Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз

Шлеев, Сергей Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз"

00461427а

Шлеев Сергей Валерьевич

Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз

Специальность 03.01.04 - «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва

2010

004614278

Работа выполнена в лаборатории химической этимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Ярополов Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Звягильская Рената Александровна

доктор химических наук, профессор Карякин Аркадий Аркадьевич

доктор химических наук, профессор Решетилов Анатолий Николаевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится «25» ноября 2010 г. в 15 час. на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, строение 2, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1.

Автореферат разослан октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Голубые медьсодержащие оксидазы (МСО), к которым относятся лакказа (1с), билирубиноксидаза (ВОх) и аскорбатоксвдаза (АОх), а также церулоплазмин (Ср), занимают особое место среди окислительно-восстановительных ферментов. Они обладают высокой удельной активностью и способностью к прямому восстановлению Ог до НгО без образования промежуточных высоко реакционно-способных токсичных интермедиатов кислорода Большой интерес, как в фундаментальном, так и прикладном плане, представляет субстратная специфичность этих ферментов, способных окислять широкий круг органических и неорганических соединений. Окисление органических соединений протекает по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен. Таким образом, МСО представляют большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований их структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра медьсодержащих оксидаз, в который входят ионы меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе каталитического акта одноэлекгронного окисления субстратов доноров электронов или атома водорода, позволяет осуществлять восстановление Ог непосредственно до НгО. Помимо этого, каталитические свойства МСО делают возможным их широкое использование в целлюлозно-бумажной, текстильной, пищевой и косметической промышленностях, а таже медицине. МСО используются для детоксикации и обесцвечивания сточных вод биодеградации ксенобиотиков, создания антимикробных композиций, получения древесноволокнистых плит, древесных блоков и картона без применения токсичных связующих, при производстве моющих средств и в клиническом анализе.

Интерес к практическому использованию МСО еще более возрх в середине 90-х годов XX века, после открытия возможности усиления действия этих ферментов с использованием различных редокс-медиаторов, что позволило существенно расширить область их практического применения. Медиаторы МСО представляют собой субстраты этих ферментов, в процессе окисления которых образуются высоко редокс-потенциальные и химически активные продукты. Последние могут вступать в реакцию с соединениями, которые не подвергаются окислению одними лишь оксидазами, или участвовать в переносе электронов в электрохимических реакциях, ускоряя электрохимические процессы с участием данных ферментов. Кроме того, в процессе окисления органических субстратов образуются свободные радикалы, которые могут модифицировать другие соединения. Значительный интерес представляет собой использование МСО в органическом синтезе. Показана возможность использования МСО для окисления первичных гидроксильных групп производных Сахаров, для синтеза винбластина и бензальдегидов.

Важным направлением практического использования данных ферментов является их применение в биоэлекгронике - новой области биотехнологии, сформировавшейся на стыке биологии и электроники и имеющей большое прикладное значение для медицины, высокотехнологичных производств и биокомпьютерных технологий. Основой для создания биосенсоров и биотопливных элементов может быть субстратная специфичность МСО, их высокая активность и стабильность, а также возможность протекания реакции прямого биоэлектрокатапиза.

Однако, до сих пор остается неясным детальный механизм функционирования и принципы регуляции активности данного класса ферментов.

Цель работы - установление механизма функционирования и регуляции активности МСО в гомогенных и гетерогенных биокаталитических системах с целью их обоснованного и рационального использования в биокаталитическом синтезе и системах биодеградации ксенобиотиков, для разработки устройств трансформации химической энергии в электрическую, а также для оптимизации электроаналитических сенсоров.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

1. Детально изучить биохимические и каталитические характеристики грибных, древесной и бактериальной Le с целью выбора наиболее перспективных ферментов для использования в различных биотехнологических процессах и биоэлектронных устройствах.

2. Разработать метод экологически чистого синтеза электропроводящего полианилина с участием высоко редокс-потенциальных Le.

3. Предложить стратегию отбора и исследования потенциальных редокс-медиаторов Le и провести апробацию пакказа-медиаторных систем (LMS) на практически значимых объектах.

4. Провести комплексное сравнительное спектральное и электрохимическое изучение МСО, включающее, в том числе, и разработку методов и подходов редокс-титрования микроколичеств белков с целью определения редокс-потенциалов их активных центров.

5. Предложить подходы для практического использования МСО в биосенсорах и биотопливных элементах.

6. Выяснить закономерности регуляции активности МСО на молекулярном уровне с использованием биохимических и электрохимических методов. Экспериментально показать "диод-" и "триод-подобные" свойства биоэлектрохимических устройств.

Научная новизна работы. На основании комплексного исследования основных биохимических и физико-химических свойств, субстратной специфичности и каталитических параметров грибных, бактериальной и древесной Le выявлены основные критерии отбора Le из различных таксономических групп для использования в биотехнологии. Детально изучены и систематизированы биоэлектрохимические свойства Le, ВОх и Ср. Предложены новые экспериментальные подходы для исследования активных центров МСО, в том числе разработаны уникальные макро и микро спектроэпектрохимические ячейки. С их использованием были определены значения редокс-потенциалов Т1 центров МСО, а также впервые установлены возможные значения потенциалов некоторых интермедиатов трехъядерного медного кластера ферментов. Сформулированы и экспериментально исследованы пути сопряжения ферментативных реакций МСО и электрохимических процессов с их участием. Комплексные физико-химические и биохимические исследования показали, что механизм и эффективность электронного переноса (ЭП) зависит от ориентации молекул фермента на поверхности электрода. Результаты исследования биохимических, физико-химических, спектральных и электрохимических свойств МСО, субстратной специфичности и механизма действия этих ферментов вносят свой вклад в понимание механизма гомогенного и гетерогенного катализа многоядерными медьсодержащими оксидазами. Теоретически обоснованы и экспериментально доказаны "диод-" и "триод-подобные" свойства высоко редокс-потенциальной грибной Trametes hirsuta Le. Высказано предположение о регуляторном значении открытых и исследованых "полупроводниковых" свойств МСО при функционировании данных ферментов в природе. Обнаружен новый класс редокс-медиаторов Le (усилителей действия фермента) с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 (РР). Подобраны и экпериментально подтверждены научно-обоснованные критерии отбора редокс-медиаторов Le для создания эффективных систем для обесчвечивания лигноцеллюлозы.

Впервые с участием высоко редокс-потенциальной грибной Le осуществлен синтез электропроводящего полианилина и изучены его физико-химические свойства. Практическая значимость. Решение поставленных задач позволило выяснить возможности, ограничения и перспективы использования голубых МСО в различных областях биотехнологии. На основе различных Le разработаны амперометрические биосенсоры для определения соединений фенольной структуры и водорастворимого литина. Сконструированы и охарактеризованы модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов, использующих в качестве топлива глюкозу, а в качестве окислителя - растворенный кислород. Предложена схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Le и экспериментальные методы их тестирования, что значительно облемает поиск новых медиаторов фермента. Ряд соединений класса РР отвечают многим требованиям, предъявляемым к усилителям действия ферментов, а именно высокая эффективность, низкая стоимость и экологическая чистота. Показана возможность использования этих соединений для отбеливания лигноцеллюлозы. В частности,

проведены лабораторные испытания LMS дпя делигнификации бумажной пульпы. Разработаны методы ферментативного синтеза электропроводного полианилина с различными свойствами, отвечающие требованиям «зеленой» химии. Положения, выдвигаемые на защиту:

• особенности механизмов гомогенного и гетерогенного катализа с участием высоко и низко редокс-потенциальных голубых МСО;

• биоэлектрохимические свойства голубых МСО, адсорбированных на электродах из различных материалов;

• обоснование "диод-" и "триод-подобных" свойств Lc;

• амперометрические биосенсоры на основе голубых МСО для определения соединений фенольной структуры и лигнина;

• модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов, использующих углеводы в качестве топлива и растворенный кислород в качестве окислителя;

• схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Lc и методы их тестирования;

• разработка методов синтеза электропроводящего псевдоводорастворимого, а также оптически активного полианилина.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 научных статьи, получено 4 российских патента. Данные диссертации суммированы в 4 обзорных статьях, а также включены в книгу "Электрохимия белков и нуклеиновых кислот", выпущенную издательством «Elsevier». Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на 17 российских и международных конференциях, конгрессах, симпозиумах, в том числе: на Международной конференции "Биокатализ-2002" (Москва, Россия, 2002), на Международной конференции "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2002), на XVII и XVIII Международных симпозиумах "Биоэлектрохимия и биоэнергетика" (Флоренция, Италия, 2003 и Коимбра, Португалия, 2005), на 8-ой Международной Пущинской Школе-Конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, Россия, 2004), на VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, Россия, 2004), на Международных конгрессах электрохимического общества (Квебек, Канада, 2005, Бусан, Корея, 2005kl Денвер, США, 2006), на IV Балтийской электрохимической конференции (Грейфсвальд, Германия, 2005), на II Международном Симпозиуме "Модификация поверхности дпя химического и биохимического распознавания" (Казимеш Долны, Польша, 2005), на Международной конференции "Электроанализ* (Бордо, Франция, 2006).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 322 страницах. Список цитируемой литературы включает 461 наименование. Иллюстративный материал содержит 110 рисунков и 26 таблиц.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, в развитии и проверке экспериментальных подходов, предложенных в работе, а также в обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Экспериментальная работа выполнена самим автором, а также сотрудниками, аспирантами и студентами под руководством автора. В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном участии в экспериментальной работе, в обсуждении полученных результатов и в оформлении их в виде публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из шести частей. В первой части описываются строение, свойства и каталитический механизм действия ферментов, относящихся

к МСО. Во второй части - основные факторы, определяющие окислительно-восстановительный потенциал этих ферментов. Третья, четвертая и пятая части обзора литературы посвящены описанию АОх, ВОх и Ср, соответственно. В шестой части рассматривается строение, свойства и каталитический механизм действия Le, а также представлено описание основных усилителей действия фермента и LMS. Помимо этого, рассмотрены возможности использования Le и LMS в биотехнологии,

Во второй главе представлены материалы и методы исследования, включая некоторые оригинальные методики автора с соавторами [Шлеев с соавт., 2000; Горшина с соавт., 2006а, 20066].

В работе использовали Le, выделенные из культурапьных жидкостей грибов Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Trametes pubescens, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrería maxima, а также частично очищенную Myceliophthora termophila Lc - коммерческий препарат фермента фирмы «Novozymes A/S» (Дания). В рамках совместных исследований были любезно предоставлены гомогенный препарат рекомбинантной Le М. thermophila (LT2), мутантные формы фермента 2В10, 7Н9,3D1,2Е9, и R2 (Др. Мигуэлем Алкаде, Испания), а также гомогенный препарат Сеггепа unicolor Lc (Проф. Дж Рогапьски, Польша). В работе были использованы частично очищенные препараты ВОх Myrothecium verrucaria (Amano 2) и Trachyderma tsunnodae (Amano 3), фирмы Amano Enzyme Ltd. (Япония). Дополнительная очистка препаратов до гомогенного состояния проводилась Др. Николасом Мано (Франция) в рамках совместных исследований. Частично очищенный препарат Rhus vernicifera Lc, который был любезно предоставлен проф. Бенгтом Рейнхаммером (Швеция), был дополнительно очищен до гомогенного по данным SDS-электрофореза состояния методом HPLC. Рекомбинантный бактериальный фермент Bacillus halodurans, а также Lc аскомицета Lamprospora wrigthii были любезно предоставлены проф. Диетмаром Халтрихом и Др. Роландом Людвигом (Австрия) в рамках выполнения совместных исследований. Помимо этого, в работе использовали Ср, выделенный из крови человека, - высокоочищенный препарат компании Sigma-Aldrich (США). Определение молекулярной массы Le проводили методом градиентного электрофореза в денатурирующих условиях. Содержание ионов меди определяли бихинолиновым методом [Broman et. al., 1962], а также методом лазерной масс-спектрометрии [Maganadze & Shutyaev, 1993]. Спектральные исследования Lc проводили с использованием спектрофотометра Coulter DU-650 («Beckman», Германия), спектрофлуофотометра RF-5301 PC («Shimadzu», Япония), ЭПР-спеетрометра ESC-106 («Bruker», Германия). Определение редокс-потенциала Т1 центра Lc осуществляли методом окислительно-восстановительного титрования, используя в качестве медиаторной пары октоцианомолибдат (IV) и (V) калия [Dutton, 1978; Xu et al., 1996b]. Определение редокс-потенциала Т1 центра ВОх осуществляли методом спектроэлектрохимического титрования в присутствии комплексов переходных металлов в качестве медиаторов [Christenson et al., 2006]. Определение pH-оптимума и каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых Lc, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей (медиаторов) Lc, проводили на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония). Спектры кругового дихроизма были записаны с использованием КД дихрографа FKD-2 (Россия). Круговой дихроизм Le и образцов полианилина измеряли в единицах ДА, как разность в поглощении лучей с левой и правой круговой поляризацией.

Для анализа продуктов окисления вератрового спирта (VA) LMS использовали метод гидрофобной обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени удерживания на колонке, их количество в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы "Мупьтихром" (Россия).

Электрохимические исследования осуществляли с использованием анализаторов CV 50W или CV 100W (BAS, США) работающих в трехэлектродном режиме (рабочий электроды -модифицированные и немодифицированные электроды на основе стеклоуглерода,

спектрального графита или золота; электроды сравнения - хлорсеребряный или каломельный электроды; вспомогательные электроды - платиновая проволока или золотая пластина).

Спектроэлектрохимические исследования МСО проводили с использованием макро [Шлеев с соавт., 2000] и микро [Larsson et al., 2001] ячеек объемом 1000 мкл и 1 мкл, соответственно.

Масс-спектроскопические исследования проводили с использованием лазер десорбционно-ионизирующей (MALDI) масс-спектрометрии на масс-спектрометрическом анализаторе "Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer" MALDI time-of-flight (TOF) (США). Гидролизаты белков также анализировали с использованием четырехполюсной ионной ловушки Bruker Esquire (Германия) в сочетании с нанораспылителем для их ионизации (ESI-QIT-MS анализ).

В третьей главе представлены результаты диссертационного исследования.

Выделение и основные физико-химические свойства лакказ из различных источников

[Королева с соавт., 2001; Шлеев с соавт., 2003; Shíeev et al., 2004b; Shleev et al., 2005b; Никитина с со asm., 2005; Shleev et al., 2006c; Shleev et a/., 2007a; Горбачева с соавт., 2008;

Морозова с соавт., 2007а; Горишна соавт., 2009а, 2009b] Были выделены в гомогенном состоянии Le из культуральной жидкости базидиальных грибов Т. hirsuta, Т. ochracea, Т. pubescens, С. fulvocinerea и С. maxima, основные биохимические характеристики которых представлены в Таблице 1. Как видно из таблицы, все изученные Le являются гликопротеинами, характеризуются оптимумом рН в интервале 3,5-5,2 (при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина), значения их изоэлектрических точек (pi) находятся в кислой области рН. Как и большинство описаных в литературе Le, эти ферменты содержат 4 иона меди на 1 молекулу белка. Необходимо отметить, что все ферменты обладают высокой стабильностью (сохраняют до 50% первоначальной активности через 52-65 часов инкубации при 50°С), что является важным условием для их использования в биотехнологических процессах, биосенсорах и биотопливных элементах.

Таблица 1. Некоторые биохимические характеристики пакказ

Мм, кДа р! рН-оптимум' Углеводы, % Ti/2**, Ч

Т. hirsuta 70 + 2 4,2 ±0.1 3,5-4,5 12 65

Т. ochracea 64 + 2 4,7 + 0.1 3,7-4,9 10 56

Т. pubescens 67 ±2 5,2 + 0.1 «4,0 13 >65

С. maxima 67 ±2 3,5 ±0.1 3,54,5 13 52

С. fulvocinerea 65 ±2 3,5 ±0.1 3,9-5,2 32 64

' При использовании в качестве субстрата-восстановителя пирокатехина " Время полуинактивации при 50°С

В таблице 2 представлены кинетические параметры реакций, катализируемых четырьмя Le для некоторых органических субстратов и ферроцианида калия. Как видно из таблицы, Г. hirsuta Le обладала наиболее высокими значениями каталитических констант по отношению к

органическим субстратам. В то же время, Le С. maxima показала наибольшее значение кш при

окислении K4Fe(CN)s.

Сравнение кинетических параметров реакций, катализируемых грибной Г. hirsuta и древесной Rhus vernicifera Le (Табл. 3) выявило высокое сродство и эффективность катализа для обеих Le по отношению к кислороду - природному акцептору электронов данных ферментов. Более того, показана линейная зависимость эффективности катализа, выраженная величиной 1д(/сВт/Км), от разности между редокс-потенциалами ионов меди Т1 центров ферментов и потенциалами субстратов. Последняя величина - разность потенциалов - является движущей силой реакции

переноса электронов от субстратов-доноров на фермент. Линейная зависимость эффективности ферментативного катализа от Д£(фермент-субстрат) указывает на внешнесферный механизм переноса электронов от субстратов на ион меди Т1 центра 1-е.

Оптимум рН для всех изученных грибных 1.С был приблизительно одинаков и находился в интервале рН 3,5-5,0 при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина (Табл. 1; Рис. 1А), а кривая зависимости активности ферментов от рН раствора имела колоколообразную форму. При использовании К4Ре(СМ)е активность ферментов монотонно падала при изменении рН раствора от 2,5 до 5,5 (Рис. 1Б). рН-профили активности всех изученных 1-е при использовании в качестве субстратов как органического, так и неорганического соединений не отличались от таковых для других 1_с, описанных в литературе.

Таблица 2. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами

Субстрат Т. hirsuta Т. ochracea С. maxima С. fulvocinerea

/fcat, С-1 Км, икМ /feat/ Км, икМ-1-с1 /feat, С"1 Кы, мкМ feat/Км, мкМ-1-с1 /feat, с-1 Км, мкМ /feat/ Км, мкМ-1'С"1 /feat, С"1 КМ, мкМ /fcat/Км, МКМ'1'С"1

пирокатехин 390 142 2,75 80 110 0,73 320 120 2,67 90 85 1,06

гваякол 430 63 6,83 90 90 1,00 300 160 1,88 95 70 1,36

синаповая кислота 580 24 24,17 170 11 15,45 330 24 13,75 140 21 6,67

Ю^С^б 400 180 2,22 150 96 1,56 450 115 3,91 130 170 0,76

" кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам

Таблица 3. Сравнение кинетических и термодинамических параметров реакций,

катализируемых грибной и растительной лакказами

Субстрат Потенциал, мВ Т. hirsuta Rhus vemicifera

/feat, С"1 Км, мкМ feat¡Км, МКМ'1'С"1 feat, С"1 Км, мкМ feat/Км, МКМ'1'С1

о2 940 13000" 150 86,67 1300* 200 6,50

K4[Mo(CN)8] 780 78 670 0,12 0 0 0

K4fFe(CN)6l 430 400 180 2,22 64 460 0,14

" литературные значения (Andreasson et. al., 1979; Cole et al., 1991; Matijosyte et al., 2008);

кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам

С точки зрения фундаментальных исследований большой интерес представляют структура МСО и механизм катализа. Активный центр 1.с содержит 4 иона меди, которые подразделяют на три типа по их спектральным характеристикам: Т1 центр, характеризующийся полосой оптического поглощения в области 600 нм и слабым сверхтонким расщеплениям в спектрах ЭПР; Т2 центр, невидимый на спектрах поглощения, но характеризующийся на спектрах ЭПР сверхтонким расщеплением; ТЗ центр -биядерный диамагнитный медный центр, который может быть идентифицирован на спектрах оптического поглощения по плечу в области 330 нм.

Спектры поглощения всех изученных в настоящей работе ферментов были типичными для МСО. В них присутствовали сигналы меди Т1 центра - пик поглощения на 610 нм и биядерного комплекса меди ТЗ - плечо в области 330 нм (например, Рис. 2).

Спектры ЭПР, характеризующие ионы меди Т1 и Т2 центров изученных грибных 1-е имели сходные характеристики (Рис. 3). На Рис. 4 представлены спектры возбуждения (I) и излучения (II) флуоресценции некоторых исследованных 1.С, записанные при комнатной температуре.

Возбуздение в области биядерного медного центра (330 нм) приводит к эмиссии при 432, 438, 436 и 443 нм для Т. hirsuta, Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima Le, соответственно. Необходимо отметить, что эти спектры не сильно различаются между собой и хорошо согласуются с литературными данными [Wynn et al., 1983; Shin et al., 2000].

Изучение вторичной структуры ферментов проводили с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Показано, что грибные Le имели незначительные отличия во вторичной структуре белка. На Рис. 5 представлены типичные КД-спекры двух форм Т. pubescens Le (Lc1 и Lc2).

40 -

зо -

20 ■

10 ■

о -2

120 100

40 20 О ■

3.5

Рисунок 1. Зависимость начальной скорости восстановления кислорода от рН реакционной смеси, при использовании в качестве субстрата пирокатехина (А) и K4[Fe(CN)6] (Б). 1 - Т. hirsuta; 2 - Т. ochracea', 3 - С. fulvocinerea", 4 -С. maxima.

Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, пирокатехин - 2 мМ, K4[Fc(CN)6] - 10 мМ.

РН

850 700 75D 800 650

Рисунок 2. Спектры оптического поглощения лакказ. 1 - Т. hirsuta', 2- Т. ochracea; 3 - С. maxima', 4 - С. fulvocinerea.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,0; концентрация ферментов около 1 мг/мл.

450 550 А, нм

Рисунок 3. ЭПР-спектры лакказ.

1 - Т. hirsuta, 2-Т. ochracea\ 3 - С. máxima, 4-С. fulvocinerea.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,0; концентрация ферментов около 1 мг/мл.

Рисунок 4, Спектры возбуждения (I) и излучения флуоресценции (II) лакказ. 1 - Т. hirsuta; 2 - Т. ochracea, 3 — С. maxima, 4 - С. fulvocinerea.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,0; концентрация ферментов около 1 мг/мл.

КД-спектры Lc были математически обработаны в области длин волн от 190 до 250 нм. Параметры вторичной структуры белков были рассчитаны с использованием компьютерной программы «Protein-CD», версия 1,5. Программа сравнивает КД-спектры интересующих нас ферментов с КД-спектрами имеющихся в базе данных белков. Результаты расчетов показали, что молекулы грибных Lc (Т. hirsuta, Т. ochracea, С. maxima, and С. fulvocinerea) содержат около 5% а-спиральных участков, 45% р-структуры, 20% изгибов и 35% представлено нерегулярной структурой.

Рисунок 5. КД-спекры двух множественных форм лакказы Т. pubescens, Lei и Lc2.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер (pH 6.0) t = 20°С

концентрация ферментов-0,1 мг/мл

Были проведены сравнительные исследования двух форм Le базидиомицета Т. pubescens и сделан вывод о значительном сходстве биохимических, физико-химических и кинетических свойств обеих форм Le. Для выяснения вопроса о том, являются ли выделенные ферменты продуктами одного гена, были проведены масс-спектроскопические исследования Lc1 и Lc2.

Анализ гидролизатов Lc1 и Lc2 методом MALDI в области масса/заряд (m/z) 500-5000 показал практически полное сходство аминокислотных последовательностей данных белков (Рис. 6). Исходя из этого, можно предположить, что выделенные ферменты Lc1 и Lc2 являются, скорее всего, продуктами одного гена, т.е. множественными формами одного и того же фермента. Следует отметить, что пять полученных пептидов Lc1 и Lc2 совпадали с описанными в литературе основными пептидами Trámeles versicolor Le. При этом аминокислотная последовательность Lc1 и Lc2 отличалась от данных, имеющихся в литературе по первичной структуре двух изоформ Т. pubescens Le (база данных NCBI, ААМ18408 и ААМ18407). Таким образом, выделенные нами ферменты являются новыми, ранее не описанными множественными формами Le Т. pubescens. Для сравнения был проведен аналогичный анализ Le Т. hirsuta. Продукты гидролиза этого фермента сильно отличались от таковых для Lei и Lc2 базидиомицета Т. pubescens Le.

В результате проведенных исследований были определены основные физико-химические характеристики ферментов и спектральные характеристики ионов меди, входящих в состав активного центра Lc, выделенных из различных источников. Показано сходство биохимических и спектральных параметров исследованных ферментов.

Поиск новых медиаторов лакказ и возможности их использования

/Бй/ееу е/ а/., 2003; Шпеев с соавт., 2004а; ЯЛ/ееу е? а/, 2006Ь; $Ьитако\пеЬ е/ а!., 2006;

Морозова с соавт., 20076] Первоначально медиаторами называли соединения - субстраты фермента, в результате окисления которых образовывались устойчивые высокопотенциальные продукты, способные вступать в химические неферментативные реакции с другими соединениями. При этом окисленный медиатор восстанавливался до первоначальной формы и таким образом формировался замкнутый цикл. Простейшая схема функционирования LMS представлена на

Рисунок 6. Суммарный масс-спектрометрический анализ продуктов гидролитического расщепления Lcl and Lc2.

Рис. 7.

Рисунок 7. Принцип функционирования LMS.

Оптимальный редокс-медиатор должен быть хорошим субстратом Le, его окисленная и восстановленная формы должны быть стабильны и не должны ингибировать ферментативную реакцию или инактивировать фермент, процесс его редокс-превращения должен быть циклическим. Соединения, которые в литературе называют медиаторами, на самом деле ими вообще не являются или их можно отнести к медиаторам с большой натяжкой. В первую очередь это связано с низкой стабильностью образующихся интермедиатов и, как следствие, низким числом редокс-циклов. В связи с этим в литературе появился термин «enhancer», т.е. усилитель действия фермента.

Принимая во внимание требования к редокс-медиаторам, была предложена схема отбора органических соединений - потенциальных медиаторов Le и экспериментальные методы их тестирования, включающая 4 стадии:

1. Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необходимости наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также -ОН и -NH2 групп.

2. Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомогенных ферментативных реакциях, катализируемых Le.

3. Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствие и в присутствии модельных соединений лигнина.

4. Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина LMS.

Первичный отбор соединений на основе их структуры Реакционная способность ароматических и гетероциклических соединений часто зависит от природы и положения заместителей. Влияние заместителей на окисление этих соединений определяется как электронными эффектами, так и стерическими факторами. Наша задача состояла в том, чтобы выбрать соединения для использования в LMS с наилучшими каталитическими параметрами в гомогенной ферментативной реакции и оптимальными характеристиками электрохимической реакции на электроде (значение редокс-потенциапа, обратимость реакции). При первичном отборе усилителей необходимо учитывать, что введение в структуру соединения тех или иных заместителей должно приводить к увеличению стабильности образующихся в результате реакции радикалов. Окисление соединений, в структуре которых присутствует гидроксильная группа, приводит к образованию нестабильных фенокси-радикалов, способных к реакции конденсации, а наличие аминогруппы вызывает димеризацию/полимеризацию промежуточных форм соединения. Электрон-донорные заместители (алкильная, фенильная и аминогруппы), увеличивая скорость окисления соединения и обеспечивая при этом стабильность образующихся радикалов, уменьшают его окислительно-восстановительный потенциал соединения. Электрон-акцепторные группы (например, карбоксильная или сульфо- группы), увеличивают окислительно-восстановительный потенциал соединения [Xu et al., 2001] и улучшают его растворимость в водных растворах. При отборе соединений в качестве усилителей действия Le необходимо принимать во внимание, что их редокс-потенциап должен быть выше 450 мВ [Bourbonnais et al., 2000], в противном случае они не могут принимать участие в окислении нефенольных подструктур лигнина.

В силу возможного масштабного коммерческого использования медиаторов, эти соединения должны быть доступны и иметь при этом низкую стоимость. Поиск нетоксичных гетероциклических соединений показал, что одним из наиболее перспективных классов органических соединений, которые могли бы использоваться в качестве медиаторов Le, являются соединения с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые производятся в промышленных масштабах и имеют низкую себестоимость (Рис. 8). Одним из наиболее известных соединений данного класса является метамизол натрия или анальгин (PPA-Na), который используется в медицинской практике в качестве обезболивающего средства. 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в своем составе два заместителя электрон-донорной природы - метальную и фенильную группы и присутствуют в растворе в виде двух таутомерных форм (Рис. 8).

Н3С н3с

с—сн2 с—сн

n^ Jíc__он Рисунок 8. Таутомерные превращения

фенилметилпиразолонов

Субстратная специфичность Были исследованы около двадцати соединений различной структуры, в том числе гетероциклических, >N-OH соединений и производных бензойной кислоты. Исследования гомогенных реакций с участием Т. hirsuta Le позволили отобрать соединения, которые могут являться усилителями фермента. Среди этих соединений выраженные субстратные свойства по отношению к Le обнаружены у 1-фенил-3-метилпиразолона-5 (РР), его сульфо- (mSPP и pSPP) и аминопроизводных (РРА и PPA-Na), а также у N-гидроксифталеимида (HPI) и 3-амино-(6-гидрокси)-бензойной кислоты (HABA). Структурные формулы этих соединений представлены на Рис. 9.

НА__ЧА._,

Ol Ol

РР pSPP mSPP

1-фенил-З- 1 -(4' -сульфофенил)- ЧЗ'-сульфофенил)-метшширазолон-5 З-ыетил-пиразолон-5 З-метил-пиразсшон-5

н3а_ин

гЛ

u J » О

N ОН

CHjSOjNa

РРА PPA-Na

1-фенил-2,3-диметил- 1-фенил-3-метил-4-мегиламино-4-аминопиразолон-5 пиразолон-5-М(4)-метансульфонат натрия

Рисунок 9.

Структурные формулы органических веществ - потенциальных медиаторов лакказ.

NH2

ЧГ

..j-S>

HPI HABA

N-гидроксифталеимид 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота

Исследование зависимости начальной скорости гомогенных ферментативных реакций от концентрации исследуемых соединений показало, что кинетика реакций описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Для оценки эффективности взаимодействия Lc с этими соединениями было проведено их сравнение с одним из лучших субстратов Lc - гидрохиноном (НО). Результаты представлены в Таблице 4. Как видно из Таблицы, производные РР с сульфогруппой в фенильном кольце (рБРР и тБРР), либо аминогруппой в гетероцикле (РРА), являются субстратами, сравнимыми по своим каталитическим константам с НО. Эффективность процесса ферментативного окисления РР намного ниже, что, возможно, связано с его гидрофобностью.

Введение в гетероцикл фенилметилпиразолона злектрон-донорных групп (аминогруппы в положение 4 и метильной группы в положение 2) увеличивает значение кш1К№ в случае РРА более чем в 18 раз по сравнению с PP. Однако, это значение в несколько раз меньше, чем для сульфо-производных фенилметилпиразолона. В случае PPA-Na, введение заместителей (метильной и метан-сульфоновой групп) в аминогруппу мало отражается на скорости ферментативной реакции, но значение Ки увеличивается более чем в 10 раз. Возможно, более слабое взаимодействие Le с PPA-Na объясняется проявлением стерического фактора.

Взаимодействие Le с HPI характеризуется низким сродством этого субстрата к ферменту и низкой скоростью реакции, a HABA является субстратом Le, сравнимым по своим кинетическим параметрам с HQ.

В отличие от производных фенилметилпиразолона, при высоких скоростях развертки потенциала система с HPI квазиобратима, что подтверждается наличием катодного пика на вольтамперограммах. Потенциал средней точки между катодным и анодным пиками равен 870 мВ, и его условно можно принять за редокс-потенциап этой пары. По-видимому, при низких скоростях развертки потенциала продукт, образующийся при окислении, недостаточно стабилен и не успевает восстановиться на электроде. Таким промежуточным продуктом может быть >N0' радикал, как это было показано для таких медиаторов, как НВТ и TEMPO [Bourbonnais et al., 1998; Xu et al., 2000; Fabbrini et al., 2002].

Описанные выше интермедиа™ субстратов Le образуются за счет их неферментативного окисления на электродах. Зависимость максимального анодного тока от квадратного корня из скорости развертки потенциала имеет линейный характер, что свидетельствует о том, что для всех исследованных соединений электродный процесс протекает в диффузионно-контролируемом режиме.

Таблица 4. Кинетические и электрохимические параметры субстратов лакказ

Соединение km, С"1 Км, м M (UKuym M-'c-1 Ev2, мВ Д///диф"

HQ 52,0 0,3 17,3 -20 -

pp. 9,7 2,1 0,46 430 0,2

mSPP 51,5 0,22 23,4 660 1,0

pSPP 43,9 0,29 15,0 570 0,8

РРА 35,1 0,41 8,66 410 550 0,7

PPA-Na 36,5 5,0 0,73 490 830 ...

НРГ 3,6 6,0 0,06 870 2,5

HABA 43,4 0,28 15,5 390 ...

Е«2 - потенциал полуволны окисления субстрата (скорость развертки потенциала 5 мВ/с); 1даФ - анодный ток окисления медиатора;

Д1 - прирост анодного тока при окислении медиатора (0,2 мМ) в присутствии УА (2 мМ). Примечания:

" Рабочие растворы содержали 2% этилового спирта "Определение Д1 и 1ДИф проводили при потенциале 1000 мВ

Потенциалы полувысоты анодного пика для всех изученных производных фенилметилпиразолона, а также для HPI и HABA, представлены в Таблице 4. Как и следовало

ожидать, потенциал полувысоты анодного пика зависел от природы заместителя в структуре фенилметилпиразолонов.

Рисунок 10. Циклические вольтамперные кривые тБРР и НР1.

Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный

буфер, рН 5,0; концентрация медиаторов - 0,2 мМ; скорость развертки потенциала: 1 - 5 мВ/с, 2 - 25 мВ/с, 3- 100мВ/с, 4 - 200мВ/с

Е, мВ отн. Ag/AgCl

Он увеличивался при введении электрон-акцепторной сульфогруппы в фенильное кольцо (mSPP и pSPP) и уменьшался при введении в гетероцикл злектрон-донорной аминогруппы (РРА).

Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей, в присутствии лакказы Trametes hirsuta

Были проведены дополнительные спектральные исследования продуктов гомогенного окисления двух соединений класса фенилметилпиразолонов - PPA-Na и mSPP в присутствии Т. hirsuta Le.

В случае PPA-Na спектры поглощения интермедиатов, образующихся в результате ферментативного окисления, зависели от соотношения концентраций медиатора и фермента в растворе (Рис. 11), что указывало на возможное образование нескольких промежуточных продуктов окисления медиатора.

Основываясь на электрохимических данных по гетерогенному окислению PPA-Na, можно предположить существование как минимум трех основных промежуточных продуктов ферментативного окисления данного субстрата (с потенциалами максимумов анодных пиков 290, 570, и 770 мВ).

При ферментативном окислении mSPP, по-видимому, образуются два интермедиата (Рис. 12). При этом продукт с максимумом поглощения при 340 нм является более высоко редокс-потенциальным, т.к. его формирование протекает на более поздней стадии ферментативной реакции. Можно предположить образование двух основных интермедиатов mSPP со значениями потенциалов 660 и 850 мВ, соответствующими максимумам поглощения при 270 и 340 нм, соответственно. При этом образование первого продукта при ферментативном окислении является быстрым процессом, в то время как образование второго продукта процесс более медленный. Похожее двухступенчатое поведение при ферментативном окислении было показано для ABTS, что позволяет предположить сходство механизмов ферментативного окисления обоих субстратов Le [Bourbonnais & Paice, 1990; Solís-Oba et al., 2005].

Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии медиаторов

Методом циклической вольтамперометрии было изучено взаимодействие отобранных соединений с модельным соединением лигнина - вератровым спиртом (VA).-Этот метод позволяет исследовать не только электродные процессы, но и сопряженные с ними химические реакции.

В качестве примера на Рис. 13 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах VA, медиаторов (mSPP, PPA-Na, HPI), а также смеси VA-медиатор. Необходимо отметить, что VA электрохимически не активен до потенциала 1000 мВ.

В присутствии mSPP (Рис. 13), а также pSPP и РРА, окисление VA происходит с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. На анодной ветви кривой наблюдается увеличение тока окисления в области потенциала 1000 мВ. В то же время, добавление VA к раствору PPA-Na не приводило к увеличению токов окисления (Рис. 13).

В присутствии УА в растворах НР1 наблюдалось значительное увеличение анодного тока в области потенциалов окисления НР1 и полное исчезновение тока восстановления на катодной ветви кривой (Рис. 13). Отсутствие катодного тока можно объяснить включением интермедиата электродного окисления НР1 в процесс химического окисления УА вблизи поверхности электрода. Химически восстановленный интермедиат вновь окислялся на электроде, давая увеличение анодного тока. При потенциале 910 мВ и скорости развертки потенциала 5 мВ/с анодный ток в присутствии УА увеличивался в 2,5 раза по сравнению с током в отсутствие УА (Рис. 13), что указывает на регенерацию восстановленной формы медиатора в результате каталитического окисления УА, и на повторное окисление НР1 на электроде.

я., нм

Рисунок 11. Изменение во времени спектров поглощения продуктов реакции, образующихся в процессе ферментативного окисления PPA-Na,

с участием лакказы Т. hirsuta при различных концентрациях медиатора и фермента.

I - исходный спектр; 2-1 мин; 3-10 мин; 4- 30 мин; 5-60 мин. Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, pH 5.0.

230 280 330 380 430

X, нм

Рисунок 12. Изменение во времени спектров поглощения продуктов реакции, образующихся в процессе ферментативного окисления mSPP с участием лакказы Т. hirsuta: 1 - исходный спектр; 2-10 мин; 3-30 мик. Условия: 0,1 М цигратно-фосфатный буфер, рН 5.0.

До потенциала 1000 мВ не наблюдалось ускорения электроокисления VA в присутствии низкопотенциального продукта электродного окисления HABA, редокс-потенциал которого составляет 390 мВ.

В Таблице 4 представлены соотношения прироста анодного тока в растворе, содержащем VA и медиатор, к диффузионному току окисления самого медиатора при потенциале 1000 мВ. Как видно из таблицы, эффективность электрокаталитического окисления VA возрастала с увеличением потенциала полуволны окисления усилителя. При взаимодействии с VA эффективными являлись соединения, имеющие потенциал полувысоты волны окисления выше 500 мВ.

mSPP

PPA-Na

HPI

1 -3

•6

-12 IJ "15 -18

-20

200 500 800 1100 200 500 800 1100 250 550 850 1150

E, mb (oth. Ag/AgCl)

Рисунок 13. Циклические вольтамперные кривые, зарегистрированные в растворах (1) медиатора (0.2 мМ); (2) вератрового спирта (2 мМ) и (5) смеси медиатора и вератрового спирта в тех же концентрациях

Условия-. 0.1 M цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0; скорость развертки потенциала 5 мВ/с

Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс усилитель фермента Для выяснения эффективности исследуемых медиаторов при деградации модельного соединения лигнина - VA, были проведены прямые эксперименты по окислению VA LMS в гомогенном растворе. Продукты окисления разделяли методом HPLC. Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени их удерживания на колонке. В качестве маркеров использовали VA, вератровый альдегид и вератровую кислоту, количество которых в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы "Мультихром" (Россия). Для оценки эффективности аналогичный эксперимент проводили с использованием ABTS в качестве медиатора.

При использовании системы Lc/HPI была достигнута высокая степень превращения VA, сравнимая со степенью окисления спирта в присутствии ABTS. Взаимодействие Le с гидроксифталеимидом характеризуется низкой скоростью реакции. Однако, как показали электрохимические исследования, образующийся при окислении катион-радикал, способен с довольно высокой скоростью окислять VA. Благодаря этому общая эффективность процесса деградации спирта системой Lc/HPI высока и составляет 70% превращения VA за 48 часов реакции. Иначе обстоит дело с системами Lc/PP. Как показали кинетические исследования (Табл. 4), Le с высокой скоростью катализирует окисление сульфолроизводных данного класса. Электрохимическими экспериментами было показано, что продукты окисления этих соединений нестабильны. Однако потенциал и время жизни продуктов окисления оказываются достаточными для того, чтобы окислить VA. Благодаря высокой скорости ферментативного окисления этих производных общая эффективность окисления VA системами Lc/mSPP или Lc/pSPP достаточно высока, в результате чего процент превращения спирта достигает, соответственно, 35% и 30% за 48 часов реакции. Более низкий по сравнению с ABTS процент деградации VA объясняется, по-видимому, слабой обратимостью процесса окисления этих производных фенилметилпиразолона.

Как и следовало ожидать на основании электрохимических исследований, в системе Lc/PPA-Na скорость окисления VA оказалась значительно ниже, чем при использовании сульфолроизводных PP. В то же время, при использовании PPA-Na окисление VA идет до соответствующей кислоты, в то время как большинство известных к настоящему времени медиаторов окисляют VA до вератрового альдегида [Bourbonnais, Paice, 1990]. По-видимому, несмотря на низкую скорость реакции окисления VA, высокопотенциальные интермедиаты PPA-Na, образующиеся в присутствии Le, способны к дальнейшему окислению вератрового альдегида до вератровой кислоты. Это хорошо согласуется с электрохимическими и спектральными результатами, полученными для PPA-Na.

Контрольные эксперименты показали, что в отсутствие Le исследуемые нами медиаторы практически не способны к окислению VA, также как и Le в отсутствие медиаторов окисляет менее 2% VA. Таким образом, производные РР могут использоваться в качестве усилителей действия Le.

Ферментативный синтез полианилина

[Ярополов с coaem., 2007,2008; Karamyshev et al., 2003; Vasil'eva et al., 2007] Полианилин является одним из наиболее важных электропроводящих полимеров в силу своей высокой химической стабильности, относительно высокой электропроводности, простоты получения и возможности изменять свои физико-химические характеристики при изменении температуры, рН раствора, электрического потенциала. Это обуславливает возможность использования электропроводящего полианилина в различных областях, таких как создание хемо- и биосенсоров, антистатических и антикоррозионных покрытий, в микроэлектронике и светоизлучающих устройствах, для разделения изомеров оптически активных соединений. В настоящей работе описываются ферментативный способ получения водной дисперсии наночастиц электропроводящего полианилина и полисульфокислоты, а также безматричный способ получения оптически активного полианилина.

В качестве катализатора реакции окислительной полимеризации мономера использовали высокоочищенные препараты Le из культурального фильтрата базидиального гриба Г. hirsuta. Использованная в работе Le является кислотостабильным ферментом, что важно при проведении ферментативного синтеза, осуществляемого при кислых значенях рН.

Матричный синтез интерполимерного комплекса наночастиц электропроводящего полианилина и супьфополистиропа Полимеризацию анилина проводили при комнатной температуре в присутствии сульфонированного полистирола как матрицы для синтеза полимера. Формирование продуктов реакции контролировали спектрофотометрически (Рис. 14). Варьировали следующие параметры синтеза: рН раствора, начальные концентрации фермента, анилина и сульфополистирола. Исследовались следующие параметры полученных образцов: строение полианилинов с использованием различных видов спектроскопии (Рис, 14), электрохимическая активность с использованием циклической вольтамперометрии, а также электропроводность синтезированных образцов. Показана возможность ферментативного получения водорастворимого электропроводящего полианилина, различающегося по основным свойствам в зависимости от условий синтеза.

Безматричный синтез оптически активного электропроводящего полианилина Использование оптически активного полианилина для создания HPLC сорбентов с целью разделения энантиомеров физиологически активных соединений представляет большой интерес. Поскольку дедопированный полианилин не имеет ассиметричных атомов углерода, оптическая активность полимера (спиралевидная конформация) индуцируется хирапьными допантами, среди которых наиболее часто используют энантиомеры сульфокамфорной кислоты (СКК).

Одной из практических задач настоящей работы являлась разработка простого, экологически чистого способа получения оптически активного полианилина. Поставленная задача была решена следующим способом: окислительную полимеризацию анилина проводили в присутствии хирального допанта (R- или S-сульфокамфорной кислот (СКК)) с использованием Т. hirsuta Le.

Ферментативный способ получения хирального полианилина протекает в одну стадию, является экологически чистым и позволяет получать полианилин не загрязненный продуктами восстановления окислителя. При значении рН около 2,8, которое было выбрано оптимальным для получения допированного полианилина, Le сохраняет -38% своей первоначальной активности после инкубации в течение 4 суток при температуре 20°С.

Были оптимизированы условия ферментативного синтеза путем варьирования концентраций реагентов (СКК и анилина от 0,025 М до 0,4 М) и их соотношений (от 1:5 до 5:1); концентрации дикислорода (0,025 тМ и 1 тМ), рН раствора (2,6+6,0); температуры (4°С и 20°С) и концентрации фермента (6'Ю-8 М и 1,6»10-7 М). Наилучшие результаты были получены при соотношении реагентов анилинхульфокамфорная кислота=1:1 и их концентраций в интервале 0,1+0,2 М.

При увеличении концентрации Ог в реакционной смеси по сравнению с раствором насыщенным воздухом, скорость полимеризации возрастает, но при этом несколько усложняется методика эксперимента. Поэтому все эксперименты, приведенные в настоящей работе, проводили на воздухе.

200 300 400 500 600 700 800 900

X, см"1

Рисунок 14. УФ-видимые (А) и ИК (Б) спекры комплекса сульфополистирол-полианилин

На рисунке 15 приведены УФ-видимые спектры полианилина, допированного S-CKK, синтезированного /л situ, при различных температурах. Видны четко выраженные полосы поглощения в области 750-800 нм, относящиеся к допированной форме полианилина и указывающие на наличие локализованного лолярона в структуре полимера.

Методом спектроскопии кругового дихроизма показана оптическая активность ферментативно синтезированного полимера (Рис. 16). Установлено, что спиралевидная конформация основной цепи полианилина является достаточно лабильной и знак оптической активности полимера можно изменить передопированием полученного образца другим энантиомером СКК.

еоо-

I а»-

о-«о-

-400 ■

Рисунок 16. КД-слсктры дисперсии ферментативно синтезированного оптически активного (хирального) полианилина в растворе диметилсульфоксида в присутствии: (1) - 8-СКК и (2) - И-СКК.

гя и зи <го «о ко sa б» X, нм

Комплексное сравнительное изучение медьсодержащих оксидаз

¡Шлеев с соавт., 2003; Shleev et al., 2004а, 2005b, 2005с, 2006(1,2007а, 2007b, 2008а, 2008b;

Ferapontova et al„ 2005; Pita et al., 2006; Christenson et at., 2004,2006; Yaropolov et al., 2007;

Nazaruk et at., 2007; Haghighi et al., 2007; Zumarraga et al., 2007, 2008a, 2008b; Горбачева с coaem., 2008; Vaz-Dom/nguez e( al., 2008; Ramirez et al., 2008; Haberska et al., 2009;

Ressine et al., 2010]

Определение окислительно-восстановительных потенциалов T1 центров МСО

Одной из основных характеристик МСО является стандартный окислительно-восстановительный потенциал Т1 центров ферментов. Значения этого потенциала варьируются у различных МСО от 430 до 1000 мВ отн. NHE [Solomon et al., 1996; Shleev et al., 2005b], T1 центр фермента является первичным акцептором электронов, поступающих от субстратов-восстановителей. Непосредственно МСО окисляют только те соединения, окислительно-восстановительный потенциал которых незначительно превышает редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента [Хи, 1997]. Кроме того, от редокс-потенциапа Т1 центра зависит эффективность катализа для большинства субстратов Lc, что делает МСО с высокими потенциалами Т1 центра весьма перспективными объектами для биотехнологических целей, например, для обесцвечивания бумажной пульпы, биоремедиации и деградации различных ксенобиотиков. Определение редокс-потенциапоа ионов меди первого типа было необходимо для выявления наиболее высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях окисления субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных интермедиатов, что весьма важно при проведении биотехнологических процессов. Более того, именно применение

высоко редокс-потенциальных МСО перспективно с точки зрения создания высокоэффективного биокатода топливных элементов.

Определение редокс-потенциалов Т1 центров МСО осуществляли методом потенциометрического титрования в присутствии редокс-медиатора(ов) с использованием разработанных микро и макро спектроэлектрохимических ячеек (Рис. 17).

На рисунке 18 представлены спектры поглощения растворов Т. hirsuta Le, записанных в процессе окислительно-восстановительного титрования с использованием редокс-пары [Mo(CN)8p-/[Mo(CN)a]4'. Аналогичные данные были получены при окислительно-восстановительном титровании Т. ochracea, С. fulvocinerea и С. maxima Le. Восстановление Т1 медного центра сопровождалось уменьшением пика поглощения в области 610 нм. Следует отметить, что редокс-потенциал системы в данном случае определялся соотношением окисленной и восстановленной форм медиатора.

Другим вариантом потенциометрического титрования в присутствии одного или нескольких редокс-медиаторов является метод электролиза смеси фермента и редокс-медиаторов. Для этой цели использовалась микро спектроэлектрохимическая ячейка с рабочим объемом около 7 мкл (Рис. 17А). Редокс-потенциал системы в данном случае определяется потенциалом, накладываемым на рабочий электрод, а медиатор служит лишь для ускорения достижения редокс-равновесия в системе. Данный метод позволяет значительно уменьшить количество медиатора, а также расширить возможную область потенциалов в процессе редокс-титрования.

А Б

Микро (рабочий объем 7 микролитров) Макро (рабочий объем 2000 микролитров) Т1 и ТЗ центры [УФ-ввдимая спектроскопия) Т1 и Т2 центры (УФ-видимая и ЭПР спектроскопия)

Рисунок 17. Спектроэлекгрохимические ячейки (А: 1 - вывод рабочего раствора; 2 и 3 - вспомогательные электроды; 4 - керамическая втулка; 5 -пластмассовая завинчивающаяся крышка; 6 - коническая муфта; 7 - пластиковое крестообразное основание;

8 - золотой рабочий электрод (капилляр); 9 - электрод сравнения; ] 0 - оптическое волокно.

Б; 1 - кварцевая кювета; 2 - плоский шлиф; 3 - зажим; 4 - ячейка для проведения электрохимических измерений; 5 - трубка ввода газа; 6 - кран; 7 - мешалка; 8 - платиновые электроды; 9 - трубка вывода газа и ввода веществ; 10 - простой шлиф; 11 - водяной затвор; 12 - капилляр;

13 - трубка для соединения рабочего раствора с электродом сравнения; 14 - трубка для шланга)

На рисунке 19 представлен пример использования данной методики при редокс-титровании двух множественных форм Г. pubescens Le с использованием редокс-пары [Mo(CN)s]3' /[MotCNje]4-. С помощью данной методики были определены окислительно-восстановительные потенциалы Т1 центров Cerrería unicolor Le, рекомбинантной U. thermophila Le (LT2), мутантов

фермента 2В10, 7Н9, 3D1, 2Е9, и R2, М. verrucaria и Т. tsunodae ВОх, а также Bacillus halodurans МСО.

Рисунок 18. Изменение спектров лакказы Т. hirsuta в процессе потенциометрического титрования с использованием редокс-пары [Mo(CN)8]37[MO(CN)8]j-.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер (рН 6.0) t = 20°С

1-7 мкМ лакказы и 2 мМ [Mo(CN)s]3' 2-6 - добавление [Mo(CN)8]4" до конечной концентрации 2 мМ

X, нм

450

Рисунок 19. Спектроэлектрохимическое окислительно-восстановительное титрование лакказ Trametespuhescens (А) Изменение спектра поглощения Lei в процессе редокс-титрования. 1 - 5 спектры поглощения фермента при потенциалах раствора 900, 800, 750, 700, и 600 мВ соответственно. Вставка: Кривые титровання Нернста Lei и Lc2 в логарифмических координатах. (Б) Спектроэлектрохимические кривые титрования, показывающие зависимость поглощения растворов Lc при 614 нм (отражающее окислительно-восстановительное состояние меди Т1), относительно редокс-потенциала среды.

Условия 0,022 мМ Lei и 0,018 мМ Lc2, 0.2 мМ K,Mo(CN)fl;

0.1 М фосфатный буфер, pH 6,5.

650 700 750 800 Е/мВ (отн. НВЭ)

Полученные данные о значении окислительно-восстановительных потенциалов Т1 центров МСО представлены в Таблице 5. Все изученные МСО относятся к высоко редокс-потенциальным ферментам и являются высокоактивными в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров. Дальнейшие электрохимические исследования и, проведенные в настоящей работе, представляют интерес для понимания механизма катализа и возможности испопьзования этих ферментов в гетерогенных биоэлектрокаталитических системах.

Таблица 5. Редокс-потенциалы Т1 центра голубых медьсодержащих оксидаз

МСО Потенциал Т1 центра, мВ отн. NHE

Trámeles ochracea Le 790 + 10

Trametes hirsuta Le 780 ±10

Trametes pubescens LAC1 746 ±5

Trametes pubescens LAC2 738 ±5

Coriolopsis fulvocinerea Le 780 + 20

Cerrera maxima Le 750 + 5

Cerrena unicolor le 750 ±10

Myceliophthora thermophila LT2 -690

Myceliophthora thermophila 2B10 -700

Myceliophthora thermophila 7H9 -700

Myceliophthora thermophila 3D1 -680

Myceliophthora thermophila 2E9 -630

Myceliophthora thermophila R2 -700

Myrothecium verrucaria BOx 670 ±10

Trachyderma tsunodae BOx >650

Bacillus halodurans бактериальная МСО 325 + 10

Редокс-титрование Т. hirsuta Le с одновременной детекцией сигнала Т1 центра посредством видимой и ЭПР спектроскопии, а также специфического сигнала Т2 центра в ЭПР спектре Le (Рис. 20) показало, что одно из возможных значений редокс-потенциала Т2/ТЗ кластера значительно ниже окислительно-восстановительного потенциала Т1 центра Le равного 780 мВ отн. NHE. При проведении данных экспериментов использовалась разработанная автором биоэлектрохимическая ячейка с параллельным спектрометрическим контролем исследуемого вещества (Рис. 17Б).

Редокс-титрование МСО в отсутствие медиаторов Уникальная конструкция микро-спектроэлектрохимической ячейки с общим объемом около 7 мкл (Рис. 17А) позволила провести окислительно-восстановительные титрования МСО, таких как Т. hirsuta Le, М. verrucaria ВОх, и Т. tsunodae ВОх, в отсутствие редокс-медиаторов. В данных экспериментах кривые титрования значительно отличались от кривых, представленных выше. Наличие четко выраженного гистерезиса в электрохимическом процессе показано для всех изученных МСО. Как видно из рисунков 21 и 22, ход окислительного титрования ферментов отличается от восстановительной ветви кривой титрования.

Используя модельный редокс-белок, азурин, который содержит в своей структуре лишь один ион меди типа 1, было показано, что данное явление связано не столько с отсутствием полного окислительно-восстановительного равновесия в системе, сколько с особыми свойствами МСО, имеющих в своем составе многоядерный медьсодержащий активный центр. Высказано предположение, что электронное поведение МСО, сходное с поведением диодов, а именно значительно различающаяся скорость электронного переноса в ходе окислительного и

восстановительного процессов, является внутренним свойством, присущим многим высоко редокс-потенциальным МСО. По-видимому, данное явление связано со специфической ориентацией белка на поверхности золотого рабочего электрода, а именно возможностью электронного контакта Т2/ТЗ центра ферментов и электрода (Рис. 22Б). Был сделан вывод о том, что одним из возможных редокс-потенциалов Т2ЯЗ центра высоко редокс-потенциальных МСО является значение близкое к 400 мВ отн. МНЕ. Анализ литературных данных, а также собственные результаты по электрохимическому поведению МСО на золотых и угольных электродах (см. ниже), подтвердили данное предположение.

X, нм

Рисунок 20. Изменение спектров поглощения (А) и ЭПР-спектров (Б) лакказы Т. hirsuta в процессе окислительно-восстановительное титрования с использованием различных редокс-медиаторов. Е - начальный спектр фермента

1 - 770 мВ ([Mo(CN)8]3V[Mo(CN)814")

2 - 450 мВ ([Fe(CN)6]37[Fe(CN)6n

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,5.

[тТ]

Рисунок 21. Спектроэлектрохимическое редокс-титрование билирубин оксидаз Myrothecium verrucaria и Trachyderma tsunodae с использованием микро спектроэлектрохимической ячейки. А и Б - кривые титрования отражающие зависимость поглощения раствора ферментов М verrucaria и Т. tsunodae от приложенного потенциала, соответсвенно.

В и Г - спектры поглощения ферментов М. verrucaria и Т. tsunodae в процессе титрования, соответственно.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0.

Н 0.5

4QC 500 S00 7X5 800 900 А, н.м

i е" е ш mv

.V Л

L ' - 3/ J rv

/ / ^ / J

| юлотой электрод

Рисунок 22. Спектроэлектрохимическое редокс-титрование лакказы Т. hirsuta с использованием микро спектроэлектрохимической ячейки. (А) Спектры поглощения лакказы в процессе титрования. Е - спектр нативного фермента, I -5 - спектры при потенциалах 20, 530, 830 и 1030 м В отн. НВЭ. (В) Кривые титрования, отражающие зависимость поглощения раствора фермента от приложенного потенциала. 1 - окислительная кривая титрования и 2 - восстановительная кривая титрования.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,5.

-100 100 300 ЫЮ до 900 1100

Е, чВ

Электрохимическое поведение МСО на золотых электродах Исследовано электрохимическое поведение Т. hirsuta, Т. ochracea и С. maxima Le, а также Т. tsunodae ВОх и человеческого Ср, адсорбированных на модифицированных и немодифицированных золотых электродах. Ср, адсорбированный на немодифицированных золотых электродах, также как электродах, модифицированных отрицательно и положительно заряженными тиолами, не обладал электрохимической активностью. Циклические вопьтамперограммы золотых электродов, модифицированных 4-аминотиофенолом, с иммобилизованным Ср в отсутствие редокс-медиаторов представлены на Рис. 23. Иммобилизация Ср на нейтральном слое аминофенола приводила к появлению электрохимической активности фермента, а именно неярко выраженного анодного пика со значением потенциала около 750 мВ отн. NHE. Рассчитанная для одноэлектронного переноса концентрация белка составляла около 8 пмоль/см2 с учетом реальной поверхности золота, имеющей фактор шероховатости около 2. Высота анодного пика слабо зависела от концентрации растворенного Ог. Важно отметить полное отсутствие ускорения электрокаталитического процесса восстановления 02 церулоплазмином, иммобилизованным на модифицированных и немодифицированных золотых электродах.

Е, мВ

Рисунок 23. Циклические вольтамперограммы золотого электрода, модифицированного 4-аминотиофенолом, с иммобилизованным церулоплазмином

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4; стартовый потенциал - 1000 мВ; скорость развертки потенциала - 100 мВ/сск.

Дополнительные элипсометрические исследования адсорбции белка на тиол-модифицированной поверхности позволили расчитать реальную концентрацию Ср при его иммобилизации на 4-аминотиольном монослое (Рис. 24). С учетом молекулярного веса целовеческого Ср, 132 кДа, эта концентрация не превышала 2 пмоль/см2. Сходная ситуация, а именно проявление электрохимической активности без ускорения электровосстановления Ог в отсутствие редокс-медиаторов, наблюдалась и при электрохимическом изучении другой МСО - Г. ^илосГае ВОх, иммобилизованной на золотых электродах, модифицированных отрицательно заряженным монослоем тиола (Рис. 25А). При этом фермент, адсорбированный на немодифицированных золотых электродах, также как и на электродах, модифицированных положительно заряженным и нейтральным тиолами, не обладал электрохимической активностью. Широкие катодный и анодный пики (Рис. 25А) отражают электрохимическое восстановление и окисление ВОх, ковалентно связанной с поверхностью электрода. Потенциал средней точки фарадеевского процесса равен 360 мВ (отн. ШЕ), интервал между катодным и анодным пиком соответствует квазиобратимому электрохимическому процессу (56 мВ), рассчитанная поверхностная

концентрация фермента - около 10 пмоль/см2. Рассчитанная с использованием Marcus-DOS теории вольтамперометрическая кривая достаточно хорошо описывает Фарадеевский процесс

при значениях энергии реогранизации Т1 центра (^) 0,4-0,8 зВ и стандартной константы скорости гетерогенного ЭП {А:0) 0,3 с-1.

30 40

Время, мин

Рисунок 24. Адсорбция церулоплазмина на поверхности золота,

модифицированной 4-аминотиофенолом - количество адсорбированного фермента на единицу поверхности,

2 - толщина адсорбированного слоя.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,4.

Введение в буферный раствор кислорода, также как и ингибирование фторид-ионами адсорбированного фермента, не приводило к появлению значительной разницы в плотностях тока по сравнению с анаэробными условиями для электрода, поляризованного при потенциале +500 мВ (Рис. 25А, вставка). При этом, добавление Kj[Fe(CN)6], эффективного медиатора, осуществляющего ЭП независимо от ориентации фермента на поверхности электрода, приводило к появлению ярко выраженного процесса ускорения электрокаталитического восстановления Ог (Рис. 25Б). Аналогичные результаты были получены и для золотых электродов, модифицированных Т. hirsuta Le.

На рис. 26 представлена циклическая вольтамперограмма фермента, адсорбированного на немодифицированном золотом электроде. Потенциал средней точки фарадеевского процесса равен 480 мВ (отн. NHE), интервал между катодным и анодным пиком соответствует квазиобратимому электрохимическому процессу (100 мВ), поверхностная концентрация фермента, рассчитанная с учетом одноэлектронного переноса, - около 4 пмоль/см2. Данная концентрация фермента незначительно превышает количество Le на единицу поверхности, рассчитанную с учетом элипсометрических исследований (Рис. 27). Следует отметить практически полное отсутствие ускорения электровосстановления 02 Le, адсорбированной на немодифицированных золотых электродах в отсутствие редокс-медиаторов.

Введение в раствор ABTS приводило к ярко выраженному биоэлектрокатапитическому восстановлению Ог Le, адсорбированной на золотых электродах. Процесс контролировался как электрохимически (Рис. 28), так и спектрофотометрически с использованием микро спектроэлектрохимической ячейки (Рис. 29),

0,1 02 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

0.2 0.3 0,4 0.5 0.6 0,7

E, мВ

Рисунок 25. Электрохимическое поведение BOx иммобилизованной на золотом электроде, модифицированном монослоем меркаптолрогшоновой кислоты. (А) Циклические вольтамперограммы модифицированного золотого электрода в анаэробных условиях. 1 и 2 - в отсутствии и присутствии фермента, соответственно, 3 - вольтамперограмма, теоретические

расчитанная полученная с использованием Marcus-DOS теории электронного транспорта. Вставка: хроноамерометрическая кривая

электрода, поляризованного при потенциале 500 мВ отн. NHE в анаеробных и аеробных условиях, а также при добавлении 10 мМ F\ (Б) Вольтамперограммы ВОх-модифицированного золотого электрода в присутствии 2 мМ Кз|Те(СМ)б].

1 - буфер, насыщенный N2,2 - буфер насыщенный Ог, 3 - буфер, насыщенный Ог, с добавлением 10 мМ F".

Следует отметить, что активность адсорбированного фермента зависела от потенциала, приложенного к золотому электроду. Данное поведение фермента напоминает поведение полупроводниковых транзисторов, в которых скорость ЭП (плотность тока) между вводом и выводом устройства зависит от потенциала, приложенного к контрольному электроду (Рис. 30). По-видимому, низко редокс-потенциальный процесс, наблюдаемый при использовании золотых материалов, соответствует редокс-трансформации Т2ЯЗ кластера МСО за счет специфической ориентации белка на поверхности электрода. Важно также отметить, что активность 1с составляла около 50% при отсутствии потенциала (Рис. 30).

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,0.

Рисунок 26. Циклическая вольтамперограмма золотого капилярного электрода с адсорбированной лакказой Trámeles hirsuta.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер рН 5,3;

0,25 мМ 02, скорость развертки потенциала - 10 мВ/с, второе сканирование).

-50 1 50 350 550 750 950 1150

Е, мВ

'ft&fl »sN^vfc" 1

О 10 20 30 40 50 60 70

Время (мин)

Рисунок 27. Адсорбция лакказы Т. hirsuta на немодифицированной

золотой поверхности 1 - количество адсорбированного фермента на единицу поверхности, 2 - толщина адсорбированного слоя.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 5,3.

Время, сек

Рисунок 28. Амперометрические исследования окисления ABTS с участием лакказы Trametes hirsuta, адсорбированной на поверхности золотого капилярного

электрода. А) Хроноамперометрические кривые плоского золотого электрода с адсорбированным ферментом, записанные при потенциале 550 мВ, 500 мВ, и 450 мВ. Б) Зависимость скорости ферментативного окисления ABTS (выраженное в виде катодного тока) от приложенного потенциала.

Условия: 0,2 М фосфатный буфер, pH 5,2; 0,25 мМ 02.

400 450

Е, мВ

-100 100 300 500 700 900 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600

Е, мВ (отн. NHE) К НМ

Рисунок 29. Спектроэлектрохимичесике исследования окисления ABTS с участием лакказы Trametes hirsuta, адсорбированной на поверхности золотого капилярного электрода. А) Зависимость скорости ферментативного окисления ABTS (выраженная в виде разностей оптического поглощения при длине волны 419 нм) от

приложенного потенциала. Б) Изменение спектров поглощения раствора ABTS во времени при окислении субстрата кислородом в присутствии фермента.

золотой электрод

0 "I f т-,-,-,-.-.-1-.

100 200 30 Е, мВ (отн. NHE) 50 800 900

Условия: 0,2 М фосфатный

буфер, pH 5,2; 0,25 мМ 02.

Рисунок 30. А Схема переноса электрона между ионами меди лакказы Trametes и поверхностью золотого электрода. Трехмерная структура фермента смоделирована с использованием программы PyMol v. 0.99 на основе струтуры Trametes versicolor Le (PDB 1GYC). Белковая глобула

выделена зеленым цетом, ионы меди -синим, углеводная часть фермента - черным (ВЭП - внутримолекулярный электронный перенос).

Б) Изменение активности лакказы Т. hirsuta при окислении ABTS в зависимости от приложенного потенциала.

Е'тгггз » 680 mV

Е'тзяз ~ 400 mV

120

Для иммобилизации МСО также использовали свежесинтезированные золотые наночастицы различного размера, от 40 до 110 нм. В этом случае, в отличие от золотых макроэлектродов, удалось добиться ПЭП между золотой поверхностью и Т1 центром некоторых ферментов, в частности Т. hirsuta Le, что выражалось в биоэлектрокаталитической активности адсорбированных МСО, проявляющейся уже при высоких потенциалах близких к редокс-

потенциалу Т1 центра. Рассчитанная к0 в случае использования Т. hirsuta Le составляла около 0.5 с-'. Плотность тока биоэлектрокаталитического восстановления Ог варьировали (в зависимости от размера наночастиц, pH буферного раствора, и т.д.) в диапазоне от 5 до 30 мкА/см2.

Электрохимическое поседение МСО на электродах из углеродных материалов Методом циклической вольтамперометрии исследованы прямые (безмедиаторные) электрохимические реакции восстановления Ог с участием Т. hirsuta, Т. ochracea, Т. pubescens, С. fuivocinerea и С. maxima Le, нативной L. wrigthii Le, рекомбинантной М. thermophila (LT2) Le и мутантов фермента 2В10, 7Н9, 3D1, 2Е9, и R2, а также М. verrucaria ВОх, Т. tsunodae Box, человеческого Ср и бактериальной МСО Bacillus halodurans, адсорбированных на электродах из спектрального графита. В аэробных условиях на электродах из спектрального графита для всех исследованных ферментов показана возможность ПЭП с электрода на фермент. Для Г. hirsuta, Т. ochracea, С. fuivocinerea, Т. pubescens, С. maxima Le, а также бактериальной МСО В. halodurans, ПЭП сопровождался ускорением электрокаталитического восстановления Ог. На Рис. 31 представлены типичные циклические вольтамперограммы немодифицированных и модифицированных Le электродов из спектрального графита в насыщенных кислородом буферных растворах. При адсорбции на электродах, все Le сильно уменьшали перенапряжение реакции электровосстановления молекулярного 02 до Н20.

ISO 350 550 750 950

Е. мВ (отн NHE)

150 350 550 750 950

F. мВ (отн. NHE)

Рисунок 31.

Биоэлектрохимическое восстановление О2 на графитовых электродах немодифицированных и модифицированных лакказами

Т. ochreacm баЗИДИОМИЦеТОВ.

-50 150 350 550 750 950

Е. мВ (отн. NHE)

Условия: 0,1 М нитратно-фосфатный буфер, рН 3,0; скорость развертки потенциала -

О мВ/сек; стартовый потенциал - 1100 мВ.

3 350 550 750 950 1150

Е. мВ (отн NHE)

Необходимо отметить, что для С. /иЛ/ос/легеа Lc наблюдалась более низкая электрокаталитическая активность по сравнению с другими изученными ферментами базидиомицетов, в то время как ее активность в гомогенном растворе сравнима с активностью других Lc. Возможно, это объясняется высоким (32%) содержанием углеводов в С. Шоапегеа 1с

(Таблица 1), что может оказывать влияние на ориентацию молекул фермента на поверхности электрода, а также затруднять ЭП с электрода на Т1 центр фермента.

Как видно из рисунка 31, начало электровосстановления Ог на электродах, модифицированных Lc, находится в области 800 мВ, т.е. существует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов и началом реакции электровосстановления Ог на электроде. Такая же корреляция получена и для низко редокс-потенциальных растительной Lc и бактериальной МСО. При этом оптимум рН биокаталитической реакции восстановления Ог находится в сильно кислой области для Lc базидиомицетов и слабощелочной области для растительного и бактериального ферментов, что совпадает с оптимумами рН гомогенных реакций данных биокатализаторов.

Lc аскомицетов, например, дикого типа L wrigthii и рекомбинантная М. thermophila, не катализировали ускорение реакции электровосстановления Ог. При этом, на циклических вольтамперограммах ферментов регистрировались достаточно ярко выраженные редокс-процессы в области потенциалов 400 мВ отн. NHE.

Электрохимическое изучение Ср проводилось на модифицированных и немодифицированных электродах из спектрального графита. В качестве примера, на Рис. 32 представлены циклические вольтамперограммы электродов из спектрального графита с иммобилизованной смесью многостенных углеродных нанотрубок с Ср. На электродах из спектрального графита, модифицированных и немодифицированных многостенными и одностенными нанотрубками, всегда присутствовал фарадеевский процесс со значением потенциала средней точки около 380 мВ отн. NHE. Поверхностная концентрация фермента, рассчитанная с учетом одноэлектронного переноса, достигала 8 и 14 пмоль/см2 для катодного и анодного пика, соответственно, с учетом факторов шероховатости элетродов.

Наряду с квазиобратимым процессом, наблюдался катодный пик со значением потенциала около 580 мВ и рассчитанной поверхностной концентрацией Ср около 3 пмоль/см2. Использование многостенных карбоновых нанотрубок в качестве матрицы для иммобилизации фермента приводило к обнаружению высоко редокс-потенциапьного квазиобратимого процесса со значением потенциала средней точки около 690 мВ отн. NHE. Показана чувствительность обоих редокс-процессов к Ог, а именно исчезновение редокс-активности Ср в анаэробных условиях (Рис. 32). Однако, как и при использовании золотых электродов, ускорения реакции электровосстановления Ог адсорбированным Ср не наблюдалось.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Е. мВ

0.8 -0.6 0 4 Б / / \ ------air ......

i::

i « Н ■0.4 ■06

-0.8 J

Е. мВ

Рисунок 32. Циклические вольтамперограммы электродов из спектрального графита, модифицированных многостеночными кар боне р. 1.1 ми нанотрубками с адсорбированным церулоплазмином (скорость развертки потенциала - 100 мВ/сек; стартовый потенциал - 1000 мВ) А - исходные вольтамперные сигналы, Б - кривые за вычетом фона.

На циклических вольтамперограммах Т. tsunodae Box, адсорбированной на электроде из спектрального графита, в анаэробных условиях наблюдались низко и высоко редокс-

потенциальные симметричные пики с потенциалами средней точки фарадеевских процессов равными 390 мВ и 690 мВ отн. NHE, соотвественно (Рис. ЗЗА). Интервалы значений потенциалов между катодными и анодными пиками соответствовали квазиобратимым электрохимическим процессам, 73 мВ и 155 мВ. Рассчитанная поверхностная концентрация фермента - около 5 и 8 пмоль/см2 для низко и высоко редокс-потенциальных процессов, соотвественно. Смоделированная с использованием Marcus-DOS теории вольтамперометрическая кривая достаточно хорошо описывает оба фарадеевских процесса при значениях энергии реорганизации 0,4 - 0,8 эВ и стандартной константы скорости гетерогенного процесса 1,3 с-1 и 0,4 с-', соответственно.

Рисунок 33.

А) Циклические вольтамперограммы Г. 1зипо(1ае ВОх, адсорбированной на спектральном графите в анаэробных условиях. Скорость развертки потенциала -100 мВ/сек, 1 - исходная вольтамперограмма, 2 -вольтамперограммы за вычетом фоновых реакций без адсорбированного фермента (о - экспериментальные данные,

1 ----рассчитанная теоретически

вольтамперограмма).

ю о

^-10 Е £-20 S-

-30

-40

Б) Влияние скорости развертки потенциала электрода на вольтамперные кривые (за вычетом фона графитового электрода). 1-10 мВ/сек, 2-100 мВ/сек.

Условия: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0; стартовый потенциал - 1000 мВ.

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 Б, мВ

Введение в буферный раствор кислорода приводило к появлению ярко выраженного каталитического процесса, ингибирующегося фторид-ионами. Добавление Кз[Ре(С!%], эффективного медиатора, осуществляющего МЭП независимо от ориентации фермента на поверхности электрода, не приводило к значительному изменению плотностей тока. При относительно высоких скоростях развертки потенциала проявлялась вторая полуволна электровосстановления Ог (Рис. ЗЗБ). Начало первой и второй полуволн электровосстановления Ог находилось в четкой корреляции с редокс-потенциалами фарадеевских процессов, зарегистрированных в анаэробных условиях (Рис. 32А).

Разработка амперометрических биосенсоров первого и второго рода для определения лигнинов и фенольных соединений

(Шлеев с соавт., 20046; Ярополов с соавт., 2005; БЬ^ е? а/., 2006а; Над111дЫ е( а/., 2007)

А) Биосенсор первого рода для определения полифенольного комплекса вин Проведено определение общего содержания фенольных соединений по значению максимального тока кислородного электрода методом хроноамперометрии с использованием Т. hirsuta Le и тирозиназы. Показано, что в случае применения отдельных препаратов тирозиназы и Le наблюдалась прямая зависимость между предельным током электрода Кларка (величина, прямо пропорциональная содержанию кислорода) и содержанием фенолов, определенных методом Фолина-Чокальтеу. Однако максимальная разница ответов ячейки на количество окисляемых соединений составляла лишь около 8 нА (6,5% шкалы прибора). При этом разница в количестве фенольных соединений в образцах достаточно значительна. Совместное использование двух ферментов приводило к получению максимальной разницы тока до 20 нА (18,5% шкалы прибора), а также к значительно более четкой корреляции между значениями токов окисления и общего содержания полифенолов в образце. Это объясняется расширением субстратной специфичности окисляемых фенольных соединений при использовании двух ферментов что, соответственно, приводит к увеличению точности анализа. Построена калибровочная кривая зависимости концентрации кислорода в ячейке Кларка (при совместном использовании тирозиназы и Le) от общего содержания фенолов в красных винах. На основании полученных данных сделан вывод о принципиальной возможности использования биосенсора первого рода для определения полифенольного комплекса вин.

Б) Биосенсоры первого и второго родов для определения лигнинов на основе лакказы Т. hirsuta В отличие от биосенсора первого рода для определения полифенольного комплекса вин, в котором производилось прямое введение ферментов в исследуемые растворы, для определения концентрации лигнинов в структуру биосенсора был добавлен реактор с иммобилизованной Le (Рис. 34).

Рисунок 34. Схема биосенсора первого рода на основе кислородного электрода. 1 - ячейка, 2 - магнитный мешальник, 3 - мембрана, 4 - реактор с иммобилизованным« ферментами, 5 - тефлоновое кольцо, 6 - электрод типа Кларка.

Показано, что иммобилизация фермента с использованием глутарового альдегида приводила к сохранению 90% от первоначальной активности фермента. На Рис. 35 представлены калибровочные кривые биосенсора при определении Крафт и хвойного лигнинов. Зависимость ответа электрода Кларка имела линейный характер в диапазоне концентраций лигнина 0,01-0,15 мг/мл. Чувствительность биосенсора составляла 0,49 и 0,21 нА/мкг по отношению к Крафт и хвойному лигнинам, соответственно. Была исследована операционная и долговременная стабильности биосенсора с иммобилизованной Lc. Показана стабильность

сигнала устройства при проведении 20 анализов за день. Необходимо отметить, что биосенсор сохранял до 85% активности при проведении 70 анализов в течение 7 дней.

Основу биосенсора второго рода составлял электрод из спектрального графита с иммобилизованной путем физической адсорбции Т. hirsute Lc. Было исследовано поведение биосенсора в двух режимах: в замкнутой системе с перемешиванием и проточно-инжекционной системе. рН-оптимум обоих биосенсоров - около 5, оптимальный потенциал - около +150 мВ. В проточно-инжекционном режиме оптимум потока буфера составлял 0,6 мл/мин. При этом наблюдалось плавное увеличение отклика биосенсора при увеличении скорости потока от 0 до 0,6 мл/мин, что указывало на быструю кинетику реакций на поверхности электрода. В диапазоне 0,6 - 1,5 мл/мин отклик биосенсора оставался постоянным. В качестве рабочего режима была выбрана скорость потока буфера 1,4 мл/мин для предотвращения возможного засорения системы нерастворимыми частицами препаратов лигнина. На Рис. 355 представлены калибровочные кривые биосенсоров в замкнутой системе с перемешиванием и проточно-инжекционной системе при определении Крафт и хвойного лигнинов. Зависимость ответа электрода Кларка имела линейный характер в диапазоне концентраций 0,01-0,50 мг/мл для Крафт и 0,01-0,25 мг/мл для хвойного лигнинов. Чувствительность биосенсора составляла 3,31 и 0,75 нА/мкг для Крафт и хвойного лигнинов, соответственно. Была исследована операционная и долговременная стабильности биосенсора с иммобилизованной Lc. В обоих режимах показано сохранение ответа устройства при проведении 100 анализов в день. Биосенсор сохранял до 70% активности при проведении 30 анализов в течение 7 дней.

Концентрация лигнина (мг/мл) Рисунок 35. Калибровочные кривые определения Крафт и хвойного лигнинов. А) на основе электрода Кларка с использованием реактора с иммобилизованной лакказой Т. hirsuto.

Б) на основе спектрального графита с иммобилизованным ферментом в системе с перемешиванием (I) и в проточно-инжекционном режиме (II).

1 - Крафт лигнин, 2 - хвойный сульфатный лигнин.

Условия: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5,0.

В) Биосенсор второго рода для определения фенольных соединений на основе лакказы Т. hirsuta Был разработан амперометрический ферментный эпектрод на основе лакказы Т. hirsuta для определения фенольных соединений. Для иммобилизации фермента на поверхности стеклоуглеродного электрода использованы три вида полимерных материалов: положительно заряженный цетилэтилполиэтиленимин и отрицательно заряженные коммерческие препараты Nation и Eastman AQ 29D, Нижний предеп обнаружения модельных фенольных соединений, гидрохинона и пирокатехина, при соотношении сигнал/шум равном 3 в буферном растворе при

иммобилизации Le в мембране Nafran составлял 3,5х10"8 М и 5,0х10'8 М, соответственно. Наименьшим временем отклика обладали электроды с Le, иммобилизованной в мембранах Nation и Eastman AQ 29. Было показано, что операционную стабильность и стабильность при хранении (долговременную стабильность) можно значительно увеличить дополнительным включением в матрицы полимеров желатина, предотвращающего инактивацию фермента в результате модификации последнего свободно-радикальными продуктами окисления фенольных соединений. Разработанный биосенсор позволяет детектировать фенольные соединения в водных растворах при концентрациях ниже 1 мкМ.

Г) Биосенсор второго рода дпя определения фенольных соединений на основе частично очищенного ферментного препарата базидиомицета Т. pubescens

При создании биосенсора использовали частично очищенный ферментный препарат Т. pubescens Le. Оптимизацию амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата проводили с использованием пирокатехина в качестве модельного субстрата. В качестве рабочего электрода использовали спектральный графит с нанесенным на его поверхность ферментным препаратом. Детекцию осуществляли при потенциале рабочего электрода, соответствующем элеетровосстановлению продукта ферментативной реакции. Показано, что оптимальная концентрация ферментного препарата для адсорбции составляла около 100 мкг/мл. Воспроизводимость результатов для шести изготовленных ферментных электродов составляла приблизительно 88%, что хорошо согласуется с литературными данными для биосенсоров на основе Lc-модифицированных электродов.

Исследована зависимость отклика биосенсора от приложенного потенциала. Показано, что для потенциалов ниже +385 мВ величина тока не зависит от приложенного потенциала. В дальнейших экспериментах электровосстановление окисленных фенольных соединений проводили при потенциале +160 мВ, т.к. этот потенциал удобен для практического использования и оказывает наименьшее влияние на превращение различных соединений в комплексных системах. Наиболее интенсивный ответ биосенсора наблюдался при скорости потока 0,5 мл/мин. Изучение влияния рН буферного раствора на отклик биосенсора показало, что оптимальное значение рН для детекции пирокатехина составляло 5,0,

В оптимизированных условиях были определены амперометрические отклики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба Т. pubescens с использованием проточно-инжекционной системы дпя ряда фенольных соединений. Чувствительность, предел детекции, линейный динамический диапазон, а также коэффициент корреляции рассчитывали, используя уравнение Михаэлиса-Ментен для электрохимических систем. Результаты расчетов для некоторых соединений представлены в Таблице 6. Сравнивая полученные нами данные для электродов, модифицированных ферментными препаратами из базидиомицета Т. pubescens, с данными дпя электродов, модифицированных гомогенными препаратами Т. versicolor и Т. hirsuta Le, можно сделать вывод, что разработанный биосенсор обладал более широким линейным диапазоном детекции для большинства использованных фенольных соединений.

Таблица б. Характеристики амперометрического биосенсора на основе ферментного препарата базидиомицета Ггате(ез риЬевсепз по отношению к фенольным соединениям

Фенол ьное Линейный диапазон Предел детекции Коэффициент корреляции

соединение детекции (цМ) (ИМ) (г)

Фенол 1-25 17,1 0,991

Допамин 1-25 20,6 0,987

Гваякол 10-100 7,3 0,998

Пирокатехин 1-25 26,0 0,980

HQ 1-10 23,1 0,984

Разработка безмедиаторных биокатодов и биотопливных элементов

(Vaz-Dominguez et ai, 2008; Coman et al., 2008, 2010)

Принципиальная возможность создания достаточно стабильных и эффективных биокатодов на основе ПЭП показана выше. Прямая физическая адсорбция Le базидиомицетов, а также грибных ВОх на графитовых электродах, приводит к созданию простейших биокатодов с плотностью тока до 100 мкА/см2, работающих в диапазоне рН 3,0-8,0. Дальнейшее увеличение плотности тока, наряду со значительным улучшением долговременной и операционной стабильностей биокатода, было достигнуто ковалентной иммобилизацией Т. hirsuta Le на модифицированных поверхностях электродов для специфической ориентации молекул фермента. Для этой цели графитовые электроды модифицировались фенольными производными различной структуры, например 2-аминофенолом и аминофенилом (Рис. 36), с последующей ковалентной пришивкой Le за счет карбоксильных групп фермента. Данные биокатоды отличались повышенной операционной стабильностью (до 1 месяца работы при сохранении практически первоначальных параметров), отсутствием ингобирования фермента хлорид-ионами, а также плотностями тока до 650 мкА/см2.

Была разработана модель простого биотопливного элемента, основанного на явлении ПЭП в катодной и анодной реакциях (Рис. 37). Как описано выше, в нашем распоряжении имелись несколько биокатодов, активных в широком диапазоне рН. Принципиальной задачей настоящей работы была разработка простой, безмембранной, безмедиаторной модели глюкоза/02 утилизирующей биотопливной ячейки. Глюкозооксидаза - фермент, широко использующийся в биотопливных элементах в настоящее время. Однако, из-за отсутствия ярко выраженного ПЭП для фермента на немодифицированных поверхностях, большинство разработанных биоанодов включали в себя растворимые редокс-медиаторы или редокс-полимеры. Лишь в последнее время появились работы, описывающие эффективный ПЭП между глюкозооксидазой и модифицированными электродами с использованием достижений нанотехнологии. В связи с этим был использован другой биокатализатор - целлобиозодегидрогеназа (CDH), фермент, обладающий ферментативной активностью по отношению к широкому кругу углеводов, включая глюкозу. В состав фермента входят две простетические группы - флавинадениндинуклеотид и гем-группа. Последняя обеспечивает наличие ПЭП между активным центром фермента и анодом биотопливного элемента (Рис. 37).

лакказа

NHOH Ж.

НО^О

IX)

У//ШШ/Ш \У//}///,уЛ"/А ШЬШЬШ

лакказа

рн ОН ОН ОИ он

.N0, Х^О, Д^» „„ ,

ГТ С Т гт но и

и« ^Ч^ КС1 «М ^Ч^ NHSre.DC

•н шшт ш///м

Рисунок 36. Схема модификации электрода лакказой с использованием карбоновых электродов, модифицированных (А) аминофенилом и (Б) 2-аминофенолом.

Рисунок 37. Схема безмембранной глюкоза/Ог биотопливной ячейки на основе голубой медьсодержащей оксидазы и целлобиозодегидрогеназы, иммобилизованных на спектральном графите.

Использование СОН и МСО из различных источников позволило создать модели биотопливных ячеек, работающих как в кислых, так и нейтральных растворах, использующих различные углеводы, включая глюкозу, в качестве биотоплива. Основные параметры разработанных устройств представлены в Таблице 7.

Таблица 7. Основные характеристики моделей безмедиаторных безмембранных углевод/Ог биотопливных ячеек работающих в слабощелочных и кислых растворах

Строение биотопливного элемента Субстрат (5 мМ) Мощность (мкВт/см2) Напряжени в (В)

D. saubinetii CDHIT. hirsuta Le (pH 4,5) Глюкоза 5,0 0,50

Целлобиоза 11,5 0,55

Галактоза 15,1 0,55

С. thermophila CDH/Г. tsunodae BOx (pH 7,4) Глюкоза 4,0 0,40

Плазма крови 3,0 0,17

В четвертой главе представлено обсуждение результатов автора, а также анализ последних литературных данных по теме диссертации.

Широкое использование окислительно-восстановительных белков, редокс-ферментов и клеток, для создания чувствительных и селективных биосенсоров, высокоэффективных биотопливных элементов, а также открытие "полупроводниковых" свойств сложных оксилительно-восстановительных ферментов, привело к возникновению нового термина в биоэлектрохимии, "биоэлектроника" (Кай, 2006) - раздела, охватывающего фундаментальные и прикладные исследования различных биоэлектронных устройств. По принципу действия биоэлектронные устройства можно разделить на три типа, а именно устройства первого, второго, и третьего родов или, другими словами, поколений (Рис. 38).

Первого рода Второго рода Третьего рода

[Fe(CN)6]+- [Fe(CN)6]3"

[Fe(CN)6]<- [Fe(CN)6]3"

И,О {

Биокаталитический Биоэлекгрохимический

процесс

Рисунок 38. Классификация биоэлектронных устройств на основе голубых медьсодержащих оксидаз

Уникальность голубых МСО состоит в возможности создания на их основе всех трех видов (родов или поколений) устройств, таких как биосенсоры, биокатоды топливных элементов, "биодиоды" и "биотриоды". В настоящей работе на основе различных голубых МСО разработаны биосенсоры первого и второго рода для детекции различных фенольных соединений, высокоэффективные биокатоды третьего рода, работающие в средах различного состава и рН, а также показаны "полупроводниковые" свойства высоко редокс-потенциальных МСО.

Определение редокс-потенциалов Le аскомицетов, а также двух ВОх, позволило сделать вывод о возможном отсутствии класса средне редокс-потенциальных МСО. Показано, что вне зависимости от аксиального лиганда (метионин - М. verrucaria ВОх, лейцин - М. thermophila Le, фенилаланин - Т. tsunodae ВОх), редокс-потенциал Т1 центра грибных МСО находится в диапазоне 630-790 мВ отн. NHE (Таблица 5). Таким образом, грибные Le (как аскомицетов, так и базидиомицетов), а также грибные ВОх, являются высоко редокс-потенциапьными белками. При этом, древесные и бактериальные голубые МСО относятся к классу низко редокс-потенциальных ферментов, имеющих значения окислительно-восстановительного потенциала Т1 центров в диапазоне 325-450 мВ. По-видимому, широкая вариация редокс-потенциалов МСО обусловлена строением Т1 центра, прежде всего вариацией расстояний между ионом меди первого типа и соответствующими лигандами, а также сольватационным эффектом, и в гораздо меньшей степени, природой аксиального лиганда.

Большинство изученных в настоящей работе МСО (Le рода Trametes, Coriolopsis, Cerrería, и Myceliophthora, М. verrucaria и Т. tsunnodae ВОх), относятся к высоко редокс-потенциальным ферментам, и благодаря высокому редокс-потенциалу Т1 центра являются высокоактивными в гомогенных реакциях окисления различных субстратов. Высокая активность и стабильность МСО

является основой для практического использования голубых высоко редокс-потенциальных МСО в органическом синтезе, например, ферментативном синтезе электропроводящего полианилина с различными свойствами, а также процессах биодеградации ксенобиотиков, например, обесцвечивания лигноцеллюлозы.

Детальный анализ биохимических, спектральных и кинетических характеристик ферментов, а также элетрохимического поведения голубых МСО из различных источников, позволил предложить каталитические и молекулярные механизмы восстановления Ог высоко и низко редокс-потенциальными ферментами при гомогенном и гетерогенном катализе, схематически представленные на Рис. 39 и 40, соотвественно. В гомогенном растворе МСО катализируют окисление широкого круга субстратов, и их специфичность связана с особым строением "И центра фермента (СШМапаг е( а1., 2007). В условиях равновесия скорость биокаталитической реакции восстановления Ог (V) описывается уравнением 1:

\lv = \lvx+\lv2+\lvъ

(1)

В большинстве случаев лимитирующей стадией биокатапитического процесса является стадия окисления природного субстрата (V,), органической (субстраты фенольной структуры - грибные и древесные Ьс, билирубин - ВОх) или неорганической природы (ионы марганца (II) - грибные 1-С, ионы железа (II) - Ср), Т1 центром фермента (= до 500 о1 и выше), в то время как внутримолеклярный перенос электрона (ВЭП, У2) с Т1 центра на трехъядерный медный кластер (Лг2>1000сг1) и восстановление дикислорода Т2/ТЗ кластером {к3>500 с1)

происходит достаточно быстро (Рис. 39).

02 + 4Н+ ^Н20

Рисунок 39. Схема функционирования голубых медьсодержащих оксидаз в растворе.

При адсорбции большинства МСО на угольных материалах, на поверхности которых присутствуют различные функциональные группы, похожие по структуре на природные органические субстраты ферментов, происходит специфическая ориентация голубых МСО с возможностью ПЭП на Т1 центр ферментов на растояние менее 20 А (Рис. 40). В результате реализуется ВЭП с Т1 центра при участии цистеин-гистидинового моста (-13 А) на Т2ЯЗ кластер, где происходит восстановление Ог до НгО. В условиях равновесия скорость реакции электровосстановления Ог, а именно величина тока в электрохимической системе (/), описывается уравнением 2:

\И = \Птт+\Пса,+\П^ (2)

где

1тт = пРАТкшт (3)

гса1=пРАТкса1С021{С02+Км) (4)

=0,62пРАВ2ПСоубсо112 (5)

где Р - постоянная Фарадея, А - площать электрода, Г - поверхностная концентрация белка, V - вязкость раствора, £> -коэффициент диффузии, о) - скорость вращения электрода.

Особенность гетерогенной системы в режиме ПЭП состоит в возможности регуляции скорости ЭП от донора электронов (электрода) на Т1 центр белка (регуляции 1ЖТ, который соответствует V, при гомогенном катализе) за счет наложения более низкого потенциала (увеличения перенапряжения). При значительном перенапряжении и достаточно высокой кд скорость данного процесса может превышать скорость окисления субстратов при гомогенном катализе в тех же условиях. Таким образом, за счет высокой скорости восстановления

дикислорода Т2/ТЗ кластером (к"сш >500 с1) появляется возможность изучения ВЭП, который

может становиться лимитирующей стадией биоэлектрокаталитического восстановления Ог(кг). При отсутствии диффузионных ограничений скорость ВЭП может быть рассчитана по уравнению 4, с использованием параметров, определенных в наших исследованиях, а также данных других авторов. При смешанной кинетике рассчитанное к2 будет ниже реальной скорости ВЭП.

Предполагаемая возможность ПЭП между электродной поверхностью и Т2/ТЗ кластером некоторых МСО позволяет объяснить "полупроводниковые" свойства высоко редокс-

потенциальных МСО. Установлено, что в определенных условиях скорость ВЭП высоко редокс-потенциальных МСО становится ниже скорости ЭП от субстрата при гомогенном катализе или от электрода при гетерогенном катализе, лимитируя био(электро)каталитическое восстановление Ог. Это происходит, например, при взаимодействии Т2ЯЗ кластера с ОН- (близкие к нейтральным значения рН для 1-е и щелочные растворы для ВОх), Р, и, возможно, некоторыми биологическими эффекторами, например N0, а также при одноэлектронном восстановлении кластера с образованием "отдыхающей" формы фермента. Возможность ПЭП между электродом и Т2/ТЗ медным кластером фермента позволяет изменять редокс-статус и строение кластера, тем самым регулируя скорость ВЭП, а значит и активность МСО. На Рис. 41 показана типичная ступенчатая зависимость количества окисленного субстрата от потенциала, приложенного к электроду с адсорбированной 1.с, в широком диапазне потенциалов, от 0 мВ до 1100 мВ отн. МНЕ (кривые 3 и 4).

110

SS 70

JS н

50 ■

-10

X Ч // \

■ л

л у \ ♦

■ а

200

400

600 Е, мВ

800

1000

1200

Рисунок 41. Зависимость активности лакказы Тгатг1ез адсорбированной на поверхности углеродных (кривые 1 и 2) и золотых (кривые 3 и 4) материалов от потенциала. 1 - рН 5 3; 2 - рН 3,0; 3 - рН 5,3 АВТБ; 4 - рН 5,3 серингалдазин.

Таким образом, по-видимому, может осуществляться регуляция активности некоторых МСО в природе (Рис. 39). Снижение скорости ВЭП может происходить за счет понижения редокс-потенциапа Т2/ТЗ кластера, что в случае высоко редокс-потенциальных МСО приводит к термодинамически невыгодному эндоэнергетическому (uphill) транспорту электрона от высоко редокс-потенциального Т1 центра к Т2ЯЗ кластеру.

В электрохимических исследованиях показано, что один из интермедиатов ферментов имеет, по-видимому, значение окислительно-восстановительного потенциала около 400 мВ отн. NHE. Принимая во внимание потенциалы Т1 центра высоко редокс-потенциальных МСО, величина свободной энергии процесса ВЭП может достигать значения +0,38 эВ. Расчет возможной скорости ВЭП с использованием теории Маркуса (уравнение 6) с учетом дистанции переноса -13 А и энергий реорганизации процесса, варьирующих от 0,92 до 1,13 эВ, приводит к широкому диапазону значений, которые коррелируют с экспериментальными данными о специфической

активности высоко редокс-потенциальных МСО (кса,).

1оё(А2) = 15-о.б/г-з.1(АО+Я)2

где кг - скорость ВЭП, Я - расстояние между Т1 центром и Т2ЯЗ кластером (13 А), Дб-изменение свободной энергии при ВЭП (АО = -nF(£7.2/г3 — Етх)), Я - полная энергия

реорганизации (А » ^ + ЛГ2/ГЗ). Значения полной энергии реорганизации процесса ВЭП в наших исследованиях были получены с использованием квантово- и молекулярно-механических расчетов А,-, и А^п •

При ориентации фермента Т1 центром к поверхности электрода, например, при использовании углеродных материалов, каталитическая активность МСО не изменяется под воздействием приложенного потенциала. Наблюдаемое ускорение электрокаталитического восстановления Ог с уменьшением потенциала, в данном случае, обусловлено увеличением перенапряжения, а значит увеличением скорости ЭП от электрода к ферменту. Этот процесс наиболее ярко выражен на начальном участке кривой активности (600-850 мВ; Рис. 41, кривые 1 и 2), и в меньшей степени при значительном перенапряжении, т.е. потенциалах намного более отрицательных по сравнению с редокс-потенциапом Т1 центра - первичного акцептора электронов. Важно отметить практически полное отсутствие обратной реакции (биоэлектрокаталитического разложения НгО) несмотря на сильно положительные значения потенциала, приложенного к электроду с адсорбированной 1.с, до +1100 мВ отн. МНЕ, т.е. 320 мВ положительнее редокс-потенциала Т1 центра фермента. Данное явление, а именно "диод-подобное" свойство 1.с, является внутренним свойством фермента и, возможно, связано с механизмом его действия. Очевидно, что редокс-ферменты не обладают твердофазными/структурными характеристиками полупроводников. Их "полупроводниковые свойства" являются следствием сопряженных электронно-транспортных реакций в нанометровом диапазоне на вытянутых орбиталях внутри каждой белковой молекулы.

Таким образом, "триод-подобное" поведение высоко редокс-потенциальной 1_с связанно с молекулярным механизмом действия фермента, т.е. последовательной трансформацией Т2/ТЗ медного кластера с образованием электронно и структурно различных интермедиатов. В настоящее время детально охарактеризованы несколько интермедиатов 1.С, а именно пероксо интермедиат (Аг2 >1000 с-1), нативные интермедиа™, полностью окисленная "отдыхающая" форма фермента (к2~1 с-1), и полностью восстановленная форма (к2=0). Экспериментально показано, что по крайней мере один из шагов в трансформации кластера, а именно связывание полностью восстановленной 1.с с Ог с образованием перокси интермедиата (Рис. 42), является

протон независимым, практически необратимым и очень быстрым процессом (к2 >1000 с-'). Эта необратимая трансформация трехъядерного кластера приводит, возможно, к появлению "диод-подобных" свойств МСО, наблюдаемых в экспериментах по биоэлектрокаталитическому восстановлению Ог адсорбированными на графитовых электродах ферментами. В литературе имеются два объяснения "диод-подобных" свойств других окислительно-восстановительных ферментов сложного строения, а именно, кинетическая модель (5ис(1е{а е{ а1., 1992) и модель, описывающая возможность образования различных редокс-состояний ферментов в процессе биоэлеетрокатализа (Саттаск, 1992). Оба этих подхода могут быть использованы для объяснения полупроводниковых свойств высоко редокс-потенциальных ю. По-видимому, "диод-подобные" свойства МСО имеют важное значение в поддержании необходимой концентрации высокоактивных форм кислорода, которые могут образовываться в процессе ферментативного био-окисления НгО. Известно, например, что супероксид анион-радикал и Н2О2 вовлечены в

процесс биодеградации лигнина, осуществляемый при участии лигнинолитического ферментного комплекса грибов, в который входит и высоко редокс-потенциапьные МСО. Однако неконтролируемое увеличение концентрации высокоактивных форм кислорода может быть очень токсичным для живых организмов.

"Отдыхающая форма" "Полностью восстановленная" "Перокси интермедиат"

г 1"*

Рисунок42. Схема молекулярного механизма трансформации Т2/ТЗ кластера голубых медьсодержащих оксидаз (ДиПзек е1 а1., 2005).

Интересно отметить, что одним из немногих свойств, объединяющих столь различные по строению и функционированию ферменты, для которых показаны "полупроводниковые" свойства, является наличие в их структуре многоядерного многовалентного кластера, такого как мульти-гемовый кластер в структуре цитохром с нитритредуктазы, железосерных кластеров гидрогеназ, а также трехъядерного медного кластера МСО. По-видимому, наличие такого компонента сложной структуры является определяющим фактором в проявлении "диод-" и "триод-подобных" свойств ферментов. Недавно опубликованные работы по изучению полупроводниковых свойств комплексов переходных металлов подтверждают данное предположение (ИаеЫдег е! а]., 2008).

Основные фундаментальные результаты работы схематически представлены на рисунке 43, суммирующем данные о возможных электрон-транспортных путях в процессе гомогенного и гетерогенного катализа с участием МСО. При гомогенном катализе, реализуемом в процессе окисления доноров электронов или атомов водорода Т1 центром фермента, имеется две

возможных лимитирующих стадии ЭП, или у2 , в то время как скорость связывания Ог

восстановленным Т2/ТЗ кластером в растворах насыщенных воздухом (~0.25 мМ Ог)

достаточно высока. Константа скорости второго порядка (к02) данного процесса составляет при

25°С около 107 М'1 (г1. При этом V, или v2 могут варьировать в достаточно широком диапазоне.

Так, в зависимости от донора электрона или атома водорода, может принимать значения от О (вещество не является субстратом данного фермента) до 580 с4 (синаповая кислота в качестве

субстрата высоко редокс-потенциальных 1_с), а к2 может варьировать от 0 (заингибированный фермент, образующийся при связывании различных эффекторов с Т2/ТЗ кластером) до 1000 с1 и более (МСО в кислых растворах в отсутствие ингибиторов фермента).

Механизм ЭП при гетерогенном катализе зависит от наличия ПЭП между активным центром МСО и электродной поверхностью, ориентации фермента на поверхности электрода, а также присутствия или отсутствия субстратов (медиаторов) МСО в растворе (Рис. 43).

Рисунок 43. Схематическое изображение электрон-транспортных путей при гомогенном и гетерогенном процессах восстановления Ог с участием голубых медьсодержащих оксидаз.

/(О,- 107 М-1 S-1

2Н,0

Ьох Лк И, к н! 4,, Биологические эфсректоры

2 red

При отсутствии прямого электронного контакта между активным центром фермента и электродом биоэлектрохимическое восстановление О2 до НгО возможно за счет сопряжения биокаталитической реакции с электрохимическим процессом востановления редокс-медиатора на поверхности электрода (Рис. 38, центральная часть и Рис. 43). При ориентации белков Т1 центром к электродной поверхности, в отсутствие редокс-медиатора(ов), электрон по тунельному механизму переносится на Т1 ион меди и далее механизм ЭП идентичен таковому при гомогенном биокаталитическом процессе восстановления Ог. Скорость первой стадии

биоэлектрокаталитической реакции (v,) в данном случае прямо пропорциональна кх и может

быть рассчитана из гД£Г, используя уравнение 3, как описано выше. В присутсвии редокс-медиаторов может наблюдаться протекание двух параллельных процессов, а именно, одновременное биоэлектрокаталитическое и биоэлектрохимическое восстановление Ог до НгО.

Эффективность каждого процесса, а значит и его вклад в суммарное значение ^, зависит от многих параметров, но одними из главных факторов являются доступность Т1 центра для медиатора, а также процент фермента находящегося в непосредственном электронном контакте с электродной поверхностью. Ориентация МСО с возможностью ЭП от электрода

непосредственно на Т2ЯЗ кластер фермента (к} ) позволяет осуществлять прямой контроль его

редокс-статуса, приводя к проявлению "полупроводниковых" свойств МСО. В данном случае Т1, ТЗ и Т2 центры фермента выполняют роль, соответственно, ввода, вывода и контрольного электродов триода или транзистора (Рис. 43).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Систематическое изучение биохимических и электрохимических свойств широкого набора окислительно-восстановительных ферментов, относящихся к классу голубых МСО (1-е, ВОх и Ср), позволило установить общность и различие в протекании биокаталитических, биоэлектрокаталитических и биоэлектрохимических реакций восстановления О2 до НгО с их участием, в том числе наличие нескольких электронно-транспортных путей при гомогенном и гетерогенном катализе. Основные фундаментальные результаты работы представлены на рисунке 44, обобщающим термодинамические и кинетические закономерности биокатализа, а именно возможного присутствия эндергонической стадии в процессе ВЭП с Т1 центра на Т2/ТЗ медный кластер высоко редокс-потенциальных голубых МСО.

Результаты данной работы важны для понимания механизма функционирования и регуляции МСО в природе. Трансформация активного центра оксидаз, осуществляемая за счет наложения внешнего электрического потенциала, приводит к модуляции скорости ВЭП и обратимому изменению каталитической активности ферментов. По-видимому, сходный механизм может быть реализован в природе за счет равновесия реакции обратимого связывания гидроксид аниона с ионами меди Т2/ТЗ кластера (регуляция активности ферментов за счет изменения рН среды), а также взаимодействия фермента с биологическими эффекторами.

С практической точки зрения результаты данной работы являются основой для использования голубых МСО в органическом синтезе, процессах биодеградации ксенобиотиков, а также для создания различных биоэлектрохимических устройств. Показана возможность функционирования МСО в режиме диодов и триодов, что позволяет управлять скоростью ферментативной реакции внешним электрическим полем. Разработаны модели высокочувствительных биосенсоров для анализа различных соединений и биокатоды топливных элементов третьего поколения.

Рисунок 44. Термодинамическая и кинетическая диаграмма биокатализа голубыми медьсодержащими оксидазами.

выводы

1. На основании комплексного изучения биохимических, спектральных и электрохимических характеристик голубых медьсодержащих оксидаз, имеющих различные значения редокс-потенциала Т1 центров, (¡) установлена четкая корреляция между редокс-потенциалом субстрата и эффективностью гомогенного катализа, (и) предположено наличие эндергонической стадии в процессе внутримолекулярного переноса электронов с Т1 центра на Т2/ТЗ медный кластер высоко редокс-потенциальных медьсодержащих оксидаз, (///) выбраны объекты . для обоснованного использования ферментов данного класса в различных биотехнологических процессах.

2. Исследование возможных путей сопряжения ферментативных реакций голубых медьсодержащих оксидаз и электрохимических процессов с их участием позволило предложить каталитические и молекулярные механизмы функционирования высоко и низко - редокс-потенциальных голубых медьсодержащих оксидаз при гетерогенном катализе; Согласно предложенной модели, механизм и эффективность биоэлектрокатализа зависят от ориентации молекул фермента на поверхности электрода. Ориентация ферментов Т1 центром к электродной поверхности обуславливает эффективное биоэлектрокаталитическое восстановление молекулярного кислорода по механизму прямого электронного переноса. При электронном контакте активного центра фермента также наблюдалось изменение удельной "активности гетерогенных биокатализаторов при различных потенциалах электрода.

3. Впервые показаны "попупроводниковые" свойства высоко редокс-потенциальных голубых медьсодержащих оксидаз в процессе гетерогенного катапиза. Высказано предположение о важности данных свойств для регуляции биокаталитической активности ферментов в природе.'

4. Созданы модели углевод-кислород утилизирующих безмембранных биотопливных' 'элементов, основанных на явлении прямого электронного переноса, являющиеся базовыми для разработки имплантируемых биоэлектронных устройств третьего поколения.

5. Созданы лабораторные образцы амперометрических биосенсоров первого, второго и третьего рода на основе голубых медьсодержащих оксидаз для определения соединений- фенольной структуры и лигнинов.

6. Найден новый класс медиаторов ферментов с общим названием 1-фенил-З-метил-пиразолоны-5. Показано, что сульфо- и аминопроизводные этого класса соединений могут эффективно испопьзоваться в качестве усилителей действия лакказ для£ деградации ксенобиотиков и делигнинофикации бумажной пульпы.

7. Разработаны методы экологически чистого синтеза электропроводящего полианилина, включая его псевдоводорастворимую и оптически активную формы, с использованием высоко редокс-потенциальных лакказ. Изучены физико-химические свойства полученных сР5разцов.

8. Выяснение биохимических и электрохимических свойств голубых медьсодержащих оксидаз позволило установить общность и различия в протекании биокаталитических, биоэлектрокаталитических и биоэлектрохимических реакций восстановления кислорода до воды с их участием. ;

У"! '

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОБЗОРЫ И ГЛАВЫ В КНИГАХ:

1. Christenson A., Dimcheva, N„ Ferapontova Е.Е., Gorton L„ Ruzgas T., Stoica L„ Shleev S.. Yaropolov A.I., Haltrich D., Thorneley R.N.F., Aust S.D. Direct electron transfer between ligninolytic redox enzymes and electrodes. Electroanalysls, 2004,16(13-14), 1074-1092.

2. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas T., Yaropolov A., Whittaker J., Gorton L. Direct electron transfer between copper containing proteins and electrodes. Biosensors and Bioelectronics, 2005a, 20(12), 2517-2554.

3. Ferapontova E.E., Shleev S„ Ruzgas T., Stoica L., Christenson A., Tkac J., Yaropolov A.I., Gorton L. Direct electrochemistry of proteins and enzymes. In: Electrochemistry of Nucleic Acid and Proteins: Towards Electrochemical Sensors for Genomic and Proteomics, Eds. E. Palecek, F. Scheller, and J. Wang (2005) Elsevier, Amsterdam, pp. 517-598.

4. Морозова О,В., Шумакович Г.П., Горбачева М.А., Шлеев C.B.. Ярополов А.И. "Голубые" лакказы. Биохимия, 2007а, 72(10), 1396-1412.

5. Морозова О.В., Шумакович Г.П., Шлеев C.B.. Ярополов А.И. Лакказо-медиаторные системы и их применение. Прикладная биохимия и микробиология, 20076,43(5), 583-597.

СТАТЬИ:

1. Шлеев C.B.. Кузнецов C.B., Топунов А.Ф. Ячейка для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества. Прикладная биохимия и микробиология, 2000,36(3), 354-358.

2. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев C.B.. Степанова Е.В., Гаврилова В.П. Выделение и изучение некоторых свойств лакказы из базидиомицета Cerrena maxima. Биохимия, 2001, 66(6), 762-767.

3. Шлеев C.B., Зайцева Е.А., Горшина Е.С., Морозова О.В., Сереженков В.А., Бурбаев Д.Ш., Кузнецов Б.А., Ярополов А.И. Спектральное и электрохимическое изучение активных сайтов лакказ базидиомицетов. Вестник Московского Университета, Серия 2 Химия 2003,44(1), 35-39.

4. Karamyshev A.V., Shleev S.V.. Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu. Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline. Enzyme and Microbial Technology, 2003,33(5), 556-564.

5. Shleev S.V.. Khan Ir Gvon, Gazaryan I.G., Morozova O.V., Yaropolov A.I. Novel laccase redox mediators: spectral, electrochemical and kinetic properties. Applied Biochemistry and

,/Biothechnology, 2003,111(3), 167-183.

6., Шлеев C.B., Хан И.Г., Морозова O.B., Мажуго Ю.М., Халунина А.С., Ярополов А.И. Фенил: ■ пиразолоны - новый класс редокс-медиаторов оксцдоредуктаз для деградации ксенобиотиков. Прикладная биохимия и микробиология, 2004а, 40(2), 165-172.

7: Шлеев C.B., Чеканова С.А., Королева О.В., Степанова Е.В., Телегин Ю.А., Сенькина З.Е. Определение полифенольного комплекса вин электрохимическими методами, в том числе с использованием ферментов тирозиназы и лакказы. Прикладная биохимия и микробиология, 20046, 40(3), 359-365.

8, Shleev S.. Kasml А.Е., Ruzgas T., Gorton L. Direct heterogeneous electron transfer reactions of bilirubin oxidase at a spectrographic graphite electrode. Electrochemistry Communications, 2004a, 6(9), 934-939.

9. Shleev S.V., Morozova O.V., Nlkitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie, 2004b, 86 (9-10), 693-703.

IQ.Shleev S„ Christenson A., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A., Gorton L., Ruzgas T. Electrochemical redox transformations of T1 and T2 copper sites in native Trametes hirsuta laccase at gold electrode. Biochemical Journal, 2005b, 385(3), 745-754.

11.Ярополов А.И., Шлеев C.B., Морозова О.В., Зайцева Е.С., Марко-Варга Г., Эмнеус Горгон Л.

• Амперометрический биосенсор для определения фенольных соединений на основе лакказы, , иммобилизованной в полимерные матрицы. Журнал Аналитической Химии, 2005, 60(6), 624628.

12.Никитина О.В., Шлеев С.В.. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Среженков В.А., Бурбаев Д.Ш., Беловолова Л.В., Ярополов А.И. Выделение и очистка ферментов лигнолитического комплекса базвдиального фиба Trametes pubescence (Schumach.) РШ и исследование их свойств. Биохимия, 2005,70(11), 1548-1555.

13. Shleev S„ Jarosz-Wilkolazka A., Khalunina A., Morozova О., Yaropolov A., Ruzgas Т., Gorton L. Direct heterogeneous electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes. Bioelectrochemistry, 2005c, 67(1), 115-124.

14.Pita M., Shleev S.. Ruzgas Т., Fernandez V.M., Yaropolov A.I., Gorton L. Direct heterogeneous electron transfer reactions of fungal laccases at bare and thiol-modified gold electrodes, Electrochemistry Communication, 2006,8(5), 747-753.

15.Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas Т., Gorton L. Laccase based biosensors for monitoring lignin. Enzyme and Microbial Technology, 2006a, 39(4), 835-840.

16.Shleev S.. Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y„ Yaropolov A., Ruzgas Т., Gorton L. Interaction of fungal laccases and laccase-mediator systems with lignin. Enzyme and Microbial Technology, 2006b, 39(4), 841-847.

17.Shumakovich G.P., Shleev S.V.. Morozova O.V., Khohlov P.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. Electrochemistry and kinetics of funga! laccase mediators. Bioelectrochemistry, 2006,69(1), 16-24.

18.Shleev S., Reimann C.T., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A.I., Gorton L„ Ruzgas T. Autoreduction and aggregation of fungal laccase in solution phase: possible corcelation with a resting form of laccase. Blochimie, 2006c, 88(9), 1275-1285.

19.Shleev S.. Pita M., Yaropolov A.I., Ruzgas Т., Gorton L. Direct heterogeneous electron transfer reactions of Trametes hirsute laccase at bare and thiol-modlfled gold electrodes. Electroanalysis, 2006d, 18(19-20), 1901-1908.

20.Christenson A., Shleev S., Mano N„ Heller A., Gorton L. Redox potentials of the blue copper sites of bilirubin oxidases. Biochimica et Biophysica Acta, 2006,1757(12), 1634-1641.

21.Горшина E.C., Русинова T.B., Бирюков B.B., Морозова О.В., Шлеев С.В., Ярополов А.И. Динамика оксидазной активности в процессе культивирования базидиапьных грибов рода Trametes Fr. Прикладная биохимия и микробиология, 2006а, 42(6), 638-644.

22.Горшина ЕС., Русинова Т.В., Марьина Н.С., Шкурина Н.А., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Горбачева М.А., Морозова О.В., Шлеев С.В.. Ярополов А.И. Биосинтез грибной лакказы -фермента для экологически безопасных производств. Труды МГУИЭ, 20066,116-123.

23.Shleev S„ Nikitina О., Christenson A., Reimann С.Т., Yaropolov A.I., Ruzgas Т., Gorton L. Characterization of two new multiforms of Trametes pubescens laccase. Bioorganic Chemistry, 2007a, 35(1), 35-49.

24.Yaropolov A., Shleev S„ Zaitseva E., Emnius J., Marko-Varga G., Gorton L. Electroenzymatic reactions with oxygen on laccase-modlfied electrodes in anhydrous (pure) organic solvent. Bioelectrochemistry, 2007,70(2), 199-204.

25.Nazaruk E., Mlchota A., Bukowska J., Shleev S„ Gorton L., Bllewlcz R. Properties of native and hydrophobic laccases immobilized in the liquid-crystalline cubic phase on electrodes. Journal of Biological and Inorganic Chemistry, 2007,13(3), 335-344.

26.Haghighi В., Rahmati-Panah A., Shleev S.. Gorton L. Carbon ceramic electrodes modified with laccase from Trametes hirsuta: fabrication, characterization and their use for phenolic compounds detection. Electroanalysis, 2007,19(9), 907-917.

27.Shleev S„ Klis M., Wang M., Rogalski J., Bilewlcz R„ Gorton L. Comparative spectroelectrochemical studies of lyophlllsed and non-lyophitised laccases from Cerrena unicolor basidiomycete. Electroanalysis, 2007b, 19(10), 1039-1047.

28.Zumarraga M., Bulter Т., Shleev S.. Polalna J., Martinez-Arias A., Plou F.J., Ballesteros A., Alcalde M. In vitro evolution of a fungal laccase In high concentrations of organic cosolvents, Chemistry and Biology, 2007,14(9), 1052-1064.

29.Vasil'eva I.S., Morozova O.V., Shumakovich G.P., Shleev S.V.. Sakharov, I.Y., Yaropolov A.I. Laccase-catalyzed synthesis of optically active polyaniline. Synthetic Metals, 2007,157(18-20), 684689.

30.Zumarraga M., Camarera S., Shleev S.. Martinez-Arias A., Ballesteros A., Plou F„ Alcalde M. Altering the lacease functionality by in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2008a, 71(1), 250-260. 31.Shleev S.. Wang Y„ Gorbacheva M„ Christenson A., Haltrich D., Ludwig R„ Ruzgas Т., Gorton L. Direct heterogeneous electron transfer reactions of Bacillus halodurans bacterial blue multicopper oxidase. Electroanalysis, 2008a, 20(9), 963-969. 32.Горбачева M„ Шумакович Г., Морозова О., Стрельцов А., Зайцева Е„ Шлеев С.В. Сравнительное изучение биокаталитических реакций с участием высоко- и низкопотенциальных грибных и древесных лакказ в гомогенных и гетерогенных реакциях. Вестник Московского Университета, Серия 2 Химия 2008,9(2), 117-121. 33.Shleev S. and Ruzgas Т. Transistor-like behaviour of a fungal lacease. Angewandte Chemie International Edition, 2008b, 47(38), 7270-7274.

34.Zumarraga M., Vaz Domínguez С., Camarero S., Shleev S.. Polalnac J., Martinez-Ariasa A., Ferrera M., De Lacey A., Fernández V., Ballesteros A., Plou F., Alcalde M. Combinatorial saturation mutagenesis of the Myceliophthora thermophila lacease T2 mutant: the connection between the C-terminal plug and the conserved 509VSG51 Uripeptide. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 2008b, 11(10), 807-816.

35.Vaz-Dominguez C., Campuzano S., Rüdiger O., Pita M„ Gorbacheva М„ Shleev S.. Fernandez V., De Lacey A. Lacease electrode for direct electrocatalytic reduction of Ог to H2O with high operational stability and resistance to chloride inhibition. Biosensors and Bioelectronics, 2008,24(4), 531-537.

36.Ramirez P., Mano N., Andreu R., Ruzgas Т., Heller A., Gorton L., Shleev S. Direct electron transfer from graphite and functionalized gold electrodes to T1 and Т2ЯЗ copper centers of bilirubin oxidase. Biochimlca Biophysica Acta, 2008,1777(10), 1364-1369.

37.Coman V., Vaz-Domínguez C., Ludwig R„ Harrelther W„ Haltrich D., De Lacey A., Ruzgas Т., Gorton L., Shleev S. A membrane-, mediator-, cofactor-less glucose/oxygen blofuel cell. Physical Chemistry Chemical Physics, 2008,10(40) 6093-6096.

38.Gorbacheva M., Morozova O., Shumakovlch G., Streltsov A., Shleev S.. Yaropolov A. Enzymatic oxidation of manganese ions catalysed by lacease. Bioorganic Chemistry, 2009,37(1) 35-49.

39. Haberska K., Vaz-Domínguez C., De Lacey A.L., Dagys M„ Reimann C.T., Shleev S. Direct electron transfer reactions between human ceruloplasmin and electrodes. Bloelectrochemistry, 2009,76(1-2), 34-41.

40.Coman V., Ludwig R„ Harreither W., Haltrich D„ Gorton L„ Ruzgas Т., Shleev S. A direct electron transfer-based glucose/oxygen biofuel cell operating in human serum. Fuel Cells, 2010,10(1), 9-16.

41.Resslne A., Vaz-Dominguez C., Fernandez V.M., De Lacey A.L., Laurell Т., Ruzgas Т., Shleev S. Bioelectrochemical studies of azurin and lacease confined in three-dimensional chips based on gold-modified nano-/microstructured silicon. Biosensors and Bioelectronics, 2010,25(5), 1001-1007.

42.Dagys M., Haberska K., Shleev S., Arnebrant Т., Kulys J., Ruzgas T. Gold nanoparticle assisted bioelectrocatalytic reduction of oxygen by Trametes hirsuta lacease. Electrochemistry Communication, 2010,12(7), 933-935.

ПАТЕНТЫ:

1. Ярополов А., Синякова А., Морозова О., Шлеев С.. Староверов С., Сахаров И., Кузнецов М. Метод получения оптически активного полианилина. 2007, Патент РФ RUXXE7 RU 2301262 С1

20070620.4 стр.

2. Ярополов А., Васильева И., Морозова О., Шумакович Г., Шлеев С. Способ получения водной дисперсии интерполимерного комплекса электропроводящего полианилина и полисульфокислот. 2008, Патент РФ RUXXE7 RU 2318020 С1 20080227,5 стр.

3. Горшина Е„ Бирюков В., Русинова Т., Шкурина Н„ Ярополов А., Морозова О., Шлеев С.. Шеблыкин И. Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta (Wulfen) pilat - продуцент голубой лакказы. 2009а, Патент РФ RUXXE7 RU 2345135 С2 20090127,6 стр.

4. Горшина Е„ Бирюков В., Русинова Т., Ярополов А., Морозова О., Шлеев С., Шеблыкин И. Способ получения ферментного препарата лакказы. 2009b, Патент РФ RU 2349644 С2

20090320.5 стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

ВЭП - внутримолекулярный электронный перенос; МЭП - медиаторный электронный перенос; ПЭП - прямой электронный перенос; ЭП - электронный перенос; ABTS - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоната); Ag/AgCI - хлор-серебрянный электрод; АОх - аскорбат оксидаза; ВОх - билирубиноксидаза; CDH - целлобиозодегидрогеназа; СКК -супьфокамфорная кислота; Ср - церулоплазмин; HABA - 3-(6-гидрокси)-аминобензойная кислота; НВТ - 1-гидроксибензотриазол; HPI - N-гидроксифталеимид; HPLC -высокоэффективная жидкостная хроматография; HQ - гидрохинон; NICO - медьсодержащие оксидазы; Le - лагаза; LMS - лакказа-медиаторная система; mSPP - 1-(3'-сульфофенил-3-метил-пиразолон-5; pi - изоэлектрическая точка; NHE - нормальный водородный электрод; РР -1-фенил-3-метил-пиразолон-5; РРА - 1-фенил-2,3-диметип-4-амино-пиразолон-5; PPA-Na - 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон-5п- метансульфонат натрия; pSPP - 1-(4'-сульфофенил-З-метил-пиразопон-5); SDS - додецилсульфат натрия; TEMPO - 2,2,6,6-тетраметил-1- пиперидинилоксил; VA- вератровый спирт (3,4-диметоксибензиловый спирт).

Подписано в печать: 11.10.10 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 200 экз. Заказ № 769157 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, доктора химических наук, Шлеев, Сергей Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общий план строения, свойства и каталитический механизм действия голубых медьсодержащих оксидаз.

1.2. факторы, определяющие редокс-потенциал медных центров голубых медьсодержащих оксидаз.

1.3. Аскорбатоксидаза.

1.4. Билирубиноксидаза.

1.5. Церулоплазмин.

1.6. j1akka3a.

ГЛАВА 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и объекты исследования.

2.2. Выделение и очистка ферментов.85 ■

2.3. Определение биохимических характеристик лакказ.

2:4. Спектральные исследования.

2.5. Электрохимические исследования.

2.6. Исследования медиаторов лакказ.

2.7. Ферментативный синтез полианилина.

2.8. Квантово- и молекулярно-механические расчеты энергий реорганизации медных центров оксидаз.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

3.1. Выделение и основные физико-химические свойства лакказ.

3.2. Медиаторы - усилители действия лакказ.

3.3. Выделение и основные физико-химические свойства лакказ Trametes pubescens.

3.4. Сравнение биокаталитических характеристик высоко и низко редокспотенциальных лаюсаз.

3.5. Бактериальная голубая медьсодержащая оксидаза.

3.6. Ферментативный синтез полианилина.

3.7. Комплексное сравнительное электрохимическое изучение медьсодержащих оксидаз.

3.8. Разработка амперометричесих биосенсоров первого и второго рода для определения липшнов и фенольных соединений.

3.9. Разработка безмедиаторных биокатодов и моделей биотопливных элементов.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз"

Голубые медьсодержащие оксидазы (МСО), к которым относятся лакказа (Lc), билирубиноксидаза (ВОх) и аскорбатоксидаза (АОх), а также церулоплазмин (Ср), занимают особое место среди окислительно-восстановительных ферментов [Solomon et al., 1996]. Они обладают высокой-удельной активностью и способностью к прямому восстановлению Ог до Н20 без образования промежуточных высоко реакционно-способных токсичных интермедиатов кислорода, таких как супероксид анион радикал (Ог")» гидроксил радикал (ОН") и пероксид водорода (Н2Ог) [Морозова с соавт., 2007а]. Большой интерес, как в фундаментальном, так и прикладном плане, представляет субстратная специфичность этих ферментов, способных окислять широкий круг органических, а также неорганических соединений. Окисление органических соединений протекает по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен. Таким образом, МСО представляют большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований их структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра медьсодержащих оксид аз, в который входят ионы меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе каталитического акта, одноэлектронного окисления субстратов доноров электронов или атома водорода, позволяет осуществлять восстановление Ог непосредственно до НгО.

Помимо этого, каталитические свойства МСО делают возможным их широкое использования в целлюлозно-бумажной промышленности для делигнификация бумажной пульпы [Cheng et al., 2003; Jetten et al., 2004; Pedersen et al., 2001; Lund and Felby, 2003], в текстильной промышленности для отбеливания тканей [Barfoed et al., 2004; Damkhus et al., 2003], в пищевой [Huang et al., 2001; Si, 2001] и косметической промьппленностях [Onuki et al., 2000; Aaslyng et al., 2002; Lang and Cotteret, 2006], для детоксикации и обесцвечивания сточных вод [Jönsson et al., 1998; Michizoe et al., 2005], для биодеградация ксенобиотиков [Johannes et al., 1996; Shintaro et al., 2001], для создания антимикробных композиций [Johansen et al., 2003], при получении древесноволокнистых плит, древесных блоков и картона без применения токсичных связующих [Болобова с соавт., 2002; Viikarbet al., 2001], при производстве моющих средств [Boutique et al., 2004; Gardner et al., 2005], и в клиническом анализе [Репу et al., 1986; Goldfinch andMaguire, 1988].

Интерес к практическому использованию МСО еще более возрос в середине 90-х годов XX века, после открытия возможности усиления действия этих ферментов с использованием различных редокс-медиаторов [Bourbonnais and Paice, 1990], что позволило существенно ¿расширить область их практического применения. Медиаторы МСО представляют собой субстраты этих ферментов, в процессе окисления которых образуются высоко редокс-потенциальные и химически активные продукты. Последние могут вступать в реакцию с соединениями, которые не подвергаются окислению одними лишь оксид азами, или участвовать в переносе электронов в электрохимических реакциях, ускоряя электрохимические процессы с участием данных ферментов. Кроме того, в процессе окисления органических субстратов образуются свободные радикалы, которые могут модифицировать другие соединения.

Значительный интерес представляет собой использование МСО в органическом синтезе. Показана возможность использования Le для синтеза винбластина [Yaropolov et al., 1994], бензальдегидов [Potthast et al., 1996], а также высокомолекулярных компонентов фенольной структуры [Echido et al, 2001].

Важным направлением возможного использования МСО является их применение в биоэлектронике — новой мультидисциплинарной области биотехнологии, сформированной на стыке биологии и электроники [Katz, 2006], имеющей огромное прикладное значение для медицины, высокотехнологичных производств, военных целей, и биокомпьютерных технологий, что привело к ее быстрому развитию в последние годы. Особенностью МСО является возможность их использования во многих областях биоэлектроники, а именно для создания биосенсоров [Malovik et al., 1984; Yaropolov et al., 1994; Durän et al., 2002; Ferapontova et al., 2005] и биокатодов топливных элементов [Aston and Turner, 1984; Barton et al., 2004; Heller, 2004; Palmore and Whitesides, 1994; Varfolomeyev et al., 1997]. Это связано с широкой ¡субстратной специфичностью данных ферментов, их высокой активностью и< стабильностью, а также возможностью прямого биоэлектрокатализа — уникальной биоэлеткрохимической характеристике, показанной для узкого круга оксидоредуктаз, включая и медьсодержащие оксидазы [Березин с соавт., 1978; Shleev et al., 2005b].

В связи с выше изложенным, представляется актуальным исследование механизмов функционирования и регуляции активности МСО, а также изучение возможного применения данных ферментов в биотехнологии и биоэлеюронике.

Цель данной работы - установление механизма функционирования и регуляции активности МСО в гомогенных и гетерогенных биокаталитических системах с целью их обоснованного и рационального использования в биокаталитическом синтезе и системах биодеградации ксенобиотиков, для разработки» устройств трансформации химической энергии в электрическую, а также для оптимизации электроаналитических сенсоров.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

1. Детально изучить биохимические и каталитические характеристики грибных, древесной и бактериальной Lc с целью выбора наиболее перспективных ферментов для использования в различных биотехнологических процессах и биоэлектронных устройствах.

2. Разработать метод экологически чистого синтеза электропроводящего полианилина с участием высоко редокс-потенциальных Ьс.

3. Предложить стратегию отбора и исследования потенциальных редокс-медиаторов Ьс и провести апробацию лакказа-медиаторных систем (ЪМБ) на практически значимых объектах.

5. Предложить подходы для практического использования МСО в биосенсорах и биотопливных элементах.

6. Выяснить закономерности регуляции активности МСО на молекулярном уровне с использованием биохимических и электрохимических методов. Экспериментально показать "диод-" и "триод-подобные" биоэлектрохимических устройств.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шлеев, Сергей Валерьевич

выводы

1. На основании комплексного изучения биохимических, спектральных и электрохимических характеристик голубых медьсодержащих оксид аз," имеющих различные значения редокс-потенциала Т1 центров, (1) установлена четкая корреляция между редокс-потенциалом субстрата и эффективностью гомогенного катализа, (//) предположено наличие эндергонической стадии в процессе внутримолекулярного переноса электронов с Т1 центра на Т2/ТЗ медный кластер высоко редокс-потенциальных медьсодержащих оксид аз, (ш) выбраны объекты для обоснованного использования ферментов данного класса в различных биотехнологических процессах.

2. Исследование возможных путей сопряжения ферментативных реакций голубых медьсодержалдах оксид аз и электрохимических процессов с их участием позволило предложить каталитические и молекулярные механизмы функционирования высоко и низко редокс-потенциальных голубых медьсодержащих оксид аз при гетерогенном катализе. Согласно предложенной модели, механизм и эффективность биоэлектрокатализа зависят от ориентации моле^л фермента на поверхности электрода. Ориентация ферментов Т1 центром к электродной поверхности обуславливает эффективное биоэлектрокаталитическое восстановление молекулярного кислорода по механизму прямого электронного переноса. При электронном контакте активного центра фермента также наблюдалось изменение удельной активности гетерогенных биокатализаторов при различных потенциалах электрода.

3. Впервые показаны "полупроводниковые" свойства высоко редокс-потенциальных голубых медьсодержащих оксид аз в процессе гетерогенного катализа. Высказано предположение о важности данных свойств для регуляции биокаталитической активности ферментов в природе.

4. Созданы модели углевод-кислород утилизирующих безмембранных биотопливных элементов, основанных на явлении прямого электронного переноса, являющиеся базовыми для разработки имплантируемых биоэлектронных устройств третьего поколения.

5. Созданы лабораторные образцы амперометрических биосенсоров первого, второго и третьего рода на основе голубых медьсодержащих оксид аз для определения соединений фенольной структуры и лигнинов.

6. Найден новый класс медиаторов ферментов с общим названием 1 -фенил-3-метил-пиразолоны-5. Показано, что сульфо- и аминопроизводные этого класса соединений могут эффективно использоваться в качестве усилителей действия лакказ для деградации ксенобиотиков и делигнинофикации бумажной пульпы.

8. Выяснение биохимических и электрохимических свойств голубых медьсодержащих оксид аз позволило установить общность и различия в протекании биокаталитических, биоэлектрокаталитических и биоэлектрохимических реакций восстановления кислорода до воды с их участием.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Шлеев, Сергей Валерьевич, Москва

1. Базилевский М.В. и Фаустов В.И. «Современные теории химических реакций вконденсированной фазе» Успехи химии 1992. Т. 61, №. 7, С. 1185-1223.

2. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Р., Ярополов

3. А.И., «Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы» Доклады АН СССР 1978. Т. 240, № 3, С. 615-617

4. Богдановская В.А., Бурштейн Р.Х., Тарасевич М.Р. «Влияние состоянияповерхности платинового электрода на скорость электровосстановления кислорода» Электрохимия 1972. Т. 8, № 8, С. 1206-1209

5. Болобова A.B., Аскадский A.A., Кондращенко В.И., Рабинович М.Л.

6. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. П: Ферменты, модели, процессы» М.: Наука, 2002, 343 стр.

7. Васильченко Л.Г., Королева О.В., Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Рабинович

8. М.Л. «Выделение и характеристика микромицета продуцента нейтральных фенолоксидаз из тропических почв с высоким содержанием диоксинов». Прикл. биохимия и микробиология 2000. Т. 36, № 4, С. 412-421

9. Герцог К., Густав К., Штреле И., «Руководство по нерганическому синтезу» М.:1. Мир, 1985, 386 стр.

10. Гиндилис А.Л., Ярополов А.И., Березин И.В. «Роль механизма действияфермента в проявлении его электрокаталитических свойств» Доклады АН СССР 1987. Т. 293, № 2, С. 383-386

11. Горбачева М., Шумакович Г., Морозова О., Стрельцов А., Зайцева Е., Шлеев C.B.

12. Сравнительное изучение биокаталитических реакций с участием высоко- инизкопотенциальных грибных и древесных лакказ в гомогенных и гетерогенных реакциях» Вестник МГУ, Сер. 2. Химия 2008. Т. 9, № 2, С. 117121

13. Горшина Е.С. «Глубинное культивирование базидиальных грибов рода Trametes

14. Fr. с целью получения биологически активной биомассы» Дисс. канд. биол. наук. -М.: МГУИЭ, 2003, 194 стр.

15. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Бирюков В.В. «Технология получениябиологически активной субстанции лекарственного гриба Кориола опушенного» Биотехнология, 2003, 2, 71-81.

16. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Бирюков В.В., Морозова О.В., Шлеев C.B.,

17. Ярополов А.И. «Динамика оксидазной активности в процессе культивирования базидиальных грибов рода Trametes Fr.» Прикл. биохимия и микробиология 2006а. Т. 42, № 6, С. 638-644

18. Горшина Е., Бирюков В., Русинова Т., Шкурина Н., Ярополов А., Морозова О.,

19. Шлеев С., Шеблыкин И. «Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta (iWulfen) pilât продуцент голубой лакказы» 2009а. Патент РФ RUXXE7 RU 2345135 С2 20090127, 6 стр.

20. Горшина Е., Бирюков В., Русинова Т., Ярополов А., Морозова О., Шлеев С.,

21. Шеблыкин И. «Способ получения ферментного препарата лакказы» 20096. Патент РФ RU 2349644 С2 20090320, 5 стр.

22. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Марьина Н.С., Шкурина H.A., Бирюков В.В.,

23. Щеблыкин И.Н., Горбачева М.А., Морозова О.В., Шлеев C.B., Ярополов А.И. «Биосинтез грибной лакказы фермента для экологически безопасных производств» Труды МГУИЭ 20066. С. 116-123

24. Дейнеко И.П., Куанг 3.JI. «Влияние соединений металлов переменнойвалентности на делигнификацию древесины в щелочной среде» Химия Растительного Сырья 2006. Т. 2, С. 5-10

25. Карякин A.A., Ярополов А.И., Зорин И.А., Гоготов И.Н., Варфоломеев С.Д.

26. Кинетика и механизм окисления водорода гидрогеназой Thiocapsa roseosersicina» Биохимия 1984. Т. 49, № 4, С. 611-621

27. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев C.B., Степанова Е.В., Гаврилова В.П.

28. Выделение и изучение некоторых свойств лакказы из базидиального гриба Cerrería maxima» Биохимия 2001. Т. 66, С. 762-767

29. Королева О.В. «Лакказы базидиомицетов: свойства, структура, механизмдействия и практическое применение» Дисс. докт. биол. наук. — М.: ИНБИ, 2006, 50 стр.

30. Леонтьевский A.A., Мясоедова Н.М., Баскунов Б.П., Позднякова H.H., Варес Т.,

31. Калккинен Н., Хатакка А.И., Головлева Л.А. «Реакции голубых и желтых лакказ с модельными соединениями лигнина» Биохимия 1999. Т. 64, № 10, С. 1362-1369

32. Леонтьевский A.A. «Лигниназы базидиомицетов» Дисс. докт. биол. наук. М.:1. ИБФМ, 2002,266 стр.

33. Мажуго Ю.М., Карамышев A.B., Шлеев C.B., Сахаров И.Ю., Ярополов А.И.

34. Ферментативный синтез электропроводного комплекса полианилина и поли(2-акриламидо-метил-1-пропансульфокислоты) с использованием пероксидазы пальмы и его свойства» Прикл. биохимия и микробиология 2005. Т. 41, № 3j с. 283-287.

35. Морозова О.В. «Лакказы базидиальных грибов, лакказа-медиаторные системы ивозможности их использования» Дисс.канд. биол. наук, Москва, Институт биохимии им. А.Н. База РАН, 2006, 139 стр.

36. Морозова О.В., Шумакович Г.П., Горбачева М.А., Шлеев C.B., Ярополов А.И.

37. Голубые" лакказы» Биохимия 2007а. Т. 72, № 10, С. 1396-1412

38. Морозова О.В., Шумакович Г.П., Шлеев C.B., Ярополов А.И. «Лакказамедиаторные системы и их применение» Прикл. биохимия и микробиология 20076. Т. 43, № 5, С. 583-597

39. Наки А. и Варфоломеев С.Д. «Механизм ингибирования активности лакказы изpolyporus versicolor ионами галогенов» Биохимия 1981. Т. 46, № 9. С. 16941701

40. Никитина О.В. «Внеклеточные оксидор едуктазы лигнинолитического комплексабазидиального гриба Trametespubescens (Schumach.) Pilât» Дисс.канд. биол. наук, Москва, Институт биохимии им. А.Н. База РАН, 2006, 129 стр.

41. Никитина О.В., Шлеев C.B., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Сереженков В.А.,

42. Бурбаев Д.Ш., Беловолова JI.B., Ярополов А.И. «Выделение и очистка ферментов лигнолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilât и исследование их свойств» Биохимия 2005а. Т. 70, вып. 11, С. 1548-1555

43. Никитина О.В., Шлеев C.B., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И. «Рольионов двухвалентного марганца в функционировании лигнолитических ферментов базидиального гриба Trametes pubescens». Вестник МГУ, Сер. 2. Химия 2005b. Т. 46, № 4, С. 267-273

44. Остерман JI.A. «Методы исследования белков и нуклеиновых кислот» 2002, М.:1. МЦНМО" 248 стр.

45. Саенко E.JL, Сиверина О.Б., Басевич В.В., Ярополов А.И. «Кинетическиеисследования оксидазной реакции церулоплазмина» Биохимия 1986. Т. 51, № 6, С. 1017-1022

46. Позднякова H.H., Турковская О.В., Юдина E.H., Родакевич-Новак Я. «Желтаялакказа гриба Pleurotos ostreatus Dl: очистка и характеристика». Прикл. биохимия и микробиология 2006. Т. 42, № 1, С. 63-69

47. Смирнов С.А., Королева О.В., Гаврилова В.П., Белова А.Б., Клячко H.JI.

48. Лакказы базидоимицетов: физико-химические характеристики и субстратная специфичность по отношению к метоксифенольным соединениям» Биохимия 2001. Т. 66, Вып. 7, С. 952-958.

49. Степанова Е.В., Пегасова Т.В., Гаврилова В.П., Ландесман Е.О., Королева О.В.

50. Сравнительное изучение внеклеточных лакказ Cerrería unicolor 059, Cerrena unicolor 0784 и Pleurotus oasíreatus 0432» Прикл. биохимия и микробиология 2003. Т. 39, № 4, С. 427-434.

51. Тарасевич М.Р. «Электрохимия углеродных потенциалов» М: Наука, 1984, 254стр.

52. Шлеев C.B., Зайцева Е.А., Горшина Е.С., Морозова О.В., Сереженков В.А.,

53. Бурбаев Д.Ш., Кузнецов Б.А., Ярополов А.И. «Спектральное и электрохимическое изучение активных сайтов лакказ базидиомицетов» Вестник МГУ, Сер. 2 Химия, 2003, Т. 44, № 1, С. 35-39

54. Шлеев C.B., Кузнецов C.B., Топунов А.Ф. «Ячейка для биоэлектрохимическихисследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества» Прикл. биохимия и микробиология 2000. Т. 36, № 3, С. 354-358

55. Шлеев C.B., Хан И.Г., Морозова О.В., Мажуго Ю.М., Халунина A.C., Ярополов

56. А.И. «Фенил-пиразолоны — новый класс редокс-медиаторов оксидоредуктаз для деградации ксенобиотиков» Прикл. биохимия и микробиология 2004а. Т. 40, № 2, С. 165-172

57. Шлеев С.В., Чеканова С.А., Королева О.В., Степанова Е.В., Телегин Ю.А.,

58. Сенькина З.Е. «Определение полифенольного комплекса вин электрохимическими методами, в том числе с использованием ферментов тирозин азы и лакказы» Прикл. биохимия и микробиология 20046. Т. 40, № 3, С. 359-365

59. Ярополов А.И. «Каталитические закономерности действия биокатализаторов вэлектрохимических системах» Дисс.докт. хим. наук. М.: Химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, 1986, 357 стр.

60. Ярополов А., Васильева И., Морозова О., Шумакович Г., Шлеев С. «Способполучения водной дисперсии интерполимерного комплекса электропроводящего полианилина и полисульфокислот» Патент РФ RUXXE7 RU 2318020 С1 20080227, 2008, 5 стр.

61. Ярополов А.И., Гиндилис А. Л. «Связь между электрохимическимипревращениями простетической группы и каталитической активностью лакказы» Электрохимия 1985. Т. 21, № 7, С. 982-983

62. Ярополов А.И., Гиндилис А.Л. «Прямой перенос электрона вэлектроферментативных системах» Биофизика 1990. Т. 35, Вып. 4, С. 689-698

63. Ярополов А.И., Карякин A.A., Варфоломеев С.Д. «Биоэлектрокатализ феноменускорения ферментами электродных процессов» Вестник МГУ, Сер. 2 Химия 1983. Т. 24, № 6, С. 523-535

64. Ярополов А.И., Карякин A.A., Гоготов И.Н., Зорин H.A., Варфоломеев С.Д.,

65. Березин И.В. «Биоэлектрокатализ. Механизм окисления молекулярного водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой» Доклады АН СССР 1984. Т. 274, № 6, С. 1434-1437

66. Ярополов А., Синякова А., Морозова О., Шлеев С., Староверов С., Сахаров И.,

67. Кузнецов М. «Метод получения оптически активного полианилина» Патент РФ RUXXE7RU 2301262 С1 20070620, 2007, 4 стр.

