Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый медьсодержащих белок из PSEUDOMONAS AERUGINOSA. Его очистка, физико-химические свойства и возможная физиологическая роль

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новый медьсодержащих белок из PSEUDOMONAS AERUGINOSA. Его очистка, физико-химические свойства и возможная физиологическая роль"

fo 1 зу

Ереванский Государственный Университет

На правах рукописи

Карапетян Ануш Вемировна

уда 577.112+579.841+631.461.4

НОВЫЙ МЕДЬСОДЕРЖАЩИЙ БЕЛОК ИЗ PSEUDOMONAS AERUGINOSA. ЕГО ОЧИСТКА, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ВОЗМОЖНАЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

03.0u.u4 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1992

Работа выполнена в лаборатории физико-химии белков Лпститута биохимии Академии наук Республики Армения (директор института - академик АН Армении, профессор Галоян A.A.)

Научный руководитель:' доктор биологических наук,

профессор Налбандян P.M.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

доцент кафедры биофизика Геворкян Эмиль Сосевич

кандидат биологических наук с.н.с. Багдасарян Зоя Нерсесовна

Зодуцее учрездоидо - Ереванский зоотехническо-ветеринарный институт.

- /1 tj*-' Защита диссертации состоится "¡Si" Л liAVth.1199-3 г. в )3_•

часов на заседании специализированного ученого совета (К.055.

)I.J'.í.) по сязциальности "биохимия" л "биофизика" по за-

цчте диссертаций на соискание учёной степени кандидата биоло-

гмчзокпх наук в Ереванском государственном университете.

Адрес: 375049, Крзван - 49, ул. Алека Манукяна I, Ереванский государственный университет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ¿рзванско: государственного университета

Автореферат разослан "/4 " ^et^ácJijL 1992г.

' /чэныЛ секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук J/ц*^^--Л.Г.Аианян

г

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В живой природе среда огромного разнообразия регуляторов биохимических процессов особое место занимают кислородные супероксиднке радикалы. Они образуются в результате действия различных оксидоредуктаз и могут опосредовать жизненно важные биохимические процессы. В то же время супероксидные радикалы являются сильно токсичными для живых систем и способны вызывать деструкцию мембран, ДНК, белков, полисахаридов, вступзя в химические реакции с различным™ метаболитами. Поэтому природа обеспечила все живые организмы, как аэробные, так и анаэробные, великолепной протектирующей от токсического действия супероксвдных радикалов ферментной системой, состоящей из супероксидцисмутазы и каталазы. Супероксидцисмутазы используют в качестве субстратов 0"2 радикалы, катализируя их спонтанную дисмутацию с образованием кислорода и перекиси водорода.таким образом регулируя концентрацию этих радикалов. В зависимости от содержания металла, супероксадцисмутазЬ' бывают Си, 2п -содержащие и Мп- или Ре-оодержащие. В прокрриотах встречаются или Мп-, или Ре- содержащие зупероксидцисмутазы, являющиеся филогенетически родственны;»! ¡юрментами, в то время как Си, 7,п - содержащие ;.упероксвддисмутззы имеют другие филогенетические корни к ¡стречэются, в основном, в эукэшотах. Многие терминальные ¡едьсодержащие оксидазы, кроме своей основной функции, обладаю! аюке супароксидцисмутазной активностью. Терминальной оксидазой очввнной нтритредуцяругащея бактерии РгеисЗогаопаз aeruginos.fi вляэтся нитритредуктаза (цктохром са , штгохрококсздазч). Это зт»рвхгшоша дамерныа фермент, не содержащий меди. В звисимости от условий роста микроорганизма нитритредуктаза в эчестве терминального акцептора электронов может использовать

эу НИТРИТ, Т^К Т^" ;

^е^■ Выяснение механизма переключения кроор! анизма с нитратного на кислородное дыхание представляем («сот: кггорес. Возможно. ';тст процесс связан с наличием •олсгичоских регуляторов, ингиоирующих или активирующих, в висимости от культивационной среды, соответствующую активность рминальных ферментных систем. Обнаружение такого регулятора

явилось бы важным этапом в изучении процессов денитрификации, приобретающих веб большую актуальность в связи с обостринием экологической проблемы загрязнения почвы нитратами и увеличения концентрации последних в пщевых продуктах. В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было выделение и изучение супэроксвдцисмутазы из Ps. aeruginosa, более подробное изучение свойств цитохромокевдазы (цитохрома cdi, нитритредукгазы) и поиск биологических регуляторов терминальной дыхательной цепи этого микроорганизма.

