Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов

Носов, Александр Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов"

21 ОЯЧ/

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

на правах рукописи

НОСОВ Александр Михайлович

УДК 581.198; 547.918

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА СТЕРОИДОВ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ ДИОСКОРЕИ ДЕЛЬТОВИДНОЙ КАК ОСНОВА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФУРОСТАНОЛОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ

специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 1992

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиолбгии растений им К. А. Тимирязева РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Т.Г. Корженевская

доктор биологических наук, профессор В.П. Комов

доктор биологических наук A.M. Егоров

Ведущее учреждение: Институт биохимии им А.Н. Баха РАН,

Москва.

Защита диссертации состоится " " 1992 г.

в /О часов на заседании Специализированного Совета Д 098.09.01 во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторское институте прикладной биохимии по адресу:

125299, Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, Кандидат биологических наук

И.И.ГУСЕВА

.. Актуальность работы.'- Культура клеток высших растений приобретает все большее значение как для фундаментальных исследований, так и для практического применения в биотехнологии. Особый интерес культивируемые клетки представляют как источник абсолютно экологически чистых продуктов вторичного метаболизма растений, широко применяемых в медицине, парфюмерии, пищевой промышленности. В качестве примера можно привести производство биомассы женьшеня в СНГ, используемой как адалтогенное и стимулирующее средство; производство нафтахинона. шиконина в Японии (фирма Toshiba) - красящего соединения, обладающего асептическими свойствами.

Однако список культур, выращивание которых имеет коммерческий успех, невелик. К 1992 году это уже упоминавшиеся Ралах ginseng С.А.Меу и Lithospermum erythrorhizon Seib et Zucc; Rauwolfia serpentina Benth. - продуцент антиаритмического алкалоида аймалина (СНГ): Coptis japónica - продуцент алкалоида берберина (Япония) CKreis et al. 1989] и, возможно, Echinacea purpurea - источник им-муномодулирующих полисахаридов (Германия) [Rittershaus et al. 19903. Это обусловлено рядом причин: отсутствием теоретических знаний о закономерностях вторичного метаболизма в клетках in vitro; сложностью технологического оформления крупномасштабного выращивания культуры меток растений; высокой себестоимостью этого процесса. Лишь комплексное исследование, включающее в себя многие аспекты - от выбора и характеристики штамма-продуцента до получения целевого продукта - может стать основой современной биотехнологии. К настоящему времени такого многопланового исследования практически ни для одной из культур клеток растений не проведено.

Объектом нашего исследования явилась культура клеток тропической лианы диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea Wall. Эта культура привлекает внимание исследователей уже более тридцати лет как потенциальный источник диосгенина - лучшего сырья для получения стероидных гормональных препаратов. Однако, не меньший интерес культура клеток диоскореи дельтовидной представляет как источник стероидных гликозидов с агликоном диосгенином. Эти соединения являются действующим началом в препаратах диоспонин и полиспонин, выпускаемых в России для лечения атеросклероза. В Болгарии на основе стероидных гликозидов из Tribulus terrestris вырабатываются используемые в ветеринарии препараты витатон и трибестан. Однако, производство указанных препаратов к настоящему времени практически

прекращено из-за отсутствия сырья. Таким образом, поиск альтернативного надежного источника стероидных гликозидов, которым может стать культура растительных клеток, весьма актуален.

Цель работы. Изучение закономерностей метаболизма стероидов в исходном и мутантных штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной и разработка научных основ биотехнологии получения препарата фуростаноловых гликозидов из штамма-сверхпродуцента. Разработка концепции о закономерностях синтеза вторичных соединений в клетках in vitro на примере культуры клеток диоскореи дельтовидной.

Задачи исследования.

1. Изучение физиологических характеристик исходного и трех мутантных штаммов культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall.

Z. Изучение закономерностей синтеза стероидных соединений в этих штаммах.

3. Получение препарата стероидных гликозидов (сапонинов) из продуктивного штамма.

4. Изучение биологической активности препарата стероидных сапонинов из клеток продуктивного штамма.

5. Разработка научных основ биотехнологии получения препарата стероидных гликозидов из культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall.

6. Анализ закономерностей синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток Dioscorea deltoidea и разработка ряда теоретических положений о синтезе вторичных соединений в культуре клеток высших растений.

Научная новизна работы. Впервые проведено сопоставление характеристик роста и синтеза вторичных метаболитов в исходном и мутантных штаммах культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall. Показаны различия в синтезе этих соединений и эффективность использования индуцированного мутагенеза для получения штаммов-сверхпродуцентов культивируемых клеток высших растений. Впервые показано, что во всех штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной синтезируются в основном фуростаноловые сапонины. Определен качественный и количественный состав стероидных сапонинов во всех штаммах. При этом синтез гликозидов в фуростаноловой форме происходит независимо от активности эндогенной олигофуростанозид-специфичной в-глюкозидазы. Показано, что состав стероидных гликозидов в клетках in vitro уникален и отличен от состава сапонинов интактного растения. Впервые в культуре клеток диоскореи дельтовидной найдены сапонины с 25S-конфигурацией агликона (ямогенин), не характерные для интакт-

ного растения. Охарактеризован мутантный штамм ИФР-ДМ-0,5 превосходящий по продуктивности исходный штамм в 5 - 6 раз и по содержанию стероидных гликозидов интактное растение в 1,5 * 2 раза.

Совместно с Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН впервые из штамма ДМ-0,5 получен и охарактеризован препарат фуростаноловых сапонинов. Совместно с медицинскими учреждениями проведено изучение биологической активности препарата и показаны его уникальные свойства. Он может быть использован как иммуномодулятор, а также как стимулятор овуляции и сперматогенеза у животных.

Выдвинута гипотеза об общих закономерностях синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток высших растений.

Практическое значение работы. Охарактеризован штамм-сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов ИФР-ДМ-0,5, превосходящий по содержанию этих соединений интактное растение в 2 ; 4 раза. Изучены различные варианты выращивания этого штамма в периодическом и проточном режимах в биореакторах разного объема и конструкции. Определены физиологические условия культивирования штамма, позволяющие получить высокую продуктивность клеток по фуростаноловым гликози-дам - более 0.1 г. с литра среды за сутки. Разработан способ получения препарата фуростаноловых гликозидов из клеточной биомассы. Препарат получен в достаточном количестве для проведения испытаний его биологической активности и доклинических токсикологических исследований. Таким образом, созданы научные основы биотехнологии получения препарата фуростаноловых гликозидов из культуры клеток диоскореи дельтовидной.

Штамм передан для внедрения на Покровский завод биопрепаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 1У Всесоюзной конференции по культуре клеток и биотехнологии (Кишинев, 1983), на Первой республиканской конференции по медицинской ботанике (Киев, 1984), на Всесоюзной конф."Новые направления биотехнологии" (Пущине, 1984), на Международном симпозиуме по исследованию лекарственных препаратов (Берлин, 1986), на 6 Международном конгрессе по культуре клеток и тканей (Монтана, 1986); на V Всесоюзной (I Международн.) конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология", (Новосибирск, 1988), на Втором съезде Всесо-юзн. общества физиологов растений (Минск, 1990), на 1 Всесоюзн. конф. "Генная и клеточная инженерия" (Пущино 1990).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы -опубликованы в 30 печатных работах, в том числе получено три авторских

свидетельства и положительное решение по заявке на авторское свидетельство.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав, выводов и списка используемой литературы.

Работа изложена страницах машинописного текста и со-

держит 17 рисунков и 32 таблицы. Список литературы включает Солее трехсот наименований.

Принятые сокращения и обозначения. ИУК - индолилуксусная кислота; НУК - 1-нафтилуксусная кислота; БАЛ - 6-бензиламинопурин; 2,АД - 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота. М - сухая масса клеток г/л , Мс - сырая масса клеток, г/л. N - число клеток, кл/мл., V - жизнеспособность клеток, %,. р. - удельная скорость роста в экспоненциальной фазе, сутки-1. Т - время удвоения клеток в популяции, сутки. Y - экономический коэффициент по сахарозе. П - продуктивность клеток по биомассе, г/л за сутки. F - содержание стероидных гликозидов в биомассе клеток, в X к М. С - содержание стероидных гликозидов в суспензии клеток, г/л. Р - продуктивность культуры клеток по гликозидам, г/л за сутки. П/Д - соотношение протодиосцин/дельтозид.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служила культура клеток Диоскореи дельтовидной, штамм Д-1, полученная в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФР АН СССР из корневища растения в 1969г М.А.Саркисовой и Р.Г.Бутенко ССаркисова, 1970]. Мутантные штаммы ДМ-0,5, ДМ-1 и ДМ-8 были получены там же в 1972г С.Л.Карановой обработкой исходного штамма химическим мутагеном М-нитрозо-М-метилмочевиной в дозах соответственно 0,5 ; 1,0 и 8,0 шМ/час с последующей селекцией по интенсивности роста [Каранова и др.,1975].

Выралщвание и характеристика культуры клеток. Штаммы выращивали на модифицированной среде Мурашге и Скуга в колбах на качалке- и в биореакторах различной конструкции и объема: АНКУМ-2, Зл.; MF-107 (New Brunswick, США), 7,5л.; АК-210, Юл.; Electrolux (Швеция) 75л. Варашивание проводили как в периодическом, так и в проточном режимах.

Для характеристики роста и физиологического состояния клеток использовали сухую и сырую массу клеток, число и жизнеспособность клеток, агрегированность клеток, число хромосом в клетках, митоти-

ческий индекс и пролиферативный пул популяции.

По полученным данным определяли I, |i, Т, Y, П (см стр. 4).

Содержание ионов NH4+, NO3", К+, Са++, Na+, Mg++ в питательной среде определяли с помощью ион-селективных, электродов на приборе фирмы "Орион" (США).

Для характеристики ультраструктуры клеток использовали просвечивающую электронную микроскопию.

Анализ стероидов. Для анализа использовали лиофилизированную биомассу клеток.

Общую экстракцию стероидов проводили смесью хлороформ : метанол 2 : 1 (v/v), экстракцию фуростаноловых гликозидов - водой, спи-ростаноловых гликозидов - смесью ацетонитрил : вода в объемном соотношении 3:1, свободных стеринов и эфиров стеринов - н-гексаном.

Перед анализом фуростаноловых сапонинов с помощью ВЭЖХ производили их очистку экстракцией из водного раствора н-бутанолом на патронах, заполненных С-18 сшшкагелем 60 мкм (Тессек, ЧСФР).

Гидролиз сапонинов и монозидов стеринов проводили двумя способами:

- 1н. HCl в 50% MetOH при 85°С в течение 14 часов

- 0,9н. HCl в 50% изопропаноле при 100°С в течение 7 часов.

Омыление эфиров стеринов проводили Юн. КОН в 50% MetOH при

110°С в течение 6 часов.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) аналитическую и препаративную проводили на стеклянных пластинках с силикагелем LC 5/40 с 13% гипса в системе хлороформ : метанол : вода в объемных соотношениях 65 : 35 : 10. Разделение сапогенинов (диосгенина и ямогенина) проводили в системе хлористый этилен : ацетон 49 : 1 (v/v) на пластинках с 2% AgNOs. Олигофуростанозиды проявляли реактивом Эрлиха, олигоспиростанозиды и стерины - реактивом Санье.

Газо-жидкостную хроматографию (ГЖХ) использовали для анализа фракций свободных стеринов, эфиров стеринов после омыления, монозидов стеринов и сапонинов после гидролиза. Анализ проводили на приборах Chrom - 41 и Chrom - 5 (ЧСФР) со стеклянными колонками 120 х 0,Зсм., 3Z 0V-17 на Chromaten-N-super 0,16+0,20 мм, детектор - ДИП. Температура испарителя 310°С, детектора - 290°С, температура колонки - 200°С с программированием до 280°С со скоростью 12°С в минуту. Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта (ацетат дегидропрегненолона).

Хромато-масс-спктрометрию проводили на приборах Varian-MAT-112 (США), аналитической системе GC-MS-2190 фирмы LKB (Швеция) и Kratos-25-RFA (Великобритания). Режимы работы: ионизирующее излучение 50 и 70 эв., ток эмиссии катода 400 + бОСГмкА, ускоряющее напряжение 4 + б кв, температура источника 200 + 250°С. Условия хроматографирования - капиллярная колонка CP-Sil 8 СВ 25 м, внутренний диаметр - 0,32 мм, температура колонки - 270°С, инжектора -220°С. Использовали также колонки и условия, аналогичные ГЖХ.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на приборе фирмы LKB, колонка "Lichrosorb RP-18", 5 мкм, 4 х 250мм, расход подвижной фазы - 0,4 мл/мин., детекция по поглощению при 203 нм. Подвижная фаза - ацетонитрил : вода 27 : 73 (v/v), Р - 60 бар.

Определение фуростаноловых гликозидов спектрофотометрическим методом проводили по модифицированной методике [Пасешниченко, 1972].

Определение биологической активности препарата проводили совместно с рядом медицинских учреждений, указанных ниже. Определение биологической активности проводили в тестах in vivo и in vitro по стандартным методикам или по оригинальным методикам медицинских учреждений.

Физиологические характеристики штаммов культуры клеток диоскореи дельтовидной.

Морфо-физиологические характеристики. Все штаммы представлены в популяции двумя типами клеток - меристемоидными и паренхимопо-добными. Жизнеспособность клеток в цикле выращивания варьирует в пределах 65 * 85Z.

Штаммы различаются по распределению клеток в популяции по числу хромосом. Модальными классами хромосом для клеток штамма Д-1 является 2N и 3N, для мугантных штаммов - как правило 2N, то есть для мутантных штаммов характерен сдвиг числа хромосом в клетках к диплоидному набору. Эта закономерность была отмечена и при получении. этих штаммов Шамина, 1988].

По агрегированное™ клеток в суспензии значительно отличается от остальных штамм ДМ-8: он является крупноагрегированным - более 60% клеток находятся в агрегатах, превышающих 20 клеток. Остальные штаммы относительно мелкоагрегированы - 70 * 80Z клеток составляют агрегаты размером не более 20 клеток.

Штаммы различаются по интенсивности пролиферации, при этом важно, что различается кинетика появления в клетках 3Н-тимидина (рис.1). Возможно это обусловлено различием в количестве одновременно делящихся клеток в популяции или разным числом клеток, находящихся в фазах в! и 62 в начале цикла культивирования.

Рис.1. Динамика появления клеток в популяции с ядрами, содержащими -"!Н-тимидин.

Исследования ультраструктурной организации клеток показали, что ¡метки Есех штаммов можно отнести к активно секретирующему типу (Васильев А.Е., 1977). В начале стационарной фазы роста (14 сутки) основная масса представлена паренхимоподобными клетками с хорошо выраженной центральной вакуолью. Цитоплазма клеток заполнена большим количеством пластид с хорошо развитыми внутренними мембранными структурами. Часто пластиды окружены ретикулярными футлярами агранулярного эндоплазматического ретикулума (ЗПР). Прослеживаются многочисленные контакты между наружной мембраной пластид и ЭПР. Обнаружено большое количество структур аппарата Гольдки. Цитоплазматическая мембрана ассиметрична; в отличие от внутренней, наружная осмиофильна, по всей длине складчатая, на некоторых участках образует ломасомы.

Наряду с общими чертами ультраструктуры, каждый штамм имеет звои особенности. При этом наиболее сильно отличается от других

штамм ДМ-0,5. Для него характерны следующие признаки:

- диктиосомы аппарата Гольджи располагаются группами по 3+5 шт., они продуцируют большое количество электронноплотных пузырьков.

- в вакуолях и на тонопласте обнаружено отложение осмиофильного вещества.

- значительно развиты межклетники, в которых отмечается накопление элекгроннопяотного продукта и в редких случаях кристаллоидов.

- каналы ЭПР часто образуют замкнутые циклические структуры или располагаются параллельными рядами по 3+5 штук.

Указанные признаки свидетельствуют о большей секреторной активности клеток этого штамма относительно клеток других штаммов.

Характеристика роста штаммов. Для всех исследуемых штаммов получена в периодическом режиме культивирования нормальная Б-об-разная кривая роста по всем изученным критериям (М, Мс, Ю- На рис. 2 А представлены кривые роста штаммов по сухой биомассе и числу клеток в линейной системе координат. Длительности фаз роста примерно одинаковы для разных штаммов, цикл выращивания составляет в среднем 14 * 18 суток. Характерной особенностью ростовой кривой для всех штаммов является очень корбткая стационарная фаза роста. В таблице 1 приведены средние значения ростовых характеристик штаммов (обработка не менее 5 независимых экспериментов, для штамма ДМ-0,5 -12 экспериментов, коэффициент вариации не более 23%.).

Таблица 1

Ростовые характеристики штаммов культуры клеток Диоскореи дельтовидной (обозначения см. стр. 4).

1 1 | Штамм 1 1 | м I И V п 1 I 1 Т 1 1 1

1 1 1 Д-1 1 11,2 8,4 0,18 0,30 0,55 1 1 1 3,9 |

1 ДМ-0,5| 11,9 8,4 0,20 0,33 0,66 1 3,5 |

1 ДМ-1 | 11.7 ?,2 0,17 0,32 0,63 1 4,1 |

1 ДМ-8 | ■ | 10,9 6,8 0,16 0,35 0,60 1 4,3 | 1 1

Как следует из данных таблицы, штаммы обладают достаточно близкими характеристиками роста и продуктивности. Несколько лучшие характеристиками можно отметить для штамма ДМ-0,5, однако эти различия не превышают оценку среднего квадратического отклонения со-

1-М-0.5 2-1-1 З-ПИ-1 4-ВИ-8

1К-0.5

Рис. 2. Характеристики роста и содержания фуростаноловых глико-зидов в штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной в колбах (А) и различных биореакторах (В). V - жизнеспособность клеток в биореакторе АК-210. ■

ответствующих характеристик.

Таким образом, различия между штаммами, показанные при их морфо-физиологической характеристике, незначительно сказываются на интегральных характеристиках роста популяции клеток.

Культуру клеток ЮюБСОгеа с1е11о1йеа выращивали в биореакторах различной конструкции и объемов (от 3 до 50л). Сотрудники нашей лаборатории осуществили культивирование штамма ДМ-0,5 в биореакторе объемом 300л ((Лрэку АКЪ. а1, 1990).

Рост штаммов при аппаратурном выращивании незначительно отличается от роста культуры при выращивания в колбах. Типичные кривые роста штаммов Д-1 и ДМ-0,5 представлены на рис. 2В. Однако при выращивании клеток в биореакторах отмечено значительное снижение жизнеспособности клеток в начальных фазах роста, вызванное повреждающим действием перемешивающих устройств.

Для уменьшения отрицательного воздействия перемешивающих устройств была проведена работа по выбору типа мешалки, щадящего режима перемешивания и стратегии процесса культивирования. В результате было установлено, что минимальное повреждающее действие оказывает мешалка типа "морской винт".

По результатам проведенных экспериментов была выбрана следующая стратегия культивирования клеток в биореакторах. В начальных фазах роста, когда клетки находятся в стрессовом состоянии, вызванном пересевом, устанавливается минимальная скорость перемешивания (по отсутствию седиментации клеток) и минимальный расход воздуха, обеспечивающий концентрацию растворенного кислорода рОг не ниже 10 * 15Х от насыщения. В период экспоненциального роста -увеличение скорости перемешивания до максимально возможной, которая не приводит к разрушению клеток (определяется микроскопически по наличию в суспензии обломков клеток) и минимальный расход воздуха, обеспечивающий тот же уровень рОг . Минимальный расход воздуха необходим в связи с интенсивным пенообразованием, характерным для заключительных фаз роста клеток.

В режиме хемостата выращивали два штамма - Д-1 и ДМ-0,5. Культивирование осуществляли в модифицированном биореакторе АК-210. На рис. ЗА представлены результаты выращивания в режиме хемостата штамма ДМ-0,5.

На 19 сутки культивирования при содержании сухой биомассы 9,6 г/л был включен проток со скоростью разбавления равной удельной скорости роста в экспоненциальную фазу Б - 0,1 сут.-1

Жг/М)

НййЛхЮ6)

Н(г/<1)

Рис. 3 Характеристики роста и содержания фуростаноловых

гликозидов в штаммах ДМ-0,5 (А) и Д-1 (В) при проточном культивировании (обозначения см. стр. 4).

После включения протока накопление биомассы продолжало увеличиваться и к 21 * 24 суткам культивирования стабилизировалось на уровне 11 г/л. При данной скорости разбавления культуру поддерживали в течение трех генераций клеток (Г - 1п2/р. 0,692/0,1 - 7 суток), что достаточно для доказательства истинности достижения равновесного состояния Шерт, 1978]. Как следует из графика рис.ЗА, в течение этих 20 суток концентрация биомассы поддерживалась достаточно стабильно. Среднее значение (оценка математического ожидания) содержания биомассы в этот период - 11,20 г/л, оценка среднего квадратического отклонения - 0,61г/л, коэффициент вариации - 5,4%.

На 39 сутки культивирования скорость разбавления увеличили до 0,22 сут.-1. Это значение было выбрано исходя из максимальной удельной скорости роста данного штамма в периодическом режиме. Данную скорость разбавления также поддерживали в течение трех генераций клеток (Т - 1п2/0,22 - 3 суток). Как следует из графика, уровень концентрации биомассы при этом не изменился по сравнению с 0-0,1 сут-1. Среднее значение (оценка математического ожидания) содержания биомассы в этот период - 11,06 г/л, оценка среднего квадратического отклонения - 0,31г/л, коэффициент вариации - 3,4%.

Анализ поглощения клетками основных компонентов среды (сахарозы, Р043~, ЯН4+, Шз", К+, Са++, №а+, Мв++) показал, что ни один из них, за.исключением фосфат-иона, не утилизируется полностью. В частности, концентрация сахарозы в среде находится на уровне 1%. Таким образом, ни один из этих факторов не является лимитирующим, поскольку, как показано ниже, исчерпание фосфата из среды не лимитирует рост. Наиболее вероятно, что лимитируюшим фактором в данном случае является кислород.

На рис. ЗВ представлены графики изменения сухой биомассы, числа клеток и доли жизнеспособных клеток штамма Д-1 в процессе аналогичного эксперимента. Как следует из рисунка, при низкой скорости протока достигается стационарное состояние, аналогично штамму.ДМ-0.5. При увеличении скорости разбавления до 0,25 сут.-1 происходит вымывание клеток. Таким образом, максимальная удельная скорость роста для штамма Д-1 оказывается ниже 0,25 сут.-1. и составляет по расчетам около 0,18 сут.-1, что ниже чем для штамма ДМ-0,5.

В таблице 2 приведены статистические оценки характеристик роста и продуктивности штаммов ДМ-0.5 и Д-1 и их максимальные значения в периодическом режиме, а также в режиме хемостата при скорости разбавления 0-0,22. *

Таблица 2

Характеристики роста штаммов Д-1 и ДМ-0,5 в периодическом и проточном режимах культивирования.

1 | Штамм 1 Штамм ДМ-0,5 1 Штамм Д-1 1

| Параметры 1 1 м- Y П 1 1 И Y п 1

| ¥ 1 о ,20 0.33 0, 66 1 о 13 0,30 0 .55 |

| ¥ шах 1 о .27 0,35 0, 91 1 о 21 0,34 0 .71 |

1 б 1 о .04 0,02 0, 15 1 о 03 0,03 0 ,11 1

| Хемостат | 1 о 1 ,22 0,55 2, 45 1 о 1 18 0,40 1 .12 | |

¥ - среднее значение параметра при периодическом

культивировании (оценка математического ожидания) ¥ шах - максимальное значение параметра при

периодическом культивировании, б - оценка среднего квадратического отклонения

параметра при периодическом культивировании Хемостат - значения параметра при выращивании культуры в режиме хемостата.

Как следует из таблицы, продуктивность по биомассе в хемоста-те для штамма ДМ-0,5 при скорости разбавления 0,22 почти в 4 раза превышает усредненную продуктивность при выращивании в периодическом режиме и более чем в 2 раза - максимальную продуктивность, полученную в этом режиме. Существенно увеличивается экономический коэффициент по сахарозе. Из данных таблицы следует, что хемостат-ный режим более эффективен для штамма ДМ-0,5, чем для штамма Д-1.

Стероидные соединения в различных штаммах культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall.

Качественный состав. Во всех штаммах были идентифицированы четыре фитостерина:' ситостерин, стигмастерин, кампестерин и холестерин. Основная доля фитостеринов (до 60% от их общего содержания)

находится в свободном виде, остальная часть - в виде монозидов. Эфиры стеринов во всех штаммах практически отсутствуют (1*2% от общего содержания фитостеринов).

Во фракции сапонинов после гидролиза в штаммах Д-1, ДМ-1 и ДМ-8 помимо диосгенина был обнаружен другой агликон. Методом препаративной ТСХ на силикагеле с 2% АеШз этот агликон был отделен от диосгенина и выделен в чистом виде (примесь диосгенина менее 10%). Масс-спектры этого сапогенина оказались полностью идентичны спектрам диосгенина. В ИК-спектре вновь обнаруженного генина присутствовала интенсивная полоса поглощения при 922 см-1 , что свидетельствует о 25Б-структуре. Таким образом, можно утверждать, что вновь обнаруженный агликон является 255-аналогам диосгенина - ямо-генином. Это было подтверждено при сравнении выделенного сапогенина со стандартным образцом ямогенина. Обнаружение ямогенина в культивируемых клетках диоскореи дельтовидой является принципиально новым фактом, поскольку для интактного растения его присутствие не характерно.

Первым этапом определения качественного состава сапонинов было определение их формы. Для этого использовали:

- различие в растворимости фуро- и спиростаноловых сапонинов.

- разницу в результатах анализа различными методами (ГЖХ, определяющим общее содержание сапонинов и спектрофотометрическим, определяющим фуростаноловые сапонины).

- независимое обнаружение обоих форм сапонинов методом ВЗЖХ;

В результате анализа этими тремя способами биомассы каждого

штамма (3*5 образцов) было установлено, что содержание спиростаноловых сапонинов в штаммах не превышает 1 * 3% от общего содержания сапонинов, в штамме ДМ-0,5 эта форма не обнаруживается.

Для определения причин отсутствия спиростаноловых сапонинов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной была проведена серия экспериментов по определению активности эндогенных Ц-глюкозидаз, для чего биомассу клеток подвергали автоферментации в течение 3 часов. Результаты представлены в табл. 3. Разница между контролем (экстракция МеЬОН) и экспериментом равна количеству олигофуроста-нозидов, перешедших в спиростаноловую форму.

Как следует из полученных результатов, в штамме ДМ-0,5 активность олигофуростанозид-специфичной в-глюкозидазы отсутствует, тогда как в других штаммах она весьма активна. Таким образом, в штаммах Д-1, ДМ-1 и ДМ-8 фуростаноловые гликозиды и расщепляющий

их фермент, видимо, находятся в разных компаргментах клетки.

Таблица 3

Сравнение результатов анализа олигофуростанозидов при экстракции из биомассы водой и 70% метанолом.

| без ¿втоферментации I(экстракция 70% MetOH) i |с автоферментацией |(экстракция водой) i

1 ДМ-0,5 1 7,8 i 1 7,8 0 % |

1 ДМ-1 1 3,5 1 1.2 70 % |

1 да-8 | 0,92 1 0,15 85 % |

1 Д-1 1 1 1,7 i 1 0,24 i 85 % | t

Определение качественного состава фуростаноловых сапонинов показало наличие во Есех штаммах двух основных сапонинов - прото-диосцина и дельтозида. ВЭЖХ-хроматограммы сапонинов из каждого штамма представлены на рис.4 . Идентификацию этих соединений проводили сравнением со стандартными образцами, а также идентификацией агликонов после гидролиза.

Из приведенных хроматограмм следует, что в области пиков дельтозида и протодиосцина находятся еще два дополнительных пика, площадь которых особенно велика для штамма Д-1. С помощью препаративной ВЭЖХ эти соединения были выделены (примесь дельтозида и протодиосцина менее 10%). Установлено, что они дают реакцию с реактивом Эрлиха и имеют тот же ЫГ на ТСХ, что и дельтозид и прото-диосцин. После обработки веществ экзогенной ц-глюкозидазой положительная реакция на реактив Эрлиха исчезла, а полученные продукты имели ГЙ" на ТСХ, аналогичный дельтонину и диосцину. Их агликоны после кислотного гидролиза были идентифицированы как ямогенин.

Предположение об идентичности углеводных фрагментов ЗбБ-сапо-нинов протодиосцину и дельтозиду подтвердили при помощи ТСХ как фуростаноловых сапонинов, так и их спиростаноловых аналогов, полученных после обработки экзогенной в-глюкозидазой. 1?Г 253-фуроста-ноловых гликозидов оказался идентичным протодиосцину и дельтозиду, а полученных 253-спиростанолов - дельтонину и диосцину. Для стро-

и.

I 1

IГ1Т

Клеточный Штаии ДЦ-Х

|{|

! I

еточнъ

ч,

Щ*?

щ.

Щ ^ 1

[

ПГ

м :"! м ;; м :! I

и !

! -Г Л

гт

"'1 ■

1Л

■ 1 Г*^»«-.? Н ; ! ;х-Ь ; : ! !

Сл

№

Рис. 4. НРЬС-хроматограммы фуростаноловых гликозидов штаммов культуры клеток диоскореи дельтовидной.

1 - 255-дельтозид, 2 - дельтозид, 3 - 253-протодиосцин, 4 - протодиосцин.

гого доказательства необходима идентификация Сахаров, входящих в в состав олигосахаридного фрагмента Сз-атома сапонинов . Однако, полученное совпадение Rf свидетельствует о том, что 25Б-сапонины являются триозидами, а вариации состава Сахаров,, не приводящие к изменению Rf, видимо, маловероятны.

Таким образом, можно считать установленным, что в изучаемых штаммах преобладают фуростаноловые сапонины протодиосцин и дельто-зид. а также их 255-аналоги.

Характеризуя качественный состав стероидных сапонинов культуры клеток диоскореи дельтовидной, следует отметить, что он является уникальным и отличается от такового в интактном растении. Во-первых, обращает на себя внимание появление ямогенпна - аглико-на с 3-конфигурацией 25-го атома углерода - и сапонинов на его основе. Эти соединения не характерны для интактного растения диоскореи дельтовидной. Во-вторых, практически все сапонины находятся в фуростаноловой форме, причем эта особенность не зависит от потенциальной активности эндогенной специфичной р-глюкозидазы. Для интактного растения эта Форма является минорной (видимо, транспортной) формой сапонинов. В-третьих, обнаружение протодиосцина и д^льтоэида как основных сапонинов культуры ¡слеток также заслуживает внимания, поскольку в интактном растении первый из них характерен для листьев, а второй - для корневища. Этот факт может рассматриваться как проявление тотнпотентности растительной ¡слеткн in vitro. И. наконец, следует отметить, что качественный состав стероидов во всех штаммах одинаков, быть может за исключением штамма ДМ-0.5, в котором не обнаружена спиростаноловая форма сапонинов.

Количественное содержание. Содержание фитостеринов во всех штаммах примерно одинаково и не превышает 3*5 мг/г сухой массы клеток. Общее содержание фитостеринов в штаммах представлено в таблице 4. (для примера в таблице приведен коэффициент вариации К для штамма Д-1). Несколько отличается от других штамм ДМ-1: в этом штамме основным фитостерином является стигмастерин. Его количество значительно выше, чем в других штаммах.

