Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение лазерной флюоресценции для оценки гигиенического состояния полости рта

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Применение лазерной флюоресценции для оценки гигиенического состояния полости рта"

Р Г Б ОД 1 5 ЯН В 200Д

На правах рукописи

Филатов Максим Владимирович

ПРИМЕНЕНИЕ ЛАЗЕРНОЙ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГИГИЕНИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПОЛОСТИ

РТА

03.00.07- микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских

наук

Москва-2003 г.

Работа выполнена в Московской Медицинской академии им И.М. Сеченова Научные руководители

доктор медицинских наук Евгений Петрович Пашков

доктор медицинских наук профессор Михаил Тимофеевич Александров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Светлана Дмитриевна. Воропаева доктор медицинских наук профессор Павел Вячеславович Калуцкий

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Защита состоится «а .» 200^года в_часов на заседании

диссертационного совета Д.208.040.08 при Московской Медицинской академии им И.М. Сеченова (119992. Москва, Б.Пироговскаяул., д. 2 строение 3)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Московской Медицинской академии им И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект д.49)

Автореферат разослан /У 20(К' .

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук

Андрей Юрьевич Миронов

1.Общая характеристика работы Актуальность темы.

Лечение стоматологических заболеваний микробной природы обходится в 20 pas дороже их профилактики (Кузьмина Е.В. с соавт., М., 1997). Такие заболевания, как кариес, пародонтит охватывают, практически 100% населения и к 60-65 годам это приводит к тому, что у пациентов к этому времени остается не более 5-6 здоровых зубов. По данным R.J. Geuco 1990, начало и развитие заболеваний микробной природы в области рта характеризуется колонизацией бактерий, их инвазией с последующим разрушением тканей как самими бактериями, так и их токсинами. При благоприятном исходе происходит репаративная регенерация тканей.

Применение существующих методов диагностики патогенетических факторов, определяющих состояние гигиены полости рта, и связанное с ним состояние здоровья человека, следует признать не достаточно объективным. Например, гигиенический индекс Федорова-Володкиной (1971) оценивает состояние гигиены полости рта по степени окрашивания фуксином или эритрозином зубного налета определенных групп зубов (Кузьмина Е.В. с соавт., 1997). Недостаток метода заключается, во-первых, в использовании красителей, что является фактором риска для пациентов с аллергическим статусом. Во-вторых, метод не позволяет учитывать основной этиологический фактор нарушения гигиены полости рта - наличие и активность бактерий, и прокрашивает в основном остатки пищи, погибшие бактерии (т.к. эти красители не являются витальными) и другие компоненты (слущившийся эпителий, детрит). Все это позволяет отнести указанный метод к субъективным качественным методам оценки гигиенического состояния полости рта.

Другой распространенный критерий - упрощенный индекс гигиены полости рта (J.C. Green, J.R. Vermillion. 1964) - основан на выявлении и визуальной субъективной оценке наличия зубного налета и зубного камня на вестибулярной и язычной поверхности 6-ти зубов верхней и нижней челюсти (Кузьмина Е.В., 1997). Индекс не учитывает как указанные выше

показатели, так и состояние ротовой жидкости (слюны), омывающей все биотопы полости рта и ее микробную обсемененность. В связи с этим предложенный индекс гигиены также является субъективным.

Дополнительно для оценки факторов, влияющих на состояние гигиены полости рта, используют эстетический стоматологический индекс (N.C. Cors с соавт., 1986): он определяет положение зубов и состояние прикуса в сагиттальном, трансверзальном и вертикальном направлении при визуальном контроле (Кузьмина Е.В. с соавг., 1997). Указанные показатели могут служить только дополнительным тестом при оценке эпидемиологического статуса населения и не являются количественными и объективными по указанным выше причинам.

Таким образом, современные методы оценки состояния гигиены полости рта и оценка эффективности средств гигиены полости рта основаны на косвенных данных, в основном субъективных критериях. Ни один из указанных современных методов не учитывает наличие, концентрацию и активность одного из важнейших факторов, этиологически определяющего состояние гигиены полости рта -микрофлору.

На сегодняшний день предложены разнообразные методы оценки гигиенического состояния полости рта. Основными из них являются:

Метод газожидкостной хроматографии - этот метод позволяет определить в биосубстрате летучие вещества - метаболиты микрофлоры. Несмотря на достаточную оперативность этот метод не получил широкого распространения из-за отсутствия однозначного подхода в оценке результатов исследований, а также из-за необходимости использования специального очень дорогого хроматографического оборудования. Кроме того для проведения исследований необходимо приготовление исследуемых образцов специальными химическими методами (Митрохин С. Д.,Ардатский М. Д, Никушкин Е, В., 1997г.)

Хромато-масс-спектралъный анализ. Этот метод диагностики инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов в организме человека основан на анализе состава специфических микробных веществ -маркеров класса жирных кислот и стеаринов, а также других липидных компонентов клетки - метаболитов жизнедеятельности микроорганизмов

на основе использования хромато-масс-спектрометрического метода исследования биологических жидкостей. Метод экспрессен, универсален в отношении разных групп микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов. Однако, для его реализации необходима предварительная специальная химическая обработка образцов исследуемого материала. Чувствительность метода по ряду измерений составляет 10 4 - 10 5 клеток в пробе, что уступает микробиологическому методу. Следует отметить высокую стоимость оборудования. (Осипов Г.А., Демина А. М. ,1996). Указанные методы не выявляют некультивируемые виды бактерий.

Наибольшее распространение имеет бактериологический метод. Этот метод представляет собой довольно громоздкие, трудоемкие, длительные по времени и дорогостоящие лабораторные исследования, не позволяющие проводить обследование большого контингента населения, а также объективный контроль лечения, в силу перечисленных недостатков. При этой методике количество определяемых микроорганизмов зависит от поставленной задачи, материальной возможности лаборатории, квалификации персонала. Особую сложность представляет культивирование облигатных анаэробов, до настоящего времени многие из которых не поддаются культивированию in vitro, а для других требуются значительные затраты времени и средств (Эпштейн-Литвин Р.В., Вилыпанская Ф.Л., 1969).

В целом существующие классические бактериологические методы значительно длительны (7—10 дней), хотя и более информативны и для целей оценки гигиены полости рта практически не применяются. Для клинико-микробиологической оценки гигиенического состояния полости рта их применяют в основном в научных целях.

В связи с этим наше внимание привлек экспресс -метод лазерной флюресцентной диагностики заболеваний и процессов микробной природы (Александров М.Т., Воробьев A.A., Пашков Е.П., и соавт., 1999). Применение указанной разработки в клинической микробиологии представляет несомненный интерес и, по данным указанных авторов, является не только актуальным, но и имеет выраженную клинико-микробиологическую направленность. Появление указанного метода открывает большие перспективы в плане экспресс - диагностики

состояния гигиены полости рта по основному этиологическому фактору -ее микрофлоре. Однако данных о применении метода для целей оценки состояния гигиены полости рта и оценки эффективности средств гигиены не выявлено.

В связи с этим перед нами было поставлено следующее: Цель работы:

Разработка объективного экспресс-метода оценки гигиенического состояния полости рта на основе использования явления флюоресценции.

Задачи исследования.

1) Провести экспериментально-теоретическое и клинико-микробиологическое обоснование применения метода флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния полости рта.

2) Методом флюоресцентной диагностики выявить клинико-бактериологические параллели состояния гигиены полости рта и на этой основе разработать информативные количественные критерии её оценки.

3) В клинических условиях определить эффективность применение флюоресцентного экспресс-метода оценки гигиенического состояния зубов, съемных и несъемных протезных конструкций, слюны.

4) Разработать объективный индекс флюоресценции полости рта в зависимости от гигиенического состояния.

5) Выявить перспективы применения метода флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния полости рта.

Научная новизна исследования.

1. Анализ литературы показал, что проблема нарушений микробиоценозов полости рта является актуальной во всем мире, как и разработка экспресс - методов диагностики состояния гигиены полости рта и оценки эффективности средств гигиены. Для оценки микрофлоры полости рта и оценки её гигиенического состояния, непосредственно в момент обследования больного, может быть использован метод лазерной флюоресцентной спектроскопии. Разработанная методика по интегральным показателям флюоресценции (спектральные характеристики, мощность) с минимальными материальными и

временными затратами позволит проводить индикацию микроорганизмов полости рта (на зубах, ротовой жидкости, съемных и несъемных протезных конструкциях), а также контроль за проведением всего комплекса лечебно-профилактических, гигиенических мероприятий.

2. Проведено экспериментально-теоретическое обоснование и клинико-бактериологическая разработка применения метода лазерной флюоресцентной диагностики для ббъективной экспресс оценки гигиенического состояния тканей и объектов полости рта (зубы, съемные и не съемные протезные конструкции, слюна).

3. Впервые разработан объективный флюоресцентный индекс гигиенического состояния полости рта, интегрально характеризующий ее гигиенический статус, эффективность проводимой профилактики и средств гигиены.

Практическая ценность работы:

1. Полученные на основании методов клинической микробиологии и флюоресцентной диагностики результаты позволили объективно выявить клиническую эффективность и информативность обратно отраженного зондирующего излучения гелий-неонового лазера с \=0,63 мкм и наведенной им флюоресценции для экспресс-диагностики гигиенического состояния тканей (зубы), биологических жидкостей (слюна) и объектов полости рта (съемные и несъемные протезные конструкции).

2. Проведенное исследование показало, что предлагаемый экспресс-метод флюоресцентной диагностики позволяет в реальном времени на принципах обратной связи, строго индивидуально, осуществлять оценку гигиенического состояния тканей полости рта, своевременно осуществлять и корректировать выбор средств гигиены, объективно проводить мониторинг их эффективности.

3. Объективным критерием гигиенической оценки состояния тканей и объектов полости рта, оценки адекватности применения средств гигиены и их профилактической эффективности является увеличение показателей обратно отраженного лазерного излучения (до максимальных), и уменьшение нормированного показателя мощности флюоресценции (до

минимаяьного), определяемого по интегральному показателю флюоресценции твердых тканей зуба, протезных конструкций и слюны.

Положения выносимые на защиту:

1. На основе экспериментально-теоретических исследований, микробиологических и клинических наблюдений обоснован экспресс-метод лазерной флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния полости рта.

2. Предложен бактериологически и клинически обоснованный алгоритм флюоресцентной экспресс-диагностики гигиенического состояния полости рта по регистрации и анализу спектрально-энергетических параметров флюоресценции микробных ассоциаций полости рта (зубы, слюна, съемные и несъемные нротезные конструкции) у взрослых и детей

Апробация работы

Основные положения научной работы доложены:

1. На заседаниях Академии медико-технических наук РФ в 2000, 2001, 2003г.

2. Конференции «Новые технологии практическому здравоохранению», 1999 год.

3. Конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской технологии», 2000 год.

Апробация работы проведена на совместном заседании кафедр микробиологии с вирусологией и иммунологией и хирургической стоматологии Московской Медицинской академии им И.М. Сеченова

Публикации

По теме диссертации опубликованы - 6 научных работ, подана заявка на изобретение и получена приоритетная справка.

Объем и структура работы Диссертация построена по традиционному плану и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Список литературы включает 126 наименований источников, из них 48 зарубежных авторов. Диссертация

изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 56 рисунками

Содержание работы Материал и методы исследования.

Клинико-бактериологическое исследование выполнено на базе кафедры микробиологии (заведующий кафедрой академик РАМН, профессор, д.м.н. A.A. Воробьев), кафедры лазерных и информационных сверхвысокочастотных систем (СВЧ) Московского государственного института электроники и математики (профессор, д.м.н. М.Т. Александров), бактериологической лаборатории ММА им И.М.Сеченова (заведующий лаборатории к.б.и. А.Н. Круглов)

Разработку экспресс методики гигиенической оценки полости рта на основе явления флюоресценции бактерий осуществляли в несколько этапов (табл.1)

Таблица 1 Этапы выполнения работ.

№ п/п Объем исследования Количество образцов Методы исследования

1 этап Обоснование методики флюоресцентной индикации бактерий (аэробных и анаэробных) 4 штамма микроорганизмов, 46 спектров поглощения и пропускания бактерий Бактериологический, спектральнооптическ- ий

2 этап Отработка методики флюоресцентной индикации бактерий (аэробных и анаэробных) и их ассоциаций 4 штамма микроорганизмов и 52 спектрограммы Бактериологический, спектральнооптическ- ий

3 этап Обоснование информативности обратноотраженного и флюоресцирующего излучений (на объектах полости рта) для оценки гигиенического состояния полости рта. Оценка степени достоверности результатов исследования и ошибки измерения. Зубы различных функциональных групп, протезные конструкции, слепочные массы. Клинический, бактериологический, спекгрофотометри-ческий, статистический.

4 этап Клинико-бактериологическая, флюоресцентно-спектроскопическая разработка интегрального экспресс метода оценки гигиенического состояния полости рта и его клиническая апробация Пациенты с различным гигиеническим состоянием полости рта, без и с протезными конструкциями: 140 пациентов, 420 зубов, 48 зубных протезных конструкций (съемных и несъемных), 123 тест образцов слюны у пациентов до и после чистки зубов Клинический, бактериологический, спектрофотометричес кий,статистический.

В ходе работы были изучены 14 видов облигатно-анаэробных, факультативно-анаэробных и аэробных микроорганизмов (таб.№2). Были

использованы, как тест-культуры референтных штаммов (S. aureus

209Р, Ps. aeruginosa 27/99), полученные из музея ГИСК им. Л.А.Тарасевича, так и штаммы, выделенные из клинического материала. Кроме этого, использовались штаммы B.bifidum из коммерческого препарата «Бифидумбактерин форте» «Партнер», L.plantarura 8R-A3 из препарата «Лактобактерин сухой» НПО «Биомед» г. Пермь, B.cereus IP 5832 (АТСС 14893) из препарата «Бактисубтил» Marion Merrel, Франция. Видовую идентификацию штаммов, выделенных из клинического материала, проводили с помощью системы «Walkaway-40», а также общепринятыми методами, используя номенклатуру Берги и сведения, обобщенные в руководствах по клинической микробиологии.

Питательной средой для накопления микробной массы служили: для облигатных анаэробов - агар Шедлера (Hi Media, Индия) с 5% крови, для факультативных анаэробов и аэробов- Mueller-Hinton (Hi Media) агар или- Mueller-Hinton агар с 5% крови. Культивирование анаэробов осуществляли в анаэробных условиях при 37° в анаэростате (anaerobic system DIFCO). Для приготовления микробной взвеси использовались культуры в стационарной фазе их роста. Смытую физиологическим раствором с плотной питательной среды взвесь микроорганизмов доводили до концентрации 1,0*10" КОЕ/мл под контролем турбидометрии. Концентрация микроорганизмов контролировалась посевом серийных разведений. Готовые взвеси в объеме 1мл вносили в стандартные стеклянные пробирки, после чего проводили измерения флюоресценции исследуемых микроорганизмов. Характеристики исследованных штаммов микроорганизмов представлены в табл.2

Таблица №2 Характеристика исследованных штаммов микроорганизмов.

Тип дыхания Название вида Окраска no Граму Морфоло гия Спороо бразова ние Среда культивир.

аэроб Pseudomonas aeruginosa Грам- Палочки - Н-М

аэроб Neisseria sicca Грам- Кокки - Н-М

Об. ан. Propionibacterium acnes Грам+ Палочки - Шедлер

Об. ан. Bacterium bifidum Грам+ Палочки - Шедлер

Об. ан. Prevotella oralis Грам- Палочки - Шедлер

Об. ан. Bacteroides vulgatus Грам- Палочки - Шедлер

Об. ан. Veillonella parvula Грам- Кокки - Шедлер

Ф. ан. Candida albicans Дрожжи - Н-М

Ф. ан. Escherihia coli Грам- Палочки - Н-М

Ф. ан. Lactobacillus plantarum Грам+ Палочки - Н-М

Ф. ан. Staphylococcus aureus Грам+ Кокки - Н-М

Ф. ан. Staphylococcus epidermidis Грам+ Кокки - Н-М

Ф. ан. Streptococcus mitis Грам+ Кокки - Н-М+кроаь

Ф. ан. Streptococcus viridans grp- Грам+ Кокет - Н-М

ф. ан. - факультативный анаэроб + - образуют споры - не образуют спор об. ан. - облигатный анаэроб Н-М - агар Мюллер-Хинтон

аэроб - облигатный аэроб

Исследование проводились с целью освоения и отработки методики, как на тест-образцах, так и на штаммах, выделенных из полости рта пациентов. Были использованы штаммы, представленные в таблице 2. Флюоресценцию монокультур и их взвесей, приготовленных из опытных штаммов в различных концентрациях (105 КОЕ/мл -109 КОЕ/мл), измеряли по алгоритму и методике, изложенной ниже.

С целью клинико-микробиологической проработки

спектрофлюоресцентной методики экспресс-диагностики гигиенического состояния полости рта, её клинической апробации и подтверждения лабораторных результатов клинический материал (зубной налет, слюна) исследовали в соответствии с действующими приказами и руководствами по микробиологической диагностике объектов исследования.

Для разработки модернизированной методики флюоресцентной диагностики биологических объектов предварительные

экспериментальные исследования проводили на лазерной компьютеризированной установке ЛЭСА-б(рис.1) производства Биоспек (Россия). ЛЭСА-6 предназначена для лечебно-диагностических целей (протокол №2 от 06.04.2000г.). Нами предложено использование клинической диагностической установки для нового применения -экспресс оценка гигиенического состояния тканей и биологических жидкостей полости рта и эффективности средств гигиены.

Рис.1. Блок-схема установки ЛЭСА-6.

Принцип работы установки следующий: излучение лазера с длиной волны 633 нм фокусируется на входном торце гибкого волоконно-оптического катетера (ВОК), Далее по ВОК подводится к исследуемому объекту. Флюоресценция, индуцированная лазерным излучением, вместе с частью рассеянного назад света принимается регистрирующим торцом ВОК и подается на диспергирующий блок, представленный системой оптических фильтров и полихроматором с решеткой 300 штрих/мм. Диспергированный свет направляется на диодную линейку (1024 канала), регистрируется и проходит предварительную обработку. В качестве регистрирующей части установки используется многоканальный оптический спектроанализатор, который преобразует излучение в электрический сигнал, поступающий в компьютер IBM PC, где при помощи специальной программы обрабатывается и отображается на мониторе в виде характерной кривой (рис.2), а также может быть занесён в память компьютера.

мониторе компьютера.

Первый пик 81(Х.-633 нм) соответствует спектру обратно рассеянного лазерного излучения, второй пик Б2 соответствует спектру флюоресценции (диапазон регистрации мощности флюоресценции 635-850нм).

Надежность и правильность измерений определяется двумя основными условиями: качеством конструкции прибора и качеством метрологического обслуживания при проведении измерений. Первое условие определяет стабильность работы самого прибора и зависит от его основных параметров. Второе условие включает в себя обеспечение сохранности показаний прибора, единства и точности измерений, что составляет основную метрологическую задачу эксперимента. В связи с этим перед измерениями прибор необходимо

стандартизировать(калибровать).

Перед проведением каждой серии измерений осуществляли тестирование всех блоков системы и необходимую юстировку при помощи оптических адаптеров с целью обеспечения соответствия работы системы оптимальному режиму настройки. Измерения проводили в затемненном помещении при комнатной температуре и нормальной влажности, так как на результаты исследований существенное влияние оказывала внешняя засветка. Кроме этого спектрофотометрические измерения проводили при постоянной мощности лазерного излучения на торце световода (10 мВт).

Калибровка экспериментальной установки проводилась следующим образом:

перед началом измерений с целью избавления от собственных шумов спектрометра, снимался спектр отраженного сигнала от абсолютно черного тела, затем в последующих измерениях он вычитался. Соотношение сигнал-шум составляло в среднем 0,1% от максимальной величины сигнала. Для избавления от влияния колебаний лазера, с целью получения сравнимых результатов, перед началом каждой серия экспериментов снимался спектр отраженного сигнала от не флюоресцирующего эталона (фторопласт), в котором присутствовала только составляющая на длине волны зондирующего излучения, при

последующих измерениях в текущей серии экспериментов все исследуемые спектры нормировались на эту величину.

Измерения производятся на установке ЛЭСА-6 следующим образом: измерение базовой линии производится на не флюоресцирующем эталоне, абсолютно черном объекте для того, чтобы избавиться ог темнового тока с ФПУ; затем производится измерение эталона, в данном случае за эталон (объект сравнения) принимается объект с нулевым содержанием фотосенса. Измерения эталона производятся для того, чтобы в последующих измерениях избавиться от влияния мощности лазера, т.к. эталон имеет постоянный коэффициент отражения; далее производят измерения в исследуемых областях. Световод приставляется вплотную к исследуемой области, перпендикулярно ей и неподвижно, значения фиксируются через равные промежутки времени; результаты измерений обрабатываются в автоматическом режиме и отображается на экране дисплея ЛЭСА-б.

Данные исследований обрабатывали методом вариационной статистики с расчетом средней арифметической, ошибки средней арифметической, среднего квадратичного отклонения. Расчеты производили на персональном ЮМ- компьютере при помощи статистического пакета "Statistica", полученные результаты представлены в виде таблиц, графиков, рисунков.

Регистрацию собственной флюоресценции исследуемых объектов проводили при возбуждении их излучением 633 нм -красная часть cneKTpa(He-Ne лазер). Преимуществом красного света при возбуждении флюоресценции является его относительно высокая способность к проникновению вглубь исследуемого объекта, невысокое рассеяние в связи с реабсорбцией флюоресценции, отсутствие флюоресценции, исходящей от других источников, нежели порфирины бактериального и не бактериального происхождения. Для оценки флюоресценции исследуемых микроорганизмов регистрировали и рассчитывали следующие спектрально-энергетические характеристики: S2/S1 - нормированная мощность флюоресценции, Si -интенсивность обратноотраженного сигнала, S2 - мощность флюоресценции.

Результаты исследования и их обсуждение

В экспериментальном исследовании обоснован выбор длины волны зондирующего лазерного излучения на основе сравнительного изучения спектров поглощения, пропускания и флюоресценции бактерий и порфиринов. (рис.3.)

Подтверждены данные Воробьева A.A. (1999), Пашкова Е. П. (2002) и Морозовой O.A. (2001) о том, что нормированные показатели мощности флюоресценции (S2/S1) различных аэробных и анаэробных бактерий и их ассоциаций существенно различны (при одинаковой концентрации монокультур бактерий). В микробных ассоциациях мощность флюоресценции характеризуется средней арифметической ее составляющих. При этом изменение мощности флюоресценции линейно зависит от концентрации бактерий (рис. 4,5).

etc. 1шимь I «pÄvjta eieeeSfc к fsrsctö

'i : > м • i i i i i u.xj.< i i i i i i 11 t ' i

Рис. 3. График зависимости коэффициентов пропускания от длины волны зондирующего излучения для различных культур аэробных и анаэробных бактерий

ДмшыМ

Рис 4 Спектры бактерий и их смеси, мощность флюоресценции бактериальных ассоциаций соответствует среднему арифметическому исходных составляющих.

0 800 § 600-

1 400

й 200

к „

. 1,600-з 1,400-

I 1,200-

1,800

1,000

0 .• ... .............. . .....,

520 557 596 634 672 711 749 787 825

X нм

Рис 5. Линейная зависимость мощности флюоресценции от концентрации бактерий (В.ЫАс1ит)

На основе бактериологических данных и флюоресцентного анализа удалось показать, что для гигиенической оценки объектов полости рта (зубы, протезные конструкции) необходимо учитывать как показатели обратноотраженного (81), так и флюоресцентного (82/81, 82) излучений, которые по мере их гигиенической обработки изменяются разнонаправлено (рисб): - увеличивается, а 82/31 и Э2 - (мощность

флюоресценции)уменьшаются.

82

» Я,/8, ОМЧ 1 15,6 5-10' КОЕ4-.

I 14,3 5'10' КОЕ*

б'М'КСЕ*

5

4*10" КОЕ*

4'10*КОЕЛ-

9x1

Рис. 6. Показатели флюоресценции и бактериологические данные (ОМЧ) у различных пациентов до (1-4) и после (5-12) обработки зубов абразивной зубной пастой.

При этом длительность обработки определяется максимальной их разницей. Эти данные подтверждены примерами на удаленных по клиническим показателям различных функциональных групп зубов (резцы, клыки, премоляры и моляры) у взрослых и детей. Показана высокая достоверность и воспроизводимость результатов исследования. Ошибка метода для всех исследованных объектов полости рта не превышала 2-6%. Бактериологически (общее микробное число - ОМЧ-КОЕ/г) показано, что микробная обсемененность различных функциональных групп зубов до их гигиенической обработки (чистка щеткой) существенно различна, в то время как после таковой эти различия уменьшаются. Выявлено, что показатели ОМЧ до и после чистки изменяются на 2-4 порядка, в то время как показатели адекватной им мощности флюоресценции изменяются в 1,54 раза. Эти данные в последствии можно использовать для разработки градуировочной кривой по определению концентрации бактерий на объектах полости рта, а также для целей оценки эффективности средств и методов гигиенической обработки полости рта.

Следует отметить, что в монобактериальной бульонной культуре при измерении концентрации бактерий методом лазерной флюоресценции на установке ЛЭСА-6 и сравнении результатов с данными бактериологического исследования установлено, что чувствительность метода находится в пределах 106 - 105 КОЕ/г, в то время как при измерении на объектах полости рта (на той же установке) 103 КОЕ/г. Это, возможно, свидетельствует как о наличии некультивируемых видов, так и о возможном усилении сигнала флюоресценции зеркальной поверхностью тканей зубов (протеза). Этот факт требует дальнейшего изучения.

Полученные экспериментальные данные позволили нам провести клиническую апробацию метода, оценить его возможности и перспективы, а также разработать объективный количественный тест оценки гигиенического состояния полости рта.

В частности, при исследовании гигиенического состояния полости рта (клинически, бактериологически и методом флюоресцентной диагностики) мы учитывали и флюоресценцию интактных тканей зуба.

При этом в итоге характеризующий гигиеническое состояние полости рта (зубы) индекс флюоресценции КфЛ .определяли по формуле:

Где К1^ - мощность флюоресценции в области режущего края зуба

К^ - мощность флюоресценции в области экватора зуба.

К^ - мощность флюоресценции в области шейки зуба.

Кннт- мощность флюоресценции интактного зуба. Мощность флюоресценции соответствовала показателям 82/81 или Б2 в исследуемой области зуба (К^.К^.К^) , п -количество обследованных зубов.

Одномоментно изучали и выявляли непосредственно в клинических условиях клинико-бактериологические параллели, характеризующие объективность разрабатываемой методики и ее статистическую достоверность.

В силу того, что в реальных клинических условиях зубной налет может включать в себя зубные бляшки, расположенные на поверхности зуба (протезной конструкции, импланта), мы совместно со специалистами Института электроники и математики (МГИЭМ) на основе методов моделирования изучили возможные особенности методики при прохождении лазерного излучения через зубной налет. Показано, что при наличии зубной бляшки (неудовлетворительное гигиеническое состояние полости рта) мощность флюоресценции по мере чистки зубов будет увеличиваться. Это, по-видимому, связано с тем, что из поверхностного рыхлого зубного налета слюной вымываются и бактерии и продукты их флюоресценции, а из минерализованной бляшки нет. В связи с этим возможен эффект «запыленной лампочки», когда мощность флюоресценции по мере чистки зубов будет увеличиваться. Этот феномен мы решили проверить и использовать для оценки удовлетворительного или неудовлетворительного гигиенического состояния полости рта.

Высказанные предположения требовали клинической апробации метода, проверки его информативности и объективности на основе сравнительной оценки клинических, бактериологических и флюоресцентных исследований гигиенического состояния полости рта.

При исследовании зубов, имллантов и протезных конструкций с удовлетворительным и неудовлетворительным гигиеническим состоянием полости рта наблюдалась высокая степень корреляции результатов исследования. При неудовлетворительной гигиене полости рта или незавершенности ее гигиенической обработки подтвержден эффект «запыленной лампочки», когда мощность флюоресценции на этапах гигиенической проработки твердых тканей зуба сначала повышалась, а затем (при более интенсивной и длительной их чистке) уменьшалась. Бактериологические и клинические данные подтверждают эффективность и информативность метода (табл. 3).

Таблица 3 Микробиологические показатели концентрации бактерий (КОЕ/г) до и после чистки при хорошей (А) и неудовлетворительной (В) гигиенической обработке полости рта *.

Объект исследования До чистки (КОЕ/мл) п=60 После чистки (КОЕ/мл)

Хорошей(А) гигиен. обр. полости рта. (п=30) Неудовлетворительно й (В), гигиен, обр. полости рта. (п=30)

Шейка зуба в/ч 5,0* 105 102 6,0*106

н/ч 4,0*103 8,0* 10" 5,0* Ю1

Экватор зуба в/ч 7,0* 103 Роста нет Роста нет

н/ч 7,0* 103 Роста нет Роста нет

Режущий край, жевательная поверхность в/ч 6,0*103 Роста нет Роста нет

н/ч 4,0* 103 80 5,0*105

Слюна 5,0*10® 4,0*10" 4,0*10"

* Забор материала зубного налета проводили одномоментно с поверхности зубов и имплактатов (известно, что они имеют однотипную микрофлору).

* Забор материала ротовой жидкости проводили до чистки зубов (имплантатов) и сразу после их чистки, до полоскания полости рта.

Эти исследования подтвердили данные литературы о том, что наибольшей бактериальной загрязненностью, практически неустранимой даже после чистки зубов, является шейка зуба.

Особого внимания заслуживают данные бактериологических и флюоресцентных исследований слюны до и после гигиенической чистки зубов, ОМЧ которой и показатели мощности флюоресценции практически всегда характеризовались высокими цифрами. В частности, ее бактериальная обсемененность до чистки составляла 5,0х108 КОЕ/мл, а после чистки зубной щеткой без пасты - 4,0x10" КОЕ/мл, при применении зубной пасты -5,0х107 КОЕ/мл, т.е. концентрация бактерий слюны превышает минимально допустимую их концентрацию (105 КОЕ/мл) в плане фактора риска для возникновении гнойно-воспалительных заболеваний, пародонтита и других инфекционных проявлений. Все это свидетельствует о том, что после чистки зубов необходима дополнительная соответствующая антисептическая обработка полости рта, так как применение только зубаой щетки и пасты недостаточно. Соответствие бактериологических, клинических и флюоресцентных показателей, однонаправлено и объективно характеризующих гигиеническое состояние полости рта (табл. 4), свидетельствует о том, что разработанный экспресс-метод флюоресцентной диагностики может быть рекомендован в широкую клиническую практику.

Таблица 4 Бактериологические и флюоресцентные показатели ротовой жидкости до и после чистки зубов.(п=30)____

Период измерения Вид бактерий Концентр ация КОЕ/мл ОМЧ КОЕ/мл Мощность флюоресценции относительные ед.

До чистки 1. Str. mitis 2. Str. Saüvarius 3. E.lentum 4. V.parvula 5. Neisseria sp. 6. Lactobacillus sp. 7. Коагулазообр стафилококки (КОС) 8. Corynebacterium 9. С. albicans 108 10' ю7 10 7 10' 103 103 107 103 5,0*108 КОЕ/Мл Мер. Sj/Si, 48,6

1. Str. mitis 10 ,u

эЯ 2. Str. pneumoniae 10»

О И 3. A. viridaus 109 До полоскания

н о 3 >я 4. Str.sanguis 109 Мер.

5. Str. salivarius 10 6 72,3

§ 5 6. Neisseria sp. 10 11

7. E.lentum 10" 4,0*10 11

i - 8. P.anaerobius 10 10 КОЕ/Мл

Г и Ö «О 9. P.granulosum 10 10 После

Я 3" 10. V.parvula 10 7

R О о 11. Lactobacillus sp. 12. КОС 10 7 105 полоскания Мер. Зг«,,

с 13. С. albicans 14. E.coli 105 103 61,6

1. Str. mitis 105

« 2. Str. salivarius 10' До полоскания

Ю 9 3. Str. viridaus grp. 10 6 Мер. Эх/Э,»

4. Neisseria sp. 106 84,8

S S * - и S 5. E.lentum 6. P.anaerobius 7. V.parvula 10 7 10 6 107 5,0*107

в к КОЕ/Мл После

я fe о я 8. Lactobacillus sp. 10 3 полоскания

9. КОС 103 Мер. Бг/Э,,

1—1 10. С. albicans 10 2 34,6

11. E.coli 103

f-oiiNöifltrjagvwo

Зубы

■До чистки

■После чистки

Рис. 7. Суммарная нормированная мощность флюоресценции зубного налета и зубного камня до и после профессиональной чистки зубов с использованием их ультразвуковой обработки.

Гигиеническая обработка полости рта особенно эффективна при использовании профессиональной чистки зубов ультразвуковыми аппаратами (рис.7).

Полученные результаты свидетельствуют, что объективность метода определяет необходимость проведения оценки гигиенического состояния полости рта на основе усредненных данных мощности флюоресценции зубов (шейка, экватор, режущий край) и показателей мощности флюоресценции слюны, при этом индекс гигиены (Кгиг) предлагается определять по формуле:

Кг^п дг> | ^ Жфя.СЯЮНЫ Д0_

К гиг = Кфл.аосл5 Кфл слюны после , ГДе

Кфл. до ~ мощность флюоресценции зубов до чистки в области шейки, экватора и режущего края (Мер)

Кфл. после " мощность флюоресценции зубов после чистки в области шейки, экватора и режущего края (Мер)

Кфл.слюны - мощность флюоресценции 1мл слюны до и после центрифугирования (Мер).

При этом получены следующие результаты. Неудовлетворительное гигиеническое состояние полости рта будет при Кгиг <2,2, а удовлетворительное при Кгиг >2,2, при этом 81до/81после в обоих случаях составляет 0,7-0,8 отн. ед. (т.е. показатели отражения увеличиваются).

Последнее свидетельствует о том, что улучшение «гладкости» поверхности зуба, о чем свидетельствует увеличение показателей его отражения, после чистки зубов является недостаточным свидетельством улучшения их гигиенического состояния, а только сопутствует ему и то лишь в случае уменьшения его бактериальной обсемененности, экспрессно выявляемой методом лазерной флюоресцентной диагностики.

Таким образом, на основании данных клинической микробиологии и флюоресцентной диагностики разработана и апробирована новая экспресс-методика гигиенической оценки полости рта, в основе которой лежит индикация, регистрация и компьютерная обработка показателей флюоресценции основного этиологического фактора, определяющего ее гигиеническое состояние, микрофлоры.

Метод, а точнее принципы диагностики гигиенического состояния тканей на основе явления флюоресценции, могут быть использованы для

оценки эффективности средств гигиены (лосьоны, кремы, гели, биологические активные препараты) в дерматологии, косметологии, гинекологии, а также в других областях медицины, промышленных и пищевых биотехнологиях.

Выводы.

1. На основе исследований собственной флюоресценции монокультур микроорганизмов и их ассоциаций in vitto и in vivo (в полости рта) разработан флюоресцентный метод объективной количественной экспресс диагностики гигиенического состояния полости рта у взрослых и детей. Разработанная экспресс-методика оценки гигиенического состояния полости рта основана на регистрации показателей отражения и флюоресценции различных микробнообсемененных объектов полости рта в красно-инфракрасном диапазоне(зубы, протезные конструкции, слюна).

2. В качестве объективных количественных спектрально-энергетических характеристик флюоресценции обосновано применение таких параметров как нормированная мощность (S2/S1) в диапазоне спектра 633-850 нм и интенсивность обратно отраженного зондирующего сигнала (S1) на длине волны лазерного излучения 633 нм, возбуждающего флюоресценцию.

3. На основе данных флюоресцентной диагностики, подтвержденной методами клинической микробиологии, при гигиенической обработке объектов полости рта во всех случаях выявлено достоверное увеличение показателей обратноотраженного зондирующего сигнала (S1) и уменьшение нормированной мощности флюоресценции (S2/Sl)npn удовлетворительной гигиенической обработке полости рта и увеличение S2/S1 при неудовлетворительной.

4. Отмечено, что для объективной характеристики гигиенического состояния полости рта необходимо проводить ее оценку до и после чистки по интегральному показателю мощности флюоресценции (Кгиг.) зубов и/или протезных конструкций и слюны. Если КГигиены>2,2 .гигиеническое состояние полости рта оценивается как удовлетворительное, а если Кгиг- < 2,2 — как не удовлетворительное.

5. В эксперименте и клинике обосновано применение метода флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния зубов, съемных и несъемных протезных конструкций, слепочной массы, слюны и средств гигиены у взрослых и детей, что определяет возможности метода и его перспективы.

Практические рекомендации.

1. Разработанный экспресс-метод лазерной флюоресцентной диагностики гигиенического состояния полости рта может быть рекомендован для использования в клинических и бытовых условиях для объективизации профессиональной и индивидуальной гигиенической обработки зубов и протезных конструкций у взрослых и детей и оптимального выбора средств гигиены.

2. Метод лазерной флуоресцентной диагностики можно рекомендовать для диагностики, мониторинговых наблюдений и оценки эффективности лечения и профилактики основных заболеваний микробной природы полости рта - кариес, пародонтит, воспалительные заболевания. Метод по оценке гигиенического состояния полости рта позволит определить степень риска возникновения этих заболеваний.

3. Для клинических наблюдений и воспроизведения результатов исследования метода необходимо использовать Бх (обратноотраженный сигнал), 82/81 (нормированная мощность флюоресценции), Кфл. (интегральный показатель мощности флюоресценции, регистрируемый до и после гигиенической обработки полости рта).

Список работ, опубликованных по теме материалам

диссертации.

1. Александров М.Т., Аразашвиллн JI.Д., Мищенко И.М. Филатов М.В. «Применение метода лазерной флюоресценции для проработки твердых тканей зуба» // Санкт-Петербург. Материалы VIII Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов. 2003 г. стр. 18.

2. Александров М.Т., Воробьев A.A., Пашков Е.П., Мищенко И.М, Баграмова Г. Филатов М.В., «Лазерная флюоресцентная диагностика в медицине, пищевой промышленности, экологии» // М, «Электроника: НТБ» 2003 г. стр. 54-59.

3. Александров М.Т., Воробьев A.A., Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Красенков Я.Н., Родионов А.Д. Филатов М.В. «Лазерная флюоресцентная диагностика заболеваний полости рта» // М. Сб. тез. Четвертой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в 21 веке» 2003 г.стр. 34-35.

4. Александров М.Т., Воробьев A.A., Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Аразашвилли Л.Д., Родионов А.Д., Филатов М.В. «Применение экспресс метода флуоресцентной диагностики дисбиоза желудочно-кишечного тракта» // М. Сб. тез. Четвертой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в 21 веке» 2003 г. стр. 35.

5. Александров М.Т., Воробьев A.A., Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Красенков Я.Н., Родионов А.Д., Филатов М.В. «Экспресс метод определения эффективности антимикробных препаратов на основе использования явления флюоресценции» // Москва. Сборник тезисов Четвертой международной научно-практической конференции «Здоровье я образование в 21 веке» 2003 г. стр. 35-36.

6. Александров М.Т., Воробьев A.A., Пашков Е.П., Филатов М.В., Бажанов H.H., Титова С.М.// «Применение лазерной флюоресценци для оценки гигиенического состояния полости рта» М. Вестник РАМН,- 2003 г. №9 стр.39-44

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Филатов, Максим Владимирович

Введение.

ГЛАВА 1. Обзор литературы. 10 1.Современные представления о роли микробиоценоза полости рта в оценке её гигиенического состояния и профилактике 10 воспалительных заболеваний.

1.1. Закономерности формирования и состав микробиоценоза полости рта в норме.

1.2. Состояние проблемы гигиенической оценки тканей полости рта. 16 1.3 Гигиенические показатели полости рта и методы их оценки. 21 1.4. Основы флюоресцентной диагностики биологических объектов микробной природы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение лазерной флюоресценции для оценки гигиенического состояния полости рта"

Актуальность темы.

Лечение стоматологических заболеваний микробной природы обходится в 20 раз дороже их профилактики (2,3,7,9,15,76). Такие заболевания, как кариес, пародонтит охватывают, практически 100% населения и к 60-65 годам это приводит к тому, что у пациентов к этому времени остается не более 5-6 здоровых зубов. По данным ряда авторов (70,76,94,98,113,115,117,118) начало и развитие заболеваний микробной природы в области рта характеризуется колонизацией бактерий, их инвазией с последующим разрушением тканей как самими бактериями, так и их токсинами. При благоприятном исходе происходит репаративная регенерация тканей.

Применение существующих методов диагностики патогенетических факторов, определяющих состояние гигиены полости рта и, связанное с ним, состояние здоровья человека следует признать не достаточно объективным. Например, гигиенический индекс Федорова-Володкиной (1971) оценивает состояние гигиены полости рта по степени окрашивания фуксином или эритрозином зубного налета определенных групп зубов (76,125). Недостаток метода заключается, во-первых, в использовании красителей, что является фактором риска для пациентов с аллергическим статусом. Во-вторых, метод не позволяет учитывать основной этиологический фактор, характеризующий нарушение гигиены полости рта - наличие и активность бактерий, и прокрашивает в основном остатки пищи, погибшие бактерии (т.к. эти красители не являются витальными) и другие компоненты (слущившийся эпителий, детрит). Все это позволяет отнести указанный метод, к субъективным, качественным методам оценки состояния гигиены полости рта.

Другой распространенный критерий - упрощенный индекс гигиены полости рта (J.C. Green, J.R. Vermillion. 1964) - основан на выявлении и визуальной субъективной оценке наличия зубного налета и зубного камня на вестибулярной и язычной поверхности 6-ти зубов верхней и нижней челюсти (76,125). Индекс не учитывает как указанные выше показатели, так и состояние ротовой жидкости (слюны), омывающей все биотопы полости рта, и ее микробную обсемененность. В связи с этим, предложенный индекс гигиены также является субъективным.

Дополнительно для оценки факторов, влияющих на состояние гигиены полости рта, используют эстетический стоматологический индекс (N.C. Cors с соавт., 1986): он определяет положение зубов и состояние прикуса, в сагиттальном, трансверзальном и вертикальном направлении при визуальном контроле (76). Указанные показатели могут служить только дополнительным тестом при оценке эпидемиологического статуса населения и не являются количественными и объективными по указанным выше причинам.

Таким образом, современные методы оценки состояния гигиены полости рта и оценка эффективности средств гигиены полости рта основаны на косвенных данных, в основном, субъективных критериях. Ни один из указанных современных методов не учитывает наличие, концентрацию и активность одного из важнейших факторов, этиологически определяющего состояние гигиены полости рта - её микрофлоры.

На сегодняшний день предложены разнообразные методы оценки состояния гигиены полости рта.(37,42,45,47,51,53) Основными из них являются:

Метод газожидкостной хроматографии - этот метод позволяет определить в биосубстрате летучие вещества — метаболиты микрофлоры. Несмотря на достаточную оперативность этот метод не получил широкого распространения из-за отсутствия однозначного подхода в оценке результатов исследований, а также из-за необходимости использования специального очень дорогого хроматографического оборудования. Кроме того для проведения исследований необходимо приготовление исследуемых образцов специальными химическими методами (54,76)

Хромато-масс-спектралъный анализ. Этот метод диагностики инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов в организме человека основан на анализе состава специфических микробных веществ - маркеров класса жирных кислот и стеаринов, а также других липидных компонентов клетки - метаболитов жизнедеятельности микроорганизмов на основе использования хромато-масс-спектрометрического метода исследования биологических жидкостей. Метод экспрессен, универсален в отношении разных групп микроорганизмов, бактерий, грибов, вирусов. Однако, для его реализации необходима предварительная специальная химическая обработка образцов исследуемого материала. Чувствительность метода по ряду измерений составляет 10 4 - 10 5 клеток в пробе, что уступает микробиологическому методу. Следует отметить высокую стоимость оборудования. (56,57,58,59,94). Указанные методы не выявляют некультивируемые виды бактерий.

Наибольшее распространение имеет бактериологический метод. Этот метод представляет собой довольно громоздкие, трудоемкие, длительные по времени и дорогостоящие лабораторные исследования, не позволяющие проводить обследование большого контингенте населения, а также объективный контроль проводимого лечения, в силу перечисленных недостатков. При этой методике количество определяемых микроорганизмов зависит от поставленной задачи, материальной возможности лаборатории, квалификации персонала. Особою сложность представляет культивирование облигатных анаэробов, до настоящего времени многие из которых не поддаются культивированию in vitro, а для других требуются значительные затраты времени и средств.

В целом существующие классические бактериологические методы длительны (7—10 дней), хотя и более информативны и для целей оценки гигиены полости рта практически не применяются. Для клинико-микробиологической оценки гигиенического состояния гигиены полости рта их применяют в основном для научных целей.

В связи с этим наше внимание привлек экспресс-метод лазерной флюоресцентной диагностики заболеваний и процессов микробной природы (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 ,75,95,96,97). Применение указанной разработки в клинической микробиологии представляет несомненный интерес и, по данным указанных авторов является не только актуальным, но и имеет выраженную клинико-микробиологическую направленность. Появление указанного метода открывает большие перспективы в плане экспресс - диагностики состояния гигиены полости рта по основному этиологическому фактору -ее микрофлоре. Однако данных о применении метода для целей оценки состояния гигиены полости рта и оценки эффективности средств гигиены не выявлено.

Цель работы: Разработка объективного экспресс метода оценки гигиенического состояния полости рта на основе использования явления флюоресценции.

Задачи исследования

1) Провести экспериментально-теоретическое и клинико-микробиологическое обоснование применению метода флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния полости рта

2) Методом флюоресцентной диагностики выявить клинико-бактериологические параллели состояния гигиены полости рта и на этой основе разработать информативные количественные критерии её оценки.

3) В клинических условиях определить эффективность применения флюоресцентного экспресс метода для оценки гигиенического состояния зубов, съемных и несъемных протезных конструкций, слюны.

4) Разработать объективный индекс флюоресценции гигиенического состояния полости рта.

5) Выявить перспективы применения метода флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния полости рта

Научная новизна

1. Анализ литературы показал, что проблема нарушений микробиоцинозов полости рта является актуальной во всем мире, как и разработка экспресс методов диагностики гигиенического состояния полости рта и оценки эффективности средств гигиены. Для оценки микрофлоры полости рта и оценки её гигиенического состояния, непосредственно в момент обследования больного, может быть использован экспресс-метод лазерной флюоресцентной спектроскопии. Разработанная методика по интегральным показателям флюоресценции (спектральные характеристики, мощность) с минимальными материальными и временными затратами позволит проводить индикацию микроорганизмов полости рта (на зубах, в ротовой жидкости, на съемных и несъемных s протезных конструкциях), а также контроль за проведением всего комплекса лечебно-профилактических, гигиенических мероприятий.

2. Проведено экспериментально-теоретическое обоснование и клинико-бактериологическая разработка применения метода лазерной флюоресцентной экспресс диагностики для объективной оценки гигиенического состояния тканей и объектов полости рта (зубы, съемные и не съемные протезные конструкции, слюна).

3. Впервые разработан объективный клинико-микробиологический флюоресцентной индекс гигиенического состояния полости рта, который интегрально, в экспресс режиме характеризует ее гигиенический статус, эффективность проводимой профилактики и средств гигиены.

Практическая ценность работы:

1. Полученные на основании методов клинической микробиологии и флюоресцентной диагностики результаты позволили объективно выявить клиническую эффективность и информативность обратно отраженного зондирующего излучения гелий-неонового лазера с А,=0,65 мкм и наведенной им флюоресценции для экспресс диагностики гигиенического состояния тканей (зубы), биологических жидкостей (слюна) и объектов полости рта (съемные и несъемные протезные конструкции).

2. Проведенное исследование показало, что предлагаемый экспресс метод флюоресцентной диагностики позволяет в реальном времени на принципах обратной связи, строго индивидуально, осуществлять оценку гигиенического состояния тканей полости рта, своевременно осуществлять и корректировать выбор средств гигиены, объективно проводить мониторинг их эффективности.

3. Объективным критерием гигиенической оценки состояния тканей и объектов полости рта, оценки адекватности применения средств гигиены и их профилактической эффективности является увеличение показателей обратно отраженного лазерного излучения (до максимальных), и уменьшение нормированного показателя мощности флюоресценции (до минимального), определяемого по интегральному показателю флюоресценции твердых тканей зуба, протезных конструкций и слюны.

Положения выносимые на защиту:

1. На основе эксперементально-теоретических исследований, микробиологических и клинических наблюдений обоснован экспресс метод лазерной флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния полости рта.

2. Предложен бактериологический клинически обоснованный алгоритм экспресс флюоресцентной диагностики гигиенического состояния полости рта по регистрации и анализу спектрально-энергетических параметров флюоресценции микробных ассоциаций полости рта (зубы, слюна, съемные и несъемные протезные конструкции) у взрослых и детей

Апробация полученных результатов и практической ценности: Основные положения научной работы доложены на заседаниях Академии медико-технических наук РФ на

1. Конференции «Новые технологии практическому здравоохранению», 1999 год,

2. Конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской технологии», 2000 год.

Результаты исследования внедрены в лабораторную и клиническую практику, учебный процесс кафедры и клиники хирургической стоматологии и микробиологии ММА им. И.М.Сеченова

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Филатов, Максим Владимирович

Выводы.

1. На основе исследований собственной флюоресценции монокультур микроорганизмов и их ассоциаций in vitro и in vivo (в полости рта) разработан флюоресцентный метод объективной количественной экспресс - диагностики гигиенического состояния полости рта у взрослых и детей.

2. Разработанная экспресс-методика оценки гигиенического состояния полости рта основана на регистрации показателей отражения и флюоресценции различных объектов полости рта в красно-инфракрасном диапазоне.

3. В качестве объективных количественных спектрально-энергетических характеристик флюоресценции обосновано применение таких параметров как нормированная мощность (S2/S1) в диапазоне спектра 633,8-800 нм и интенсивность обратно отраженного зондирующего сигнала (S1) на длине волны лазерного излучения 633,8 нм, возбуждающего флюоресценцию.

4. На основе данных флюоресцентной диагностики, подтвержденной методами клинической микробиологии, при гигиенической обработке объектов полости рта выявлено достоверное увеличение показателей обратноотраженного зондирующего сигнала (S1) и уменьшение нормированной мощности флюоресценции (S2/Sl)npn удовлетворительной гигиенической обработке полости рта и увеличение S2/S1 при неудовлетворительной.

5. Отмечено, что для объективной характеристики гигиенического состояния полости рта необходимо проводить ее оценку до и после чистки по интегральному показателю мощности флюоресценции (Кгиг.) зубов и/или протезных конструкций и слюны и, в случае, если КгаГиены>2,2 гигиеническое состояние полости рта оценивается как удовлетворительное, а если Кгиг. <2,2 — как неудовлетворительное.

6. В эксперименте и клинике обосновано применение метода флюоресцентной диагностики для оценки гигиенического состояния зубов, съемных и несъемных протезных конструкций, слепочной массы, слюны и средств гигиены у взрослых и детей, что определяет возможности метода и его перспективы.

Практические рекомендации.

1. Разработанный экспресс-метод лазерной флюоресцентной диагностики гигиенического состояния полости рта может быть рекомендован для использования в клинических и бытовых условиях для объективизации профессиональной и индивидуальной гигиенической обработки зубов и протезных конструкций у взрослых и детей и оптимального выбора средств гигиены.

2. Гигиенический метод лазерной флюоресцентной диагностики можно рекомендовать для мониторинговых наблюдений и оценки эффективности лечения и профилактики основных заболеваний микробной природы полости рта - кариес, пародонтит, воспалительные заболевания. Метод по гигиенической оценке состояния полости рта позволит определить степень риска возникновения этих заболеваний.

3. Для клинических наблюдений и воспроизведения результатов исследования метода необходимо использовать как Si (обратноотраженный сигнал), S2/S1 (нормированная мощность флюоресценции), Кфл. (интегральный показатель мощности флюоресценции, регистрируемый до и после гигиенической обработки полости рта).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Филатов, Максим Владимирович, Москва

1. Александров М.Т., Морозова О.А., Круглов А.Н., Эрдес С.И., Пашков Е.П., Новый метод лазерной спектрофлюоресценцни в диагностике дисбиоза кишечника у детей. Тез.докл.конф. " Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей". М.2001г., с. 99-100.

2. Александров М. Т., Козьма С. Ю., Таубинский И. М., Черкасов А. С., Зуев В. М., Лабазанов А. А., Зайцева Е. В., Шейхалиев А. И. Патент РФ №2121144 от 20.03.97 «Способ диагностики заболеваний слизистой оболочки полости рта».

3. Александров М. Т., Прохончуков А. А. Лазеры в стоматологии. Лазеры в клинической медицине // Под редакцией Плетнёва С. Д.- Москва.- 1981.-С.331-351.

4. Александров М.Т ТитоваС.Н.Экспресс-метод оценки эффективности лечения гнойной раны на основе применения лазерно-флюоресцентной фотометрии. Ж. "Стоматология для всех",№ 2,2002г.,с. 14-16.

5. Александров М.Т.и coaBT.(Laser-induced tissue fluorescence in patients with benign and premalignsnt changes of the uterine " cervix. SPIE Vol.3829. Novel Laser Methods in Medicine and Biology. ALT 1998, pp.60-63.

6. Александров М.Т., Применение флуоресцентной спектроскопии для экспрессоценки состояния микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Ж. «Биомедицинская электроника», 2000г.,№1

7. Александров М.Т., А.А.Воробьев и др.Концепция применения методафлюоресценции для индикации анаэробов при бактериологической диагностике. Свидетельство на интеллектуальный продукт ВНИТЦ от 27.08.1999г. №70990000120,2

8. Александров М.Т., Баграмова Г.Э., Данищук И.В. .Флуоресцентная диагностика типов кожи. SH-F" Всероссийский съезд дерматовенерологов .Тез.н.работ ч.1. М.,2001г.,с 64.

9. Александров М.Т., Грудянов А.И. и соавт. Изучение интенсивности флюоресценции интактных и патологических изменений тканей зуба. Российский ж. «Новое в стоматологии"-2000г.,№ 1 (81)-С. 26-32.

10. Александров М.Т., Д. А Терехов,Е.К.Ямницкий, Е.П.Пашков. Метод и устройство для диагностики воспалительных заболеваний кожи. Тез.докл.междунар.конф. "Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии". М.,2001г.,с. 79-80.

11. Александров М.Т., Кубанова А. А., Баграмова Г.Э., Данищук И.В. Мониторинг оптических характеристик кожи лица в процессе выполнения поверхностного химического пилинга. Вестник Эстетической Медицины, 2002г., том 1,.№>2,с. 93-98.

12. Александров М.Т., Морозова О. А., Круглов А.Н. Экспериментально-клиническое обоснование метода лазерной флюоресцентной диагностики дисбиоза кишечника у детей. Материалы IX съезда педиаторов России. 2001г.,с.414.

13. Александров М.Т., Морозова О.А., Пашков Е.П.Метод флюоресцентной диагностики метод индикации микрофлоры человека в норме и патологии. ЖМЭИ, 2001г., № З.С. 57-60.

14. Александров М.Т., Пашков Е.П., Бажанов Н.Н., Воробьев А.А., Зайцева Е.В.

15. Метод флюоресцентной диагностики качества пищевых продуктов. Тез. сессии РАМП "Новые биотехнологии практическому здравоохранению", М., 1999г.,с.36-37.

16. Александров М.Т., Пашков Е.П., Бажанов Н.Н., Воробьева. А.А. Методика лазерной флюоресцентной диагностики качества пищевых продуктов. Тез. докл. междунар. конф. "Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии" М.,2001г., с. 25-26.

17. Александров М.Т., Пашков Е.П., Морозова О.А., Воробьев А.А. Интегральный показатель состояния микрофлоры кишечника, выявленный с помощью флюоресценции. Ж. "Клиническая лабораторная диагностика". 1999г.,№ 11, с.4.

18. Александров М.Т., Черкасов А.С.и .соавтр. Способ определения состояния биологической ткани. Патент РФ 2121289.

19. Александров М.Т., Черкасов А.С.и др., Способ для обнаружения и оценки концепции анаэробных бактерий в биологическом субстрате. Патент РФ. -2121 143.

20. Александров М.Т., Черкасов А.С.Способ лечения воспалительно-дистрофических заболеваний. Патент РФ.2 122451.

21. Барышев М.В. "Лазерная флуоресцентная диагностика несенсибилизированная биотканей." Автореферат диссертации на соискания степени к.т.н. Москва 1993 год.

22. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях. // Микробиол., 1997,№4,с.20-25.

23. Брискин Б.С. Внутрибольничная инфекция и послеоперационные осложнения с позиций хирурга./ Инфекции и антимикробная терапия, 2000, том 2, №4, с. 124-128.

24. Быховский В .Я. «Микробиологический синтез порфиринов» ВНИИСЭНТИ 1985г стр 356

25. Внутрибольничные инфекции: пер. с англ. / Под ред. Венцела Р.П. / М., Медицина, 1990,656с.

26. Воробьев А.А. с соавт. Состояние проблемы инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробными бактериями.//Вестн. РАМН, М., Медицина, 1996, с.3-8.

27. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В. Микрофлора человека и иммунитет: единство и противоположность.//Сборник трудов. Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии., М., 1997, с. 137-141

28. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. / пер. с англ., под ред. Кондратьевой Е.Н.- М., Мир, 1982,3 Юс.

29. Грачева Н.М., Юшук Н.Д., Чупринина Р.П. и др. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения. Диагностика. Применение бактерийных биологических препаратов //Пособие для врачей и студентов, М., 1999,44с.

30. Грудянов А.И. «Пародонтология: избранные лекции» // Методич. пособие -1997r.,C.3-31.

31. Добрынин В.М., Каргальцева Н.М., Добрынина И.А. Микробиологическая диагностика дисбактериозов кишечника. // Рекомендации для врачей, С-П., 1996,20с.

32. Карнаухов В.Н. "Спектральный анализ в изучении внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергии. " -Цитология, 1976 г., т. ххуШ, N 4, стр. 408-418 \)

33. Кочеровец В.И., Петраков А.А., Пономарева Т.Р. и др. Методические рекомендации по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных неспорообразующими анаэробными бактериями. М., 1986,49 с.

34. Кочубей С. М., Федоренко Ю. П. Автоматизированный лазерный спектрофлуориметр // Сборник научных трудов «Спектрометрические методы исследования в физиологии и биохимии».- Л., Наука.- 1987.

35. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь -справочник, Минск. "Асар", 1999,400с.

36. Лабораторные методы исследования в клинике/ Справочник под ред. Меньшикова В.В.,М.,Медицина, 1987г,368с

37. Лакович Д., Основы флуоресцентной спектроскопии. Москва, Мир, 1986

38. МЗ СССР, приказ №535, 22.04.1985г., "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений", М.,1985.

39. Медицинские аспекты микробной экологии. Вып. 6. М. 1992.

40. Медицинские аспекты микробной экологии. Вып. 5. М. 1991.

41. Медицинские аспекты микробной экологии. Вып. 7-8. М. 1994.

42. Методы общей бактериологии. Под ред. Герхардта Ф. и др. / пер. с англ., под ред. Кондратьевой Е.Н.- М., Мир, 1984, т. 1-3.

43. Миронов А.Ю. Неспорообразующие анаэробы и их роль в патологии человека / Под ред. Воробьева А. А. /, М.,' 1990,66с.

44. Миронов А.Ю. Основы клинической микробиологии и иммунологии/ Под ред. Воробьева А.А.ДМ., 1997,160с.

45. Митрохин С.Д., Иванов А.А., Михайлова И.И. и др. Ионная хроматография как метод экспресс-диагностики дисбактериозов желудочно-кишечного тракта. // Тез. докладов конф. "Дисбактериозы и эубиотики". М., 26-28 марта 1996.

46. Мусин М. Н. Вопросы гигиены с точки зрения современной имплантологии. Клинические и зуботехнические аспекты. //Клиническая имплантология и стоматология. СПб., 1997.-№2.

47. Осипов Г.А, Белобородова Н.В. Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма. //Патент РФ по заявке №97117426/14(018498). Приоритет от 21.10.97г.

48. Осипов Г.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов. //Патент РФ № 2086642. С12М 1/00, 1/20, С120 1 /4. Приоритет от 24 дек. 1993г.

49. Осипов Г.А., Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробны инфекционных процессах. //Вестник РАМН. -1996, Т. 13,-№2,-С.52-59.

50. Патологическая физиология / под ред. А.И. Воложина, Г.В. Порядина. М: «Медпресс»,1998-480с.

51. Пашков Е.П., Миронов А.Ю., Миронов А. А. Транспортная среда для облигатных анаэробных бактерий на основе мясопептонного бульона. //Лаб.дело, 1988, с. 67-69.

52. Платонова В.В. «Экспериментальное обоснование и клиническая разработка патогенетической терапии больных с одонтогенными флегмонами челюстно-лицевой области» / Автореферат дисс. док. мед. наук. -Москва, 1999, -С.З.

53. Подопригора Г. И. Иммунные и неспецифические механизмы колонизационной резистентности. //Сборник' трудов ВНИИ Антибиотиков, вып. XIX, М., 1990, с. 16-25.

54. Прохончуков А. А., Александров М. Т., Бугай Е. П. и др. Применение излучения He-Ne лазера в стоматологии // Методические рекомендации. Москва,- 1980.

55. Раевский К.К., Добрынин В.М., Кочеровец В.И. и др. Совершенствование микробиологической диагностики дисбактериозов. //Вестник РАМН, 1997, №3, с. 13-16.

56. Райскина М.Е., Акалене Д.А.Статистическая обработка медицинских данных. //, Вильнюс. Мокслас, 1989.

57. Соловьев К.Н « Люминесценция порфиринов и металопорфиринов» Минск. 1969г

58. Тучин В.В. «Основы взаимодействия низкоинтенсивного лазерного излучения с биотканями: дозиметрический и диагностический аспекты». -Изв. РАН, Серия Физическая, 1995, Т.59, №6.

59. Филатов Н.Н., Храпунова И. А., Матвеев С. И. Проблема гнойно-септических инфекций в стационарах хирургического профиля.// Тез. докл. Российск. научно-практ. Конференции с международным участием. М., 1999 254-5

60. Шендеров Б. А. Значение колонизационной резистентности в патогенезе инфекционных заболеваний.- В кн.: Иммунология инфекционного процесса / Под ред. В.И.Покровского и др., М., 1994

61. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание, т. 1,М., 1998,287с.

62. Шендеров Б.А. Роль анаэробных неспорообразующих бактерий в поддержании здоровья человека. // Вестник' РАМН, 1996, №1.

63. Шендеров Б. А. "Медицинская микробная экология и функциональное питание", т. II, М., 1998,410с.

64. Шлегель Г. Общая микробиология. / пер. с нем. под ред. Кондратьевой Е.Н.-М., Мир, 1987,566с.,

65. Юденфренд С «Флуоресцентный анализ в биологии и медицине» М: Мир 1965г

66. Яковлева В.И., Трофимова В.К., Давидович Т.П., Просверяк Г.П. Диагностика, лечение и профилактика стоматологических заболеваний.// Учебник для медицинских вузов: Высш. Шк., 1995 494с.

67. Alfano R.R. and Yao S.S., "Human teeth with and without caries studied by visible luminiscence spectroscope" J.Dent. Res. 60,120-122(1981).

68. Alfano R.R. et al. "Method for detecting cancerous tissue using visible native luminescence". US patent N 4,930,516 Jun. 5,1990.

69. Baquero F., Fernandes-Jorge A., Visente V.F. et al. Diversity Analysis of the human intestinal flora. A simple method based on bacterial morphotypes.// Microb. Ecol. Health Disease., 1988, vol. 1.

70. Becker W., Becker В., Newman M., Nyman S. Clinical and microbiological findings that may contribute to dental implant failure. // Int. J. Oral Maxillofac Implants, 1990; 5; 31-38.

71. Bergendal Т., Forsgren L., Kving S., Lowstedt E. The effect of an abrasive instrument on soft and hard tissues around osseointegrated implants. // Swed. Dent. J.- 1990.-N14.- P.219-223.

72. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994 ( перевод: Определитель бактерий Берджи. )т1 и т2 М., Мир, 1997.

73. Carmichael R.P. Zarb G. A., McCulloch С.A. "Biological, Microbiological and clinical Aspects of the Peri-Implant Mucosa// Toronto, 1989, p. 39-69, Quintessence book.

74. Claudia Jager Гигиена полости рта у пациентов с имплантатами// Квинтэссенция, Стоматологический ежегодник- 1993 1994 г., С.98-101.

75. Connor Vl.J. "Origin of labile NADH tissue fluorescence". In: Oxygen and Physiological Function. Edited by F. F. Jobs is. Dallas, Professional information library, 1977:90.

76. Deasy M.I., Guttsta G., Rustogi K.N., Voipe A.R. University of Medicine and Dentistry, New Jersey Dental School. Antiplaque efficacy of a triclosan/copolymer pre brush rinse: a plaque prevention clinical study. Am. J. Dent; 1992 Apr; 5(2); p.91-94.

77. Detection of dental tissues using fiberoptic sensor / S.G.Vari. V.R.Pergadia, M.Stavridi // Proc. ofSPIE, 1993,2080: 181-186.

78. Doiron D.R. "Photophysics and instrumentation for porphyrin selection and activation". A Liss Progress in clinical and biological research", v. 170,41-75 pp.

79. Fanta D. et al., "Die Porphyrinproducktion dcs Propionibacterium acnes bci Acne und S ebon-hoe Arch. Demlatol. Res. 261. pp. 175-179, 1978.

80. Finegold S.M. Pathogenic Anaerobes.// Arch. Intern. Med.- vol. 142, 1982, P. 1988-1992. J

81. Finegold S.P. Nonnal human intestinal flora.//Ann. 1st. Super. Sanita, 1986, voL. 22, №3.

82. Flemming T.F. Effect des recalls auf die subgingival Mikroflora von osseointegrierten. Implantaten. Z. Zahnarztl Implantol. 1990; 6: 45-51.

83. Fox S.C., Moriarty J.D., Kusy R.P. The effects of scaling a titanium implant surface with metal and plastic instruments: An in vitro study. // J. Periodontal 1990,61:485-490.

84. Jiro Sasari, Arihiro Kaueco, Junko Yamazari et all, Causative Organisms Identified from Odontogenic Infection from March 1993 to December 1995.// J. Dentistry in Japan. Vol.35:130-133; 1999.

85. Kanig K. et al., "Laser-induced autofluorescence of carious regions of human teeth and canes- involved bacteria. Proceedings SPIE Budapest. 2080., 1993.

86. Kanig K. et al., "Laser-Induced Fluorescence of Dental Caries". Proceedings SPIE 907. pp. 125-131, 1993.

87. Kanig K., Hibst R., Meyer H. Laser-induced autofluorescence of carious regions of human teeth and cariesinvolved bacteria///Proc. of SPIE, 1993,2080: 170-180.

88. Listgarten M.A. Normal development, structure, physiology and repair of gingival ephilelium. // Oral Sci. Rev. 1: 3-67; 1972.

89. Listgarten M. A., Hellden L. Relative distribution of bacteria at clinically healthy and periodontally diseased sites in humans. //J. din. Periodontal. 5: 115-132; 1978.

90. Marwah A.S., Weinmann I.P., Meyer I. Effect of chronic inflammation on the epithelial turnover of the human gingiva. //Arch. Pathol. 69: 147-153, 1960.

91. Mombelli A, Buser D., Lang N.P. Colonization of osseointegrated titanium implants in edentulous patients. Early results. // Oral Microbial Immunol 1988; 3: 113-120.

92. Mombelli A, Van Oosten M.A.C., Schurch E., Lang N.P. The microbiota associated with successful or failing osseointegrated titanium implants. Oral Microbiol. Immunol. 1987; 2: 149-15 1.

93. Mombelli A., Van Oosten MAG, Schurch E., Lang N.P. The Microbiota. associated with successful or failing osseointegrate titanium implants. // Oral Microbiol. Immunol 1987; 2: 145-148.

94. Moore W.E.C., Holdeman L.V., Cato E.P., Good I.J., Smith E.P., Ranney RX, Palcanis K.G. Variations in periodontal floras, fi Infect. Immun. 46: 720-726, 1984.

95. Newman M., Flemming T.F. Periodontal considerations of implants and implant associated microbiota. // J. Dent. Educ. 1988; 52: 737-744.

96. Rams Т.Е., Link C.C. Microbiology of failing dental implants in humans. // J.Oral Implantol. 12: 93- 100; 1986.

97. Rush V.C. Das konzept symbiose: Eine ubersicht uber die terminologie zur beschreibung von lebensgemeinschafiten ungleichnamiger organismen.//Microecol. Therapy., 1989, vol. 19.

98. Sanz M., Newman M.G., Holt R., Jeswan S., Stewart R. Microbiota assiciated with "Sapphire" implants in partially ediutulouse patients. // J. Dent. Res. 65 (Special Issue): Abstr. no 404; 1986.

99. Savage D С . The normal human microflora composition-In: The regulatory and protective role of the normal microflora eds . Grubb R. et al,) M Stocton Press, New York, 1989.

100. Savage D.C. Overview of the association of microbes with epithelial surfaces.// Microecol. Therapy., 1984, vol. 14.

101. Schomacker K.T., Frisoli LK., Compton C.C., Flotte T.J., Richter LM., Nishioka N.S. and Deutsch T.F., "Ultraviolet laser induced fluorescence ofbolonic tissue;basic biology and diagnostic potential," Lasers Surg. Med. 12,63-78(1992).

102. Schou S., Holmstrup P., Hjorting-Hansen E., Lang N. Plaque-induced marginal tissue reactions of osseointegrated oral implants: a review of the literature.// Clin. Oral Implants. Res. 1992; 3(4); 149-161.

103. Shah H.N. et al., 'The Porphyrin Pigmentalion of Subspecies of Bacteroides melamnogenicus", Biochem. J 180, pp. 45 50, 1979. apl.

104. Sutter V. L. Anaerobes as normal oral flora.// Rev. Infekt. Dis., 1984, vol. 6, Suppl. 1.

105. Tang G.C., Pradchan A, Alfano R.R. et al. "Pulsed and cw laser fluorescence spectra fitom cancerous, normal, and chemically treated normal human breast and lung tissues". A.0.15 June 1989, V.28, N 12, p.2337-2343.

106. Tanner A.C.R., Socransky S.S., Goodson J.M. A study of the bacteria associated with advanced periodontitis in man. // J. Clin. Periodontal: 278-307; 1979.

107. Tannock G. W. The Normal Mikroflora: new concents in Health Promotion.// Mikrobi-ologinal Sciences, 1988, vol. 5.

108. Van Winkelhoff A.J., van der Velden U, Winkel E.G., de Graaff J. Black-pigmented Bacteroides and motile organisms on oral mucosal surfaces in individuals with and without periodontal breakdown. // J. Periodontal. Res. 21: 434439; 1986.

109. Vandepitte, K.Engbaek, P.Piot at al. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology, World Health Organization, Geneva, 1994, vol.132.

110. Wilson M.J., Wade W.G., Weightman A.J. The analysis of previously uncharacterised oral bacteria by 16S ribosomal RNA sequencing.// Microecol. Therapy., 1995, vol. 25.

111. Young J. W. and Conte E.T., "Porphyrias and Porphyrins", Intern. J. Dermatol. 30, pp. 399-404,1991.

112. Yuanlong Y, Alfano R. R. fluorescence spectroscopy of dermal wounds in rats, SPIE, JBO 2(1), 5.4-57 (January 1997)

113. Царев.В.Н, Ушаков P.B. « Этиология и этиотропная терапия неспецифических инфекций в стоматологии», Иркутск 1997г.

114. Кузьмина Е.М. с соавт., "Профилактика стоматологических заболеваний", М., 1997 стр. 53-54.

115. R.J.Geoco et all ("Contemporary periodontics" Toronto, 1990)