68. Ярополов А.И., Сухомлин Т.К., Карякин А.А., Варфоломеев С.Д., Березин И.В.

69. О возможности туннельного переноса электрона при ферментативном катализе электродных процессов» Доклады АН СССР 1981. Т. 260, № 5, С. 1192-1195

70. Ярополов А.И., Шлеев С.В., Морозова О.В., Зайцева Е.С., Марко-Варга Г.,

71. Эмнеус Гортон JI. «Амперометрический биосенсор для определения фенольных соединений на основе лакказы, иммобилизованной в полимерные матрицы» Журнал Аналитич. Химии 2005. Т. 60, № 6, С. 624-628

72. Aaslyng D., Tsuchiya R, Gaffar A., Smith S.F. «Tooth bleaching» US Patent6,379,653, April 30, 2002

73. Abadulla E., Tzanov Т., Costa S., Robra K.-H., Cavaco-Paulo A., Gubitz G.M.

74. Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Trametes hirsuta» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, P. 3357-3362

75. Acunzo F., Galli C. «First evidence of catalytic mediation by phenolic compounds inthe laccase-induced oxidation of lignin models» Eur. J. Biochem. 2003. V. 270, P. 3634-3640

76. Alexandre G. and Zhulin I. B. «Laccases are widespread in bacteria» Trends

77. Biotechnol. 2000. V. 18, P. 41-42

78. Allendorf MD., Spira D.J., Solomon E.I. «Low-temperature magnetic circulardichroism studies of native laccase: Spectroscopic evidence for exogenous ligand bridging at a trinuclear copper active site» Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1985. V. 82, P. 3063-3067

79. Amitai G., Adani R, Sod-Moriah G., Rabinovitz I., Vincze A., Leader H., Chefetz B.,1.ibovitz-Persky L., Friesem D., Hadar Y. «Oxidative biodégradation of phosphorothiolates by fungal laccase» FEBSLett. 1998. V. 438, P. 195-200

80. Anand J., Palaniappan S., Sathyanarayana D.N. «Conducting polyaniline blends andcomposites» Prog. Polymer Sci. 1998. V. 23, P. 993-1018

81. Andreasson L.E. and Reinhammar B. «The mechanism of electron transfer in laccasecatalyzed reactions» Biochim. Biophys. Acta 1979. V. 568, P. 145-156.

82. Annunziatini C., Baiocco P., Gerini MF., Lanzalunga O., Sjogren B. «Aiyl substituted

83. N-hydroxyphthalimides as mediators in the laccase-catalysed oxidation of lignin model compounds and delignification of wood pulp» J. Mol. Catal. B: Enzym.2005. V. 32, P. 89-96

84. Antorini M., Herpoel-Gimbert I., Choinowski T., Sigoillot J.C., Asther M,

85. Winterhalter K., Piontek K. «Purification, crystallisation and X-ray diffraction study of fully functional laccases from two ligninolytic fungi». Biochim. Biophys. Acta 2002. V. 1594, P. 109-114

86. Arends I.W.C.E., Li Y.-X., Ausan R., Sheldon R.A. «Comparison of TEMPO and itsderivatives as mediators in laccase catalysed oxidation of alcohols» Tetrahedron2006. V. 62, P. 6659-6665

87. Ashraf S.A., Kane-Maguire L.A.P., Majidi M.R, Pyne S.G., Wallace G.G. «Influenceof the chiral dopant anion on the generation of induced optical activity in poly anilines» Polymer 1997. V. 38, P. 2627-2631

88. Astolfi P., Brandi P., Galli C., Gentili P., Gerini M.F., Greci L., Lanzalunga O. «Newmediators for the enzyme laccase: mechanistic features and selectivity in the oxidation of non-phenolic substrates» New J. Chem. 2005. V. 29, P. 1308-1317

89. Aston WJ. and Turner A.P.F. «Biosensors and biofuel cells» Biotechnol. Genet.

90. Engineer. Rev. 1984. V. 1, P. 89-120

91. Avigliano L., Vecchini P., Sirianni P., Marcozzi G., Marchesini A., Mondovi B. «Areinvestigation on the quaternary structure of ascorbate oxidase from Cucurbita pepomedullosa» Mol. Cell. Biochem. 1983. V. 56, P. 107-112

92. Aizawa M., Wang L., Shinohara H., Ikariyama Y. «Enzymic synthesis of polyanilinefilm using a copper-containing oxidoreductase: bilirubin oxidase» J. Biotechnol. 1990. V. 14, P. 301-309

93. Bajpai P. «Application of Enzymes in the Pulp and Paper Industry» Biotechnol. Progr.1999. V. 15, P. 147-157

94. Balakshin M.; Chen C.-L.; Gratzl J.S.; Kirkman A.G.; Jakob H. «Biobleaching of pulpwith dioxygen in laccase-mediator system-effect of variables on the reaction kinetics» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001a. V. 16, P. 205-215

95. Balakshin M.Yu., Evtuguin D.V., Neto C.P., Cavaco-Paulo A. «Polyoxometalates asmediators in the laccase catalyzed delignification» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001b. V. 16, P. 131-140

96. Baldrian P. «Fungal laccases — occurrence and properties» FEMSMicrobiol Rev. 2006.1. V. 30, P. 215-242

97. Bao W., O'Malley D.M., Whetten R., Sederoff R.R. «A Laccase Associated with1.gnification in Loblolly Pine Xylem» Science 1993. V.260, P. 672-674

98. Baminger U., Ludwig K, Galhaup C., Leiner C., Kulbe K.D., Haltrich D. (2001)

99. Continuous enzymatic regeneration of redox mediators used in biotransformation reactions employing flavoproteins» J. Mol. Cat. B. Enzym. 2001. V.ll, P.541-550

100. Barfoed M., Kirk O., Salmon S. «Enzymatic method for textile dyeing» US Patent6,805,718, October 19, 2004

101. Bar-Nun N. and Mayer A.M «Cucurbitacins-repressors of induction of laccaseformation» Phytochemistry 1989. V. 28, P. 1369-1371

102. Barton S.C., Gallaway J., Atanassov P. «Enzymatic biofuel cells for implantable andmicroscale devices» Chein. Rev. 2004. V. 104, P. 4867-4886

103. Bauer C.G., Kuhn A., Gajovic N. Skorobogatko O., Holt P.J., Bruce N.C., Makower

104. A., Lowe C.R., Scheller F.W. «New enzyme sensors for morphine and codeine based on morphine dehydrogenase and laccase» Fresenius J. Anal. Chem. 1999. V. 364, P. 179-183

105. Bento I., Martins L.O., Lopes G.G., Carrondo MA., Lindley P.F. «Dioxygen reductionby multi-copper oxidases; a structural perspective» Dalton Trans. 2005. V. 21, P. 3507-3513

106. Berka R.M, Schneider P., Golightly E.J., Brown S.H, Madden M., Brown K.M,

107. Halkier T., Mondorf K, Xu F. «Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of Myceliophthora thermophila and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae» Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63, P. 3151-3157

108. Bertrand T., Jolivalt C., Caminade E., Joly N., Mougin C., Briozzo P. «Purificationand preliminary crystallographic study of Trametes versicolor laccase in its native form» Acta Cryst. 2002. D58, P. 319-321

109. Bielli P. and Calabrese L. «Structure to function relationships in ceruloplasmin: amoonlighting" protein» Cell. Mol. Life Sei. 2002. V. 59, P. 1413-1427

110. Blaich R. and Esser K. «Function of enzymes in wood destroying fungi IE. Multipleforms of laccase in white rot fungi» Arch. Microbiol. 1975. V. 103, P. 271-277

111. Blanford C., Heath R., Armstrong F. «A stable electrode for high-potential,electrocatalytic O2 reduction based on rational attachment of a blue copper oxidase to a graphite surface» ChemComm. 2007. P. 1710-1712.

112. Bogdanovskaya V.A., Tarasevich M.R., Hintsche R., Scheller F. «Electrochemicaltransformations of proteins adsorbed at carbon electrodes» Bioelectrochem. Bioenerget. 1988. V. 19, P. 581-584

113. Bond A.M. «Chemical and electrochemical approaches to the investigation of redoxreactions of simple electron transfer metalloproteins» Inorg. Chim. Acta 1994. V. 226, P. 293-340

114. Bourbonnais R, Paice M.G. «Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded rolefor laccase in lignin biodégradation» FEB S1990. V. 267, P. 99-102.

115. Bourbonnais R, Paice M.G., Freiermuth B., Bodie E., Bomeman S. «Reactivities ofvarious mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds» Appl. Environ. Microbiol. 1997, V. 63, P. 4627-4632.

116. Bourbonnais R., Leech D., Paice M.G. «Electrochemical analysis of the interactions oflaccase mediators with lignin model compounds» Biochim. Biophys. Acta 1998. V. 1379, P. 381-390

117. Bourbonnais R, Rocherfort D., Paice M.G., Renand S., Leech D. «Transition metalcomplexes: a new class of laccase mediators for pulp bleaching» Tappi J. 2000. V. 83, P. 68-78

118. Bourbonnais R, Rochefort D., Paice M.G., Renaud S., Leech D. «Oxidase process forpulp» US Patent № 6,660,128, December 9,2003

119. Boutique J.-P., Burckett-Saint-Laurent J.C.T.R., Coosemans S.J.L., Goovaerts L.,

120. Gualco L.M.P., Johnston J.P. «Pouched cleaning compositions» US Patent № 6,815,410, November 9, 2004

121. Branchi B., Galli C., Gentili P. «Kinetics of oxidation of ben2yl alcohols by thedication and radical cation of ABTS. Comparison with Iaccase-ABTS oxidation: an apparent paradox» Org. Biomol. Chem. 2005. V. 3, P. 2604-2614

122. Broman L., Malmstrom B.G., Aasa R., Vanngard T. «Quantitative electron spinresonance studies on native and denatured ceruloplasmin and laccase» J. Mol. Biol. 1962. V. 5, P. 301-310

123. Burrows A.L., Hill H.A., Leese T.A., Mcintire W.S., Nakayama H., Sanghera G.S

124. Direct electrochemistry of the enzyme, methylamine dehydrogenase, from bacterium W3A1» Eur. J. Biochem. 1991. V. 199, P. 73-78

125. Call H.P., Mucke I. «History, overview and applications of mediated lignolytic systems,especially laccase-mediator-systems (Lignozym®-process)» J. Biotechnol. 1997. V. 53, P. 163-202

126. Cambria M.T., Cambria A., Ragusa S., Rizzarelli E. «Production, purification, andproperties of an extracellular laccase from Rigidoporus lignosus» Protein Expr. Purif. 2000. V. 18, P. 141-147

127. Cammack R. « Biological electron transfer. Plug in a molecular diode» Nature 1992.1. V. 356, P. 288-289

128. Campos R.; Kandelbauer A.; Robra K.H.; Cavaco-Paulo A.; Gubitz G.M. «Indigodegradation with purified laccases from Trametes hirsuta and Sclerotium rolfsii» J. Biotechnol 2001. V. 89, P. 131-139.

129. Cantarella G., Galli C., Gentili P. «Free radical versus electron-transfer routes ofoxidation of hydrocarbons by laccase/mediator systems. Catalytic or stoichiometric procedures» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2003. V. 22, P. 135-144

130. Caramyshev A.V., Lobachov V.M., Selivanov D.V., Sheval E.V., Vorobiev A.Kh.,

131. Katasova O.N., Polyakov V.Y., Makarovi A.A., Sakharov I.Yu. «Micellar peroxidase-catalyzed synthesis of chiral polyaniline» Biomacromolecules 2007. V. 8, P. 2549-2555

132. Carrico RJ., Malmstrom B.G., Vanngard T. «Reduction and oxidation of humanceruloplasmin. Evidence that a diamagnetic chromophore in the enzyme participates in the oxidase mechanism» Eur. J. Biochem. 1971. V. 22, P. 127-133

133. Case D.A., Cheatham T.E., Darden T., Gohlke H., Luo R., Merz KM., Onufriev A.,

134. Simmerling C., Wang B., Woods RJ. «The amber biomolecular simulation programs» J. Comput. Chem. 2005. V. 26, P. 1668-1688

135. Cass A.E.G., Davis G„ Francis G.D., Hill H.A.O., Aston W. J., Higgins I.J., Plotkin

136. E.V., Scott L.D.L., Turner A.P.F. «Ferrocene-mediated enzyme electrode for amperometric determination of glucose» Anal. Chem. 1984. V. 56, P. 667-671

137. Cha M.-K. and Kim I.-H. «Ceruloplasmin has a distinct active site for the catalyzingglutathione-dependent reduction of alkyl hydroperoxide» Biochemistry 1999. V. 38, P. 12104-12110

138. Chefetz B., Chen Y., and Hadar Y. «Purification and characterization of laccase from

139. Chaetomium thermophilium and its role in humification» Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64, P. 3175-3179.

140. Chen T„ Barton S.C., Binyamin G., Gao Z., Zhang Y., Kim H.-H, Heller A. «Aminiature biofuel cell» J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123, P. 8630-8631

141. Cheng H.N., Delagrave S., Gu Q.-M, Murphy D. «Bio-bleaching of pulp using laccase,mediator, and chain transfer agent» WO 2003023133, March 20, 2003a

142. Cheng HN., Delagrave S., Gu Q.-M., Michalopoulos D., Murphy D. «Laccase activityenhancers » WO 2003023043, March 20, 2003b

143. Cheng HN., Delagrave S., Gu Q.-M, Muiphy D. «Enhancing laccase activity usingpro-oxidants and pro-degradants» WO 2003023142, March 20, 2003c

144. Cheng HN., Delagrave S., Gu Q.-M., Michalopoulos D., Murphy D. «Laccase activityenhancers for pulp bleaching» WO 2003023134, March 20,2003d

145. Christenson A., Dimcheva N., Ferapontova E.E., Gorton L., Ruzgas T., Stoica L.,

146. Shleev S., Yaropolov A.I., Haltrich D., Thorneley R. N.F., Aust S.D. «Direct electron transfer between ligninolytic redox enzymes and electrodes» Electroanalysis 2004. V. 16, P. 1074-1092

147. Christenson A., Shleev S., Mano N., Heller A., Gorton L. «Redox potentials of the bluecopper sites of bilirubin oxidases» Biochim. Biophys. Acta 2006. V. 1757, 16341641

148. Claus H «Laccases and their occurrence in prokaiyotes» Arch. Microbiol. 2003. V.179, P.145-150

149. Claus H «Laceases: structure, reactions, distribution» Micron 2004. V. 35, P. 93-96

150. Colao MCh., Gandllo A.M., Buonocore V., Schiesser A., Ruzzi M. «Primary structureand transcription analysis of a laccase-encoding gene from the basidiomycete Trámeles trogii» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 63, P. 153-158

151. Cole J.L., Ballou D.P., Solomon E.I. «Spectroscopic characterization of the peroxideintermediate in the reduction of dioxygen catalyzed by the multicopper oxidases» J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113, 8544-8546

152. Cole J.L., Tan G.O., E. K. Yang, Keith O. Hodgson, Solomon E.I. «Reactivity of thelaccase trinuclear copper active site with dioxygen: an X-ray absorption edge study» J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112, P. 2243-2249

153. Coll P.M., Fernández-Abalos J.M,.Villanueva J;R, Santamaría R, Pérez P.

154. Purification and characterization of a phenoloxidase (laccase) from the lignin-degrading basidiomycete PM1 (CECT 2971)» Appl. Environ. Microbiol. 1993a. V. 59, P. 2607-2613

155. Coll P.M, Tabernero C., Santamaría R, Pérez P. «Characterization and structuralanalysis of the laccase I gene from the newly isolated ligninolytic basidiomycete PM1 (CECT 2971)»Appl. Environ. Microbiol. 1993b. V. 59, P. 4129-4135

156. Coman V., Ludwig R, Harreither W., Haltrich D., Gorton L„ Ruzgas T., Shleev S. «Adirect electron transfer-based glucose/oxygen biofuel cell operating in human serum» Fuel Cells 2010. V. 10, P. 9-16

157. Coman V., Vaz-Domínguez C., Ludwig R, Harreither W., Haltrich D., De Lacey A.,

158. Ruzgas T., Gorton L., Shleev S. «A membrane-, mediator-, cofactor-less glucose/oxygen biofuel cell» Phys. Chem. Chem. Phys. 2008. V. 10, P. 6093-6096

159. Couto S.R and Herrera J.L.T. «Industrial and biotechnological1 applications oflaccases» Biotechnol. Adv. 2006. V. 24, P. 500-513

160. Dagys M., Haberska K, Shleev S., Arnebrant T., Kulys J., Ruzgas T. «Goldnanoparticle assisted bioelectrocatalytic reduction of oxygen by Trametes hirsuta laccase» Electrochem. Commun. 2010. V. 12, P. 933-935

161. Damkhus T., Fogt U. «Method of removing excess dye from print or colored textiles oryarn» US Patent N2 6,409,771 June 25, 2002

162. Das N., Sengupta S., Mukheijee M «Importance of laccase in vegetative growth of

163. PleurotusJlorida» Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63, P. 4120-4122

164. Dedeyan B., Klonowska A., Tagger S., Tron T., Iacazio G., Gil G., Le Petit J.

165. Biochemical and molecular characterization of a laccase from Marasmius quercophilus» Appl. Environ. Microbiol 2000. V. 66, P. 925-929

166. De Ley M and Osaki S. «Intramolecular electron transport in human ferroxidaseceruloplasmin)» Biochem. J. 1975. 151, P. 561-566

167. Denium J. and Vanngard T. «The stoichiometry of the paramagnetic copper and theoxidation-reduction potentials of type I copper in human ceruloplasmin» Biochim. Biophys. Acta 1973. V. 310, P. 321-330

168. Diamantidis G., Effosseb A., Potierb P., Ballyb R «Purification and characterization ofthe first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum» Soil Biol Biochem. 2000. V. 32, P. 919-927

169. Dittmer J.K., Patel N.J., Dhawale S.W., Dhawale S.S. «Production of multiple laccaseisoforms by Phanerochaete chrysosporium grown under nutrient sufficiency» FEMSMicrobiology Letters 1997. V. 149, P. 65-70

170. Dong J.L. and Zhang Y.Z «Purification and Characterization of Two Laccase1.oenzymes from a Ligninolytic Fungus Trametes gallica» Prep. Biochem. Biotech. 2004. V. 34, P. 179-194

171. Ducros V., Brzozowski A.M., Wilson KS., Brown S.H., 0stergaard P., Schneider P.,

172. Yaver D.S., Pedersen A.H., Davies G.J. «Crystal structure of the type-2 Cu depleted laccase from Coprinus cinereus at 2.2 A resolution». Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5, P. 310-316.

173. Ducros V., Brzozowski A.M, Wilson K.S., 0stergaard P., Schneider P., Svendson A.,

174. Davies G.J. «Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68 A resolution: evidence for different 'type 2 Cu-depleted1 isoforms» Acta Cryst. 2001. V. D57, P. 333-336

175. Dutton P.L. «Redox potentiometry: Determination of midpoint potentials of oxidationreduction components of biological electron-transfer systems» Methods Enzymol. 1978. V. 54, P. 411-435

176. Duran N., Rosa MA., D'Annibale A., Gianfreda L. «Applications of laccases andtyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review» Enzyme Microb. Technol. 2002. V. 31, P. 907-931

177. Echigo T., Ohno R. «Process for producing high-molecular-weight phenoliccompounds with myrothecium» US Patent № 6,190,891 February 20, 2001

178. Ehresmann B., Imbault P., Well J.H. «Spectrophotometric determination of proteinconcentration in the cell extracts containing tRNA's» Anal. Biochem. 1973. V. 54, P. 454-463

179. Edens W.A., Goins T.Q., Dooley D., Hensonl J.M «Purification and characterizationof a secreted laccase of Gaeumannomyces graminis var. Tritici» Appl Environ. Microbiol. 1999. V. 65, P. 3071-3074

180. Eggert C., Temp U., Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. «Lacease-mediated formation of thephenoxazinone derivative, cinnabarinic acid» FEBSLett. 1995. V. 376, P. 202-206

181. Eggert C., Temp U., and Eriksson K.E «The ligninolytic system of the white rotfungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the lacease» Appl. Environ. Microbiol 1996. V. 62, P. 1151-1158.

182. Eggert C., Temp U., Eriksson K-E. L. «Lacease is essential for lignin degradation bythe white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus». FEBS Letteers 1997. V. 407, P. 89-92

183. Eggert C„ LaFayette P.R, Temp U., Eriksson K.-E.L., Dean J.F.D. «Molecularanalysis of a laccase gene from the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus» Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64, P. 1766-1772

184. Einsle O., Messerschmidt A., Stach P., Bourenkov G.P., Bartunik H.D., Huber R,

185. Kroneck P.M. «Structure of cytochrome c nitrite reductase» Nature 1999. V. 400, P. 476-480

186. Enguita F.J., Matías P.M, Martins L.O., Plácido D., Henriques A.O., Carrondo M.A.

187. Spore-coat laccase CotA from Bacillus subtilis: crystallization and preliminary X-ray characterization by the MAD method» Acta Cryst. 2002. V. D58, P. 1490-1493

188. Enguita F.J., Martins L.O., Henriques A.O., Carrondo M.A. «Crystal structure of abacterial endospore Coat component: A laccase with enhanced thermostability properties» J. Biol. Chem., 2003. V. 278, P. 19416-19425

189. Enguita F.J., Mar?al D., Martins L.O., Grenha R, Henriques A.O., Lindley P.F.,

190. Carrondo MA. «Substrate and dioxygen binding to the endospore Coat laccase from Bacillus subtilis» J. Biol. Chem. 2004. V. 279, P. 23472-23476

191. Esaka M, Fujisawa K., Goto M, Kisu Y. «Regulation of ascorbate oxidase expressionin pumpkin by auxin and copper» Plant Physiol. 1992. V. 100, P. 231-237

192. Fabbrini M., Galli C., Gentili P. «Comparing the catalytic efficiency of some mediatorsof laccase» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2002. V.16, P. 231-240

193. Falk K.E., Reinhammar B. «Visible and near-infrared circular dichroism of some bluecopper proteins» Biochim. Biophys. Acta, 1972, 285, 84-90

194. Farneth W.E., Hasty N.M., Damore M.B., Chisholm D.A. «Oxygen scavengingcompositions and methods of use» WO 2005033676, April 14,2005

195. Ferapontova E.E., Shleev S., Ruzgas T., Stoica L., Christenson A., Tkac J., Yaropolov

196. Ferraroni M., Duchi I., Myasoedova N.M., Leontievsky A.A., Golovleva L.A.,

197. Scozzafava A., Briganti F. «Crystallization and preliminary structure analysis of the blue laccase from the ligninolytic fungus Panus tigrinus» Acta Cryst. 2005. V. F61, P. 205-207

198. Frieden E., Hsieh H.S. «Ceruloplasmin: the copper transport protein with essentialoxidase activity» Adv. Enzymol. Ramb. 1976. V. 44, P. 187-236

199. Freire RS., Pessoa C.A., Mello L.D., Kubota L.T. «Direct electron transfer: anapproach for electrochemical biosensors with higher selectivity and sensitivity» J.

200. Braz. Chem. Soc. 2003. V. 14, P. 230-243

201. Fukushima Y. and Kirk T.K. «Laccase component of the Ceriporiopsis subvermisporalignin-degrading system» Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61, P. 872-876

202. Galhaup C. and Haltrich D. «Enhanced formation of laccase activity by the white-rotfungus Trametes pubescens in the presence of copper» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 56, P. 225-232

203. Galhaup C., Goller S., Peterbauer C.K., Strauss J., Haltrich D. «Characterization of themajor laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions» Microbiology 2002, V. 148, P. 2159-2169

204. Galli C., Gentili P. «Chemical messengers: mediated oxidations with the enzymelaccase» J. Phys. Org. Chem. 2004. V. 17, P. 973-977.

205. Gamelas J.A.F., Tavares A.P.M., Evtuguin D.V., Xavier A.M.B. «Oxygen bleaching ofkraft pulp with polyoxometalates and laccase applying a novel multi-stage process» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2005a. V. 33, P. 57-64

206. Gamelas J.A.F., Gaspar A.R., Evtuguin D.V., Neto C.P. «Transition metal substitutedpolyoxotungstates for the oxygen delignification of kraft pulp» Applied Catalysis A: General 2005b.V. 295, P. 134-141

207. Garavaglia S., Cambria M.T., Miglio M., Ragusa S., Iacobazzi V., Palmieri F.,

208. D'Ambrosio C., Scaloni A., Rizzi M. «The structure of Rigidoporus lignosus laccase containing a full complement of copper ions, reveals an asymmetrical arrangement for the T3 copper pair» J. Mol. Biol. 2004. V. 342, P. 1519-1531

209. Gardner RR, Glogowski M.W., Haught J.C., Baeck A.C., Convents A.C., Smets J.,

210. Van Steenwinckel P.C.A., Gray P.G., Cruickshank G.D., Costello A., Duncan M. «Compositions for cleaning with softened water» W02006044952, April 27, 2006

211. Garzillo A.M., Colao M.C., Buonocore V., Oliva K, Falcigno L., Saviano M., Santoro

212. A.M., Zappala R., Bonomo R.P., Bianco C., Giardina P., Palmieri G., Sannia G. «Structural and kinetic characterization of native laccases from Pleurotus ostreatus, Rigidoporus lignosus, and Trametes trogii». J. Protein Chem. 2001. V. 20, P. 191201

213. Gelo-Pujic M., Kim H.H., Butlin N.G., Palmore G.T. «Electrochemical studies of atruncated laccase produced in Pichia pastoris» Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65, P.5515-5521

214. Gianfreda L., Xu F., Bollag J.-M. «Laccases: A useful group of oxidoreductiveenzymes» Bioremediation J. 1999. V. 3, P. 1-26

215. Ghindilis A. L., Gavrilova V. P., Yaropolov A. I. «Laccase-based biosensor fordetermination of polyphenols: determination of catechols in tea» Biosens. Bioelectron. 1992. V. 7, P. 127-131

216. Ghindilis A. «Direct electron transfer catalysed by enzymes: application for biosensordevelopment» Biochem. Soc. Tran. 2000. V. 28, P. 84-89

217. Giardina P., Aurilia V., Cannio R, Marzullo L., Amoresano A., Siciliano R, Pucci P.,

218. Sannia G. «The gene, protein and glycan structures of laccase from Pleurotus ostreatus» Eur. J. Biochem. 1996. V. 235, P. 508-515

219. Giardina P., Palmieri G., Scaloni A., Fontanella B., Faraco V., Cennamo G., Sannia G.

220. Protein and gene structure of a blue laccase from Pleurotus ostreatus» Biochem. J. 1999. V. 341, 655-663

221. Goldfinch M.E. and Maguire G.A. «Investigation of the use of bilirubin oxidase tomeasure the apparent unbound bilirubin concentration in human plasma» Ann. Clin. Biochem. 1988. V. 25, P. 73-77

222. Gomes S.A.S.S., Nogueira J.M.F., Rebelo M.J.F. «An amperometric biosensor forpolyphenolic compounds in red wine» Biosens. Bioelectron. 2004. V. 20, P. 12111216

223. Gorbacheva M, Morozova O., Shumakovich G., Streltsov A., Shleev S., Yaropolov A.

224. Enzymatic oxidation of manganese ions catalysed by laccase» Bioorg. Chem. 2009. V. 37, P. 35-49

225. Gotoh Y., Kondo Y., Kaji H., Takeda A., Samejima T.J. «Characterization of copperatoms in bilirubin oxidase by spectroscopic analyses» J. Biochem. (Tokyo) 1989. V. 106, P. 621-626

226. Gorton L., Lindgren A., Larsson T., Munteanu F.D., Ruzgas T., Gazaryan I. «Directelectron transfer between heme-containing enzymes and electrodes as basis for third generation biosensors» Anal. Chim. Acta 1999. V. 400, P. 91-108

227. Grass G. and Rensing C. «CueO is a multi-copper oxidase that confers copper tolerancein Escherichia coli» Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 286, P. 902-908

228. Greco G., Sannino F., GianfiredaL., Toscanoa G., Cioffi M. «Dephenolisation of olivemill waste-waters by olive husk» Water Res. 1999, V. 33, P. 2905-3062

229. Guillén F., Muñoz C., Gómez-Toribio V., Martínez A.T., Martínez MJ. «Oxygenactivation during oxidation of methoxyhydroquinones by laccase from Pleurotus eryngii» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, P. 170-175

230. Gunnarsson P.O., Nylen U., Pettersson G. «Kinetics of the interaction betweenceruloplasmin and reducing substrates» Eur. J. Biochem. 1973. V. 37, P. 41-46

231. Guo H., Knobler C.M, Kaner R.B. «A chiral recognition polymer based onpoly aniline» Synthetic Metals 1999. V. 101, P. 44-47

232. Guo J., Liang X.X., Mo P.S., Li G.X. «Purification and properties of bilirubin oxidasefromMyrothecium verrucaria» Appl. Biochem. Biotechnol 1991. V. 31, P. 135-143

233. Guo L.H., Hill H.A.O. «Direct electrochemistry of proteins and enzymes» Adv. Inorg.

234. Chem. 1991. V. 36, P. 341-375

235. Gwyer J.D., Richardson D.J., Butt J.N. «Diode or tunnel-diode characteristics?

236. Resolving the catalytic consequences of proton coupled electron transfer in a multi-centered oxidoreductase» J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127, P. 14964-14965

237. Gunther Th., Pemer B., Gramss G. «Activities of phenol oxidizing enzymes ofectomycorrhizal fungi in axenic culture and in symbiosis with Scots pine (Pinus sylvestris L.)» J. Basic Microbiol. 1998. V. 38, P. 197-206

238. Haberska K, Vaz-Dominguez C., De Lacey A.L., Dagys M, Reimann C.T., Shleev S.

239. Direct electron transfer reactions between human ceruloplasmin and electrodes» Bioelectrochemistry 2009. V. 76, P. 34-41

240. Hage R., Hora J., SwarthofFT., Twisker RS. «Method for enhancing the activity of anenzyme» US Patent № 6,225,275, Mayl, 2001

241. Hagen W.R «Direct electron transfer of redox proteins at the bare glassy carbonelectrode» Eur. J. Biochem. 1989. V. 182, P. 523-530

242. Haghighi B., Rahmati-Panah A., Shleev S., Gorton L. «Carbon ceramic electrodesmodified with laccase from Trametes hirsuta: fabrication, characterization and their use for phenolic compounds detection» Electroanalysis 2007. V. 19, P. 907-917

243. Hakulinen N., Kiiskinen LL., Kruus K., Saloheimo M., Paananen A., Koivula A.,

244. Rouvinen J. «Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site» Nat. Struct. Biol. 2002. V. 9, P. 601-605

245. Heller A., Mano N. Kim H.-H., Zhang Y., Mao F., Chen T„ Barton S.C. «Miniaturebiological fuel cell that is operational under physiological conditions, and associated devices and methods» W003106966, December 20,2003

246. Heller A. «Miniature biofuel cells» Phys. Chem. Chem. Phys. 2004. V. 6, P. 209-216

247. Heller A. «Biological fuel cell and methods» US Patent 7,018,735, March 28,2006

248. Hiromi K, Yamaguchi Y., Sugiura Y., Iwamoto H, Hirose J. «Bilirubin oxidase from

249. Trachyderma tsunodae K-2593, a multi-copper enzyme» Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. V. 56, P. 1349-1350

250. Hirose J., Inoue K, Sakuragi H., Kikkawa M, Minakami M, Morikawa T., Iwamoto

251. HL, Hiromi K. «Anions binding to bilirubin oxidase from Trachyderma tsunodae K-2593» Inorg. Chim. Acta 1998. V. 273, P. 204-212

252. Hirst J., Sucheta A., Ackrell B.A.C., Armstrong F. A. «Electrocatalytic voltammetry ofsuccinate dehydrogenase: direct quantification of the catalytic properties of a complex electron-transport en2yme» J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118, P. 5031-5038

253. Hyung K.H., Jun K.Y., Hong H.-G., Kim H.S., Shin W. «Immobilization of laccaseonto the gold electrode using /?-mercaptopropionate» Bull. Korean Chem. Soc. 1997. V. 18, P. 564-566

254. Hoegger P.J., Kilaru S., James T.Y., Thacker J.R., Kiies U. «Phylogenetic comparisonand classification of laccase and related multicopper oxidase protein sequences» FEBSJ. 2006. V. 273, P. 2308-2326

255. Huang R., Christenson P., Labuda I.M «Process for the preparation of nootkatone bylaccase catalysis» US Patent № 6,200,786, March 13,2001

256. Hublik G., Schinner F. «Characterization and immobilization of the laccase from

257. Pleurolus ostreaius and its use for the continuous elimination of phenolic pollutants» Enzyme Microb. Technol. 2000. V. 27, P. 330-336

258. Hullo M.-F., Moszer I., Danchin A., Martin-Verstraete I. «CotA of Bacillus subtilis is acopper-dependent laccase» J. Bacteriol 2001. V. 183, P. 5426-5430

259. Hofer C. and Schlosser D. «Novel enzymatic oxidation of Mn2+ to Mn3+ catalyzed by afungal laccase» FEBSLett. 1999. V. 451, P. 186-190

260. Hiittermann A., Majcherczyk A., Mai C., Braun-Lullemann A., Fastenrath M.,

261. Ikeda O. and Sakurai T. «Electron transfer reaction of stellacyanin at a bare glassycarbon electrode» Eur. J. Biochem. 1994. V. 219, P. 813-819

262. Itoh H., Hirota A., Hirayama K., Shin T., Murao S. Properties of ascorbate oxidaseproduced by Acremonium sp. HI-25. Biosci. Biotech. Biochem. 1995. V. 59, P. 1052-1056

263. Jarosz-Wilkolazka A., Ruzgas T., Gorton L. «Amperometric detection of mono- anddiphenols at Cerrena unicolor laccase-modified graphite electrode: correlation between sensitivity and substrate structure» Talanta 2005. V. 66, P. 1219-1224

264. Jetten J.M., Van Den Dool R, Van Hartingsveldt W., Besemer A.C. «Process forselective oxidation of cellulose» US Patent № 6,716,976, April 6, 2004

265. Jin L., Liu H., Fang Y. «Ascorbic acid oxidase biosensor based on the glassy carbonelectrode modified with Nafion and methyl viologen» Fenxi Huaxue 1992. V. 20,1. P. 515-519

266. Johannes C., Majcherczyk A., Huttermann A. «Degradation of anthracene by laccaseof Trametes versicolor in the presence of different mediator compounds» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 46, P. 313-317

267. Johannes C., Majcherczyk A. «Natural mediators in the oxidation of polycyclicaromatic hydrocarbons by laccase mediator systems» Appl. Environ. Microbiol. 2000a. V. 66, P. 524-528

268. Johannes C., Majcherczyk A. «Laccase activity tests and laccase inhibitors» J.

269. Biotechnol. 2000b. V. 78, P. 193-199

270. Johansen C., Deussen H.-J. «Antimicrobial composition containing an oxidoreductaseand an enhancer of the N-hydroxyanilide-type» US Patent № 6,592,867, July 15, 2003

271. Johnson D.L., Thompson J.L., Brinkmann S.M, Schuller K.A., Martin L.L.

272. Electrochemical characterization of purified Rhus vernicifera laccase: voltammetric evidence for a sequential four-electron transfer» Biochemistry 2003. V. 42, P. 10229-10237

273. Jong de E., Field J.A., Bont de J.A.M. «Aiyl alcohols in the physiology of ligninolyticfungi» FEMSMicrobiol Rev. 1994,V.13,P. 153-187

274. Jung H., Xu F., Li K. «Purification and characterization of laccase from wooddegrading fungus Trichophyton rubrum LKY-7» Enz. Microb. Technol. 2002. V. 30, P. 161-168

275. Jonsson L.J., Palmqvist E., Nilvebrant N.-O., Hahn-Hagerdal B. «Detoxification ofwood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49, P. 691-697

276. Kabsch W. and Sander C. «Dictionary, of protein secondary structure: Patternrecognition of hydrogen-bonded and geometrical features» Biopolymers 1983. V. 22, P. 2577-2637

277. Kane-Maguire L.A.P., MacDiarmid A.G., Norris I.D., Wallace G.G., Zheng W.

278. Facile preparation of optically active polyanilines via the in situ chemical oxidative polymerisation of aniline» Synth. Met. 1999. V. 106, P. 171-176

279. Karamyshev A.V., Shleev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu.1.ccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline» Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 33, P. 556-564

280. Karhunen E., Niku-Paavola M.-L., Viikari L., Haltia T., van der Meer R.A., Duine J.A.

281. A novel combination of prosthetic groups in a fungal laccase; PQQ and two copper atoms» FEBSLett. 1990. V. 267, P. 6-8

282. Katz E. «Bioelectronics» Electroanalysis 2006. V. 18, P. 1855-1857

283. Kawahara K., Suzuki S., Sakurai T., Nakahara A. «Characterization of cucumberascorbate oxidase and its reaction with hexacyanoferrate (II)» Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 241, P. 179-186

284. Kawai S., Nakagawa M., Ohashi H. «Aromatic ring cleavage of a non-phenolic b-O-4lignin model dimer by laccase of Trametes versicolor in the presence of 1 -hydroxybenzotriazole» FEBS Lett. 1999. V. 446, P. 355-358

285. Kersten P.J., Kalyanaraman B., Hammel K.E., Reinhammar B. and Kirk T.K.

286. Comparison of lignin peroxidase, horseradish peroxidase and laccase in the oxidation of methoxybenzenes» Biochem. J. 1990. V. 268, 475-480

287. Kiefer-Meyer M.C,, Gomord V., O'Connell A., Halpin C., Faye L. «Cloning andsequence analysis of laccase-encoding cDNA clones from tobacco» Gene 1996. V.178, P. 205-207

288. Kierulff J.V. «Modification of polysaccharides by means of a phenol oxidizingenzyme» US Patent № 6,660,503, December 9, 2003

289. Kiiskinen L.-L., Viikari L., Kruus K. «Purification and characterisation of a novellaccase from the ascomycete Melanocarpus aJbomyces» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, V. 59, P. 198-204

290. Kiiskinen L.L., Saloheimo M «Molecular cloning and expression in Saccharomycescerevisiae of a laccase gene from the ascomycete Melanocarpus albomyces» Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70, P. 137-144

291. Klein in J., Prodromidis MI., Karayannis M.I. «An enzymic method for thedetermination of bilirubin using an oxygen electrode» Electroanalysis 2000. V. 12, P. 292-295

292. Klonowska A., Gaudin C., Fournel A., Asso M., Le Petit J., Giorgi M., Tron T.

293. Characterization of a low redox potential laccase from the basidiomycete C30» Eur. J. Biochem. 2002. V. 269, P. 6119-6125

294. Ko E.-M, Leem Y.-E., Choi H.T. «Purification and characterization of laccaseisozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57, P. 98-102

295. KojimaY., TsukudaY., KawaiY., Tsukamoto A., Sugiura J., Sakaino M, Kita Y.

296. Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus» J. Biol. Chem. 1990. V. 265, P. 15224-15230

297. Koroljova O., Stepanova E., Gavrilova V., Biniukov V., Jaropolov A., Varfolomeyev

298. S., Scheller F., Makower A., Otto A. «Laccase of Coriolus zonatus: isolation,purification, and some physicochemical properties» Appl. Biochem.Biotech. 1999. V. 76, P. 115-128

299. Kroneck P.M.H., Armstrong F.A., Merkle H., Marchesini A. «Ascorbate oxidase:molecular properties and catalytic activity» Adv. Chem. Ser. 1982. V. 200, P. 223248

300. Kruus K. «Laccase: a useful enzyme for industrial applications». Kemia Kemi 2000.1. V. 27, P. 184-186

301. Kumar S.V.S., Phale P.S., Durani S., Wangikar P.P. «Combined sequence andstructure analysis of the fungal laccase family» Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 83, P. 386-394

302. Kumari H. L. and Sirsi M. «Purification and properties of laccase from Ganodermalucidum» Arch. Microbiol. 1972. V. 84, P. 350-357

303. Kuznetsov A.M., Bogdanovskaya V.A., Tarasevich M.R, Gavrilova E.F. «Themechanism of cathode reduction of oxygen in a carbon carrier-laccase system» FEBSLett. 1987. V. 215, P. 219-222

304. LaFayette P.R., Eriksson K.-E.L., Dean J.F.D. «Characterization and heterologousexpression of laccase cDNAs from xylem tissues of yellow-poplar (Liriodendron tulipifera)» Plant Molecular Biology 1999. V. 40, P. 23-35

305. Lang G., Cotteret J. «Dyeing composition containing a laccase and method for dyeingkeratinous fibres» US Patent Application № 20060021155, February 2, 2006

306. Lante A., Crapisi A., Krastanov A., Spettoli P. «Biodégradation of phenols by laecaseimmobilised in a membrane reactor» Process Biochem. 2000. V. 36, P. 51-58

307. Larrabee J.A. and Spiro T.G. «Cobalt11 substitution in the type 1 site of the multicopper oxidase Rhus laccase» Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 88, P. 753-760

308. Larsson T., Lindgren A., Ruzgas T. «Spectroelectrochemical study of cellobiosedehydrogenase and diaphorase in a thiol-modified gold capillary in the absence of mediators» Bioelectrochemistry 2001. V. 53,243-249

309. Lee C.-W., Gray H.B., Anson F.C. «Catalysis of the reduction of dioxygen at graphiteelectrodes coated with fungal laccase A» J. Electroanal. Chem. 1984. V. 172, P. 289-300

310. Lee S.-K, George S.D., Antholine W.E., Hedman B., Hodgson KO., Solomon E.I.

311. Nature of the intermediate formed in the reduction of O2 to H2O2 at the trinuclear copper cluster active site in native laccase» J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124, P. 6180-6193

312. Leite O.D., Fatibello-Filno O., de M. Barbosa A. «Determination of catecholamines inpharmaceutical formulations using a biosensor modified with a crude extract of fungi lacase (Pleurotus ostreatus•)» J. Braz. Chem. Soc. 2003. V. 14, P. 297-303

313. Leonowicz and K. Grzywnowicz «Quantitative estimation of laccase forms in somewhite-rot fungi using syringaldazine as a substrate» Enzyme Microb. Technol. 1983. V. 3, P. 55-58

314. Leonowicz A., Cho N.-S., Luterek J., Wilkolazka A., Wojtas-Wasilewska M.,

315. Matuszewska A., Hofrichter M., Wesenberg D., Rogalski J. «Fungal laccase: properties and activity on lignin» J. Basic Microbiol. 2001. V. 41, P. 185-227

316. Leontievsky A.A., Myasoedova N.M, Baskunov B.P., Evans C.S., Golovleva L.A.

317. Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by the white rot fungi Panus tigrinus and Coriolus versicolor» Biodégradation 2000. V. 11, P. 331-340

318. Leontievsky A., Myasoedova N., Baskunov B., Golovleva L., Bucke C., Evans C.

319. Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by free and immobilized fungal laccase» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57, P. 85-91

320. Lewis E.A., Tolman, W.B. «Reactivity of dioxygen-copper systems» Chem. Rev. 2004.1. V. 104, P. 1047-1076

321. Li J.-B., McMillin D. R «The electronic spectrum of Co(H) in the type 1 site of Rhusvernicifera laccase» Inorg. Chim. Acta 1990. V. 167, P. 119-122

322. Li K, Xu F., and Eriksson K-E.L. «Comparison of fungal laccases and redox mediatorsin oxidation of a nonphenolic lignin model compound» Appl. Environ. Microbiol. 1999, V. 65, P. 2654-2660

323. Li X., Wei Z., Zhang M, Peng X., Yu G., Teng M, Gong W. «Crystal structures of E.coli laccase CueO at different copper concentrations» Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 354, P. 21-26

324. Lin L.S. and Varner J.E. «Expression of ascorbic acid oxidase in zucchini squash

325. Cucurbitapepo L.)» Plant Physiol. 1991. V. 96, P. 159-165

326. Lindgren A., Tanaka M, Ruzgas T., Gorton L., Gazaryan I., Ishimori K, Morishima I.

327. Direct electron transfer catalysed by recombinant forms of horseradish peroxidase: insight into the mechanism» Electrochem. Commun. 1999. V. 1, P. 171-175

328. Lindgren A., Gorton L., Ruzgas T., Baminger U., Haltrich D., Schûlein M «Directelectron transfer of cellobiose dehydrogenase from various biological origins at gold and graphite electrodes» J. Electroanal. Chem. 2001. V. 496, P. 76-81

329. Lindley P.F., Card G., Zaitseva I, Zaitsev V., Reinhammar B., Selin-Lindgren E.,

330. Yoshida K «An X-ray structural study of human ceruloplasmin in relation to ferroxidase activity» J. Biol. Inorg. Chem. 1997. V. 2, P. 454-463

331. Liu W., Kumar J., Tripathy S., Samuelson L.A. «Enzymatic synthesis of conductingpolyaniline in micelle solutions» Langniuir 2002. V. 18; P. 9696-9704

332. Ludwig R, Salamon A, Varga J, Zamocky M, Peterbauer CK, Kulbe KD, Haltrich D.

333. Characterisation of cellobiose dehydrogenases from the white-rot fungi Trametes pubescens and Trametes villosa» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. V. 64, 213222

334. Lund M., Felby C. «Process for treating pulp with laccase and a mediator to increasepaper wet strength» US Patent № 6,610,172, August 26, 2003

335. Lyashenko A.V., Zhukhlistova N.E., Gabdoulkhakov A.G., Zhukova Y.N., Voelter W.,

336. Ma, X., S. E. Rokita. «Role of oxygen during horseradish peroxidase turnover andinactivation» Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 157, P. 160-165

337. Macholan L. and Chmelikova B. «Plant tissue-based membrane biosensor for Lascorbic acid» Anal. Chim. Acta. 1986. V. 185, P. 187-193

338. Machonkin T.E. «Spectroscopic and biochemical studies of multicopper oxidasesinvolved in iron metabolism» Ph.D. Thesis, Stanford University, Stanford, CA, USA, 2000

339. Machonkin T.E., Musci G., Zhang H.H., Bonaccorsi di Patti M.C., Calabrese L.,

340. Hedman B., Hodgson K.O., Solomon E.I. «Investigation of the anomalous spectroscopic features of the copper sites in chicken ceruloplasmin: comparison to human ceruloplasmin» Biochemistry 1999. V. 38, P. 11093-11102

341. Machonkin T.E., Zhang EH., Hedman B., Hodgson K.O., Solomon E.I.

342. Spectroscopic and magnetic studies of human ceruloplasmin: identification of a, redox-inactive reduces type 1 copper site» Biochemistry 1998. V. 37, P. 9570-9578

343. Maganadze G.G., Shutyaev T.Yu. In: «Laser Ionization Mass Analysis» (Vertes A.,

344. Gijbels R. and Adams F. Eds.) Chemical Analysis Series, 1993, V. 124, P. 505549, J. Wiley and Sons, New York

345. Malkin R, Malmstrom B.G., Vanngard T. «The reversible removal of one specificcopper (E) from fungal laccase» Eur. J. Biochem. 1969. V. 7, P. 253-259

346. Malmstrom B.G. «Enzymology of Oxygen» Annu. Rev. Biochem. 1982. V. 51, P. 21-59

347. Malovik V., Yaropolov A.I., Varfolomeev S.D. «Oxidation of lignins and theircomponents by oxygen in the presence of laccase from Polyporus versicolor. Lignin detection by an enzyme electrode» Collection Czech. Chem. Commun. 1984. V. 49, P. 1390-1394

348. Mano N., Kim H.-H., Heller A. «On the relationship between the characteristics ofbilirubin oxidases and O2 cathodes based on their "wiring"» J. Phys. Chem. B 2002. V. 106, P. 8842-8848

349. Mano N., Kim H-K, Zhang Y., Heller A. «An oxygen cathode operating in aphysiological solution» J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124, P. 6480-6486

350. Marchesini A., Kroneck P.MH «Ascorbate oxidase from Cucurbita pepomedullosa.

351. New method of purification and reinvestigation of properties» Eur. J. Biochem. 1979, V. 101, P. 65-76

352. Marcus R.A. and Sutin N. «Electron transfers in chemistry and biology» Biochim.

353. Biophys. Acta 1985. V. 811, P. 265-322

354. Martins L.O., Soares C.M, Pereira M.M., Teixeira M, Costa T., Jones G.H.,

355. Henriques A.O. «Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore Coat» J. Biol. Chem. 2002. V. 277, P. 18849-18859

356. Marzorati M, Danieli B., Haltrich D., Riva S. «Selective laccase-mediated oxidationof sugars derivatives» Green Chem. 2005. V. 7, P. 310-315

357. Matijosyte I., Arends I.W.C.E., Sheldon R.A., S. de Vries. «Pre-steady state kineticstudies on the microsecond time scale of the laccase from Trametes versicolor» Inorg. Chim. Acta 2008. V. 361, 1202-1206

358. Matsumoto K, Yamada R, Osajiama K. «Ascorbate electrode for determination of Lascorbic acid in food» Anal. Chem. 1981. V. 53, P. 1974-1979

359. May S.W. «Applications of oxidoreductases» Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V. 10,1. P. 370-375

360. Mayer A.M and Staples RC. «Laccase: new functions for an old enzyme»

361. Phytochemistry 2002. V. 60, P. 551-565

362. MacDiarmid A.G. «Polyaniline and polypyrrole: where are we headed?» Synth. Met.1997. V. 84, P. 27-34

363. MacDiamid A.G. «Synthetic metals: a novel role for organic polymers» Synth. Met.2002. V. 125, P. 11-22

364. Messerschmidt A. and Huber R. «The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase andceruloplasmin. Modelling and structural relationships» Eur. J. Biochem. 1990. V. 187, P. 341-352

365. Messerschmidt A., Ladenstein R, Huber R, Bolognesi M, Avigliano L., Petruzzelli

366. R, Rossi A., Finazzi-Agro A. «Refined crystal structure of ascorbate oxidase at 1.9 Â resolution». J. Mol. Biol. 1992. V. 224, P. 179-205

367. Michizoe J., Ichinose H., Kamiya N., Maruyama T., Goto M. «Biodégradation ofphenolic environmental pollutants by a surfactant-laccase complex in organic media» J. Biosci. Bioeng. 2005. V. 99, P. 642-647

368. Min K.-L.; Kim Y.-H.; Kim Y.W.; Jung H.S.; Hah Y.C. «Characterization of a novellaccase produced by the wood-rotting fungus Phellinus ribis» Arch. Biochem. Biophys. 2001. V. 392, P. 279-286

369. Minteer S.D., Treu B.L., Duma R. «Direct electron transfer using enzymes inbioanodes, biocathodes, and biofuel cells» 2007. WO 2007084249 A2, 56 pp.

370. Minussi R, Pastore G.M, Duran N. «Potential application of laccase in the foodindustry» Trends Food Sci. Technol. 2002. V. 13, P. 205-216

371. Mizutani K, Toyoda M., Sagara K., Takahashi N., Sato A., Kamitaka Y., Tsujimura S.,

372. Nakanishi Y., Sugiura T., Yamaguchi S., Kano K., Mikamia B. «X-ray analysis of bilirubin oxidase from Myrothecium verrucaria at 2.3Â resolution using a twinned crystal» Acta Cryst. 2010. V. F66, P. 765-770

373. Molitoris HP., Esser K «Die phenoloxydasen des ascomyceten Podospora anserina.

374. V. Eigenschafiten der laccase I nach weiterer reinigung» Arch. Microbiol. 1970. V. 72, P. 267-296

375. Mondovi B., Befani O., Sabatini S. «Recent results on the active site of amineoxidases» Agents Actions 1984. V. 14, P. 356-357

376. Morie-Bebel MM, Morris M.C., Menzie J.L., MeMillin D.R. «A mixed-metalderivative of laccase containing mercury (II) in the type 1 binding site» J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106, P. 3677-3678

377. Munoz C., Guillen F., Martinez A.T. and Martinez MJ. «Laccase isoenzymes of

378. Pleurotus eryngii: characterization, catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn2+ oxidation» Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63, P. 2166-2174

379. Murao S. and Tanaka N. «A new enzyme "bilirubin oxidase" produced by

380. Myrothecium verrucaria MT-1» Agricult. Biol. Chem. 1981. V. 45 P. 2383-2384

381. Nakagawa T., Tsujimura S., Kano K., Ikeda T. «Bilirubin oxidase and Fe(CN)6.3"/4"modified electrode allowing diffusion-controlled reduction of O2 to water at pH 7.0.» Chem. Lett. 2003. V. 32, P. 54-55

382. Nakamura T. «Purification and physico-chemical properties of laccase» Biochim.

383. Biophys. Acta 1958. V. 30, P. 44-52

384. Nakamura T., Makino N., Ogura Y. «Purification and properties of ascorbate oxidasefrom cucumber» J. Biochem. (Tokyo) 1968. V. 64, P. 189-195

385. Naqui, A and S.D. Varfolomeev. «Inhibition mechanism of Polyporus laccase byfluoride ion» FEBS Lett. 1980. V. 113, P. 157-160

386. Nazaruk E., Michota A., Bukowska J., Shleev S., Gorton L., Bilewicz R. «Properties ofnative and hydrophobic laccases immobilized in the liquid-crystalline cubic phase on electrodes» J. Biol. Inorg. Chem. 2007. V. 13, P. 335-344

387. Newcomb E.H. «Effect of auxin on ascorbic acid oxidase activity in tobacco pith cells»

388. P. Soc. Exp. Biol. Med. 1951. V. 76, P. 504-509

389. Ng T.B., Wang H.X. «A homodimeric laccase with unique characteristics from theyellow mushroom Cantharellus cibarius» Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 313, P. 37-41

390. Nicholson R.S., Shain I. «Theory of stationary electrode polarography. Single scan andcyclic methods applied to reversible, irreversible, and kinetic systems»-¿«a/. Chem. 1984. V. 36, P. 706-723

391. Nilsson I., Möller A., Mattiasson B., Rubindamayugi MS.T., Welander U.

392. Decolorization of synthetic and real textile wastewater by the use of white-rot fungi» Enzyme Microb. Technol. 2006. V. 38, P. 94-100

393. Nishizawa Y., Nakabayashi K, Shinagawa E. «Purification and characterization oflaccase from white rot fungus Trametes sanguined M85-2» J. Ferment. Bioeng. 1995. V. 80, P. 91-93

394. Nitta K., Kataoka K, Sakurai T. «Primary structure of a Japanese lacquer tree laccaseas a prototype enzyme of multicopper oxidases» J. Inorg. Biochem. 2002. V. 91, P. 125-31

395. Ong E., Pollock W.B., Smith M. «Cloning and sequence analysis of two laccasecomplementary DNAs from the ligninolytic basidiomycete Trametes versicolor» Gene 1997. V. 196, P. 113-119

396. Onuki T., Noguchi M., Mitamura J. «Hairdye composition comprising indoline and/oran indoline compound and laccase» WO 00078274, Decrmber 28, 2000

397. Ortel T.L., Takahashi N., Putnam F.W. «Structural model of human ceruloplasminbased on internal triplication, hydrophilic/hydrophobic character, and secondary structure of domains» Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1984. V. 81, P. 4761-4765

398. Page C., Moser C., Chen X., Dutton, L. «Natural engineering principles of electrontunnelling in biological oxidation-reduction» Nature 1999. V. 402, P. 47-52

399. Palmore G., Tayhas R, Kim H.-H. «Electro-enzymic reduction of dioxygen to water inthe cathode compartment of a biofuel cell» J. Electroanal. Chem. 1999. V. 464, P. 110-117

400. Palmer A. E., Lee, S. K, Solomon E. I. «Decay of the peroxide intermediate in laccase:reductive cleavage of the O-O bond» J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, P. 6591-6599

401. Palmeiri G., Giardina P., Marzullo L., Desiderio B., Nittii G., Cannio R, Sannia G.

402. Stability and activity of a phenol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39, P. 632-636

403. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Scaloni A., Capasso A. and Sannia G. «A novelwhite laccase from Pleurotus ostreatus» J. Biol. Chem. 1997. V. 272, P. 3130131307

404. Palmieri G., Giardina P., Bianco C., Fontanella B., Sannia G. «Copper induction oflaccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, P. 920-924

405. Palmieri G., Cennamo G., Faraco V., Amoresano A., Sannia G. and Giardina P.

406. Atypical laccase isoenzymes from copper supplemented Pleurotus ostreatus cultures» EnzymeMicrob. Technol. 2003.V. 33, P. 135-325

407. Palmore G.T.R. and Whitesides G.M. «Microbial and enzymic biofuel cells» ACS

408. Symp. Ser. 1994. V. 566, Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, P. 271-290

409. Palonen H, Saloheimo M, Viikari L., Kruus K. «Purification, characterization andsequence analysis of a laccase from the ascomycete Mauginiella sp» Enzyme

410. Microb. Technol. 2003. V. 33, P. 854-862

411. Pedersen L.S., Felby C. «Process for preparing a lignocellulose-based product, andproduct obtainable by the process» US Patent № 5,846,788 1998

412. Pedersen L.S., Felby C., Munk N. «Process for increasing the charge on- alignocellulosic material» US Patent № 6,187,136, February 13,2001

413. Pegasova T.V., Zwart P., Koroleva O.V., Stepanova E.V., Rebrikov D.V., Lamzin V.S.

414. Crystallization and preliminary X-ray analysis of a four-copper lacease from Coriolus hirsutos» Acta Cryst. 2003. V. D59, P. 1459-1461

415. Perdew J.P., Burke K., Ernzerhof M. «Generalized gradient approximation madesimple» Phys. Rev. Lett. 1996. V. 77, P. 3865-3868

416. Perry B„ Doumas B.T., Buffone G., Glick, M.O., Ching N. Ryder K «Measurement oftotal bilirubin by use of bilirubin oxidase» Clin. Chem. 1986. V. 32, P. 329-332

417. Perry C.R., Smith M., Britnell C.H., Wood D.A., Thurston C.F. «Identification of twolacease genes in the cultivated mushroom Agaricus bisporus» J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139, P. 1209-1218

418. PiontekK, Antorini M, Choinowski T. «Crystal structure of a lacease from the fungus

419. Trametes versicolor at 1.90-Á resolution containing a full complement of coppers» J. Biol. Chem. 2002. V. 277, P. 37663-37669

420. Pita M., Shleev S., Ruzgas T., Fernández V.M., Yaropolov A.I., Gorton L. «Directheterogeneous electron transfer reactions of fungal laceases at bare and thiolmodified gold electrodes» Electrochem. Commun. 2006. V. 8, P. 747-753

421. Potthast A., Rosenau T., Chen C.L., Gratzl J.S. «A novel method for the conversion ofbenzyl alcohols to benzaldehydes by laccase-catalyzed oxidation» J. Mol. Catal. A. 1996. V. 108, P. 5-9

422. Portaccio M., Di Martino S., Maiuri P., Durante D., De Luca P., Lepore M.,

423. Bencivenga U., Rossi S., De Maio A., Mita D.G. «Biosensors for phenolic compounds: The catechol as a substrate model» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2006. V. 41, P. 97-102

424. Pron A. and Rannou P. «Processable conjugated polymers: from organicsemiconductors to organic metals and superconductors» Prog. Polym. Sci. 2002. V. 27, P. 35-90

425. Quintanar L., Yoon J., Aznar C.P., Palmer A.E., Andersson KK, Britt R. D., Solomon

426. E.I. «Spectroscopic and electronic structure studies of the trinuclear Cu cluster active site of the multicopper oxidase laccase: nature of its coordination unsaturation» J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127, P. 13832-13845

427. Quintanar L., Stoj C., Taylor A.B., Hart P.J., Kosman D.J., Solomon E.I. «Shall wedance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner» Accounts Chem. Res. 2007. V. 40, P. 445-452

428. Raebiger H, Lany S., Zunger A. «Charge self-regulation upon changing the oxidationstate of transition metals in insulators» Nature 2008. V. 453, P. 763-766

429. Raghukumar C. «Fungi from marine habitats: an application in bioremediation»

430. Mycological Res. 2000. V. 104, P. 1222-1226

431. Ramirez P., Mano N., Andreu R., Ruzgas T., Heller A., Gorton L., Shleev S. «Directelectron transfer from graphite and functionalized gold electrodes to T1 and T2/T3copper centers of bilirubin oxidase» Biochim. Biophys. Acta 2008. V. 1777, P. 1364-1369

432. Ranocha P., McDougall G., Hawkins S., Steijiades R., Borderies G., Stewart D.,

433. Cabanes-Macheteau M.,. Boudet A.-M, Goffner D. «Biochemical characterization, molecular cloning and expression of laccases a divergent gene family — in poplar» Eur. J. Biochem. 1999. V. 259, P. 485-495

434. Reid M.E. «Relation of vitamin C to cell size in the growing region of the primary rootof cowpea seedlings» Am. J. Bot. 1941. V. 28, P. 410-415

435. Reinhammar B.R, Vanngard T.I. «The electron-accepting sites in Rhus verniciferalaccase as studied by anaerobic oxidation-reduction titrations» Eur. J. Biochem. 1971. V. 18, P. 463-468

436. Reinhammar B.R.M. «Oxidation-reduction potentials of the electron acceptors inlaccases and stellacyanin» Biochim. Biophys. Acta 1972. V. 275, P. 245-259

437. Reinhammar D., «Laccase» In: Copper Proteins and CopperEnzymes V. 3, P. 1-351.ntie R, Ed.) CRC Press: Boca Raton, Fla, 1984

438. Rekha K, Gouda M.D., Thakur M.S., Karanth N.G. «Ascorbate oxidase basedamperometric biosensor for organophosphorous pesticide monitoring» Biosens. Bioelectron. 2000. V. 15, P. 499-502

439. Ressine A., Vaz-Dominguez C., Fernandez V.M., De Lacey A.L., Laurell T., Ruzgas

440. T., Shleev S. «Bioelectrochemical studies of azurin and laccase confined in three-dimensional chips based on gold-modified nano-/microstructured silicon» Biosens. Bioelectron. 2010. V. 25, P. 1001-1007

441. Rosconi F., Fraguas L. F., Martinez-Drets G., Castro-Sowinski S. «Purification andcharacterization of a periplasmic laccase produced by Sinorhizobium meliloti» EnzymeMicrob. Technol. 2005. V. 36, P. 800-807

442. Ryde U. «The coordination of the catalytic zinc ion in alcohol dehydrogenase studiedby combined quantum-chemical and molecular mechanics calculations» J. Comput-AidedMol. Des. 1996. V. 10, P. 153-164

443. Ryde U. and Olsson M.H.M. «Structure, strain, and reorganization energy of bluecopper models in the protein» Inter. J. Quant. Chem. 2001. V. 81, P, 335-347

444. Rulisek L., Solomon E.I., Ryde U. «A combined quantum and molecular mechanicalstudy of the O2 reductive cleavage in the catalytic cycle of multicopper oxidases» Inorg. Chem. 2005. V. 44, P. 5612-5628

445. Rumbau V., Pomposo J.A., Alduncin J.A., Grande H., Mecerreyes D., Ochoteco E. «Anew Afunctional template for the enzymatic synthesis of conducting poly aniline» Enz. Microb. Technol. 2007. V. 40, P. 1412-1421

446. Ryan S., Schnitzhofer W., Tzanov T., Cavaco-Paulo A., Giibitz G.M. «An acid-stablelaccase from Sclerotium rolfsii with potential for wool dye decolourization» Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 33, P. 766-774

447. Ryden L. and Bjork I. «Reinvestigation of some physicochemical and chemicalproperties of human ceruloplasmin (ferroxidase)» Biochemistry 1976. V. 15, P. 3411-3417

448. Sakurai T. and Kataoka K. «Basic and applied features of multicopper oxidases, CueO,bilirubin oxidase, and laccase» Chem. Rec. 2007a. V. 7, P. 220-229

449. Sakurai T. and Kataoka K « Structure and function of type 1 copper in multicopperoxidases» Cell. Mol. Life Sci. 2007b. V. 64, P. 2642-2656

450. Sakasegawa S., Ishikawa H., Imamura S., Sakuraba H., Goda S., Ohshima T.

451. Bilirubin oxidase activity of Bacillus subtilis CotA» Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72, P. 972-975

452. Santucci R, Ferri T., Morpurgo L., Savini I., Avigliano L. «Unmediated heterogeneouselectron transfer reaction of ascorbate oxidase and laccase at a gold electrode» Biochem. J. 1998. V. 332, P. 611-615

453. Sakurai T., Zhan L., Fujita T., Kataoka K, Shimizu A., Samejima T., Yamaguchi S.

454. Authentic and recombinant bilirubin oxidases are in different resting forms» Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67, P. 1157-1159

455. Sakurai T. «Anaerobic reactions of Rhus vernicifera laccase and its type-2 copperdepleted derivatives with hexacyanoferrate (II)» Biochem J. 1992. V. 284, P. 681685

456. Sakurai T. «Cyclic voltammetry of cucumber ascorbate oxidase» Chem. Lett. 1996. P.481.482.

457. Sato Y., Wuli B., Sederoff R, Whetten R «Molecular cloning and expression of eightlaccase cDNAs in loblolly pine (Pinus taedap J. Plant Res. 2001. V. 114, P. 147155

458. Schliephake K., Mainwaring D.E., Lonergan G.T., Jones, Baker W.L. «Transformationand degradation of the disazo dye Chicago Sky Blue by a purified laccase from Pycnoporus cinnabarinus» Enzyme Microb. Technol. 2000. V. 27, P. 100-107

459. Schmid G. and Corain B. «Nanoparticulated gold: syntheses, structures, electronics,and reactivities» Eur. J. Inorg. Chem. 2003. V. 17,3081-3098

460. Schneider P., Conrad L.S., Ebdrup S., Yde B. «Enhancement of enzyme reactions»1. US Patent 5,700,769,1997

461. Schneider P., Pedersen A. «Enhancement of laccase reactions» US Patent5,885,304, March 23, 1999

462. Schneider P., Caspersen M.B., Mondorf K., Halkier T„ Skov L.K., 0stergaard P.R.,

463. Brown KM., Brown S.H., XuF. «Characterization of a Coprinus cinereus laccase» Enzyme Microb. Technol. 1999. V. 25, P. 471-545

464. Schlosser D. and Hofer C. «Laccase-catalyzed oxidation of Mn2+ in the presence ofnatural Mn3+ chelators as a novel source of extracellular H2O2 production and its impact on manganese peroxidase» Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68, P. 35143521

465. Sezgintiirk M K. and Dinckaya E. «An amperometric inhibitor biosensor for thedetermination of reduced glutathione (GSH) without any derivatization in some plants» Bio sens. Bioelectron. 2004. V. 19, P. 835-841

466. Sheldon R.A., Arends I.W.C.E. «Catalytic oxidations mediated by metal ions andnitroxyl radicals» J. Mol. Catal. A: Chem. 2006. V. 251, P. 200-214

467. Shi C., Clemmons J. «Single bath process for bleaching and dyeing textiles»

468. WO 03016615, December 27, 2003

469. Shimizu A., Kwon J.H., Sasaki T., Satoh T., Sakurai N., Sakurai T., Yamaguchi S.,

470. Samejima T. vMyrothecium verrucaria bilirubin oxidase and its mutants for potential copper ligands» Biochemistry 1999. V. 38, P. 3034-3042

471. Shin W., Sundaram U.M., Cole J.L., Zhang H.H., Hedman B., Hodgson K.O., Solomon

472. E. I. «Chemical and spectroscopic definition of the peroxide-level intermediate in the multicopper oxidases: Relevance to the catalytic mechanism of dioxygenreduction to water» J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118, P. 3202-3215.

473. Shin K.-S., Lee Y.-J «Purification and Characterization of a New Member of the1.ccase Family from the White-Rot Basidiomycete Coriolus hirsutus» Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 384, P. 109-115

474. Shintaro F., Masahiro G., Hiroyuki W. «Biodégradation of dioxin using laccase»

475. JP2001037465, February 13, 2001

476. Shumakovich G.P., Shleev S.V., Morozova O.V., Khohlov P.S., Gazaryan I.G.,

477. Yaropolov A.I. «Electrochemistry and kinetics of fungal laccase mediators» Bioelectrochemistry 2006. V. 69, P. 16-24

478. Shleev S., Christenson A., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A., Gorton L.,

479. Ruzgas T. «Electrochemical redox transformations of T1 and T2 copper sites in native Trametes hirsuta laccase at gold electrode» Biochemical J. 2005a. V. 385, P. 745-754

480. Shleev S., Jarosz-Wilkolazka A., Khalunina A., Morozova O., Yaropolov A., Ruzgas

481. T., Gorton L. «Direct heterogeneous. electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes» Bioelectrochemistry 2005b. V. 67, P. 115124

482. Shleev S., Kasmi A.E., Ruzgas T., Gorton L. «Direct heterogeneous electron transferreactions of bilirubin oxidase at a spectrographic graphite electrode» Electrochem. Commun. 2004a, V. 6, P. 934-939

483. Shleev S.V., Khan Ir Gvon, Gazaryan I.G., Morozova O.V., Yaropolov A.I. «Novellaccase redox mediators: spectral, electrochemical and kinetic properties» Appl. Biochem. Biothechnol. 2003. V. Ill, P. 167-183

484. Shleev S., Klis M, Wang M, Rogalski J., Bilewicz R., Gorton L. «Comparativespectroelectrochemical studies of lyophilised and non-lyophilised laccases from Cerrena unicolor basidiomycete» Electroanalysis 2007a. V. 19, P. 1039-1047

485. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V.,

486. Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. «Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes» Biochimie 2004b. V. 86, P. 693-703

487. Shleev S., Nikitina O., Christenson A., Reimann C.T., Yaropolov A.I., Ruzgas T.,

488. Gorton L. «Characterization of two new multiforms of Trametes pubescens laccase» Bioorg. Chem. 2007b. V. 35, P. 35-49

489. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton1. «Interaction of fungal laccases and laccase-mediator systems with lignin» EnzymeMicrob. Technol. 2006a. V. 39, P. 841-847

490. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas T., Gorton1. «Laccase-based biosensors for monitoring lignin» Enzyme Microb. Technol. 2006b. V. 39, P. 835-840

491. Shleev S., Pita M, Yaropolov A.I., Ruzgas T., Gorton L. «Direct heterogeneouselectron transfer reactions of Trametes hirsuta laccase at bare and thiol-modified gold electrodes» Electroanalysis 2006c. V. 18, P. 1901-1908

492. Shleev S., Reimann C.T., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A.I., Gorton L.,

493. T.Ruzgas «Autoreduction and aggregation of fungal laccase in solution phase: Possible correlation with a resting form of laccase» Biochimie 2006d. V. 88, P. 1275-1285

494. Shleev S. and Ruzgas T. «Transistor-like behaviour of a fungal laccase» Angew.

495. Chemie Intern. Edd. 2008a. V. 47, P. 7270-7274

496. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas T., Yaropolov A.I., Whittaker J.W., Gorton1. «Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes» Biosens. Bioelectron. 2005c. V. 20, P. 2517-2554

497. Shleev S., Wang Y., Gorbacheva M, Christenson A., Haltrich D., Ludwig R, Ruzgas

498. T., Gorton L. «Direct heterogeneous electron transfer reactions of Bacillus halodurans bacterial blue multicopper oxidase» Electroanalysis 2008b. V. 20, P. 963-969

499. Shleev S., Wetterö, Magnusson K.-E., Ruzgas T. «Electrochemical characterization andapplication of azurin-modified gold electrodes for detection of superoxide» Biosens. Bioelectron. 2006e. V. 22, P. 213-219

500. Shoji E. and Freund M.S. «Potentiometrie sensors based on the inductive effect on thepKa of poly(aniline): a non-enzymatic glucose sensor» J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123, P.33 83-33 84.

501. Si J.Q. «Use of laccase in baking» US Patent № 6,296,883, October 2, 2001

502. Siddiqi I. and Mangan C. «Electrochemical method for the determination of bilirubin insolution» EU Patent № 326524A2, January 28,1989

503. Slomczynski D., Nakas J.P., Tanenbaum S.W. «Production and Characterization of1.ccase from Botrytis cinerea 61-34» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 61, P. 907-912

504. Soares G.M.B.; Costa-Ferreira Ml; de Amorim MT.P. «Decolorization of ananthraquinone-type dye using a laccase formulation» Bioresour. Technol. 2001. V. 79, P. 171-177

505. Solomon E.I., Baldwin M.J., Lowery M.D. «Electronic structures of active sites incopper proteins: contributions to reactivity» Chem. Rev. 1992. V. 92, P. 521-542

506. Solomon E.I., Tuczek F., Root D.E., Brown C.A. «Spectroscopy of binuclear dioxygencomplexes» Chem. Rev. 1994. V. 94, P. 827-856

507. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. «Multicopper Oxidases and

508. Oxygenases» Chem. Rev. 1996. V. 96, P. 2563-2606

509. Solomon E.I., Xie X., Dey A. «Mixed valent sites in biological electron transfer»

510. Chem. Soc. Rev. 2008. V. 37, P. 623-638

511. Souza de C.G.M, Peralta R.M. «Purification and characterization of the main laccaseproduced by the white-rot fungus Pleurotus pulmonarius on wheat bran solid state medium» J. Basic Microbiol. 2003. V. 43, P. 278-286

512. Souza de C.G.M, Tychanowicz G. K, De Souza D. F., Peralta RM. «Production oflaccase isoforms by Pleurotus pulmonarius in response to presence of phenolic and aromatic compounds» J. Basic Microbiol. 2004. V. 44, P. 129-136

513. Spira-Solomon D.J., Allendorf M.D., Solomon E. I. «Low-temperature magneticcircular dichroism studies of native laccase: confirmation of a trinuclear copper active site» J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108, P. 5318-5328

514. Sterjiades R, Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. «Laccase from sycamore maple (Acerpseudoplatanus) polymerizes monolignols» Plant Physiol. 1992. V. 99, P. 11621168

515. Sucheta A., Ackrell B.A.C., Cochran B., Armstrong F.A. «Diode-like behavior of amitochondrial electron-transport enzyme» Nature 1992. V. 356, P. 361-362

516. Takahama U. and Oniki T. «Effects of ascorbate on the oxidation of derivatives ofhydroxycinnamic acid and the mechanism of oxidation of sinapic acid by cell wall-bound peroxidases» Plant Cell Physiol. 1994. V. 35, P. 593-600

517. Takahashi N., Ortel T.L., Putnam F.W. «Single-chain structure of humanceruloplasmin: the complete amino acid sequence of the whole molecule» Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984. V. 81, P. 390-394

518. Tanaka N. and Murao S. «Purification and some properties of bilirubin oxidase of

519. Myrothecium verrucaria MT-1 »Agric. Biol. Chem. 1982. V. 46, P. 2499-2503

520. Tang S.-P.W., Coleman J.E., Myer Y.P. «Conformational studies of copper proteins.

521. Pseudomonas blue protein and Polyporus laccase» J. Biol. Chem. 1968. V. 243, P. 4286-4297

522. Teke A.B., Sezginturk M.K., Teke M., DinCkaya E., Telefoncu A. «A bio-imprintedascorbate oxidase biosensor» Intern. J. Environ. Anal. Chem. 2007. V. 87, P. 723729

523. Thakker G.D., Evans C. S. and Rao K.K «Purification and characterization of laccasefrom Monocillium indicum Saxena» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 37, P. 321-323

524. Thiyagarajan M., Samuelson L.A., Kumar J., Cholli A.L. «Helical conformationalspecificity of enzymatically synthesized water-soluble conducting polyaniline nanocomposites» J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125, P. 11502-11503

525. Thuesen M.H., Farver O., Reinhammar B., Ulstrup J. «Cyclic voltammetry andelectrocatalysis of the blue copper oxidase Polyporus versicolor laccase» Acta Chem. Scand. 1998. V. 52, P. 555-562

526. Thurnston C.F. «The structure and function of fungal laccase» Microbiology 1994. V.140, P. 19-26

527. Toshiaki K, Takashi W. «Decomposition method of polyurethane» JP2004339438,1. December 2,2004

528. Tomoaki N., Makoto K. «Method for decomposing polyolefin resin» JP2003128835,1. May 8, 2003

529. Topcagic S., Treu B.L., Minteer S.D. «Characterization/optimization of oxygenbiocathodes for membraneless biofuel cells» Proc. Electrochem. Soc. 2005. V. 18, P. 230-242

530. Treutler O. and Ahlrichs R. «Efficient molecular numerical integration schemes» J.

531. Chem. Phys. 1995. V. 102, P. 346-354

532. Tsujimura S., Fujita M, Tatsumi H, Kano K., Ikeda T. «Bioelectrocatalysis-baseddihydrogen/dioxygen fuel cell operating at physiological pH>> Phys. Chem. Chem. Phys. 2001. V. 3,P. 1331-1335

533. Tsujimura S., Kuriyama A., Fujieda N., Kano K., Ikeda T. «Mediatedspectroelectrochemical titration of proteins for redox potential measurements by a separator-less one-compartment bulk electrolysis method» Anal. Biochem. 2005. V. 337, P. 325-331

534. Tsujimura S., Nakagava T., Kano K., Ikeda T. «Kinetic study of directbioelectrocatalysis of dioxygen with bilirubin oxidase at carbon electrodes» Electrochemistry (Tokio) 2004. V. 72, P. 437-439

535. Tsujimura S., Tatsumi H., Ogawa J., Shimizu S., Kano K., Ikeda T.

536. Bioelectrocatalytic reduction of dioxygen to water at neutral pH using bilirubin oxidase as an enzyme and 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) as an electron transfer mediator» J. Electroanal. Chem. 2001. V. 496, P. 69-75

537. Varfolomeev S.D., Kurochkin I.N., Yaropolov A.I. «Direct electron* transfer effectbiosensors» Biosens. Bioelectron. 1996. V. 11, P. 863-871

538. Vasil'eva I.S., Morozova O.V., Shumakovich G.P., Shleev S.V., Sakharov, I.Y.,

539. Yaropolov A.I. «Laccase-catalyzed synthesis of optically active polyaniline» Synthetic Metals 2007. V, 157, P. 684-689

540. Vaz-Dominguez C., Campuzano S., Riidiger O., Pita M., Gorbacheva M, Shleev S.,

541. Fernandez V., De Lacey A. «Laccase electrode for direct electrocatalytic reduction of O2 to H2O with high operational stability and resistance to chloride inhibition» Biosensors and Bioelectronics, 2008, V. 24, P. 531-537

542. Viikari L., Hase A., Qvintus-Leino P., Niku-Paavola M.-L. «Intermediate product forpreparation of lignin polymers and use thereof for production of wood materials» US Patent № 6,280,855, August 28, 2001

543. Vincent K.A., Parkin A., Armstrong F.A. «Investigating and exploiting theelectrocatalytic poperties of hydrogenases» Chem. Rev. 2007. V. 107, P. 4366-4413

544. Wahleithner J.A., Xu F., Brown KM, Brown S.H., Golightly E.J., Halkier T.,

545. Kauppinen S., Pederson A., Schneider P. «The identification and characterization of four laccases from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani» Curr. Genet.1996. V. 29, P. 395-403

546. Wang X., Watanabe H., Uchiyama Shunichi. «Amperometric L-ascorbic acidbiosensors equipped with enzyme micelle membrane» Talanta 2008. V. 74, P. 1681-1685

547. White G.A., Krupka R.M. «Ascorbic acid oxidase and ascorbic acid oxygenase of

548. Myrothecium verrucaria» Arch. Biochem. Biophys. 1965. V. 110, P. 448-461

549. Wood D.A. «Inactivation of extracellular laccase during fruiting of Agaricus bisporus»

550. J. Gen. Microbiol. 1980. V. 117, P. 339-345

551. Wynn R.M., Sarkar H.K., Holwerda R.A., Knaff D.B. «Fluorescence associated withthe type 3 copper center of laccase» FEBSLett. 1983. V. 156, P. 23-28

552. Xu F. «Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: correlationbetween activity and redox potentials as well as halide inhibition» Biochemistry 1996. V. 35, P. 7608-7614

553. Xu F. «Effects of redox potential and hydroxide inhibition on the ph activity profile offungal laccases» J. Biol. Chem. 1997. V. 272, P. 924-928

554. Xu F., Berka KM., Wahleithner J.A., Nelson B.A., Shuster J.R., Brown S.H, Palmer

555. A.E., Solomon E.I. «Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity and pH profile» Biochem. J. 1998. V. 334, P. 63-70

556. Xu F., Palmer A.E, Yaver D.S., Berka R.M., Gambetta G.A., Brown S.H., Solomon E.I.

557. Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of the T1 copper» J. Biol. Chem. 1999. V. 274, P. 12372-12375

558. Xu F., Kulys J.J., Duke K, Li K, Krikstopaitis K, Deussen H-J.W., Abbate E.,

559. Galinyte V., Schneider P. «Redox chemistry in laccase-catalyzed oxidation of N-Hydroxy compounds» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, P. 2052-2056

560. Xu F., Deussen H.-J.W., Lopez B., Lam L., Li K «Enzymatic and electrochemicaloxidation of N-hydroxy compounds: Redox potential, electron-transfer kinetics, and radical stability» Eur. J. Biochem. 2001. V. 268, P. 4169-4176

561. Xu F., Li K, Elder T.J. «N-hydroxy mediated laccase biocatalysis: recent progress onits mechanism and future prospect of its application». Progress Biotechnol. 2002. V. 21, P. 89-104

562. Xu F. «Application of oxidoreductases: recent progress» Industrial Biotechnol. 2005.1. V. 1, P. 38-50

563. Yague S., Terron M.C., Gonzalez T., Zapico E., Bocchini P., Galletti G.C., Gonzalez

564. A.E. «Biotreatment of tannin-rich beer factory wasterwater with white-rot basidiomycete Coriolopsis gallica monitored by pyrolysis/gas chromatography/mass spectrometry» Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000. V. 14, P. 905-910

565. Yang J. and Hu N. «Direct electron transfer for hemoglobin in biomembrane-likedimyristoyl phosphatidylcholine films on pyrolytic graphite electrodes» Bioelectrochem. Bioenerg. 1999. V. 48, P. 117-127

566. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. «Flowinjection analysis of phenols at a graphite electrode modified with co-immobilised laccase and tyrosinase» Anal Chim. Acta 1995. V. 308, P. 137-144

567. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L.

568. Electrochemical properties of some copper-containing oxidases» Bioelectrochem. Bioenerg. 1996. V. 40, P. 49-57

569. Yaropolov A.L, Skorobogat'ko O.V., Vartanov< S.S., Varfolomeev S.D. «Laccase:properties, catalytic mechanism, and applicability» Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 49, P. 257-280

570. Yaropolov A., Shleev S., Zaitseva E., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton- L.

571. Electroenzymatic reactions with oxygen on. laccase-modified electrodes in anhydrous (pure) organic solvent» Bioelectrochemistry 2007. V. 71', P. 157-162

572. Yaver D.S., Xu F., Golightly E.J., Brown K.M, Brown S.H., Rey MW., Schneider P.,

573. Halkier T., Mondorf K., Dalboge H. «Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa» Appl Environ. Microbiol. 1996. V. 62, P. 834-841

574. Yaver D.S., Oveijero M.D.C., Xu F., Nelson B.A., Brown KM, Halkier T., Bemauer

575. S., Brown S.H., Kauppinen S. «Molecular characterization of laccase genes from the basidiomycete Coprinus cinereus and heterologous expression of the laccase Lccl»Appl Environ. Microbiol. 1999. V. 65, P. 4943-4948

576. Yoon C.-J. and Kim H.-H. «Electrochemical studies of immobilized laccases on themodified-gold electrodes» J. Korean Electrochem. Soc. 2004. V. 7, P. 26-31

577. Yoshitake A., Katayama Y., Nakamura M, Iimura Y., Kawai S., Morohoshi N. «N1.nked carbohydrate chains protect laccase-DI from proteolysis in Coriolusversicolor» J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139, P. 179-185

578. Zaitsev V., Zaitseva I, Card G., Bax B., Ralph A., Lindley P. «The three-dimensionalstructure of human ceruloplasmin at 3.0 A resolution» Fold. Des. 1996. V. 1, P. 71

579. Zhang W. and Li G. «Third-generation biosensors based on the direct electron transferof proteins» Analyt. Sci. 2004. V. 20, P. 603-609

580. Zhang Y., Zhu C., Kan J. «Synthesis and characterization of ferromagnetic polyanilinewith conductivity in an applied magnetic field» J. Appl. Polymer Sci. 2008. V. 109, P. 3024-3029

581. Zhao J. and H. S. Kwan «Characterization, molecular cloning, and differentialexpression analysis of laccase genes from the edible mushroom Lentinula edodes» Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65, P. 4908-4913

582. Zille A., Munteanu F.-D., Giibitz G.M., Cavaco-Paulo A. «Laccase kinetics ofdegradation and coupling reactions» J. Mol. Catal. B: Enzym. 2005. V. 33, P. 23-28

583. Zumarraga M, Bulter T., Shleev S., Polaina J., Martinez-Arias A., Plou F.J.,

584. Ballesteros A., Alcalde M «In vitro evolution of a fungal laccase in high concentrations of organic cosolvents» Chem. Biol. 2007. V. 14, P. 1052-1064

585. Zumarraga M., Camarero S., Shleev S., Martinez-Arias A., Ballesteros A., Plou F.,

586. Alcalde M «Altering the laccase functionality by in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra» Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 2008a. V. 71, P. 250-260

587. Работа выполнена при поддержке Государственного контракта №02.467.11.3004, а также гранта РФФИ № 03-04-48937, Европейского гранта ШСО-Сореписш № 1СА2-СТ-2000-10050, Шведского Института и Шведского Научного Совета

Информация о работе

Шлеев, Сергей Валерьевич
доктора химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы