность прогноза и управления биосинтетической активностью клеточных популяций.

6. На основе экспериментальных данных предложен новый алгоритм оптимального культивирования исследованных клеточных штаммов для получения фуростаноловых гликозидов. При соблюдении этого алгоритма продуктивность исходного штамма Д-1 по фуростаноловым гли-козидам составила 100 мг/л/за сутки, что сопоставимо с продуктивностью мутантного штамма-сверхпродуцента.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Кандараков О.Ф., Воробьев A.C.. Носов A.M. Биосинтетические характеристики популяции клеток Dioscorea deltoidea при проточном культивировании.// Физиол. Растен.-1994. Т. 41. N 6. С. 913-917.

2. Кандараков О.Ф.. Воробьев A.C.. Носов A.M. Биосинтетические и морфологические характеристики популяции Dioscorea deltoidea при хемостатном режиме культивирования. В сб.: " Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Тезисы докладов II Международной конференции. под ред. Бутенко Р. Г.. Алматы, 1993. с. 174.