Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биологическое обоснование применения лечебно-профилактического препарата на основе гриба-ксилотрофа Trametes Pubescens (Shumach. FR) Pilat. в отношении энтерогеморрагической кишечной палочки

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биологическое обоснование применения лечебно-профилактического препарата на основе гриба-ксилотрофа Trametes Pubescens (Shumach. FR) Pilat. в отношении энтерогеморрагической кишечной палочки"

Полученные данные являются фрагментом проведения доклинических исследований препарата траметин, который будет использоваться в системе борьбы с желудочно-кишечными болезнями молодняка крупного рогатого скота

Практическая значимость полученных результатов

Усовершенствована методика индикации и диагностики ЭКГП серотипа 0157;Н7 для использования в ветеринарных исследованиях. Предложены современные методы, позволяющие быстро и эффективно диагностировать юшибактериоз, этиологическим фактором которого являются ЭГКП серотипа 0157:Н7. В работе обоснована экономическая эффективность применения данных методик в животноводческих хозяйствах.

Предложен альтернативный способ утилизации отходов производства препарата траметин, который является экологичным, экономически привлекательным и достаточно перспективным в плане практического применения. Разработана методика приготовления шпательных сред на основе ферментолизата биомассы базидиомицетов, которая может быть применена в качестве аналога при проведении подобных исследований.

Реализация н внедрение результатов исследования

Теоретические положения, результаты исследования и рекомендации использованы при выполнении НИР и ОКР по теме № 01.2.00 900998 «Оптимизация диагностических, профилактических и терапевтических мероприятий по борьбе с инфекционными и инвазионными заболеваниями животных в современных экологических условиях Восточной Сибири» (2008-2012 гг.), выполнявшейся на кафедре анатомии и ветеринарно-саиигарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», научный руководитель - д.б.н. В.А. Чхенкели; по государственному контракту № 2012.41773 от 16 мая 2012 г. с Министерством сельского хозяйства Иркутской области «Усовершенствование методов индикации и диагностики энтерогеморрагической кишечной палочки», научный руководитель - д.б.н. Чхенкели В.А; по теме №01201355870 «Усовершенствование методов диагностики, профилактики и лечения в системе борьбы с желудочно-кишечными и респираторными болезнями телят в современных условиях АПК Иркутской области» (2013 -2017 гг.), выполняющейся на кафедре анатомии и ветеринарно-сашггарной экспертизы ФГБОУ ВПО ИрГСХА, научный руководитель - д.б.н. Чхенкели В.А.

Апробация работы

Основные результаты диссертационного исследования представлены на региональных, всероссийских и международных конференциях, семинарах и конкурсах: Региональной научно-практической конференция молодых ученых «Научные достижения производству» (Иркутск, 2011); Конкурсе молодых ученых в рамках XXV международной зимней школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвященной 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, 2013); Научно-практическом семинаре, посвященном «Дню аспиранта ИрГСХА» (Иркутск, 2013); VI Всероссийском молодежном научно-практическом конгрессе с международным участием «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013); IV Межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за инфекционными заболеваниями» (Иркутск, 2013); Ш Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», посвященной 35-летию кафедры физико-химической биологии ИГУ и 95-летию Иркутского государственного университета (Иркутск, 2013).

Степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации

Обоснованность научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации, подтверждается сопоставлением полученных экспериментальных данных с данными других ученых как российских, так и зарубежных, полученными в работах по изучению распространения ЭПСП у крупного рогатого скота, разработке новых методов индикации и диагностики ЭГКП серотипа 0157:Н7 в ветеринарии, разработке мер борьбы с возбудителем колибактериоза телят с использованием препаратов на основе грибов -ксилотрофов, обсуждением на научно - практических конференциях регионального, Всероссийского и международного уровня по микробиологии, экологии, биотехнологии, ветеринарии; публикациями основных положений диссертационного исследования в рецензируемых журналах, в том числе из перечня рекомендуемых ВАК журналов для защиты кандидатских и докторских диссертаций («Сибирский медицинский журнал, «Вестник ИрГСХА»),

Публикации

По результатам исследования опубликовано 16 научных работ; из них 14 - статьи, из которых 3 - в изданиях из списка ВАК, 1 - в электронном гадании; 1 методические рекомендации; 1 заявка на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и 2 приложений. Работа излажена на 161 странице, содержит 19 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 172 наименования, из которых 102 - российские, 66 - зарубежные издания, 4 интернет-сайта.

Благодарности

Выражаю глубокую признательность научному руководителю - д. б.н. Вере Александровне Чхенкели за теоретическую и методическую помощь в организации и проведении исследований, внедрении результатов исследования, организации поездок в хозяйства Иркутской области и на научные форумы, За помощь в проведении микроскопических исследований благодарю д.б.н. Елену Валентиновну Лихошвай и сотрудников отдела ультраструктуры клетки ЛИН СО РАН, за помощь в проведении исследований - Татьяну Иннокентьевну Барыкину - ветеринарного врача бактериологического отдела Иркутской межобластной ветеринарной лаборатории и Татьяну Николаевну Малову - химика-токсиколога отдела токсикологии и биохимии ФГБУ ИМВЛ. Отдельную благодарность выражаю начальнику отдела аспирантуры ИрГСХА Шеметовой Инне Сергеевне за всестороннюю информационную поддержку. Благодарю также Хамидуллину Зою Валерьевну и Кузнецова Алексея Валерьевича за помощь в техническом оформлении диссертации и моральную поддержку. Особую благодарность приношу своим родным за оказанную моральную и финансовую поддержку.

Содержание работы Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы приведены современные данные об эпидемиологический, эпизоотологичесмэй и экологической значимости энтерогеморрагической кишечной палочки как возбудителя кишечных инфекций человека и животных, а также как микроорганизма-индикатора загрязнения окружающей среды. В главе 1 приведены данные по экологии трибов-ксилотрофов рода Trameies, рассмотрены особенности культивирования высших базидиальных грибов, принципы получения и использования БАВ грибов рода Trámeles в

медицине и ветеринарии. Далее рассмотрены механизмы действия некоторых антимикробных препаратов. В заключении изложены технологические особенности утилизации культурального мицелия гриба-продуцента Т. pubescens - отхода биотехнологического производства, а также приведены рецепты приготовления питательных сред.

Глава 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали штаммы Е. coli серотипа 0157:Н7, выделенные у крупного рогатого скота на товарно-молочных ферм ОАО СХ «Белореченское» п. Хайта (август 2012 г.) и производственного отдела ИрНИИСХ Россельхозакадемии п. Пивовариха (июль 2012 г.). Было обследовано 105 и 93 животных, соответственно. Сбор материала проводился ректально у крупного рогатого скота различных возрастных групп (новорожденные, молодняк, дойные коровы, нетели). Исследование материала проводили на базе ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» на кафедре анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы и в ФГБУ «Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория» (ИМВЛ).

Объектам исследования являлся ветеринарный препарат траметин, разработанный в Иркутском фнлнпс ГНУ «Инсппут экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» Россельхозакадемии. Траметин получают при жидкофазном культивировании гриба-ксилотрофа Trámeles pubescens (Shumach:.Fr) Pilat цгтамм 0663 из Коллекции базидиальных грибов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН с добавлением в среду культивирования цинка сернокислого и натрия селенистокислого.

Объектам исследования был также культуральный мицелий гриба-ксилогрофа Т. pubescens, который является отходом производства препарата траметин. Согласно технологической схеме производства препарата, биомасса продуцента используется для получения кормовой добавки для крупного рогатого скота.

Антимикробное действие гриба изучалось методом агаровых блочков. В качестве тест-культур использовались бактерии семейства Enterobacteriaceae.

В работе использовали комплексный эпизоотологический подход для мониторинга ситуации по колибактериозу крупного рогатого скота в регионе. Были проанализированы ветеринарные статистические отчеты районных ветеринарных лабораторий за период с 2006 по 2010 г., отчеты ФГБУ «ИМВЛ» (форма 4-вет) с 2006 по 2011 г.; ветеринарная отчетность Службы ветеринарии Иркутской области.

Дня изучения причин желудочно-кишечных болезней новорожденных телят проводили бактериологическое исследование материала от живых животных согласно МУК №13-72/2117 Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» (2000) и МУК №13-7-2/1759 «Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (1999). Выделение и идентификацию Е. coli 0157:Н7 проводили в соответствии с МУК 4.2.992 - 00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7» (2000). Для выделения штаммов Е. coli 0157:Н7 использовали отечественную среду «Сорбитол Е. coli 0157:Н7» (питательная среда для выделения и дифференциации Е. coli 0157:Н7 и других энтеробакгерий по признаку ферментации сорбита) производства ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск)

Для биохимической идентификации использовали пластины биохимические, дифференцирующие энтеробакгерий (ПБДЭ) производства ООО «Диагностические системы»

(г. Н. Новгород) согласно инструкции по использованию, которые позволяют проводить идентификацию по 20 признакам.

Для определения токсичности выделенных штаммов проводили биопробы на белых беспородных мышах. Для подготовки суспензии культуры выращивали в чашках Петри на триптозном ГРМ-агаре, с добавлением 90 мкг/мл линкомицина. Через 1S-20 ч инкубирования в термостате при температуре 37 °С культуру смывали физиологическим раствором в объеме 3 мл. В каждую пробирку с суспензией добавляли по 7,5 мг полимиксина В и тщательно перемешивали в течение 10 мин. Обработанную микробную взвесь центрифугировали при 3000 об. /мин в течение 30 мин. Таким образом получали супернатанты для обнаружения веротоксинов. Для определения наличия веротоксинов для каждой культуры брали по 2 мыши весом 16-18 г. Одной мыши вводили по 1 мл супернатанта, а другой - контрольной - по 1 мл прокипяченного в течение 45 мин. супернатанта. При положительном результате мыши погибали через 10-12 ч. При вскрытии мышей наблюдали патологические изменения в толстом кишечнике, характеризующиеся явлениями гемоколита (отек слизистой оболочки, эритемы, геморрагии). Мыши, которым вводили прокипяченные суспензии бактерий, остались живы (В. А. Чхенкели, 2013).

Для проведения мониторинговых исследований для экспресс-оценки антигена ЭГКП 0157:Н7 в фекалиях крупного рогатого скота использовали иммунохромагографические тест-системы «E.coli 0157:Н7 Тест» производства Novamed Ltd (Израиль).

При получении препарата трамегин начальным этапом является поддержание продуцента, т.е. культуры гриба Т. pubescens на твердой питательной среде - сусло-агаре. Посевной материал выращивают на стандартной твердой питательной среде Сабуро, в которую предварительно добавляют микрокристаллическую целлюлозу, активирующую природную метаболическую активность продуцента. Далее выращивают посевной материал на жидкой питательной среде. Селен и цинк вносится в питательную среду в виде растворов солей. Посевной материал выращивался в колбах Эрленмейера в шейкере-инкубашре ES-20 (Латвия) при 220 об./мин. при температуре 28-30 °С в течение 4 сут. Посевной материал вносится в ферментационную среду в количестве 5-10 % по объему. Ферментация осуществляется в течение 4-5 сут. при 220 обУмин. и температуре 28-30 "С. Затем культуральную жидкость отделяют от биомассы культурального мицелия центрифугированием в течение 10 мин. при 6000 обУмин, авггоклавнруют при 0,8 атм. в течение 30 мин. Лиофилизацию биологического препарата проводят с использованием лабораторной лиофильной сушилки LZ - 9СР (Чехия).

Определение замещённых ароматических производных препарата траметин проводили методом хромаш-масс-спетрометрии на хромато-масс-спектрометре 5975С inert XL MSD with Triple-Axis Detector abhvs Agilent Technologies» (США) в соответствии с МУК 4.1.649-96 «Методические указания по хромаго-масс-спектрометрическому определению летучих органических веществ в воде» Минздрава России по определению концентрации летучих органических веществ в воде (A.C. Фролов, 2008).

Антимикробное действие изучалось методом диффузии в агар и методом серийных разведений с использованием среды АГВ и агара Мюллера-Хинтона, а также бульона Хотгингера и бульона Мюллера-Хинтона производства НИЦФ (г. СПб.). В качестве тест-культур использовали референтные пггаммы микроорганизмов, полученные из ГНИИ стандартизации и контроля медицинских препаратов им Л.А. Тарасевича (г Москва). Микробная нагрузка составляла 1-2х107 кое/мл. Для приготовления инокулята использовались 18-20-часовые агаровые культуры. Суспензию доводили до 0,5 по стандарту

Таблица 2. Динамика заболеваемости и падежа телят от желудочно-кишечных болезней в __Иркутской области (2009 -20101 г.)__

Районы Поголовье КРС Заболеваемость, % Падеж, % Поголовье КРС Заболеваемость, % Падеж, %

2009 г. 2010 г

Ангарский 1250 3'0,2 - 1489 15/1.0 -

Балаганский 3866 315/8.1 52/1,3 3560 105/2.9 24/0,7

Братский 9584 85/0,9 14/0.1 9253 49/0,5 20'0,2

Болайбинский 304 - - 118

Заларинскнй 9767 215/2,0 35/0,4 10292 347/3,4 29/0.3

Зиминский 8061 297/3.7 5/0,06 7794 386/5,0 106/1,4

Иркутский 199*10 1097/5,5 267/1,3 18893 1787/9.5 Тб4'0.9

Казач.-Ленский 1108 43/3.9 - 1149 61/5.3 -

Качутский 14415 682/5.0 32/0.2 14799 699/4.7 37/0,3

Кирснский 1330 272/20,5 3/0.2 1199 192/16,0 0

Куйтунекий 16379 1691/10,3 366/2,2 14908 1452/9,7 237/1,6

Катанга 104 11/10,5 - 242 11/4,5 -

Ннжнешшмский 1431 - - 1180 - -

Нижнеудинскнй 10427 1596/15,3 114/1.0 10225 1476/14,4 85/0,8

Ольхонский 7657 29/0.4 2/0,03 7240 18/0.2 0

Тайшетский 11251 1147/10,2 36/0.3 10995 920/8,4 45/0,4

Тулунский 11478 165/1,4 11/0,1 11190 41/0,4 0

Усольский 12978 433/3.3 76/0.6 13256 390/2.9 25/0,2

Усть-Илимский 1247 122/9.8 - 1161 147/12,7 -

Усть-Кутский 832 22/2,6 6/0,7 592 11/1,9 1/0,2

Усть-Удинский 5829 125/2,1 - 6369 20/0,3 -

Черемховский 22875 610/2.7 5/0,02 23319 570'2.4 3/0,01

Чунскнй 40X4 9/0.2 - 3627 18/0,5 -

ВСЕГО: 176173 8969/5,09 1024/0.58 172,850 8715/5,04 776/0.44

Примечание: «-»- не наблюдалось

Таблица 5 - Химический состав экстрактов

Форма Наименование компонентов

Экстракт« гекеаном Экстракция хлороформом

I 2 3

Нативная Бензойный альдегид 3,7 -декадиен- 5,6 -диол,4,7 -диме....

2,4 - дихлорофенклизотиоцианат 2 -бугеновая кислота

3 -хлоро -4 - метоксибеюальдегвд Гексадекан

3 -аминофенол 2 -пропионовая кислота

Флорин Бензойная кислота

Оюадскан

10 -метилнонадекан

2Н-имидазо[4,5<5]пиримидин -5,7

4-фяоро -Ы - фурф}рилбегсамцдин

3 -флоробешнламан

Пирроло[1,2~а] пиразин-1,4,-дион

1,2 -бе нзидиндикарбо новая кислота

п -гексадекановая кислота

Пентадекановая кислота

Тридекановая кислота

Олеиновая кислота

Теградецил - трифлороацетзт

14 -пентадекановая кислота

2( 1Н) - пиримидин

Эйкозан

Пентакозан

Этофумезат

Ацетамид

Бешоквинолин

Оюадекан

1Д, 5 -Оксадиазол -3 -амин

3 -метил -1 -фенил -2 -азофлорин

Хенэйкозан

1Н - индол -2 -карбоновая кислота

5- метал -2 -фенилицдолизин

Эргостин

3 -Фенил -4 -азафлоренон

Гексадекан

Этофумезат

Модифициро-

ванная 2,5 -дичетилбензин -1,4 -диол Гексадекан

3 -аминопиразол Оксолиновая

2,5 -октадиен кислота

1,4 -бензодиоксол -5 -амин I -кзпренил-3,5-диметил -5-...

Циклопе нтан 2,5 -диметилбензил -1,4 -диол

9 -октадецин 1,2 -бензидиндикарбе новая кислота

1.2 -бензндицдикарбоновая кислота Бегооквиналин

Норкетон Этофумезат

5 -метокси -5- шггробензотрифлорид 2 -флорбензиловый альдегид

3 -аминофенол 3 -флоробензиловый с пир г

2,4 -гептадиен 2,4 -декадиенапь

6,6 -дим етилге ггга -2,4 -диен Гексадекан

1,4 -гексадиен 2,5 -Диметилбензин -1,4 -диол

1,5,9-декатр иен 2- бутил - дельта! -пиррол ин

Эгофумезат 3 -октин

3 -гидрокси - бета — дамаскон 3,4 -гексадиеналь

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калинович, Арсений Евгеньевич, Иркутск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ИРКУТСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

04201451188 ца Правахрукописи

КАЛИНОВИЧ Арсений Евгеньевич

ЭКОЛОГО - БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ВЕТЕРИНАРНОГО ПРЕПАРАТА НА

ОСНОВЕ ГРИБА-КСИЛОТРОФА ТИАМЕТЕБ РЦВЕ8СЕЫ8 (8НиМАСН:.Р11.)Р1ЬАТ. В ОТНОШЕНИИ ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ

КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ

03.02.08-экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

В.А. Чхенкели

Иркутск 2013

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................13

1.1. Экология, эпидемиологическая и эпизоотологическая значимость энтерогеморрагической кишечной палочки.....................................................13

1.2. Экология грибов-ксилотрофов рода Trametes........................................21

1.3. Механизмы действия антимикробных препаратов................................31

1.3.1. Антимикробные вещества, подавляющие синтез клеточной стенки бактерий............................................................................................................33

1.3.2. Антимикробные вещества, подавляющие синтез ДНК..................36

1.4. Схема утилизации биомассы гриба-продуцента Т. pubescens — отхода биотехнологического производства..................................................................40

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................46

2.1. Характеристика объектов исследования.................................................46

2.2. Методы исследования...............................................................................47

2.2.1. Методы мониторинговых исследований распространения ЭГКП 47

2.2.2. Методы забора проб патологического материала, индиикации и диагностики Е. coli 0157:Н7..........................................................................48

2.2.3. Определение характера взаимоотношений Т. pubescens и бактерий семейства Enterobacteriaceae..........................................................................54

2.2.4. Микроскопические методы анализа.................................................56

2.2.5. Получение ветеринарного препарата траметин..............................58

2.2.6. Изучение состава препарата траметин.............................................60

2.2.7. Определение антимикробной активности препарата траметин ....60

2.2.8. Определение чувствительности/устойчивости выделенных

2

культур ЭГКП к антимикробным препаратам..............................................61

2.2.9. Разработка питательной среды..........................................................61

2.2.10. Методы статистической обработки даных....................................63

Глава 3. Эпизоотология и этиология желудочно-кишечных заболеваний телят в Иркутской области....................................................................................63

Глава 4. Эколого-биологические аспекты антимикробного воздействия

препарата траметин в отношении энтерогеморрагической кишечной палочки

71

4.1. Определение характера взаимоотношений Т. pubescens и бактерий семейства Enterobacteriaceae.............................................................................71

4.2. Изучение химического состава препарата траметин с использованием хромато-масс-спектрометрического анализа......................72

4.3. Усовершенствование методики индикации и диагностики энтерогеморрагической кишечной палочки (ЭГКП) в ветеринарии.............78

4.4. Изучение антимикробного действие препарата траметин....................88

4.5. Изучение антимикробной активности препарата траметин в отношении изолятов E.coli 0157:Н7.................................................................91

Глава 5. Утилизация биомассы гриба-продуцента как отхода производства препарата траметин...............................................................................................94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................104

ВЫВОДЫ..............................................................................................................107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................109

Список сокращений

УТЕС -веротоксин Е. coli

БАВ - биологически активные вещества

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

ГРМ - гидролизат рыбной муки

ГУ С - гемолитико-уремический синдром

ИК - инфракрасный

ИМВЛ - Иркутская межобластная ветеринарная лаборатиоря

ИФА - иммуноферментный анализ

КРС - крупный рогатый скот

ЛД - летальная доза

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МПК - минимальная подавляющая концентрация

МТФ - молочно-товарная ферма

МЦА - мусциноподобный антиген

НИЦФ - научно-исследовательский центр фармакотерапии

ОКБ - общее количество бактерий

ООИ - особо опасные инфекции

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЭА - раково-эмбриональный антиген

ТСХ - тонкослойная хроматография

ХМС - хромато-масс-спектрометрия

ЭГКП - энтерогеморрагическая кишечная палочка

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Возбудители инфекционных заболеваний являются достаточно значимым экологическим фактором, особенно в условиях искусственной экосистемы, какой является животноводческая ферма [30-32]. Стойловое содержание животных способствует их тесному контакту в ограниченном пространстве, что способствует распространению инфекционных заболеваний, многолетней циркуляции возбудителей, а также приобретению болезнетворными бактериями множественной резистентности к применяемым антимикробным препаратам [77]. Современная система животноводства, предполагающая, как и любой другой бизнес, извлечение максимальной прибыли при минимальных затратах, не предполагает использования дорогостоящих эффективных антимикробных препаратов в системе борьбы с инфекциями, что делает затруднительной девастацию возбудителей и требует разработки и внедрения недорогих и эффективных антимикробных препаратов [49].

В виду того, что энтерогеморрагическая кишечная палочка серотипа 0157:Н7 имеет не только эпизоотологическую значимость, но и эпидемиологическую, т.к. в плследние десятилетия вспышки острого геморрагического колита у людей регистируются во многих странах мира [100,104-106,129,133,136,141-144], проблема её распространения привлекает всё больший интерес ученых. При попадании в окружающую среду Е. coli 0157:Н7 может стать причиной эпидемии острого геморрагического колита, который характеризуется как острым течением болезни, так и серьезными осложнениями [76,164,170]

В настоящее время немаловажная проблема заключается в

5

недостаточности методических материалов по индикации и диагностике энтерогеморрагических эшерихий в ветеринарии, а также отсутствии мониторинговых исследований в хозяйствах нашего региона. Разработанные и успешно применяемые в крупных ветеринарных центрах методы ПЦР и ИФА требуют использования стационарного дорогостоящего оборудования, их внедрение на молочно-товарных фермах не целесообразно и не оправдано с различных точек зрения. Однако без достаточного контроля на уровне хозяйств, может оказаться незамеченной вспышка эпизоотии, вызванная ЭГКП серотипа 0157:Н7, а при проникновении возбудителя в продукты переработки животноводства, или водоемы возрастает и эпидемическая опасность. Исходя из этого, была усовершенствована методика индикации и диагностики энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа 0157:Н7 в ветеринарии.

При этом, в последние десятилетия все больше внимания ученых

привлекают базидиальные грибы и биологически активные вещеста (БАВ),

синезируемые ими. Так, в работах В.А. Чхенкели [85], Е.С. Горшиной [25] и

др. показана достаточно высокая антимикробная и лечебно-

профилактическая эффективность препаратов, полученных на основе грибов-

ксилотрофов рода Тгап^еэ. Особый интерес для целей данного исследования

представляет новый полифунциональный препарат траметин, разработанный

в Иркутском филиале Института экспериментальной ветеринарии Сибири и

Дальнего Востока Россельхозакадемии, так как его прототип -

антимикробный препарат Леван-2 - показал сравнительно высокую

антимикробную активность, в том числе и по отношению к

полирезистентным штаммам различных микроорганизмов [88,93], и в

системе борьбы с колибактериозом телят. При исследовании траметина в

первую очередь следует рассмотреть характер взаимоотношения гриба-

продуцента и микроорганизмов, в том числе и представителей семейства

6

Enterobacteriaceae. Такое исследование даст возможность понять природу и механизм антимикробной активности продуцента, изучив его состав, обнаружить факторы, способные ее повысить с точки зрения биотехнологии.

В процессе производства препарата закономерно встает вопрос об утилизации отходов биотехнологичского производства. Метод жидкофазной ферментации способствует постоянному накоплению биомассы гриба-продуцента, которую можно использовать в качестве кормовой добавки для скота, как и предлагалось в технологическом регламенте. Однако чтобы такой метод утилизации отходов приобрел значимую экономическую целесообразность, необходимо производить колоссальное количество биомассы продуцента, что не соотносится с потребностью региона в ветеринарных антимикробных препаратах.

Цель работы заключается в выявлении эколого-биологических аспектов, определяющих антимикробную активность препарата траметин в отношении энтерогеморрагической кишечной палочки, и в разработке альтернативной схемы утилизации отходов его производства. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Определить характер взаимоотношений гриба-ксилотрофа Trametes pubescens (Shumachr.Fr)Pilat и микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Изучить природу биологически активных веществ, определяющих антимикробное действие препарата траметин на микроорганизмы данного семейства.

2. Усовершенствовать методику индикации и диагностики ЭГКГТ серотипа 0157:Н7 в ветеринарии и выделить изоляты E.coli серотипа 0157:Н7 от крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах.

3. Изучить устойчивость/чувствительность выделенных изолятов к

современным антимикробным препаратам, и изучить in vitro

антимикробную активность препарата траметин в отношении

7

выделенных изолятов Е. coli 0157:Н7.

4. Разработать альтернативную схему утилизации биомассы гриба-продуцента как отхода производства препарата траметин, изучить возможность использования биомассы T. pubescens в качестве основы для приготовления питательных сред, пригодных для культивирования микроорганизмов рода Bacillus.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На обследованных молочно-товарных фермах циркулируют (ЭГКП) серотипа 0157:Н7, проявляющие полирезистентность к антимикробным препаратам, применяемым в животноводческих хозяйствах, что является значимым экологическим фактором.

2. Гриб-ксилотроф Trametes pubescens (Shumachi.Fr.) Pilât, проявляет ярко выраженную антагонистическую активность в отношении бактерий семейства Enterobacteriaceae, а препарат траметин, разработанный на его основе, проявляет высокую антимикробную активность in vitro относительно энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа 0157.-Н7.

3. Культуральный мицелии гриба T. pubescens, который является отходом производства препарата траметин, представляет полноценную основу питательной среды для культивирования бактерий рода Bacillus, а также может служить основой для разработки питательных сред для культивирования других бактерий.

Научная новизна

Впервые на молочно-товарных фермах Иркутской области были выделены ЭГКП серотипа 0157:Н7, изучена их

устойчивость/чувствительность к современным антимикробным препаратам, показана их полирезистентность. Впервые установлена in vitro высокая антимикробная активность препарата траметин в отношении выделенных изолятов ЭГКП Е. coli 0157:Н7. Впервые проведено сравнительное исследование состава замещенных ароматических соединений в препаратах на основе гриба-ксилотрофа Т. pubescens.

Полученные данные являются фрагментом проведения доклинических исследований препарата траметин, который будет использоваться в системе борьбы с желудочно-кишечными болезнями молодняка крупного рогатого скота.

Практическая значимость полученных результатов

Усовершенствована методика индикации и диагностики ЭКГП серотипа 0157:Н7 для использования в ветеринарных исследованиях. Предложены современные методы, позволяющие быстро и эффективно диагностировать колибактериоз, этиологическим фактором которого являются ЭГКП серотипа 0157:Н7. В работе обоснована экономическая эффективность применения данных методик в животноводческих хозяйствах.

Предложен альтернативный способ утилизации отходов производства препарата траметин, который является экологичным и достаточно перспективным в плане практического применения. Разработана методика приготовления питательных сред на основе ферментолизата биомассы базидиомицетов, которая может быть применена в качестве аналога при проведении подобных исследований.

Реализация и внедрение результатов исследования

Теоретические положения, результаты исследования и рекомендации

использованы при выполнении следующих проектов: при выполнении НИР и

ОКР по теме по теме № 01.2.00 900998 «Оптимизация диагностических,

профилактических и терапевтических мероприятий по борьбе с

9

инфекционными и инвазионными заболеваниями животных в современных экологических условиях Восточной Сибири» (2008-2012 гг.), выполнявшейся на кафедре анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», научный руководитель — д.б.н. В.А. Чхенкели; по государственному контракту № 2012.41773 от 16 мая 2012 г. с Министерством сельского хозяйства Иркутской области «Усовершенствование методов индикации и диагностики энтерогеморрагической кишечной палочки», научный руководитель — д.б.н. Чхенкели В.А; при выполнении НИР и ОКР по теме №01201355870 «Усовершенствование методов диагностики, профилактики и лечения в системе борьбы с желудочно-кишечными и респираторными болезнями телят в современных условиях АПК Иркутской области»(2013 -2017 гг.), научный руководитель - д.б.н. Чхенкели В.А.

Апробация работы

Основные результаты диссертационного исследования представлены на

региональных, Всероссийских и международных конференциях, семинарах и

конкурсах: Региональной научно-практической конференция молодых

ученых «Научные достижения производству» (Иркутск, 2011); Конкурсе

молодых ученых в рамках XXV международной зимней школы

«Перспективные направления физико-химической биологии и

биотехнологии», посвященной 30-летию Научно-образовательного центра

ИБХ РАН (Москва, 2013); Научно-практическом семинаре, посвященном

«Дню аспиранта ИрГСХА» (Иркутск, 2013); VI Всероссийском молодежном

научно-практическом конгрессе «Симбиоз-Россия 2013» с международным

участием (Иркутск, 2013); IV Межрегиональном семинаре «Организация

санитарно-эпидемиологического мониторинга за инфекционными

заболеваниями» (Иркутск, 2013); III Всероссийской научно-практической

конференции с международным участием «Развитие физико-химической

10

биологии и биотехнологии на современном этапе», посвященной 35-летию кафедры физико-химической биологии ИГУ и 95-летию Иркутского государственного университета (Иркутск, 2013).

Степень обоснованности научных положений, выводов и

рекомендаций, сформулированных в диссертации

Обоснованность научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации, подтверждается сопоставлением полученных экспериментальных данных с данными других учёных как российских, так и зарубежных, полученными в работах по изучению распространения ЭГКП у крупного рогатого скота, новых методов индикации и диагностики ЭГКП серотипа 0157:Н7 в ветеринарии, разработки мер борьбы с возбудителем колибактериоза к телят с использованием перпаратов на основе грибов — ксилотрофов, обсуждением на научно — практических конференциях регионального, Всероссийского и международного уровня по микробиологии, экологии, биотехнологии, ветеринарии; публикациями основных положений диссертационного исследования в рецензируемых журналах, в том числе из перечня рекомендуемых ВАК журналов для защиты кандидатских и докторских диссертаций («Сибирский медицинский журнал, «Вестник ИрГСХА»).

Публикации

По результатам исследования опубликовано 16 научных работ, из них 14 статьи, из которых 3 - в изданиях из списка ВАК, 1 - в электронном издании; 1 методические рекомендации; 1 заявка на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка

литературы и 2 приложений. Работа изложена на 161 странице, содержит 19

таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 172 наименования, из

11

которых 102- российских, 66 - зарубежные издания, 4 интернет-сайта.

Благодарности

Выражаю глубокую признательность научному руководителю - доктору биологических наук, Вере Александровне Чхенкели за теоретическую и методическую помощь в организации и проведении исследований, внедрении результатов исследования, организации поездок в хозяйства Иркутской области и на научные форумы, За помощь в проведении микроскопических исследований благодарю Елену Валентиновну Лихошвай и сотрудников отдела уль