Научная новизна. В результате наших исследований мы обнаружили:

а) новый медьсодержащий белок, изучили его физико-химические свойства и связь с нтритредуцируюшэй системой;

б) новую активность нитршредукгазы - супероксвдцисмутазную ¿лтивность, сравнимую с активностью железо-содержащей СОД из микроорганизмов;

в) разработали метод выделения и очистки Fe-СОД из Ps.aeruginosa и изучили некоторые ее физико-химические свойства.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на всесоюзной конференции по магнитному резонансу (Черноголовка, 1981г.), на ТГ Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии ( Тбилиси, 1981г.), были представлены на 1-ой всесоюзной конференции "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс,^ 1985).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 91 стр. машинописного текста с 3 таблицами и 20 рисунками. Диссертация состоит из Введения, 4 Глав, Заключения, Выводов и Списка литературы. Список литературы включает 135 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Метода исследования Культуру Pseudomonas aeruginosa, штамм IF0 3080 (полученный из коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН Республики Армения), выращивали в анаэробных условиях на полусинтетической среде, описанной в работе Парра и др. (Рагт S.R. et all,V 1976). Молекулярные массы белков определялись методом электрофореза в 10% полиакриламщщом геле (ПААГ) по Веберу и Осборну (Weber К., Osborn М., 1969) и методом гель

фильтрации по Эндросу (Andrews Р., 1965). Содержание белка

определялось по методу Лоури и сотрудников (Lowry О.Н. et al., 1951), а для гомогенных окрашенных белков - из общепринятых величин коэффициентов "экстинции характерных полос поглощения-в ультрафиолетовой области. Аминокислотный состав определялся после 8 и "72-х часового кислотного гидролиза белка. SH-групш определяли помощью реагента Эллмана (Sedlak J., Lindsay Н., 1963). Триптофан определяли реакцией с NES-ом (Spande T.I., Witkop , 1967). Содержание меди в препаратах определялось с помощью тетразтилгидрамдисульфида (Matsuda J., Takahashi J., 1970). Содержание железа - на основе комплексообразования с о-феннэнтролином (Cameron В.F., 1565) и методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

О гомогенности подученных белковых препаратов судили по форме элюционной диаграммы и по числу белковых полос при аналитическом электрофорезе по Дэвису (Davis B.J.,1964).

Для получения гема dt и гем с-содержащей части цитохромоксидазы использовалась методика, описанная в работах Яманака и Окунуки (Yamanaka Т., Okunuki К., 1963).

Цитохромоксидазную активность определяли

спектрофотометрически в 0,01М фосмфатном буфере pH 7,0 в присутствии ICf4M ЭДТА, прослеживая уменьшение интенсивности а-полосы цитохрома из Рз. aeruginosa, либо по увеличению

интенсивности полосы бЗОнм эзурина. Активность фермента выражали в виде числа оборотов в минуту. Супероксвдцисмутазную (СОД) активность препаратов определяли по способности аликвот этих растворов ингибировать реакцию восстановления нитротетразолиевого синего супероксидными радикалами согласно Нишикими и сотр. (Nishikimi М., 1972), а также по методу Мисра и Фридович (Misra V., Tridovich J., 1972), основанному на ингибировании СОД реакции автоокисления адреналина в адренохром в щелочных средах.

ЭПР спектры в виде первой производной регистрировались на приборе "Е-4" фирмы "Varían". Оптические спектры и кинетика реакция записаны на спектрометрах "Specord М-40", "Beckman М-26", "Hitachi 150-20".

Аминокислотный анализ проводился на аминокислотном анализаторе "AAA Т 339".

Результаты и обсуждение

Очичтка металлсодержащих белков из Pseudomonas aeruginosa. Нами была разработана методика одновременного выделения и очистки железосодержащей супероксщщисмутазы нового медь-содержащего гликопротеина; цитохромоксадазы и двух электронных переносчиков -азурина и цигохрома с501. В основу методики легла легла методика выделения растворимых медь-содеркащих белков из Ps. aeruginosa, разработанная Парром и др. (Parr S.R. et al.,1976).

Бактериальную пасту промывали 0,02М К-фосфатным буфером и диспергировали ультразвуком. Затем озвученную массу центрифугировали и надосадочный раствор подвергали дробному фракционированию сульфатом аммония, собирая фракцию, осаждающуюся между 45% и 100% насыщения. Эта фракция после диализа служила исходным материалом для одновременного получения ряда металлсодержащих белков и ферментов.

Исходный экстракт подвергали гель фильтрации через колонку с сефадвксом G-75 (тонкий), уравновешенную 0.02М фосфатным буфером, рН 7,0. Фракции анализировали на щтохромоксвдазную, супероксидцисмутазную активности, на содержание меди, а также регистрировали их спектры поглощения в видимой области. Фракции с супероксидцисмутазной активностью даализовали против 2мМ трис-НС1-буфера, рН 8,2, содержащего 0,1мМ дитиотрейтола. Диализат после центрифугирования наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой ДЭ-52 (1,6x4см), уравновешенную 0,2мМ трис-НС1-буфером и после ее промывания этим же буфером элюировали фермент 0,01М буфером. Затем проводили гель-фильтрацию через колонку с сефадексом G-75 (сверхтонкий). Для концентрирования использовали небольшую колонку с ДЭАЭ-целлюлозой ДЭ-52.