В таблице 5 представлены данные о количественном содержании сапонинов в изучаемых штаммах. Представленные данные являются результатом обработки не менее пяти независимых экспериментов (для штамма Д-1 - 9. ДМ-0.5 - 17) при стандартных условиях культивирования. Анализ проводили на стационарной фазе роста клеток (. !4 18 сутки культивирования). Коэффициент вариации не превышает 21%.

Таблица 4.

Содержание фитостеринов в штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной (в иг/г сухой массы)

1 I Соединение 1 Штаммы 1 К* |

1 1 |ДМ-0,5| 1 | ДМ-1 ДМ-8 Д-1

| Стигмастерин 1 I 1 0,22 | 2,28 0,82 0,62 27,9 |

| Ситостерин 1 1,31 | 1,47 1,38 1,53 21,4 |

| Кампестерин 1 1,08 | 1,11 0,96 1,18 27,8 |

| Холестерин 1 0,11 | I 1 0,13 0,11 0,19 34,5 | 1

Как следует из полученных результатов, максимальное содержание сапонинов отмечено для штамма ДМ-0,5 - около 10% на сухую массу клеток. Штаммы Д-1 и ДМ-8 содержат минимальное количество сапонинов - 1,5 - 3%. Штамм ДМ-1 занимает промежуточное положение -около 6%.

Таблица 5

Содержание фуростаноловых сапонинов в штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной (в мг/г сухой массы).

I 1 | Штамм | Общее содерж. - 25!?-конфигурация 25Б-конфигурация 1

1 Д-1 1 14,2 4,2 1 1,8 | 2,3 5,5 1 2,7 | 58% |

1 ДМ-0,5| 92,3 54,3 27,1 | 2,0 7,2 3,7 | 12% |

1 ДМ-1 | 57,6 31,2 20,9 | 1,5 3,4 2,1 I 9% |

1 ДМ-8 | 1 1 29,2 9,1 1 10,2 | 1 0,9 5,0 4,9 | ■ 34% | |

Соотношение сапонинов с И- и Б-конфигурацией С-25 атома различно для разных штаммов. При этом можно проследить закономерность: для штаммов с низким общим содержанием сапонинов доля Б-сапонинов относительно велика (35 * 60%). Для штаммов ДМ-1 и ДМ-0,5 содержание сапонинов с агликоном ямогенином минимально (около

10Х). Таким образом, оказывается, что содержание Б-сапонинов для разных штаммов в расчете на клеточную биомассу практически одинаково: 0,5 * 1,01, а различия в содержании обусловлены в основном сапонинами с [^-конфигурацией (протодиосцином и дельтозидом).

Соотношение сапонинов с разными углеводными фрагментами (протодиосцин/дельтозид, З-протодиосцин/ З-дельтозид) достаточно' постоянны и специфичны для каждого штамма.

Таким образом, исследование количественного содержания стероидов показало значительное различие штаммов по содержанию и соотношению сапонинов. При этом штамм ДМ-0,5 является сверхпродуцентом - содержание сапонинов в клетках этого штамма превышает содержание сапонинов в корневище интактного растения.

Стабильность содержания стероидных соединений. Для изучения стабильности содержания стероидов в штаммах использовали три подхода:

- мониторинг за содержанием сапонинов в течение всего периода исследования (12 лет).

- изучение содержания стероидов в цикле выращивания культуры клеток.

- криосохранение культуры клеток (сопоставление содержания сапонинов в клетках, поддерживаемых в растущем виде, с клетками после возобновления культуры из криобанка).

Длительный мониторинг за содержанием сапонинов в клетках показал значительную стабильность содержания сапонинов в штаммах культуры клеток ^оэсогеа с1е11о1<Зеа. В таблице 6 представлены результаты по содержанию сапонинов в начальный период исследования (1979 - 82 гг) ив настоящее время.

Таблица 6

Среднее содержание сапонинов в штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной в начале и конце 80-х годов (в мг/г сухой массы).

1 | Штамм Содержание в 1979 - 82 гг. 1 Содержание в | 1988 - 91 гг.' |

1 Д-1 14,-3 16,1 I

1 ДМ-0,5 68,3 97,4 |

1 ДМ-1 26,5 61,4 |

1 ДМ-8 ■ | 30,3 28,9 | |

Как следует из таблицы, содержание сапонинов в низкопродуктивных штаммах изменилось незначительно, в высокопродуктивных -несколько возросло.

Для штамма Д-1 в 1981 - 82 гг. был поставлен специальный эксперимент по определению стабильности синтеза сапонинов в течение длительного культивирования штамма. В этом эксперименте анализировали содержание сапонинов практически в каждом цикле выращивания культуры. Результаты эксперимента представлены на рис.5.

Как следует из представленных результатов, содержание сапонинов в целом при двухлетнем культивировании достаточно стабильно (коэффициент вариации 34%). Однако на фоне этой стабильности можно отметить определенную закономерность в изменении содержания сапонинов в клетках. Она проявляется в достаточно четком чередовании минимумов и максимумов содержания сапонинов в течении годового цикла выращивания культуры. При этом отмечается два хорошо выраженных максимума содержания, которые приходятся на март и июнь-июль. Это наводит на мысль о существовании определенной годовой цикличности содержания сапонинов в культуре клеток диоскореи. Любопытно, что для корневища интактного растения Оюэсогеа <1еКо1с1еа максимумы содержания диосгенина обнаружили в период цветения (июнь-июль) и выхода из зимнего покоя (март-апрель) [Пасеш-ниченко, 1973].

Следует отметить постепенное увеличение доли Б-сапонинов в течение культивирования штамма Д-1: за два года культивирования относительное содежание 25Б-сапонинов увеличилось до 601.

Изучение содержания фитостеринов в течение длительного культивирования клеток показало меньшие колебания содержания этих соединений, по сравнению с сапонинами (коэффициент вариации 18X).

Содержания сапонинов в цикле выращивания культуры изменяется незначительно для всех изучаемых штаммов (рис. 2А ). Отмечено увеличение содержания сапонинов в заключительных фазах ростового цикла, но это увеличение не превышает 1,5 - 2,0 раз.

Количественное содержание фитостеринов в цикле культивирования практически не изменяется.

Анализ содержания стероидов в культивируемых клетках разных штаммов после длительного периода криосохранения (6 лет) в сравнении с клетками, поддерживаемыми в растущем состоянии, не показал значительных количественных различий, однако в штамме после криох-

мг/г сухой массы 16-

1981 год

141210 -

о Т|III II 11 22 декабрь январь

I П I I I Т I I V I I I I V I I I I 1 I I 6 18 14 II 9

март апрель май июнь толь

I Т I I т I I 3 I 16 12 28

сеет*йрь октаорь ноябрь

дата -255 - сапонины

1982 год

СЭ -25Я- сапонины мг/г сухой массы

б -

г-

I М I I Т I I

декабрь февраль апрель

выверь иарт иай

I И I VI И I I V П I I I I ТI I I I I I М I I I

10 24 8 6 19 20 И -

июнь август ноябрь

июль сентябрь ДО.Тс1

25 Я -сапонины

25 - сапонины

[ I

Рис. 5. Содержание фуростаноловых гликозидов в штамме Д-1 при стандартных условиях выращивания в 1981 - 1982 гг.

ранения обнаружили практически полное отсутствие 25S-сапонинов. Это может свидетельствовать о том, что в процессе длительного культивирования штамма постепенно отбираются клетки с определенным содержанием 253-сапонинов.

И, наконец, в качестве своеобразного доказательства стабильности синтеза стероидных сапонинов культивируемыми клетками была рассчитана оценка математического ожидания количественного содержания сапонинов в штамме ДМ-0,5 при различных условиях культивирования. Изменения условий культивирования состояли в использовании в среде различных форм и концентраций углеводов, азота, фосфора, фитогормонов (включая гибберелин), ретардантов (ССС), микроэлементов, разные начальные рН среды и др.

В результате обработки более 100 анализов оказалось, что оценка математического ожидания содержания сапонинов при различающихся условиях культивирования равна 72,2 мг/г сухой массы, оценка среднего квадратического отклонения - 23,3 мг/г, коэффициент вариации - 32,3%. Следовательно, даже значительные изменения условий культивирования не приводят к существенному изменению содержания сапонинов в продуктивном штамме ДМ-0,5.

Таким образом можно сделать вывод о чрезвычайно высокой стабильности синтеза сапонинов в штаммах культуры клеток Diioscorea deltoidea.

Влияние факторов культивирования на содержание и продуктивность стероидных соединений в культуре клеток диоскореи дельтовидной.

Влияние способа культивирования. Путем платирования суспензии клеток было получено по 10 * 12 индивидуальных каллусных клонов от каждого штамма. Результаты анализа содержания сапонинов в клонах представлены в таблице 7.

Пределы варьирования общего содержания фуростаноловых гли-козидов в различных клонах составили для штамма Д-1 - 0,4 * 1,0% к сухой массе клеток, штамма ДМ-0,5 - 0,6 * 3,3%, штамма ДМ-1 - 1,2 * 4.2% и для штамма ДМ-8 - 0,2 * 1,4%. Таким образом содержание сапонинов в клетках при поверхностном культивировании в среднем в 3 * 10 раз ниже, чем при суспензионном культивировании. При этом больше всего снижается содержание сапонинов в наиболее продуктивном штамме ДМ-0,5. Следует отметить, что при общем снижении содержания сапонинов в каллусных тканях сохраняются штаммовые характе-

ристики по синтезу сапонинов: штаммы ДМ-1 и ДМ-0,5 содержат в 3 + 4 раза больше сапонинов, чем штаммы Д-1 и ДМ-8. Любопытно, что при поверхностном культивировании штамм ДМ-1 в среднем оказывается более продуктивным по сапонинам, чем штамм ДМ-0,5."

Таблица 7

Содержание фуростаноловых сапонинов в штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной (в мг/г сухой массы) при поверхностном культивировании (среднее для всех проанализированных клонов).

1 1 | Штамм | Общее содерж. 1 I 251?- конфигурация 1 25Б-конфигурация 1

1 Д-1 1 5,5 1 1,1 1 1,4 | 0,8 1,7 ' 1 1,3 | 54% |

1 ДМ-0,5| 21,8 1 13,1 8,7 | 1,5 О о 1 0% |

1 ДМ-1 | 28,4 1 13,5 7,5 | 1,8 4,8 2,6 | 26% |

1 ДМ-8 | ■ I 6,8 1 2,3 1 2,8 | 1 0,8 1,1 0,6 | 1 25% | 1

В каллусной культуре несколько изменяется соотношение прото-диосцин : дельтозид, причем наиболее существенно для штамма Д-1 -при поверхностном культивировании в этом штамме преобладающим сапонином становится дельтозид. Изменяется также содержание 25Э-са-понинов. Для штамма ДМ-0,5 эта форма в каллусах вообще не обнаруживается, тогда как для штамма ДМ-1 ее доля увеличивается до 25%.

Влияние режимов культивирования. Установлено, что режимы культивирования и его аппаратурное оформление практически не сказываются на содержании стероидов в клетках при периодическом выращивании.

Содержание сапонинов при выращивании клеток в режиме хемоста-та представлено на рисунке 3 . Как следует из этих данных, при проточном культивировании содержание сапонинов в клетках соответствует их содержанию в экспоненциальную фазу роста при периодическом культивировании и практически не зависит от скорости протока. Для штамма ДМ-0,5 это содержание находится в пределах 5+6% от сухой массы клеток.

Отсюда можно сделать вывод, что интенсивно пролиферирующие клетки в суспензии активно синтезируют фуростаноловые сапонины.

Это имеет принципиальное значение, поскольку в ряде работ, в частности, израильских авторов [Tal et al., 1983] с диоскореей дельто- | видной указывается, что при проточном культивировании культур клеток растений содержание вторичных метаболитов значительно снижается вплоть до полного исчезновения.

Влияние состава среды. Углеводное питание. Использование в качестве субстрата глюкозы, галактозы и глюкозы + галактозы в различных концентрациях незначительно изменяет содержание и продуктивность штамма Д-1 по сапонинам и фитостеринам по сравнению с выращиванием на сахарозе. Отмечено некоторое снижение содержания сапонинов на среде с галактозой при одновременном . увеличении доли 25R-сапонинов до 60%.

Результаты по влиянию различных начальных концентраций сахарозы на содержание сапонинов и характеристики роста штамма ДМ-0,5 приведены в таблице. 8.

Таблица 8

Влияние различных концентраций сахарозы в среде на характеристики роста и синтеза сапонинов штамма ДМ-0,5. (обозначения см. стр. 4.).

1 1 |% сахарозы| и II ' Y F i 1 с Р П/Д I

1 2,5 | 0,24 0,64 0,35 9,3 | 729 34,2 1,7 1

1 3,0 | 0,24 0,71 0,35 9,5 I 871 42,8 1,8 |

1 4,0 | 0,24 0,76 0,35 7,2 I 916 43,9 1,5 |

1 5,0 | 0,25 0,79 0,32 6,4 11029 41,9 1,5 |

1 6,0 | 0,21 0,74 0,29 5,2 11023 39,2 1,3 |

1 8,0 | i i 0,15 0,63 0,25 5,0 I 968 i 28,8 "1,1 1 i

Как следует из данных таблицы, продуктивность культуры клеток по биомассе незначительно возрастает с увеличением концентрации сахарозы до 5 * 6%. Это сопровождается достоверным снижением максимального содержания сапонинов на 20 * 30%. Повышение концентрации сахарозы в среде часто приводит к значительному (до 50%) повышению доли 255-сапонинов и к изменению соотношения протодиос-цин/дельтозид в сторону дельтозида. Общая продуктивность по сапонинам вариантов с 3 * 6% сахарозы в среде практически одинакова, так как снижение содержания сапонинов компенсируется повышением продуктивности культуры по биомассе.

Минеральное питание. Для выяснения влияния элементов минерального питания были поставлены эксперименты по внесению в среду различных доз ионов фосфата, нитратного и аммонийного азота.

Несмотря на то, что фосфат поглощается из среды клетками ди-оскореи с максимальной скоростью, увеличение дозы фосфата в 3 раза не приводит к заметному увеличению продуктивности штамма ДМ-0,5 как по биомассе, так и по сапонинам (таблица 9 ).

Таблица 9

Влияние различных концентраций фосфата на характеристики роста и синтеза сапонинов штамма ДМ-0,5. (обозначения см. стр. 4.).

1 1 |Р043-мМ| 1 1 М П 1 Y | 1 F 1 1 с 1 Р ' 1 П/Д |

1 1 |1,3(1Ы)| 10,6 0,40 1 0,30 | 8,0 1 | 856 43 1 2,0 |

12,6(2N) | 10,9 0,52 0,37 | 8,0 | 872 45 8 1,8 1

13,9(3N)| 1 ) 10,8 0,48 0,37 | | 8,3 | 924 | 44 0 1,8 | 1

При изменении доз фосфата в среде скорость его поглощения оставалась неизменной (0,4 * 0,5 мМ/сутки). При этом в варианте с тройной нормой в среде после цикла культивирования оставалось 1,0 - 1,5 мМ фосфата. Продуктивность по сапонинам в этих экспериментах оставалась на уровне, характерном для стандартных условий выращивания.

Несмотря на то, что при стандартных количествах NH4+ и Шз~ в среде (соответственно 20 и 40 мМ) клетки поглощают из среды всего лишь 30 -г- 50% общего азота, снижение в два раза обеих форм азота приводит к почти полной остановке роста (таблица 10).

Сохранение исходной концентрации NH4+ при одновременном снижении концентрации Ы0з~ на 50% (до 20 мМ; соотношение NH4+/N03~ -1 : 1) обеспечивает хороший рост культуры, но значительно снижает содержание сапонинов (до 4 * 5%) и, следовательно, продуктивность культуры по сапонинам (до 20 25 мг/л. за сутки).

Лучшим из испытанных вариантов оказалось соотношение МН4+/М0з~ 1 : 3 при общем снижении концентрации азота в среде до 40 мМ. Этот вариант при более низкой концентрации азота в среде по ростовым и биосинтетическим характеристикам не уступает контрольному.

Таблица 10

Влияние различных концентраций нитратного и аммонийного азота на характеристики роста и синтеза сапонинов, (обозначения см. стр. 4.).

1 I МН4++ N03",мм м. П У Р С I 1 1 Р 1

| 10+20 0,08 0,11 0,10 2 5 58 1 5,8 |

| 20+20 0,18 0,51 0,35 5,0 495 1 "24,8 |

| 10+30 0,19 0,58 0,29 10,0 660 1 41,3 |

| 20+40 | 0,22 0,5 0,31 8,3 642 1 37,5 | | 1

Интересно, что при выращивании клеток на контрольном варианте среды, в них было обнаружено большое количество этаноламина -48 + 82 мМ/г сухой биомассы (29 * 35 мг/л среды). На среде с уменьшенной дозой Ь1Н4+ количество этаноламина не превышало 2,6 мМ на грамм сухой биомассы. Видимо, образование этаноламина является способом связывания избыточного количества аммонийного азота.

Таким образом, содержание неорганических компонентов среды оказывает определенное влияние на рост культуры и синтез сапонинов. При этом наиболее существенным фактором, по-видимому, является количество и соотношение различных форм азота. В целом, измене-, ние минерального состава среды не позволило существенно повысить продуктивность культуры по биомассе и целевому продукту.

Фитогормоиы. Для изучения влияния фитогормонов на синтез сапонинов в штамме ДМ-0,5 были поставлены эксперименты, в которых в качестве цитокининов использовали кинетин и БАП, а в качестве ауксинов - ИУК, НУК, 2,4Д.

При попытке выращивания в отсутствии фитогормонов, клетки ди-■оскореи выдерживали только один цикл роста и в начале второго погибали. При добавлении в среду ауксина или комбинации фитогормонов штамм успешно выращивали в течении 10 + 15 пассажей, после чего клетки возвращали на контрольную среду.

Полученные результаты представлены в таблице И (среднее из 6 биологических повторностей, коэффициенты вариации не превышают 21%). Как следует из приведенных результатов, композиция фитогормонов не оказывает существенного влияния на рост культуры, но значительно сказывается на синтезе сапонинов. Установлено, что для

синтеза сапонинов необходимо присутствие ауксинов: при вырашивании клеток на среде, содержащей только кинетин, продуктивность культуры оказалась минимальной, при этом значительно изменилось отношение протодиосцин : дельтозид.

Таблица 11

Влияние различных комбинаций фитогормонов на характеристики роста и синтеза сапонинов штамма ДМ-0,5. (обозначения см. стр. 5.).

1 | Фитогормоны и П 1 1 Р С Р 1 п/д I

I кинетин (0,1мг/л) 0,17 0,55 1 4,2 414 21. 6 0,8 |

| НУК (0,25мг/л) 0,18 0,61 1 5,0 457 27 0 1,4 I

I ИУК (10мг/л) 0,16 0,67 1 6,1 585 32, 8 1,7 1

I 2,4Д (0,25мг/л) 0,18 0,53 1 9,7 918 43 2 1,9 |

I НУК + ВАЛ 0,20 0,66 ! 5,2 485 24 7 1,3 |

| (0,25 +0,1 МГ/Л)

I 2,4Д + кинетин* 0,20 0,56 110,2 932 44, 9 2.0 |

] (0,25 + 0,1 мг/л) г | |

* контрольная (стандартная) среда

Лучшие результаты получены на средах, содержащих 2,4Д - продуктивность клеток по сапонинам в этом случае в 1,5 * 2.0 раза выше, чем в других вариантах за счет повышения содержания сапонинов.

Возврат с различных вариантов сред на контрольную среду приводил к восстановлению высокой продуктивности клеток по росту и биосинтезу сапонинов и к характерному соотношению протодиосцин : дельтозид 2 : 1.'

Механизм влияния фитогормонов на синтез сапонинов неясен. Однако, различие во влиянии разных ауксинов указывает на возможность их непосредственной регуляторной роли в биосинтезе стероидных гли-козидов.

Влияние неспецифического стресса. В качестве стрессовых факторов использовали гипоксию и "голодание" клеток. Эксперименты со штаммом Д-1 проводили на разных вариантах сред (5 - удвоенная концентрация сахарозы, N - азота, N3 - сахарозы и азота) и с двумя уровнями интенсивности стрессового воздействия.

В результате проведенных исследований было установлено, что

стрессовое воздействие приводит к увеличению содержания сапонинов в клетках штамма Д-1. При этом хорошо прослеживается зависимость степени увеличения содержания генинов от интенсивности стрессового фактора и фазы роста культуры в момент воздействия: чем воздействие интенсивнее и чем раньше оно было произведено, тем более существенен уровень повышения содержания сапонинов. Изменение содержания стероидов после стрессового воздействия зависит также от состава среды. Максимальное увеличение содержания сапонинов - в 3 4 ргша - получено в вариантах К и N при жестком воздействии на культуру, находящуюся в конце экспоненциальной фазы роста. Для вариантов 3 и N3 содержание сапонинов увеличивалось в 1,5 * 2 раза.

