Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий - возбудителей заболеваний человека

Вишневская, Елена Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий - возбудителей заболеваний человека
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий - возбудителей заболеваний человека"

На правах рукописи

РГ5 ОЛ

ВИШНЕВСКАЯ Елена Борисовна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

03.00.07- микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный консультант: доктор биологических наук Шмелева Е.А.

Официальные оппоненты:

Профессор, доктор медицинских наук Дорожкова И.Р. Профессор, доктор медицинских наук Кочаровец В.И. Доктор биологических наук Черноусова Л.Н.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

Защита диссертации состоится «_»_2000 г. в_час

На заседании диссертационного совета Д 084.18.01. в Московском научно исследовательском институте им. Г.Н.Габричевского МЗ РФ по адресу: 125212 г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского МЗ РФ.

Автореферат разослан « » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Кандидат биологических наук С.Ю.Камбарова

> ••

Актуальность проблемы.

В 90-е годы во всем мире, даже в развитых странах, отмечен рост заболеваемости туберкулезом. Раннее выявление и диагностика туберкулеза являются актуальной задачей в борьбе с этим заболеванием.

Основным критерием при постановке диагноза туберкулез остается выделение возбудителя - Mycobacterium tuberculosis. В то же время, на ранних стадиях заболевания культура микобактерий выделяется не более чем у 20% больных, на более поздних - в 50 - 90%, при внелегочном туберкулезе эти цифры значительно ниже - 20 - 50% (Kallenius G., Hoffner S.E. е.а., 1994; Вишневский Б.И., Качанова Н.В., 2000). Методы культурального исследования, как правило, занимают месяцы. Современные варианты с применением жидких сред и автоматизированных систем требуют недель. Быстрый метод бактериоскопии не дает возможности дифференцировать M.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий и обладает низкой чувствительностью. Таким образом, разработка методов быстрого и специфичного выявления M.tuberculosis представляет собой важную проблему бактериологических лабораторий.

Одной из первоочередных задач бактериологической диагностики туберкулеза является повышение эффективности выделения культур микобактерий и их быстрая видовая идентификация. Известно, что помимо типичных клеточных форм, микобактерии могут присутствовать в макроорганизме в виде измененных вариантов, L-форм (Дорожкова И.Р. и др., 1980; Коваленко И.В., 1989). Однако, хотя методы выделения L-форм микобактерий из биологических образцов разработаны уже более двух десятилетий назад, вопрос точной видовой идентификации выделенных L-форм до сих пор остается не решенным окончательно. Для разрешения этой проблемы целесообразно применение молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить идентификацию выделенных L-форм на уровне генома.

Для прогнозирования течения заболевания и назначения адекватного лечения необходимо знать основные биологические свойства возбудителя. Особенности биохимических свойств микроорганизмов во многих случаях определяются наличием плазмид, несущих гены, ответственные за син-

тез биологически активных веществ. Многие исследователи сообщали о плазмидах у нетуберкулезных микобактерий (Meissner P.S., Falkinham J.O., 1986; Crawford J.T., Bates J.H., 1988), но четкой взаимосвязи между наличием плазмид и биологическими свойствами установлено не было, и этот предмет все еще требует изучения.

В последнее десятилетие для выявления М.tuberculosis в клинических образцах применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако, данные различных зарубежных исследователей об эффективности ПЦР при внелегочном туберкулезе весьма разноречивы (Tortoli Е. et al., 1997; Saltini С., 1998). Актуальной задачей является поиск оптимальных путей подготовки образца для детекции микроорганизмов амплификационными методами.

В структуре детского туберкулеза в России значительное место занимают заболевания, вызываемые вакцинным штаммом BCG. Стандартные методы идентификации М.bovis BCG трудоемки и не всегда точны; более того, диагностика таких заболеваний затруднена из-за низкой высеваемости возбудителя. В этом случае очень полезными могут оказаться чувствительные и специфичные молекулярные методы.

Все перечисленные проблемы обуславливают цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: Целью настоящего исследования явилась разработка и использование молекулярно-генетических методов для идентификации возбудителей туберкулеза и микобактериозов в клиническом материале.

Задачи работы:

1. Оценить эффективность амплификационных методов выявления микобактерий в нереспираторных клинических образцах и идентифицировать М. bovis BCG непосредственно в биологическом материале.

2. Разработать схему применения молекулярно-генетических методов в диагностике туберкулеза и микобактериозов.

3. Идентифицировать Ь-формы микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции.

4. Определить плазмидный профиль микобактерий и установить взаимосвязь наличия плазмид с биологическими свойствами штаммов.

Научная новизна:

Разработан дифференцированный подход для выявления микобактерий в различных типах клинических образцов методом ПЦР.

Разработана схема применения молекулярно-генетических методов в диагностике заболеваний, вызываемых микобактериями.

Предложен экспресс-метод определения М.Ьоу1з ВСО в клинических образцах.

С помощью молекулярно-генетических методов доказана микобактериальная природа Ь-форм, выделяемых из клинических образцов при туберкулезе, и определены особенности структуры ДНК микобактериальных Ь-форм.

Охарактеризован плазмидный профиль микобактерий, выделенных от больных, проживющих в Северо-Западном регионе Российской Федерации и установлена связь между частотой выделения плазмид и жизнеспособностью микобактерий

Практическая значимость исследования:

Предложенный вариант анализа Ь-форм микобактерий методом ПЦР позволяет быстро и надежно проводить их видовую идентификацию, что в значительной мере повышает эффективность бактериологической диагностики туберкулеза.

Разработанные варианты выделения ДНК из патологического материала и методы снижения ингибирования ПЦР клиническими образцами позволяют повысить эффективность выявления микобактерий туберкулеза методом ПЦР: для варианта очистки гель-фильтрацией - на 35%; для варианта с применением сорбента -на 18%; для анализа костей, суставов и тканей - на 25 - 30%.

Выявленная зависимость эффективности ПЦР от типа клинического образца позволила разработать практические рекомендации по выбору исследуемого

материала для обнаружения M.tuberculosis при исследовании биологического материала от больных внелегочным туберкулезом.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Эффективность применения полимеразной цепной реакции для выявления

M.tuberculosis в биологических образцах от больных внелегочным туберкулезом, которая достигнута за счет дифференцированного подхода к выделению ДНК из различных типов проб, превосходит эффективность стандартных бактериологических методов (микроскопии и посева) в 2 - 20 раз. Предложенная схема применения молекулярно-генетических тестов позволяет проводить ускоренную идентификацию и исследование биологических свойств микобактерий различных видов.

2. L-формы, выделяемые из биологических образцов от больных внелегочным

туберкулезом и идентифицированные методом полимеразной цепной реакции в 85% случаев принадлежат к M.tuberculosis и к М.bovis BCG, при этом ДНК культур L-форм не всегда содержит инсерционный элемент IS 6110.

3. Нетуберкулезные микобактерии - возбудители микобактериозов,

выделяемые от больных, проживающих в Северо-Западном регионе РФ, содержат плазмиды: М.avium - 28% штаммов, M.chelonae - 37,5% и M.fortuitum — 49%. Наличие плазмид взаимосвязано с биологической активностью микобактерий.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на: СПб научном обществе микробиологов (1997, 1998, 1999, 2000), Европейском ежегодном семинаре ми-кобактериологов (Париж, 1996), русско-финском совещании по проблеме инфекционных заболеваний (Турку, 1997, Хельсинки, 1998, СПб, 1999), русско-финском семинаре по проблемам туберкулеза (СПб, 1998, 1999), Научно-практической конфе-ренции СПбНИИФ (1997, 1998), Всероссийском съезде микробиологов и эпидемиологов (Москва, 1998), пленуме Межведомственного

научного совета РАМН и МЗ РФ по туберкулезу и гранулематозным заболеваниям легких (Москва, 1998), Всероссийской научно-практической конференции "ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний" (СПб, 1998), международном семинаре по проблеме изучения полирезистентных микобактерий туберкулеза (СПб, 1999), международной конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000), региональной научно-практической конференции "Роль хирургических методов в лечении внелегочного туберкулеза" (СПб, 2000).

Диссертационное исследование выполнено по плану научно-исследовательских работ СПбНИИ фтизиопульмонологии и апробировано на заседании коллектива Проблемной комиссии №4 СПбНИИФ "Экспериментально-лабораторные исследования во фтизиатрии и пульмонологии".

Внедрение в практику.

Материалы исследования использованы при подготовке Методических рекомендаций "Методы выделения ДНК для диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции" и "Повышение эффективности этиологической диагностики внелегочного туберкулеза".

Результаты работы внедрены в клинико-лабораторную практику бактериологической лаборатории и используются в клиниках внелегочного туберкулеза Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии.

Публикации результатов исследования.

По теме диссертации опубликовано 23 печатных работы и 2 находятся в печати. Утверждены Минздравом России Методические рекомендации "Методы выделения ДНК для диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции" (№ 99/154, 1999 г.).Получена приоритетная справка по заявке на изобретение «Способ бактериологической диагностики туберкулеза» (№ 2000103371 от 10.02.2000 г.).

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследований, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выво-

дов и практических рекомендаций. Иллюстративный материал включает 17 таблиц и 20 рисунков. Список литературы содержит 293 наименования, из них 55 отечественных и 238 иностранных источников.

Материалы и методы исследования.

В работе исследовано 832 образца биологического материала от 650 больных внелегочным туберкулезом или с подозрением на этот диагноз, 120 культур нетуберкулезных микобактерий и 60 культур L-форм.

Материалом для исследования на L-формы микобактерий туберкулеза служили образцы тканей и биологические жидкости от больных внелегочным туберкулезом. L-формы выращивали на полужидкой питательной среде с предварительной деконтаминацией серной кислотой. Наличие характерных L-форм оценивали с помощью фазово-контрастной (в нативном мазке) и люминесцентной (окраска акридиновым оранжевым) микроскопии.

Для видовой идентификации методом ПЦР-анализа использовали культуры L-форм с выраженным макроростом, не содержащие посторонней микрофлоры. Разработан метод выделения ДНК для ПЦР из колоний L-форм. Реакцию амплификации проводили с различными парами праймеров. В работе использовали:

- Набор для обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза методом полимеразной цепной реакции "Амплитуб" (Москва, МНИИТ), амплифицирующий участок инсерционного элемента M.tuberculosis complex IS 6110;

- Набор реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в биологических пробах методом полимеразной цепной реакции "Политуб" (Москва, НПФ "Литех"), амплифицирующий участок гена МРВ 64 M.tuberculosis complex;

Мультиплексный вариант ПЦР-анализа для дифференциации M.tuberculosis complex от М.bovis BCG с тремя праймерами.

Для детекции и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса в биологических образцах также применяли российские тест-системы "Амплитуб" (Москва, МНИИТ) и "Политуб" (Москва, НПФ "Литех"). Для дифференцировки М.bovis BCG от вирулентных штаммов M.tuberculosis complex

применяли метод ПЦР, описанный Talbot (1997), в собственной модификации. Режимы амплификации оптимизированы для каждой тест-системы. Продукты амплификации анализировали путем электрофореза в геле агарозы с последующим окрашиванием бромистым этидием и просмотром гелей в ультрафиолетовом освещении.

С целью повышения эффективности ПЦР для выявления M.tuberculosis предложены модифицированные методы выделения ДНК из различных типов клинических образцов. При варианте экстракции ДНК фенолом для образцов, содержащих значительное количество крови (или сгустков), а также гноя, компоненты которых являются сильными ингибиторами ПЦР, предложена дополнительнаю очистка гель-фильтрацией. В случае выделения ДНК с изотиоцианатом гуанидина и диатомовой землей (модификация метода Boom с соавт., 1990) для наиболее полного удаления возможных ингибиторов отмывку сорбента каждым реагентом проводили от одного до трех-четырех раз, до визуального исчезновения окраски отмывочного реагента. Предложен способ выделения ДНК из костного материала, предусматривающий щелочной лизис образца, осаждениеДНК изопропанолом и экстракцию с применением сорбента.

Лигазную цепную реакцию проводили с использованием коммерческой тест-системы для обнаружения M.tuberculosis (LCx®, Abbott Laboratories, Inc., Abbott Park, IL) в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для оценки плазмидного профиля микобактерий исследовали эталонные штаммы и клинические изоляты из музея лаборатории бактериологии СПб НИИФ. Микобактерии культивировали на среде Сотона до достижения стационарной фазы роста. Посевной материал выращивали на среде Левенштейна-Йенсена. Плазмиды выделяли по методу Kieser (1984), разработанному для выделения кольцевых ковалентно замкнутых плазмид из стрептомицетов.

Проведен подбор оптимальных условий лизиса микобактериальных клеток для выделения плазмид. Для оптимизации условий лизиса было использовано по 8 штаммов четырех видов микобактерий: M.tuberculosis, M.avium, M.fortuitum и M.chelonae. Оптимальным считали вариант, при котором условия были достаточно жесткими для полного лизиса клеток и значительной денатурации хромосомной ДНК, но не приводили к денатурации плазмид. Исследование пла-

змидного спектра проводили путем электрофореза полученного материала 0,7% геле агарозы с последующей окраской бромистым этидием и просмотро гелей в ультрафиолетовом освещении.

Гели фотографировали с помощью цифровой фотокамеры "Agfa ePhoto' Просмотр и обработку фотографий проводили на компьютере Pentium II помощью программы Adobe Photoshop 5.5.

При обработке результатов бактериологических и молекулярнс генетических исследований определяли относительные статистически показатели, среднюю ошибку к ним находили по формуле:

ш = у/Р( 100 — Р)/(п — 1) , где Р - показатель в процентах.

Вероятность определялась по таблице Стьюдента. Различия i определяемых величинах расценивались как достоверные при вероятности 95%.

Результаты исследования и их обсуждение. Применение молекулярно-генетических методов для идентификацш микобактерий в биологических образцах.

С целью повышения эффективности бактериологической диагностик туберкулеза внелегочных локализаций применены амплификационные методы выявления М. tubérculos is complex в биологических образцах.

Для успешного выявления возбудителей инфекционных заболеваний в клинических образцах методом ПЦР необходимо учитывать локализацию микроба в организме, а также особенности строения микробной клетки. В работе определены наиболее эффективные методы выделения ДНК из тканей для анализа методом ПЦР. Исследовали образцы от больных активным туберкулезом костей, почек и женских гениталий. В таблице 1 приведены результаты ПЦР-анализа образцов, ДНК из которых была выделена двумя различными методами.

Как видно из таблицы, эффективность ПЦР оказалась достоверно выше в случае применения щелочного лизиса патологического материала. Возможно, слишком большое разведение обработанных ферментом проб приводило к потере специфической целевой ДНК. Можно также предположить, что в исследованных образцах микобактерии располагались не только внутриклеточно, но и в межклеточном пространстве, и не было необходимости в

полном расщеплении тканей.

Таблица 1.

Зависимость эффективности ПЦР от способа лизиса образца.

Локализация туберкулеза Всего больных Ферментативный лизис, ПЦР+ Щелочной лизис, ПЦР+

Туберкулез почек 12 6 (50%) 10(83,3%)

Гинекологический туберкулез 26 11 (42,3%) 18 (69,2%)

Р<0.05

Метод ПЦР приобретает особую значимость при анализе олигобациллярных образцов материала, поскольку, благодаря высокой чувствительности, позволяет обнаружить ДНК возбудителя даже в случае очень низкого ее содержания в исследуемом образце. Проведенное исследование показало, что при анализе внелегочного олигобациллярного клинического материала методом ПЦР особое внимание следует уделять этапу подготовки проб. По нашим данным, максимальной эффективности ПЦР-анализа можно добиться, во-первых, применяя различные способы выделения ДНК в зависимости от вида материала, а во-вторых, исследуя параллельно несколько фрагментов из каждого образца.

Изучена зависимость частоты выявления ДНК М.tuberculosis от типа исследуемого материала (таблица 2).

По совокупности проведенных исследований был выработан алгоритм выявления M.tuberculosis путем ПЦР-анализа в образцах внелегочного материала. Варианты подготовки различных типов биологических образцов к ПЦР-анализу представлены на рисунке 1.

Таблица 2.

Результаты ПЦР-анализа образцов от больных туберкулезом.

Тип материала Всего ПЦР + (абс./%)

Заболевания женских гениталий:

Ткань эндометрия, биоптаты 73 65 / 89,0%

Аспират из полости матки (слизь) 58 21 /36,2%

Абортивный материал (плодное яйцо) 9 0

Костные очаги V детей:

Фрагменты костей 32 27 / 84,4%

Стенки полости 24 8 / 33,3%

Костные очаги V взрослых:

Фрагменты костей 52 33 /63,5%

Некротические массы 21 18/85,7%

Гной 17 16/94%

Заболевания суставов:

Синовиальная жидкость 19 15/78,9%

Синовиальная оболочка 21 17/80,9%

Использование предлагаемых методов позволяет значительно повысить эффективность ПЦР для выявления ДНК микобактерий туберкулеза в тканях костей, суставов, почек и биопсийном материале.

Для быстрой идентификации М. bovis BCG использован метод ПЦР с праймерами ETI, ЕТ2 и ЕТЗ, основанный на определении у ДНК аттенуированных штаммов делеции фрагмента RDI (Talbot с соавторами, 1997). В данной работе впервые был применен метод ПЦР-анализа для выявления М.bovis BCG непосредственно в клинических образцах. Анализировали образцы патологического материала, полученные от больных внелегочными формами туберкулеза детей (костные очаги, операционный материал).

Схема выделения ДНК из биологических образцов для выявления ДНК M.tuberculosis complex методом ПЦР.

Образцы,содержащие кровь или гной

Температурная обработка

Биологический материал

Образцы костей и плотных тканей

Щелочной лизис

Осаждение изо-пропанолом

Биологические жидкости

Концентрирование осаждением

Температурная обработка

Экстракция ДНК на сорбенте в присутствии солей гуанидина

ПЦР на M.tuberculosis complex

Рис. 1.

Проведена оптимизация условий амплификации для исследования патологического материала, показана необходимость реамплификации продуктов реакции для повышения чувствительности ПЦР.

Всего исследовано 26 образцов, давших положительный результат ПЦР с праймерами, специфичными к M.tuberculosis complex.. Все образцы получены от детей с туберкулезом костей, 12 - с подозрением на возбудитель-BCG. Ни в одном случае не была изолирована культура М.bovis BCG. В четырех случаях из образцов методом посева была выделена культура M.tuberculosis. Результаты амплификации с праймерами ETI, ЕТ2 и ЕТЗ показали, что выявленная ДНК М.tuberculosis complex в пяти случаях принадлежала М.bovis BCG, в двадцати -вирулентным штаммам M.tuberculosis complex. В одном случае в образце

выявлено одновременно два типа ДНК - M.íuberculosis и М.bovis BCG. Все образцы, давшие положительный результат ПЦР только на M.bovis BCG, были получены от детей с подозрением на туберкулез, вызванный BCG. Образец, показавший присутствие как вирулентного, так и аттенуированного штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, был получен от ребенка, больного туберкулезом, у которого методом посева была выделена культура М. tuberculosis. Таким образом, при исследовании методом ПЦР образцов патологического материала, полученных от детей, чтобы избежать ошибок и ложноположительных результатов, следует учитывать возможность выявления ДНК вакцинного штамма. В этом случае очень полезным оказывается метод ПЦР, позволяющий дифференцировать M.bovis BCG от других членов M.íuberculosis complex непосредственно в клинических образцах.

Таким образом, прямое выявление ДНК M.bovis BCG в клиническом материале путем полимеразной цепной реакции позволяет точно дифференцировать природу заболевания. С помощью метода ПЦР возможно также изучение длительности и локализации персистирования штамма BCG в организме вакцинированных лиц.

В бактериологической лаборатории Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии проведены исследования эффективности ПЦР-анализа для выявления M.íuberculosis при внелегочном туберкулезе. Известно, что обычные бактериологические методы при внелегочном туберкулезе, как правило, мало результативны, что связано как с особенностями вегетации M.íuberculosis в очагах внелегочной локализации, так и с низким содержанием клеток возбудителя в исследуемом материале.

Тестировали биопсийные и послеоперационные образцы от больных, находящихся на излечении в клиниках Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии. Исследованы следующие типы патологического материала: соскобы эндометрия и аспираты из полости матки, абортивный материал, биоптаты маточных труб (от больных с заболеваниями женских гениталий); образцы костной ткани, очаги деструкции, гной, синовиальные оболочки, синовиальная жидкость (от больных с заболеваниями костей и суставов); послеоперационный материал - ткань почки, яичка, мочеточника (от больных с заболеваниями мочеполовой системы). Всего методом ПЦР

исследовано 494 образца от больных внелегочным туберкулезом и 171 образец от больных с неспецифическими заболеваниями костей, суставов, женских половых органов и мочеполовой системы. Сравнительные результаты эффективности ПЦР-исследования и посева на М.шЬегси1оз1з приведены в таблицах 3,4,5.

Таблица 3.

Чувствительность методов ПЦР и посева на М. tuberculosis при анализе образцов внелегочного материала.

Локализация туберкулеза Всего (100%) Выделены МБТ, абс./ % ПЦР + Чувствитель-ностьПЦР, %

Туберкулез костей и суставов 167 63 /37,7% 121 72,5%

Туберкулез мочеполовой системы 29 13/44,8% 27 93,1%

Туберкулез женских гениталий 298 9/3,0% 209 70,1%

Р<0,05

Таблица 4.

Специфичность метода ПЦР при анализе образцов от больных с нетуберкулезными заболеваниями.

Локализация заболевания Всего (100%) ПЦР + Специфичность ПЦР, %

Заболевания костей и суставов 42 4 90,5

Заболевания мочеполовой системы 17 1 94.1

Заболевания женских гениталий 112 11 90.2

Р<0,05

Таблица 5.

Прогностические показатели метода ПЦР при детекции М.шЬегси1оз1з в образцах внелегочного материала.

Локализация туберкулеза Положительный прогностический показатель Отрицательный прогностический показатель

Туберкулез костей и суставов 96,8% 45%

Туберкулез мочеполовой системы 96,4% 88,9%

Туберкулез женских гениталий 91,7% 53,2%

Особый интерес представляет высокий (35,3%) уровень положительных результатов ПЦР соскобов эндометрия и абортивного материала от больных с активным экстрагенитальным туберкулезом (туберкулез легких, почек, лимфоузлов). В подобных случаях возможно выявление ДНК микобактерий, находящейся в крови в результате гематогенного распространения инфекции, поскольку все гинекологические образцы содержат значительное количество крови. Это вполне согласуется с современными данными зарубежных исследователей.

Весьма интересные результаты ПЦР получены при анализе образцов от больных с урогенитальным туберкулезом. Из 14 исследованных образцов операционного материала 9 были от больных с активным туберкулезом почек, и 5 - с аденомой предстательной железы. Все образцы от больных туберкулезом дали положительный результат ПЦР, у всех больных с аденомой ПЦР-тест был отрицательным.

Таким образом, применение метода ПЦР для обнаружения ДНК М. tuberculosis в биологических образцах, полученных от больных внелегочным туберкулезом, позволяет не только выявить присутствие возбудителя

туберкулеза, но и определить его локализацию и уровень диссеминации в организме.

При детекции присутствия микроорганизмов в биологическом материале молекулярно-генетическими методами важную роль играет правильный выбор реагентов. Проведеносравнение эффективности трех российских коммерческих тест-систем для выявления возбудителя туберкулеза в клинических образцах методом ПЦР: "Амплитуб"(Москва), "Политуб" (Москва, НПФ "Литех"), ТВ1 и ТВ2 (Москва, "Ниармедик").

Эффективность тест-систем оценивали по следующим критериям:

1. Объективные критерии.

чувствительность выявления специфической ДНК в клеточной суспензии (минимальное число клеток в пробе, выявляемое с помощью тест-системы);

чувствительность по сравнению с бактериоскопией и посевом (количество ПЦР-положительных образцов в % от бактериоположительных образцов);

чувствительность выявления ДНК возбудителя в образцах от больных туберкулезом (количество ПЦР-положительных образцов в % от всех образцов от больных с диагнозом туберкулез).

2. Субъективные критерии.

стабильность и воспроизводимость результатов при работе с разными партиями тест-систем; удобство работы с тест-системой; простота интерпретации результатов электрофореза.

Результаты тестирования чувствительности исследованных тест-систем отображены в таблице 6.

Система ТВ2 (тестировано два набора) не дала положительного результата ПЦР ни с суспензией клеток лабораторного штамма М.tuberculosis H37Rv, ни с входящей в состав набора контрольной ДНК Мtuberculosis, в связи с чем дальнейшее тестирование этой системы не проводили.

Все тест-системы требовали оптимизации условий амплификации. По удобству интерпретации результатов электрофореза тест-системы распределились следующим образом: "Политуб", "Амплитуб", ТВ1.

Таблица 6.

Чувствительность исследованных тест-систем

Тест-система Чувствительность системы

клеток в пробе относительно 18-ти бактериоположительных образцов (абс. / %) относительно 53-х образцов от больных туберкулезом (абс. / %)

"Амплитуб" 10 17 / 94,4% 39 / 73,6%

"Политуб" 10- 102 16 / 88,9% 36 / 67,9%

ТВ1 102 14 / 77,8% 32 / 60,4%

Проведенное исследование показало, что отечественные коммерческие ПЦР-тест-системы вполне пригодны для выявления в клиническом материале ДНК возбудителя туберкулеза. По чувствительности и специфичности диагностикумы российских производителей не уступают зарубежным аналогам. Однако все тестированные наборы обладали различными недостатками, такими, как, например, невысокая чувствительность, трудности оценки результатов после электрофореза, нестабильность работы разных партий, или иными. Учитывая высокую значимость ПЦР для диагностики туберкулеза, необходимо дальнейшее совершенствование отечественных наборов для ПЦР-иследований M.íuberculosis с тем, чтобы, при сохранении их несомненных достоинств, свести к минимуму имеющиеся недостатки.

В последнее время все чаще применяют амплификацию микобактериальной ДНК путем не только полимеразной цепной реакции, но и разработанной позднее лигазной цепной реакции (ЛЦР), что оказывается весьма полезной для выявления возбудителя туберкулеза. Проведено сравнение эффективности методов ПЦР и ЛЦР для выявления M.íuberculosis при анализе гинекологического материала от женщин с подозрением на туберкулез гениталий.

Методами микроскопии, посева, ПЦР и ЛЦР исследовано 55 образцов от больных из отделения гинекологического туберкулеза СПбНИИФ. Ни в одной

из трех исследованных групп М.tuberculosis не были выявлены с помощью микроскопии или посева. Чувствительность ПЦР и ЛЦР-тестов в случае активного туберкулеза гениталий составила 69,2% и 34,6% соответственно. Положительный прогностический показатель составил 94,7% для ПЦР и 90% для ЛЦР, отрицательный прогностический показатель для ПЦР и ЛЦР был 69,2% и 51,4% соответственно. Специфичность обоих методов составила 94,7%. Десять образцов были получены от больных экстрагенитальным туберкулезом (легких, почек или глаз), шесть из них были ПЦР-положительны (60%) и четыре ЛЦР-положительны (40%). Лишь пять (16,7%) ПЦР-отрицательных образцов ингибировали ПЦР, в то время как 25 ЛЦР-отрицательных образцов (64,1%) обладали ингибирующей активностью по отношению к ЛЦР.

Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что методы амплификации ДНК могут оказаться весьма полезными для обнаружения М.tuberculosis в гинекологических образцах, особенно когда стандартные бактериологические методы оказываются неэффективными. Высокий уровень положительных результатов ПЦР и ЛЦР в бактерионегативных образцах позволяет предположить, что с помощью амплификационных методов можно выявить микобактерии, которые неспособны к росту in vitro.

Основной проблемой ЛЦР-теста в данном исследовании был высокий уровень ингибирования. Для ПЦР метод экстракции ДНК был специально модифицирован применительно к содержащим кровь гинекологическим образцам. Сравнивая уровень ингибирования реакции амплификации материалом, выделенным из биологических проб, надо учитывать, что ЛЦР тест-система разработана для анализа респираторных образцов. Поскольку в ЛЦР участвуют два фермента, вероятность ингибирования возрастает по сравнению с ПЦР, и при получении отрицательного результата ЛЦР необходимо проводить контроль ингибирования. Желательно также введение дополнительных стадий очистки ДНК для ЛЦР.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что современные амплификационные методы - полимеразная цепная реакция и лигазная цепная реакция - могут быть весьма полезными для выявления возбудителя заболевания при гинекологическом туберкулезе, особенно в случаях, когда

микроскопия и посев оказываются неэффективными.

Перспективы применения амплификационных тестов для изучения вегетации и персистирования микобактерий в макроорганизме видятся в использовании количественных вариантов ПЦР, позволяющих более точно определить бактериальную нагрузку при заболевании или инфицировании. Большое значение для исследования поведения микобактерий в макроорганнзме может иметь также применение ПЦР, направленной на выясление специфической РНК (RT-PCR), что дает возможность детекции жизнеспособных клеток.

Изучение L-форм М.tuberculosis с применением полимеразной цепной реакции.

Анализ 60 клинических изолятов, проведенный методом ПЦР со специфичными к М.tuberculosis complex праймерами, показал, что в 85% случаев L-формы, выделяемые из клинических образцов от больных внелегочным туберкулезом, относятся к микобактерия туберкулезного комплекса.

Среди выделенных L-форм преобладали зернистые сферопласты, культуры со значительными участками зернистости, реже встречались сферические тела без зернистости. L-формы в виде зернистых тел или участков зернистости высевались в основном из образцов патологического материала, содержащих гной, некротические массы, костных очагов деструкции. Рост в виде сферических тел был более характерен для образцов тканей, полученных от гинекологических больных - соскобов и аспиратов эндометрия. По-видимому, на морфологию L-форм оказывают влияние условия их вегетации в макроорганизме. Результаты ПЦР не зависели от морфологии выделенных культур L-форм.

Ни в одном случае не был получен рост клеточных форм микобактерий при пересеве L-форм на яичную питательную среду. Этот результат свидетельствует, во-первых, о том, что в культуре исследованных L-форм не присутствовали жизнеспособные клеточные варианты микобактерий, а во-вторых, об отсутствии реверсии L-форм, по крайней мере, при первом пассаже. Таким образом, наши данные несколько расходятся с наблюдениями И.Р.Дорожковой с соавт. (1984),

согласно которым Ь-формы, растущие в виде участков зернистости, имеют склонность к реверсии в бактериальные формы микобактерий. Однако, выделение условно стабильных культур Ь-форм из нереспираторных образцов коррелирует с данными, полученными МаИшап (1993), которая выделяла из крови больных туберкулезом неревертирующие Ь-варианты бактерий, охарактеризованные ею как [.-формы микобактерий туберкулеза. Возможно, такие варианты Ь-форм характерны для внелегочных локализаций туберкулеза.

Выявлена зависимость результатов ПЦР от скорости роста Ь-форм (Таблица 7).

Таблица 7.

Зависимость результатов ПЦР-анализа от скорости роста Ь-форм.

Скорость роста < 1 недели 1 - 5 недель 5-10 недель

Всего культур 3 18 39

ПЦР+ (абс./%) 1 / 33,3%* 14 / 77,7% 36 / 92,3%

Р<0,1; * -Р>0,1

Полученные данные можно объяснить, учитывая биологические особенности микобактерий туберкулезного комплекса, которые, как известно, относятся к медленнорастущим и, следовательно, высокий процент положительных результатов ПЦР среди изолятов, достигающих стационарной фазы за полтора - два месяца после посева клинического образца, представляется нам вполне логичным.

Отрицательные результаты ПЦР могут быть обусловлены, например, наличием Ь-форм нетуберкулезных микобактерий или иных микроорганизмов.

С целью исключения ложноположительных результатов идентификации Ь-форм туберкулезного комплекса проведен ПЦР-анализ пассированных культур. Всего исследовано 14 культур Ь-форм М.tuberculosis третьей генерации, все они оказались ПЦР-положительны. Бактериоскопический контроль ПЦР-положительных культур Ь-форм всех генераций (окраска мазков по Цилю-Нильсену и аурамином) ни в одном случае не выявил присутствия кислотоустойчивых палочек.

Методом ПЦР, направленным на амплификацию специфичного для M.tuberculosis complex фрагмента IS6110, исследована 31 культура Ь-форм,

выделенных от больных, находящихся на лечении в клиниках СПбНИИфтизиопульмонологии. Положительный результат ПЦР был получен только в 23 случаях. Все культуры L-форм анализировали также методом ПЦР, амплифицируюшей участок гена МРВ 64, при этом для амплификации использовали те же пробы ДНК, что и в предыдущем опыте. Доля положительных результатов ПЦР составила: для ПЦР на IS6110 — 74,2%, для ПЦР на ген МРВ 64 - 87,1%.

Известно, что M.bovis, в частности аттенуированный штамм M.bovis BCG, в отличие от М.tuberculosis, содержит малое (1—2) количество копий IS 6110. Так как часть исследованных культур L-форм изолировали от больных туберкулезом детей и подростков, можно было ожидать, что в ряде случаев выделялись L-формы вакцинного штамма M.bovis BCG, не имеющего элемента IS 6110. Все изоляты L-форм, как ПЦР-положительные, так и давшие отрицательный результат ПЦР с любыми парами праймеров, тестировали на принадлежность к M.bovis BCG. Показано, что ряд выделяемых из клинических образцов L-форм принадлежал к вакцинному штамму BCG. Сводные результаты ПЦР представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Результаты ПЦР клинических изолятов L-форм с различными парами

праймеров.

L-формы ПЦР-положительные образцы

ПЦР на IS 6110 ПЦР на ген МРВ 64 ПЦР на M.bovis BCG

Всего —31 культура L-форм 23 27 4

ПЦР-отрицательные (на IS 6110)- 8 культур - 4 2

ПЦР-отрицательные (на ген МРВ 64) - 4 культуры 0 - 0

Как видно из таблицы, ряд культур L-форм не содержал элемента IS 6110. Поскольку исследования более 200 клинических изолятов M.tuberculosis, вегетирующих на территории Санкт-Петербурга и Северо-Запада РФ,

проведенные в Санкт-Петербургском НИИЭМ им. Пастера совместно с СПбНИИФ, ни в одном случае не выявили отсутствия IS 6110, можно предположить, что L-формы Л/,tuberculosis, в отличие от клеточных форм, реже содержат эту вставку. Инсерционный элемент IS 6110 может также отсутствовать у патогенных штаммов M.bovis. В нашем случае выделение L-форм M.bovis представляется маловероятным, так как многолетний опыт бактериологической лаборатории СПбНИИ фтизиопульмонологии показывает, что патогенные варианты M.bovis как возбудителя туберкулеза практически не встречаются на Северо-Западе России. Исходя из полученных данных сделан вывод о том, что для идентификации культур L-форм целесообразно применять праймеры, гомологичные стабильным участкам хромосомы.

Таким образом, результаты исследований показали возможность видовой идентификации L-форм методом полимеразной цепной реакции. Установлено, что основная часть L-форм микобактерий, выделяемых из клинического материала от больных туберкулезом внелегочных локализаций, принадлежит к М.tuberculosis или M.bovis BCG. Данные, полученные при изучении L-форм M.tuberculosis методом ПЦР с разными парами праймеров, продемонстрировали различия генетической структуры L-форм и клеточных форм. В то же время, поскольку не все L-формы микобактерий, выделенные из образцов клинического материала, принадлежали к M.tuberculosis complex, полученные результаты говорят о необходимости видовой идентификации изолятов L-форм и открывают перспективы для дальнейших исследований измененных форм микобактерий.

Изучение плазмидного профиля микобактерий - возбудителей микобактериозов у жителей Северо-Западного региона Российской федерации.

Изучен плазмидный профиль 120 штаммов нетуберкулезных микобактерий, из них 62 M.fortuitum, 43 М.avium и 15 M.chelonae, а также 20 полирезистентных штаммов M.tuberculosis. Все изученные штаммы нетуберкулезных микобактерий являлись клиническими изолятами от 117 больных микобактериозами. Выбор для исследования трех перечисленных видов НТМБ обусловлен тем, что по данным СПбНИИфтизиопульмонологии, эти виды явля-

ются наиболее распространенными возбудителями микобактериозов на Северо-Западе России (Оттен Т.Ф., 1994,1997).

Ни при каких условиях лизиса и экстракции не удалось выявить присутствие кольцевых ковалентно замкнутых плазмид у штаммов М.tuberculosis, устойчивых к рифампицину, изониазиду и стрептомицину. Учитывая, что, кроме кольцевых ковалентно замкнутых форм, плазмиды могут также присутствовать в микроорганизмах в открытых кольцевых и линейных формах, не выявляемых стандартными методами, проведен опыт по элиминации лекарственной устойчивости ДНК-тропными соединениями. В результате обработки ДНК-тропными соединениями ни один из штаммов не потерял чувствительность ни к одному препарату. В некоторых случаях рост штаммов на среде, содержащей антибиотики, был массивнее, чем на контрольной среде. Полученные данные подтверждают выводы различных исследователей о неплазмидной природе полирезистентности возбудителя туберкулеза. Встречающиеся в литературе данные об элиминации устойчивости M.tuberculosis к некоторым препаратам ДНК-тропными соединениями можно объяснить воздействием последних на иные мобильные генетические элементы.

Плазмиды были выявлены у всех исследованных видов нетуберкулезных микобактерий (рис.2,3). Выделенные плазмиды значительно различались по молекулярной массе и количеству в штамме, частота встречаемости плазмид также была различной для разных видов микобактерий (Таблица 9).

Таблица 9.

Распределение плазмид у трех видов НТМБ.

Частота Среднее Средний диапазон

Вид НТМБ Всего встречаемос- количество в молекулярных

ти, абс./% штамме масс,Мда

M.fortuitum 62 30 / 48,4% 2-3 25-60

M.avium 43 13/30,2% 1 30-100

M.chelonae 15 6 / 40% 1-2 15-60

Р<0,1

Плазмидный профиль штаммов М.аушт. Схема результатов электрофореза

в 0,7% геле агарозы.

тг

«о

сЧ ■-О

О Оч ч->

<4 •ч-

о Ч-

чо >С

^ ^ - •? £ - ^

Оо ЧЬ °С г-*

00 1Г| к > ^ 'Л ^

Л > 1л| »а > ао ^

К -ч Х-) Оп о» >*-ч

Рис. 2.

Плазмидный профиль штаммов М.АэПшШт. Схема результатов электрофореза в 0,7% геле агарозы.

5 Я Г^ =5 ^ Г" ^ т,-

С^ ^ П« ^ — N о, ^ /77/

^ ^ ГГ, ^ Г^ —

СЧ) я^ш

Iшя

Рис.3.

У 13 несущих илазмиды штаммов М.avium преобладали плазмиды с относительно высокими молекулярными массами. Лишь в одном случае у клинического изолята выявлено две плазмиды с молекулярными массами 76МДа и 40МДа, остальные штаммы имели только одну плазмиду. Только у вида М. avium обнаружено наличие тяжелых плазмид с молекулярной массой свыше 100 МДа.

Изучение плазмидного профиля M.fortuitum и M.chelonae показало, что у этих видов микобактерий частота встречаемости плазмид и их распределение по молекулярной массе были схожи. У M.fortuitum, так же как и у M.chelonae, преобладали плазмиды со средними массами, однако два штамма M.chelonae имели легкие плазмиды с молекулярными массами около 15 МДа. Для M.fortuitum было характерно присутствие двух - трех плазмид в штамме, выявлено лишь три изолята M.fortuitum, имеющих только одну плазмиду. У M.chelonae, напротив, из шести исследованных плазмидонесущих штаммов четыре имели только одну плазмиду, и два - по две плазмиды.

Отмечена стабильность наличия плазмид у штаммов, выделяемых в разное время от одного больного.

Изучение возможной корреляции плазмидоносительства нетуберкулезных микобактерий с их основными биологическими свойствами и устойчивостью к антибиотикам не выявило корреляции между наличием плазмид и резистентностью к стрептомицину, циклосерину, рифампицину, этамбутолу, оксациллину и активностью бета-лактамазы. Единственным признаком, коррелировавшим с наличием плазмид у НТМБ, оказалась биологическая активность культур микобактерий. Биологическую активность штаммов микобактерий оценивали по скорости роста на плотной среде Финна-П и полужидкой синтетической среде Сотона. Исследовано 10 культур М.avium и 90 культур M.fortuitum с разным возрастом посевного материала. Использовали свежую биомассу: от 10 - 14 дней для М. avium и 5 - 7 дней для M.fortuitum (большинство клеток посевного материала находится в состоянии активного роста, основная часть клеток жизнеспособна) и культуры, хранившиеся на плотных средах от шести месяцев до года (для обоих видов - небольшое количество жизнеспособных клеток в культуре, клетки в стационарной фазе).

Скорость и массивность роста как М.avium, так и M.fortuitum, зависели от

возраста посевного материала. В среднем, из свежего посевного материала на плотных средах вырастало более 200 колоний, в то время как длительно хранившийся посевной материал давал на плотной среде рост 20 - 40 колоний.

Обнаружено, что частота выявления плазмид была значительно чаще в тех случаях, когда в качестве посевного материала использовали свежую биомассу, дающую быстрый видимый рост культур на плотных средах (таблицы 10,11).

Таблица 10.

Частота выявления плазмид у M.fortuitum в зависимости от скорости роста._

Время роста культуры Исследовано штаммов Число культур с плазмидами

абс. %

>2 недель 16 3 18,8

1 - 2 недели 44 16 36,3

< 1 недели 35 17 48,6

Достоверность различий между группами 1 и 3, 1 и 2 - Р<0,05; между группами 2 и 3 - Р > 0,05. Таблица 11. Частота выявления плазмид у М. avium в зависимости от скорости роста.

Время роста культуры Исследовано штаммов Число культур с плазмидами

абс. %

>4 недель 12 2 16,7

2-3 недели 18 16 22,2

< 2 недель 22 17 36,4

Достоверность различий между группами 1 и 3 - Р<0,05;

между группами 2 и 3 - Р<0,1; между группами 1 и 2 - Р > 0,05.

Отмечен только один случай потери плазмиды изолятом М./огшИит после нескольких пассажей (штамм, несущий три плазмиды с молекулярными массами 65 МДа, 37 МДа и 32 МДа после трех последовательных пересевов де-

монстрировал наличие всего двух плазмид, плазмида в 37 МДа оказалась утерянной). Чаще встречался обратный вариант, когда старые культуры, жизнеспособность которых изначально была низкой (рост более 2 недель для M.fortuitum и более 4 недель для М.avium) после одного - двух пассажей показывали наличие плазмид, не определявшихся ранее. Возможно, это обусловлено тем, что при старении и длительном пребывании в неблагоприятных условиях культура теряет плазмиды, в общей популяции остается лишь небольшой процент несущих плазмиды клеток, не определяемый при разделении электрофорезом. При попадании в благоприятные условия, то есть при активизации жизнедеятельности, несущие плазмиды клетки начинает размножаться более интенсивно, чем бесплазмидные, и в результате становятся доминирующими в популяции.

Распространенность плазмид у российских штаммов М. avium, M.fortuitum и M.chelonae оказалась несколько ниже таковой у европейских и американских изолятов. По данным последних лет (Picardeau M., Vincent V., 1997, 1998), плазмиды у M. avium встречаются более чем в 50% случаев, у M.fortuitum - в 60 -70%. При этом в работах, опубликованных более 10—15 лет назад (Meissner P.S., Falkinham J.О., 1986) эти цифры ближе к данным наших исследований. Полученный результат можно объяснить тем, что в последнее десятилетие большинство клинических изолятов нетуберкулезных микобактерий, выделяемых за рубежом, получено от больных СПИДом. Как известно, у таких больных снижен иммунный статус, практически отсутствует защитная реакция организма на инфекцию, а следовательно, выше жизнеспособность клеток инфекционного агента (в данном случае, микобактерий). Частое выделение плазмид у таких штаммов коррелирует с нашими данными, согласно которым у культур микобактерий с высокой жизнеспособностью плазмиды встречаются в два раза чаще, чем при низкой жизнеспособности клеток.

Обнаруженная в настоящем исследовании связь наличия плазмид с жизнеспособностью нетуберкулезных микобактерий, изученная на примере основных возбудителей микобактериозов - М. avium и M.fortuitum, может служить теоретическим обоснованием применения различных ДНК-тропных соединений для лечения микобактериозов, что весьма важно, посколь-

ку НТМБ, как правило, обладают устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам.

На основании полученных результатов, с учетом известных достижений современной науки в области изучения генома микобактерий, сформирована схема применения молекулярно-генетических методов в исследовании микобактерий как возбудителей заболевания человека и животных (рисунок 4). Поскольку ни один микроорганизм не может существовать вне окружающей среды, отправным пунктом исследования является биологический образец, из которого микобактерии выделяют культуральным методом, исследуя далее выделенную культуру, или прямо детектируют наличие специфической ДНК (РНК). На схеме пунктиром выделены методы, не применявшиеся в данной работе, использование которых логично вписывается в предлагаемый алгоритм. Первоочередное исследование биологического образца на присутствие М.шЪегайоз'к объясняется тем, что этот вид сегодня является наиболее значимым среди микобактерий - возбудителей заболеваний человека, и его выявление особенно важно.

Большое место отведено в алгоритме методам выделения ДНК. Необходимость тщательной очистки и максимальной экстракции генного материала для молекулярно-генетических исследований подчеркивается многими авторами. По данным .Г.Вагап с соавт. (2000), эффективность ПЦР спинномозговой жидкости в модельных опытах несколько уступала эффективности культурального метода из-за ингибирования реакции амплификации. Наши результаты сравнения ПЦР и ЛЦР (64,1% ингибирования при ЛЦР и 16,7% при ПЦР) также доказывают необходимость тщательной обработки образцов для наиболее полного исключения ложноотрицательных результатов.

Из предложенной схемы видно, что молекулярно-генетические методы могут применяться на всех этапах изучения микобактерий, от биологических субстратов, в которых они обитают, до чистых культур и измененных форм.

Фрагменты работы выполнены совместно с Бобченок А.П., Вильяненом М.К., Вишневским Б.И., Дискаленко О.В., Кочоровой М.Н., Ланцовым В.А., Ляненко E.H., Маничевой O.A., Марттила Х.Дж., Мельниковой H.H., Мирлиной Е.Д., Олейник А.Н., Оттен Т.Ф., Поповой С.С., Семеновским A.B., Сойни X., Трояновским P.A., Хокканен В.М.

Практические рекомендации

Для быстрой и надежной видовой идентификации L-форм микобактерий и повышения эффективности бактериологической диагностики туберкулеза целесообразно применять метод полимеразнон цепной реакции с видоспецифичными для M.tuberculosis и М.bovis BCG праймерами.

Для выделения ДНК из патологического материала и снижения ингибирования ПЦР клиническими образцами целесообразно применять модифицированные методы, сочетающие глубокий лизис и тщательную очистку генного материла. Применение модифицированных методов позволяет позволяют повысить эффективность выявления микобактерий туберкулеза методом ПЦР:

- Для анализа биологических жидкостей и мягких тканей -в случае очистки гель-фильтрацией - на 35%; для варианта с применением сорбента -на 18%;

Для анализа костей, суставов и плотных тканей - на 25 - 30%. При выявлении M.tuberculosis методом ПЦР следует учитывать зависимость эффективности ПЦР от типа клинического образца. Рекомендуемый для исследования материал:

При гинекологическом туберкулезе - ткань эндометрия или биоптаты маточных труб;

При туберкулезе костей у детей - фрагменты костей; При туберкулезе костей у взрослых - гной, некротические массы; При туберкулезе суставов - параллельное исследование синовиальной жидкости и синовиальной оболочки.

Рис. 4.Схема применения молекулярно-генетических тестов в диагностике туберкулеза и микобактериозов

биологический образец

Посев на микобактерии

Молекулярно-гене-тические методы идентификации; Анализ мутаций в генах устойчивости к лекарственным препаратам; Молекулярно-эпи-демиологические исследования

Посев на L-формы

Выделены^ -формы

Экстракция ДНК на сорбенте в присутствии солей гуанидина

Подготовка к ПЦР-анализу

Образцы, содержащие кровь или гной _

Температурная обработка

Образцы костей и плотных тканей

Щелочной лизис

Биологические жидкости

Концентрирование осаждением

ПЦР (ЛЦР) на М.tuberculosis complex

Осаждение изо-пропанолом У

Экстракция ДНК на сорбенте в присутствии солей гуанидина

отрицательный результат

ПЦР на род Mycobacterium, Идентификация НТМБ

Выводы.

1. Использование современных молекулярно-генетических методов позволило повысить эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса в биологических образцах при внелегочном туберкулезе в 2 - 20 раз по сравнению со стандартными бактериологическими методами.

2. Показана высокая чувствительность и специфичность методов полимеразной цепной реакции и лигазной цепной реакции для выявления М. tuberculosis из внелегочного материала.

3. Предложен метод идентификации вакцинного штамма M.bovis BCG методом полимеразной цепной реакции непосредственно в клинических образцах.

4. С помощью молекулярно-генетических методов установлено, что 85% L-форм, изолируемых из клинического материала, полученного от больных внелегочным туберкулезом, относятся к представителям микобактерий туберкулезного комплекса (М tuberculosis и М. bovis BCG).

5. Выявлено, что генетическая структура L-форм М. tuberculosis отличается от генетической структуры клеточных форм.

6. Анализ плазмидного спектра основных видов нетуберкулезных микобактерий - возбудителей микобактериозов у жителей СевероЗападного региона России показал, что наиболее часто плазмиды встречаются у M.fortuitum (48,4%), реже всего - у M.avium (30,2%), M.chelonae занимают промежуточную позицию (40%). Для M.fortuitum характерно наличие двух-трех плазмид в штамме, в то время как большинство штаммов M.avium несут одну плазмиду. У штаммов М. tuberculosis плазмид не обнаружено.

7. Установлена прямая связь между биологической активностью (по критериям скорости роста) и наличием плазмид у нетуберкулезных микобактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Вишневская Е.Б., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Плазмиды вегетирующих в России микобактерий: распространенность и связь с биологическими свойствами// 7 нац. конгресс по болезням орг.дых. - М.,1997. - N1294.

2. Вишневская Е.Б. Дифференцированный подход к выделению ДНК для ПЦР из различных типов патологического материала// Клин.лаб.диагн. - 1998-№9. - с.31-32.

3. Вишневская Е.Б. Особенности выделения ДНК для ПЦР при туберкулезе внелегочных локализаций//Пробл. туб.- 1998. - №5. - с.40-42.

4. Вишневская Е.Б. Пути снижения ингибирования ПЦР компонентами клинических образцов// Клин. лаб. диагн. - 1998. - №7. - с. 35-36.

5. Вишневская Е.Б., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Плазмидный профиль микобактерий, распространенных на территории Российской Федерации// Пробл. туб.-1998. - №1. - с.44-46.

6. Вишневская Е.Б. Применение полимеразной цепной реакции при туберкулезе внелегочных локализаций// Новые технол. в диагн. и лечении туберкулеза различных органов и систем. - СПб.,1998. - т.1. - с.28-30

7. Вишневская Е.Б. Методы выделения ДНК для диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции: Методические рекомендации № 99/154 . - СПб, 1999.

8. Вишневская Е.Б. Повышение эффективности ПЦР-диагностики внелегочного туберкулеза при исследовании биопсийного и послеоперационного материала//"Роль хирургических методов в лечении внелегочного туберкулеза". - СПб, 2000. - с.51.

9. Вишневская Е.Б. Проблемы ПЦР-диагностики внелегочного туберкулеза.// "Генодиагностика в современной медицине". - М.,2000. - с.281 -282.

10. Вишневская Е.Б., Бобченок А.П., Мельникова H.H., Вишневский Б.И. Пути повышения эффективности этиологической диагностики

туберкулеза//Вторая международная ассамблея "Новые медицинские технологии":Тез.докл.. - М., 2000. - с. 17-18.

И. Вишневская Е.Б. Проблемы ПЦР-анализа олигобациллярных образцов тканей при внелегочном туберкулезе// Пробл.туб. - 2000. - № 5 (в печати).

12. Вишневская Е.Б., Бобченок А.П., Мельникова H.H., Вишневский Б.И. Заявка на изобретение "Способ бактериологической диагностики туберкулеза", приоритетная справка №2000103371 от 10.02.2000 г.

13. Вишневский Б.И. Мирлина Е.Д. , Вишневская Е.Б., Маничева O.A. Выявление возбудителя внелегочного туберкулеза методом полимеразной цепной реакции//"Внелегочный туберкулез - актуальная проблема здравоохранения" - СПб, 1997. - с.26 - 27, No.20.

14. Вишневский Б.И. Мирлина Е.Д., Вишневская Е.Б., Маничева O.A., Ланцов В.А. Диагностические возможности ПЦР при внелегочном туберкулезе // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Сб.тр.П Междунар.конф. - СПб, 1998.-с. 27-28.

15. Вишневский Б.И., Мирлина Е.Д., Вишневская Е.Б., Маничева O.A., Ланцов В.А. Диагностические возможности метода ПЦР при туберкулезе внелегочных локализаций// Новые технол. в диагн. и лечении туберкулеза различных органов и систем. - СПб., 1998. - т.2 - с.60 -61.

16. Вишневский Б.И.,Маничева O.A., Вишневская Е.Б. Проблема этиологической диагностики внелегочного туберкулеза// Новые технол. в диагн. и лечении туберкулеза различных органов и систем. - СПб., 1998. -т.2- с.59-60.

17. Дискаленко О.В., Ляненко E.H., Трояновский P.A., Хокканен В.М., Вишневская Е.Б. Витрэктомия периферического увеита туберкулезной этиологии// Тез.докл. IV съезда Науч.-мед.асооц.фтиз. (НМАФ). - Йошкар-Ола, 1999. - №668.

18. Кочорова М.Н., Семеновский A.B., Олейник А.Н., Вишневская Е.Б. ПЦР ткани плода и эндометрия у больных туберкулезом различных локализаций при прерывании беременности ранних сроков// "Роль хирургических методов в лечении внелегочного туберкулеза". - СПб, 2000. - с.51.

19. Семеновский А.В., Олейник А.Н., Кочорова М.Н., Попова С.С., Вишневская Е.Б. Полимеразная цепная реакция в комплексной диагностике туберкулеза женских половых органов//. Новые технол. в диагн. и лечении туберкулеза различных органов и систем. - СПб., 1998. - т.2 - с.61.

20. Vyshnevskaya Е., Soini Н., Otten Т., Viljanen М.К. Performance of PCR in diagnosis of extrapulmonary tuberculosis//17th Meeting of the Eur. Soc.for Mycob. - Paris, France, June 1996. - abstr.1046.

21. Vyshnevskaya E. Use of a PCR assay for the diagnosis of gynecological tuberculosis//18th Meeting of the Eur. Soc.for Mycob. - Cordoba, Spain,17-18 June 1997. - abstr.368.

22. Vyshnevskaya E. Use of a PCR for the diagnosis of gynecological tuberculosis.// Clinical Mycobacteriology/ ed. M.Casal. - Prous Science, S.A.,1998. - P. 363 -364.

23. Vyshnevskaya E., Oleinik A., Kochorova M. The evidence of fetus protection against tuberculous infection// "Fetus as a patient". Chapt."Perinat.inf.-labor and delivery". - Rome, 2000. - No. 17.

24. Вишневская Е.Б. Оценка трех коммерческих диагностических наборов для выявления M.tuberculosis методом полимеразной цепной реакции// Клин, лаб. диагн. - 2001. - №2 (в печати).

25. Вишневская Е.Б., Марттила X. Дж., Семеновский А.В Олейник А. Н., Вильянен М.К., Вишневский Б.И. Сравнение эффективности полимеразной цепной реакции и лигазной цепной реакции в диагностике гинекологического туберкулеза// Пробл.туб. - 2001. - №2 (в печати).

Список пспользованных сокращений.

BCG - Bacillus Calmette-Guerin

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КОЕ - колониеобразующая единица

ЛЦР - лигазная цепная реакция

М. - Mycobacterium

MAC - Mycobacterium avium complex

MGIT- Mycobacteria Growth Indicator Tube

НТМБ - нетуберкулезные микобактерии

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная РНК

мРНК - матричная РНК

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Вишневская, Елена Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Род микобактерий.

1.2. Молекулярно-генегические методы исследования микобактерий.

1.3. Идентификация вакцинного штамма M.bovis BCG.

1.4. L-формы микобактерий.

1.5. Плазмиды микобактерий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2Л. Исследование L-форм микобактерий.

2.2. Выделение ДНК из образцов патологического материала для полимеразной цепной реакции.

2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.4. Лигазная цепная реакция.

2.5. Методы выделения плазмид нетуберкулезных микобактерий.

ГЛАВА 3. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕС-КИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ.

3.1 .Разработка схемы выявления микобактерий в клинических образцах методом ПЦР.

3.2. Идентификация М. bovis BCG в клинических образцах методом ПЦР.

3.3. Эффективность применения амплификационных методов для выявления М. tuberculosis.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ L-ФОРМ M.tuberculosis С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

4.1. Верификация принадлежности L-форм к M.tuberculosis complex.

4.2. Видовая идентификация L-форм, принадлежащих к M.tuberculosis complex, и их генетические особенности.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПЛАЗМИДНОГО ПРОФИЛЯ МИКО-БАКТЕРИЙ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОБАКТЕРИ-ОЗОВ У ЖИТЕЛЕЙ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО РЕГИОНА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий - возбудителей заболеваний человека"

Актуальность проблемы.

В 90-е годы во всем мире отмечен рост заболеваемости туберкулезом, который по уровню смертности занимает одно из первых мест среди инфекционных заболеваний (Baiter, 1999). Даже в тех странах, в которых в течение последних пятидесяти лет наблюдали постоянное снижение числа вновь заболевших, сегодня говорят об угрозе новой эпидемии туберкулеза. Раннее выявление и диагностика туберкулеза являются актуальной задачей в борьбе с этим заболеванием. Известно, что при вовремя и правильно назначенном лечении с помощью современных методов химиотерапии возможно излечение до 98% больных (Fox, 1981). Существует предположение, что даже в развитых странах до 5% больных туберкулезом остаются невыявленными и не получают своевременной противотуберкулезной терапии, что приводит к увеличению смертности от туберкулеза (Saltini, Ivanyi, 1995).

Основным критерием при постановке диагноза туберкулез остается выделение возбудителя - Mycobacterium tuberculosis. В то же время, на ранних стадиях заболевания культура микобактерий выделяется не более чем у 20% больных. На более поздних стадиях туберкулеза легких бактериологическое подтверждение туберкулеза получают в 50 - 90% случаев. При туберкулезе внелегочных локализаций эти цифры значительно ниже - 20 - 50% (Вишневский Б.И., Качанова Н.К., 2000). Наиболее широко распространенные методы культурального исследования на плотных питательных средах занимают месяцы. Современные варианты выделения возбудителя туберкулеза с применением жидких сред, автоматизированные системы ВАСТЕС, MGIT и другие позволяют сократить срок исследования до недель. Наиболее быстрым методом выявления микобактерий является бактериоскопия, но она не дает возможности дифференцировать M.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий. Кроме того, далеко не все образцы клинического материала содержат достаточное для обнаружения с помощью микроскопии количество микобактериальных клеток. Таким образом, разработка методов быстрого и специфичного выявления M.tuberculosis является актуальной задачей лабораторной диагностики туберкулеза.

С конца 80-х годов широкое распространение получают молекулярные методы диагностики инфекционных заболеваний, основанные на выявлении специфической ДНК или РЕПС возбудителя. Одним из наиболее развитых методов молекулярной диагностики является полимеразная цепная реакция. Этот метод, одним из первых представленный Saiki et al. в 1985 г., позволяет с высокой степенью чувствительности и специфичности выявлять даже несколько копий ДНК возбудителя, присутствующих в биологическом материале, что дает возможность применять его непосредственно при исследовании клинических образцов. Метод ПЦР по праву относится к экспресс-методам диагностики, так как результат анализа может быть получен в течение одного дня.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления M.tuberculosis непосредственно в клинических образцах применяется уже довольно давно, при этом чувствительность различных ПЦР-диагностикумов варьирует в широких пределах. Особую важность этот метод приобретает в случаях внелегочного туберкулеза, при котором стандартные методы бактериологического исследования часто оказываются неэффективными. В то же время, при работе с олигобациллярными образцами появляется и ряд новых проблем (Tan, Ng, 1997). Данные различных зарубежных исследователей об эффективности ПЦР при внелегочном туберкулезе весьма разноречивы

Tortoli et al., 1997; Saltini, 1998).

Пути повышения эффективности ПЦР ряд исследователей усматривает в совершенствовании методов экстракции ДНК возбудителя из клинического материала (Lisby, 1999; Veloso, 2000). Для наиболее успешного проведения ПЦР целесообразно применять комплексные методики, включающие глубокий лизис образца и тщательную очистку ДНК (Saltini е.а., 1998), однако подобные методики оказываются слишком сложными и многостадийными. Поиск оптимальных путей подготовки образца для анализа амплификационными методами является актуальной задачей молекулярной диагностики.

В структуре детского туберкулеза в России значительное место занимают заболевания, вызванные вакцинным штаммом BCG. Стандартные методы идентификации M.bovis BCG трудоемки и не всегда точны; более того, диагностика таких заболеваний затруднена из-за низкой высеваемости возбудителя (Коваленко К.Н., 2000). В этом случае чувствительные и специфичные методы молекулярной диагностики также могут оказаться очень полезными.

Одной из первоочередных задач бактериологической диагностики туберкулеза является повышение эффективности выделения культур микобактерий и их быстрая видовая идентификация. Известно, что помимо типичных клеточных форм, микобактерии могут присутствовать в макроорганизме в виде измененных вариантов, L-форм (Дорожкова И.Р. и др., 1980; Коваленко И.В., 1989). Однако, хотя методы выделения L-форм микобактерий из биологических образцов разработаны уже более двух десятилетий назад, вопрос точной видовой идентификации выделенных L-форм до сих пор остается не решенным окончательно. В мировой литературе существуют противоположные взгляды на проблему L-форм, ряд исследователей ставит под сомнение само существование такого рода измененных микроорганизмов, в то время как другие считают фазу L-трансформации естественной фазой жизненного цикла [224]. Для разрешения этой проблемы целесообразно применение молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить идентификацию выделенных L-форм на уровне генома.

В последние десятилетия обострилась проблема заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями - микобактериозов (Оттен Т.Ф., 1994), особенно у ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом. Для прогнозирования течения заболевания и назначения адекватного лечения необходимо знать основные биологические свойства возбудителя. Особенности биохимических свойств микроорганизмов во многих случаях определяются наличием плазмид, несущих гены, ответственные за синтез биологически активных веществ. Многие исследователи сообщали о плазмидах у нетуберкулезных микобактерий (Meissner, Falkinham, 1986; Crawford, Bates, 1986), но четкой взаимосвязи между наличием плазмид и биологическими свойствами установлено не было. До сих пор нет работ, посвященных прямому исследованию плазмидного профиля у различных видов микобактерий, вегетирующих на территории Российской Федерации. Вопрос о наличии плазмид у микобактерий туберкулезного комплекса также остается открытым (Cole, Telenti, 1995).Таким образом, несмотря на пристальное внимание ученых к проблеме плазмид у микобактерий, этот предмет все еще требует изучения.

Все вышеперечисленные проблемы, встающие перед исследователями микобактерий - возбудителей заболеваний человека, определяют цели и задачи работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Целью настоящего исследования явилась разработка и использование молекулярно-генетических методов для идентификации возбудителей туберкулеза и микобактериозов в клиническом материале.

Задачи работы:

1. Оценить эффективность амплификационных методов выявления микобактерий в нереспираторных клинических образцах и идентифицировать M.bovis BCG непосредственно в биологическом материале.

3. Идентифицировать L-формы микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции.

Научная новизна:

1. Разработан дифференцированный подход для выявления микобактерий в различных типах клинических образцов методом ПЦР.

2. Разработана схема применения молекулярно-генетических методов в диагностике заболеваний, вызываемых микобактериями.

3. Предложен экспресс-метод определения M.bovis BCG в клинических образцах.

4. С помощью молекулярно-генетических методов доказана микобактериальная природа L-форм, выделяемых из клинических образцов при туберкулезе, и определены особенности структуры ДНК микобактериальных L-форм. 5. Охарактеризован плазмидный профиль микобактерий, выделенных от больных, проживющих в Северо-Западном регионе Российской Федерации и установлена связь между частотой выделения плазмид и жизнеспособностью микобактерий.

Практическая значимость исследования:

По теме диссертации:

- направлена заявка на изобретение «Способ бактериологической диагностики туберкулеза», получена приоритетная справка № 2000103371 от 10.02.2000 г.

- опубликовано 22 работы, 2 находятся в печати.

- утверждены Минздравом России Методические рекомендации "Методы выделения ДНК для диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции" (№ 99/154, 1999 г.).

- представлены на утверждение в Минздрав России Методические рекомендации: "Повышение эффективности этиологической диагностики внелегочного туберкулеза".

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Эффективность применения полимеразной цепной реакции для выявления M.tuberculosis в биологических образцах от больных внелегочным туберкулезом, которая достигнута за счет дифференцированного подхода к выделению ДНК из различных типов проб, превосходит эффективность стандартных бактериологических методов (микроскопии и посева) в 2 - 20 раз.

Предложенная схема применения молекулярно-генетических тестов позволяет проводить ускоренную идентификацию и исследование биологических свойств микобактерий различных видов.

2. L-формы, выделяемые из биологических образцов от больных внелегочным туберкулезом и идентифицированные методом полимеразной цепной реакции в 85% случаев принадлежат к М.tuberculosis и к M.bovis BCG, при этом ДНК культур L-форм не всегда содержит инсерционный элемент IS 6110.

3. Нетуберкулезные микобактерии - возбудители микобактериозов, выделяемые от больных, проживающих в Северо-Западном регионе РФ, содержат плазмиды: М.avium - 28% штаммов, M.chelonae -37,5% и M.fortuitum - 49%. Наличие плазмид взаимосвязано с биологической активностью микобактерий.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на:

СПб научном обществе микробиологов (1997, 1998, 1999, 2000), Европейском ежегодном семинаре микобактериологов (Париж, 1996), русско-финском совещании по проблеме инфекционных заболеваний (Турку, 1997, Хельсинки, 1998, СПб, 1999), русско-финском семинаре по проблемам туберкулеза (СПб, 1998, 1999), Научно-практической конференции СПбНИИФ (1997, 1998), Всероссийском съезде микробиологов и эпидемиологов (Москва, 1998), пленуме Межведомственного научного совета РАМН и МЗ РФ по туберкулезу и гранулематозным заболеваниям легких (Москва, 1998), Всероссийской научно-практической конференции "ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний" (СПб, 1998),

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Вишневская, Елена Борисовна

ВЫВОДЫ

5. Выявлено, что генетическая структура L-форм М. tuberculosis отличается от генетической структуры клеточных форм.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

Для быстрой и надежной видовой идентификации L-форм микобактерий и повышения эффективности бактериологической диагностики туберкулеза целесообразно применять метод полимеразной цепной реакции с видоспецифичными для M.tuberculosis и M.bovis BCG праймерами.

- Для анализа костей, суставов и плотных тканей - на 25 - 30%.

При выявлении M.tuberculosis методом ПЦР следует учитывать зависимость эффективности ПЦР от типа клинического образца. Рекомендуемый для исследования материал:

- При гинекологическом туберкулезе - ткань эндометрия или биоптаты маточных труб;

- При туберкулезе костей у детей - фрагменты костей;

- При туберкулезе костей у взрослых - гной, некротические массы;

- При туберкулезе суставов - параллельное исследование синовиальной жидкости и синовиальной оболочки.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Вишневская, Елена Борисовна, Санкт-Петербург

1. Альварес Фигероа М.В., Лепеха Л.Н., Никоненко Б.В. и др.// Выявление Mycobacterium tuberculosis в крови методом ПЦР (экспериментальная модель)//'Тенодиагностика в современной медицине". - М., 2000. - С. 277 - 279.

2. Беллендир Э.Н. Патогенез внелегочных локализаций туберкулеза// Внелегочный туберкулез. Руководство для врачей/ ред. А.В.Васильев: СПб, 2000-С. 38-49.

3. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Голанов B.C. и др. способ прогнозирования течения туберкулезного процесса в легких. Патент RU 2121302 // РЖ "Туберкулез". 1999. - №1. - С. 21-23.

4. Вишневский Б.И., Оттен Т.Ф. Актуальные вопросы современной микобактериологии//Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем СПб, 1998.- т.1.- С.21 - 23.

5. Вишневский Б.И., Качанова Н.К. Микробиологические методы исследования// Внелегочный туберкулез. Руководство для врачей/ ред. А.В.Васильев: СПб, 2000 С. 114 - 123.

6. Гамалея Н.Ф. Гетероморфизм бактерий под влиянием солей лития//

7. Врач. 1894.-Т. 15.-С. 541.

8. Голышевская В.И., Корнеев А.А., Черноусова JI.H. Биологическая характеристика M.tuberculosis и трудности микробиологической диагностики туберкулеза// Пробл.Туб. 1995. - №2. - С. 30 - 32.

9. Голышевская В.И., Корнеев А. А., Черноусова JI.H. Микробиологическая диагностика туберкулеза// Вестн.Рос.Акад.наук.1995.-№7.-С. 16-18.

10. Голышевская В.И., Корнеев А. А., Черноусова Л.Н. Новые микробиологические методы в диагностике туберкулеза// Пробл.Туб.1996,- №6. -С. 22-25.

11. Голышевская В.И., Черноусова Л.Н., Шишкина Е.Ф. и др. Применение ПЦР для диагностики туберкулеза легких// "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний". М., 1998. - С. 93 - 94.

12. Демкин В.В., Скотникова О.И., Николаева Н.П. и др. Эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса тест-системой, основанной на использовании принципа нестед ПЦР// "Генодиагностика в современной медицине". М., 2000. - С. 268 - 271.

13. Дорожкова И.Р., Земскова З.С. Формы персистирования микобактерий туберкулеза в организме практически здоровых в отношении туберкулеза людей // Журн.микробиол. 1973. - №1. - С. 115-119.

14. Дорожкова И.Р., Волк А.В. Фазы морфогенеза L-форм микобактерий туберкулеза, полученных под влиянием различных антибиотиков и туберкулостатических препаратов// Журн.микробиол. 1973. - №11. - С. 12-18.

15. Дорожкова И.Р., Кочемасова З.Н., Дыхно М.М. Выделение L-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала. Методические рекомендации МЗ СССР. М.,1984. - 19 с.

16. Дорожкова И.Р., Карачунский М.А., Абдуллаев Э.Т. и др. Выявление L-форм МБТ как прогностический критерий рецидивов и обострений туберкулеза у больных с большими остаточными изменениями в легких//Пробл. туб. 1989. - № 3. - С. 14 - 17.

17. Иртуганова О.А., Лобашова Г.П., Мороз A.M., Литвинов В.И. Автоматизированные системы выявления роста M.tuberculosis ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВАСТ: сравнительный анализ// Тез.доклТУ съезда науч.-мед. ассоциации фтизиатров. Йошкар-Ола, 1999. - № 903.

18. Карачунский М.А., Дорожкова И.Р., Балта Ю.Е. Динамика выделения L-форм микобактерий при лечении больных с впервые выявленным деструктивным туберкулезом легких //Пробл.туб,- 1978. №3.- С. 66-69.

19. Карачунский М.А., Дорожкова И.Р., Гаджиев Г.С. и др. Особенности клиники туберкулеза периферических лимфоузлов при выделении L-форм МБТ//Пробл.туб. 1983. - № 11. - С.32-35.

20. Кац Л.Н., Волк А.В., Константинова Н.Д. Ультраструктура L-форм. Сообщение 1. Микобактерии туберкулеза.//Журн.микробиол. 1974. - № 4. - С. 73 - 77.

21. Кноринг Б.Е. Применение иммунолюминесцентного метода для идентификации микобактерий туберкулеза и выявления специфических антител: Автореф.дис. .канд.мед.наук. Л., 1970. - 22с.

22. Коваленко И.В. L-формы микобактерий туберкулеза: клиническое значение и выявление. М.: Наука и техника, 1989. - 104 с.

23. Коваленко И.В. Антигенность и серологическая активностьмикобактерий, полученных экспериментальным путем// L-формы микобактерий туберкулеза/ ред. Коровкин B.C.: Наука и техника, М., 1989. 104 с.

24. Коваленко И.В. Определение L-форм методом посева и иммунофлюоресценции в патологическом материале у больных активным туберкулезом легких// L-формы микобактерий туберкулеза/ ред. Коровкин B.C. : Наука и техника, М., 1989. 104 с.

25. Коваленко К.Н. Туберкулез костей и суставов у детей// Внелегочный туберкулез. Руководство для врачей/ ред. А.В.Васильев. СПб, 2000 -С. 253-275.

26. Кожухарь Г.Н., Аникин В.Н., Жук Н.А. и др. Способ обнаружения микобактерий туберкулеза.//РЖ "Туберкулез". 1999. - № 3.- с. 9-11.

27. Корнеев А.А., Пузанов В.А., Гришина Т.Д., Черноусова JI.H. S и R формы M.tuberculosis как проблема получения клонированных и фенотипически компетентных штаммов// Пробл.Туб. 1996. - №2. - С. 36-40.

28. Кочемасова З.Н., Дыхно М.М., Кассирская Н.Г. и др.//Биологические свойства ревертантов, полученных из L-форм микобактерий туберкулеза // Пробл.туб. 1969. - №2. - С. 65 - 68.

29. Кочемасова З.Н., Дыхно М.М., Дорожкова И.Р., Кассирская Н.Г., Баканова Д.Я. L-формы микобактерий туберкулеза. М.: Медицина, 1980.- 175 с.

30. Круду В.Н. Характеристика микобактериальной популяции и ее рольв реактивации процесса у лиц с остаточными туберкулезными изменениями в легких. Автореф.дис. .канд.мед.наук. М., 1990. - 22с.

31. Кузнецов П.В. Способ диагностики туберкулеза почек. Патент RU 2121145//РЖ "Туберкулез". 1999. -№1. - С. 19-20.

32. Куличенко А.Н., Завалев В.И., Майоров Н.В. и др. Сравнительное использование различных схем анализа при ПЦР-диагностике туберкулеза// Тез.докл-IV съезда науч.-мед. ассоциации фтизиатров. -Йошкар-Ола, 1999. № 791. - С. 213.

33. Лазовская Л.Л., Пинчук Л.М. Факторы патогенности микобактерий туберкулеза //Пробл.туб. 1988. - № 8. - С. 72 - 76.

34. Леви Д.Т., Аксенова В.А., Закирова Н.Р., Александрова Н.В. Вакцинация BCG: характеристика препаратов и причина поствакцинальных осложнений. Пробл.туб. - 1999. - № 4. - С.4-7.

35. Оттен Т.Ф. Особенности бактериологической диагностики и этиотропной терапии микобактериозов легких.: Дисс. . д.м.н. СПб., 1994.-240с.

36. Прозоровский С.В. Проблема патогенности L-форм бактерий имикоплазм (сравнительный анализ): Дисс. .д.м.н. М.,1970- 416с.

37. Руководство по микробиологическим методам./ред. Биргер М.О.: М., "Медицина", 1982.-80 с.

38. Терешин И.М., Белоусова И.И. // Действие биологически активных веществ на устойчивость к антибиотикам // Химиотерапия инфекций и лекарственная устойчивость патогенных микроорганизмов: сб.науч.тр. М., 1973. С.28 - 30.

39. Терешин И.М. Преодоление лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний JL: Медицина, 1977.-182с .

40. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. Биология L-форм бактерий. М.: Медгиз, 1961.-235 с.

41. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии. М.: Медицина, 1973. - 392 с.

42. Тимаков В.Д. Роль L-форм бактерий и микоплазм в этиологии и патогенезе некоторых острых и хронических заболеваний// Вестн.АМН СССР. 1976. - №5. - С. 3-10.

43. Федерольф А.К. Влияние хлористого лития на бактерии// Врач. -1895.-Т. 16.-С. 1084.

44. Хоменко А.Г. Динамика бацилловыделения и критерии абациллирования у больных туберкулезом легких// Тез. докл. 8-го Всес.съезда фтизиатров. -М., 1973. С.159 - 160.

45. Черноусова JI.H., Ларионова Е.Е., Севастьянов Э.В. и др. Обнаружение M.tuberculosis в мокроте больных с ограниченными формами туберкулеза легких методом ПЦР// "Туберкулез сегодня -проблемы и перспективы". М., 2000. - С. 89 - 90.

46. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянов Э.В. и др. Повышение эффективности диагностики абациллярного туберкулеза при сочетании ПЦР-анализа с культуральным посевом// "Генодиагностика в современной медицине" М.,2000. - С. 290-291.

47. Черноусова JI.H., Николаева Г.М., Смирнова Т.Г. и др. Определение содержания ДНК микобактерий в диагностическом материале от больных туберкулезом легких в процессе химиотерапии// "Генодиагностика в современной медицине". М., 2000. - С. 291 - 292.

48. Шмелев Н.А., Дорожкова И.Р., Земскова З.С. Персистирование возбудителя туберкулеза в организме в виде L-форм и их повреждающее действие // Вестник Акад.мед.наук. 1976. - № 5. - С. 29-37.

49. АЬе С., Hirano К., Wada М. Evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube system using an oxygen sensitive fluorescent sensor for rapid detection of mycobacteria// Clin. Mycobacter. 1998. - P. 175 - 180.

50. Afghani B. Rapid differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis using glycerol susceptibility and quantitative polymerase chain reaction. //J. Investig. Med. 1998. - Vol. 46. - No. 2. - P. 73-75.

51. Aka N., Vural E.Z. Evaluation of patients with active pulmonary tuberculosis for genital involvement//J.Obstet.Gynaecol.Res. 1997. - Vol. 23.-No. 2.-P. 337-340.

52. Alberghina M, Nicoletti G. Genetic determinants of aminoglycoside resistance in strains of Mycobacterium tuberculosis II Chemotherapy. 1973. -Vol. 19. - No.l. - P. 148- 160.

53. Alexander-Jackson E. Tuberculous mycobacteria spheroplasts// Ann.N.Y.Acad.Sci. 1945. -Vol.7. - No.l. - P.81.

54. Aljada I.S., Crane J.K., Corriere N., Wagle D.G. Mycobacterium bovis BCG causing vertebral osteomyelitis (Pott's disease) following intravesical BCG therapy.// J.Clin.Microbiol. 1999. - Vol.37. - No.6. -P.2106-2108.

55. Almenoff P.L., Johnson A., Lesser M., Mattman L.H. Growth of acid fast L- forms from the blood of patients with sarcoidosis. // Thorax. 1996. -Vol. 51.-No. 5.- P. 530-533.

56. Amicosante M., Richeldi L., Trenti G. et al. Inactivation of polymerase inhibitors for Mycobacterium tuberculosis DNA amplification in sputum by using capture resin// J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - No. 3. - P. 629 -630.

57. Ausina V., Barrio J., Luquin M. et al. Mycobacterium xenopi infections in the Acquired Immunodeficiency Syndrome// Ann.Intern.Med. 1988. - Vol. 109.-No. 5.- P. 927-928.

58. Bachrach G., Colston M.J., Bercovier H. e.a. A new single-copy mycobacterial plasmid, pMFl, from Mycobacterium fortuitum which is compatible with the pAL5000 replicon // Microbiology. 2000. - Vol. 146. -No. 2. - P. 297-303.

59. Badak F.Z., Kiska D.L., Seetterquist S. et al. Comparison of Mycobacteria Growth Indicator Tube with BACTEC 460 for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens // J. Clin.Microbiol. 1996. - Vol. 34. -No. 11.-P. 2236-2239.

60. Balazs D., Cojocaru R., Damian M. Molecular characterization of Mycobacterium bovis BCG: Romanian sub-strain.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - Vol. 3. - No. 6. - P. 542-545.

61. В alter M. AIDS now World's fourth biggest killer//Science. 1999. - No. 3. - P.1101 - 1102.

62. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase// Proc.Nat.Acad.Sci. 1991. - Vol. 88. - No. 2. - P. 189

63. Barnes P.F. Rapid diagnostic tests for tuberculosis: progress but no gold standard//Am.J.Resp.Crit.Care Med. 1997.-Vol. 155.-No. 5.-P. 173-179.

64. Beggs M.L., Crawford J.T., Eisenach K.D. Isolation and sequencing of the replication region of Mycobacterium avium plasmid pLR7// J. Bacterid.- 1998.-Vol. 177.- No. 17,- P. 4836-4840.

65. Beggs M.L., Eisenach K.D., Cave M.D. Mapping of IS6110 insertion sites in two epidemic strains of Mycobacterium tuberculosis// J.Clin.Microbiol. — 2000. Vol. 38. - No. 8. - P. 2923 - 2928.

66. Birkenmayer L., Armstrong A.S. Preliminary evaluation of the ligase chain reaction for specific detection of Neisseria gonorrhoeae/! J.Clin.Microb. 1992. - Vol. 30. - No. 15. - P. 3089 - 3094.

67. Boddinghaus В., Flohr Т., Rogall T. et al. Identification of mycobacteria by amplification of rRNA// J.Clin.Microbiol. 1990. - Vol. 28. - No. 8. - P. 1751 - 1759.

68. Boddinghaus В., Rogall Т., Flohr T. et al. Detection and identification of mycobacteria by amplification and hybridization of rRNA// J.Clin.Microbiol. -1991.-Vol. 29.-No. l.-P. 171-175.

69. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.H. Rapid and simple method for purification of nucleic acid// J.Clin.Microb. 1990. - Vol. 28. - No. 2. - P. 495-503.

70. Brosman S.A. Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy// Urol. Clin. North.Am. 1992. - No. 3. - P. 557-564.

71. Buddie B.M., Parlane N.A., Keen D.L. Differentiation between Mycobacterium bovis BCG-vaccinated and M. bovis-infected cattle by using recombinant mycobacterial antigens.// Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. -Vol. 6. - No.l.-P. 1-5.

72. Butler W.R., Jost K.S., Kilburn J.O. Identification of mycobacteria by high-performance liquid chromatography // J. Clin.Microbiol. 1991. - Vol.29. No. 13. - P. 2468-2472.

73. Butler W.R., O'Connor S.P., Yakrus M.A. Cross-reactivity of genetic probe for detection of Mycobacterium tuberculosis with newly described species Mycobacterium celatum/l J. Clin.Microbiol. 1994. — Vol. 32. - No. 3.-P. 536-538.

74. Caldarelli-Stefano R., Yazo L., Bonetto S. et al. Use of magnetic beads for tissue DNA extraction and IS6110 Mycobacterium tuberculosis PCR// Mol. Pathol. 1999.-Vol. 52.-No. 3.-P. 158- 160.

75. Calmette A., Guerin G., Negre L., Boquet A. Premunition des nouveaux-nes contre la tuberculose par le vaccin BCG, 1921-1926// Ann. Inst. Pasteur (Paris). 1926. - Vol.40. - P. 89 - 133.

76. Cattaneo C., Smillie D.M., Gelsthorpe K. et al. A simple method for extracting DNA from old skeletal material// Forensic.Sci.Int. 1995. - Vol. 74. - No. 3. - P. 167-174.

77. Charache, P. Atypical bacterial forms in human disease// Microbial protoplasts, spheroplasts and L-forms/ ed. L. B. Guze: TheWilliams & Wilkins Co., Baltimore, 1968. P. 484-494.

78. Cheab F.F., Kan Y.W. Detection of specific DNA sequences by fluorescence amplification: a color complementation assay// Proc.Nat.Acad.Sci. 1989. - Vol. 86. - No. 17. - P. 9178 - 9182.

79. Chen C.M., Yuen K.Y., Chan K.S. et al. Single-tube nested PCR in the diagnosis of tuberculosis// J. Clin. Pathol. 1996. - Vol. 49. - No. 2. - P. 290-294.

80. Christel L.A., Petersen K., McMillan W. et al. Rapid, automated nucleic acid probe assays using silicon microstructures for nucleic acidconcentration// J.Biomech.Eng. 1999. - Vol. 121. - No. 1. - P.22 - 27.

81. Clarrige III J.E., Shawar B.M., Shinnick T.M., Pilkaytis B.B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of in a routine mycobacteriology laboratory// J.Clin.Microbiol. 1993. - Vol. 31. - No. 7. -P. 2049-2056.

82. Cole S.T., Telenti A. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis!1 Eur.Resp.J. 1995. - Vol. 8, Suppl. 20. - P. 701 - 713.

83. Coombs N.J., Gough A.C., Primrose J.N. Optimization of DNA and RNA extraction from archival formalin-fixed tissue//Nucl.Acids Res. 1999. - Vol. 27.-No. 16.-P. 12.

84. Crawford J.T., Bates J.H. Isolation of plasmids from mycobacteria // Infect. Immun. 1979,- Vol. 24.-No. 3. - P. 979-981.

85. Crawford J.T., Cave M.D., Bates J.H. Characterization of plasmids from strains of Mycobacterium avium-intracellulare II Rev. Infect. Dis. 1981. -Vol. 3.-No. 5. - P. 949-952.

86. Crawford J.T., Bates J.H. Analysis of plasmids in Mycobacterium avium-intracellulare isolates from persons with acquired immunodeficiency syndrome//Am.Rev.Respir.Dis. 1986. - Vol. 143. - No. 4. - P. 659 - 661.

87. Crawford J.T., Falkinham J.O. Plasmids of the Mycobacterium avium complex//Molecular biology of the mycobacteria/ Ed. J.McFadden: London, 1990.-P. 97-119.

88. Dailloux M., Laurain C. Value of nucleic acid amplification methods Amplicor (Roche) and Amplified MTD (Gen-Probe) for the rapid diagnosis of tuberculosis// Ann.Biol.Clin.Paris. 1996. - Vol. 54. - P. 297 - 301.

89. Dale J.W. Mobile genetic elements in mycobacteria // Europ.Resp.J. -1995. Vol. 8, Suppl. 20. - P. 633 - 648.

90. D'Amato R.F., Isemberg H.D., Hochshtein L et al. Evaluation of the Roshe Septi-Check AFB system for the recovery of mycobacteria // J. Clin.Microbiol. 1991. - Vol. 29. - No. 15. - P. 2906 - 2908.

91. Dar L., Sharma S.K., Bhanu N.V. et al. Diagnosis of pulmonary tuberculosis by polymerase chain reaction for MPB 64 gene: an evaluation in a blind study// Indian J.Chest Dis.Allied Sci. 1998. - Vol. 40. - No. 1. - P. 5-16.

92. David H.L. Bacteriology of mycobacterioses. Washington, 1976. - P. 94 - 109.

93. Del Portillo P., Murillo L.A., Patarroyo M.A. Amplification of a species-specific DNA fragment of Mycobacterium tuberculosis and its possible use in diagnosis// J.Clin.Microbiol. 1991. - Vol. 29. - No. 8. - P. 2163-2168.

94. Dienes, L. L type variant forms in cultures of various bacteria//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1939. - Vol. 42. - P. 773-778.

95. Dienes, L., H. J. Weinberger, and S. Madoff. The transformation oftyphoid bacilli into L forms under various conditions.// J. Bacteriol. 1950. - Vol. 59. - No. 3. - P. 755-764.

96. Dienes, L., S. Madoff, and S. Bullivant. Study of L-forms as seen in thin sections with the electron microscope// Current research on group A Streptococcus/ ed. R. Caravano: Excerpta Medi. Foundation, Amsterdam,1966. P. 342.

97. Dienes, L. Morphology and reproductive processes of bacteria withdefective cell wall// Microbial protoplasts, sphero-plastsand L-forms/ ed. L. B. Guze: The Williams & Wilkins Co., Baltimore., 1968. P. 74.

98. Dienes, L. Permanent alterations of the L-forms of Proteus andSalmonella under various conditions//J.Bacteriol. 1970. - Vol. 104. - P. 1369-1377.

99. Dienes, L. Nomenclature of bacterial L-form and cell wall-defective bacteria// J. Infect. Dis. 1973. - Vol. 127. - No. 3. - P. 476-477.

100. Domingue, G. J., and J. U. Schlegel. The possible role of microbialL-forms in pyelonephritis.// J. Urol. 1970. - Vol. 104. - No. 4. - P. 790-798.

101. Domingue, G. J. Filterable, cell-associated cell wall-deficient bacteriain renal diseases. Addison-Wesley PublishingCo., Reading Mass., 1982. - P. 121 - 138.

102. Domingue, G. J. Cell wall-deficient bacteria: basic principles and clinical significance. Reading Mass., 1982. - 264p.

103. Domingue G.J., Woody H.B. Bacterial Persistence and Expression of Disease// Clin. Microb. Rev. 1997. - Vol. 10. - No. 2. - P. 320-344.

104. Eing B.R., Becker A., Sohns A., Ringelmann R. Comparison of Roshe Cobas Amplicor Mycobacterium tuberculosis assay with in-house PCR and culture for detection of M.tuberculosis 11 J.Clin.Microbiol. 1998. - Vol. 36. -No. 7.-P. 2023-2029.

105. Erardi F.X., Failla M.L., Falkinham J.O. // Plasmid-encoded copperresistance and precipitation by Mycobacterium scrofulaceum // Appl. Environ. Microbiol.- 1987.-Vol. 53. No. 8.- P. 1951-1954.

106. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J J. Recent advances in the polymerase chain reaction// Science-1991. Vol. 252. - No. 10. - P. 1643 -1651.

107. Faerman M., Jankauskas R. Paleopathological and molecular evidence of human bone tuberculosis in Iron Age Lithuania//Anthropol.Anz. 2000. -Vol. 58,-No. 1.- P. 57-62.

108. Falkinham J.O., Crawford J.T. Plasmids// Tuberculosis: pathogenesis, protection and control/ Ed. Bloom B.R.: London, SU Press, 1990. p. 97 -119.

109. Figueroa D.R., Martinez V.I., Villagrana Z.R. Tuberculosis of the female reproductive tract: effect of function// Int.J.Fertil.Menopausal Stud. -1996. Vol. 41. - No. 3. - P. 430 - 436.

110. Folgueira L., Delgado R., Palenque E. Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in clinical samples by using a simple lysis method andpolymerase chain reaction// J.Clin.Microbiol. 1993. - Vol. 31. - No. 5. - P. 1019-1021.

111. Forbes B.A., Hicks K.E.S. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol- 1993.- Vol. 31.- No. 5. P. 1688 -1694.

112. Fox W. Whither short-course chemotherapy?//Br.J.Dis.Chest. — 1981. — Vol. 75. No. 2. - P. 331 - 357.

113. Franzblau S.G., Takeda Т., Nakamura M. Mycobacterial plasmids: screening and possible relationship to antibiotic resistance in Mycobacterium avium/ Mycobacterium intracellulare II Microb.Immun. 1986. - V. 30. -No. 5.- P. 903 -907.

114. Frothingham R., Wilson K.H. Sequence-based differentiation of strains in the Mycobacterium avium complex// J.Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - No. 13. - P. 2818-2825.

115. Frothingham R., Wilson K.H. Molecular phylogeny of the Mycobacterium avium complex demonstrates clinically meaningful divisions// J.InfectDis. 1994.-Vol. 169.- No. 2. - P.305-312.

116. Frothingham R. Differentiation of strains in Mycobacterium tuberculosis complex by DNA sequence polymorphisms, including rapid identification of M. bovis BCG// J.Clin.Microbiol. 1995. - Vol. 33. - No.3. -P.840 - 844.

117. Gangadharam P.R., Perumal V.K., Crawford J.T., Bates J.H. Association of plasmids and virulence of Mycobacterium avium complex // Am. Rev. Respir. Dis. 1988. - Vol. 137. - No. 1. - P. 212-214.

118. Garcia-Quintanilla A., Garcia L., Tudo G. et al. Single-tube balanced heminested PCR for detecting Mycobacterium tuberculosis in smear-negative samples// J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - No. 3. - P. 1166-1169.

119. Garvin D.F., Mattman L.H. Immunofluorescent identification of mycobacterial variants//Bact.Proc. 1967 - Vol.67. - No. l.-P. 101-104.

120. Gavigan J.A., Ainsa J.A., Perez E. e.a. Isolation by genetic labeling of a new mycobacterial plasmid, pJAZ38, from Mycobacterium fortuitum. II J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - No. 13. - P. 4115-4122.

121. Ginesu F., Pirina P., Sechi L.A. et al. Microbiological diagnosis of tuberculosis: a comparison of old and new methods// J.Chemother. 1998. -Vol. 10. - No. 4. - P. 295 - 300.

122. Good R.C., Snider D.E. Isolation of nontuberculous mycobacteria in the United States, 1980// J. Infect. Dis. 1982. - Vol.146. - No. 6. - P.829 -833.

123. Haeseleer F. Structural instability of recombinant plasmids in mycobacteria//Res. Microbiol. 1994. - Vol. 145.-No. 9. - P. 683 - 687.

124. Hance A.J., Grandcharnp В., Levy-Frebault V. et al. Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA// Mol.Microbiol. 1989. - Vol. 3. - No.5. -P. 843 - 849.

125. Hance A.J., Levy-Frebault V., Grandcharnp В., et al. Detection and identification of mycobacterium species by DNA amplification// Mol.Microb. 1990.-Vol. 4.-No. l.-P. 83-87.

126. Hawley R.J., Mann N., Imaeda T. Ultrastructure of Nocardia-like variants of Mycobacterium smegmatis and chemical composition of the basal cell wall layer// Canad. J. Microbiol. 1977. - Vol. 23. - No. 12. - P. 1723

127. Hellyer T.J., Brown I.N., Dale J.W. e.a. Plasmid analysis of Mycobacterium avium/intracellulare isolated in the United Kingdom // J.Med.Microb. 1991. - Vol. 34. - No. 1. - P. 225-231.

128. Hellyer T.J., DesJardin L.E., Teixeira L. et al. Detection of viable Mycobacterium tuberculosis by reverse transcriptase-strand displacement amplification of mRNA// J.Clin.Microbiol. 1999. - Vol. 37. - No. 3. -P.518 - 523.

129. Hijmans, W., and H. A. L. Clasener. A survey of the L-forms of bacteria// Mycoplasma and the L-forms of bacteria./ ed. S. Madoff: New York., 1971.-P. 37-47.

130. Hijmans W.,. vanBoven C.P.A, Clasener H.A.L. Fundamentalbiology of the L-phase of bacteria// The myco-plasmatales and the L-phase of bacteria./ ed. L. Hayflick: Appleton-Century-Crofts: NewYork., 1969. P. 67 -75.

131. Horsburgh С.J., Selik R.M. The epidemiology of disseminated nontuberculous mycobacterial infection in the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)//Am.Rev.Resp.Dis. 1989. - Vol. 139.-No.l.- P. 4-7.

132. Hull S.I., Wallace R.J., Bobey DJ. e.a. Presence of aminoglycoside acetyltransferase and plasmids in Mycobacterium fortuitum/l Amer.Rev.Resp.Dis. 1984. -Vol. 129.-No.2. - P. 614-618.

133. Ikonomopoulous J.A., Gorgoulis V.G., Zacharatos P.V. et al. Multiplex PCR assay for the detection of mycobacterial DNA sequences directly from sputum// In Vivo. 1998. - Vol. 12. - No. 5. - P. 547 - 552.

134. Iovannisci D.M., Winn-Deen E.S. Ligation amplification and fluorescence detection of Mycobacterium tuberculosis DNA// Mol.Cell.Probes. 1993. - No. 7. - P. 35 -43.

135. Isenberg H.D., D'Amato R.F., Heifets L. et al. Collaborative feasibility study of a biphasic system (Roshe Septi-Check AFB) for rapid detection and isolation of mycobacteria // J. Clin.Microbiol. 1991. - Vol. 29. - No. 9. - P. 1719-1722.

136. Jatana S.K., Nair M.N., Lahiri K.K., Sarin N.P. Polymerase chain reaction in the diagnosis of tuberculosis// Indian Pediatr. 2000. - Vol. 37. -No. 4.-P. 375-382.

137. Jensen A.J., Bennedsen J., Rosdahl V.T. Plasmid profiles of Mycobacterium avium/intraceUulare isolated from patients with AIDS or cervical lymphadenitis and from environmental samples // Scand.J.Infect.Dis. 1989.-Vol. 21.- No.3. - P. 645-649.

138. Jonas V., Alden M.J., Curry Ji et al. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by amplification ofrRNA//J.Clin.Microbiol.- 1993.-Vol. 31.-No. 10.-P. 2410-2416.

139. Jonas V., Curry Ji. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis from respiratory tract specimens by amplification of rRNA// J.Clin.Microbiol. 1993. -Vol. 31. - No. 13.-P. 2684-2689.

140. Jones W.D., David H.L. Preliminary observations on the occurence of a streptomycin R-factor in Mycobacterium Smegmatis ATCC 607 // Tubercle.- 1972. Vol. 53. - No. 1.- P. 35-42.

141. Katila M.L., Katila P., Erkinjuntti-Pekkanen R. Accelerated detection and identification of mycobacteria with MGIT 960 and COBAS AMPLICOR systems// J.Clin.Microbiol. 2000. - Vol. 38. - No. 3. - P. 960 - 964.

142. Kearns A.M., Magee J.G., Gennery A. et al. Rapid identification of Mycobacterium bovis BCG by the detection of the RD1 deletion using a multiplex PCR technique// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - Vol. 3. - No.7.- P.635-638.

143. Kieser T. Factors affecting the isolation of cccDNA from Streptococcuslividans //VXs&mid. 1984. - Vol. 12. - No. 1. - P. 19 - 36.

144. Klemen H., Bogiatzis A., Ghalibafian M., Popper H.H. Multiplex polymerase chain reaction for rapid detection of atypical mycobacteria and Mycobacterium tuberculosis complex// Diagn.Mol.Pathol. 1998. - Vol. 7. -No. 6.-P.310-316.

145. Klieneberger E. The natural occurrence of pleuropneumonia-likeorganisms in apparent symbiosis with Streptobacillus moniliformis and otherbacteria// J. Pathol. Bacteriol. 1935. - Vol. 40. - No. 1. - P. 93-105.

146. Kocagoz Т., Yilmaz E., Ozkara S. et al. Detection of in sputum samples by polymerase chain reaction using a simplified procedure// J.Clin.Microbiol. 1993. - Vol. 31. - No. 6. - P. 1435 - 1438.

147. Koga H., Shigeru H., Kazunori T. et al. Clinical evaluation of the reagent for detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA by ligase chain reaction (LCR)// J.Jap.Assoc.Infect.Diseases. 1997. - Vol. 71. - No. 12.-P. 1246- 1251.

148. Kolattukudu P.E., Fernandes N.D., Azad A.K. et al. Biochemistry and molecular gentics of cell-wall lipid biosynthesis in mycobacteria// Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - No. 1. - P. 263 - 270.

149. Kolk A.H.J., Schuitema A.R., Kuijper S. et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a non-radioactive detection system// J.Clin.Microbiol. 1992. -Vol. 30. - No. 10. - P. 2567 - 2575.

150. Kolk A.H., Kox L.F., van Leeuwen J. et al. Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis// Eur.Resp.J.- 1998.-Vol. 11. No. 6.-P. 1222-1226.

151. Kues U., Stahl U. Replication of plasmids in gram-negative bacteria // Microbiol. Rev. 1989. -Vol. 53. - No 2. - P. 491-516.

152. Kwiatkowska S., Marczak J., Zieba M., Nowak D. Clinical utility of a commercial ligase chain reaction kit for the diagnosis of smear-negativepulmonary tuberculosis// Int.J.Tuberc.Lung Dis. 1999. - Vol. 3. - No. 5. -P. 421 -425.

153. Labidi A., Daugnet C., Goh K.S. et al. Plasmid profiles of M.fortuitum complex isolates//Curr. Microb. 1984. - Vol. 11.- No.2. - P. 235 - 240.

154. Labidi A., Mardis E., Roe B.A. et al. Cloning and DNA sequence of the Mycobacterium fortuitum var fortuitum plasmid pAL5000 // Plasmid. -1992.-Vol. 27. No.l.-P. 130-140.

155. Lamm D.L.,van der Meijden A.,Morales A. et al. Incidence and treatment of complications of Bacillus Calmette-Guerin intravescical therapy in superficial bladder cancer// J.Urol. 1992. - Vol. 147. - No.3. - P. 596 -600.

156. Landegren U., Kaiser R., Caskey C.T., Hood L. DNA diagnostic: molecular techniques and automation// Science. 1988. - Vol. 242. - No. 1. -P. 229 - 237.

157. Le Т.К., Bach K.H., Ho M.L. et al. Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Vietnam using IS6110 as probe// Tuberc. Lung Dis. 2000. - Vol. 80. -No. 2. -P. 75 - 83.

158. Lebrun L., Espinasse F., Poveda J.D.et al. Evaluation of nonradioactive DNA probes for identification of mycobacteria// J. Clin.Microbiol. 1992. - Vol. 30. - No. 13. - P. 2476 - 2478.

159. Leckie G., Alcalde X., Black W. et al. Clinical performance of the LCx Mycobacterium tuberculosis assay in a multicenter study// Clin. Mycobacter. 1998.-P. 131 - 140.

160. Lefevre P., Braibant M., Content J. Characterization of a Mycobacterium bovis BCG insertion sequence related to the IS21 family// FEMS Microbiol. Lett 1999. - Vol. 178. - No. 2. - P. 211-217.

161. Li G.L. Induction of the L forms of M. tuberculosis in vivo guinea pigs// Chung Hua Chieh Ho Ho Hu Hsi Tsa Chih 1990. Vol.13. - No. 6. -P.351-354.

162. Li H., Gyllensten U.B., Cui X. et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells// Nature. 1988. -Vol. 335. -No.3. - P. 414 - 417.

163. Li J.Y., Lo S.T., Ng C.S. Molecular detection of Mycobacterium tuberculosis in tissues showing granulomatous inflammation without demonstrable acid-fast bacilli// Diagn.Mol.Pathol. 2000. - Vol. 9. - No. 2. -P. 67-74.

164. Linares M.J., Pelaez M.J., Casal M. Application of high-performance liquid chromatography for identification of atypical mycobacteria// Clin. Mycobacter. 1998. - P. 185 - 187.

165. Lisby G. Application of nucleic acid amplification in clinical microbiology// Mol.Biotechnol. 1999. - Vol. 12. - No. 1. - P. 75 - 99.

166. Lotte A., Wasz-Hockert O., Poisson N. et al. BCG complications: estimates for the risk among vaccinated subjects and statistical analysis of their main characteristics//Adv.Tuberc.Res. 1984. - Vol. 21. - No.l. - P. 107- 193.

167. Lotte A., Wasz-Hockert O., Poisson N. Second IUATLD study on complications induced by intradermal BCG-vaccination//Bull.Int.Union Tuberc.- 1988.-Vol. 63. No.l. - P.47-59.

168. Lugosi L. Theoretical and methodological aspects of BCG vaccine from the discovery of Calmette and Guerin to molecular biology//Tubercle Lung Dis. 1992. - Vol. 73. - No.l. - P. 252-261.

169. Madiraju M.V., Qin M.H., Rajagopalan M. Development of simple and efficient protocol for isolation of plasmids from mycobacteria using zirconia beads//Lett.Appl. Microbiol.- 2000.- Vol. 30. No. 1. - P.38 - 41.

170. Madoff, S., M. E. Burke, and L. Dienes. Induction and identificationof L-forms of bacteria.//Ann.N.Y.Acad. Sci. 1967. - Vol. 143. - No. 4. - P. 755-759.

171. Madoff, S. The bacterial L-forms. Marcel Dekker, Inc., NewYork,. 1986. - 116p.

172. Madyavan H.N., Therese K.L., Gunisha P. et al. Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in epiretinal membrane in Eale's disease// Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2000. - Vol. 41. - No.3. -P.822 - 855.

173. Magdalena J., Supply P., Locht C. Specific Differentiation between Mycobacterium bovis BCG and Virulent Strains of the Mycobacterium tuberculosis Complex// J.Clin.Microb. 1998. - Vol. 36. - No. 9. - P. 24712476.

174. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickey MJ. e.a. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M.bovis //J.Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - No. 6. - P. 1274 - 1282.

175. Manual of Clinical Microbiology 8th ed./Ed. by Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A. et al.: Washingtone, 1998. 1243p.

176. Marchetti G., Gori A., Catozzi L. et al. Evaluation of PCR in detection of Mycobacterium tuberculosis from formaline-fixed, paraffin-embedded tissues: comparison of four amplification assays// J.Clin.Microbiol. 1998. -Vol. 36.-No. 6.-P. 1512-1517.

177. Marttila H., Soini H., Huovinen P., Viljanen M. katG mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients//Antimicr.Agents Chem. 1996. - Vol.40. - No.9. - P.2187-2189.

178. Marttila H. Molecular genetics of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Turku, 1999 - 79 p.

179. Mattman L.H. L-forms isolated from infections In: Microbialprotoplasts, spheroplasts and L-forms. / Ed. by L.B.Guze: Baltimore, 1968. -P. 472-483.

180. Mattman, L. H. Cell wall-deficient forms// Stealth pathogens, 2nd ed. -CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1993. P. 285.

181. Mattman, L. H. Leprosy// Stealth pathogens, 2nd ed. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1993. - P. 197.

182. Mattman, L. H. Mycobacterium tuberculosis and atypicals// Stealth pathogens, 2nd ed. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1993. - P. 175.

183. Mattman, L. H. Sarcordosis.// Stealth pathogens, 2nd ed. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1993. - P. 187.

184. McGee, Z. A., R. G. Whittler, H. Gooder, and P. Charache. Wall-defective microbial variants: terminology and experimental design// J. Infect. Dis. 1971.-Vol. 123.-No. 2.-P. 433-438.

185. Meissner P.S., Falkinham J.O. Plasmid-encoded mercuric reductase in Mycobacterium scrofulaceum И J. Bacteriol. 1984. - Vol. 157. - No.2. - P. 669-672.

186. Mira-Guttierez J., Paredes-Salido F., Sasian-Matias P. et al. Value of a gas chromatography to identify some rapidly growing mycobacterial species// Clin. Mycobacter. 1998. - P. 193 - 198.

187. Miyazaky Y., Koga H., Kohno S., Kaku M. Nested polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples// J.Clin.Microbiol. 1993. - Vol. 31. - No. 8. - P. 2228 - 2232.

188. Mizuguchi Y., Fukunaga M., Taniguchi H. Plasmid deoxyribonucleic acid and translucent-to-opaque variation in Mycobacterium intracellular 103 //J.Bacteriol. 1981. -Vol. 146,- No. 3. - P. 656 - 659.

189. Moore D.F., Curry J.I. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by ligase chain reaction// J.Clin.Microbiol. 1998. - Vol. 36. - No. 4. - P. 1028 - 1031.

190. Mordarska H., Mordarski M., Goodfellow M. Chemotaxonomic characters and classification of some nocardioform bacteria// J.Gen.Microbiol. 1972. - Vol.71. -P.77- 86.

191. Morris A.J., Reller L.B. Reliability of cord formation in BACTEC media for presumptive identification of mycobacteria// J. Clin.Microbiol. -1993.-Vol. 31.-No. 12.-P. 2533 -2534.

192. Morris S.L., Rouse D.A., Malik A. e.a. Characterisation of plasmids extracted from AIDS—associated Mycobacterium avium isolates // Tubercle. -1990. Vol. 71. - No. 3. - P. 181-185.

193. Much's granules revisited. Leading article.// Tubercle. 1987. - V.68. -No. 2. - P.241 -242.

194. Nightingale S.D.,Byrd L.T., Southern P.M. et al. Incidence of Mycobacterium avium-intracellulare complex in human immunodefeciency virus-positive patiennts//J.Inf.Dis. -1992.-Vol.165. No. 6.- P. 1082-1085.

195. Niyaz Ahmed A.S., Khan J.R., Ganai N.A. et al. DNA amplification assay for rapid detection of bovine tubercle bacilli in semen.// Anim. Reprod. Sci.-1999.-Vol. 31,- No. 1-2.-P. 15-21.

196. Nolte F.S., Metchock В., McGowan J.E. et al. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum by polymerase chain reaction and DNA hybridization// J.Clin.Microbiol. 1993. - Vol. 31. - No. 8. - P. 1777 -1782.

197. Nolte F.S., Metchock B. Mycobacterium// Manual of Clinical

198. Microbiology, 6th ecL/Ed. by Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A. et al: Washingtone, 1995. P.400 - 437.

199. Oosthuizen A.P., Wessels P.H., Hefer J.N. Tuberculosis of the female genital tract in patients attending an infertility clinic//S.Afr.Med.J. 1990. -Vol. 77. - No. 11. - P. 562 - 564.

200. Pai S.R., Actor J.K., Sepulveda E. et al. Identification of viable and non-viable Mycobacterium tuberculosis in mouse organs by directed RT-PCR for antigen 85B mRNA// Microb.Pathol. 2000. - Vol. 28. - No. 6. - P. 335 -342.

201. Pestel-Caron, M., Graff, G., Berthelot, G.,e.a.// Molecular Analysis of Mycobacterium avium Isolates by Using Pulsed-Field Gel Electrophoresis and PCR.// J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37.- No. 10.- P. 2450 - 2455.

202. Pethel M.L., Falkinham J.O. Plasmid-influenced changes in Mycobacterium avium catalase activity // Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. -No. 6. - P. 1714- 1718.

203. Picardeau M., Vincent V. Characterization of large linear plasmids in mycobacteria // J. Bacteriol. 1997 - Vol. 179. - No. 8 .- P. 2753 - 2756.

204. Picardeau M., Vincent V. Mycobacterial linear plasmids have an invertron-like structure related to other linear replicons in actinomycetes// Microbiology. 1998. - Vol. 144. - No. 7. - P. 1981 - 1988.

205. Picardeau M., Le Dantec C., Vincent V. Analysis of the internal replication region of a mycobacterial linear plasmid // Microbiology. 2000. -Vol. 146,- No. 2.- P. 305 - 313.

206. Piepkorn M.W., Reichenbach D.D. Infective endocarditisassociated with cell-wall deficient bacteria. Electron microscopic findings in four cases//

207. Hum. Pathol. 1978.-Vol. 19.-No.l.-P. 163-173.

208. Plikaytis B.B., Eisenach K.D., Crawford J.T., Shinnick T.M. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG by a polymerase chain reaction assay. //Mol .Cell. Probes. 1991. -Vol. 5. - No.3. - P. 215-219.

209. Portillo-Gomez L., Morris S.L., Panduro A. Rapid and efficient detection of extra-pulmonary Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis// Int.J.Tuberc.Lung dis. 2000. - Vol. 4. - No. 4. - P. 361 - 370.

210. Pozzi G., Meloni M., Iona E. e.a. rpoB mutations in multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Italy // J.Clin.Microb. 1999. - Vol. 37. - No. 7. - P. 1197-1199.

211. Ranes M.G.,. Rauzier J., Lagranderie M., e.a. Functional analysis of pAL5000, a plasmid from Mycobacterium fortuitum: construction of a "mini" mycobacterium-Escherichia coli shuttle vector // J. Bacteriol. 1990. -Vol. 172. - No.ll.- P. 2793 -2797.

212. Rauzier J., Moniz-Pereira J, Gicquel-Sanzey B. Complete nucleotide sequence of hAL5000, a plasmid from M.fortuitum // Gene. 1988. - Vol. 71. - No. 2. - P. 315-321.

213. Richter С., Kox L.F., Van-Leeuwen J.V. et al. PCR detection of mycobacteraemia in tanzanian patients with extrapulmonary tuberculosis// Eur.J.Clin.Microb.Infect.Dis. 1996. - Vol. 15. -No. 10. - P. 813 - 817.

214. Roberts G.D., Koneman E.W., Kim Y.K. Mycobacterium//Manual of clinical microbiology/ Ed. Balows A., Hausler W.T., Herrmann K.L. et al.: NY, 1991.-P. 304-309.

215. Rodriguez-Barradas M.C., Clarridge J., Darouiche R. Disseminated Mycobacterium fortuitum disease in an AIDS patient// Am.J.Med. 1992. -Vol.93. - No.3. - P. 473-474.

216. Rook G.A.W., Stanford J. L. Slow bacterial infections or autoimmunity// Immunol. Today 1992. - Vol.13. - No.l. - 160-164.

217. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F.et al. Enzymatic amplification of (3-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia// Science. 1985. - Vol. 230. - P. 1350 - 1354.

218. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with sequence-specific oligonucleotide probes// Proc.Nat.Acad.Sci. 1989. - Vol. 86. - P. 6230 - 6234.

219. Salch A.F., Weyer В., Bruns U. Comparison of ВАСТЕС MGIT 960 with ВАСТЕС 460 and solid media for detection of mycobacteria in clinical specimens in clinical laboratory// Clin.Microb.and Infect. 1999. - Vol.5, Suppl.3. -P.95.

220. Salian NV, Rish JA, Eisenach VD, Cave MD, Bates JH. Polymerase chain reaction to detect Mycobacterium tuberculosis in histology specimens// Amer.J.Resp.Crit.Care Med. -1998. Vol. 158. - No. 5. - P. 1150 - 1155.

221. Saltini C., Ivanyi J. Bridging research to medicine//Europ.Resp.J. -1995.-Vol.8, Suppl. 20.-P. 615-616.

222. Saltini C. Direct amplification of Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid in paucibacillary tuberculosis//Eur.Respir.J. 1998. -Vol. 11. -No. 6.-P. 1215 - 1217.

223. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. NY, 1989. - 264p.

224. Schroder G. Multicentre evaluation of the new Abbott LCx MTB assay// Clin. Mycobacter. 1998. - P. 141 - 148.

225. Sewell D.L., Rashad A.L., Rourke W.J. et al. Comparison of the Septi-Check AFB and BACTEC systems and conventional culture for recovery of mycobacteria// J. Clin.Microbiol. 1993. - Vol. 31. - No. 13. - P. 2689 -2691.

226. Sherman I., Harrington N., Rothrock A., George H. Use of a cut-off range in identifying Mycobacteria by the Gen-Probe rapid diagnostic system// J.Clin.Microbiol. 1989. - Vol.27. - No. 2. - P. 241 - 244.

227. Shinnik T.M., Good R.C. Mycobacterial taxonomy// Eur.J.Cli.Microb. Infect.Dis.- 1994.-Vol. 13.- No.3. P.884-901.

228. Siddiqi S.H., Libonati J.P., Middlebrook G. Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis //J.Clin.Microbiol. 1981. - Vol.13. -No.4. -P. 908 - 912.

229. Sjobring U., Mecklenburg M., Andersen A.B., Miorner H. Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis// J.Clin.Microbiol. 1990. - Vol. 28. - No. 7. - P. 2200 - 2204.

230. Small L.C., Ramakrishnan L., Falkow S. Remodeling schemesof intracellular pathogens.//Science.-1994,-Vol. 263. -No.2. P.637-639.

231. Soini H., Bottger E.C., Viljanen M.K. Identification of mycobacteria by

232. PCR-based sequence determination of the 32-kilodalton protein gene//J.Clin.Microbiol. 1994. - Vol. 32. - No. 12. - P. 2944 - 2947.

233. Soini H. Detection and identification of mycobacteria by PCR and sequencing of the 32-kDa protein gene. Turku, 1996. - 61 p.

234. Stager C.E., Libonati J.P., Siddiqi S.H. et al. Role of solid media when using in conjunction with the BACTEC system for mycobacterial isolation and identification // J. Clin.Microbiol. 1991. - Vol. 29. - No. 1. - P. 154 -157.

235. Stolt P., Stoker N.G. Functional definition of regions necessary for replication and incompatibility in the Mycobacterium fortuitum plasmid pAL5000 // Microbiology. 1996. - Vol. 142. - No. 10. - P. 2795 - 2802.

236. Su W.J., Tsou A.P., Yang M.H. et al. Clinical experience in using polymerase chain reaction for rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis// Chung Hua I Hsueh Tsa Chin (Taipei). 2000. - Vol. 63. - No. 7. - P. 521 -526.

237. Suffys P.N., Ivens de Araujo M.E., Degrave N.M. et al. The changing face of the epidemiology of tuberculosis due to molecular strain typing a review// Memorial Inst.Oswaldo Gruz. - 1997. - Vol. 92. - No. 3. - P. 297 -316.

238. Suffys P., Palomino J.C., Cardoso Leao S. et al. Evaluation of the polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis I J Int.J.Tuberc.Lung Dis. 2000. - Vol. 4. -No.2.-P. 179- 183.

239. Talbot E.A., Williams D.L., Frothingham R. PCR identification of Mycobacterium bovis BCG//J.Clin.Micr. 1997. - Vol. 35. - No.3. - P. 566569.

240. Tan M.F., Ng W.C., Chan S.H. Comparative usefulness of PCR in the detection of Mycobacterium tuberculosis in different clinical specimens//J.Med.Microbiol. 1997. - V. 46. - No. 1. - P. 164 - 169.

241. Thibert L., Lapierre S. Routine application of high-performance liquid chromatography for identification of mycobacteria // J. Clin.Microbiol. -1993. Vol. 31. - No. 9. - P. 1759- 1763.

242. Thierry D.A., Brisson-Noel A., Vincent-Levy-Frebault S. et al. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS 6110, and its application in diagnosis// J.Clin.Microb. 1990. - Vol. 28. -No. 12.-P. 2668-2673.

243. Udou Т., Ogawa M., Mizuguchi Y. Spheroplast formation of Mycobacterium smegmatis and morphological aspects of their reversion to the bacillary form.//J. Bacteriol. 1982. - Vol. 151. - No. 2. - P. 1035 - 1039.

244. Vachee A., Savage G., Blanckaert C. et al. Diagnosis of osteo-articular tuberculosis by Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (AMTD)//Clin.Mycobacter. Cordoba, 1998. - P. 165 - 170.

245. Vaquero M., Guttierrez J., Casal M. Comparison of ligase chain reaction and polymerase chain reaction methods for the detection of Mycobacterium tuberculosis!/Clin. Mycobacter. Cordoba, 1998. - P. 171 -174.

246. Veloso I., Lopes M., Salas C., Moreira E.//A comparison of three DNA extractive procedures with leptospira for polymerase chain reaction analysis// Mem.Inst.Oswaldo Cruz. 2000. - Vol. 95. - No. 3. - P. 339 - 343.

247. Vordermeier H.M., Cockle P.C., Whelan A. Development of diagnostic reagents to differentiate between Mycobacterium bovis BCG vaccination and M. bovis infection in cattle//Clin. Diagn. Lab. Immunol. -1999. Vol. 6. - No. 5. - P. 675-682.

248. Wahlberg J., Lundeberg J., Hultman Т., Uhlen M. General colorimetric method for DNA diagnostics allowing direct solid-phase genomic sequencing of the positive samples// Proc.Nat.Acad.Sci. 1990. - Vol. 87. - P. 6569 -6573.

249. Wayne L.G. Microbiology of tubercle bacilli//Am.Rev.Resp.Dis. -1982. Vol. 125 (Suppl.). - P. 31-41.

250. Wayne L.G., Kubica G.P. The mycobacteria// Bergey's manual of systematic bacteriology, vol.2/ Ed. P.H.A.Sneath: Baltimore, 1986. P. 14351457.

251. Wilson K.H., Blitchington R.B., Green R.C. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction// J.Clin.Microbiol. -1990.-Vol. 28.-No. 10.-P. 1942- 1946.

252. Wilson S.M., McNerney R., Nye P.M. et al. Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis// J.Clin.Microbiol.- 1993. Vol.31. -No.3.- P. 776 - 782.

253. Yagupsky P.V., Kaminski D.A., Palmer K.M., Nolte F.S. Cord formation in BACTEC 7H12 medium for rapid, presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex 1990. Vol. 28. - No. 7. - P. 1451 -1453.

254. Yuen K.Y., Chan K.S., Chan C.M. et al. Use of a PCR in routine diagnosis of treated and untreated pulmonary tuberculosis// J.Clin.Pathol. -1993. Vol. 46. - No. 3. - P. 318 - 322.

Информация о работе

Вишневская, Елена Борисовна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий - возбудителей заболеваний человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий - возбудителей заболеваний человека - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы