Внеклеточные оксидоредуктазы лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes Pubescens (Schumach.) Pilat

Никитина, Оксана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внеклеточные оксидоредуктазы лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes Pubescens (Schumach.) Pilat
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточные оксидоредуктазы лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes Pubescens (Schumach.) Pilat"

На правах рукописи

Никитина Оксана Викторовна

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ ЛИГНИНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА TRAMETES PUBESCENS (SCHUMA CH.) PILÂT

Специальность 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель кандидат биологических наук,

С. В. Шлеев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Р. А. Звягильская

кандидат технических наук Е. Н. Ефременко

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН

Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится « с?/~» _2006 г. в _часов на заседании

диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «. » АО&рТй^ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ^^ А.Ф. Орловский

а,оо£!\

5X77

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее десятилетие большое число работ посвящено поиску и изучению новых штаммов базидиальных грибов -продуцентов лигнинолитических ферментов, а также поиску ферментов с новыми физико-химическими свойствами, что связано с широкими прикладными аспектами их использования. Внеклеточные ферментные системы дереворазрушающих грибов, как правило, включают спектр множественных форм оксидоредуктаз следующих трех основных структурных типов: гем-содержащие, флавинсодержащие и медьсодержащие ферменты. Среди лигнинразрушающих грибов широко распространено явление образования множественных форм ферментов, однако его физиологическая роль до настоящего времени точно не установлена.

Лакказа (Ьс) является одним из основных ферментов лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов. Однако, несмотря на большое число публикаций, касающихся фундаментальных исследований этого фермента, роль Ьс в деградации лигнина до конца не ясна. Современные исследования базидиальных грибов в этой области показали, что Ьс в сочетании с другими лигнинолитическими ферментами, марганецпероксидазой (МпР) или лигнинпероксидазой (1лР), может выполнять существенно более значимые функции при деградации лигнина, чем простое окисление его фенольных подструктур. В связи с этим интересно было исследовать возможные взаимосвязи, возникающие между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиальных грибов.

Известно, что наличие ионов металлов переменной валентности в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительно-восстановительных ферментов. Особенно важным в этом отношении является наличие ионов марганца. Именно Мп (II) является основным субстратом МпР, а также может играть значительную роль в каталитическом цикле 1ЛР. Недавние исследования показали, что Мп (II) является также нетипичным субстратом Ьсв базидиальных грибов и может обеспечивать наличие кооперативного действия Ьс и МпР. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с Ьсэ из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов и изучение кооперативного действия Ьс с другими лигнинолитическими ферментами. Кроме того, изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического

ионов марганца, как природного медиатора, может прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили.

Базидиомицет Trametes риЬеэсет является хорошим объектом исследования. Ранее было показано, что он может секретировать в культуральную жидкость несколько внеклеточных ферментов в детектируемых количествах, в частности: Ьс, 1лР и СОН. Известно также, что штамм 923-2 лекарственного базидиального гриба Т. риЬе&сет является промышленным штаммом-продуцентом биомассы, из которой получают биологически активные добавки. После отделения биомассы фильтрат культуральной жидкости не используют и потенциально он может служить источником внеклеточных ферментов.

Понимание роли отдельных ферментов, входящих в состав лигнинолитического комплекса при деградации лигнина, во-первых, открывает возможные пути оптимизации переработки этого полимера. Во-вторых, исследование множественных форм ферментов лигнинразрушающих грибов на примере базидиомицета Тгатегез риЪвБсет представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения метаболизма грибов белой гнили, так и с позиции применения данного организма для получения препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств и закономерностей действия основных компонентов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. риЪевсет - Ьс, 1ЛР и МпР. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода очистки и получение гомогенных препаратов основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Т. риЪезсет-. Ьс, ЬЛР и МпР.

2. Изучение основных физико-химических свойств выделенных ферментов.

3. Проведение сравнительных исследований множественных форм Ьсв базидиомицета Т. риЬейсет.

4. Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиального гриба Т. риЪе$сет при деградации модельных соединений лигнина. Установление роли каталитического окисления ионов Мп до Мп Ьс в присутствии хелатирующих агентов.

5. Разработка вариантов возможного использования лигнинолитических ферментов базидиомицета Т. риЪевсеж для создания биосенсоров.

Научная новизна работы. Проведенные исследования позволили впервые изучить механизм кооперации Ьс, Ь1Р и МпР базидиального гриба Тгатегеь риЬезсет в процессе деградации лигнина Предложена схема

кооперации ферментов лигнолитического комплекса данного базидиомицета. Впервые очищены до гомогенного состояния и частично охарактеризованы LiP и МпР гриба Т. pubescens. Проведено детальное сравнительное исследование двух новых, ранее не описанных множественных форм Lcs базидиомицета Т. pubescens. Электрохимическим методом доказана возможность окисления ионов Мп2+ до Мп3+ высокопотенциальными Lcs базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов и определены основные параметры данной реакции.

Практическая ценность работы. Результаты исследования некоторых физико-химических свойств Lc, ее субстратной специфичности и механизма действия фермента вносят вклад в понимание механизма катализа многоядерными медьсодержащими оксидоредуктазами. На основе частично очищенного препарата Lcs базидиомицета Т. pubescens разработан амперометрический биосенсор для определения соединений фенольной структуры.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на научных конференциях: 8-ой Международной Пущинской Школе-Конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), Международной конференции студентов и аспирантой по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005), International Conference Fundamentals & Applications "Biocatalysis - 2005" (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в числе которых 3 статьи в российских и зарубежных научных журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включает

наименований. Иллюстративный материал содержит £ 9 рисунков и W таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный внеклеточным ферментативным системам базидиальных грибов. Рассматриваются строение, свойства и механизмы действия основных ферментов, входящих в состав лигнинолитического комплекса базидиомицетов. В последнем разделе собраны

факты, описывающие ферментативные системы базидиальных грибов рода Trametes.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовали внеклеточные ферменты: Lc, LiP и МпР - лигнинолитического комплекса штамма базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilat (Syn.: Coriolus pubescens (Schum. ex Fr.) Quel.) ВСБ 923-2 семейства Polyporaceae.

Культивирование баэидиомицета Т. pubescens. Получение культуральной жидкости с высоким содержанием Lc и LiP-активности проводили путем глубинного культивирования штамма-продуцента в 30 литровом ферментационном аппарате "Marubishi" (Япония) при избыточном давлении 0,4 атм. Аэрация воздухом в стерильных условиях составляла 1 л/1л в мин с механическим перемешиванием 250 об/мин мешалкой турбинного типа на среде следующего состава, г/л: глюкоза - 20,0; (NH^SC^ - 2,5; КН2Р04 -1,2; мочевина - 0,7; кукурузный экстракт сгущенный - 10; вода водопроводная. Культивирование осуществляли в условиях рН-статирования при рН 3,5 и температуре +26°С. Продолжительность культивирования составила 114 часов.

Получение культуральной жидкости с высоким содержанием Lc и МпР-активности проводили путем глубинного культивирования того же штамма гриба в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, с объемом среды 150 мл на круговой качалке (200 об/мин) при температуре +26°С и исходном рН-среды 5,8 на среде следующего состава, г/л: меласса - 30; NH4NO3 - 3; КН2Р04 - 1,2; мочевина - 0,7. Продолжительность культивирования составила 72 часа.

Выделение и очистка ферментов. Все виды колоночной хроматографии низкого давления проводили с помощью комплекта стандартного оборудования для жидкостной хроматографии низкого давления фирмы "Pharmacia LKB Biotechnology" (Швеция) при температуре +4°С. Жидкостную хроматографию среднего и высокого давления проводили с использованием системы ЖХВД "Стайер" фирмы "Аквилон" (Россия) при комнатной температуре.

Контроль активности ферментов. Контроль активности ферментов в процессе выделения и очистки осуществляли спектрофотометрическими методами. Активность ферментов выражали в международных единицах -единица активности соответствовала такому количеству фермента, которое катализировало превращение 1 мкмоля субстрата или образование 1 мкмоля продукта за 1 минуту. Активность Lc регистрировали, используя в качестве субстрата 10 мМ раствор пирокатехина (А, = 410 нм; е = 740 М"1 см"1) в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 4,5. Контроль активности LiP осуществляли по окислению вератрового спирта, измеряя изменение оптического поглощения

при 310 нм (б = 9300 М"1 см"1) в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 3,0. Активность МпР регистрировали, используя в качестве субстрата MnS04 при 238 нм (е = 6500 М"1 см"1) в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 5,0, в присутствии 0,1 мМН202.

Кинетические измерения и рН-зависимость. Кинетические измерения при определении каталитических параметров ферментативных реакций Le для пирокатехина, гидрохинона, гваякола и K4Fe(CN)6, а также измерение рН-зависимости Les проводили на кислородном электроде типа Кларка по изменению концентрации 02 в системе. Определение кинетических параметров и измерение рН-зависимости реакции окисления АБТС осуществляли в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 4,5, при длине волны 436 нм.

Регистрацию окисления ионов Мп2+ до Мп3+, катализируемое Le, осуществляли в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 5,0 (X = 238 нм) и в 0,1 М Na-оксалатном буфере, рН 5,0 (X, = 270 нм) в присутствии 0,1 мМ MnS04.

Образование Н202 в системе, содержащей Le, ионы Мп2+ и хелатор, регистрировали с помощью LiP по окислению АБТС. Реакционную смесь, содержащую 210'7 М Le и 0,1 мМ MnS04 в 0,1 М Na-тартратном или Na-оксалатном буфере, рН 5,0, инкубировали в течение 120 мин при комнатной температуре, затем подвергали ультрафильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 12 кДа путем центрифугирования в течение 30 мин при 10000 об/мин для удаления Le. Концентрацию Н202 определяли по увеличению оптической плотности в реакции окисления АБТС, катализируемой LiP. Возможное образование супероксиданион-радикала регистрировали по восстановлению нитросинего тетразолия (0,2 мМ) при 560 нм.

Спектральные исследования. Все спектры записывали в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,5. Спектры оптического поглощения регистрировали на спектрофотометре Coulter DU 650 "Beckman" (Германия); спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции записывали с помощью спектрофлуофотометра RF-5301 PC "Shimadzu" (Япония). Регистрацию спектров ЭПР осуществляли на ЭПР-спектрометре ESC-106 фирмы "Bruker" (Германия). Спектры кругового дихроизма регистрировали на спектрофотометре Jasco J-715 (Япония). Параметры вторичной структуры белков рассчитывали с использованием компьютерной программы «Protein-CD», версия 1,5 (Москва, Россия).

Масс-спектроскопические исследования проводили с использованием лазер десорбционно-ионизирукмцей (MALDI) масс-спектрометрии на масс-спектрометрическом анализаторе "Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer" MALDI time-of-flight (TOF) (США). Гидролизаты белков также

анализировали с использованием четырех полюсной ионной ловушки Bruker Esquire (Германия) в сочетании с нанораспылителем для их ионизации (ESI-QIT-MS анализ).

Электрохимические исследования.

Приготовление электродов. Исследования проводили на электродах двух типов: спектроскопическом графитовом электроде (Ringsdorff Werke GmbH, Bonn, Germany) и стеклоуглеродном электроде фирмы "BAS". Поверхность стеклоуглеродного рабочего электрода перед экспериментами полировали А120з, затем промывали деионизированной водой. Поверхность спектроскопического графитового электрода полировали на влажной наждачной бумаге (Tufback Durfte PI200), промывали бидистиллированной водой и высушивали. Модификацию графитового электрода осуществляли следующим образом: каплю раствора лакказы (10 мкл; 0,7 мг/мл) или препарата культурального фильтрата наносили на полированную поверхность электрода и оставляли в течение 20 минут для адсорбции, избыток фермента(ов) осторожно смывали деионизированной водой.

Циклические вольтамперограммы записывали с использованием вольтамперометрического анализатора CV-50W фирмы "BAS" (США) с использованием трехэлектродной электрохимической ячейки в широком интервале потенциалов и при варьировании скорости сканирования.

Амперометрические исследования биосенсоров проводили с использованием трехэлектродного потенциостата (Zata Electronics, Лунд, Швеция) в проточно-инжекционной системе. В качестве рабочего электрода использовали модифицированный спектроскопический графитовый электрод. Поток создавали с помощью перистатического насоса Gilson (Франция) 0,1 M растворами цитрат-фосфатного буфера. Анализируемую пробу объемом 50 мкл вносили в поток, используя шестиканальный инжектор ((LabPRO Rheodyne injection, PR700-100-01, Rheodyne, США). Регистрацию данных осуществляли с помощью самописца (Kipp and Zonen, тип BDI 11, Delft, Нидерланды).

Электродом сравнения во всех случаях являлся Ag I AgCl I ЗМ NaCl электрод (BAS, 210 мВ vs. NHE), а вспомогательным электродом служила платиновая проволока диаметром 1 мм.