Получение апосупероксидцисмутазы и её реконструкция. Все используемые растворы предварительно продували аргоном для создания анаэробных условий. Белок в течение 25 мин. инкубировали в 0,2М Na- карбонатном буфере с 2мМ ЭДТА и 10мМ дитиотрейтолом при рН II (рН доводили IM NaOH) при 30°. Затем диализировали против 0,2М карбонатного буфера, рН 9,2 с 1мМ ЭДГА и 1мМ дитиотрейтолом в течение 5-12 часов при 4°С. После десятикратного взведения диализат наносили на колонку с ДЭАЭ целлюлозой, • авновешенной 2,5мМ калий-фосфатным буфером, рН 7.8. Апобелок ■орбируется на колонке и элюируется 50мМ калий-фосфатным

е

буфером, содержащим 1мМ датиотрейтол, после тщательного

промывания колонки уравновешивают®! буфером. Для реконструкции апобелок инкубировали в течение 25 мин при 30°С в растворе с 12мМ сслх Мера и 10мМ дитиотреятола в 0,2М Ма-карбонатном буфере, рН II. Затем препарат диализировали против 1мМ дитиотрейтола и 1мМ соли Мора в течение 5-12 часов при 4°С. После 24 часового диализа против калий фосфатного буфера (рН 7,8, 0.С5М) концентрировали на колонке с целлюлозой ДЕ-52, уравновешенной этим же буфером.

Очистка цигохромоксидазы. Подученные при гель-фильтрации

UU^WpiiiuUl^lW и^Л 1 VJÀ l-J>-< 111-J l.*4J .l^'-I^J,, . ^uui^Juutli uJvu ¡UAjtl ■ v' ■

w г; И ri'IV Г11..'V-ПЛ.Ч ПО КОЛОпКУ С ¿^/AD-ЦОЛЛ!иЛОЗОЙ , —o2 (колонка

3 x 8см), уравновешенную О,DIM фосфатным буфером, рН 7,4. В этих условиях цитохромоксидаза элюировалась без задержки, а на колонке адсорбировалась фракция с каталазной активностью.

Оксидазную фракцию диализировали против 2мМ буфера, рН 7.4 и вновь подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 (колонка 3,6-* 12см). Заряженную колонку промывали линнейным градиентом фосфатного буфера от 0,01 до Q.IM общим объемом 200мл. Фракции* содержание цитохромокежззу, объединяли, доводили их рИ до 6.4 и подвергали хроматегрз рии на КУ-целлюлозо, ОМ-32, уравновешенной 0,01м фосфатным буфером, рН в,4. .v;:-"..1^ йсчорпквзжиого промывания колонки этим я» буфером (ТССмд) йог-опт э.тйировэли 0,05М буфером, рН 6.9. Полученный про г.':,.7:. циггохромоксидазы был электрсфор'-етичес/.и гомогенным. Активно:; г> npensратэ {1С } при р'! С,0 к % 2Г."0 по «итохре.чу с ссстаь.1иль IIOxxh'J а по азурину - ЗОмтГ! Цитохромоксидаза из Рз. aeruginosa представляет собой двухгемовый белок, содержащий одновременно '"Г"". с и. ""гпа (3, ----г:: соотв^тетвеныо ггп .-.'О:.:-. "

■ "•О'1.:". На :.'ол'?:-'уллр>:7-: ''::с у ::г-!иу.олится П'. "" < '1

с и d. Подученный препарат цитохромоксидазы обладает также свойствами нитритредуктазы, поскольку он способен к штяпяжтггпоннпму восстянпв.7тянит штштя В' гжипь яяптя. шичям :' \ •.::.':;■ f.-г.'гл ттнгсхроуг.кснлазно/:, ы

'-"■'; ):.\Г: гс^ формонт обрабатывали

остаток, представляющий собой гем е-содержащую часть

цитохромоксвдэзы. Надосадочную зеленоватую фракцию, содержа гем й4 .пропускали через колонку с сефадексом LH-2 уравновешенную пирофосфатным буфером, рН 8,3, 0,05М. Белков часть, содержащую гем с, еще раз обрабатывали кислым ацетоно затем суспендировали в пирофосфатном буфере той же молярности рН для исследования его СОД-активности.

Очистка нового медьсодержащего белка. В ходе исследоваг анализа меди во фракциях экстракта было обнаружено, что noMi азурина, медь содержится ещё в одной фракции. Эту фраш соб1фали отдельно и адсорбировали на колонке с ДЭАЭ-целлюло: DE-52 (1,5 к 3 см), уравновешенной фосфатным буфером, рН 7, Колонку промывали буфером с градиентом молярности от 0,001 0,4М, рН 7,4, общим объемом 100мл. Медьсодержзвде фрак собирали, диализовали против О,ЭЙ! буфера, рН 7,4, и по концентрирования подвергали гель-фильтрации через сефадекс G (сверхтонкий). В ряде экспериментов стадии гель- фильтрацщ хроматографии повторяли до тех пор, пока при гель-фильтрации получали одиночный пик. Такой препарат являе элекгрофорэтачески гомогенным. Для получения агоформы бе ингибитора медь из него удаляли двумя методами. В первом из препарат белка инкубировали в течение одного часа в ка. фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 1% KCN, и затем реакцио! смесь пропускали через колонку с сефадексом G-25 (тонк уравновешенную 0,01М К-фосфатным буфером рН 7,0, содержащим I ЭДТА. Во втором методе белковый препарат диализировали проти К-фосфатного буфера, содержащего 10~ЭМ диэтилдигиокарбамат течение 24-х часов, затем против 0.005М К-фосфатного буфера 7,0. После диализа проводили хроматографию на сефадексе (тонкий), уравновешенном 0,001М К-фосфатным буфером, рН содержащим 10"5М ЭДТА. Сравнение спектров поглощения холобел апоформы показывает, что наблюдающийся в спектре максимум 325-330ям обусловлен наличием меди, входящей в его состав, этом оказалось, что из двух использованных методов полу1 апоформы только обработка цианидом позволяла получить ггреп; полностью свободный от меди. Посла обра< циэталдитиокарбаматом препарат белка содержал до 25% остат меди, удаление которой требовало повторения процэдуры и, в говоря, было затруднено.

