Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение внутриклеточной локализации стероидных гликозидов в культивируемых клетках Dioscorea deltoidea wall

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение внутриклеточной локализации стероидных гликозидов в культивируемых клетках Dioscorea deltoidea wall"

РГо од - 1 ДПР Ь-о

На правах рукописи

КНЯЗЬКОВ ИГОРЬ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ СТЕРОИДНЫХ ГЛИК03ИД0В В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ DIOSCOREA DELTOIDEA WALL.

(Специальность 03.00.12 - физиология растений)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им К.А.Тимирязева РАН.

Научные руководители: д.б.н. А.М.Носов,

к. б.н. Е. С. Лобакова.

Официальные оппоненты:

Д.б.н., профессор И.П. Ермаков, К.б.н. Н.В. Загоскина.

Ведущее учреждение: Главный ботанический сад им.Н. В.Цицына

РАН, Москва.

Защита диссертации состоится ".-^Г" Р^у^т^^.лЪШ г. в /.<?. часов на заседании диссертационного совета К. 053.05.14. при Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М.Горького Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан . у^.&^У???'?*... 1996 г.

/

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

0.Г.Полесская.

Актуальность работы. Культура клеток высших растений, являясь источником получения экологически чистых продуктов метаболизма растений, в то же время - удобный объект для изучения фундаментальных вопросов биологии. В искусственно созданных и контролируемых условиях системы In vitro возможно подробное исследование процессов вторичного метаболизма растительных клеток.

В настоящее время изучение этих вопросов не сводится только к установлению закономерностей синтеза и накопления вторичных соединений. продуцируемых клеткой in vitro. Исследователей все более интересуют вопросы внутриклеточной локализации биосинтеза этих соединений. его регуляция. Разработка методов внутриклеточной идентификации вторичных соединений в культивируемых клетках также необходима для скрининга получаемых новых клонов и штаммов по их продуктивности. Это весьма актуально, поскольку поиск новых линий клеток-сверхпродуцентов обычно сложен методически и требует большого количества времени и материала для анализа.

Объектом нашего исследования явились исходно полученный и му-тантные штаммы культуры клеток диоскореи дельтовидной Dloscorea deltoidea Wall. Клетки этого растения при выращивании в системе in vitro накапливают большое количество стероидных гликозидов. Их количество варьирует в зависимости от выбора штамма и фазы его роста от 1 до 12 % на сухую массу. Секреции гликозидов в культуральную среду не происходит.

Таким образом, культура клеток диоскореи является интересной модельной системой для изучения внутриклеточной локализации вторичных метаболитов.

Цель работы. Разработка методов внутриклеточной идентификации стероидных гликозидов и исследование внутриклеточной локализации этих соединений в исходном и трех мутантных штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной.

Задачи исследования

1. Изучение физиологических характеристик роста и особенностей ультраструктурного строения клеток исходного и трех мутантных штаммов суспензионной культуры Dloscorea deltoidea .

2. Разработка методов выявления стероидных гликозидов в на-тивной и фиксированной ткани.

3. Определение внутриклеточной локализации стероидных глико-

зидов с применением:

- световой, электронной микроскопии и гистохимии.

- прямого определения стероидных гликозидов в различны;* структурах (клетках, протопластах, вакуолях).

4. Сопоставление результатов по определению внутриклеточноР локализации этих соединений, полученных с применением разных методов.

5. Разработка метода скрининга линий клеток-продуцентов культуры D.deltoidea на основе проведенных исследований.

Научная новизна работы. Разработан комплекс методов определения внутриклеточной локализации стероидных гликозидов в биомассе культивируемых клеток диоскореи дельтовидной штаммов с разнык уровнем продуктивности. Изучены особенности ультрастуктурной организации клеток исследованных штаммов. Установлена корреляция межд;, уровнем продуктивности этих штаммов и особенностями их ультраструктурной организации.

Показана корреляция между отложением электронноплотных соединений в различных клеточных компартментах и накоплением в биомассе стероидных гликозидов. Обнаружена связь активности флуоресценцт клеточных стенок и вакуолей в ультрафиолетовом свете с продуктивностью клеток.

Обнаружена гетерогенность популяции клеток по их продуктивное™ в пределах каждого штамма. Выделены и охарактеризованы интактные вакуоли: показана их гетерогенность по величине, плотности и значению рН их содержимого.

Определена локализация стероидных гликозидов как в свободнок пространстве клетки, так и в вакуолях. Обнаружена фракция слабс связанных гликозидов в межклетниках культивируемых клеток.

Практическое значение работы. Разработан метод оценки продуктивности клеточных линий культуры диоскореи дельтовидной in vitre по активности флуоресценции в проходящем ультрафиолетовом свете. Разработан метод фиксации материала, позволяющий сохранить в фиксированной ткани спирто- и водорастворимые стероидные гликозиды.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены ш XIV конференции по электронной микроскопии (биология и медицина) . Черноголовка, 1992 г., на II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алматы. 199; г. На семинаре Гумбольдт-Университета 1994г.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков и 2 таблицы. Список литературы включает 252 наименования.

Принятые сокращения и обозначения. РФП - ретикулярный футляр пластиды. СП - свободное пространство. ТСХ - тонкослойная хроматография. ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, ЭПР - эндогтлазмати-ческий ретикулум, ЭПС - электронноплотные соединения.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служила культура клеток Dloscorea deltoldea Wall, полученная из корневища интактного растения в 1969 г. М. А.Саркисовой и Р.Г.Бутенко (штамм ИФР Д-1) [Саркисова. 1970]. Мутантные штаммы ИФР ДМ-0,5. ИФР ДМ-1 и ИФР ДМ-8 были получены С.Л.Карановой при обработке исходного штамма химическим мутагеном N-нитрозо-М-метилмочевиной в дозах соответственно 0,5; 1,0 и 8,0 шМ/час [Каранова и др. ,1975]. Основным различием штаммов является продуктивность по фуростаноловым гликозидам. Штаммы Д1 и ДМ-8 являются низкопродуктивными (1,0 -3,0% к сухой массе клеток); штамм ДМ-О,5 является сверхпродуцентом (6 - 12%) и штамм ДМ - 1 занимает промежуточное положение по этому признаку (4-6%). Кроме того штамм ИФР ДМ-8 является прототрофным по фитогормонам. В большинстве случаев эксперименты проводили на клетках штамма ДМ-0.5.

Выращивание и характеристика культуры клеток. Штаммы выращивали на модифицированной среде Мурасиге и Скуга в колбах на качалке (100 об/мин). Рост и физиологическое состояние клеток оценивали по изменению: веса сухой и сырой биомассы клеток; их числа; жизнеспособности; агрегированности.

Ультраструктуру клеток изучали с использованием трансмиссионной электронной микроскопии. Для этого клетки промывали средой, отфильтровывали под вакуумом и фиксировали, параллельно используя три различных способа.

1. Фиксация в 0,5%-ном глютаровом альдегиде на буфере Милло-нига [Mlllonlg,1965] в течение 45 мин с постфиксацией в 1%-тетрао-киси осмия на том же буфере в течение 4 часов.

2.Фиксация в 2%-ном глютаровом альдегиде на какодилатном буфере (12 ч при 2оС) с постфиксацией в 1%-ном перманганате калия в течение 1ч.

3. Фиксация в 2%-ной тетраокиси осмия в течение 4 ч на како-дилатном буфере.

Обезвоживание проводили в спиртах возрастающей концентрации (703? спирт был насыщен уранилацетатом) и заливали материал в Эпон. Для обезвоживания материала в некоторых экспериментах использовали также ацетон. Срезы получали на микротоме ОМ-УЗ фирмы "Reichert" (Австрия). Материал контрастировали в растворе цитрата свинца в течение 30 мин. Срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Получение изолированных протопластов и вакуолей. Для получения протопластов клетки инкубировали в среде MC, содержащей О,4M маннита. 0.5% целлюлазы. 0.25% мацерозима, 0,25% целлюлизима при 24°С в течение 12 ч на качалке. Полученные протопласты дважды промывали осмотиком (О,4M маннит). Очистку от клеток и клеточных агрегатов проводили путем флотации суспензии протопластов в 22 SS-ной сахарозе центрифугированием в течение 20 мин при 100 g.

Для получения вакуолей изолированные протопласты разрушали, используя различные способы лизиса плазмалеммы: а) лизис детергентами (дигитонин 1 mg/ml или ДЕАЕ-декстран 0,05 mg/ml); б) гипоос-мотический лизис (среда с 0,25 М маннитом); в) гиперосмотический лизис (среда с 0,85 М маннитом).

Для очистки изолированных вакуолей использовали градиент плотности сахарозы или фикола (0, 5%, 10%. 20%) по стандартной методике. Центрифугирование проводили на центрифуге L8-80 MR фирмы Beckman (Австрия) (ротор типа SW-40 TI) при 284.000 g в течение 1ч.

Анализ стероидов. Химический анализ проводили спектрофотометри-ческим способом по модифицированной методике [Пасешниченко.1972]. Тонкослойную хроматографию сапонинов проводили на пластинках "Sllufol" (Chemarol.ЧСФР) в системе хлороформ: метанол: вода = 65:35:10. Пластинки проявляли реактивом Эрлиха.

Для сопоставления содержания фуростаноловых гликозидов в интакт-ных клетках и изолированных протопластах рассчитывали количество этих соединений на одну клетку или протопласт. Подобная процедура пересчета необходима, поскольку при выделении протопластов с ферментативным лизисом клеточной стенки и при обезвоживании теряется значительная масса клетки.

Изучение автофлуоресценции клеток, изолированных протопластов и вакуолей проводили в микроскопе Reichert Jung. Unlvar (Австрия) при длине волны возбуждения 390 нм и фильтре 450 нм.

Экспериментальная часть.

Основными методами определения внутриклеточной локализации соединений являются методы фракционирования и гистохимии. Однако их применение, как правило, ограничено малорастворимыми или связанными с мембранами веществами. Наиболее точным является метод электронно-микроскопической иммунной гистохимии.

Фуростаноловые гликозиды - соединения водо- и спиртораство-римые. Получение специфических антител к этим веществам затруднено, так как они не являются белковыми соединениями. Поэтому, применение отдельно каждого из перечисленных выше методов недостаточно надежно.

Исходя из изложеного и используя тот факт, что стероидные гликозиды являются электоронноплотными соединениями, в данной работе были параллельно применены: методы фракционирования, световой гистохимии и прямой электронномикроскопической гистохимии.

Сопоставление результатов, полученных различными методами, может достаточно надежно дать ответ о внутриклеточной локализации фуростаноловых гликозидов.

МорФо-Физиологическая характеристика штаммов

культуры клеток Dloscorea deltoldea Wall.

В популяции изученных штаммов диоскореи выявили два типа клеток: меристемо- и паренхимоподобные. В период активного роста (экспоненциальная фаза) меристематические клетки преобладали во всех штаммах и составляли около 55-85% популяции. Клетки изученных штаммов сравнительно мелкие и плотно упакованы в агрегатах.

Жизнеспособность клеток в цикле выращивания для всех штаммов варьировала от 65 до 85 % .

Кривые роста для исследуемых штаммов по числу клеток и сухой биомассе имели S-образный вид, типичный для большинства культивируемых в периодическом режиме клеток. Характерной особенностью ростовой кривой для всех штаммов D.deltoldea является очень корот-

кал стационарная фаза роста. Цикл выращивания составлял в среднем 14-18 суток.

Все исследуемые штаммы культуры клеток диоскореи дельтовидной имели достаточно высокие ростовые характеристики (удельная скорость роста 0,16 - 0.20 сут.-1, индекс роста по сухой биомассе 6,8 - 8,4), но различались по продуктивности: 0,55 г/л сухой массы в сутки для штамма Д-1 и 0,66 - для штамма ДМ-0.5.

Электронномикроскопическая характеристика клеток

изученных штаммов диоскореи дельтовидной.

Известно, что в процессе выращивания клеток диоскореи содержание стероидных гликозидов в биомассе увеличивается и достигает максимума в стационарной фазе роста [Носов и др.. 1986]. Исходя из этого, для изучения материала было выбрано две точки на ростовой кривой - 10 и 17 сутки культивирования, что соответствует экспоненциальной и стационарной фазам роста.

Анализ полученного материала позволил выделить следующие особенности культивируемых клеток диоскореи. типичные для биосинтети-чески активных клеток терпеноидного типа : ядра округло-овальной формы ограниченны осмиофильной ядерной мембраной с большими активными порами. Сильно развитый ЭПР. расположенный параллельными рядами вокруг пластид и вдоль клеточной стенки, пронизывает всю цитоплазму. Каналы ЭПР состоят из чередующихся фрагментов агрануляр-ного и гранулярного ретикулума, что свидетельствует о тесной связи белкового и липидного биосинтеза в клетке диоскореи.

Для изучения внутреннего строения пластид была использована фиксация материала перманганатом калия. Как правило, внутренние мембранные структуры пластид изученных клеток расположены параллельными рядами в виде гран или концентрических колец.

Сильно складчатая, ассимметричная цитоплазматическая мембрана на некоторых участках образует ломасомы. что может свидетельствовать об активной роли плазмалеммы в биосинтезе, секреции и обмене продуктами метаболизма с соседними клетками. В межклетниках обнаружены осмиофильные отложения фибриллярной структуры.

Все перечисленные особенности ультраструктурной организации клеток диоскореи характерны для биосинтетически активных клеток терпеноидного типа [Васильев.1977].

Наряду с общими чертами строения, штаммы имели индивидуальные

особенности, связанные в основном с преимущественным развитием тех или иных органелл. При этом наибольшие отличия были выявлены между штаммами Д-1. имеющим низкие количества стероидных гликозидов и высокопродуктивным по этим соединениям штаммом ДМ-0,5. Для клеток штамма ДМ-0,5 в конце экспоненциальной фазы роста характерно сильное развитие мембранного аппарата клетки, а именно: диктиосом, ЭПР смешанного типа и ретикулярных футляров пластид.

Кроме того, в клетках высокоагрегированных штаммов ДМ-0,5 (рис.1а) и ДМ-8 отмечено развитие структурированных межклетников.

Особенностью штамма ДМ-8 является накопление липидов, локализованных как в цитоплазме, так и в пластидах; помимо этого в клетках штамма ДМ-8 отмечено образование кристаллов и сферических пластоглобул в лейкопластах.

Таким образом, для высокопродуктивных по сапонинам штаммов диоскореи характерно преимущественное развитие и биосинтетически активных органелл и запасающих компартментов (вакуолей и межклетников) .

На стационарной фазе роста культуры в сильно развитых межклетниках с утолщенной электронноплотной клеточной стенкой отметили наличие многочисленных полостей. В дальнейшем содержимое межклетников подвергалось полной деструкции (рис.1 б). Наиболее сильно эта отличительная особенность выражена в крупно агрегированных штаммах ДМ-0,5 и ДМ-8. а также в клетках, находящихся в центре агрегатов мелко агрегированных штаммов.

В стационарной фазе роста наибольшие различия клеток разных штаммов наблюдаются в строении и развитии вакуолярного аппарата: в клетках штамма Д-1 сохраняется много мелких вакуолей; в клетках ДМ-0.5 и ДМ-8 центр клетки занимает одна большая вакуоль сферической формы, а в штамме ДМ-1 вакуоли пересечены многочисленными ци-топлазматическими тяжами, тонопласт при этом складчатый и элект-ронноплотный.

Таким образом, клетки штаммов Б. сЫШбеа отличаются друг от друга по степени развития и количеству определенных органелл. Степень этого различия в значительной мере коррелирует с уровнем их активности в накоплении стероидных гликозидов.

Рис. 1. Особенности строения межлетников в агрегатах клеток О.беиоМеа штамма ДМ-0,5 (фиксация глютаральдегид -осмий):

а) фаза экспоненциального роста (10 сут.культ.);

б) стационарная фаза роста (17 сут.культ.).

В - вакуоль, КС -клеточная стенка, Мкл - межклетник

- и -

Определение содержания стероидных гликозидов в клетках и протопластах штамма ДМ-0.5.

Для определения локализации стероидных гликозидов в клетках было исследовано их содержание в протопластах и свободном пространстве ("части клетки, лежащей вне объема, ограниченного плазма-леммой" [Курсанов,1976]).

В качестве дополнительного контроля использовали определение стероидных гликозидов в клетках после инкубации их в среде с осмо-тиком (но не содержащей ферментов) и 3-х кратного центрифугирования.

Изучение распределения стероидных гликозидов в свободном пространстве клетки и протопласте проводили на 7 и 14 сутки культивирования, соответствующие экспоненциальной и стационарной фазам роста. Средние данные двух независимых опытов приведены в табл.1.

Таблица 1.

Содержание сапонинов в клетках и изолированных протопластах, (в процентах на сухую массу клетки).

Возраст, сут Протопласты Клетки, Клетки без

обработанные осмотиком обработки

7 0,75% 3,30% 3,50%

14 2,00% 3,60% 4,60%

Как следует из представленных данных , стероидные гликозиды содержатся как в свободномом пространстве, так и в протопласте. В свободном пространстве клеток содержание гликозидов в процессе онтогенеза практически не изменялось и составляло около 2,6-2,7% на клетку.

Содержание стероидных гликозидов в клетках в цикле роста возрастало за счет их накопления в протопласте. Количество локализованных там сапонинов увеличивалось более чем в 2 раза как по абсолютному, так и по относительному значению.

Следует отметить, что в стационарной фазе роста в свободном пространстве клеток увеличивалась доля слабо связанных стероидных

гликозидов, потерю которых наблюдали при повышении осмотической плотности среды (второй контроль эксперимента). Относительное количество таких гликозидов в свободном пространстве возрастало от 7 до 40 %, что составляло 6-22 % общего содержания этих соединений в клетке.

Таким образом, был сделан вывод о 3-х пулах стероидных гликозидов в клетке: один в протопласте и два (прочно и слабо связанные) в свободном пространстве клетки.

Получение и характеристика изолированных вакуолей

из штаммов Д-1 и ДМ-0.5 Dioscorea deltoidea.

Предварительные эксперименты показали, что плазмалемма клеток диоскореи изученных штаммов обладает повышенной прочностью. Вакуоли из протопластов D.deltoidea были выделены только после дополнительного разрушения плазмалеммы химическими детергентами (дигито-нином, ДЕАЕ-декстраном, CHAPS) или после осмотического лизиса протопластов. В последнем случае применяли как гипоосмотический, так и гиперосмотический шок. Разделение вакуолей затем проводили на градиенте сахарозы или фикола.

Наблюдение протопластов (рис. 2а) и содержащихся в них вакуолей, а также изолированных вакуолей в световом микроскопе после окрашивания нейтральным красным (рис. 26) показало, что содержащиеся в клетках вакуоли очень гетерогенны , и относятся к двум типам:

1-й тип: мелкие (d = 10 - 20 мкм) большой удельной плотности (с 15/1-ного фикола), окрашивающиеся нейтральным красным в красно-малиновый цвет,

2-й тип: большие (d = 45 - 60 мкм) слабоокрашенные светложел-товатые меньшей плотности (с 10%-ного фикола).

Поскольку цвет нейтрального красного зависит от кислотности среды [Луппа,1980]. был сделан вывод о содержании в одной клетке вакуолей с различным рН.

Прочность мембран тонопласта у разных типов вакуолей к деформирующему воздействию (сжатие-растяжение) различна. Так, при выделении вакуолей с использованием гипоосмотического шока преобладали вакуоли 2-го типа, а при гиперосмотическом лизисе протопластов -1-го типа.

Однако, в клетках высокопродуктивного штамма ДМ-0,5 всегда

Рис. 2а. Изолированные протопласты D.deltoldea, штамм ДМ-0.5; 14 сут.культивирования.

Рис. 26. Гетерогенность вакуолей,

изолированных из D.deltoldea, штамм ДМ-0,5; 14 сут.культ., (фазов.контр.): I - вакуоли 1 типа,

II - вакуоли 2 типа.

преобладал 2-й тип вакуолей, а в исходном штамме Д-1 - вакуоли первого типа, которые'имели большую удельную плотность.

На основе выявленного различия в строении и продуктивности изученных штаммов и разницы физических характеристик двух типов вакуолей можно сделать предположение о разной роли этих вакуолей в компартментации вторичных соединений. В этом случае соотношение разных типов вакуолей в клетках может служить маркером продуктивности штаммов по стероидным гликозидам.

Для установления локализации стероидных гликозидов в вакуолях провели изучение автофлуоресценции интактных клеток, изолированных протопластов и вакуолей разных штаммов культуры клеток диоскореи (рис 3). Данный подход основан на способности фуростаноловых гликозидов флуоресцировать в проходящем ультрафиолетовом свете [Луп-па, 1980]. Обнаружено, что вакуоли Б.с1еио1с1еа интенсивно флуоресцируют в клетках, протопластах и в изолированном состоянии. Также была выявлена значительная флуоресценция клеточных стенок и межклетников в клетках наиболее агрегированных штаммов: ДМ-8 и ДМ-0,5.

Флуоресценция и интактных клеток, и изолированных вакуолей была максимальной для суспензионной культуры клеток высокопродуктивного штамма ДМ-0,5 (рис. За). Минимальный уровень флуоресценции выявлен для клеток штамма Д-1 (рис. 36). Таким образом, можно отметить положительную корреляцию между интенсивностью флуоресценции и содержанием стероидных гликозидов в штаммах.

В качестве контроля в этом эксперименте служили изолированные протопласты и вакуоли культуры клеток сахарной свеклы, не содержащей стероидных гликозидов. У исследованной культуры флуоресценция в данных условиях отсутствовала.

На основании этого предположили, что выявленная флуоресценция может быть обусловлена наличием стероидных гликозидов.

Рис. 3. Автофлуоресценция клеточных агрегатов суспензионной культуры 0.<Зе1Со1с1еа (14-е сутки культивирования, длина волны возбуждения 390 нм, фильтр 450 нм): а) штаммДМ-0,5; б) штамм Д-1.

Определение внутриклеточной локализации стероидных гликозидов

методом электронной микроскопии.

Для выявления в клетках стероидных гликозидов предварительно провели скрининг различных методов фиксации и отбор веществ, избирательно повышающих электронную плотность стероидных соединений.

Потери гликозидов во время фиксации и обезвоживания контролировали методом ТСХ, определяя их содержание в отработанных растворах.

Обнаружено, что хотя тетраокись осмия прочно связывается со стероидной группой гликозидов, осмиевая фиксация в стандартных условиях не стабилизировала стероидные гликозиды в местах их витальной локализации. Установлено, что в этом случае основные потери стероидных гликозидов происходили во время обезвоживания. Аналогичное вымывание гликозодов наблюдали и при фиксациях клеток глю-таральдегидом и перманганатом калия. Было сделано предположение, что все используемые фиксации недостаточно стабилизируют мембраны клетки, с чем и связано вымывание стероидных гликозидов.

Для стабилизации водорастворимых соединений (в том числе и стероидных гликозидов) в среду была добавлена глюкоза, а барьерные свойства мембраны усилены за счет двойной фиксации: О,5% глюта-ральдегидом ( связывающимся с белками) и 1% осмием (связывающимся со стероидами). Кроме того, мембраны дополнительно стабилизировали ионами кальция.

ТСХ-контроль показал, что при таком способе фиксации стероидные гликозиды практически не вымывались из клеток.

В материале, фиксированном этим способом обнаружено большое количество электронноплотных соединений (ЭПС) локализованных в основном в свободном пространстве клеток и вакуолях.

При этом количество ЭПС коррелировало с продуктивностью штамма и накоплением гликозидов в цикле роста. Максимальное накопление осмиофильных веществ обнаружено в высокопродуктивном штамме ДМ-0,5 в стационарной фазе роста (17 сутки культивирования). Клеточная стенка имела высокую электронную плотность. Осмиофильны плазмалем-ма клеток, мембраны пластид, диктиосом и продуцируемых ими пузырьков Гольджи.

В стационарной фазе роста, по сравнению с активно пролифери-рующими клетками увеличивается доля компартментов, запасающих ЭПС. Однако плотность осмиофильных включений в межклетниках и вакуолях

- 17 -

в обоих типах клеток примерно одинакова.

Сопоставление этих данных с ранее известными, а именно:

- большой концентрацией стероидных гликозидов в клетке (до 10% на сухую массу).

- увеличением их содержания в биомассе в цикле роста.

- способностью тетраокиси осмия, цитрата свинца и уранилацетата связываться со стероидной группой гликозидов, увеличивая тем их электронную плотность,

- стабилизацией гликозидов в клетках при данных условиях фиксации

можно сделать предположение, что обнаруженные ЭПС могут быть стероидными гликозидами.

Доказательством этого служит аналогичное распределение ЭПС (в клеточных стенках и вакуолях) в клетках всех изученных штаммов ди-оскореи.

При этом обнаружено, что:

1. В клетках штамма Д-1, накапливающих лишь 1-3% стероидных гликозидов ЭПС в клеточной стенке и вакуолях практически отсутствуют.

2. В вакуолях и по тонопласту клеток штамма ДМ-1 обнаружено значительное отложение ЭПС. Клеточная стенка низкой электронной плотности, межклетников почти нет.

3. В клетках штамма ДМ-8 ЭПС, напротив, локализованы преимущественно в клеточной стенке и межклетниках.

Опыты также показали, что при увеличении числа и протяженности таких органелл, как ЭПР. диктиосом и пластид в более продуктивных штаммах степень их электронной плотности не увеличивается. Возможно это связано с быстрым транспортом синтезируемых соединений в запасающие компартменты. Данная черта свойственна именно штаммам-сверхпродуцентам.

Таким образом, вся сумма полученных электронномикроскопичес-ких данных позволяет считать, что обнаруженные ЭПС могут быть стероидными гликозидами.

Сравнение распределения электронноплотных включений

в клетках. Фиксированных разными методами.

Для дополнительного доказательства того факта, что обнаруженные осмиофильные включения в клетках разных штаммов являются гликозидами, провели подробное сравнение клеток, фиксированных в ус-

ловиях стабилизирующих стероидные гликозиды, с микрофотографиями материала, фиксированного в условиях контролируемого экстрагирования этих соединений.

Было показано, что выявленные нами ранее ЭПС при избирательном экстрагировании стероидных гликозидов (осмиевая фиксация) в клеточных стенках и межклетниках высокопродуктивного штамма ДМ-0.5 практически отсутствуют. Вакуоли клеток, после фиксации одним осмием также практически лишены электронноплотных включений.

Аналогичное вымывание ЭПС в сходных условиях фиксации отмечено в клетках штамма ДМ-8. На наш взгляд это служит достаточным доказательством нашего предположения о том, что электронноплотные включения в вакуолях и свободном пространстве клеток представлены в основном стероидными гликозидами.

Заключение и обсуждение.

Анализ выполненной работы позволяет заключить, что результаты всех экспериментов указывают на преимущественную локализацию стероидных гликозидов в вакуолях и свободном пространстве клетки. Эти данные согласуются с общепринятой точкой зрения о компартментации вторичных соединений в клетках растений. Согласно этой концепции, в клетках синтез и накопление вторичных метаболитов пространственно разделены. При этом синтез осуществляется в метаболически активных компартментах (цитоплазма. ЭПР, пластиды), а накопление - в метаболически неактивных (вакуль, СП).

Как свидетельствуют данные литературы [Glelzes, 1976; Сухов.1956; Fahn,1987], роль веществ, откладывающихся в клеточной стенке и запасаемых в вакуолях различна: в вакуолях - реутилизиру-емая форма соединений, тогда как в клеточной стенке не реутилизи-руемые вещества, функционирующие как стрессовые и сторожевые агенты на пути проникновения в клетку патогенов.

Таким образом, можно сделать предположение о том, что преимущественная компартментация гликозидов в начале цикла роста в СП клеток может быть связана не только со слабым развитием вакуоляр-ного аппарата в это время, но и с тем, что клетки при периодическом пассировании испытывают некоторый стресс. Этот стресс вызывает и лаг-фазу роста и транспорт стероидных гликозидов в клеточную стенку и межклетники.

Можно предположить также, что обнаруженные при химическом

анализе различные эпимерные формы гликозидов (на основе ямогенина и диосгенина) локализованы в разных компартментах. Обнаруженная гетерогенность вакуолей может свидетельствовать о разной роли в компартментации вторичных соединений вакуолей разных типов. Преобладание в высокопродуктивных клетках штамма ДМ-0,5 крупных вакуолей второго типа позволяет предположить локализацию в них водорастворимых фуросапонинов.

Выводы.

1. Проведено изучение ультраструктуры клеток четырех штаммов диоскореи дельтовидной, различающихся по уровню накопления стероидных гликозидов. Установлено, что клетки изученных штаммов по своему строению могут быть отнесены к клеткам терпеноидного типа. Степень развития органелл, синтезирующих терпеноидные соединения, коррелирует с продуктивностью штаммов по стероидным гликозидам.

2. Произведено изучение распределения электронноплотных соединений в различных компартментах клетки.

Максимальное содержание электронноплотных веществ было выявлено в вакуолях и свободном пространстве клетки. Показано, что при избирательном вымывании стероидных гликозидов из клеток изученных штаммов электронноплотные соединения в этих структурах не выявляются. На основании этих фактов и учитывая, что стероидные гликозиды являются осмиофильными веществами и накапливаются в клетках в большом количестве (до 10%), сделано предположение о локализации их в вакуолях и в свободном пространстве клетки.

3. Установлено, что в штаммах с разным уровнем содержания стероидных гликозидов распределение электронно-плотных соединений неодинаково и коррелирует с продуктивностью клеток по этим соединениям.

4. Проведено количественное определение содержания стероидных гликозидов в клетках и протопластах высокопродуктивного по стероидным гликозидам штамма ДМ-0,5 в разные фазы роста. Показано, что в протопласте количество этих гликозидов в 2 - 5 раз меньше, чем в интактной клетке. Накопление стероидных гликозидов в цикле роста клеток происходит за счет увеличения их концентрации в протопласте (вакуолях).

5. Рассчитано содержание стероидных гликозидов в свободном пространстве клетки и показано, что в цикле роста не происходит

изменений в количественном содержании гликозидов в этом компарт-менте. однако значительная их часть переходит в слабо связанную форму. ^

6. Посколку стероидные гликозиды флуоресцируют в проходящем ультрафиолетовом свете, проведено изучение флуоресценции суспензионной культуры клеток, протопластов и вакуолей. Установлено, что максимальная флуоресценция клеток связана с вакуолями и клеточной стенкой изученных штаммов. Уровень автофлуоресценции коррелирует с накоплением клетками стероидных гликозидов и может служить критерием отбора продуктивных клонов диоскореи при селекции.

7. Сопоставление полученных результатов, позволяет заключить, что депонирование стероидных гликозидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной может происходить в клеточной стенке, межклетниках и в вакуолях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Бутенко Р.Г.. Воробьев А.С..Носов A.M..Князьков И.Е. Синтез, накопление и локализация стероидных гликозидов в клетках разных штаммов Dloscorea deltoidea Wall.// Физиология растений. 1992. 39.-Вып.6.-с.1146-1153.

2. Князьков И.Е.,Лобакова Е.С..Носов A.M. Определение локализации стероидных гликозидов в культуре клеток Dloscorea deltoidea на основе изучения их ультраструктуры.// Физиология растений. 1994.-41,- N 6,- С.896-902.

3. Князьков И.Е.. Носов A.M. Выделение вакуолей из клеток суспензионной культуры Dloscorea deltoidea.// II Международная конференция: Биология культивируемых клеток растений и биотехнология. Тез. докл. - Алматы., 1993. - С. 175.

4. Князьков И.Е..Лобакова Е.С..Носов A.M. Электронномикроско-пическое изучение клеток мутантных штаммов Dloscorea deltoidea In vitro.// XIV конференция по электронной микроскопии (биология, медицина). Тез.докл. - Черноголовка., - 1992. - С. 195.