Определение окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) Т1 центра лакказы осуществляли методом редокс-титрования, используя октоцианомолибдат (IV) калия в качестве медиатора. Электрохимическое потенциометрическое титрование вели в спектроэлектрохимической ячейке, (золотой капилляр с рабочим объемом 0,7 мкл), потенциал которою контролировали с помощью трехэлектродного потенциостата BAS LC-3E. В

данных исследованиях насыщенный хлорсеребряный (Ag | AgCl | KClial; 200 мВ vs. NHE) и платиновый электроды использовались в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода, соответственно. Спектр поглощения регистрировали с помощью PC2000-UV-VIS и миниатюрного оптоволоконного спектрометра Ocean Optics (Dunedin, FL, USA).

Все потенциалы в работе приведены относительно нормального водородного электрода (vs. NHE), рН 7,0; 25°С.

В третьей главе представлены собственные результаты.

Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Trametes pubescens.

Сравнительное исследование качественного состава ферментов лигнинолитического комплекса при глубинном культивировании базидиомицета Т. pubescens, штамм 923-2, на базовой глкжозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом и на комплексной среде (мелассе) показало, что в первом случае продуцировались значительные количества Lc- и LiP-активностей и обнаруживались лишь следовые количества MnP-активности. В то время как при глубинном культивировании того же штамма гриба на мелассе наблюдался максимум МпР и Ьс-активностей, а LiP-активность практически не детектировалась. Поэтому для выделения основных лигнинолитических ферментов гриба Т. pubescens (Lc, LiP и МпР) были использованы культуральные фильтраты двух типов, полученные при выращивании данного штамма гриба на вышеописанных средах.

Для изучения физико-химических и биохимических характеристик ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Т. pubescens разработан метод получения ферментов в количествах, достаточных для решения поставленных в работе задач. Он включал в себя следующие стадии: осаждение белков из культуральной жидкости сульфатом аммония в диапазоне насыщения 0-90% и ионообменную хроматографию низкого давления на носителях Сервацел ДЕАЕ 52 и Toyopearl DEAE 650М. В результате был получен препарат «голубой» лакказы (в дальнейшем Lcl), а также комплекс ферментов, обладающих оксидазной и пероксидазной активностями, для разделения которых была разработана схема очистки, представленная на рисунке 1. Комплекс ферментов удалось разделить введением дополнительных стадий очистки с использованием гельфильтрационной, адсорбционной и гидрофобной хроматографии. В результате, после стадий гидрофобной хроматографии, были получены гомогенные препараты двух форм Lcs: Lcl с удельной каталитической активностью (Ауд) - 75,1 мкмоль/мин на 1 мг белка и

общим выходом по активности (по пирокатехину) в результате очистки -10,7%, и Lc2 с Ауд = 66,7 мкмоль/мин на 1 мг белка и общим выходом по активности (по пирокатехину) в результате очистки - 14,6%; а также LiP или МпР, в зависимости от типа исходного культурального фильтрата. LiP и МпР имели следующие удельные каталитические активности: 15,5 мкмоль/мин на 1 мг белка и 40,0 мкмоль/мин на 1 мг бежа соответственно.

Рисунок 1. Схема очистки ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens.

Таким образом, использованный в настоящей работе штамм гриба Т. pubescens 923-2 при соответствующих вышеописанных условиях культивирования продуцировал три лигнинолитических фермента: Lc, LiP и МпР. Из образцов культурального фильтрата в гомогенном состоянии были выделены две формы Lc, а также впервые получены гомогенные препараты LiP и МпР. Было показано, что Lc2, в отличие от Lei, образует весьма прочный комплекс с LiP или же МпР (в зависимости от условий культивирования), который удавалось разрушить только с использованием гидрофобного носителя на последней стадии очистки.

Физико-химические свойства ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens.

Выделенные препараты ферментов изучали в сравнении с другими известными ферментами по следующим параметрам: молекулярная масса, изоэлектрическая точка, состав и строение углеводной части, спектральные характеристики ферментов.

Показано, что Lei и Lc2 базидиомицета Т. pubescens представляли собой мономерные белки с близкой молекулярной массой около 67 кДа. Обе выделенные Les являлись гликопротеинами, их углеводная часть составляла приблизительно 13% от массы белка. В состав углеводной части Le T. pubescens входили: N-ацетил-глюкозамин, манноза и ксилоза. Показано, что среднее содержание меди в молекулах Lei и Lc2 гриба Т. pubescens составляло 3,9 и 3,8 иона металла на одну молекулу белка, соответственно, что является типичным значением для «голубых» оксид аз.

LiP имела молекулярную массу 45 кДа, а молекулярная масса МпР составляла 54 кДа. Изученные Lei, Lc2 и LiP являлись кислыми белками с изоэлектрическими точками 5,3; 5,1 и 4,2 соответственно. Основные биохимические характеристики лигнинолитических ферментов базидиомицета Т. pubescens представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные биохимические характеристики гомогенных препаратов ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета

Trametes риЬевсепв

Фермент Удельная активность (мкмоль/мин на мг белка) MW (кДа) Pi Углеводная часть (%)

Lei 66,7* 67 ±2 5,3 ±0,1 13

Lc2 75,1* 67 ±2 5,1 ±0,1 13

LiP 15,5** 45 ±2 4,2 ±0,1 н.о.

МпР 40,0*** 54 ±2 н.о. н.о.

Примечания: Результаты рассчитаны как среднее значение по трем измерениям; н.о. - параметр не определяли. MW - молекулярный вес. * -активность по пирокатехину, ** - активность по вератровому спирту, *** -активность по M11SO4.

Для выяснения строения активного центра оксидоредуктаз базидиомицета Т. pubescens были проведены спектральные исследования ферментов. Спектры поглощения Lei и Lc2 типичны для нативных «голубых»

Lcs базидиальных грибов, и в них присутствовали сигналы обоих центров меди, а именно Т1 (пик 610 нм) и ТЗ (плечо в области 330 нм). Спектры поглощения LiP и МпР типичны для гем-содержащих ферментов и характеризовались ярко выраженными максимумами поглощения в области 407 нм и 403 нм, соответственно (полоса Соре), а также полосами поглощения в областях 500 нм и 635 нм.

В спектре ЭПР LiP наблюдался сигнал при g = 6,0, характерный для высокоспинового иона железа (Fe3+) в гем-содержащих ферментах. Для Lei и Lc2 получены близкие спектры ЭПР, типичные для «голубых» Lcs. Рассчитаны значения компонент g- тензора и А-тензора: для Т1 центра: gn = 2,20, Ац= 9010" "см"1 и для Т2 центра: g||=2,25, Ац= 188'10"4cm"'.

Изучение вторичной структуры ферментов проводили с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Показано, что Lei и Lc2 имели незначительные отличия во вторичной структуре белка, в то время как КД-спектр LiP значительно отличался от двух спектров лакказ. Он имел четкий максимум поглощения при 210 нм и плечо в области 222 нм, что хорошо согласуется с литературными данными.

КД-спектры лакказ базидиомицета Т. pubescens были математически обработаны в области длин волн от 190 до 250 нм. Параметры вторичной структуры белков были рассчитаны с использованием компьютерной программы «Protein-CD», версия ],5. Программа сравнивает КД-спектры интересующих нас ферментов (Lei и Lc2) с КД-спектрами имеющихся в базе данных белков. Наилучшая корреляция КД-спектров исследуемых ферментов (Lei и Lc2) с КД-спектрами, имеющимися в базе данных, была получена для кластера, состоящего из 18 белков с известной вторичной структурой. Результаты расчетов показали, что обе формы Lc содержат около 2-3% а-спиральных участков, 45-46% ß-структуры, 20% изгибов и 33-34% представлено нерегулярной структурой.

Таким образом, в результате проведенных исследований, были детально охарактеризованы основные физико-химические свойства двух форм Lcs, а также частично исследованы гомогенные препараты ферментов LiP и МпР. Показано сходство биохимических и спектральных параметров двух форм Lcs с лакказами других базидиальных грибов.

Сравнительные исследования двух множественных форм лакказ базидиомицета Trametes pubescens.

Ввиду того, что лакказа является одним из основных ферментов, необходимых для деградации лигнина, интересно было провести детальные сравнительные исследования физико-химических свойств лакказ Т. pubescens.

Изучены зависимости начальной скорости гомогенной каталитической реакции от концентрации различных субстратов Le в стационарных условиях. В таблице 2 представлены значения каталитических констант (ккш) ферментативных реакций по различным субстратам-донорам для Lei и Lc2, значения констант Михаэлиса (Км), а также отношение этих величин, характеризующее эффективность каталитического процесса. Как видно из таблицы 2, Lc2 обладала более высокими значениями каталитических констант по отношению к нефенольным субстратам (ABTS, K4Fe(CN)6), в то время как Lei обладала высокими скоростями окисления субстратов фенольной структуры (гидрохинон и гваякол). При этом, сродство Lei по отношению к гидрохинону ниже такового по сравнению с Lc2, тогда как эффективность каталитической реакции окисления пирокатехина выше для Lei за счет низкого значения константы Михаэлиса (Таблица 2).

Оптимум pH обеих Les практически совпадал и находился в интервале 4,0 - 4,5 при использовании пирокатехина в качестве субстрата ферментов. В присутствии K4Fe(CN)6 активность ферментов при возрастании pH раствора от 2,5 до 6,0 сначала практически не изменялась, а затем монотонно падала.

При инкубации Lei базидиомицета T. pubescens при 37°С фермент терял лишь около 25% от своей первоначальной активности за 72 часа, в то время как лакказа из широко описанного в литературе базидиомицета Trametes hirsuta теряет около 40%. Таким образом, Lei гриба Т. pubescens весьма термостабильна, что делает привлекательным ее возможное использование в биотехнологических процессах.

Таблица 2. Кинетические параметры Lei и Lc2 базидиомицета Trametes pubescens

Lei Lc2

Субстрат Км kca¡ ксЛы Км kcat кСа/К M

(мМ) (с1) (с'мМ"1) (мМ) (С) (cW)

Гидрохинон 0,50 240 480 0,20 170 850

Пирокатехин 0,20 60 300 0,60 160 260

Гваякол 0,22 136 620 0,12 55 560

АБТС 0,05 150 3000 0,06 400 6700

KtFe(CN)í 0,70 280 400 0,20 370 1850

Примечания: кинетические константы были рассчитаны как средние значения по трем измерениям, ошибка измерения не превышала 10%. Условия: 0,1 М цитрат-фосфатный буфер, рН 4,5; 20°С.

Рисунок 3. Спектроэлектрохимическое окислительно-восстановительное титрование лакказ Trametes pubescens (0,022 мМ Lei и 0,018 мМ Lc2; 0,2 мМ K4Mo(CN)6; 100 мМ фосфатный буфер, pH 6,5).

(А) Изменение спектра поглощения Lei в процессе редокс-титрования. 1 - 5 спектры поглощения фермента при потенциалах раствора 900, 800, 750, 700, и 600 мВ соответственно. Вставка: Кривые титрования Нернста Lei и Lc2 в логарифмических координатах. (Б) Спектроэлектрохимические кривые титрования, показывающие зависимость поглощения растворов Le при 614 им (отражающее окислительно-восстановительное состояние меди Т1), относительно редокс-потенциала среды.

450 500 550 600 650 700 750 800 X, НМ

0.13 -

2 0.12 -

со 0.11 -

1 0.1 -

i" 0.09 -

I 0.08 -

0.07 ■

0.06 -

550 600 650 700 750 800 850 900 Е/мВ (V5. NHE)

Определены окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП) Т1 медного центра двух форм лакказ. На рисунке ЗА представлены спектры

поглощения, регистрируемые в процессе окислительно-восстановительного титрования Lei базидиомицета T. pubescens. Такие же изменения спектра наблюдались и в случае другой формы лакказы (Lc2). Восстановление Т1 медного центра сопровождалось практически полным исчезновением поглощения в «голубой» области спектра. Кривые окислительно-восстановительного титрования двух форм Les представлены на рисунке ЗБ. Показано, что ОВП Lei и Lc2 незначительно отличаются друг от друга и составляют 746 ± 5 и 730 ± 5 мВ, соответственно. Угол наклона кривых титрования составил 61 мВ и 65 мВ для Lei и Lc2, соответственно (Рисунок ЗА, вставка), что соответствует одноэлектронному восстановлению ионов меди Т1 центра.

Проведено сравнительное изучение биоэлектрокаталитических свойств Les базидиомицета T. pubescens. В присутствии субстрата фермента, молекулярного кислорода, показана возможность прямого электронного переноса с электрода на молекулу фермента с последующим электрокаталитическим восстановлением дикислорода на графитовых электродах. При адсорбции на электродах обе формы лакказы сильно снижают потенциал, необходимый для электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Электрокаталитический ток электродов, модифицированных Lei и Lc2, регистрировался уже при потенциале около + 870 мВ со значением потенциала полуволны электровосстановления дикислорода +745 мВ и +735 мВ для Lei и Lc2, соответственно.

Исследована зависимость плотностей электрокаталитических токов от значения pH раствора в области pH 2,5 - 6,0. Показано, что pH-зависимости электровосстановления молекулярного кислорода для двух форм Les очень близки как в случае ферментов, адсорбированных на электродах, так и в случае гомогенного катализа.

Для двух форм ферментов (Lei и Lc2) показано ингибирование электрокаталитической активности галогенид-ионами (за исключением иодид-анионов), что хорошо согласуется с литературными данными. Также нами были изучены каталитические параметры биоэлектрохимических реакций, в частности зависимость скорости биоэлектрохимической реакции от концентрации растворенного молекулярного кислорода.

Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать вывод о значительном сходстве биохимических, физико-химических, а также электрохимических свойств обоих форм лакказ. Для выяснения вопроса о том, являются ли выделенные ферменты продуктами одного гена, были проведены масс-спектроскопические исследования Lei и Lc2.

Анализ гидролизатов Lei и Lc2 методом MALDI в области масса/заряд (m/z) 500-5000 показал практически полное сходство аминокислотных последовательностей данных белков (рисунок 4). Исходя из этого можно предположить, что выделенные ферменты Lei и Lc2 являются, скорее всего, продуктами одного гена, т.е. множественными формами одного и того же фермента. Для сравнения был проведен аналогичный анализ ранее изученной Le Trametes hirsuta. Продукты гидролиза этого фермента сильно отличались от таковых у исследуемых и охарактеризованных Lei и Lc2 базидиомицета Т pubescens. Следует отметить, что пять полученных пептидов Lei и Lc2 совпадали с основными пептидами Le Trametes versicolor. При этом аминокислотная последовательность Lei и Lc2 отличалась от данных, имеющихся в литературе по первичной структуре двух изоформ лакказ Т. pubescens (база данных NCBI, ААМ18408 и ААМ18407). Таким образом, выделенные нами ферменты являются новыми, ранее не описанными множественными формами Le Т. pubescens.

Рисунок 4. Суммарный масс-спектрометрический анализ продуктов гидролитического расщепления Lcl and Lc2.

Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов гриба Trametes pubescens при деградации модельных соединений лигнина.

Как было сказано выше, Lc2, в отличие от Lei, образует весьма прочный комплекс с LiP или же МпР (в зависимости от условий культивирования) и ее достаточно сложно получить в гомогенном состоянии. Это обстоятельство, а также большое сходство свойств двух форм Les определили выбор объекта наших дальнейших исследований. В последующих экспериментах использовали в основном препарат Lei, однако для сравнения результатов и контрольных экспериментов использовали оба препарата Les (Lcl и Lc2) базидиомицета T. pubescens.

-f

Одной из задач нашей работы являлось исследование возможных взаимосвязей, возникающих между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиомицета Т pubescens. Ранее было показано, что Le из базидиомицета Т. versicolor катализировала окисление ионов Мп2+ до Мп3+ в присутствии хелатирующего агента - Na-пирофосфата. Использование анионов оксалата и малоната в качестве комплексонов трехвалентного марганца приводило к образованию супероксиданион-радикала с последующим его превращением в Н2О2. Была также предложена схема взаимодействия Le и МпР. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с Les из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов.

Одним из основных параметров, от которого зависит скорость окисления субстратов Le, является различие в потенциалах донора и первичного акцептора электронов фермента. Как было показано выше, Les базидиомицета T. pubescens можно отнести к ipyraie высоко-редокс-потенциальных ферментов, так как значение ОВП Т1 центра для обоих ферментов составляло около 740 мВ, в то время как редокс-потенциал пары Мп2+/Мп3+ (аква-комплекс) составляет 1100 мВ. Таким образом, высокая разность в значениях редокс-потенциалов делает термодинамически невозможным процесс окисления ионов Mn(II) Т1 центром Les. Однако, образование комплексов марганца с хелатирующим агентом (например, анионом дикарбоновых или «-оксикарбоновых кислот) может значительно понижать редокс-потенциал этой пары. Это было показано прямым электрохимическим экспериментом.

На рисунке S представлена циклическая вольтамперограмма, записанная с использованием стеклоуглеродного электрода в Na-тартратном буферном растворе, содержащем ионы Мп2+. Потенциал средней точки, равный +940 мВ, соответствует ОВП тартратного комплекса пары Мп2+/Мп3+. При более положительных потенциалах наблюдалось некоторое необратимое окисление аква-комплекса Мп2+ вплоть до потенциала 1100 мВ. По-видимому, существует равновесие между ионами марганца в составе водного комплекса и ионами металла, хелатированными тартрат-анионами, и только последние могут принимать участие в ферментативной реакции. При этом равновесие смещено в сторону водного комплекса ионов марганца.

Таким образом, полученное экспериментальным путем значение редокс-потециала тартратных комплексов марганца указывает на термодинамическую возможность их медленного окисления высокоредокс-потенциальными Les базидиальных грибов. Для проверки данного предположения была

спектрофотометрически изучена реакция ферментативного окисления ионов Мп2+, катализируемая Lei гриба Т. pubescens, в присутствии хелатирующих агентов (анионов тартрата и оксалата).

—|_1_I_ ■ • ' ■_I_ ■

200 400 600 800 1000 1200 Е / мВ (vs. NHE)

Рисунок 5. Циклические вольтамперограммы, записанные на стеклоуглеродном электроде, в присутствии (1) и в отсутствии (2) 0,2 мМ M11SO4 в 0,1 M тартратном буфере (скорость сканирования - 50 мВ/с; начальный потенциал 210 мВ).

Исследование зависимости начальной скорости гомогенной каталитической реакции от концентрации ионов Мп2+ в стационарных условиях показало, что кинетика реакции хорошо описывается классическим уравнением Михаэлиса-Ментен. Однако, эффективность ферментативного процесса (ккш/Км = 0,043 мМ"'с"') при окислении ионов Мп2+ в присутствии анионов татрата существенно ниже, чем при окислении традиционных субстратов Les (таблица 2). Обращает на себя внимание тот факт, что оптимум рН реакции окисления ионов Мп2+ сдвинут в нейтральную область, по сравнению с типичными субстратами Les, и находится в интервале рН 5,5 - 6,0.

Исследованы продукты реакции ферментативного окисления ионов Мп Les гриба Т pubescens в присутствии анионов оксалата или тартрата в качестве

хелаторов. Показано, что одним из продуктов реакции являлся пероксид водорода. Кроме того, возможное присутствие супероксиданион-радикала косвенно показано по восстановлению нитросинего тетразолия в системе, содержащей Le, Na-оксалатный или Na-тартратный буфер и ионы Мп2+. Участие супероксиданион-радикала во вторичных химических реакциях или же его диспропорционирование в растворе приводит к образованию пероксида водорода.

Таким образом, в результате проведенных исследований доказана возможность протекания и изучена реакция окисления ионов Мп2+, катализируемая Les базидиомицета Т. pubescens, в присутствии хелатирующих агентов. Аналогичные результаты были получены с использованием Le другого базидиального гриба Т. hirsuta. На основании литературных данных и проведенных исследований можно предположить, что указанная реакция характерна для большинства Les базидиальных грибов.

Было показано, что в реакционной смеси, содержащей Le, МпР, Мп2+ и хелатор, без добавления Н2О2, наблюдалось резкое увеличение скорости образования комплекса Mn(III) с тартрат-анионом. В отсутствие Le эта реакция не протекает, то есть Le действительно может являться инициатором МпР- и LiP-реакций.

Высокий редокс-потенциал хелатированной пары Мп2+/Мп3+ позволяет также проводить непосредственное окисление нефенольных подструктур лигнина, например, вератрового спирта. Методом циклической вольтамперометрии показано, что в присутствии ионов Мп2+ и хелатора наблюдалось увеличение анодного тока на 25% в области потенциалов окисления Мп(П) по сравнению с фоновой реакцией. То есть окисление вератрового спирта происходило с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. Помимо электрохимических экспериментов в работе было проведено спектрофотометрическое детектирование ферментативного окисления вератрового спирта Les Т. pubescens в присутствии комплекса Mn(II). В процессе реакции наблюдалось увеличение оптической плотности в области 310 нм - максимуме поглощения вератрового альдегида, основного продукта окисления вератрового спирта.

Заключительным этапом нашей работы являлось исследование возможности использования выделенных и охарактеризованных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Т. pubescens при создании биосенсора для анализа фенольных соединений.

Разработка амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата базидиомицета Trametes pubescens.

В настоящей работе при создании биосенсора использовали частично очищенный ферментный препарат лаюсаз базидиомицета Т. pubescens.

Оптимизацию амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата из гриба Т. pubescens проводили при использовании пирокатехина в качестве модельного субстрата ферментов. В качестве рабочего электрода использовали спектральный графит с нанесенным на его поверхность ферментным препаратом. Детекцию осуществляли при потенциале рабочего электрода, соответствующего электровосстановлению продукта ферментативной реакции. Показано, что оптимальная концентрация ферментного препарата для адсорбции составляла около 100 мкг/мл. Воспроизводимость результатов для шести изготовленных ферментных электродов составляла приблизительно 88%, что хорошо согласуется с литературными данными для биосенсоров на основе лакказа-модифицированных электродов.

Исследована зависимость изменения отклика биосенсора от приложенного потенциала. Показано, что для потенциалов ниже +385 мВ ток пика не зависит от приложенного потенциала. В дальнейших экспериментах электровосстановление окисленных фенольных соединений проводили при потенциале +160 мВ, так как этот потенциал удобен для практического использования и оказывает наименьшее влияние на превращение различных соединений в комплексных системах. Наиболее интенсивный ответ биосенсора наблюдался при скорости потока 0,5 мл/мин. Изучение влияния рН буферного раствора на отклик биосенсора показало, что оптимальное значение рН для детекции пирокатехина составляло 5,0.

В оптимизированных условиях были определены амперометрические отклики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба Т. pubescens с использованием проточно-инжекционной системы для ряда фенольных соединений. Чувствительность, предел детекции, линейный динамический диапазон, а также коэффициент корреляции рассчитывали, используя уравнение Михаэлис-Ментен для электрохимических систем. Характеристики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба Т pubescens представлены в таблице 3.

Таблица 3. Характеристики амперометрических биосенсоров на основе ферментного препарата базидиомицета Тгате1езриЪе$сет по отношению к фенольным соединениям.

Фенольное соединение Наклон калибровочной кривой (пАдМ-1) Линейный диапазон детекции (ИМ) Предел детекции (цМ) Коэффициент корреляции (Г)

Фенол 0,06 1-25 17,1 0,991

я-Крезол 0,39 1-50 8,3 0,998

L-ДOФA 1,34 1-75 11,4 0,996

Ванилин 1,56 1-10 16,4 0,992

Конифериловый альдегид 1,60 1-75 9,5 0,997

Допамин 1,99 1-25 20,6 0,987

Гваякол 2,35 10-100 7,3 0,998

Пирокатехин 2,87 1-25 26,0 0,980

ДОФУК 3,35 1-10 10,4 0,997

Гидрохинон 5,06 1-10 23,1 0,984

Сравнивая полученные нами данные для электродов, модифицированных ферментными препаратами из базидиомицета T. pubescens, с известными литературными данными для электродов, модифицированных лакказами Т. versicolor и Т. hirsuta, можно сделать вывод, что разработанный биосенсор обладал более широким линейным диапазоном детекции для большинства использованных фенольных соединений (таблица 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований разработана схема очистки лигнинолитических ферментов базидиального гриба Т. pubescens. Показано, что использованный в настоящей работе штамм базидиомицета Т. pubescens 923-2 при выбранных условиях культивирования продуцировал в детектируемых количествах следующие лигнинолитические ферменты: две формы лакказы (Lei и Lc2), LiP и МпР, которые были выделены и очищены до гомогенного состояния. Проведено комплексное исследование оксидоредуктаз базидиомицета Т. pubescens, включающее изучение биохимических, спектральных, каталитических и электрохимических свойств ферментов.

Основное внимание в работе уделяли изучению Les базидиомицета Т. pubescens, так как Le является одним из основных ферментов утилизации лигнина. Наши исследования показали сходство биохимических, спектральных

и электрохимических параметров Lei и Lc2. Определены ОВП Т1 ионов меди обоих форм ферментов, последние были отнесены к группе высокоредокс-потенциальных Lcs. Обе формы Lc катализировали реакции электровосстановления молекулярного кислорода, протекающего по четырехэлектронному безмедиаторному механизму. Результаты электрохимических экспериментов по электровосстановлению молекулярного кислорода (гетерогенная система) хорошо согласуются с результатами гомогенной кинетики ферментативного восстановления дикислорода. Результаты электрохимических экспериментов подтверждают ранее предложенный механизм функционирования лакказы на угольных электродах. Впервые было показано, что данный механизм справедлив в отношении множественных форм лакказ, выделенных из одного штамма базидиомицета.

Исследование кинетических характеристик Lei и Lc2 позволило выявить некоторые различия в кинетических параметрах данных ферментов (Таблица 2). Наблюдались значительные различия эффективности каталитического окисления и сродства к разным субстратам Lei и Lc2 несмотря на их принадлежность к одной окислительно-восстановительной группе -высокоредокс-потенциальных лакказ. Это может служить примером усложнения регуляции процесса деградации лигнина. Например, низкое сродство при высокой специфичности системы (конститутивные формы Lc, подобно Lei и Lc2 базидиомицета Т pubescens) необходимо при наличии низкого уровня субстрата. В то время как высокое сродство при низкой специфичности системы (индуцируемые формы лакказ) необходимо в случае избытка субстрата. Таким образом, наличие множественных форм ферментов, вероятно, является необходимым эволюционным ответом на способность грибов белой гнили деградировать твердый жесткий субстрат (лигнин) в различных условиях окружающей среды, которые могут изменяться в течение жизненного цикла грибов.

На основании результатов масс-спектрометрических исследований можно предположить, что Lei и Lc2 представляют собой два продукта одного гена, т.е. являются конститутивными множественными формами одного фермента, которые образуются в результате пост-трансляционной модификации белка.

Интересно было также исследовать возможные взаимосвязи, возникающие между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиомицета Т. pubescens. Первоначально необходимо было ответить на вопрос: что может обеспечивать наличие синергетического действия основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиальных грибов?

Из литературных данных известно, что наличие ионов металлов (особенно, марганца, меди и железа) в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительно-восстановительных ферментов. Именно Mn (II) является основным субстратом MnP, а также может играть значительную роль в каталитическом цикле LiP. Недавние исследования показали, что Mn (II) является также нетипичным субстратом Les базидиальных грибов и может обеспечивать наличие кооперативного действия Le и МпР.

Мы предположили, что изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического комплекса (Le, LiP и МпР) на примере базидиомицета T. pubescens в присутствии ионов марганца, как природного медиатора, может помочь прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили. Как было показано, данный металл действительно может играть роль связующего звена между тремя основными ферментами лигнинолитического комплекса базидиального гриба T. pubescens.

Методом циклической вольтамперометрии доказана возможность протекания ферментативной реакции окисления ионов Mn (II) высокопотенциальными Les базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов (анионов органических кислот). Были определены условия протекания (насыщающая концентрация фермента и субстрата (Мп (II)), подобраны хелатирующие агенты и рН буферного раствора) и исследованы продукты данной реакции. Показано, что образование Мп3+-тартратного или Мп3+-оксалатного комплекса в ходе ферментативного окисления запускает цепь реакций, ведущих к возможному образованию супероксиданион-радикала, и, в конечном итоге, пероксида водорода.

Действительно, из литературных источников известно, что окисление анионов органических кислот (щавелевая, глиоксалевая и яблочная кислоты) ионами Mn(III) может являться одним из путей образования внеклеточного пероксида водорода. Например, установлена следующая последовательность реакций, протекающих при окислении щавелевой кислоты:

Mn* + СООН-СООН = Мп1+ + СО,' - + С02 + 2Н+

со2- + о2 = о2_+со2

02" + Мп2+ + 2ЕГ = Mn* + H2Oj

02+ ВТ = % н2о2 + У, о2

Пероксид водорода, в свою очередь, может участвовать в качестве окислительного субстрата для основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиальных грибов. Этот путь является одним из возможных путей образования внеклеточного пероксида водорода.

Таким образом, в настоящей работе мы подтвердили схему кооперации лакказы и МпР, предложенную ранее немецкой группой ученых [Schlosser and Hofer, 2002], дополнив и расширив ее на все основные ферменты лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. pubescens: Lc, LiP и МпР (Рисунок 6).

Рисунок 6. Предполагаемая схема взаимодействия основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Trameies pubescens (пояснения в тексте).

Наличие прочного комплекса, образуемого Ьс и 1лР (или МпР, в зависимости от условий культивирования), позволяет предположить следующую схему кооперации лигнинолитических ферментов базидиомицета Т. риЬе5сеп5. Ьс катализирует окисление ионов Мп2+ молекулярным кислородом в присутствии анионов органических кислот. В результате реакции образуется комплекс Мп(П1) с анионами органических кислот, который участвует в серии неферментатавных процессов, ведущих к образованию пероксида водорода. Последний, в свою очередь, может использоваться в качестве окислительного субстрата, как 1ЛР, так и МпР.

Кроме того, высокий редокс-потенциал хелатированной пары Мп2+/Мп3+ позволяет также непосредственно окислять нефенольные подструктуры лигнина, например, вератровый спирт, а в присутствии Ьс пара Мп2+/Мп3+ может выполнять роль усилителя действия фермента. Таким образом,

полученные данные позволяют говорить о существенно более важной роли Les в составе лигнинолитического комплекса при разрушении древесины, чем предполагалось ранее.

На заключительном этапе работы была показана принципиальная возможность использования лигнинолитических ферментов гриба T. pubescens в биотехнологии. Разработан амперометрический биосенсор на основе частично очищенного препарата культурального фильтрата гриба T. pubescens для определения соединений фенольной структуры, который имел более широкий линейный диапазон детекции для большинства использованных субстратов.

ВЫВОДЫ

1. Выделены в гомогенном состоянии и детально охарактеризованы две новые, ранее не описанные множественные формы лакказы базидиомицета Trametes pubescens Впервые получены в гомогенном состоянии и частично охарактеризованы лигнинпероксидаза и марганецпероксидаза базидиального гриба Trametes pubescens.

2. Показано сходство биохимических, спектральных и электрохимических характеристик лакказы 1 и лакказы 2 базидиомицета Trametes pubescens между собой и другими высокопотенциальными лакказами. Однако две множественные формы лакказы гриба Trametes pubescens имеют различное значение эффективности каталитического окисления и сродства к разным субстратам.

3. Электрохимически доказана возможность протекания реакции каталитического окисления ионов двухвалентного марганца высокопотенциальными лакказами базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов (анионов тартрата и оксалата). Предложена расширенная схема кооперации ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens.

4. На основе частично очищенного препарата культурального фильтрата базидиомицета Trametes pubescens разработан амперометрический биосенсор для определения соединений фенольной структуры, который имеет широкий линейный диапазон детекции для большинства использованных фенольных соединений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. Comparison of physico-chemical characteristics of four laceases from different basidiomycetes. (2004) Biochimie, 86, 693-703.

2. Никитина O.B., Шлеев C.B., Горшина E.C. Русинова T.B., Сереженков В.А., Бурбаев Д.Ш., Беловолова Л.В., Ярополов А.И. Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilât и исследование их свойств. (2005) Биохимия. Т. 70, вып. 11, с. 1548-1555.

3. Никитина О.В., Шлеев C.B., Горшина Е.С. Русинова Т.В., Ярополов А.И. Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнинолитических ферментов базидиального гриба Trametes pubescens. (2005) Вестн. Моск. Ун-та, Сер. 2. Химия. Т. 46, № 4, с. 272-278.

4. Никитина О.В., Шлеев C.B., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И. Лакказа базидиального гриба Trametes pubescens // Тезисы докладов международной конференции 8-ой Международной Пущинской Школы-Конференции "Биология - наука XXI века", 17-21 Май 2004, Пущино, Россия, С. 272.

5. Никитина О.В., Русинова Т.В., Шлеев C.B. Ионы двухвалентного марганца - нетипичный субстрат лакказы базидиального гриба Trametes pubescens // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2005». Секция «Химия», т. 1, 12 -15 апреля, Москва, 2005, С. 94.

6. Nikitina O.V., Shleev S.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V. and Yaropolov A.I. A role of Mn2+ in the function of ligninolytic enzymes from Trametes pubescens basidiomycete // International Conference Fundamentals & Applications "Biocatalysis - 2005", June, 19 - 23,2005, C. 95.

к исполнению 16/03/2006 Исполнено 17/03/2006

Заказ № 162 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

52.77

-5 2 77

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитина, Оксана Викторовна

СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 лигнинолитическая система базидиальных грибов.

1.1.1 Лигнинолитический комплекс грибов.

1.1.2 Множественные формы лигнинолитических ферментов.

1.1.3 Синергизм действия лигнинолитических ферментов, роль марганца в процессе деградации лигнина.

1.2 Основные ферменты лигнинолитического комплекса базидиомицетов.

1.2.1 Лакказа.

1.2.2 Лигнинпероксидаза.

1.2.3 Марганецпероксидаза.

1.3 Базидиальные грибы рода Trametes.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы и объекты исследования.

2.1.1 Штаммы микроорганизмов и ферменты.

2.1.2 Носители для хроматографии.

2.1.3 Реагенты.

2.2 Культивирование базидиомицета Trametes pubescens.

2.2.1 Культивирование на глюкозо-аммонийной среде.

2.2.2 Культивирование на мелассе.

2.3 Выделение и очистка ферментов.

2.4 Определение молекулярной массы и изоэлектрофокусирование.

2.5 Контроль активности ферментов.

2.5.1 Контроль активности лакказы.

2.5.2 Контроль активности лигнинпероксидазы.

2.5.3 Контроль активности марганецпероксидазы.

2.5.4 Определение активности целлобиозодегидрогеназы.

2.6 Кинетические измерения и рН-зависимость.

2.6.1 Регистрацш окисления ионов Мп2+ до Мп3+, катализируемого лакказой.

2.6.2 Исследование продуктов реакции окисления ионов Мп катализируемой лакказой.

2.7 Аналитические методы.

2.7.1 Определение концентрации белка.

2.7.2 Определение металлов.

2.7.3 Определение углеводной части лакказ.

2.8 Спектральные исследования.

2.9 Масс-спектроскопические исследования.

2.9.1 Расщепление белков.

2.9.2 MALDI-массспектроскопия.

2.9.3 Расчет данных.

2.10 Электрохимические исследования.

2.10.1 Приготовление электродов.

2.10.2 Циклические вольтамперометрические измерения.

2.10.3. Амперометрические исследования биосенсоров.

2.10.4 Определение окислитиельно-восстановителъного потенциала Т1 центра лакказы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens.

3.2. Физико-химические свойства ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета trametes pubescens.

3.2.1 Основные биохимические свойства ферментов.

3.2.2 Основные спектральные свойства ферментов.

3.3 Сравнительные исследования двух множественных форм лакказ базидиомицета trametes pubescens.

3.3.1 Исследование субстратной специфичности, рН-оптимума и стабильности двух форм лакказ.

3.3.2 Электрохимические исследования двух форм лакказ.

3.3.3 Масс-спектроскопические исследования двух форм лакказ.

3.4 Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиомицета trametes pubescens при деградации модельных соединений лигнина.

3.4.1 Ионы Мп2+ - нетрадиционный субстрат лакказы гриба Т. pubescens.

3.4.2 Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиомицета Trametes pubescens.

3.5 Разработка амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе частично очищенного препарата культурального фильтрата базидиомицета Trametes pubescens.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточные оксидоредуктазы лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes Pubescens (Schumach.) Pilat"

Актуальность проблемы. Среди огромного разнообразия грибов, колонизирующих в природе древесные субстраты, ксилотрофы составляют одну из наиболее изученных групп, обладающую значительной ролью в превращении отмирающей древесины в природе. Кроме того, эти грибы, особенно, возбудители белой гнили, традиционно рассматриваются и как источники разнообразных ферментов для трансформации древесины.

В последнее десятилетие большое число работ посвящено поиску и изучению новых штаммов базидиальных грибов - продуцентов лигнинолитических ферментов, и нахождению ферментов с новыми физико-химическими свойствами, что связано с широкими прикладными аспектами их использования. Например, получение биопластика, биотопливных элементов, биодеградации ксенобиотиков, производстве антимикробных средств, синтетических моющих и косметических средств, использовании ферментов в органическом синтезе, аналитических системах (биосенсоры и иммуноанализ), текстильной, пищевой и целлюлозно-бумажной промышленностях. Практический интерес к изучению ферментов обусловлен, прежде всего, их каталитическими характеристиками: активностью и специфичностью действия.

Известно, что лакказа является одним из основных ферментов лигнинолитического комплекса и продуцируется дереворазрушающими грибами, наиболее изученным из которых является базидиомицет Trametes versicolor. Однако, несмотря на значительное число публикаций, касающихся фундаментальных исследований этого фермента, роль лакказы в деградации лигнина до конца не ясна. Современные исследования базидиальных грибов в этой области показали, что лакказа в сочетании с другими ферментами лигнинолитического комплекса - марганецпероксидазой (МпР) или лигнинпероксидазой (UP), может выполнять существенно более значимые функции при деградации лигнина, чем простое окисление его фенольных подструктур [Higuchi, 2004; Shleev et. al., 2006].

В последние 20 лет в мире активно разрабатываются биотехнологические способы удаления лигнина с помощью дереворазрушающих грибов либо посредством лигнинразлагающих ферментов этих организмов. Особый интерес представляет проблема механизма регуляции активности лигнинолитических ферментов в грибах. Возможное ее решение, на наш взгляд, состоит в выделении отдельных ферментов лигнинолитического комплекса и выяснение роли каждого их них в составе данного ферментативного комплекса, исходя из результатов детального исследования свойств индивидуальных ферментов.

Состояние проблемы. Способность к глубокому разложению и усвоению лигнина встречается у грибов различных таксономических групп, в частности, у аскомицетов [Rodriguez et. al., 1997; Bergbauer and Newell, 1992], но особенно выражена она у базидиомицетов [Eriksson et. al., 1990; Palmieri et. al., 1993]. Внеклеточные ферментные системы этих грибов построены наиболее сложно и, как правило, включают спектр множественных форм оксидоредуктаз следующих трех основных структурных типов: гемм-содержащие, флавинсодержащие и медьсодержащие ферменты [Farmer et. al., 1960; Kuwahara et. al., 1984; Tien and Kirk, 1984; Kirk and Shimada, 1985; Kersten and Kierk, 1987; Bourbonnais and Paice, 1990; Болобова с соавт., 2002].

Для лигнинразрушающих грибов, например, Phanerochaete chrysosporium, Ceriporiopsis subvermispora и Trametes gallica, характерно образование множественных форм лакказ и других ключевых ферментов разрушения лигнина -МпР и LiP. Это явление образования множественных форм ферментов широко распространено среди лигнинолитических грибов, хотя его физиологическая роль до настоящего времени точно не установлена [Karahanian et. al., 1998; Larrondo et. al., 2003; Palmieri et. al., 2003]. По известному изоферментному составу можно успешно идентифицировать множество различных микроорганизмов, в частности грибов, таких как эктомикоризальные грибы [Sims et. al., 1999], дейтериомицеты [Buddie et. al., 1999] и базидиомицеты [Zervakis et. al., 2001].

Вызывает интерес также исследование возможных взаимосвязей, возникающих между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиальных грибов. Из литературных данных известно, что наличие ионов металлов переменной валентности в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительно-восстановительных ферментов. Особенно важным в этом отношении является наличие ионов марганца. Именно двухвалентный марганец является основным субстратом МпР, а также играет значительную роль в каталитическом цикле UP [Рорр et. al., 1990; Болобова с соавт., 2002].

Ранее было показано, что лакказа из базидиомицета Trametes versicolor катализирует окисление ионов Мп2+ до Мп3+в присутствии хелатирующего агента -Na-пирофосфата [Hofer and Schlosser, 1999]. Использование анионов оксалата и малоната в качестве комплексующих агентов ионов Мп3+ ведет к образованию супероксиданион радикала с последующим его превращением в пероксид водорода [Schlosser and Hofer, 2002]. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с лакказами из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов и изучение кооперативного действия лакказы с другими лигнинолитическими ферментами. Кроме того, изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического комплекса (лакказы, LiP и МпР) в присутствии ионов марганца, как природного редокс-медиатора, может прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили.

Базидиомицет Trametes (Coriolus) pubescens (Schumach.) Pilat может секретировать несколько внеклеточных ферментов, в частности: лакказу, пероксидазу и целлобиозодегидрогеназу [Galhaup et. al., 2001; Galhaup et. al., 2002; Ludwig et. al., 2004]. Он также известен как лекарственный гриб. Штамм Т. pubescens 923-2 является продуцентом биомассы - субстанции для получения биологически активной добавки. Из мицелия и плодовых тел Т. pubescens экстрагируют связанные с белками полисахариды с противоопухолевой и иммунизирующей активностями [Горшина с соавт., 2003]. После отделения биомассы фильтрат культуральной жидкости не используется, и потенциально он может служить источником внеклеточных ферментов.

Понимание роли лигнинолитических ферментов в процессе деградации лигнина, во-первых, открывает возможные пути оптимизации переработки этого полимера. Во-вторых, исследование множественных форм ферментов лигнинразрушающих грибов на примере базидиомицета Т. pubescens представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения метаболизма грибов белой гнили, так и с позиции применения данных микроорганизмов для получения ферментных препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств и закономерностей действия основных компонентов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. pubescens - лакказы, LiP и МпР. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- Разработка метода очистки и получение гомогенных препаратов основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Т. pubescens: лакказы, LiP и МпР.

- Изучение основных физико-химических свойств выделенных ферментов.

- Проведение сравнительных исследований множественных форм лакказ базидиомицета Т. pubescens.

- Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиального гриба Т. pubescens при деградации модельных соединений лигнина. Установление роли каталитического окисления ионов Мп2+ до Мп3+ лакказой в присутствии хелатирующих агентов в данном процессе.

- Разработка биосенсора на основе ферментного препарата лакказы из базидиомицета Т. pubescens.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Никитина, Оксана Викторовна

Выводы

1. Выделены в гомогенном состоянии и детально охарактеризованы две новые, ранее не описанные множественные формы лакказы базидиомицета Trametes pubescens. Впервые получены в гомогенном состоянии и частично охарактеризованы лигнинпероксидаза и марганецпероксидаза базидиального гриба Trametes pubescens.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитина, Оксана Викторовна, Москва

1. Беккер Е.Г., Синицын А.П. (1992) Выбор схем очистки ферментов лигнинолитического комплекса. Биохимия, 57,1519-1526.

2. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д. (1978) Биоэлектрокатализ, равновесный потенциал в присутствии лакказы. ДАН СССР, 240, 615-618.

3. Бирюков В.В., Битеева М.Б., Черкезов А.А., Ширшиков Н.В., Щеблыкин И.Н., Горшина Е.С., Осипова В.Г., Коваленко Н.В., Китайкин В.М., Зюкова Л.А. (2002) Способ получения белковой биомассы гриба. Патент РФ № 2186851, Бюл. №22.

4. Богдановская В.А., Гаврилова Е.Ф., Тарасевич М.Р. (1986) Влияние состояния углеродных сорбентов на активность иммобилизованных фенолоксидаз. Электрохимия, 22, 742-746.

5. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондращенко В.И., Рабинович М.Л. (2002) Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Книга II: Ферменты, модели, процессы. М.: Наука, 2002, 343 с.

6. Горшина Е.С. (2003) Глубинное культивирование базидиальных грибов рода Trametes Fr. с целью получения биологически активной биомассы. Дис. канд. биол. наук. М.: МГУИЭ, 194 с.

7. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Бирюков В.В. (2003) Технология получения биологически активной субстанции лекарственного гриба Кориола опушенного. Биотехнология, 2, 71-81.

8. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Высоцкий В.Г., Бару Р.В., Качалай Д.П. (2003а) Биотехнологический препарат лекарственного гриба Траметеса опушенного. В сборнике: Успехи современной микологии, Т. 1, 274-276. М.: Национальная академия микологии, 358 с.

9. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев С.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П. (2001) Выделение и изучение некоторых свойств лакказы из базидиомицета Cerena maxima. Биохимия, 66, 618-622.

10. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Наука, 1979,480 с.

11. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, 536 с.

12. Пулатова М.К., Рихирева Т.Т., Куроптева З.В. (1989). Электронный парамагнитный резонанс в молекулярной радиобиологии. Энергоатомиздат, Москва, с. 232.

13. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Кондращенко В.И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Книга I: Древесина и разрушающие ее грибы. М.: Наука, 2001, 264 с.

14. Степанова Е.В. (1999) Сравнительная характеристика лакказ высших гибов и возможность их практического применения. Дис. канд. биол. наук. М.: ИНБИ им. А.Н. Баха РАН, 172 с.

15. Тарасевич М.Р., Богдановская В.А., Фридман В.А, Кузнецова Л.Н. (2001) Кинетика и механизм электровосстановления Н202 на электродах, промотированных пероксидазой. Электрохимия, 37,12-20.

16. Шлеев С.В., Зайцева Е.А., Горшина Е.С., Морозова О.В., Сереженков В.А., Бурбаев Д.Ш., Кузнецов Б.А., Ярополов А.И. (2003) Спектральное и электрохимическое изучение лакказ базидиальных грибов. Вестник Московского Университета, Серия Химия, 44, 35-39.

17. Шлеев С.В., Хан Ир Г., Морозова О.В., Мажуго Ю.М., Халунина А.С., Ярополов А.И. (2004) Фенил-пиразолоны новй класс редокс-медиаторов оксидоредукгаз для леградации ксенобиотиков. Прикладная биохимия и микробиология, 40, 165-172.

18. Ярополов А.И. (1986) Кинетические закономерности действия биокатализаторов в электрохимических системах. Дис. докт. хим. наук. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, 357 с.

19. Ярополов А.И., Наки А., Пепанян Г.С., Саенко Е.Л., Варфоломеев С.Д. (1986) Механизм активации лакказы в предстационарной стадии реакции. Вестник Московского Университета, Серия 2, 27, 93-97.

20. Akhtar M., Blanchette R.A., Kirk Т.К. (1997) Fungal delignification and biomechanical pulping of wood. Adv. Biochem. Engin. Biotechnol., 57,160-193.

21. Allendorf M.D., Spira D.J., Solomon E.I. (1985) Low-temperature magnetic circular dichroism studies of native laccase: spectroscopic evidance for exogenous ligand bridging at a trinuclear copper active site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 30633067.

22. Andersson L.A., Renganathan V., Chiu A.A., Loehr T.M., Gold M.H. (1985) Spectral characterization of diarylpropane oxygenase, a novel peroxide-dependent, lignin-degrading heme enzyme. J. Biol. Chem., 260, 6080-6087.

23. Andersson L.A., Renganathan V„ Loehr T.M., Gold M.H. (1987) Lignin peroxidase: resonance Raman spectral evidence for compound II and for a temperature-dependent coordination-state equilibrium in the ferric enzyme. Biochemistry, 26, 22582263.

24. Balakshin M., Chen C.-L., Gratzl J.S., Kirkman A.G., Jakob H. (2001) Biobleaching of pulp with dioxygen in laccase-mediator system effect of variables on the reaction kinetics. J. Mol. Catal. B: Enzyme, 16, 205-215.

25. Baminger U., Ludwig R., Galhaup C., Leiner C., Kulbe K.D., Haltrich D. (2001) Continuous enzymatic regeneration of redox mediators used in biotransformation reactions employing flavoproteins. J. Mol. Cat. B. Enzym, 11, 541-550.

26. Band L., Bartalesi I., Ciofi-baffoni S., Tien M. (2003) Ufolding and pH studies on manganese peroxidase: role of heme and calcium on secondary structure stability. Biopolymers (Biospectroscopy), 72, 38 47.

27. Banci L., Ciofi-Baffoni S., Tien M. (1999) Lignin and Mn peroxidase-catalyzed oxidation of phenolic lignin oligomers. Biochemistry, 38, 3205 3210.

28. Bao W., Fukushima Y., Jensen Jr. К. A., Moen M. A., Hammel К. E. (1994) Oxidative degradation of non-phenolic lignin during lipid peroxidation by fungal manganese peroxidase. FEBS Lett., 354, 297 300.

29. Battistuzzi G., Borsari M., Loschi L., Menziani M.C., De Rienzo F., Sola M. (2001) Control of metalloprotein reduction potential: the role of electrostatic and salvation effects probed on plastocyanin mutants. Biochemistry, 40, 6422-6430.

30. Berezin I.V., Varfolomeev S.D. (1980) Bioelectrocatalysis as a new phenomen. In: Fronties et Bioorganic Chemistry and Molecular Biology. IUPAC, Edited by S.N. Ananchenko. Pergamon. Oxford, 467-473.

31. Bergbauer M., Newell S.Y. (1992) Contribution of lignocellulose degradation and DOS formation from a salt marsh macrophyte by the ascomycete Phaeosphaeria spartinicola. FEMS Microbiol. Ecol., 86, 341-348.

32. Bermek H., Li K., Eriksson K.E.-L. (1998) Laccase-less mutants of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus cannot de-lignify kraft pulp. J. Biotechnol., 66, 117124.

33. Blanchette R.A. (1984) Manganese accumulation in wood decayed by white-rot fungi. Phytopathology, 74,153-160.

34. Bollag J.-M., Leonowicz A. (1984) Comparative studies of extracellular fungal laccase. Appl. Environ. Microbiol., 48, 849-854.

35. Bonnen A.M., Anton I.H. and Orth A.B. (1994) Lignin-degrading enzymes of the commercial button mushroom, Agaricus bisporus. Appl. Environ. Microbiol., 60, 960965.

36. Bourbonnais R., Paice M.G. (1990) Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation. FEBS Lett., 267, 99-102.

37. Bourbonnais R., Paice M.G. (1992) Demethylation and delignification of kraft pulp by Trametes versicolor laccase in presence of 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate). Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 823-827.

38. Bourbonnais R., Rochefort D., Paice M.G., Renaud S., Leech D. (2000) Transition metal complexes: a new class of laccase mediators for pulp bleaching. Tappi J., 10, 68-69.

39. Boyle C.D., Kropp B.R., Reid I.D. (1992) Solubilization and mineralization of lignin by white rot fungi. Appl. Environ. Microbiol., 58, 3217-3224.

40. Broman L., Malmstrom B.G., Aasa R., Vanngard T. (1962) Quantitative electron spin resonance studies on native and denatured ceruloplasmin and laccase. J. Mol. Biol., 5, 301-310.

41. Buddie A.G., Martinez-Culebras P., Bridge P.D., Garcia M.D., Querol A., Cannon P.F., Monte E. (1999) Molecular characterization of Colletotrichum strains derived from strawberry. Mycol. Res., 103, 385-394.

42. Cai D.Y., Tien M. (1992) Kinetic studies on the formation and decomposition of compounds II and III. Reactions of lignin peroxidase. J. Biol. Chem., 267, 11149-11155.

43. Call H.P., Mucke I. (1997) History, overview and application of mediated lignolytic systems, especially laccase-mediator-system (LignozymR-process). J. Biotechnol., 53, 163-202.

44. Cheton P.L.-B., Archibald F.S. (1988) Manganese complex and the generation and scavenging of hydroxyl free radicals. Free Rad. Biol. Med., 5, 325-333.

45. Choi G.H., Larson T.G., Nuss D.L. (1992) Molecular analysis of the laccase gene from the chestnut blight fungus and selective suppression of its expression in an isogenic hypovirulent strain. Mol. Plant-Microbe Interact, 5,119-128.

46. Coassin M., Ursini F., Bindoli A. (1992) Antioxidant effect of manganese. Arh. Biochem. Biophys., 299, 330-333.

47. Cole J.L., Tan G.O., Yang E.K., Hogson K.O., Solomon E.I. (1990) Reactivity of the laccase trinuclear copper active-site with dioxygen. An X-ray absorption-edge study. J. Amer. Chem. Soc., 112, 2248- 2249.

48. D'Anniable A. (1997) The biodegradation of recalcitrant effluents from an olive mill by a white-rot fungus. J. Biotechnol., 61, 209-218.

49. De Souza C.G., Tychanowicz G.K., De Souza D.F., Peralta R.M. (2004) Production of laccase isoforms by Pleurotus pulmonarius in response to presence of phenolic and aromatic compounds. J. Basic Microbiol., 44.129-136.

50. Dedeyan В., Klonowska A., Tagger S., Tron Т., lacazio G., Gil G., Le Petit J. (2000) Biochemical and molecular characterization of a laccase from Marasmius quercophilus. Appl. Environ. Microbiol., 66, 925-929.

51. Dutton M.V., Evans C.S. (1996) Oxalate production by fungi: its role in pathogenicity and ecology in the soil environment. Can. J. Microbiol., 42, 881-895.

52. Eggert C., Temp U., Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. (1996) A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase. FEBS Lett., 391, 144-148.

53. Eggert C., Temp U„ Eriksson K.-E.L. (1997) Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. FEBS Lett., 407, 89-92.

54. Ehresmann В., Imbault P., Well J.H. (1973) Spectrophotometric determination of protein concentration in the cell extracts containing tRNA's. Analyt. Biochem., 54, 454463.

55. Eriksson K., Blanchette R.A., Ander P. (1990) Microbial ang enzymatic degradation of wood and wood components. New York: Springer Verlag, 230 p.

56. Falk K.E., Reinhammar B. (1972) Visible and near-infrared circular dichroism of some blue copper proteins. Biochim. Biophys. Acta, 285, 84-90.

57. Farell R.L., Murtagh K.E., Tien M., Mozuch M.D., Kirk Т.К. (1989) Physical and enzymatic properties of lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium. Enzyme Microb. Technol., 11, 322-328.

58. Farmer V.C., Henderson M.E.K., Russsel J.D. (1960) Aromatic-alcohol-oxidase activity in the growth medium of Polystictus versicolor. Biochem. J., 74, 257-262.

59. Farnet A.M., Criquet S., Tagger S., Gil G., Le-Petit J. (2000) Purification, parial characterization, and reactivity with aromatic compounds of two laccases from Marasmius quercophilus strain 17. Can. J. Microbiol., 46, 189-194.

60. Farnet A.-M., Tagger S., Petit J.L. (1999) Effects of copper and aromaric inducers on laccases of the white-rot fungus Marasmius quercophilus. Plant Biol. Pathol., 322, 499-503.

61. Forney L.J., Reddy C.A., Tien M., Aust S.D. (1982) The involvement of hydroxyl redical derived from hydrogen peroxide in lignin degradation by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. J. Biol. Chem., 257,11455-11462.

62. Forrester I.T., Grabski A.C., Burgess R.R., Leatham G.F. (1988) Manganese, Mn-dependent peroxidase, and the biodegradation of lignin. Biochem. Biophys. Res. Comm., 157, 992-999.

63. Galhaup C., Goller S., Peterbauer C.K., Strauss J., Haltrich D. (2002) Characterization of the major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology (UK), 148, 2159-2169.

64. Galhaup C., Haltrich D. (2001) Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper. Appl Microbiol Biotechnol., 56, 225-32.

65. Galliano H., Gas G., Seris J.L., Boudet A.M. (1991) Lignin degradation by Rigidoporus lignosus involves synergistic action of two oxidizing enzymes: Mn peroxidase and laccase. Enzyme Microb. Technol., 13, 478-482.

66. Glenn J.K., Akileswaran L., Gold M.H. (1986) Mn2+ oxidation is the principal function of the extracellular Mn-peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Arch. Biochem. Biophys., 251, 688 696.

67. Glenn J.K., Gold M.H. (1985) Purification and characterization of an extracellular Mn(ll)-dependent peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium. Arch. Bioche. Biophys., 242, 329-341.

68. Glumoff Т., Harvey P., Molinari S., Goble M., Frank G., Palmer J.M., Smith D.G., Leisola M.S.A. (1990) Lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Molecular and kinetic characterization of isozymes. Eur. J. Biochem., 187, 515-520.

69. Gold M.H., Kuwahara M., Chui A.A., Glenn J.K. (1984) Purification and characterization of an extracellular H202-requiring diarylpropane oxygenase from the white rot basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium. Arch. Biochem. Biophys., 234, 353-362.

70. Gorton L., Lindgren A., Larsson Т., Munteanu F.D., Ruzgas Т., Gazaryan I. (1999) Direct electron transfer between heme-containing enzymes and electrodes as basis for third generation biosensors. Anal. Chim. Acta, 400, 91-108.

71. Graziani, M.T., Morpurgo L., Rotilio, G., Mondovi B. (1976) Selective remuvel of type 2 copper from Rhus vernicifera laccase. FEBS Lett., 70, 87-90.

72. Green F., Hightly T.L. (1997) Mechanism of brown-rot decay: paradigm or paradox. Int. Biodeteriol. Biodegr., vol. 39. p. 113-124.

73. Guillen F., Martinez M.J., Munoz C., Martinez A.T. (1997) Quinone redox cycling in the ligninolytic fungus Pieurotus eryngii leading to extracellular production of superoxide anion radical. Arch. Biochem. Biophys., 339, 190-199.

74. Guillen F., Munoz C., Gomez-Toribio V., Martinez A.T., Martinez M.J. (2000) Oxygen activation during oxidation of methoxyhydroquinones by laccase from Pieurotus eryngii. Appl. Environ. Microbiol., 66,170-175.

75. Haemmerli S.D., Leisola M.S., Sangalard D., Fiechter A. (1986) Oxidation of benzo(a)pyrene by extracellular ligninasesof Phanerochaete chrysosporium. J. Biol. Chem.,261, 6900-6903.

76. Hakulinen N. Kiiskinen L.-L., Kruus K., Saloheimo M., Paananen A., Koivula A., Rouvinen J. (2002) Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat. Struct. Biol., 9, 601-605.

77. Hammel К., Kalyanaran В., Kirk Т. (1986) Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons and dibenzop.-dioxins by Phanerochaete chrysosporium ligninase. J. Biol. Chem., 261, 16948-16952.

78. Hammel K.E. Fungal degradation of lignin. (1997) In: Plant litter quality and decomposition., eds. G. Cadisch and K.E. Giller, CAB INTERNATIONAL, 33-45.

79. Hammel K.E., Jensen K.A., Mozuch M.D., Landucii L.L., Tien M., Pease E.A. (1993) Ligninolysis by a purified lignin peroxidase. J. Biol. Chem., 268, 12274-12281.

80. Hammel K.E., Mozuch M.D., Jensen K.A.Jr., Kesten P.J. (1994) H202 recycling during oxidation of the arylglycerol beta-aryl ether lignin structure by lignin peroxidase and glyoxal oxidase. Biochemistry, 33,13349-13354.

81. Hatakka A. (1994) Ligninolytic enzymes from selected white-rot fungi: production and role in lignin degradation. FEMS Microbiol. Rev., 13,125-135.

82. Hatakka A. Biodegradation of lignin. (2001) In: M. Hofrichter and A. Steinbtichel {eds) Lignin, Humic Substances and Coal. Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 1, 129-180.

83. Hatakka A.I., Kantelinen A., Tervila-Wilo A.L.M., Vikari L. (1987) Production of ligninases by Phlebia radiata in agitated conditions. In: Odier E. (ed.), Lignin: Enzymic and Microbial Degradation. Paris: INRA Publishers, 185-189.

84. Heinzkill M., Bech L., Halkier Т., Schneider P., Anke T. (1998) Characterization of laccases and peroxidases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Appl. Environ. Microbiol., 64,1601-1606.

85. Henriksson G., Johansson G., Pettersson G. (2000) A critical review of cellobiose dehydrogenases. J. Biotechnol., 78, 93-113.

86. Higuchi T. (1990) Lignin biochemistry: biosynthesis and biodegradation. Wood Sci. Technol., 24, 23-63.

87. Higuchi T. (2004) Microbial degradation of lignin: Role of lignin peroxidase, manganese peroxidase, and laccase. Proceedings of the Japan Academy, Series B: Physical and Biological Sciences, 80, 204-214

88. Hofer C„ Schlosser D. (1999) Novel enzymatic oxidation of Mn2+ to Mn3+ catalyzed by a fungal laccase. FEBS Lett., 451,1860190.

89. Hofrichter M., Ziegenhagen D., Vares Т., Friedrich M., Jager M.G., Fritsche W., Hatakka A. (1998) Oxidative decomposition of malonic asid as basis for the action of manganese proxidase in the absence of hydrogen peroxide. FEBS Lett., 434, 362-366.

90. Jensen K.A., Jr., Bao W., Kawai S., Srebotnik E., Hammel K.E. (1996) Manganese-dependent cleavage of nonphenolic lignin structures by Cereporiopsissubvermispora in the absence of lignin peroxidase. Appl. Environ. Microbiol., 62, 36793686.

91. Johansson Т., Nyman P.O. (1987) A manganese(ll)-dependent extracellular peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Acta Chem. Scand., B41, 762-765. !

92. Johansson Т., Nyman P.O. (1996) A cluster of genes encoding major isozymes of lignin peroxidase and manganese peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Gene, 170, 31-38.

93. Johnson D.L., Thompson J.L., Brinkmann S.M., Schuller K.A., Martin L.L. (2003) Electrochemical characterization of purified Rhus vernicifera laccase: voltammetric evidence for a sequential four-electron transfer. Biochemistry, 42,10229-10237.

94. Jong E.D., Field J.A., de Bont J.A.M. (1994) Aryl alcohols in the physiology of ligninolytic fungi. FEMS Microbiol. Rew., 13,153-188.

95. Kabsch W., Sander C. (1983) Dictionary of protein secondary structure: Pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopolymers, 22, 2577-2637.

96. Karahanian E., Corsini G., Lobos S., Vicuna R. (1998) Structure and expression of a laccase gene from the ligninolytic basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. Biochim. Biophys. Acta, 1443, 65-74.

97. Karamyshev A.V., Shleev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Y. (2003) Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline. Enzyme Microb. Technol., 33, 556-564.

98. Karhunen E„ Niku-Paavola M.-L., Viikari L., Haltia Т., Meer R. A. and Duine J. A. (1990) A novel combination of prosthetic groups in a fungal laccase; PQQ and two copper atoms. FEBS Let., 267, 6-8.

99. Kawai S., Umezawa Т., Higuchi T. (1988) Degradation mechanisms of phenolic C-1 lignin substructure model compounds by laccase of Coriolus versicolor. Arch. Biochem. Biophys., 262, 99-110.

100. Kersten P.J., Kierk Т.К. (1987) Involvement of a new enzyme, glyoxal oxidase in extracellular H2O2 production by Phanerochaete chrysosporium. J. Bacterid., 169, 21952201.

101. Khindaria A., Barr D.P., Aust S.D. (1995) Lignin peroxidase can also oxidize manganese. Biochemistry, 34, 7773-7779.

102. Khindaria A., Grover T.A., Aust S.D. (1994) Oxalate-dependent reductive activity of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Arh. Biochem. Biophys., 314, 301-306.

103. Klonowska A., Gaudin C., Asso M„ Fournel A., Reglier M., Tron T. (2005) LAC3, a new low redox potential laccase from Trametes sp. strain C30 obtained as a recombinant protein in yeast. Enz. Microb. Technol., 36, 34-41.

104. Klonowska A., Gaudin C., Fournel A., Asso M., Le Petit J., Giorgi M., Tron T. (2002) Characterization of a low redox potential laccase from the basidiomycete C30. Eur. J. Biochem., 269, 6119-6125,

105. Kojima Y., Tsukuda Y., Kawai Y., Tsukamoto A., Sugiura J., Sakaino M., Kita Y. (1990) Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus. J.Biol. Chem., 265, 15224-15230.