Обо , ^ гва_котзллсодзраззц« белков Pseudomonas aeruginosa.

Свойства-i e-COil. - Молекулярный - вес - бежа определял»

иегпл-м«: я) методам гздь-фидьтрзции; б) кетодои

б ПААГ ас Веберу и Осборну. Оба метоода

пэкпзз.::,, что ¡¿олжулярвд вес Fe-СОЛ равен 40кДа.

Мете по;; л!:«к-гель-эо®ктрофорвза в ПААГ по Веберу и Осборну быт оттр^егетг TiTC"o гт^егкпгчштг состав белка и молекулярный вес cyöif■ икнл... Олыуолсль, -ло ^'л-гол состоит из .двух субъвдю-иц с молекулярным весом 20кДа.

ПоПЯПЖЯНИЯ WÖT этптя пплопптп»^лт Д

OfiHH-i'nilOKOnwi? И тп»мшк>/пгм«» птталГГЗС"!, ОСНОВ2ПНСТЛ НО рСГЯСТраЦй^» высокоспецифичного комплекса Fez+ с о-фенантролином. Аналитические данные свидетельствуют, что препарат содержит •1,8г-атома железа на моль фермента. Определение железа методом атомно-абсорбционной спектроскопии показало его более высокое содержание в исследуемом препарате — 2,1г-атома на моль дамерэ. Исследование препарата на содержание в нем таких металлов, как Мп, Со, Zn, Си, зтокно абсорбсиопноа спектроскопией показа.1 содержание этих металл об » прэпярзгв соответствует концонтртг-'"' относклым л следов:,;." ^ол.';лллbim '"еное 0,02г-зтома).

I ТТП Т7ТГ»

ООЛЗ-

aeruginosa имеет выраженный максимум при 278нм и плечо при 280нм.

зта полоса исчезает. Она отсутствует также в спектре поглощения апобелка, не имеющего выраженного поглощения в ввдимой области. В 1\ль7рс^:;олйТОвоа области холофермент и апоФермент имеют

- ''.'л л......телллп на вносит в;сЛтЛ-:

"""" "'.ллл' : .• . чегэнкего препарата феряентэ сказялс-

• '• .Г:г •." . В ¿тих измерениях концентрация белка бы.;-.

-¡ттпртга ттлтге» тт г\ Ятггум

1'-и-.-

Магнитные свойства. ЭПР спектр СОД лежит в области ^зонаасоз, характерных для высокосшкового трехвалентного

железа, находящегося а поле лигандов с ромбическим искаже: симметрии, описываемым набором g-фaктopoв: 8^=4,81, ^=3 83=3,74.

При исследовании зависимости ЭПР спектра от рН срэды уда, выявить появление и изменение небольшого пика в спектрах Ре-при й4=4,74. Оказалось, что изменения рН как в кислую, так щелочную сторону приводит к увеличению интенсивности этого га которое имеет обратимый характер в оласти рН 2,5 - 10. добавлении роданида калия происходит падение активности ферме! но в спектре белка, кроме небольшого уширения в области g ~3, других изменений не наблюдается. Таким образом, хотя как фто£ так и роданид являются сильными ингибиторами ферме! однозначное доказательство, что их ингибирующий эффект связан взаимодействием с атомами железа, входящими в активный це фермента, на основании ЭПР-данных было получено только фторида.

Исследование ферментативной активности Ре-СОД. На гра$ зависимости степени подавления образования формазана концентрации Бе-СОД 50%-ое подавление реакции образова формазана наблюдается при концентрации фермента 2x10' Апоферкент ингибирующей активностью не обладает. Добавление Е 1000-кратном молярном избытке по отношение к фэрг,:онту привода подавлению активности на 80%, а роданида в том т соотношении практически полной потере фзр:,;знтат1вко1: активности. 3 то время цианид в то:: жз соотношении не оказывал 1шп;б1фу;ог: влияния на фермент.

Обсухщзнке. Пр>Г сразивши; Гэ-СОД т.з Рз. аегцзтозг с известными железо-содерх'.аидсик СОД из разных источников, основании полученных данных :.;ожно сделать вывод, что фзрмент этого источника является типичным представите,

супероксиддисмутаз, содержащих в активном центре железо. Так, > субъединичный состав, содержание металла, влияние ингибитор! резистентность к цианиду, форма и параметры ЭПР спектр! оптические свойства являются довольно характерными для эп класса супероксиддисмутаз.

Свойства цитохромоксидазы (цитохромз с(31, нитритредуктазы). Известно, что многие терминальные медь-содержащие оксидазы, ] синие, так и несиние, как растворимые, так и мембранные проявл! некоторую сод активность. Установлено, что' СОД йкгивш

еновной терминальной оксидазы - цитохром - с - оксидазы, эдержащей как темы ааэ, так и медь, обусловлена в основном-5дью. В то" же""время, терминальная оксидззз из Ps. aeruginosa держит два разных гема с и d, и не содержит меди. В этой связи I изучили СОЛ активность цитохромоксидазы из Ps. aeruginosa, казалось, что эта цитохромоксидаза также ингибир.ует реакцию ¡разования формазана, образующегося в результате взаимодействия •дароксидных радикалов с тетрэзолием. Оказалось,что 50%-ое гийирование наблюдается при концентрации фермента 1О_0М, а для /Zn СОД - 5-10~вМ. Таким образом СОД активность тохромоксидазы всего па один порядок меньше активности Cu/Zn Ц и сравнима с активностью Fe-СОД из микроорганизмов. В льнейшем, для выяснения роли гемов в СОД-активнасти лофермента мы экстрагировали и очистили тем ö из фермента и гем содержащий остаток цитохромоксидазы.

Основной вклад в СОД-активность цитохромоксидазы принадлежит ty di. График зависимости подавления образования формазана от щентрации цитохромоксидазы имеет несколько атипичную для

.idiii сьоаствати. СОД-активность гема d^ также

эвляется цианидом.

"зо-ссдэ;^» ССД а ¿'ö-w« из ?а. aeruginosa в их числе не мтся гемопротеинэми. Поэтому обнаружение СОД-активности у гсромокевдазы из Ps. aeruginosa является первым призером, что

и :со; .плэкеам меди. Из двух имеющихся ь активность была связана с гемом d ,который непосредственно додойствуот с кислородом или нитритом в ходе оксидазной или итредуктазной активности данного фермента. В отличие от активности Cu.Zn-СОД, активность гема dt ингибируется не ко цианидом, но и фторидом. А в отличие от Fe-СОД из Ps

aeruginosa, активность гема ингибируется не только фторидом, но и цианидом. Таким образом, имеется определенная особенность в ингибировании этого фермента анионами. Важно подчеркнуть, что СОД-активность гомогенатов Ps. aeruginosa может быть связана не только с Fe-СОД, но и с цитохромоксидазой, причем СОД-активность обоих ферментов соизмерима.

Свойства нового медьсодержащего белка. Выше говорилось об обнаружении в экстрактах Ps. aeruginosa нового медьсодержащего белка, отличного от азурина. Для выяснения функции этого белка необходимо было более подробно изучить его свойства.- Молекулярный вес бежа, определенный методом гель-фильтрации и диск-гель-электрофореза в ПААГ оказался равным 20кДа. На основе данных диск-гель-электрофореза по Веберу-Осборну мы предположили, что белок состоит из 2-х равных субъединиц по 10кДа..

Аминокислотный состав, содержание углеводов и сульфгидриль-ных групп, определение металла. Анализ аминокислотного состава белка проводили после его 48- и 72- часового гидролиза. Определение триптофана NBS-ом показало, что в молекуле белка имеется также по крайней мере один остаток триптофана. Количество сульфгидрильных групп, определённое методом Эллмана, показало, что на одну молекулу белка (на молекулярную массу 20 кДа ) приходится одна сульфгидрильная груша.

На наличие меда в белке указывал характерный для меда типа II сигнал ЭПР меда. Количество меди мы определяли также химически, используя комплексообразование с

тетраэтшггиурамдисульфидом . Согласно полученным данным на моль белка (20 кДа) приходится два г.-атома меди. Содержание железа в белке, определенное химическим анализом, оказалось следовым. Препарат на содержание других металлов не тестировали.

Спектральные свойства. Белок имеет широкий максимум поглощения при 258нм и поглощение в ближней УФ области при 325нм. Апобелок не имеет поглощения при 325нм, при удалении метахча в УФ области максимум смещается на 2-Знм в сторону длинных волн. Разностный спектр белка ("апо" минус "холо") имеет узкий пик при 278нм и минимум при ЗЗОнм. Адсорбционный спектр белка в ближней УФ области зависит от рН . Мы рассчитали сзы для каждого значения рН и построили график зависимости е от рН. • Оказалось, что кривая рН-титрования имеет точку перегиба в области рН от 7,8 до 8,2. Медь в белке находится в парамагнитной,

-ухвалентной форме и обнаруживает ЭПР спектр со следующий эрзубтрэгш: 2,07; 2,23; А,= 180 С. Форма и параметры спала, как оказалось, зависят от рН.- При- качественном анализе •»парата медьсодержащего белка на углеводы оказалось, что белок одер':.тл" фруктозу. Таким образом, ого можно рассматривать как ^"соттротсид. 7зоолетструтч9скзг. точка тликспротсинэ, определенная х^кгроооротически, оказалась п районе 3-4, то есть он шаруживает весьма кислые свойства.

Зс'.-м^'ная _ф:теплг<гкчсскзя роль нови о ¡медьсодержащего белка. : сбдар^:.:;^!, что окисление азурина, так же как и щггохрома Щ4, катализируемое штохгомоклипяло«, чнгйбтеуетег! "'.слтг". .ДдсздОншОннП!.; глйкшшотвйЬ! >м из ?з.аеги£1пога. Зги дадпке шве день; на Рис. 1а и 1Ъ. Для определения константы ингибирования провели серию экспериментов с разными концентрациями субстата итохрома с5В1) и ингибпггора. Данные представлены в Диксоновских ординатах на Рис.1с. Константу ингибирования определили афически, как показано на рисунке. Она оказалась равной =2,5-10~вМ. Ингибирующее влияние бежа было полностью ратимым, поскольку удаление его из реакционной среди сродстзом гелъ-фильтрэцкя привацкгс к полному восстановлению гнвности цитохромоксидазы. Нхкаких изменения с восстанозленныуи к окисленными белкзм-л, служащими субстратами для гохровдкеидазы (азурин, цитохром с ), не происходит при Равлонии тзтого белка. Спектральных изменения не наблюдается оно и в спектре цитохромоксидазы при добавлен™ к ней белкового гяЗкгорз - желтого белка. Никаких изменений б спектра;-: 5стратов и цитохромоксидазы не наблюдалось также под влиянием )белка, который явлется столь же эффективным ингибитором "отро"- п аз;-они- окекдазной активности цитохромоксидазы, как и :оболо::. 7^о-лючается участие медной компонента белка шгибировании цитохромоксидазы.

Мы исследовали также влияние желтого белка на эроксвдцисмутазную активность цитохромоксидазы

тр;ггредуктэзы). Полученные данные в графическом виде приведены Рис.2 (2 иЗ). Супероксвддисмутазная активность охрокэксидэзы при добавлении 2 * 107М желтого белка ныаается только на 5%, а сигкоидзлъностъ кривой зависимости авления образования формазана от концентрации нитритредуктазы колько сглаживается. Тагам образом, можно сделать вывод, что

Рис Л . Влияние медного белка на окисление цитохрома с-551 (А) и азурина (В) нитритредуктазой.

Данные для окисления цитохрома с-551 приведены в Диксоновских координатах (С). Концентрация нитритредуктазы в (А) и (В) 1,5 х 10 'ГЛ. Для кривых I и 2 концентрации пдтохрояа с-551 и азурина соответственно равнялась 1,6 х Ю-5М и 2,35 х 10"%. Кривые 2 снимались после добавления желтого белка с конечной концентрацией последнего в реакционной смеси 4,4 х Ю'^'Л. Пунктирные 'линии - это контрольные кинетики окисления цитохрома с-551 и азурина без добавления нитритредуктазы. В ( С ) концентрации цитохрома с-551 и нитритредуктазы соответствен! следующие :■ 3,2 х Ю-5 и 1,5 х Ю-7

I Iii

¿¡

'--1—--1--1_______

У /1 , л, i W

СОД-активность цитохромоксидазы существенно не изменяется по действием медного гликопротеина.

Мы также допустили возможность переноса меди от желтог белка азурину, то есть предположили, что Cu-белок может служит переносчиком меди. С целью проверки этого предположения апоазури инкубировали с зквимолярным количеством желтого белка, а также его избытком. Затем смеси пропускали через колонку с сефадексо1 G-50 и во фракции с апоазурином определяли содержание меди. IIpi этом оказалось, что в апоазуриновой фракции медь ж обнаруживается. Тем самым может быть исключена возможная рол] Cu-белка как донора меда для апоазурина.

Обсуждение результатов. Полученные данные по определении молекулярного веса свидетельствуют о том, что белок состоит иг двух, вероятнее всего, идентичных субъединиц с молекулярным весок 10кДа и содержит 2,2 - 2,4 г-атома меда на молекулу бежа. Дисульфидаый мостик имеющийся в каждой субЪединице, вероятно, недоступен для растворителя, так как субъеданица с молекулярным весом 5кДа появляется только после обработки белка 6М мочевиной и ^-меркапто этанолом. Роль, способ связи и количественное содержание углеводной компоненты остаются невыясненными. Неясно, присоединены ли углеводы ковалентно или же являются только инклюзией. Поскольку данные по аминокислотному составу дают примерно то же значение молекулярного веса для одной субъединицы, можно предположить, что содержание углеводов невелико. Фактически, при их содержании более 10% наблюдались бы уже заметные отклонения в аминокислотном составе, а также отмечались разночтения в величине молекулярного веса, определенного злекгрофоретически и ' гель-фильтрацией. Как уже отмечалось,максимум поглощения белка в УФ области находится при 260нм. Такое положение максимума является нетипичным для белков, для которых более характерно поглощение при 275-285н:;,, обусловленное ароматическими аминокислотами. Максимум при 260нм наблюдался также у металлотионеина и нейрокупреина. Однако, в первом случае он обусловлен наличием связей металл-сера, тогда как во втором случае - . наличием органического кофактора неизвестной природа. У белка из Ps. aeruginosa эта полоса не связана с присутствием меда, поскольку после удаления мзда она сохраняется. В то же время поглощение при 325нм исчезает после удаления меда, что ясно свидетельствует - о принадлежности этой

полосы медному центру. Зависимость интенсивности поглощения при 324нм от рН при неизменности поглощения в УФ области, может косвено указывать на наличие у меди титрующейся лигандной группы. Исходя из значения рКа=8,з взято - значение точки перегиба на графике зависимости е от рН, можно предположить, что этим лигандом является SH-группа цистеина. Как установлено, ЭПР спектр Cu-белка характерен для меди типа II , находящейся в ромбически искаженном лигандяом окружении. Интенсивность сигнала при низких рН падает, что может говорить о частичном восстановлении меди одной тиоловой группой. В пользу предположения, что основной функцией желтого белка является его способность ингибировать цитохромоксидазу говорит тот факт, что его сродство к щ-ггохромоксидазе даже сильнее сродства азурина или цитохрома с=з»» являющихся субстратами этого фермента. Желтый белок является металлопротеином, однако наличие металла не играет никакой роли в процессе этого ингибирования: апобелок так же эффективно ингибирует цитохромоксидазу, как и холобелок. Следовательно, медь не имеет здесь структурной и окислительно-восстановительной роли. Кроме того, в окислительно-восстановительных процессах с цитохромоксидазой этот белок не участвует. Он также не переносит металл на азурин. Все эти результаты позволяют рассматривать этот белок как регулятор нитритредуктазной активности в Ps. aeruginosa. В отличие от азурина и цитохрома с551 - электронных доноров цитохромоксидазы, желтый белок сильно кислый и не исключено, что имеет опреднленные связывания на цитохромоксидазв. Взаимодействие белка с цктохромоксидазой приводит к прекращению доступа электронов от азурина или цитохрома с551. В пользу такого предположения говорят также результаты влияния желтого бежа на супероксиддисмутазную активность цитохромоксидазы. Действительно, если сигмоидальностъ кривой этов активности для цитохромоксидазы является результатом суммирования действий двух независимых активных центров (цитохрома с и гема d), то исключение одного из них привело бы к сглаживанию кривой и к уменьшению активности на определенное постоянное значение после насыщения ингибитором, что и наблюдалось в эксперименте (Рис.2). Так как основная СОД-активность 'цитохромоксидазы обусловлена гемом 3. ,а не

А

цитохромом с, то можно предположить, что под влиянием ингибитора "выключается" именно гем с.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Феномен нитратного (нитритного) дыхания, при котором наблюдается переход от использования в качестве терминального акцептора электронов азотсодержащих соединений вместо кислорода, является все еще загадочным. Каковы биологические механизмы переключения системы от использования одного акцептора к другому, в чём состоит значение этих переключений, какие конкретные процессы вовлекаются в механизм трансформации, какова их роль длг окружающей среда - вот только небольшой круг вопросов, требующиз рассмотрения в первую очередь.

Обнаружение и изучение свойств СОД в Ps. aeruginosa показывает, что денитрифицирующие микроорганизмы надежно защищень от супероксидных радикалов и, следовательно, это косвеннс означает также, что в ходе метаболизма денитрификаторов возможнс образование этих реакционноспособных радикалов. Более того, сам; терминальная система (цитохромоксидэза, нитритредуктаза, цитохро? cdt) этих микроорганизмов также обладает значительно! СОД-активностью, связанной, как было выяснено, преимущественно < гемом dt, который фактически и выступает кзк терминальный, тс есть непосредственно взаимодействующий с кислородом (нитритом компонент данного фермента. Тем самым впервые удалось показать что гем типа й , являющийся одним из самых распространенных i микроорганизмах . терминальных гемов, способен выступать Kai фермент, катализирующий дисмутациа супероксида на свободны] кислород и перекись водорода. В то же время гем с ] цитохромоксидазе, подобно гемзм с из других источнико; (практически любые цитохромы типа с ), функционирует ка] одноактный скэвендкер супероксидных радикалов, восстанавливаяс: при этом, а не является катализатором процесса их дасмутации.

Хотя точное физиологическое значение наличия СОД активност гена а у Ps. aeruginosa в настоящее время неясно, тем не мене! уже сейчас можно высказать предположение, что оно отражав' механизм восстановления кислорода на этом ферменте, которы' логически должен быть одноэлектронным. Это означает, что кэханиз. восстановления нитрита, по всей вероятности, также являете одно электронным:

N0^ + Н* + -> N0 + ОН".

Наличие СОД-активности гема d поднимает также вопрос

зможности дасмутации нитрита на теме d:

2NO: + 2Н+ -> NO + N0 + НО.

2 2 2

а возможность, однако, может быть проверена лишь в последующих ленаправленных исследованиях. -

Каковы бы ни были механизмы денитрификации или сстановления кислорода и переключения этих активностей на тохроме cdi у Ps.aeruginosa, любые предполагаемые схемы должны дут учитывать наличие у этого организма кислого медьсодержащего еткспротеинэ, выступающего как эффективный природный ингибитор :сидазноя активности цитохромз с^. Характерно, что этот белок ! обладает заметной СОД-акгивностью и, следовательно, он не ;жет выступать как конкурент за супероксидные радикалы, ¡разующиеся при восстановлении кислорода на цитохроме cd, . Кроме iro, медь в белке не вовлекается в процесс ингибирозания, iTopoe обусловлено белок-белковым взаимодействием между фментом и ингибитором, а не связано с оттоком электронов на !дь. Поскольку этот белок не влияет на СОД-активность цитохрома ^, а только на его оксидазную функцию, его участок ¡имодействия с цитохромом cti^ должен лежать не на терминальном ;ме d, а на участке ближе к гему с, или даже непосредственно на эм. Таким образом, благодаря действию этого белкового ггибитора, по-видимлому, прерывается внутриферментныя поток гоктронов от гема с к гему d.

Такой механизм ингибирования свидетельствует о чрезвычайно эжной роли белков этого типа в регуляции активности цитохромз 1а и его переключении от оксидазноя к нитритредуктазной функции, {огда данная работа была закончена, появилось сообщение о эличии сходного по свойствам белка в других денитрифицирующих лкрооргзнизмах, что подтверждает наши результаты и зидетельств.ует о распространенности этого белка в других знитрификаторах и его вовлеченности в процессы регуляции знитрификации.

вывода

1. Разработана методика выделения и очистки Fe-содержащей СОД в высокоочищенном состоянии из денитрифицирующих бактерий Pseudomonas aeruginosa.

2. Изучены физико-химические свойства Fe-СОД. Подучена апоформа фермента и произведена его реконструкция. Определен молекулярный вес, субъединичный состав, содержание металла, коэффициент зкстинкции характерных полос поглощениям. Изучено влияние рН и различных анионов на ЭПР -спектры и влияние анионов на активность фермента.

3. Обнаружен новый тип активности (супероксиддисмутазная) у нитритредуктазы из Pseudomonas aeruginosa. Показано, что эта активность связана с гемсм dt нитритредуктазы. Изучено влияние неорганических анионов на СОД активность гема di и нитритредуктазы.

4. В лизатах клеток обнаружен новый медьсодержащий гликопротэин. Разработана методика его выделения и очистки до электрофоретически гомогенного состояния этого гликопротеина.

5. Изучены физико-химические свойства нового медьсодержащего белка. Определены молекулярный вес, субЪединичныг состав,содержание металла, аминокислотный состав этого белка. Разработаны методы получения эпобелка и его реконструкция. Изучено влияние рН на оптический спектр поглощения и нг ЭПР-спектр медьсодеркащего гликопротеина.

6. Показано ингибирующее влияние желтого медьсодеркащегс гликопротеина и его апобелка на "азуриноксидазную" и "цитохроь с5=1-оксидазную" активности нитритредуктазы. Доказано,что медь i белке не влияет на ингибиторную активность этого гликопротеина.

7. Изучено влияние жёлтого гликопротеина на СОД-активност1 нитритредуктазы. На основе ■ подученных данных выдвинутс представление о возможном механизме взаимодействия электронны: переносчиков (азурина и цитохрома сВ51> с нитритрэдуктззой.

го

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.В.Карапетян, М.А.Симонян, Р.М.Налбандян. Взаимодействие супероксвддисмутазыс антителами. Тезисы 4-ого авсесоюзного биохимического съезда.

2. А.В.Карапетян, Н.И.Мкртчян. железосодержащая супероксиддисмутаза из Рз.aeruginosa. Тезисы I Республиканской молодежной конференции по биохимии, биофизики и молекулярной биологии, посвещенвая 60-летию Советской Армении. Цахкадзор, 24-26 декабря 1980г., стр.3.

3. А.В.Карапетян, Н.И.Мкртчян, Г.Н.Надаарян. ЭПР-стактры железосодержащей супероксидцисмутазы из Ps. aeruginosa. Тезисы всесоюзной конференции ш магнитному резонансу, Черноголовка, 1981г. стр.73.

4. А.V.Катареtlan, R.M.Nalbandian. A Novel Copper Cotalnlng Protein irom Ps.auerogxnosa, USSR-Sweden III symposium on Physico-Chemlcal Biology, Abstracts. Tbilisi, 1931, p.153.

5. М.Г.Камалян, А.В.Караштян. Получение и некоторые свойства компонентов дыхательной цепи денитрифицирующих бактерий Ps.aeruginosa. Тезисы III республиканской молодежной конференции по физико химической биологии, Агверан, 1985, С.28

6. М.Г.Камалян, А.В.Карапетян, Р.М.Налбандян. Металлсодержащие белки и ферменты денитрифицирующих микроорганизмов. Их свойства и роль. Тезисы республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван, 1988, с.22.

. М.Г.Камалян, А.В.Карапетян, Р.М.Налбандян. Растворимые металлсодержащие белки Ps.aeruginosa. Биохимия, (1986), 51. в.9, стр.1420-1425.

. А. V. Катаре tian, M.G.Kamalian, R.M.Nalbandian. On the Superoxide Dlsmutase Activity of Cytochrome Oxidase from Ps. aeruginosa. Superoxide and Superoxide Dlsmutase in Chemistry, Biology and Medicine; ed. G.Rotilio, Ilsevier/ Science Publisher B.V.(Biochemical Division), Amsterdam, (1986), pp.72-74.

Э V.Karapetian, M.G.Kamalian, R.M.Nalbandian. A Copper Containing Protein that Inhibits Nitrite Reductase Irom Ps.aeruginosa.FIBS Lett., (1986}» u,2w pp.131-134.

.10. А.в.караштян, Р.М.НалЗандян. Свойства белка ингибитора нитригредукгазы из Ps.aeruginosa. Биохимия, в печати.

Технический редактор А.С.Абраиян

Подписано в печать 30.11.92г. Формат 60x84x16

Офсетная печать. Тираж io0 экз.

Зак.тип. 061

Отпечатано в Ереванском $йзячсскол институте Ереван-36, ул. Братьев Алиханян 2.