После воздействия стрессовыми факторами наблюдается четкая закономерность в изменении соотношения сапонинов. Во всех вариантах степень увеличения общего содержания 253-сапонинов выше, чем 25Н-сапонинов. Содержание фитостеринов в штамме Д-1 после стрессового воздействия меняется незначительно. Таким образом, при неблагоприятных условиях культивирования интенсифицируется синтез сапонинов, а не всей стероидной фракции клеточной культуры.

Характер изменения содержания сапонинов одинаков как при гипоксии, так и при "голодании" клеток. Это позволяет заключить, что действие указанных стрессовых' факторов неспецифично и что наблюдаемые изменения являются реакцией клеточной культуры именно на неблагоприятные условия, а не на специфику действия факторов.

Эксперименты по влиянию неспецифического стресса на содержание стероидов в штамме ДМ-0,5 показали, что для этого штамма стрессовые воздействия не приводят к увеличению содержания сапонинов.

Оценка штамма ДМ-0,5 как источника коммерческого препарата. Продуктивность штамма ДМ-0,5 по сапонинам при различных условиях культивирования представлена в таблице 12. Из анализа приведенных результатов следует, что варьирование условий культивирования может изменить содержание сапонинов в (слетках, но только в сторону их уменьшения. Таким образом, повышение продуктивности клеток по сапонинам оказывается возможным лишь путем повышения продуктивности культуры по биомассе. Максимальная продуктивность получена при культивировании штамма ДМ-0,5 в режиме хемостата. Некоторое снижение содержания сапонинов в клетках (до 6%) перекрывается выигрышем по выходу биомассы. Полученная продуктивность штамма ДМ-0,5 по сапонинам превышает продуктивность по веществам вторичного метаболизма известных по публикациям штаммов-продуцентов.

Таблица 12

Продуктивность штамма ДМ-0,5 по сапонинам при различных условиях культивирования (в мг/л за суткй).

1 1 | Норм. Ферм. Пов. Сах. 1 1 1 Р043~1 1 I Азот Горм. 1 Хемост.|

| Min. 1 34,0 24,7 1,7 28,8 ) 1 1 39,8 | 5,8 24,5 |

1 Мах. 1 70,4 62 ,-4 10,8 43,8 1 44,0 | 41,3 41,7 |

I М 1 44,7 46,2 1 1 115,5 |

1 б | 1 15,3 | 17,1 1 1 I I 1

где: Min., Max., М - соответственно минимальное

максимальное и среднее значение продуктивности, б - среднее квадратическое отклонение.

Варианты: Норм. - стандартное культивирование в колбах

Ферм. - периодическое культивирование в биореакторах Пов. - поверхностное культивирование (каллус) Сах., РО43-, Азот, Горм., - вариации в среде углеводов, фосфата, разных форм азота и фитогормонов соответственно Хемост. - проточное культивирование.

На основании имеющихся в нашем распоряжении исходных данных была проведена ориентировочная оценка рентабельности получения препарата фуростаноловых сапонинов из штамма ДМ-0,5.

К июню 1992 года оценка себестоимости 1 кг. биомассы культуры клеток при выращивании в биореакторе объемом 600 литров составляла около 4 ООО руб. (в расчет входила оценка амортизации оборудования, стоимости среды, заработной платы и энергозатрат). Близкие цифры получены при культивировании клеток женьшеня на Омутнинском биохимическом заводе. Таким образом, себестоимость 1 кг. препарата фуростаноловых сапонинов составит около 90 ООО руб. Как показали предварительные эксперименты по применению препарата в животноводстве, его доза составляет 0,8 * 1,0 г. на курс (для крупного рогатого скота). Таким образом, цена одной дозы будет составлять 80 * 100 рублей, что, по оценкам специалистов, приемлемо.

Получения препарата фуростаноловых гликозидов и результаты

определения его биологической активности.

Способ выделения фуростаноловых гликозидов из биомассы клеток без применения хроматографии разработан совместно с Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН (группой д.б.н., проф. В.А.Пасешниченко). Способ защищен Авторскими свидетельствами N 1453667 и N 1594990. Принцип способа выделения препарата основан на обнаруженном свойстве сапонинов соосаждаться с белком. Для максимальной полноты соо-саждения предложено добавлять в среду выделения сывороточный альбумин до оптимальной концентрации.

Из биомассы клеток штамма ДМ-0,5 было наработано около 500 г. препарата фуростаноловых гликозидов. Выход препарата составил 95 * 96% от теоретически возможного, чистота - 65 * 70%, при этом примеси представлены в основном олигосахаридами. Однократное хрома-тографирование на колонке с силикагелем позволяет повысить чистоту препарата до 90 * 93%. Для испытаний по определению биологической активности препарата использовали неочищенный препарат.

Изучение токсических свойств препарата в опытах in vitro показали его низкую токсичность. В эксперименте с лимфоцитами периферической крови человека в дозе 100 мкг/мл он не оказывал цито-токсического действия - жизнеспособность лимфоцитов не отличалась от контрольных и составляла 85 * 90%. В опытах in vivo на крысах было установлено, что LD50 составляет около 1000 мг/кг для живот-. ных._0днократное и многократное введение препарата не вызывало аллергических реакций и не приводило к развит™ токсического действия. У крыс и кроликов не выявлено аномалий в развитии плода, не было выявлено уродств у потомства.

Определение иммуномодулирующих свойств препарата проводили в опытах in vitro и in vivo.

Исследования in vitro проводили в Институте трансплантологии РАМН, (совместно с В.С.Сусковой с сотр.) по

- влиянию препарата на Т-хелперы в реакции бласттрансформации лимфоцитов, индуцированных ФГА.

- влиянию препарата на активность NK - клеток (естественных клеток-киллеров) .

- влиянию препарата на генерацию и активность Кон-А-Т-супрессоров.

В зависимости от концентрации, препарат вызывал либо стимуляцию, либо супрессию пролиферативного ответа лимфоцитов на митоген-ный стимул ФГА. Наибольший стимулирующий эффект препарата выражен

в концентрации от 0,01 до 0.10 мкг/мл (эффект в 1.5 раза выше по сравнению с контролем). Препарат в концентрации от 1,0 до 100 мкг/мл оказывал ингибирующее действие на пролиферативный эффект лимфоцитов, индуцированный ФГА, вплоть до полного*исчезновения ответа. Циклоспорин А, взятый в качестве тест-препарата с выраженным иммуносупрессивным действием, в аналогичных концентрациях ингиби-ровал функцию Т-лимфоцитов в тесте РБТЛ.

В дозах от 0,1 до 100 мкг/мл препарат не оказывал влияния на активность естественных клеток-киллеров, также как и контрольный препарат - циклоспорин А.

Опыты по изучению влияния препарата на генерацию и активность индуцированных Кон-А Т-супрессоров показали, что препарат в определенной мере стимулирует генерацию этих клеток. Циклоспорин А не оказывает влияния на этот процесс.

Таким образом, в трех тестах клеточного иммунитета показано иммуномодулирующее действие препарата на разные субпопуляции лимфоцитов .

Определение иммуномодулируюших свойств препарата в тестах in vivo проводили в Институте медицинской радиологии РАМН (совместно с Б.П.Суриновым с сотр.) по его влиянию как на специфическую, так и неспецифическую резистентность. Кроме того определяли действие препарата на коррекцию иммунодефицитных состояний разной этиологии (пострадиационный, постстрессовый, опухолеассоциированный иммунодефицита) .

Введение препарата мышам за три дня до иммунизации значительно влияло на образование антителообразующих клеток (АОК) в селезенке. При этом наблюдалась стимуляция образования АОК в селезенке в диапазоне доз от 0,5 до 6 мг/кг с оптимумом при дозах 0,75 + 1,5 мг/кг. (рис. 6А). Масса селезенки и ее клеточность (содержание спленоцитов) существенно не изменялись.

Препарат спиростаноловых сапонинов при введении по той же схеме оказывал иммунодепрессивное действие уже при дозе 0,75 мг/кг (рис. 6В).

При анализе в крови мышей гемолизинов - антител к эритроцитам барана, оказалось, что как у низкоотвечающей линии мышей (С57В1), так и у высокоотвечающей линии (гибриды F1) титр гемолитической активности сыворотки крови после введения препарата возрастает примерно в 1,5 раза.

Исследование состояния показателей неспецифической резистент-

процент

600 -1

500 -

0 (К)

0.25 0,50 0,75 1 3 6 , 50 , ч

доза препарата (мг/кг)

I ) - . АОК в - И - АО К 10 6 -селезенке спленоцитов

процент

0 (к)

0,5

0,75

Г~1 - АОК в селезенке,

1 10/ у ч

доза препарата (мг/кг;

Ш- АОК 10 6-спленоцитов

Рис. 6. Влияние фуростаноловых (А) и спиростаноловых (В)

гликозидов на количество антителообразующих клеток в селезенке мышей.

ности у крыс показало, что при дозах препарата, стимулирующих ан-тителогенез, происходит увеличение содержания в крови лизоцима. Одновременно с этим, но в значительно меньшей степени активизируется система комплемента.

При испытании иммуномодулирующих свойств препарата при пострадиационном иммунодефиците (после облучения мышей в дозах 2 и 4 Гр) наблюдалась стимуляция антителогенеза (увеличение содержания АОК в селезенке.) при дозе 0,5 мг/кг. Этот эффект проявлялся через 3, 7, 14 суток после облучения и введения препарата. Препарат повышал концентрацию лизоцима в крови у облученных крыс через 3 и 14 суток после воздействия радиации и его введения, именно в те сроки, когда в группе облученных животных без введения препарата наблюдалось снижение концентрации лизоцима.

Фуростаноловые гликозиды обладают иммуномодулирующей активностью при постстрессовом иммунодефицитном состоянии. Если стрессовое воздействие на мышей - плавание в течение 60 мин - угнетает почти в 2 раза антителогенез, то введение препарата восстанавливает антителогенез практически до уровня контроля.

Для исследования влияния препарата на антителогенез при опу-холеассоциированном иммунодефиците его вводили мышам в разных дозах начиная через сутки после инокуляции карциномы Льюиса. Оказалось, что после иммунизации таких мышей эритроцитами барана содержание АОК в селезенке превышает в 1,5 * 2,5 раза уровень АОК у мышей без введения препарата.

Таким образом, исследования иммуномодулирующих свойств препарата в опытах in vivo показали явно выраженную иммуномодулирующую активность.

Изучение влияния препарата на репродуктивную систему проводили в Институте акушерства и гинекологии РАМН (совместно с В.В.Кор-ховым с сотр.). Препарат, вводимый подкожно в дозах от 1,0 до 3,0 Мг/кг вызывал стимуляцию овуляции у самок белых крыс (~ 11 ооцитов у контрольной группы и 14 * 15 - у опытной). В тех же концентрациях препарат вызывал достоверную стимуляцию овуляции и у самок кроликов (в контроле - 10 проовулировавших фолликулов, в опыте - 13 * 14). При этом происходило более чем двукратное увеличение массы яичников (60 * 63 мг/кг у контрольной, 140 * 160 мг/кг у опытной групп). Таким образом препарат обладает четко выраженным овулести-мулирующим действием. По оценкам специалистов, он имеет перспективы для использования в ветеринарии, медицине и животноводстве.

Анализ полученных результатов и постулирование некоторых общих закономерностей вторичного метаболизма в культуре клеток растений.

Для выявления ряда закономерностей вторичного метаболизма в культуре клеток растений важными являются следующие особенности метаболизма стероидов в культуре клеток диоскореи:

1. Высокий уровень синтеза и накопления сапонинов. В интакт-ном растении клетки, осуществляющие синтез сапонинов (клетки листа) содержат не более 1Z фуростаноловых сапонинов в расчете на сухую биомассу. Культивируемые клетки диоскореи содержат эти соединения в большем количестве, причем в лучшем мутантном штамме более чем на порядок (до "12% к сухой биомассе клеток).

2. Высокая стабильность синтеза и содержания сапонинов. Эта особенность также характерна для всех штаммов как при длительном субкультивировании при стандартных условиях, так и в цикле выращивания.

Отмеченные особенности в клетках in vitro могут быть обусловлены лишь двумя причинами:

- конституционно высоким уровнем синтеза сапонинов в штаммах из-за генетических изменений клеток в культуре вследствие спонтанного и (или) индуцированного мутагенеза.

- широкой нормой реакции -генотипов клеток в популяции по синтезу стероидных гликозидов и физиологической обусловленностью ее реализации на верхнем пределе. Эта причина предполагает физиологическую значимость фуростаноловых гликозидов для клетки in vitro.

Второе из указанных предположений подтверждается следующей особенностью синтеза сапонинов:

3. Снижением уровня содержания сапонинов при поверхностном культивировании. Содержание сапонинов в каллусных культурах в 3 * 5 раз ниже, чем при глубинном культивировании клеток. Однако при этом штаммовые особенности сохраняются - более продуктивные штаммы в суспензии соответственно остаются и более продуктивными при выращивании на твердых средах. Отсюда можно заключить, что генотипи-ческая характеристика клеток сохраняется независимо от способа культивирования, но высокий уровень и стабильность содержания сапонинов обусловлены главным образом физиологическими особенностями метаболизма клеток в суспензии.

Учитывая специфику культуры клеток как биологической системы (популяционный-контроль развития и четкая направленность в отборе клеток с метаболизмом, способствующим наиболее интенсивной и ус-

тойчивой пролиферации), логично предположить, что высокое содержание сапонинов может либо интенсифицировать пролиферацию клеток in vitro, либо делать ее более устойчивой при различных стрессах культивирования. Другими словами, высокое содержание сапонинов в клетках дает этим клеткам преимущество при отборе в популяции.

Анализируя возможные причины этого явления, можно придти к выводу, что здесь принципиальную роль играет следующая особенность:

4. Все штаммы содержат сапонины в фуростаноловой форме. Более того, в трех штаммах выявлена активность олигофуростанозид-специфичной в-глюкозидазы, переводящей фуростаноловую форму сапонинов в спиростаноловую, однако в интактных клетках эта реакция не осуществляется, скорее всего по причине разобщения фермента и субстрата. Обращает на себя внимание тот факт, что наиболее продуктивным по содержанию сапонинов является штамм ДМ-0,5, в котором активность этого фермента полностью отсутствует, что, вероятно, увеличивает широту нормы реакции по содержанию стероидных гликозидов клеток этого штамма.

Изложенные факты можно объяснить исходя из гипотезы, что клетки, имеющие фуростаноловые, но не спиростаноловые, сапонины имеют преимущество при пролиферации, причем в большей степени в суспензионной культуре. По нашим передварительным данным, фуростаноловые гликозиды интенсифицировали рост культуры клеток женьшеня, тогда как спиростаноловые сапонины ингибировали этот процесс.

Выяснение механизмов влияния фуростаноловых сапонинов на пролиферацию клеток является серьезной задачей и это предмет специального исследования. Однако, исходя из свойств фуростаноловых сапонинов можно предположить, что это либо Red-Ох-регулирование (в частности, антиоксидантное действие), либо влияние на стабильность мембран.

Следует отметить, что как показано в наших экспериментах, так й по данным литературы, фуростаноловые сапонины по ряду характеристик альтернативны спиростаноловым гликозидам (таблица 13). Особенно интересен тот факт, что кардинальные различия по многим свойствам, в том числе по биологической активности, имеют соединения, структурно различающиеся лишь наличием одной молекулы глюкозы, биогенетически связанные между собой и переходящие одно в другое в результате одностадийной реакции, катализируемой одним ферментом.

Таблица 13.

Сопоставление свойств фуростаноловых и спиростаноловых сапонинов.

1 | Свойства Фуростаноловая форма 1 Спиртютаноловая ф. |

| Растворимость водорастворимые водонерастворимые |

| Поверхностная | активность отсутствует поверхностно | активны |

| Действие на | биомембраны не лизирует (возможно стабилизирует) мембраны лизирует мембраны |

| Действие на I клетку стимулирует пролиферацию клеток цитотоксическая и | цитостатическая | активность |

| Действие на I Red-Ox систему 1 антиоксидантная активность активность' не | показана | 1 1

На основании приведенного анализа закономерностей синтеза стероидных соединений в культуре клеток диоскореи дельтовидной и синтеза веществ специализированного обмена в интактных растениях можно сформулировать концепцию некоторых закономерностей вторичного метаболизма в клетках in vitro. Исходные посылки:

1. Функции веществ вторичного метаболизма в интактном растении - экологические в широком понимании, то есть они необходимы для функционирования растения в реальной экологической ситуации.

Z. Любая клетка (в составе организма или изолированная) имеет вектор направленности метаболизма ("сверхзадачу"). В интактном растении этот вектор для клетки определяет контроль развития, причем конкретный механизм этого эпигенетического контроля пока неясен.

3. Культура клеток растений является экспериментально созданной биологической системой и представляет собой неполовую популяцию соматических клеток. Вектор метаболизма клеток в этой популя-

ции определен и направлен на достижение максимально интенсивной и устойчивой пролиферации в конкретных условиях.

Анализируя эти посылки можно сделать следующие заключения:

- вторичный метаболизм для клетки в интактном растении является одной из "сверхзадач", диктуемой организмом.

- вторичные метаболиты не несут специальной функциональной нагрузки в популяции культивируемых клеток или она является для них вторичной.

Из сопоставления этих выводов с посылкой 3 следует, что в культуре клеток синтез вторичных метаболитов должен или отсутствовать, или находиться на минимальном уровне.

Из анализа литературы следует что этот факт и наблюдается чаще всего: синтез вторичных метаболитов в первичных культурах тканей и клеток или отсутствует, или очень нестабилен.

В этом случае оптимальная стратегия получения высокопродуктивной культуры клеток в отношении веществ вторичного обмена может быть представлена следующей схемой.

1. Лучший вариант, обеспечивающий отбор клеток с высоким и стабильным синтезом вторичных метаболитов, реализуется в том случае, когда эти соединения способствовуют интенсивности или устойчивости пролиферации клеток. Этот случай изначально, видимо, чрезвычайно редок, исходя из экологической функций вторичного метаболизма в интактном растении. Для его осуществления возможно два подхода:

- изменить клетки и их метаболизм таким образом, чтобы вто-

ричныи метаболит оказался необходимым для устоичивои и интенсйнои пролиферации. Для такой процедуры, видимо, эффективен индуцированный мутагенез, но появление мутантов с нужными свойствами случайно и имеет очень низкую вероятность.

- выбрать форму соединения, на основе анализа его биогенеза, которая способствует пролиферации клеток in vitro. Чаще всего это может оказаться или транспортная форма или ближайший неактивный предшественник синтеза. Из этих соединений при необходимости может быть получен конечный продукт с помощью химического или ферментативного синтеза. Этот полусинтетический путь может оказаться весьма эффективным и коммерчески выгодным. Вероятность успеха такого подхода достаточно велика из-за существования функциональных пар метаболитов, характерных для интактного растения (аналогично фу-ростаноловым и спиростаноловым гликозидам).

• Если данный вариант осуществить не удается, этапами предлагаемой схемы могут Сыть уже известные:

2. Селекция клеток-продуцентов.

3. Поиск сигналов, посредством которых в йнтактном растении происходит управление синтезом вторичных метаболитов в клетках:

- воздействие неспецифическим стрессом

- воздействие элиситорами

- поиск специфических сигналов.

4. Разделение ростового и биосинтетического этапа культивирования клеток (вариант двухстадийного способа культивирования)

5. Применение генно-инженерных подходов регулирования активности ключевых ферментов биосинтеза вторичных метаболитов.

ВЫВОДЫ.

1. Охарактеризованы морфо-физиологические признаки четырех штаммов суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной. Показано различие в ультраструктуре клеток разных штаммов. Штамм ДМ-0,5 отличает структура активно секретирующей терпеноиды клетки.

2. Изучены характеристики роста штаммов при различных режимах глубинного культивирования (в колбах и биореакторах разной конструкции) . Показано, что штаммы- незначительно различаются по накоплению биомассы в цикле выращивания. Максимальная продуктивность по-биомассе получена при проточном культивировании штамма ДМ-0,5 в режиме хемостата - 2,5 г/л за сутки.

3. Установлен качественный состав стероидов штаммов культуры клеток диоскореи дельтовидной. Показано, что все штаммы содержат четыре фитостерина: ситостерин, стигмастерин, кампестерин и холестерин и четыре сапонина: протодиосцин, дельтозид (агликон диосге-нин) и их 25S-аналоги (агликон ямогенин). Таким образом установлены уникальность состава стероидов в культуре клеток растений (в йнтактном растении диоскореи не обнаружены 25S-сапонины) и тотипо-тентность растительной клетки in vitro (протодиосцин характерен для листьев растения диоскореи, дельтозид - для корневища).

Показано практически полное отсутствие спиростаноловых сапонинов для штамма ДМ-0,5 и незначительное их содержание (менее 2 * 3% от общего содержания сапонинов) для остальных штаммов.

Фитостерины в клетках находятся преимущественно в свободном виде (60%) и в виде гликозидов. Количество эфиров стеринов минимально.

4. Установлено, что штаммы значительно различаются по количественному содержанию сапонинов и незначительно - по содержанию фи-тостеринов. Штамм ДМ-0,5 является сверхпродуцентом по сапонинам и содержит их до 12% к сухой массе клеток. В штаммах Д-1, ДМ-8 и ДМ-1 это содержание составляет соответственно около 1.5%, 3% и 6% соответственно. Содержание фитостеринов для всех штаммов находится в пределах 0,2 +0,5% к сухой массе клеток. Показана высокая стабильность содержания сапонинов как при длительном субкультивировании клеток, так и в цикле выращивания культуры.

5. Установлено, что условия культивирования штаммов (вариации углеводного и минерального состава среды, различия в природе и количестве фитогормонов) не изменяют качественного состава стероидов в клетках, но могут вызывать изменения в их содержании и соотношениях. Наиболее сильно влияет на содержание сапонинов состав фитогормонов в среде. Показано, что для успешного синтеза сапонинов необходимо присутствие ауксинов, наиболее эффективным из которых является их синтетический аналог 2,4-Д.

Неспецифический стресс приводит к интенсификации синтеза сапонинов в низкопродуктивном штамме Д-1 и не влияет на содержание сапонинов в сверхпродуценте ДМ-0,5.

6. Показано, что максимальная продуктивность культуры клеток диоскореи дельтовидной по сапонинам достигается при проточном культивировании штамма ДМ-0,5 и составляет 115 мг/л за сутки. Использован оригинальный метод выделения сапонинов из биомассы клеток без применения хроматографии.

Таким образом, созданы научные основы технологии получения препарата фуростаноловых сапонинов на основе штамма-сверхпродуцента культуры клеток диоскореи дельтовидной.

7. Определена биологическая активность препарата фуростаноловых сапонинов, полученных из высокопродуктивного штамма ДМ-0,5. В тестах in vivo и in vitro показана иммуномодулирующая активность фуростаноловых сапонинов. Определено, что спиростаноловые сапонины имеют явно выраженный иммуносупрессорный эффект. Установлено, что препарат фуростаноловых сапонинов стимулирует овуляцию и сперматогенез у животных. По оценкам специалистов, препарат имеет перспективы для применения в животноводстве, ветеринарии и медицине.

8. На основе полученных экспериментальных данных сформулирована концепция о закономерностях синтеза вторичных метаболитов в культивируемых клетках растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Волкова JI.А., Попов A.C., Носов A.M., Бутенко Р.Г.// Сохранение биосинтетического потенциала клетками диоскореи (Dioscorea deltoidea Wall) после криогенного хранения. Доклады Академии Наук СССР, 1982, Т.265, N 2, с.504-506-

2. Носов A.M., Пауков В.Н., Бутенко Р.Г., Исследование стероидной фракции культуры клеток Диоскореи дельтовидной // Тез.докладов 1Y Всесоюзной конференции по культуре клеток и биотехнологии. Кишинев, Штиинца, 1983, с.67-68.

3. Носов A.M., Пауков В.Н., Бутенко Р.Г. Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой клеток Диоскореи дельтовидной.// Тез.докладов IY Всесоюзной конференции по культуре клеток и биотехнологии. Кишинев, Штиинца, 1983, с.68-69.

4. Каранова С.Л., .Носов A.M., Пауков В.Н., Шамина З.Б. Продуктивность различных клеточных линий Диоскореи дельтовидной.// Тез.докладов IY Всесоюзной конференции по культуре клеток и биотехнологии, Кишинев, Штиинца, 1983, с.69.

5. Волкова Л.А., Пауков В.Н., Носов A.M., Попов A.C., Бутенко Р.Г. Влияние аминокислот на клетки Диоскореи дельтовидной при подготовке к глубокому замораживанию и характеристика возобновленной культуры.// Тез.докладов IY Всесоюзной конференции по культуре клеток и биотехнологии. Кишинев, Штиинца, 1983, с. 216- 212.

6. Носов A.M., Пауков В.Н., Бутенко Р.Г. Стероидные соединения Dioscorea deltoidea Wall, при выращивании культуры в микробиологическом ферментере.// Прикладная биохимия и микробиология, 1984, т. XX, вып. I. с. 125-129.

7. Носов A.M. Стероидные соединения культивируемых клеток Dioscorea deltoidea Wall, при глубинном выращивании.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук. М., 1984.

8. Butenko R.G., Popov A.S., Volkova L.A., Cnernyak N.D., A.V.Nosov. Recovery of cell cultures and their biosenthetic capacity after storage of Dioscorea deltoidea and Panax ginseng cells in liquid nitrogen.// Plant Scince Letters, 1984, v 33, N 3, pp. 285-292.

9. Пауков B.H., Горская H.B.. Носов A.M., Каранова С.Л. Волкова Л.А. Попов A.C. Бутенко Р.Г. Культура растительных клеток диоскореи дельтовидной - перспективный источник стероидных соединений.// Тез.

докл. Первой республиканской конференции по медицинской ботанике. Киев, 1984, с.46.

10. Каранова С.Л., Носов A.M., Горская Н.В., Пауков В.Н., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. Селекция продуктивных клеточных линий Диоскореи дельтовидной - продуцента стероидных сапонинов.// Тез. докл. Всесоюзной конф."Новые направления биотехнологии" Пущино, 1984, с.85-86.

11. Носов A.M., Пауков В.Н. Бутенко Р.Г. Физиологическая регуляция синтеза стероидов в культуре клеток Диоскореи дельтовидной.// Тез. докл. Всесоюзной конф."Новые направления биотехнологии" Пущино, 1984, С.92-93.

12. Lipsky A.Kh., Nosov A.M., Paukov V.N., Karanova S.L. Growth and metabolism of the Dioscorea deltoidea cell culture on submerged cultivation.// In:"Plant Cell Culture" ed. R.G.Butenko. MIR Publ., 1935. pp.76-107.

13. Butenko R.G., Nosov A.M. Genetishe und physiologische Grundlagen der synthese pharmakologisch wichtiger stoffe mittels in vitro kultivierten Pf lanzenzellen.// In: Gesellschaft fur Arzneistofforshung der DDR simposium biogen arzneistooffe, auffindung chemie, biotechnjljgie. VEB Verlag, Volk und Gesundheit, Berlin, 1986, p 7.

14. Butenko R.G., Nosov A.M., Karanova S.L., Urmantseva V.V. Stress factors effect on steroids production in suspension culture of Dioscorea deltoidea - sapogenin and phytosterol production.// Int. Congr. Plant Tissue Cell Cult., 1985 6 Meet, p. 252.

15. Носов A.M., Пауков B.H., Бутенко P.Г. Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой клеток диоскореи дельтовидной.// В кн.:"Культура клеток растений и биотехнология" Москва, Наука, 1986, С. 76-79.

16. Носов A.M., Пауков В.Н., Кинтя П.К. Исследование стероидной фракции культуры клеток диоскореи дельтовидной.// В кн.:"Культура клеток растений и биотехнология" Москва, Наука, 1986, с. 79-83.

17. Каранова С.Л., Носов A.M., Пауков В.Н., Шамина З.Б. Продуктивность различных клеточных линий диоскореи дельтовидной.// В кн.:"Культура клеток растений и биотехнология" Москва, Наука, 1986, с. 83-87.

18. Бутенко Р.Г., Каранова С.Л., Шамина З.Б., Пауков В.Н., Носов A.M. Штамм культивируемых клеток растений Dioscorea deltoidea Wall, используемый для получения стероидных сапонинов с агликоном диосге-нином.// Авторское свидетельство N 1389283, 15 декабря 1987 г.

19. Носов A.M. Физиологическая регуляция роста и синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений.// Тез.докл. Y Всесоюзной (I Международн.) конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск, 1988, с.З.

20. Вильялобос Альваро, Носов A.M., Глубинное выращивание культуры клеток женьшеня настоящего.// Тез.докл. Y Всесоюзной (I Международн. ) конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск, 1988, с.94.

21. Гуриелидзе К.Г., Васильева И.С., Пасешниченко В.А.; Воробьев A.C., Носов A.M. Способ получения олигофуростанозидов.// Авторское свидетельство N 1453667, 21 сентября 1988 г.

22. Воробьев A.C. Васильева И.С., Пасешниченко В.А., Носов A.M. Способ получения олигофуростанозидов.// Авторское свидетельство N 1594990, 22 мая 1990 г.

23. Носов A.M., Стероидные соединения в культуре клеток диоско-реи дельтовидной.// Тезисы докл. Второго съезда Всесоюзн. общества физиологов растений. (24-29 сент. 1990г. ..Минск) Москва, 1990, с.69.

24. Васильева И.С., Пасешниченко В.А., Урманцева В.В., Носов A.M., Чхеидзе Э.Г., Беззубов A.A. Биосинтез фуростаноловых гликози-дов в суспензионной культуре клеток Dioscorea deltoidea Wall из [2-14С] ацетата.// "Биохимия",- 1990, т.55, вып.З, с. 564 - 570.

25. Шамков Н.В., Зайцева Г.В., Белоусова Н.М., Строгов С.Е.. Симонова Г.М.. Бутенко Р.Г., Носов A.M. Опыт крупномасштабного культиви^ рования клеток женьшеня в суспензии. II.Отработка режимов культивирования клеток женьшеня на опытно-промышленной установке.// "Биотехнология", 1991, N 3, с. 32 - 34.

26. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре.клеток растений.// В кн.: "Биология культивируемых клеток и биотехнология растений" Москва, Наука, 1991 г. с. 5 - 20.

27. Носов A.M. Получение медицинских и ветеринарных препаратов на основе фуростаноловых гликозидов из мутантного штамма ИФР-ДМ-0,5 культуры клеток диоскореи дельтовидной.// Тезисы докл. 1 Всесоюзн. конф. "Генная и клеточная инженерия", (ноябрь-декабрь 1990 г., Пу-щино), Москва, 1991г. с. 111-113.

28. Корхов В.В., Бойкова В.В.. Пасешниченко В.А., Васильева И.С., Носов A.M. Способ стимуляции овуляции у животных.// Авторское свидетельство заявка N 4487637/14. Положит, реш. от 30 марта 1992 г.

29. Князьков U.E., Лобакова Е.С., Носов A.M. Электронномикроско-пическое изучение клеток мутантных штаммов Dioscorea deltoidea in

vitro.// Тез. докл. XIY конф. по электронной микроскопии. Черноголовка, июнь 1992 г. с.195.

30. Р.Г.Бутенко, А.С.Воробьев, А.М.Носов, И.Е.Князьков. Синтез, накопление и локализация стероидных гликозидов в клетках разных штаммов Dioscorea deltoidea Wall.// Физиология растений, 1992, N 6., (в печати).

Информация о работе

Носов, Александр Михайлович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.23

Автореферат

Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы