Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка принципов ускоренной идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка принципов ускоренной идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом"

На правах рукописи

ИВАНОВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА ПРИНЦИПОВ УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МШфБАКТЕРИЙ ЛАЗЕРНО-ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗДЭи^ио

Москва 2010

003490308

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Доктор медицинских наук,

профессор

Александров Михаил Тимофеевич, Доктор медицинских наук, профессор

Пашков Евгений Петрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор медицинских наук, профессор Воропаева Светлана Дмитриевна, Доктор медицинских наук, профессор Митрохин Сергей Дмитриевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоится <<№» 2010 г. в*^" часов на

заседании Диссертационного Совета Д.208.040.08 в ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, по адресу: 119992 г. Москва, ул. М.Трубецкая, д. 8.,стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «/У » 20С#г. Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.08.

Доктор медицинских наук, профессор Андрей Юрьевич Миронов

Актуальность темы

Согласно оценкам ВОЗ, с каждым годом во всем мире регистрируется все большее число новых случаев заболевания туберкулезом. Так, в 2007 г. насчитывалось 9,27 млн. новых случаев заболевания туберкулезом и 1,75 млн. человек умерло от туберкулеза, из которых 0,45 млн. были ВИЧ-инфицированы [WHO, 2008]. Возбудители туберкулеза относятся к Mycobacterium tuberculosis complex, куда входят M.tuberculosis (MET), M.bovis, M.bovis BCG, M.microti, M.africanum.

Наряду с широким распространением по всему миру туберкулеза, отмечается также рост заболеваемости микобактериозами, возбудителями которых являются нетуберкулезные микобактерии (НТМБ) (Оттен Т.Ф., 2004; Макарова М.В., 2007). Резкий подъем числа заболеваний, вызываемых НТМБ, в том числе M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.fortuitum и др., в значительной мере обусловлен развитием эпидемии ВИЧ-инфекции - у 2550% больных СПИДом развивается диссеминированная микобактериальная инфекция (Adle-Biassette Н. et al., 2003; Bonard D. et al., 2004). Особенностью НТМБ является их высокая природная резистентность к антибактериальным препаратам, в том числе и противотуберкулезным. На сегодня по литературным данным во всем мире известно более 120 видов НТМБ [Griffith D.E. et al., 2007; Euzéby J.P., 2008]. В России распространенность НТМБ в 2004-2005 гг. составила 0,5-6,2 % среди всех микобактерий у впервые выявленных больных [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005]. При схожей клинической картине туберкулеза и микобактериоза главным критерием при постановке диагноза микобактериоза является бактериологическое исследование больного с выделением культуры микобактерии и их идентификацией.

Классический бактериологический метод выделения и идентификации микобактерий основывается на способности роста культуры при различных температурах, оценке скорости роста, морфологии колонии, пигментообразования, ферментативной активности, биохимических свойств

[Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978]. Основным недостатком

бактериологического метода является длительность. Так, по данным авторов Т.Ф. Отген, A.B. Васильев (2005г.) сроки идентификации НТМБ классическими бактериологическими методами достигают до 6 месяцев. По приказу №109 МЗ РФ от 21.03.2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ» диагноз туберкулез ставится после двухкратного подтверждения бактериологическим методом, а все остальные методы идентификации являются дополнительными.

Существующие на сегодняшний день ускоренные методы идентификации микобактерий, такие как молекулярно-генетические, хроматографические, автоматизированные системы культивирования на жидких средах, при несомненных своих достоинствах и преимуществах существенно ограничены для широкого внедрения и применяются в основном в крупных централизованных микробиологических центрах. Для проведения этих исследований необходима специализированная лабораторная служба, высококвалифицированный персонал, используются дорогостоящие расходные материалы и оборудования. Все это делает актуальным поиск, разработку и внедрение в широкую практику новых современных экспресс методов идентификации микобактерий.

В связи с этим, мы обратили внимание на принципиально новый перспективный экспрессный лазерно-флюоресцентный метод. Он основан на регистрации и анализе собственной флюоресценции микроорганизмов, индуцированной лазерным излучением. Лазерно-флюоресцентный метод разработан отечественными авторами М.Т.Александровым, А.А.Воробьевым, Е.ППашковым и был удостоен в 2002 году Государственной премии Российской Федерации. Однако до настоящего времени экспериментально-теоретическое обоснование лазерно-флюоресцентного метода, его методическое и технологическое обеспечение для индикации и идентификации M.tuberculosis complex и нетуберкулезных микобактерий не были разработаны.

Таким образом, проблема разработки современных экспрессных, чувствительных и специфичных методов идентификации микроорганизмов, доступных для широкого применения, остается на сегодняшний день весьма актуальной, в первую очередь, для диагностики таких опасных инфекционных заболеваний, как туберкулез и микобактериоз. Цель исследования:

Разработать принципы ускоренной идентификации различных видов микобактерий лазерно-флюоресцентным методом. Задачи исследования:

1) Изучить лазерно-индуцированную аутофлюоресценцию микобактерий комплекса М. tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий ¡n vitro.

2) Создать базу данных спектрально-флюоресцентных характеристик микобактерий в различных концентрациях, микобактериальных ассоциациях.

3) Разработать принципы повышения эффективности идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.

4) Разработать алгоритм экспресс-идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом в чистых и смешанных культурах.

5) Провести апробацию лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий на неизвестных клинических штаммах и оценить его эффективность.

Научная новизна

Проведено экспериментально-теоретическое обоснование применения лазерно-флюоресцентного метода для экспресс-идентификации разных видов микобактерий (М. tuberculosis complex и НТМБ). Впервые создана база данных спектрально-флюоресцентных характеристик 17 видов микобактерий в чистых культурах и их смесях, основанная на фундаментальном изучении

их лазерно-индуцированной аутофлюоресценции. На основании

базы данных амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции микобактерий впервые разработан ускоренный метод их идентификации в смешанных культурах. Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что для объективной и эффективной идентификации микобактерий необходимо повышение чувствительности существующего лазерно-флюоресцентного метода. Объективно обосновано применение для этих целей детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик. Практическая значимость работы

Проведенные экспериментально-теоретические и лабораторно-клинические научные исследования явились фундаментальным этапом разработки лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий. Данная научно-исследовательская работа имеет важное значение в практической фтизиатрии, так как может позволить реализовать новый метод экспресс индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза и микобактериозов в клинических штаммах с предварительным результатом идентификации уже через 1-2 часа и с окончательным через 1-2 суток по сравнению с классическим бактериологическим методом (3-6 мес.). Положения, выдвигаемые на защиту

1. На основании экспериментальных исследований объективно обосновано применение метода лазерной флюоресценции для ускоренной идентификации M.tuberculosis complex и нетуберкулезных микобактерий в чистых и смешанных культурах.

2. Разработаны основные принципы повышения эффективности лазерно-флюоресцентного метода идентификации микобактерий на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа спектральных характеристик микобактерий.

3. Лазерно-флюоресцентный метод позволяет проводить

индикацию и дифференциацию возбудителей туберкулеза и микобактериоза в клинических штаммах с эффективностью 80-90%. Апробация работы и публикации

Основные положения работы доложены на I Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи -путь к обществу, основанному на знаниях» 24-27 июня 2009 года, за участие в которой работа была награждена дипломом 1 степени и удостоена золотой медали.

Апробация диссертации состоялась на заседании научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова 12 декабря 2008г. (протокол №6).

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в лабораторную практику Московского городского научно-практического Центра борьбы с туберкулезом и используются в учебном процессе для студентов, аспирантов и врачей на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 2-х глав собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации представлено 22 таблицы и 45 рисунков. Список литературы включает 142 источника, из них 65 отечественных и 77 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В ходе работы были изучены спектрально-флюоресцентные свойства 19 видов микроорганизмов, из них 17 видов микобактеряй (МБ) и 2 условно-

патогенных микроорганизма (S. aureus, E.coli). Среди 17 видов МБ были 2 вида микобактерий туберкулезного комплекса (M.tuberculosis, M.bovis) и 15 видов НТМБ - М.avium, M.intracellulare, M.vaccae, M.kansasii, M.fortuitum, M.gordonae, M.szulgai, M.chelonae, M.xenopi.M.scrofulaceum, M.smegmatis, M.marinum, M.flavescens, M.malmoense, M.simiae. Были изучены как референтные штаммы, полученные из музея Московского городского научно-практического Центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), так и клинические штаммы, выделенные у больных туберкулезом и микобактериозами в МНПЦБТ.

Питательной средой для накопления микробной массы исследуемых микобактерий служили плотные яичные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Финна 2. Бактериологическую работу проводили согласно Приказу №109 МЗ РФ от 21.03.2003 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ» в специализированном отделе для идентификации НТМБ в микробиологической лаборатории МНПЦБТ совместно с к.б.н. М.В.Макаровой. Для приготовления суспензии использовали культуры микобактерий в стационарной фазе их роста. Для исследования на аппарате лазерно-флюоресцентной диагностики (ЛФД) использовали культуральные суспензии в разных концентрациях по стандарту мутности МакФарланда. Приготовление культуральных суспензий проводили согласно Приказу №109 МЗ РФ от 21.03.2003, Приложение №11. Концентрация микроорганизмов в суспензии контролировалась посевом серийных разведений. Готовые суспензии в объеме 1,5 мл вносили в стандартные пробирки типа «Эппендорф», после чего проводили измерения флюоресценции исследуемых микроорганизмов на аппарате ЛФД. Флюоресценцию микроорганизмов изучали как в монокультурах, так и в различных смесях.

Регистрацию собственной флюоресценции исследуемых микроорганизмов при возбуждении их излучением 633 нм (He-Ne лазер) проводили на экспериментальном, модернизированном совместно с сотрудниками Института Общей Физики РАН РФ, лазерном волоконном

многоканальном спектроанализаторе - сертифицированном аппарате «ЛЭСА-6». Главный принцип работы ЛЭСА-6 заключается в одновременной регистрации спектров отражения и флюоресценции исследуемых объектов при возбуждении их излучением длиной волны 633 нм (Не-Ые лазер) (рис.1).

Для воспроизводимости результатов исследования измеряли флюоресценцию контрольных объектов: 1) фторопластовый объект сравнения - объект с нулевым содержанием фотосенса); показатели (81 -интенсивность обратно-отраженного излучения, 52/81 - отношение мощности аутофлюоресценции исследуемого объекта (82) к для

фторопласта были одинаковы на всех этапах проведения измерений, что обеспечивало высокую воспроизводимость и достоверность результатов исследования); 2) дополнительный контроль - изотонический раствор №С1.

Разработку лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий проводили в несколько этапов (табл.1).

Таблица 1.

Этапы выполнения работы_

№ Проводимые исследования Объект исследования и количество образцов

Этап 1 Исследование флюоресценции различных видов микобактерий (создание базы данных спектрально-флюоресцентных характеристик микобактерий) Всего 19 видов бактерий, в том числе 17 видов МБ и 2 УПМ (S.aureus, E.co'i).

1.1. Исследование флюоресценции монокуль гур микобактерий in vitro 40 образцов монокультур микобактерий (около 800 спектров флюоресценции)

1.2. Исследование флюоресценции микробных ассоциаций in vitro 30 образцов микробных ассоциаций (около 600 спектров флюоресценции)

Этап 2 Разработка принципов повышения эффективности идентификации микобактерий 82 образца монокультур микобактерий, 34 образца микробных ассоциаций, 2 детергентных препарата - мирамистин, аламинол (около 11900 спектров флюоресценции)

2.1. Влияние на флюоресценцию микобактерий физических и химических факторов

2.2. Повышение интенсивности флюоресценции микобактерий на основе применения детергента

2.3. Повышение чувствительности лазерно-флюоресцентного метода на основе регистрации оптических характеристик среды

Этап 3 Разработка алгоритма экспресс - идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом 14 образцов клинических штаммов микобактерий

Этап 4 Апробация экспресс идентификации микобактгрий лазерно-флюоресцентным методом на неизвестных клинических штаммах двойным слепым методом (около 300 спектров флюоресценции)

Итого: 200 микробных образца, 13600 спектров флюоресценции

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили по общепринятому методу вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (а), ошибки средней арифметической (т). Сравнение параметрических вариантов после предварительной оценки правильности распределения выборок (соответствия его нормальному распределению) проводилось на основе критерия Стьюдента (t) с вычислением вероятности ошибки (р).

При использовании лазерно-флюоресцентного метода воспроизводимость исследуемых спектров подтверждали путем регистрации 10-15 спектров, записываемых последовательно с интервалами в 5 секунд. Ошибка измерений интегральной мощности флюоресценции не превышала ±1.5%.

Метод факторного анализа

Математическая модель и программа обработки спектрально-флюоресцентных характеристик микроорганизмов методом факторного анализа для индикации и идентификации исследуемых бактерий была разработана и экспериментально обоснована инженером-физиком Института Общей Физики РАН, к.ф-м.н. E.H. Васильевым.

Суть статистического метода факторного анализа спектральных характеристик микроорганизмов состоит в том, что, имея в наличии большую совокупность спектральных данных исследуемых микроорганизмов в различных концентрациях и ассоциациях, проведя ряд линейных преобразований, направленных на выделение статистически обусловленных независимых факторов для статистических вариаций спектров, определяются соотношения спектральных характеристик концентрационных параметров.

Процедура распознавания (идентификации) вида микробов предполагает наличие базы данных спектральных характеристик. Задача идентификации бактерий состоит в том, чтобы, используя информацию, содержащуюся в базе данных, определить на основе сравнительного анализа исследуемого объекта с показателями базы данных значения концентрации и вида для искомого объекта с максимальным уровнем статистической значимости.

Рис. 1. Типичный спектр флюоресценции (S1 - мощность обратно отраженного зондирующего лазерного излучения; S2 - мощность флюоресцентного сигнала, S2/S1 -нормированная мощность флюоресценции).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе были исследованы особенности лазерно-индуцированной флюоресценции микобактерий. В результате исследования 17 видов МБ было установлено, что спектральные кривые флюоресценции монокультур разных видов рода Mycobacterium, полученные при одних и тех же условиях лазерного возбуждения и измерения соответствующих величин, имеют много схожих параметров по форме спектра, пиков, интенсивности флюоресценции (рис.2). Эта схожесть приводит к низкой специфичности и информативности и, следовательно, к затруднению проведения индикации и идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом, используя

традиционные методы расчета спектральных параметров

(Александров М.Т., 2008) исследуемого вещества (Б1, Б2, 82/81).

В экспериментах выявлено, что интегральная интенсивность флюоресценции при одинаковых условиях измерения флюоресценции 19 видов микробов (рис. 3) наиболее высокая у 5 видов (26,3%) - МЬоуи, Б.аигеия, М.зсго/и1асеит, Е.соИ, М.хепор1 (от 4,862 до 8,645 отн.ед.); относительно средние показатели флюоресценции также отмечены у 5 видов (26,3%) - M.smegmatis, М.скектае, М./оПиПит, М.катснИ, МЛиЪегсиШгь Н37 Лу (от 2,276 до 2,951 отн.ед.); наиболее низкие показатели интенсивности флюоресценции зарегистрированы у остальных 9 видов (47,4%) - М.тшт, М.уассае, М.т1гасе11и1аге, М.яШае, М^опЬпае, М.зги^т, М.та1тоете, М-Атезсет, М.таппит (от 1,348 до 1,854 отн.ед.).

Как видно на рис. 2 и 3, достаточно высокие и средние показатели интенсивности флюоресценции отмечаются только у 10 из 19 видов микробов (52,6%), тогда как остальные 9 видов (47,4%) очень слабо флюоресцируют, из-за чего возникает сильная схожесть параметров флюоресценции у разных видов бактерий.

Тем не менее, имеются некоторые характерные различия в спектральном составе флюоресцентного сигнала разных видов МБ (рис. 4), которые были использованы как основа для качественного и количественного анализа методом факторного анализа. При этом для успешного применения факторного анализа спектральных характеристик МБ, в целях экспресс-идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом, необходимо было создать базу данных исследуемых образцов, как объект сравнения, в различных концентрациях и ассоциациях, чтобы на основе этой' базы данных можно было проводить индикацию и дифференциацию микобактерий.

На рис. 4 видно, что разные виды микобактерий отличаются друг от друга по спектральным характеристикам флюоресценции (форма спектра, пики, интенсивность флюоресценции). Из 5 видов микобактерий,

приведенных на данном рисунке, наибольшую схожесть по спектрально-флюоресцентным свойствам имеют близкие по микробиологическим характеристикам - M.avium и M.intracellnlare, объединенные в общий комплекс M.avium-complex (MAC). Оба вида отличаются от других видов тем, что слабо флюоресцируют даже при высоких концентрациях (18х 108 м.т./мл - 6-й стандарт мутности по МакФарланду), имеют одинаковые пики флюоресценции (660 нм, 675 нм, 704 нм, 730 нм). Это имеет важное значение, так как показатели их флюоресценции при возбуждении на данной длине волны 633 нм возможно характеризуют и определенные близкие микробиологические и биохимические свойства, т.е. отвечают за индивидуальность микроорганизма. Следовательно, у близких по видовой классификации микроорганизмов могут быть общие флюоресцентные характеристики.

В условиях экспериментов in vitro показано, что интегральная интенсивность флюоресценции бактерий практически линейно зависит от концентрации культуральной суспензии (рис.5). Чем выше концентрация микобактерий, тем выше интенсивность их флюоресценции, при этом основные амплитудно-спектральные характеристики сохраняются при динамическом наблюдении (до 6 дней).

Для создания объективной, аналитической базы данных спектральных характеристик необходимо было снять спектры флюоресценции не только в разных концентрациях, по и в различных ассоциациях разных видов микобактерий. Для этого приготавливали двух-, трех-, четырех- и пятикомпонентные культуральные суспензии (микст-суспензии) путем смешивания разных видов микобактерий в равных соотношениях (1:1) и исследовали их на аппарате ЛФД такой же методикой, как и монокультуры микобактерий. На примере трехкомпонентной суспензии показано, что основные спектрально-энергетические особенности флюоресценции микобактерий сохраняются и при исследовании микробных ассоциаций (рис. 6).

Рис. 2. Спектры флюоресценции 19 видов микроорганизмов, в том числе 17 видов и 2 УПМ (S.aureus, ¿.coli) в концентрации 18х10ем.т./мл.

Рис. 3. Показатели нормированной интенсивности флюоресценци (S2/S1) 19 видов микроорганизмов в концентрации 18х108м.т./мл.

— М.катсчи

— МЛиЬегси1о$15 Н37Яу

— М.а\чит

— Ммассаг

— М. Шгасе11и1аге

Рис. 4. Спектры флюоресценции 5 видов микобакгерий.

Спжтры

! Ч

;' I !

— М.катеаН 30* 108

— М.капвсиН 15*108

— \i.kansasii 7,5x10*

— М.каюавп 3,7*108

Рис. 5. Спектры флюоресценции М.кагисяи в двукратных разведениях.

М.т/шт

52/81 -1,14 отн.ед

М./огШНит 82/51 - 7,77 отн.ед

А)

Б)

\i.smegmatis 82/81-2,33 отнед

; ; : '

Микст-сусп. (М.скшт, М./огШНит, М.шерпаИь) 52/51-3,21 отн.ед

по »м м вя> т его ыо аао тоо по 720 по т гя ш т не т ко ею ю

впиамококовгобеовп^гютш/здтппоттагйопокс^&ю р\

В) «хат»» I )

Рис. 6. Спектры флюоресценции микст-суспензии, состоящей из М.аумт, М./оШИит, М.яте^аИя: а) М.а\шт\ б) М./огШИипг, в) \i.smegmatis', г) микст-суспензия.

В этих исследованиях установлено, что основные спектрально -энергетические особенности флюоресценции монокультур сохраняются и

при исследовании их смесей. В частности, выявлено, что нормированная интенсивность флюоресценции смесей тем выше, чем выше интенсивность флюоресценции микобактерий, входящих в состав смеси (микст-суспензии).

Как было показано ранее, большинство микобактерий в чистом виде слабо флюоресцируют, что выражается в низкой флюоресценции микобактериальных смесей, и как следствие, возникает затруднение в их индикации и идентификации. Флюоресценция микст-суспензий высока только в тех смешанных культурах, где содержатся хорошо флюоресцирующие бактерии.

Таким образом, из вышеуказанного следует, что необходимо улучшить чувствительность лазерно-флюоресцентного метода идентификации микобактерий с помощью использования дополнительных технологий повышения эффективности разрабатываемой нами медицинской технологии.

В связи с этим мы предприняли попытку усовершенствования лазерно-флюоресцентного метода идентификации микобактерий. Для начала необходимо было повысить собственную флюоресценцию микобактерий. Известно, что для эндогенных флюорофоров, содержащихся внутри клетки, характерно наличие тушения флюоресценции, что не позволяет им эффективно преобразовывать поглощаемое лазерное излучение во флюоресценцию [Ьакошкг I., 1982].

Основываясь на гипотезе о внутриклеточном тушении большей части эндогенных флюорофоров, мы предприняли поиски различных способов, которые позволили бы высвободить эндогенные флюорофоры из внутриклеточного состояния во внешнюю среду и таким образом интегрально повысить интенсивность аутофлюоресценции без изменения спектральной характеристики объекта исследования.

Для повышения интенсивности флюоресценции микобактерий профессором Александровым М.Т. было предложено воздействие на них разрушающим структуру клеточной стенки микобактерий не

флюоресцирующим детергентным препаратом, который бы за счет разрушения клеточной стенки бактерий высвободил эндогенные флюорофоры. В ходе исследования влияния различных детергентных препаратов (аламинол, Тритон-Х, SDS (sodium dodecyl sulfate), гипостабил, мирамистин) на флюоресценцию микобактерий нами было выявлено, что только аламинол и мирамистин дают прирост интенсивности флюоресценции микобактерий, тогда как остальные препараты почти не вызывали каких-либо изменений показателей флюоресценции. Однако при дальнейшем исследовании выяснилось, что аламинол обладает высокой аутофлюоресценцией, неустойчивой в количественном и качественном отношении в зависимости от концентрации. Таким образом, единственно удобным в спектрометрическом отношении оказался мирамистин, флюоресценция которого была минимальна и близка к эталону (фторопласту). При добавлении мирамистина в культуральные суспензии высвобождаются эндогенные флюорофоры, что приводило к резкому усилению спектральной интенсивности флюоресценции микобактерий без изменения ее амплитудно-спектральных характеристик (рис. 7).

На рис. 7 видно, что интенсивность флюоресценции M.vaccae (12х108 м.т./мл) увеличивается при добавлении раствора мирамистина (конечная концентрация в суспензии 0,3%). При этом максимальное повышение нормированного показателя флюоресценции (S2/S1) наблюдается на 2-ые сутки экспозиции M.vaccae с раствором мирамистина в 4 раза.

Повышение интенсивности флюоресценции показано также и на микст-культурах, которые ранее слабо флюоресцировали (рис. 8). Аналогичные результаты получены при исследовании других моно- и микст-культур с мирамистином. В отдельных случаях отмечалось увеличение интенсивности флюоресценции до 20-крат, что подтверждает гипотезу о внутриклеточном тушении большей части флюоресцирующих эндогенных флюорофоров.

620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 7S0 7S0 770 760 790 BOO 610 630

Длине волг*>| ИМ.

Рис. 7. Спектр флюоресценции Муассае с мирамистином (МИР) в динамике до и после добавления мирамистина - 0 (сразу после добавления МИР) , 1 час, 24ч, 48ч и 6-й день.

Спектры ___ _ _

620 630 640 650 660 670 660 690 700 710 720 730 740 750 760 770 7В0 790 BOO 610 820 Длин« юлны мм.

Рис. 8. Спектр флюоресценции микст-купътуры с мирамистином в динамике до 6 суток. Данная микст-культура состоит из 5 видов микобакгерий: М. avium, M.xenopi, M.smegmatis, M.vaccae, E.coli.

— +МИР, 40ч.

— +МИР.0

— Mszitlgai (живая)

•»Еявмкамогоиобеолп

Рис.9. Спектры флюоресценции M.szulgai (живая культура).

— 4-МИР, 48ч.

— +МИР.0

— M.szulgai (инакт.)

Рис.Ю.Спекгры флюоресценции M.szulgai (мертвая культура).

В частности, на рис. 8 представлены спектральные характеристики флюоресценции микст-культуры с мирамистином в конечной концентрации в суспензии 0,3%, при котором отмечается повышение интенсивности флюоресценции в 3,78 раза на 2-е сутки экспозиции суспензии с мирамистином. Следует отметить, что амплитудно-спектральные характеристики исследуемой культуры микобактерий сохраняют при этом свои характерные особенности.

В результате проведенных исследований, нами было достигнуто увеличение чувствительности метода на аппарате ЛФД в 10-15 раз, т.е. по разработанной нами технологии применения мирамистина стало возможным исследовать образцы в концентрации от ЮМО7 м.т./мл и меньше.

Разработанная технология применения мирамистина открыла лазерно-флюоресцентному методу еще одну возможность, а именно, проведение дифференциации живых и мертвых бактерий по их спектрально-флюоресцентной характеристике. Для наглядности приводим спектры отдельно живых и мертвых микобактерий, инактивированных автоклавированием. На рис. 9 представлены спектры флюоресценции М-яги^т (живая культура) до добавления мирамистина, сразу после добавления мирамистина и на 2-ые сутки экспозиции. На рис. 10 - спектры флюоресценции Мягк/^ш (мертвая культура) после автоклавирования: до добавления мирамистина, сразу после добавления мирамистина и на 2-ые сутки.

На рис. 9 видно, что интенсивность флюоресценции М.хги^ш (живая культура) повышается в 8,3 раза при добавлении мирамистина -нормированный показатель флюоресценции (82/81) увеличился с 1,46 до 12,18 отн.ед. На рис. 10 видно, что инактивированная автоклавированием культура М км/да/ изначально хорошо флюоресцирует и на 2-е сутки экспозиции с мирамистином показатель флюоресценции 82/81 находился на почти одинаковом уровне - 10,1 и 9,4 отн.ед. Таким образом, отличительным свойством мертвой культуры от аналогичной живой культуры является то,

что при добавлении в мертвую культуру раствора мирамистина интенсивность флюоресценции мертвой культуры почти не меняется, то есть мирамистин изменяет интенсивность флюоресценции только живых бактерий, что объективно подтверждает гипотезу внутриклеточного тушения флюорофоров (т.е. их внутри микроба уже нет и методика с мирамистином это доказывает).

Таким образом, с помощью мирамистина можно не только повысить интенсивность флюоресценции слабофлюоресцирующих в нативном состоянии микобактерий, к которым и относится М.$ти1%т, но и различить живые бактерии от мертвых (рис.9 и 10).

Установлено, что возможность дифференциации живых и мертвых бактерий на основе использования мирамистина лазерно-флюоресцентным методом характерна для всех изученных 17 видов микобактерий. При воздействии мирамистина на живую культуру интенсивность флюоресценции для всех исследованных микобактерий резко повышается на 1-е, 2-е сутки, тогда как флюоресцентные свойства мертвой культуры с мирамистином практически не изменяются при динамическом наблюдении.

После того как нам удалось повысить аналитическую чувствительность метода с помощью мирамистина до 108-107 м.т./мл, были выявлены и другие объективные факторы, частично уменьшающие качество флюоресцентной индикации бактерий. Это связано с оптической мутностью среды вследствие существенных различий рассеивающих характеристик объекта исследования в зависимости от его размеров, формы и концентрации, что влияет на объективность и вопроизводимость регистрации параметров флюоресценции исследуемых образцов.

Таким образом, одним из возможных путей дополнительного повышения эффективности методики является учет рассеивающих характеристик среды. Выявлено, что с помощью дополнительного измерения спектров пропускания образцов были скорректированы спектры флюоресценции образцов с микробами, и при моделировании на основе

таких спектральных данных было получено улучшенное

прогнозирование видов и концентраций микобактерий в смесях при последующей обработке результатов исследования методом факторного анализа (воспроизводимость 80-90%).

В итоге проведенных научных исследований был разработан алгоритм проведения экспресс-идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом (табл.2).

Таблица 2.

Алгоритм проведения экспресс-идентификации микобактерий

лазерно-флюоресцентным методом

Таким образом, нами разработаны основные принципы повышения эффективности идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом на основе использования детергента (мирамистин), учета

оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.

На основе приведенного алгоритма (табл.2) была проведена апробация усовершенствованного нами лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий на неизвестных клинических штаммах (14 образцов) в чистых культурах и их смесях двойным слепым методом (табл.3).

Таблица 3.

Результаты идентификации неизвестных клинических штаммов микобактерий лазерно-флюоресцентным методом в сравнении с микробиологическим методом

№ Вид бактерии Идентификация вида лазерно-флюоресцентным методом Результат (верно/неверно) Общий процент совпадений (%)

1 M.kansasü M.kansasü Верно

2 M.vaccae M.vaccae Верно

3 M.intracelhilare M. intracellular Верно

4 М. avium M. avium +M. intracellulare+ Верно/неверно 82,5%

5 М. avium M. avium +M. intracellulare Верно/неверно

6 M.tuberculosis M.tuberculosis Верно

7 M.tuberculosis M.intracellulare Неверно

8 M.tuberculosis M.tuberculosis Верно

9 M.tuberculosis M.tuberculosis + M. intracellulare Верно/неверно

10 M.tuberculosis M. tuberculosis Верно

11 M.intracellulare M.intracellulare Верно

12 M.tuberculosis M.tuberculosis Верно

13 M.tuberculosis + M.vaccae M.tuberculosis +M.vaccae верно

14 M. tuberculosis + M.kansasü M.tuberculosis +M.kansasii Верно

Из представленных в табл. 3 результатов оценки лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий в сравнении с микробиологическим методом, следует, что при исследовании двойным слепым методом 14 образцов неизвестных клинических штаммов микобактерий в чистых культурах и их смесях общий процент совпадений составил 82,5%.

В целом, эффективность разработанной новой медицинской технологии идентификации микобактерий на основе явления флюоресценции, индуцированной лазером, составила 80-90%.

Таким образом, поставленные перед нами цель и задачи исследования методически и методологически были решены на основе современных микробиологических, оптических, спектрофотометрических и математических методов исследования.

В ходе экспериментальных исследований были разработаны принципы повышения эффективности лазерно-флюоресцентного метода индикации и дифференциации микобактерий с помощью использования детергентных средств (мирамистин), оптического метода (учет рассеивающих характеристик среды), метода математического моделирования и обработки результатов исследования на основе факторного анализа.

Полученные результаты кратко можно представить в виде следующих выводов.

ВЫВОДЫ

1. В условиях эксперимента in vitro впервые изучены особенности лазерно-индуцированной аутофлюоресценции 17 видов микобактерий, в том числе 2-х видов микобактерий комплекса M.tuberculosis и 15 нетуберкулезных микобактерий.

2. Создана база данных спектрально-флюоресцентных характеристик микобактерий в их различных концентрациях и ассоциациях.

3. Разработаны принципы повышения эффективности лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.

4. Разработан экспресс-метод лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий, который позволяет получить предварительный

результат по идентификации микобактерий в клинических

штаммах через 1-2 ч и окончательный через 1-2 сут.

5. Разработана экспресс-технология выявления живых и мертвых бактерий на основе использования детергентной методики с применением раствора мирамистина (конечная концентрация в субстрате 0,3%), имеющая важное научное и прикладное значение.

6. Апробация экспресс-метода лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий на клинических штаммах показала его эффективность в 80-90%, что подтверждает разработанный алгоритм диагностики.

Практические рекомендации

1. Разработанный экспресс-метод лазерно-флюоресцентной

идентификации микобактерий может быть рекомендован для проведения своевременной диагностики туберкулеза и микобактериоза, назначения больным соответствующей химиотерапии, проведения мониторинга ее эффективности.

2. Разработанная новая медицинская технология лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий, как инновационная, рекомендуется использовать для обучения студентов, аспирантов при освоении новых методов в клинической микробиологии и их . усовершенствовании.

3. Разработанная методика дифференциации живых и мертвых микобактерий на основе использования детергента (мирамистин) и лазерно-флюоресцентной диагностики позволит объективно определять активность патологического процесса и эффективность его лечения, проводить ускоренный скрининг вновь разрабатываемых противотуберкулезных препаратов.

Список опубликованных работ по теме диссертации: 1. M.T.Alexandrov, O.G.Gaponenko, M.A.Ivanova, V.A.Khomenko, G.P.Kuzmin, M.V.Makarova, E.P.Pashkov, G.M.Sorokoumova, E.N.Vasilev. Increasing Efficiency of Laser Fluorescence Diagnostics of Microbial Diseases. Laser Physics, 2007, Vol.17, No. 12, pp. 1416-1423.

2. M.T.Alexandrov, E.N.Vasilev, M.A.Ivanova, G.P.Kuzmin, M.V.Makarova. The increase of efficiency of differential laser fluorescence diagnostics of deceases of microbe origin. Abst. of International Conference on Laser Applications in Life Science, June 11-14,2007: Conference program. - Moscow, 2007, p.44.

3. Г.Л.Геворков, М.Т.Александров, В.Ф.Прикулс, М.А.Иванова, Д.А. Бочарова. Инновационные лазерные флюоресцентные биотехнологии и их применение для анализа жизнедеятельности микрофлоры полости рта// Стоматология для всех. - 2008. - №4. - с.22-24.

4. М.Т.Александров, М.А.Иванова, Е.Васильев, В.А.Хоменко, О.Г.Гапоненко. Лазерко-флуоресцентная медицинская технология исследования спектральных характеристик различных микобактерий и ее клиническая апробация // «Лазерная клиническая биофотометрия» -М.: Техносфера, 2008. - с.460-477.

5. Иванова М.А. Экспресс-дифференциация живых и мертвых бактерий лазерно-флюоресцентным методом с использованием мирамистина / I Международная научно-практическая конференция «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях» 24-27 июня 2009г.: Сб. научных докладов. - М.: МГСУ, 2009. -с.357-358.

6. М.А.Иванова, М.В.Макарова, Е.В.Васильев, М.Т.Александров, Е.П.Пашков. Ускоренная идентификация микобактерий с помощью лазерной флюоресценции//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - №3. - с.81-85.

Список сокращений:

ЛФД - лазерно-флюоресцентная диагностика

МБ - микобактерии

МИР - мирамистин

м.т./мл - микробных тел на миллилитр

НТМБ - нетуберкулезные микобактерии

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

He-Ne - гелий-неоновый

КОПИ-ЦЕНТР св. 7:07:10429 Тираж 100 экз. г. Москва, ул. Енисейская, д.36 тел.: 8-499-185-7954, 8-906-787-7086

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Иванова, Мария Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современное состояние проблемы диагностики туберкулеза и микобактериоза.

1.1.1. Нетуберкулезные микобактерии.

1.2. Современные методы видовой идентификации микобактерий.:.

1.2.1. Микробиологические методы видовой идентификации микобактерий.

1.2.1.1. Культуральные методы исследования.

1.2.1.2. Биохимические методы исследования.

1.2.1.3. Автоматизированные системы культивирования микобактерий на жидких средах.

1.2.2. Хроматографические методы исследования.

1.2.3. Молекулярно-генетические методы исследования.

1.3. Обоснование возможности применения лазерно-флюоресцентного метода для ускоренной идентификации микобактерий.

1.3.1. Порфирины.

1.3.1.1. Микробиологический синтез порфиринов.

1.3.1.2. Метаболизм микобактерий.

1.3.2. Применение лазерно-флюоресцентного метода для экспресс-индикации бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка принципов ускоренной идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом"

Актуальность исследования

Согласно оценкам ВОЗ, с каждым годом во всем мире регистрируется все большее число новых случаев заболевания туберкулезом. Так, в 2007 г. во всем мире насчитывалось 9,27 миллиона новых случаев заболевания туберкулезом, из них 1,37 миллиона (15%) были ВИЧ-положительными. В 2007 г. умерло от туберкулеза 1,3 миллиона ВИЧ-отрицательных лиц и 0,45 миллиона ВИЧ-инфицированных лиц [56,97]. Возбудители туберкулеза относятся к Mycobacterium tuberculosis complex, куда входят M.tuberculosis (МБТ), M.bovis, M.bovis BCG, M.microti, M.africanum.

Сегодня, как и в предыдущие годы, туберкулез в России остается ведущей причиной смерти среди всех инфекционных заболеваний [56,63]. Так, по данным М.В.Шиловой (2008г.) из всех умерших в 2007 г. в стационаре от инфекционных и паразитарных болезней доля больных, смерть которых наступила от туберкулеза, составила 70% [63].

В распространении туберкулеза все большую роль играет эпидемия ВИЧ-инфекции [24,36,47,107,125,127,128]. Если сравнить, что в 2004 году показатель заболеваемости ВИЧ-инфекции в России был равен 19,9 на 100 тыс. населения, то в 2007 году уже составил 34,6 [56,63,97].

Наряду с широким распространением по всему миру туберкулеза, отмечается также рост заболеваемости микобактериозами, возбудителями которых являются нетуберкулезные микобактерии (НТМБ) [31,45]. Резкий подъем числа заболеваний, вызываемых НТМБ, в том числе М.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.fortuitum и др., в значительной мере обусловлен развитием эпидемии ВИЧ-инфекции - у 25-50% больных СПИДом развивается диссеминированная микобактериальная инфекция [67,76]. Особенностью НТМБ является их высокая природная резистентность к антибактериальным препаратам, в том числе и противотуберкулезным. На сегодня, по литературным данным, во всем мире известно более 120 видов НТМБ [92,98]. В России распространенность НТМБ в 2004-2005 гг. составила 0,5-6,2 % среди всех микобактерий у впервые выявленных больных [45]. При схожей клинической картине туберкулеза и микобактериоза главным критерием при постановке диагноза микобактериоза является бактериологическое исследование больного с выделением культуры микобактерии и их идентификацией.

Классический бактериологический метод выделения и идентификации микобактерий основывается на способности роста культуры при различных температурах, оценке скорости роста, морфологии колонии, пигментообразования, ферментативной активности, биохимических свойств [20,22,23]. Основным недостатком бактериологического метода является длительность и сложность обработки диагностического материала. Так, по данным авторов Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев (2005г.) сроки идентификации НТМБ традиционными методами достигают до 6 месяцев [45]. По приказу №109 МЗ РФ от 21.03.2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ» диагноз туберкулез ставится после двукратного подтверждения бактериологическим методом, а все остальные методы идентификации являются дополнительными [52].

Существующие на сегодняшний день ускоренные методы идентификации микобактерий, такие как молекулярно-генетические, хроматографические, автоматизированные системы культивирования на жидких средах, при несомненных своих достоинствах и преимуществах существенно ограничены для широкого внедрения и применяются в основном в крупных централизованных микробиологических центрах [45,46,55,59]: Для проведения этих исследований необходима специализированная лабораторная служба, высококвалифицированный персонал, используются дорогостоящие расходные материалы и оборудования. Все это делает актуальным поиск, разработку и внедрение в широкую практику новых современных экспресс методов идентификации микобактерий.

В связи с этим, мы обратили внимание на принципиально новый перспективный экспрессный лазерно-флюоресцентный метод [1-12]. Он основан на регистрации и анализе собственной флюоресценции микроорганизмов, индуцированной лазерным излучением. Лазерно-флюоресцентный метод разработан отечественными авторами М.Т.Александровым, А.А.Воробьевым, Е.П.Пашковым и был удостоен в 2002 году Государственной премии Российской Федерации [1,21,48]. Однако до настоящего времени экспериментально-теоретическое обоснование лазерно-флюоресцентного метода, его методическое и технологическое обеспечение для индикации и идентификации М. tuberculosis complex и нетуберкулезных микобактерий не были разработаны.

Таким образом, проблема разработки современных экспрессных, чувствительных и специфичных методов идентификации микроорганизмов, доступных для широкого применения, остается на сегодняшний день весьма актуальной и востребованной, в первую очередь, для диагностики таких опасных инфекционных заболеваний, как туберкулез и микобактериоз.

Цель исследования

Разработать принципы ускоренной идентификации различных видов микобактерий лазерно-флюоресцентным методом.

Задачи исследования

1) Изучить лазерно-индуцированную аутофлюоресценцию микобактерий комплекса M.tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий in vitro.

2) Создать базу данных спектрально-флюоресцентных характеристик микобактерий в различных концентрациях и ассоциациях.

3) Разработать принципы повышения эффективности идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.

4) Разработать алгоритм экспресс-идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом в чистых и смешанных культурах.

5) Провести апробацию лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий на неизвестных клинических штаммах и оценить его эффективность.

Научная новизна

Проведено экспериментально-теоретическое обоснование применения лазерно-флюоресцентного метода для экспресс-идентификации разных видов микобактерий (М. tuberculosis complex и НТМБ). Впервые создана база данных спектрально-флюоресцентных характеристик 17 видов микобактерий в чистых культурах и их смесях, основанная на фундаментальном изучении их лазерно-индуцированной аутофлюоресценции.

На основании базы данных амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции микобактерий впервые разработан ускоренный метод их идентификации в смешанных культурах.

Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что для объективной и эффективной идентификации микобактерий необходимо повышение чувствительности существующего лазерно-флюоресцентного метода. Объективно обосновано применение для этих целей детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.

Практическая значимость

Проведенные экспериментально-теоретические и лабораторно-клинические научные исследования явились фундаментальным этапом разработки лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий.

• Данная научно-исследовательская работа имеет важное значение в практической фтизиатрии, так как может позволить реализовать новый метод экспресс индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза и микобактериозов с предварительным результатом уже через 1-2 часа и с окончательным через 1-2 суток по сравнению с классическим бактериологическим методом идентификации микобактерий (3-6 мес.).

Положения, выдвигаемые на защиту

1. На основании экспериментальных исследований объективно обосновано применение метода лазерной флюоресценции для ускоренной идентификации M.tuberculosis complex и нетуберкулезных микобактерий в чистых и смешанных культурах.

2. Разработаны основные принципы повышения эффективности лазерно-флюоресцентного метода идентификации микобактерий на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа спектральных характеристик микобактерий.

3. Лазерно-флюоресцентный метод позволяет проводить индикацию и дифференциацию возбудителей туберкулеза и микобактериоза в клинических штаммах с эффективностью 80-90%.

Апробация работы и публикации

Основные положения работы доложены на I Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи -путь к обществу, основанному на знаниях» 24-27 июня 2009 года, за участие в которой работа была награждена дипломом 1 степени и удостоена золотой медали.

Результаты работы были опубликованы и представлены в следующих журналах, конференциях и монографии:

1. M.T.Alexandrov, O.G.Gaponenko, M.A.Ivanova, V.A.Khomenko, G.P.Kuzmin, M.V.Makarova, E.P.Pashkov, G.M.Sorokoumova, E.N.Vasilev. Increasing Efficiency of Laser Fluorescence Diagnostics of Microbial Diseases // Laser Physics. - 2007. - Vol.17. - No. 12. - pp. 1416-1423.

2. M.T.Alexandrov, E.N.Vasilev, M.A.Ivanova, G.P.Kuzmin, M.V.Makarova. The increase of efficiency of differential laser fluorescence diagnostics of deceases of microbe origin // Abst. of International Conference on Laser Applications in Life Science, June 11-14, 2007: Conference program. -Moscow, 2007. - p.44.

3. Г.Л.Геворков, М.Т.Александров, В.Ф.Прикулс, М.А.Иванова, Д. А. Бочарова. Инновационные лазерные флюоресцентные биотехнологии и их применение для анализа жизнедеятельности микрофлоры полости рта// Стоматология для всех. - 2008. - №4. - с.22-24.

4. М.Т.Александров, М.А.Иванова, Е.Васильев, В.А.Хоменко, О.Г.Гапоненко. Лазерно-флуоресцентная медицинская технология исследования спектральных характеристик различных микобактерий и ее клиническая апробация // «Лазерная клиническая биофотометрия» -М.: Техносфера, 2008. - с.460-477.

5. Иванова М.А. Экспресс-дифференциация живых и мертвых бактерий лазерно-флюоресцентным методом с использованием мирамистина / I Международная научно-практическая конференция «Научно-техническое творчество молодежи — путь к обществу, основанному на знаниях» 24-27 июня 2009г.: Сб. научных докладов. - М.: МГСУ, 2009. -с.357-358.

6. М.А.Иванова, М.В.Макарова, Е.В.Васильев, М.Т.Александров, Е.П.Пашков. Ускоренная идентификация микобактерий с помощью лазерной флюоресценции//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - №3. - с. 81-85.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 2-х глав с изложением результатов проведенных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. В диссертации представлено 22 таблицы и 45 рисунков. Список литературы включает 142 источника, из них 65 отечественных и 77 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Иванова, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

1. В условиях эксперимента in vitro впервые изучены особенности лазерно-индуцированной аутофлюоресценции 17 видов микобактерий, в том числе 2-х видов микобактерий комплекса M.tuberculosis и 15 нетуберкулезных микобактерий.

2. Создана база данных спектрально-флюоресцентных характеристик микобактерий в их различных концентрациях и ассоциациях.

3. Разработаны принципы повышения эффективности лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.

4. Разработан экспресс-метод лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий, который позволяет получить предварительный результат по идентификации микобактерий в клинических штаммах через 1-2 ч и окончательный через 1-2 сут.

5. Разработана экспресс-технология выявления живых и мертвых бактерий на основе использования детергентной методики с применением раствора мирамистина (конечная концентрация в субстрате 0,3%), имеющая важное научное и прикладное значение.

6. Апробация экспресс-метода лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий на клинических штаммах показала его эффективность в 80-90%, что подтверждает разработанный алгоритм диагностики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный экспресс-метод лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий может быть рекомендован для проведения своевременной диагностики туберкулеза и микобактериоза, назначения больным соответствующей химиотерапии, проведения мониторинга ее эффективности.

2. Разработанная новая медицинская технология лазерно-флюоресцентной идентификации микобактерий, как инновационная, рекомендуется использовать для обучения студентов, аспирантов при освоении новых методов в клинической микробиологии и их усовершенствовании.

3. Разработанная методика дифференциации живых и мертвых микобактерий на основе использования детергента (мирамистин) и лазерно-флюоресцентной диагностики позволит объективно определять активность патологического процесса и эффективность его лечения, проводить ускоренный скрининг вновь разрабатываемых противотуберкулезных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Иванова, Мария Александровна, Москва

1. Александров М. Лазерная клиническая биофотометрия (теория, эксперимент, практика). М.: Техносфера, 2008. - 584 с.

2. Александров М.Т., Васильев Е.Н., Лебедев А.В. 2007. и др. Многофакторный анализ в лазерной флуоресцентной диагностике // Радиотехника и электроника. 2007. - том 54. - №4. - с.486-491.

3. Александров М.Т., Воробьев А.А. и др. Концепция применения метода флюоресценции для индикации анаэробов при бактериологической диагностике // Свидет-во на интеллект, продукт от ВНИТЦ №70990000120 от 27.08.1999.

4. Александров М.Т., Морозова О.А., Круглов А.Н. и др. Новый метод лазерной спектрофлюоресценции в диагностике дисбиоза кишечника у детей // Тез.докл.конф. "Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей". М., 2001. - с.99-100.

5. Александров М.Т., Морозова О.А., Пашков Е.П. Метод флюоресцентной диагностики метод индикации микрофлоры человека в норме и патологии // ЖМЭИ. - 2001. - №3. - с.57-60.

6. Александров М.Т., Пашков Е.П., Бажанов Н.Н. и др. Методика лазерной флюоресцентной диагностики качества пищевых продуктов // Тез. докл. Международ.конф. "Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии". М., 2001. -с.25-26.

7. Александров М.Т., Пашков Е.П., Морозова О.А. и др. Интегральныйпоказатель состояния микрофлоры кишечника, выявленный с помощью флюоресценции // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. -№11.- с.4.

8. Александров М.Т., Таубинский И.М., Козьма С.Ю. Применение флуоресцентной спектроскопии для экспресс-оценки состояния микрофлоры желудочно-кишечного тракта // Биомедицинская радиоэлектроника. 2000. - №1.

9. Александров М.Т., Таубинский И.М., Козьма С.Ю. Способ для обнаружения и оценки концентраций анаэробных бактерий в биологическом субстрате // Патент РФ №97100364 от 21.01.97.

10. Александров М.Т., Черкасов А.С. Способ определения состояния биологической ткани // Патент РФ №2121289.

11. Баранов А. А., Марьяндышев А.О. Применение методов молекулярной биологии для исследования микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2008. -№4. - с.3-7.

12. Быховский В.Я. Микробиологический синтез порфиринов. ВНИИСЭНТИ. 1985.

13. Вейсфелер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии. Экспериментальные и теоретические исследования. Будапешт: Акад.Наук Венгрии. -1975. - 334с.

14. Гринхальх Т. Основы доказательной медицины: пер. с англ. / под ред. И.Н.Денисова, К.И.Сайткулова. 3-е изд. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009.-288с.

15. Дорожкова И.Р. Микобактерии // Клиническая лабораторная аналитика. Том IV. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории / под ред. В.В.Меньшикова. М.: Агат-Мед, 2003. - С. 557-577.

16. Дыхно М.М. Сравнительное изучение и методы дифференциации туберкулезных микобактерий, атипичных штаммов и кислотоустойчивых сапрофитов // Дис. . док. мед. наук. М., 1963.

17. Зайцева Т. А. Лазерно-флюоресцентный метод определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 2006. - 24 с.

18. Зыков М.П., Ильина Т.Б. Потенциально-патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов. М.: Медицина. - 1978. - 134с.

19. Ильина Т.Б. Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий // методические рекомендации. М., 1975. - 21с.

20. Какорина Е.П., Фролова О.П., Шинкарева И.Г. Проблема туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией в России // Туберкулез в России, Год 2007: материалы VIII Российского съезда фтизиатров. -М.: ООО "Идея", 2007. с.366-367.

21. Лабораторная диагностика туберкулеза / Под ред. В.И.Литвинова, А.М.Морозова. М.: МНПЦБТ, 2001. - 184с.

22. Левшин Л.В., Салецкий A.M. Люминесценция и ее измерения. М.: МГУ. - 1985. - 279с.

23. Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. М.: МНПЦБТ, 2008. - 256 с.

24. Лозовская М. Э. Совершенствование методов лечения микобактериозов в связи с лекарственной устойчивостью нетуберкулезных микобактерий // Актуальные вопросы лабораторной диагностики туберкулеза в эксперименте и клинике. -1989.- с. 39-44.

25. Макаревич Н.М. Атипичные микобактерии: методы идентификации, источники выделения, значение в клинике // Дис. . док.мед.наук. М.,1973.

26. Макаревич Н.М., Рудой Н.М., Лотоцкая Р.А. и др. Диагностика заболеваний легких, вызванных нетуберкулезными микобактериями // 10-й Всесоэзн. съезд фтизиатров: тез. докл. Киев. - 1986. - с.85.

27. Макарова М.В. Нетуберкулезные микобактерии (обзор литературы) // Научн. труды к 80-летию ведущего противотуберкулезного учр. г.Москвы, 10-летию МНПЦБТ / Под ред. В.И.Литвинова. -М.Медицина и жизнь, 2007. С. 233-246.

28. Меньшиков В.В. Анализ по месту лечения. М.: Юнимед-Пресс, 2003. - 160 с.

29. Мирамистин: применение в хирургии, травматологии и комбустиологии: Сб. трудов / Под ред. Ю.С.Кривошеина. М.: ООО "Типогр. "Мастер печати", 2006. - 106 с.

30. Мирамистин: Сб. трудов / Под ред. Ю.С.Кривошеина. М.: ООО "Мед. Информ. Агенство", 2004. - 156 с.

31. Михайлова Ю.В., Скачкова Е.И., Матинян Н.С. и др. Национальная стратегия борьбы с туберкулезом в России // Пробл. соц. гигиены,здравоохр. и истории медицины. 2009. - №4. - с.33-35.

32. Мишин В.Ю. Туберкулез у ВИЧ-инфицированных больных Электронный ресурс. // Consilium Medicum, том 10. 2008. - №10 -Доступ: http://tbpolicy.ru/publications/7icH79, свободный.

33. Мороз A.M. Лабораторная диагностика туберкулеза: реальность и перспективы // Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. Научные труды и материалы конференции, посвященный памяти М.М.Авербаха (к 75-летию со дня рождения). М., 2000. - 229с.

34. Морозова О.А. Экспериментальное обоснование экспресс метода лазерной флюоресцентной диагностики заболеваний микробной природы: автореф. Дис. . канд. мед. наук. М., 2001. - 25 с.

35. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. -М.: Мир. 1984. -с.88-101.

36. Научные труды (к 80-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г.Москвы, 10-летию МНПЦБТ). Сб. трудов / Под ред. В.И.Литвинова. М.: Изд. "Медицина и жизнь", 2007. - 248с.

37. Оттен Т.Ф. Микобактериоз легких: клинико-бактериологические критерии диагностики // БЦЖ. 1999. - №5. - с.32-35.

38. Оттен Т.Ф. Особенности бактериологической диагностики и этиотропной терапии микобактериоза легких // Автореф.дис. . д-ра мед. наук. СПб. - 1994. - 41с.

39. Оттен Т.Ф. Характеристика нетуберкулезных микобактерий -потенциальных возбудителей заболеваний человека // Пробл.туб. -1994. №3. - с.56-59.

40. Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. СПб.: Медицинская пресса, 2005. - 224 с.

41. Оттен Т.Ф., Макроусов И.В., Нарвская О.В. и др. Возможности и перспективы бактериологической диагностики микобактериоза // Пробл.туб. и болезней легких. 2004. - №5. - с. 17-19.

42. Патрушева К.И., Маслаускене Т.Г. Летальность больных с ВИЧ/СПИД ассоциированным туберкулезом // Туберкулез в России. Год 2007: материалы VIII Российского съезда фтизиатров. М.: ООО "Идея", 2007.-с.382.

43. Пашков Е.П. Лазерно-флюоресцентный метод экспресс-индикации микроорганизмов при гнойно-воспалительных заболеваниях, дисбактериозах и другой патологии микробной этиологии: автореф. дис. в виде науч. докл. . д-ра мед. наук. М., 2002. - 84с.

44. Перельман М.И. Туберкулез сегодня. Материалы VII Российского съезда фтизиатров. М.: Изд.Бином. - 2003. - 352с.

45. Порфирины: структура, свойства, синтез / Под ред. Н.С.Ениколопяна. М.: Наука. - 1985. - 333с.

46. Приезжев А.П., Тучин В.В. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.:Наука. - 1989.

47. Приказ МЗ РФ от 21 марта 2003 г №109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ" // Пробл. туб. 2004. -№4.-С. 31-61.

48. Развитие мультирезистентных форм туберкулеза и влияние ВИЧ-инфекции на ситуацию по туберкулезу Электронный ресурс.: Ресурсный Центр по изучению политики в сфере туберкулеза. -Доступ: http://tbpolicy.ru/topics/?id=16&page=, свободный

49. Синяк М.Ю. Автоматизация микробиологических исследований // Лабораторная медицина. — 2003. №6. — с.62-70.

50. Скотникова О.И., Носова Е.А., Галкина К.Ю. и др. Современные технологии определения вида микобактерий и чувствительности

51. M.tuberculosis к лекарственным препаратам // Туберкулез в России, Год 2007: материалы VIII Российского съезда фтизиатров. М.: ООО "Идея", 2007. - с.127-128.

52. Туберкулез в Российской Федерации 2007г. Аналитический обзор основных статистических показателей по туберкулезу, используемых в РФ / Под ред. М.И.Перельмана, Ю.В.Михайловой. -М., 2008.

53. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ. / Под ред. Барри Р.Блума. М.: Медицина, 2002. - 696 с.

54. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. - 1998. - 350с.

55. Фтизиатрия: национальное руководство / Под ред. М.И.Перельмана. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 512 с. - (Серия "Национальные руководства").

56. Цыбикова Э.Б. Эпидемиологические индикаторы туберкулеза // Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза (Научные труды Всероссийской научно-практ. конф. / Под ред.

57. Ю.Н.Левашева. СПб., 2006. - с. 321-323.

58. Шилова М.В. Туберкулез в России в 2007 году: монография. М., 2008. - 152с.

59. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. -М.: Мир. 1965. -483с.

60. Adle-Biassette H., Huerre M., Breton G. et al. Nontuberculous mycobacterial diseases // Ann. Pathol. 2003. - v.23. - p.216-235.

61. Alexandrov M.T., Kuzmin G.P., Gaponenko O.G. et al. Laser fluorescence spectroscopy and factor analysis in diagnostics of microbial diseases // Laser physics. 2007. - v.17. - №3. - p.290-295.

62. Arend S.M., van Soolingen D., Ottenhoff Т.Н. Diagnosis and treatment of lung infection with nontuberculous mycobacteria//Curr. Opin. Pulm. Med. 2009. - v.15. - p.201-208.

63. Bang D., Herlin Т., Stegger M. et al. Mycobacterium arosiense sp. nov.,a slowly growing, scotochromogenic species causing osteomyelitis in an immunocompromised child // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - v.58. - p.2398-2402.

64. Barclay R., Ewing D.E., Ratledge C. Isolaton , identification and structural analysis of the mycobactins of Mycobacterium avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, and M. paratuberculosis // J. Bacteriol. -1985.-v.164. p.896-905.

65. Barclay R., Ratledge C. Iron-binding compounds of Mycobacterium avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, and mycobactin-dependent M. paratuberculosis and M. avium // J. Bacteriol. 1983. - v. 153. -p.l 138-1146.

66. Barclay R., Ratledge C. Mycobactins and exochelins of Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum and other related strains // J. Gen. Microbiol. 1988. - v.134. - p.771-776.

67. Barclay R., Wheeler P.R. Metabolism of mycobacteria in tissues // In C.Ratledge, J. Stanford, and J. M. Grande (ed.) / The Biology of the Mycobacteria. Academic Press, London. - 1989. - v.3. - p.37-196.

68. Bonard D., Messou E., Seyler C. et al. High incidence of atypical mycobacteriosis in African HIV-infected adults with low CD4 cell counts: a 6-year cohort study in cote d'lvoire // AIDS.-2004.-v. 18.-p.1961-1964.

69. Butler W., Guthertz L. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of Mycobacterium spesies//Clin.Microbiol.Rev.-2001.-v.l4.-p.704-726

70. Cattior V. Molecular identification of mycobacteria and detection ofantibiotic resistance//Ann. Biol. Clin. (Paris). 2004. - v.62. - p.405-413.

71. Cloud J., Neal H., Rosenberry R. et al.Identification of mycobacterium ssp. by using a commercial 16S ribosomal DNA sequencing kit and additional sequencing libraries//J.Clin. Microbiol.-2002.-v.40.-p.400-406

72. Cloud J.L., Meyer J.J., Pounder J.I. et al. Mycobacterium arupense sp. nov., a non-chromogenic bacterium isolated from clinical specimens // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - v.56. - p.1413-1418.

73. Correa A.G., Starke J.R. Nontuberculous mycobacterial disease in children//Semin. Respir. Infect. 1996. - v.l 1. - p.262-271.

74. Corti M., Palmero D. Mycobacterium avium complex infection in HIV/AIDS patients // Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2008. - v.6. -p.351-63.

75. Da vidson P.T. The diagnosis and and managent of disease caused by M.avium complex, M.kansasii and other mycobacteria // Clin. Chest Med. 1989.-v.l0,№3.-p.431-443.

76. Dandapat P., Verma R., Venkatesan K. et al. Rapid detection of Mycobacterium bovis on its lipit profile by thin-layer chromatography//Vet.Mikrobiol.-l 999.-v.65.-p. 145-151.

77. Dobiuk-Gad R., Dyachenko P., Ziv M. et al. Nontuberculous mycobacterial infections of the skin: A retrospective study of 25 cases//J. Am. Acad. Dermatol. 2007. - v.57. - p.413-420.

78. Dominguez J., Blanco S., Lacoma A. et al. Utility of molecular biology in the microbiological diagnosis of mycobacterial infections // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2008. - v.26. - p.33-41.

79. Dorronsoro I., Torroba L. Microbiology of tuberculosis//An. Sist. Sanit. Navar. 2007. - v.30. - p.67-85.

80. El Amin N., Hanson H., Petterson B. et al. Idenfication of nontuberculous mycobacteria: 16S rRNA gene sequence analysis vs. conventional methods // Scand. J. Infect. Dis.-2000.-v.32.-p.47-50

81. Etemadi A., Convit J., Mycolic acids from "noncultivable" mycobacteria//Infect.Immunity.-l 974.-V. 10.-p.236-239

82. Euzeby J.P. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature -Genus Mycobacterium Электронный ресурс. 2009 Доступ:Ьйр://^^т.Ьас1епо.с1с1.&/т/тусоЬас1егшт.Мт1, свободный.

83. Field S.K., Cowie R.L. Lung disease due to the more common nontuberculous mycobacteria//Chest. 2006. - v.129. - p.1653-1672.

84. Floyd M., Silcox V., Jones W. et al. Separation of Mycobacterium bovis BCG from Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by using high-performance liquid chromatography of mycolic acids//J.Clin.Microbiol.l992.-v.30.-p. 1327-1330.

85. Fujita J., Hibiya K., Haranaga S. et al. Overview of respiratory infection caused by nontuberculous mycobacteria/ZKekkaku. 2007. - v.82. -p.721-727.

86. Glassroth J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria//Chest. 2008. - 133(1). - p.243-251.

87. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing Электронный ресурс. WHO report. Geneva, WHO. - 2009. -Доступ: http://www.who.int/tb/publications/en/.

88. Griffith D.E., Aksamit Т., Brown-Elliott B.A. et al. An official ATS/IDSA statement: Diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases/Mm. J. Respir. Crit. Care Med. -2007.-v.175. -p.367-416.

89. Guerrant G., Lambert M., Moss C.Gas-chromatographic analysis of mycolic acidcleavage products in mycobacteria// J.Clin. Mikrobiol.-1981.-v.l3-p.899-907

90. Hall R.M., Ratledge C. Mycobactins as chemotaxonomic characters for some rapidly growing mycobacteria // J. Gen. Microbiol. 1984. - v. 130. - p.1883-1893.

91. Hawkins C., Cold W., Whimbey E. et al. M.avium complex infections in patient with acquired immunodeficiency syndrome // Ann. Intern. Med. -1986.-v.105.-p.184-188.

92. Heifets L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria // Semin.in Respir. Crin. Care Med. 2004. - v.25. - p.283-295.

93. Heifets L., Jenkins P. Speciation of mycobacteria in clinical laboratories // In: Gangadharam P.R. Jenkins P.A. Mycobacteria. Vol. I. Basic aspects. New York: Chapman a Hall (Inf.Thompson Publishing). 1998. -p.308-350.

94. Holland S.M. Nontuberculous mycobacteria//Am. J. Med. Sci. 2001. -v.32. - p.49-55.

95. Horsburg C.R. Epidemiology of disease caused by nontuberculous mycobacteria//Semin. Respir. Infect. 1996. - v.l 1. - p.244-251.

96. Horsburgh CR.Jr., Gettings J., Alexander L.N. et al. Disseminated Mycobacterium avium complex disease among patients infected with human immunodeficiency virus, 1985-2000 // Clin. Infect. Dis. 2001. -v.33. - p.1938-1943.

97. Huard R., de Oliveira Lazzarini L., Butler W. et al. PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions//.!.Clin. Mycrobiol.-2003.-v.41.-p.1637-1650

98. Jarzembowski J.A., Young M.B. Nontuberculous mycobacterial infections//Arch. Pathol. Lab. Med. 2008. - v.132. - p.1333-1341.

99. Johnson M.M., Waller E.A., Leventhal J.P. Nontuberculous mycobacterial pulmonary disease//Curr. Opin. Pulm. Med. 2008. - v. 14. - p.203-210.

100. Karakousis PC., Moore RD., Chaisson RE. Mycobacterium avium complex in patients with HIV infection in the era of highly active antiretroviral therapy // Lancet Infect Dis. 2004. - v.4. - p.557-565.

101. Katalinic-Jankovic V., Grle S.P., Obrovae M. et al. Infections due to nontuberculous mycobacteria//Lijec. Vjesn. 2007. - v. 129. - p.146-151.

102. Katoch V.M. Infections due to nontuberculous mycobacteria (NTM) // Indian J. Med. Res. 2004. - v. 120. - p.290-304.

103. Koh W-J., Kwon O.J., Lee K.S. Diagnosis and treatment of nontuberculous mycobacterial pulmonary diseases: a Korean perspective//.!. Korean Med. Sci. 2005. - v.20. - p.913-925.

104. Lakowicz J.R. Fluorescence Spectroscopy. Wiley. 1982.

105. Leite C., da Silva Rocha A., de Andrade Leite S. et 1. A comparison of mycolic acid analysis for nontuberculous mycobacteria identification by thin-layer chromatography and molecular methods// Microbiol. Immunol.-2005.-v.49.-p.571-578.

106. Liu Z., Cai X., Zhu P. et al.Study on species identification of mycobacteria by gas chromatography analysis of whole-cell fattyacid//Zhondghua Jie He He Hu Xi Za Zhi.-2005.-v.28.-p.403-406.

107. Lu D., Heeren В., Dunne M. Comparison of the Automated Mycobacteria Growth Indicator Tube System (ВАСТЕС 960/MGIT) With Lowenstein-Jensen Medium for Recovery of Mycobacteria from clinical specimens // Am.J.Clim.Pathol. 2002. - v. 118. - p.542-545.

108. Macham L. P., Ratledge C. A new group of water-soluble iron-binding compounds from mycobacteria: the exochelins // J.Gen. Microbiol. -1975. -v.89. p.379-382.

109. Macham L. P., Ratledge C., Nocton J.C. Extracellur iron acquisition by mycobactria: role of the exochelins and evidence against the participation of mobactin // Infect. Immun. 1975. - v. 12. - p. 1242-1251.

110. Macham L. P., Stephenson M.C., Ratledge C. Iron transport in Mycobacterium smegmatis: the isolation , purification and function of exochelin MS //J.Gen.Microbiol. 1977. - v.101 - p.41-49.

111. Mahaisavariya P., Chaiprasert A., Khemngern S. et al. Nontuberculous mycobacterial skin infections: clinical and bacteriological studies//J. Med. Assoc. Thai. 2003. - v.86. - p.52-60.

112. Marras Т., Daley C. Epidemiology of human pulmonary infection with nontuberculous mycobacteria//Clin. Chest Med.-2002.-v.23.-p.553-567

113. Martens H., Naes T. Multivariative Calibration. Wiley. 1998.

114. Masakazu A. Present situation of tuberculosis and atypical mycobacteriosis in Japan // Asian. Med.J.-1998.-v.41-p. 197-202

115. Matos E.D., Santana M.A., Santana M.C. et. al. Nontuberculosis mycobacteria at a multiresistant tuberculosis reference center in Bahia: clinical epidemiological aspects // Braz. J. of Infect. Dis. v.8. - 2004.

116. Murcia M.I., Tortoli E., Menendez M.C. et al. Mycobacterium colombiense sp. nov., a novel member of the Mycobacterium avium complex and description of MAC-X as a new ITS genetic variant // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - v.56. - p.2049-2054.

117. Natural history of disseminated M.avium complex infection in AIDS // J.1.fect. Dis. 1991. - v. 164. - p.994-998.

118. O'Brien D.P., Currie В J., Krause V.L. Nontuberculous mycobacterial disease in Northern Australia: a case series and review of the literature//Clin. Infect. Dis. 2000. - v.31. - p.958-967.

119. Parrish S.C., Myers J., Lazarus A. Nontuberculous mycobacterial pulmonary infections in non-HIV patients/ZPostgrad. Med. 2008. -v. 120. - p.78-86.

120. Patel J., Leonard D, Pan X. et.al. Sequence-based identification of Mycobacterium species using the MicroSeq 500 16S rDNA bacterial identification system // J Clin Microbiol. 2000. - V.38. - p.246-251.

121. Reed C., von Reyn CF., Chamblee S. et al. Environmental risk factors for infection with Mycobacterium avium complex // Am. J. Epidemiol. -2006. v.164. -p.32-40.

122. Schluger N.W. Tuberculosis and nontuberculous mycobacterial infections in older adults//Clin. Chest Med. 2007. - v.28(4). - p.773-781.

123. Shrestra N.K. Rapid diagnosis testing for mycobacterial infections//Future Microbiol. 2007. - v.2. - p.397-408.

124. Stephenson M. C., Ratlenge C. Specificity of exochelins for iron transport in three species of mycobacteria // J.Gen. Microbiol. 1980. -v.116. - p.521-523.

125. Stout J.E. Evaluation and management of patients with pulmonary nontuberculous mycobacterial infections/ZExpert Rev. Anti. Infect. Ther. 2006. - v.4. - p.981-993.

126. Supplement: American Thoracic Society Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculosis mycobacteria // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1997. - v.156. - N.2. - p.25.

127. Tomioka H. Bacteriology of mycobacteria: taxonomic and morphological characteristics//Nippon. Rinsho. 1998. - v.56. - p.3001-3007.

128. Wong D., Yip P., Cheung D. et al. Simple and rational approach to the identification of M.tuberculosis, MAC and other commonly isolated mycobacteria // J. Clin. Microbiol. 2001. - v.39. - p.3768-3771.

129. Woods G.L., Washington J.A. Mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis: review of microbiologic and clinical aspects // Rev. infect. Dis. 1987. - v.9. -p.275-294.