Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лазерно-флюоресцентный метод определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Зайцева, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Показания и принципы определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам.

1.2 Методы определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам.

1.3 Критика современных подходов к назначению противомикробных препаратов.

1.4 Метод лазерной флюоресцентной диагностики.

1.4.1 Лазерное излучение, как физическое явление.

1.4.2 Физика флюоресценции.

1.4.3 Химико-физическая природа флюоресценции микробов и методы ее регистрации.

1.4.4 Применение метода лазерной флюоресцентной диагностики в медицине и в частности в клинической микробиологии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Этапы выполнения работы.

2.2. Установка для проведения флюоресцентно-спектроскопических исследований.

2.3. Алгоритм проведения измерения на установке ЛЭСА-6.

2.4. Сравнительное исследование чувствительности бактерий к антибиотикам методом лазерной флюоресценции и стандартным методом пороговых концентраций.

2.5. Сравнительное исследование чувствительности грибов рода Candida к антимикотикам при помощи метода лазерной флюоресценции и метода серийных разведений.

2.6. Исследование чувствительности бактерий гнойного отделяемого раны к антибактериальным препаратам.

2.7. Статистическая обработка результатов исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. Обоснование применения метода лазерной флюоресценции для определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам.

3.1. Алгоритм проведения исследования чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам.

3.2. Сравнительное исследование чувствительности S.aureus к ампициллину, гентамицину методом лазерной флюоресценции и стандартным методом серийных разведений.

3.3. Результаты определения чувствительности P.aeruginosa к ампициллину, гентамицину методом лазерной флюоресценции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лазерно-флюоресцентный метод определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам"

Антибактериальные препараты являются наиболее часто используемыми препаратами для лечения инфекционных заболеваний человека и животных, занимают ведущее место по объему производства и потребления среди всех других групп лекарств [18]. Благодаря им стало возможно лечить те заболевания, которые ранее были смертельными (туберкулёз, менингит, скарлатина, пневмония).

Антимикробные препараты представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. Так, в России в настоящее время используется 30 различных групп антибиотиков, а число препаратов приближается к 200 [17].

Антибиотики - вещества, избирательно угнетающие жизнедеятельность микроорганизмов, т.е. они активны только в отношении микроорганизмов при сохранении жизнеспособности клеток макроорганизма и действуют не на все, а на определенные роды и виды микроорганизмов. Например, фузидиевая кислота обладает высокой активностью в отношении стафилококков, но не действует на пневмококки [61]. Все антибиотики, несмотря на различия химической структуры и механизма действия, объединяет ряд уникальных качеств.

Уникальность антибиотиков заключается в том, что, в отличие от большинства других лекарственных средств, их мишень-рецептор находится не в тканях человека, а в клетке микроорганизма. Но активность антибиотиков не является постоянной, а снижается со временем, что обусловлено формированием устойчивости микроорганизмов к ним (резистентности) [21,35].

В последние годы при проведении антибиотикотерапии возникли две значительные проблемы: возрастание частоты выделения антибиотикорезистентных штаммов и постоянное внедрение в медицинскую практику новых антибиотиков и их новых лекарственных форм. Антибиотикорезистентность коснулась всех видов микроорганизмов и является основной причиной снижения эффективности антибиотикотерапии. Устойчивость бактерий к антибиотикам является серьезным препятствием для успешного применения этих препаратов в терапевтических целях. Для эффективного лечения инфекционных заболеваний прежде всего необходимо точно установить возбудителя и определить его чувствительность к препарату.

Таким образом, несмотря на многие общие черты, объединяющие антибактериальные препараты, при их назначении следует учитывать особенности каждого лекарственного средства путем определения чувствительности микробов к антибактериальным препаратам.

С появлением в медицинской практике антибиотиков и последующим формированием устойчивых к ним микроорганизмов возникла необходимость оценки антибиотикочувствительности возбудителей как ориентира для выбора препарата. Определение чувствительности возбудителя заболевания к антимикробным препаратам, наряду с тщательной бактериологической диагностикой заболевания с выделением и идентификацией возбудителя, является главным условием для рациональной и целенаправленной терапии инфекции. Бактериологическое, серологическое подтверждение диагноза и определение антибиотикограммы микроорганизма - возбудителя заболевания - должны предшествовать началу лечения, так как необходимо выбрать наиболее эффективный препарат среди множества близких по спектру действия [61]. Наиболее значимо проведение определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в отношении группы микробов (стафилококки, кишечная палочка, клебсиелла, энтерококки, протей, синегнойная палочка, микобактерии и др.), среди которых выделяется большое число антибиотикоустойчивых штаммов. Их распространение сопровождается снижением эффективности антимикробной терапии [18,19].

В настоящее время широкое распространение в лабораторной практике получили ряд методов: метод серийных разведений в жидких и плотных средах, диффузионные методы, а также экспресс-методы и новые автоматизированные методы (например, Baxter MicroScan, AutoSCAN-4).

Существующие современные методы определения чувствительности не позволяют быстро и качественно проводить исследования на антибиотикочувствительность микроорганизмов в силу некоторых недостатков, основным из которых является их длительность (от поступления материала от больного для исследования до получения результатов проходит в среднем от 5 до 10 дней), что ие позволяет своевременно начать и проводить адекватную индивидуальную специфическую терапию [75], невозможность оценить роль многих не культивируемых микроорганизмов в этиологии заболевания [34,68,69,70], а так же тех, которые погибают на этапах доставки материала в лабораторию, трудоемкость и малая пропускная способность, громоздкость и/или дороговизна существующих экспресс методов. В связи с чем врачи часто отказываются от проведения бактериологического исследования или начинают лечение антибиотиками до получения результатов чувствительности микробов к ним, что часто приводит к неудовлетворительным результатам лечения и развитию антибиотикорезистентности [17].

В последнее время наблюдается рост числа больных с гнойно-воспалительными заболеваниями, которые осложняются вторичной инфекцикй или генерализацией процесса, что обусловлено возрастанием количества антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, усилением вирулентности условно-патогенной микрофлоры и снижением резистентности макроорганизма [115,144].

Тяжелые инфекционно- воспалительные заболевания, такие как сепсис, пневмония, перитонит, занимают важное место в структуре заболеваемости и смертноси. Так неадекватность эмпирической антибактериальной терапии послеоперационных перитонитов приводила к увеличению смертности до 45% по сравнению с 16% в случае правильного первично назначенного препарата [118]; прогноз вентилятор-ассоциированной пневмонии напрямую зависит от правильного выбора стартовой антибактериальной терапии: неадекватные лечебные назначения сопровождаются значительным увеличением показателей смертности [92,110,111]. Только ранняя и максимально эффективная терапия позволяет достичь более благоприятного исхода течения тяжелых инфекционных заболеваний [88].

Уже в 40-е годы значительно возросло количество возбудителей инфекционных заболеваний, устойчивых к антибиотикам, в связи с широким применением этих препаратов. Например, процент устойчивых к пенициллину штаммов стафилококков в 1943 г. равнялся 12%, в 1945 г. - 21,5%, в 1948 г. - 68%, а в 1952 г. уже - 75% [104]. В настоящее время процент устойчивых штаммов у этого микроорганизма составляет: к бензилпенициллину - 80-95%, к тетрациклину - 70-85%, к левомицетину - 30-55% [101]. В 1960 г. М.Н. Лебедева, С.Д. Воропаева отмечали значительное повышение устойчивости микобактерий к стрептомицину, дизентерийных бактерий к синтомицину и другим антибиотикам [46].

До середины 60-х годов прошлого века лечение пневмококковых инфекций с успехом осуществлялось пенициллином. Однако место препарата стало пересматриваться с момента сообщения в 1967 г. о случаях выделения устойчивых пневмококков. К началу 70-х годов пенициллиноустойчивые штаммы были выявлены в Германии и Польше, затем - в Южной Африке, Испании, Швейцарии, Великобритании, Японии и других странах [14]. В 90-х годах проблема приняла столь масштабный характер, что о ней заговорили как об угрозе национальной и экономической безопасности. Осложняет ситуацию тот факт, что наряду с ростом частоты выделения пенициллиноустойчивых штаммов был отмечен рост устойчивости к другим препаратам, составляющим основу антибактериальной терапии (АТ) -тетрациклины, макролиды, триметоприм/сульфаметоксазол, что осложняет выбор эмпирической АТ.

Для решения указанных проблем роста антибиотикорезистентости микробов, снижения эффективности лечения инфекционных заболеваний, коллективом авторов [3,7,8,10,11,12] разработан клинический оптический экспресс-метод лазерной флюоресцентной диагностики (ЛФД), позволяющий в экспресс режиме выявлять заболевания и процессы микробной природы на основе явления флюоресценции эндо- и экзогенных порфиринов бактерий.

Флюоресцентная диагностика по своей природе является чувствительным аналитическим методом индикации бактерий и измерения их концентрации. Способность различных микроорганизмов флюоресцировать с различной интенсивностью при воздействии на них лазерного излучения - в зависимости от особенностей и активности физиологических процессов - мы используем для оценки антибиотикочувствительности микроорганизмов.

В связи со всем выше сказанным разработка нового экспресс метода определения атбиотикочувствительности представляет большую практическую ценность и является актуальным вопросом для клинической микробиологии и для медицины в целом.

Цель и задачи планируемого исследования.

Целью исследования является экспериментально-теоретическое и клинико-бактериологическое обоснование возможности использования метода лазерной флюоресценции для ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

В соответствии с целью необходимо решить следующие задачи:

1. экспериментально обосновать применение флюоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам;

2. сравнительно изучить традиционные методы определения чувствительности и метод лазерной флюоресценции;

3. определить возможность и перспективы применения метода лазерной флюоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в медицине;

Научная новизна.

Впервые обоснован экспресс метод лазерной флюоресценции для ускоренного определения чувствительности микроорганизмов и их ассоциаций к антимикробным препаратам.

Впервые на основании выявленных закономерностей флюоресценции микроорганизмов разработаны критерии оценки подавления их роста антимикробными препаратами при помощи лазерной флюоресценции.

Практическая ценность работы.

Полученные результаты работы привели к разработке ускоренного способа определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам, что в свою очередь позволит проводить современные исследования для ранней диагностики и рациональной антибиотикотерапии патологических процессов микробной этиологии.

Использование разработанного метода в практическом здравоохранении позволит так же проводить микробиологический мониторинг устойчивости возбудителей в рамках системы эпидемиологического надзора и предупреждения распространения устойчивых форм микроорганизмов.

Положения выносимые на защиту:

1. На основании экспериментальных, микробиологических исследований обосновано применение метода лазерной флюоресценции для ускоренного определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам.

2. Метод лазерной флюоресцентной диагностики позволяет объективно проводить скрининг чувствительности различных бактерий и грибов рода Candida к антимикробным препаратам.

Апробация полученных результатов

Основные положения работы доложены на:

1. 4-ой международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке», 23-25 мая 2003 года;

2. научной конференции отделения профилактической медицины РАМН «Современные проблемы химиопрофилактики и химиотерапии инфекций», г. Смоленск, 30 января 2004 год;

3. 6-ой международной конференции «Экология человека и природа», Москва-Плес, 5-11 июля 2004 года;

4. VII международном научном конгрессе «Современный олимпийский спорт и спорт для всех». Москва, 2004;

5. 2-ом съезде общества биотехнологов России, Москва, 13-15 октября 2004г;

6. I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 26-28 октября 2004;

7. апробация диссертации состоялась на заседании научно-методической конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М. Сеченова 14 июня 2006г. (протокол № 29).

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Текст работы иллюстрирован 40 рисунками и 34 таблицами. Публикации:

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зайцева, Татьяна Александровна

168 Выводы

1. Впервые экспериментально обоснована, бактериологически и клинически подтверждена возможность использования метода лазерной флюоресценции для экспресс оценки чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

2. Объективным критерием подавления микроорганизмов антибиотиками является изменение интегральной мощности флюоресценции относительно бактериального контроля до показателей контроля антибиотика, что и является основой определения антибиотикочувствительности микроорганизмов при помощи метода лазерной флюоресценции.

3. Метод лазерной флюоресценции позволяет ускорить процесс определения чувствительности грамположительных, грамотрицательных факультативно-анаэробных и аэробных бактерий к антимикробным препаратам (2 часа после посева).

4. Показано, что метод лазерной флюоресцентной диагностики позволяет ускоренно определять чувствительность грибов рода Candida к антимикотикам через 2 часа после посева.

5. Возможно ускоренное определение антибиотикочувствительности ассоциаций микроорганизмов, находящихся непосредственно в исследуемом материале (гнойное отделяемое и др.).

6. Включение разработанной методики определения чувствительности ассоциаций микроорганизмов в схему лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области позволило сократить сроки лечения в среднем на 3-5 дней.

7. Метод лазерной флюоресценции высоко информативен, прост и удобен в применении, что позволит считать его доступным и перспективным в клинической микробиологической лаборатории и непосредственно в условиях клиники. Метод позволит проводить анализ по месту лечения.