106. Kuan l.-C., Johnson K.A., Tien M. (1993) Kinetic analysis of manganese peroxidase. The reaction with manganese complexes. J. Biol. Chem., 268, 2006420070.

107. Kuan l.-C., Tien M. (1993) Stimulation of Mn peroxidase activity: a possible role for oxalate in lignin biodegradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,1242-1246.

108. Kuila D., Tien M., Fee J.A., Ondrias M.R. (1985) Resonance raman spectra of extracellular ligninase: evidence for a heme active site similar to those of peroxidases. Biochemistry, 24, 3394-3397.

109. Kuwahara M., Glenn J.K., Morgan M.A., Gold M.H. (1984) Separation and characterization of two extracellular H202-dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium. FEBS. Lett., 169, 247-250.

110. Larrondo L.F., Avila M., Salas L., Cullen D., Vicuna R. (2003) Heterologous expression of laccase cDNA from Ceriporiopsis subvermispora yields copper-activated apoprotein and complex isoform patterns. Microbiology, 149,1177-1182.

111. Larsson Т., Lindgren A.,.Ruzgas T. (2001) Spectroelectrochemical study of cellobiose dehydrogenase and diaphorase in a thiol-modified gold capillary in the absence of mediators. Bioelectrochemistry, 53, 243-249.

112. Leatham G., Stahman M.A. (1981) Studies on the laccase of Lentinus edodes: specificity, localization and association with the development of fruiting bodies. J. Gen Microbiol., 125, 147-157.

113. Lee C.W., Gray H.B., Anson F.C., Malmstrom B.G. (1984) Catalysis of the reduction of dioxygen at graphite electrodes coated with fungal laccase A. J. Electroanal. Chem., 172, 289-300.

114. Lee S.-K., DeBeer G.S., Antholine W.E., Hedman В., Hodgson K.O., Solomon E.I. (2002) Nature of the intermediate formed in the reduction of O2 to H2O at the trinuclear copper cluster active site in native laccase. J. Am. Chem. Soc., 124, 61806193.

115. Leonowicz A., Cho N.-S., Luterk J., Wilkolazka A., Wojtas-Wasilewska M., Matuszewska A., Hofrichter M., Wesenberg D., Rogalski J. (2001) Fungal laccase: properties and activity on lignin. J. Basic Microbiol., 41,185-227.

116. Leonowicz A., Trojanowski J., Orlicz B. (1978) Induction of laccase in Basidiomycetes: apparent activity of the inducible and constitutive forms of the enzyme with phenolic substrates. Acta Biochim. Pol., 25, 369-378.

117. Leontievsky A.A., Vares Т., Lankinen P., Shergill J.K., Pozdnyakova N.N., Myasoedova N.M., Kalkkinen N., Golovleva L.A., Cammack R., Thurston C.F., Hatakka A. (1997) Blue and yellow laccases of ligninolytic fungi. FEMS Microbiol. Lett., 156, 9-14.

118. Levin L., Forchiassin F., Ramos A. M. (2001) Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametes trogii. Rev Argent Microbiol., 33, 223-228.

119. Lindley P., Zaitseva I., Zaitsev V., Ralph A., Card G. (1996) The Structure of Human Ceruloplasmin at 3,0 A Resolution. The Beginning of the End of an Enigma. Biochemistry 1996, 35,109-109.

120. Liu S.X., Dong J.L., Zhang Y.Z. (2000) Analysis of laccase isozymes from Pleurotus osteatus. Si Chuan Da Xue Xue Bao (Natural Science Edition), 37, 769-771.

121. Ludwig R, Salamon A, Varga J, Zamocky M, Peterbauer CK, Kulbe KD, Haltrich D. (2004) Characterisation of cellobiose dehydrogenases from the white-rot fungi Trametes pubescens and Trametes villosa. Appl Microbiol Biotechnol, 64, 213-222.

122. Maganadze G.G., Shutyaev T.Yu. (1993) In: Laser Ionization Mass Analysis. Edited by Vertes A., Gijbels R. and Adams F. Chemical Analysis Series., 124, 505-549.

123. Maltseva O.V., Niku-Paavola M.-L., Leontievsky A.A., Mysoedova N.M., Golovleva L.A. (1991) Ligninolitical enzymes of the white-rot fungus Panus tigrinus. Biotechnol. Appl. Biochem., 13, 291-302.

124. Mansur M., Suarez Т., Fernandez-Larrea J.В., Brizuela M.A., Gonzalez A.E. (1997) Identification of a laccase gene family in the new lignin-degrading basidiomycete CECT 20197. Appl Environ Microbiol, 63, 2637-2646.

125. Marko-Varga, G., J. Emnes, T. Ruzgas and L. Gorton. (1995) Development of enzymebased amperometric sensors for the determination of phenolic compounds. Trends Anal. Chem., 14, 319-328.

126. Marzorati M., Danieli В., Haltrich D., Riva S. (2005) Selective laccase-mediated oxidation of sugars derivatives. Green Chemistry, 7, 310-315.

127. Marzullo L., Cannio R., Giardina P., Santini M.T., Sannia G. (1995) Veratryl alcohol oxidase from Pleurotus ostreatus participates in lignin biodegradation and prevents polymerization of laccase-oxidized substrates. J. Biol. Chem., 270, 3823-3827.

128. Mayer A.M., Staples R.C. (2002) Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry. 60, 551-565.

129. McMillin R., Eggleston M.K. (1998) Bioinorganic chemistry of laccase. Multi copper oxidases, 129-166

130. Messerschmidt A., Huber R. (1990) The blue oxidases: ascorbat oxidase, laccase and ceruloplasmin. Modelling and structural relationship. Eur. J. Biochem., 187, 341352.

131. Messerschmidt A., Ladenstein R., Huber R., Bolognesi M., Avigliano L„ Petruzzelli R., Rossi A., Finazzi-Agro A. (1992) Refined crystal structure of ascorbate oxidase at 1.9 A resolution. J. Mol. Biol., 224,179-205.

132. Mester Т., Ambert-Balay K., Ciofi-Baffoni S., Band L., Jones A.D., Tien M. (2001) Oxidation of a tetrameric nonphenolic lignin model compound by lignin peroxidase. J. Biol. Chem., 276, 22985-22990.

133. Min K.-L., Kim Y.-H., Kim Y.W., Jung H.S., Hah Y.C. (2001) Characterization of a novel laccase produced by the wood-rotting fungus Phellinus ribis. Arch. Biochem. Biophys., 392, 279-286.

134. Mino Y., Wariishi H., Blackburn N.J., Loerh T.M., Gold M.H. (1988) Spectral characterization of manganese peroxidase, an extracellular heme enzyme from the lignin-degrading basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium. J. Biol. Chem., 263, 7029-7036.

135. Munoz C., Gullen F., Martinez A.T. (1997) Induction and characterization of laccases in the ligninolytic fungus Pieurotus eryngii. Curr. Microbiol., 34, 1-5.

136. Naki A., Varfolomeev C.D. (1980) Inhibition mechanism of Poiiporus laccase by fluoride ion. FEBS Letter., 113,157-160

137. Niku-Paavola M.L., Karhunen E., Salola P., Raunio V. (1988) Ligninolytic enzymes of the white-rot fungus Phlebia radiate. Biochem. J., 254, 877-884.

138. Nishikimi M., Appaji Rao N., Yagi K. (1972) The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem. Biophys. Res. Com., 46, 849-854.

139. Orth A.B., Royse D.J., Tien M. (1993) Ubiquity of lignin-degrading peroxidase among various wood-degrading fungi. App. Environ. Microbiol., 59, 4017-4023.

140. Paice M., Bourbonnais R., Renaud S., Labonte S., Sacciadis G., Berry R., Amann M., Candussio A., Mueller R. (2002) Pilot plant bleaching trials with laccase and mediator. Prog. Biotechnol., 21, 203-211.

141. Palmieri G., Cennamo G., Faraco V., Amoresano A., Sannia G„ Giardina P. (2003) Atypical laccase isoenzymes from copper supplemented Pieurotus ostreatus cultures. Enz. Microb. Technol., 33, 220-230.

142. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Fontanelia В., Sannia G. (2000) Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol., 66, 920-924.

143. Palmieri G., Giardina P., Marzullo L., Desiderio В., Nitti G., Cannio R., Sannia G. (1993) Stability and activity of a phenol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 632-636.

144. Paszczynski A., Grawford R.L. Huynh V.-B. (1988) Manganese peroxidase from Phanerochaete chrisosporium: Purification. In: Methods Enzymol. Edited by Wood, W.A., Kellogg, S.T. AP: New York, 161, 264-271.

145. Paszczynski A., Huinh V.-B., Crawford F. (1986) Comparison of ligninase-l and peroxidase-M2 from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Arch. Biochem. Biophys., 244, 750-765.

146. Paszczynski A., Huynh V.-B., Crawford R.C. (1985) Comparison of ligninase-1 and peroxidase-M2 from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Arh. Biochem. Biophys., 244, 750-765.

147. Perie F.H., Gold M.H. (1991) Manganese regulation of manganese-peroxidase expression and lignin degradation by the white-rot fungus Dichomitus squalens. Appl. Environ. Microbiol., 57, 2240-2245.

148. Perry C.R., Smith M., Britnell C.H., Wood D.A., Thurston C.F. (1993) Identification of two laccase genes in the cultivated mushroom Agaricus bisporus. J. Gen. Micro., 139, 1209-1218.

149. Petersen L.C., Degn H. (1978) Steady state kinetics of laccase from Rhus vernicifera. Biochim. Biophys. Acta., 526, 85 92.

150. Pfister T.D., Gengenbach A.J., Syn S., Lu Yi. (2001) The role of redox-amino acids on compound I stability, substrate oxidation, and protein cross-linking in yeast cytochrome с peroxidase. Biochemistry, 40, 14942-14951.

151. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. (2002) Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1,90A resolution containing a full complement of coppers. J. Biol. Chem., 277, 37663-37669.

152. Pointing S.B., Jones E.B.G., Vrijmoed L.L.P. (2000) Optimization of laccase production of laccase production by Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture. Mycologia, 92,139-144.

153. Popp J.L., Kalyanaraman В., Kirk Т.К. (1990) Lignin peroxidase oxidation of Mn2+ in the presence of veratryl alcohol, malonic or oxalic acid, and oxygen. Biochemistry, 29, 10475-10480.

154. Reddy C.A. (1993) An overview of the recent advances on the physiology and molecular biology of lignin peroxidases of Phanerochaete chrysosporium. J. Biotechnol., 30, 91-107.

155. Reinhammar B. (1984) Laccase. In: Copper Proteins Copper Enzymes. Edited by R. Lontie. CRC Press, Boca Raton, Fla, 1-35.

156. Reinhammar В., Vanngard T.I. (1971) Electron-accepting sites in Rhus vernicifera laccase as studied by anaerobic oxidation-reduction titrations. Eur. J. Biochem., 18, 463-468.

157. Reinhammar B.R.M., (1972) Oxidation-reduction potentials of the electron acceptors in laccases and stellacyanin. Biochim. Biophys. Acta., 275, 245-259.

158. Reinhammer B. Malstrom B.G., (1981) "Blue" copper-containing oxidases. In: Copper proteins and metal ions in biology. Edited by T.G. Spiro. John Wiley & Sons, New York, 109-149.

159. Renganathan V., Gold M.H. (1986) Special characterization of the oxidized states of lignin peroxidase, an extracellular heme enzyme from the white rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Biochemistry, 25, 1626-1631.

160. Rochefort D., Bourbonnais R., Leech D., Paice M.G. (2002) Oxidation of lignin model compounds by organic and transition metal-based electron transfer mediators, Chem. Commun., 1182-1183.

161. Rodriguez J., Ferraz A., Nogueira R.F., Ferrer I., Esposito E., Duran N. (1997) Lignin biodegradation by the ascomycete Chrysonilia sitophila. Appl Biochem Biotechnol., 62, 233-242.

162. Rothschild N., Levkowitz A., Hadar Y., Dosoretz C. (1999) Extracellular mannose-6-phosphatase of Phanerochaete chrysosporium: a lignin peroxidase-modifying enzyme. Arch. Biochem. Biophys., 372,107-111.

163. Roy B.P., Achibald F. (1993) Effects of kraft pulp and lignin on Trametes versicolor carbon metabolism. Appl. Environ. Microbiol., 59,1855-1863.

164. Rulisek L., Solomon E.I., Ryde U. (2005) A combined quantum and molecular mechanical study of the O2 reductive cleavage in the catalytic cycle of multicopper oxidases. Inorganic Chemistry, 44, 5612-5628.

165. Ruttimann C., Schwember E., Salas L., Cullen D., Vicuna R. (1992) Ligninolytic enzymes of the white-rot basidiomycete Phlebia brevispora and Ceriporiopsis subvermispora. Biotech. Appl. Biochem., 16, 64-76.

166. Sack U., Hofrichter M„ Fritsche W. (1997) Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by manganese peroxidase of Nematoloma frowardii. FEMS Microbiol. Lett., 152, 227-234.

167. Salas С., Lobos S., Larrain J., Salas L., Cullen D., Vicuna R. (1995) Properties of laccase isoenzymes produced by the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. Biotechnol. Appl. Biochem., 21, 323-333.

168. Santussi R., Ferri Т., Morpurgo L., Savini I., Avigliano L. (1998) Unmediated heterogenious electron transport reaction of ascorbate oxidase and laccase at a gold electrode. Biochem. J., 332, 611-615.

169. Saparrat M.C.N., GuillenF., Arambarii A.M., Martinez A.T., Martinez M.J. (2002) Induction, isolation, and characterization of two laccases from the white rot basidiomycete Coriolopsis rigida. Appl. Environ. Microbiol., 68, 1534-1540.

170. Scheibner K., Hofrichter M. (1998) Conversion of aminonitrotoluenes by fungal manganese peroxidase. J. Basic Microbiol., 38, 51-59.

171. Schlosser D., and Hofer C. (2002) Laccase-catalyzed oxidation of Mn2+ in the presence of natural Mn3+ chelators as a novel source of extracellular H2O2 production and its impact on manganese peroxidase. Appl. Environ. Microbiol., 68, 3514-3521.

172. Schneegass lM Hofrichter M., Scheibner K., Fritsche W. (1997) Purification of the main manganese peroxidase isoenzyme MnP2 from the white-rot fungus Nematoloma frowardiiЫ9. Appl. Microbiol. Biotechnol., 48, 602-605.

173. Schneider P., Caspersen M.B., Mondorf K., Halkier Т., Skov L.K., 0stergaard P.R., Brown K.M., Brown S.H., Xu F. (1999) Characterization of a Coprinus cinereus laccase. Enzyme Microb. Technol., 25, 502-508.

174. Shah V., Nerud F. (2002) Lignin degrading system of white-rot fungi and its exploitation for dye decolorization. Can. J. Microbiol., 48, 857-870.

175. Shimada M., Higuchi L. (1983) Degradation of lignin. In: Wood and cellulosic chemistry. Edited by D.N.-S. Hon and N. Shiraishi. N.Y. and Basel: Marcek Dekker, 1991,525-591.

176. Shin K.-S., Lee Y.-J. (2000) Purification and characterization of a new member of the laccase family from the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus. Arch. Biochem. Biophys., 384, 109-115.

177. Shleev S., Christenson A., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A., Gorton L., Ruzgas T. (2005b) Electrochemical redox transformations of T1 and 12 copper sites in native Trametes hirsuta laccase at gold electrode. Biochem. J., 385, 745-754.

178. Shleev S., Jarosz-Wilkolazka A., Khalunina A., Morozova O., Yaropolov A., Ruzgas Т., Gorton L. (2005a) Direct heterogeneous electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes. Bioelectrochemistry, 67,115-124.

179. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Yu., Yaropolov A., Ruzgas Т., Gorton L. (2006) Interaction of fungal laccases and laccase-mediator systems with lignin. Enzyme and Microbial Technology, in press.

180. Shleev S., Reimann C.T., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A.I., Gorton L., Ruzgas T. (2006a) Autoreduction and aggregation of fungal laccase in solution phase: possible correlation with a resting form of laccase. Biochimie, in press

181. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas Т., Yaropolov A. I., Whittaker J., Gorton L. (2005) Direct electron transfer between copper containing proteins and electrodes. Biosens. Bioelectron., 20, 2517-2554.

182. Shuttleworth K.L., J.-M. Bollag. (1986) Soluble and immobilized laccase as catalysts for the transformation of substituted phenols. Enzyme Microb. Technol., 8,171177.

183. Sims K.P., Sen R., Watling R., Jeffries P. (1999) Species and population structure of Pisolithus and Scleroderma identified by combined phenotypic and genomic marker analysis. Mycol. Res., 103, 449-458.

184. Soden D.M., Dobson A.D.W. (2001) Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajor-caju. Microbiology, 147,1755-1763.

185. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin Т.Е. (1996) Multicopper oxidases and oxygenases. Chem. rev., 96, 2563-2605

186. Solomon E.I., Szilagyi R., George K., Serena D., Basumallick L. (2004) Electronic structures of metal sites in proteins and models: contributions to function in blue copper proteins. Chem. Rev., 104, 419-458.

187. Spira-Solomon D.J., Allendorf M.D., Solomon E.I. (1986) Low-temperature magnetic circular dichroism studies of native laccase: conformation of a trinuclear copper active site. J. Amer. Chem. Soc., 108, 5318-5328.

188. Srinivasan C., D'Souza T.M., Boominathan K., Reddy C.A. (1995) Demonstration of laccase in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. App. Environ. Microbiol., 61,4274-4277.

189. Staszczak M., Zdunek E.f Leonowicz A. (2000) Studies on the role of proteases in the white-rot fungus Trametes versicolor, effect of PMSF and chloroquine on ligninolytic enzymes activity. J. Basic. Microbiol., 40, 51-63.

190. Stephens P.J., Jollie D.R., Warshel A. (1996) Protein control of redox potentials of iron-sulfur proteins. Chem. rev., 96, 2491-2513.

191. Surma-Slusarska В., Leks-Stepien J. (2001) TCF bleaching of kraft pulps with laccase and xylanase. J. Wood Chem. Technol., 21, 361-370.

192. Sutherland G.R., Khindaria A., Aust S.D. (1996) The effect of veratryl alcohol on manganese oxidation by lignin peroxidase. Arch. Biochem. Biophys., 327, 20-26.

193. Sutherland G.R., Khindaria A., Chung N., Aust S.D. (1995) The effect of manganese on the oxidation of chemicals by lignin peroxidase. Biochemistry, 34, 1262412629.

194. Sutherland G.R.J., Schick Zapanta L., Tien M., Aust S.D. (1997) Role of calcium in maintaining the heme environment of manganese peroxidase. Biochemistry, 36, 3654-3662.

195. Szklarz G., Leonowicz A. (1986) Cooperation between fungal laccase and glucose oxidase in the degradation of lignin derivatives. Phytochemistry, 25, 2537-2539.

196. Takao S. (1965) Organic acid production by basidiomycetes. I. Screening of acid-producing strains. Eur. J. Appl. Microbiol., 13, 732-737.

197. Tampo Y., YonahaM. (1992) Antioxidant mechanism of Mn(ll) in phospholipids peroxidation. Free Rad. Biol. Med., 13,115-120.

198. Tang S.-P.W., Coleman J.E., Myer Y.P. (1968) Conformational studies of copper proteins. Pseudomonas blue protein and Polyporus laccase. J. Biol. Chem., 243, 42864297.

199. Tarasevich M.R., Yaropolov A.I., Bogdanovskaya V.A.6 Varfolomeev S.D. (1979) Electrocatalysis of a cathodic oxygen reduction by laccase. Bioelectrochem. Bioenerg., 6, 393-403.

200. Thurnston C.F. (1994) The structure and function of fungal laccases. Microbiol., 140, 19-26.

201. Tien M. (1987) Properties of ligninase from Phanerochaete chrysosporium and there possible applications. Crit. Rev. Microbiol., 15, 141-168.

202. Tien M., Kirk T. (1988) Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. In: Methods Enzymol., (Wood, W.A., Kellogg, S.T., ed.), Academic Press, N.Y., 161, 238249.

203. Tien M., Kirk Т.К. (1984) Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium: purification, characterization and catalytic properties of a unique H2O2-requiring oxygenase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 2280-2284.

204. Timofeevskii S.L., Reading N.S., Aust S.D. (1998) Mechanisms for protection of manganese peroxidase by hydrogen peroxide. Arch. Biochem. Biophys., 356, 287-295.

205. Tombs M.P., Akroy D.P. (1967) Akrylamide gel electrophoresis Shandon Instr. Appl., 18,1-16.

206. Tomsovsky M., Homolka L. (2003) Laccase and other ligninolytic enzyme activities of selected strains of Trametes spp. from different localities and substrates. Folia Microbiol (Praha), 48, 413-416.

207. Urzua U., Kersten P.J., Vicuna R. (1998) Manganese peroxidase-dependent oxidation of glyoxylic and oxalic acids synthesized by Ceriporiopsis subvermispora produces extracellular hydrogene peroxide. Appl. Environ. Microbiol., 64, 68-73.

208. Urzua U., Larrondo L.F., Lobos S., Larrain J., Vicuna R. (1995) Oxidation reactions catalyzed by manganese peroxidase isoenzymes from Ceriporiopsis subvermispora. FEBS Lett., 371, 132-136.

209. Vares Т., Kalsi M., Hatakka A. (1995) Lignin peroxidases, manganese peroxidases, and other ligninolytic enzymes produced by Phlebia radiata during solid-state fermentation of wheat straw. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3515-3520.

210. Vesterberg O., Svensson H. (1966) Isoelectric fractionation analysis and characterization of ampholytes innatural pH gradients IV. Further studies on the resolving in connection with separation of mioglobins. Acta Chem. Scand., 20, 820-834.

211. Wariishi H., Akileswaran L., Gold M.H. (1988) Manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium: spectral characterization of the oxidized states and the catalytic cycle. Biochemistry, 27, 5365-5370.

212. Wariishi H., Dunford H. В., MacDonald I. D., Gold M. H. (1989a) Manganese peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Transient state kinetics and reaction mechanism. J. Biol. Chem., 264, 3335-3340.

213. Wariishi H., Gold M.H. (1989) Lignin peroxidase compound III: formation, inactivation and conversion to the native enzyme. FEBS Lett., 243,165-168.

214. Wariishi H., Gold M.H. (1990) Lignin peroxidase compound III. Mechanism of formation and decomposition. J. Biol. Chem., 265, 2070-2077.

215. Wariishi H., Huang J., Dunford H.B., Gold M.H. (1991) Reaction of lignin peroxidase compounds I and II with veratrylalcohol. J. Biol. Chem., 266, 20694-20699.

216. Wariishi H., Renganathan V., Gold M.H. (1989b) Thiol-mediated oxidation of nonphenolic lignin model compounds by manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. J. Biol. Chem., 264, 14185-14191.

217. Wariishi H., Valli K., Gold M.H. (1992) Manganese(ll) oxidation by manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Kinetic mechanism and role of chelators. J. Biol. Chem., 267, 23688-23695.

218. Wong Y., Yu J. (1999) Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Water Res. 33, 3512-3520.

219. Xu F. (1997) Effects of redox potential and hydroxyl inhibition on the pH activity profile on fungal laccases. J. Biol. Chem., 272, 924-928.

220. Xu F., Berka R.M., Wahleithner J.A., Nelson B.A., Shuster J.R., Brown S.H., Palmer A.E., Solomon E.I. (1998) Site-directed mutations in fungal laccase: Effect on redox potential, activity and pH profile. Biochem. J., 334, 63-70.

221. Xu F., Kulys J.J., Duke K., Li K., Krikstopaitis K., Deussen H.J., Abbate E., Galinyte V., Schneider P. (2000) Redox chemistry in laccase-catalyzed oxidation of N-hydroxy compounds. Appl. Environ. Microbiol., 66, 2052-2056.

222. Xu F., Palmer A.E., Yaver D.S., Berka R.M., Gambetta G.A., Brown S.H., Solomon E.I. (1999) Targeted mutations in a Trametes villosa laccase, axial perturbations of the T1 copper. J. Biol. Chem., 274, 12372-12375.

223. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. (1995) Flow-injection analysis of phenols at a graphite electrode modified with co-immobilised lactase and tyrosinase. Anal. Chim. Acta, 308,137-144

224. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. (1996) Electrochemical properties of some copper-containing oxidases. Bioelectrochem. Bioenerg., 40, 49-57.

225. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeyev S.D. (1994) Laccase. Properties, catalytic mechanism, and applicability. Appl. Biochem. Biotechnol., 49, 257-280.

226. Yaver D.S., Golightly E.J. (1996) Cloning and characterization of three laccase genes from the white-rot basidiomycete Trametes villosa: genomic organization of the laccase gene family. Gene, 181, 95-102.

227. Zaitsev V., Zaitseva I., Card G., Bax В., Ralph A., Lindley P. (1996) The three-dimensional structure of human ceruloplasmin at 3,0A resolution. Fold. Design, 1, 71.

228. Zapanta L.S., Tien M. (1997) The roles of veratryl alcohol and oxalate in fungal lignin degradation. J. Biotechnol., 53, 93-102.

229. Проф. Курта Реймана (Лундский университет, Швеция) за проведение масс-спектрометрических экспериментов и помощь при обсуждении результатов.

230. Докторанта Андреаса Кристенсона (Лундский университет, Швеция) за помощь при проведении экспериментов по спектроэлектрохимическому редокс-титрованию лакказ.

231. Работа выполнена при поддержке ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРАКТА № 02.467.11.3004, гранта РФФИ (No. 03-04-48937), а также Федеральной Научно-Технической Программы Российского Минестерства Науки и Технологии (43.073.1.1.2505).

Информация о работе

Никитина, Оксана Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Внеклеточные оксидоредуктазы лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes Pubescens (Schumach.) Pilat - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы