Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый медьсодержащий белок из Pseudomonas aeruginosa. Его очистка, физико-химические свойства и возможная физиологическая роль

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новый медьсодержащий белок из Pseudomonas aeruginosa. Его очистка, физико-химические свойства и возможная физиологическая роль"

Ереванский Государственный Университет

На правах рукописи

Карапетян Ануш Вемировна

УДК 577.112+579.841+631.461.4

НОВЫЙ МЕДЬСОДЕРЖАЩИЙ БЕЛОК ИЗ PSEUDOMONAS AERUGINOSA. ЕГО ОЧИСТКА, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ВОЗМОЖНАЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1992

Работа выполнена в лаборатории физико-химии белков Лнститута биохимии Академии наук Республики Армения (директор института - академик АН Армении, профессор Галоян A.A.)

Научный руководитель:' доктор биологических наук,

профессор Налбандян P.M.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

доцент кафедры биофизика Геворкян Эмиль Сосевич

кандидат биологических наук с.и.с. Багдасарян Зоя Нерсесовна

Зодуцее учреждение - Ереванский зоотехническо-ветеринарный институт.

Зацита диссертации состоится ЧЬ" .¿njftjxЯЭЭЗ г. в 0 часов на заседании специализированного ученого совета (К.055. Ji.ü<3.) по специальности "биохимия" и "биофизика" по за-•цпто диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук в Ереванском государственном университете.

Адрес: 375049, Ереван - 49, ул. Алека Манукяна I, Ереванский государственный университет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ^реванско: государственного университета

Автореферат разослан " /*У " /j.E 992г.

/чёиый секретарь специализированного совета, _

кандидат биологических наук --Л.Г.Ананян

г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА -РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В живой природе среда огромного разнообразия регуляторов биохимических процессов особое место занимают кислородные супероксидаые радикалы. Они образуются в результате действия различных оксидоредуктаз и могут опосредовать жизненно важные биохимические процессы. В то же время с.упероксидные радикалы являются сильно токсичными для живых систем и способны вызывать деструкцию мембран, ДНК, белков, полисахаридов, вступая в химические реакции с различнымии метаболитами. Поэтому природа обеспечила все живые организмы, как аэробные, так и анаэробные, великолепной протектирующей от токсического действия супероксидных радикалов ферментной ' системой, состоящей из супероксидцисмутазы и каталазы. Супероксидцисмутазы используют в качестве субстратов 0~2 радикалы, катализируя их спонтанную дисмутацию с образованием кислорода и перекиси . водорода,таким образом регулируя концентрацию этих радикалов. В зависимости от содержания металла, супероксиддисмутазЬ' бывают Си, Zn -содержащие и Мл- или Fe-содержащие. В прокариотах встречаются или Mn-, иж Fe- содержащие супероксидцисмутазы, являющиеся филогенетически родственными ферментами, в то время как Си, Zn . - содержащие супзроксиддисмутазы имеют другие филогенетические корни и встречаются,' в основном, в зукариотах. Многие терминальные медьсодержащие оксвдазы, кроме своей основной функции, обладают также супероксиддисмутазной активностью. Терминальной оксидазой почвенной нитритредуцирующей бактерии Pseudomonas aeruginosa является нитритредуктаза (цитохром ct^, цитохромоксидазэ >. Это четырехгемовый димерный фермент, не содержащий меди. В зависимости от условий роста микроорганизма нитритредуктаза в качестве терминального акцептора электронов может использовать как нитрит, так и кислород.

Цель и задачи исследования. Выяснение механизма переключения микроорганизма с нитратного на кислородное дыхание представляет большой интерес. Возможно, этот процесс связан с наличием биологических регуляторов, ингибирующих или активирующих, в зависимости от культивационной среды, соответствующую активность терминальных ферментных систем. Обнаружение такого регулятора

явилось бы важным этапом в изучении процессов денитрификации, приобретающих все большую актуальность в связи с обостринием экологической проблемы загрязнения почвы нитратами и увеличения концентрации последних в пищевых продуктах. В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было выделение и изучение сушроксидцисмутазы из Рв. aeruginosa, более подробное изучение свойств цитохромоксидазы (вдггохрома сй1, нитритредуктазы) и поиск биологических регуляторов терминальной дыхательной цепи этого микроорганизма.

Научная новизна. В результате наших исследований мы обнаружили:

а) новый медьсодержащий белок, изучили его физико-химические свойства и связь с нитритредуцирующей системой;

б) новую активность нитритредуктазы - супероксвдцисмутазную ьлтивность, сравнимую с активностью железо-содержащей СОД из микроорганизмов;

в) разработали метод выделения и очистки Fe-СОД из Ps.aeruginosa и изучили некоторые ее физико-химические свойства.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на всесоюзной конференции по магнитному резонансу (Черноголовка, 1981г.), на ]Г Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии ( Тбилиси, 1981г.), были представлены на 1-ой всесоюзной конференции "Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 91 стр. машинописного текста с 3 таблицами и 20 рисунками. Диссертация состоит из Введения, 4 Глав, Заключения, Выводов и Списка литературы. Список литературы включает 135 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Метод,! исследования Культуру PseudoEonas aeruginosa, штамм IF0 3080 (подученный из коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН Республики Армения), выращивали в анаэробных условиях на полусинтетической „среде, описанной в работе Парра и др. (Pair S.R. et alд 1976). Молекулярные массы белков определялись методом электрофореза в 10$ полиакриламидном геле (ПААГ) по Воберу и Осборну (Weber К., ' Osborn М., 1969) и методом гель

фильтрации по Эндрюс.у (Andrews Р., 1965). Содержание бежа определялось по методу Лоури и сотрудников (Lowry О.Н. et al., 1951), а для гомогенных окрашенных белков - из общепринятых величин коэффициентов зкстинции характерных полос поглощения в ультрафиолетовой области. Аминокислотный состзв определялся после 8 и 72-х часового кислотного гидролиза бежа. SH-группы определяли помощью реагента Эллмана (Secllak J., Lindsay Н., 1963). Триптофан определяли реакцией с NBS-ом (Spanfle Т.Е., Witkop , 1967). Содержание иеди в препаратах определялось с помощью тетразтилгидрамдисульфзда (Matsuúa J., Takahashi J., 1970). Содержание железа - на основе комплексообразования с о-феннантролином (Cameron В.F., 1965) и методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

О гомогенности полученных белковых препаратов судили по форме элюционной диаграммы и по числу белковых полос при аналитическом электрофорезе по Дзвису (Davis B.J.,1964).

Для получения гема и гем с-содержащей части

цитохромоксидазы использовалась методика, описанная в работах Яманака и Окуяуки (Yamanaka Т., Okmuki К., 1963).

Цитохромоксидазную активность определяли

спектрофотометрически в 0,01М фосмфатном буфере pH 7,0 в присутствии 10~"*М ЭДТА, прослеживая уменьшение интенсивности «--полосы цитохрома с5=1 из Ps. aeruginosa, либо по увеличению интенсивности полосы бЗОнм азурина. Активность фермента выражали в виде числа оборотов в минуту. Сулероксиддисмутазную (СОД) активность препаратов определяли по способности зликвот этих растворов ингибировать реакцию восстановления нитротетразолиевого синего супероксвдными радикалами согласно Нишикими и сотр. (Nishikimi М., 1972), а также по методу Мисра и Фридович (Misra V., Fridovich J., 1972), основанному на ингибировании СОД реакции автоокисления адреналина в адренохром в щелочных средах.

ЭПР спектры в ввде первой производной регистрировались на приборе "Е-4" фирмы "Varian". Оптические спектры и кинетика реакций записаны на спектрометрах "Specorö М-40", "Beckman М-26", "Hitachi 150-20".

Аминокислотный анализ проводился на аминокислотном анализаторе "AAA Т 339".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Очичтка металлсодержащих белков из Pseuflomonas aeruginosa. Наш была разработана методика одновременного выделения и очистки железосодержащей супероксвдцисмутазы нового медь-содержащего гликопротеина: - цитохромоксидазы и двух электронных переносчиков -— азурина и цитохрома с551. В основу методики легла легла методика . выделения растворимых медь-содержащих белков из Ps.aeruginosa, разработанная Парром и др. (Parr S.R. et al.,1976).

Бактериальную пасту промывали 0.02М К-фосфатным буфером и дисперпфовали ультразвуком. Затем озвученную массу центрифугировали и надосадочный раствор подвергали дробному фракционированию сульфатом аммония, собирая фракцию, осаждающуюся между 45% и 100% насыщения. Эта фракция после диализа служила исходным материалом для одновременного получения ряда металлсодержащих белков и ферментов.

Исходный экстракт подвергали гель фильтрации через колонку с сефадексом G-75 (тонкий), уравновешенную 0,02М фосфатным буфером, рН 7,0. Фракции анализировали на цитохромоксидазную, супероксидцисмутазную активности, на содержание меди, а также регистрировали их спектры поглощения в водимой области. Фракции с супэроксидднсмутазной активностью диализоваж против 2мМ трис-НС1-буфера, рН 8,2, содержащего 0,1мМ дитиотрейтола. Диализат после центрифугирования наносили на колонку с ДЭАЭ-Ц8ЛЛЮЛозой ДЭ-52 (1,&<4см), уравновешенную 0,2мМ трис-НС1-буфером и после ее промывания этим же буфером элюировали фермент О,DIM буфером. Затем проводили гель-фильтрацию через колонку с сефадексом G-75 (сверхтонкий). Для концентрирования использовали небольшую колонку с ДЭАЭ-целлзолозой ДЭ-52.

Получение апосупероксвдцисмутазы и её реконструкция. Все используемые растворы предварительно продували аргоном для создания анаэробных условий. Белок в течение 25 мин. инкубировали в 0,2М На- карбонатном буфере с 2мМ ЭДТА и 10мМ дитиотрейтолом при рН II (рН доводили IM NaOH) при 30°. Затем диализировали против 0,2М карбонатного буфера, рН 9,2 с 1мМ ЭДТА и IMM дитиотрейтолом в течение 5-12 часов при 4°С. После десятикратного -а введения диализат наносили на колонку с ДЭАЭ целлюлозой, т.авновешенной 2,5мМ калий-фосфатным буфером, рН 7.8. Апобелок •орбируется на колонке и элюируется 50мМ калий-фосфатным

е

буфером, содержащим 1мМ дагиотрейтол, после тщательного промывания колонки уравновешивающим буфером. Для реконструкции зпобелок инкубировали в течение 25 мин при 30°С в растворе с 12мМ соли Мора и ТОмМ дитиотрейтола в 0,2М Ма-карбонатном буфере, рН II. Затем препарат диализировали против 1мМ дитиотрейтола и 1мМ соли Мора в течение 5-12 часов при 4°С. После 24 часового диализа против калий фосфатного буфера (рН 7,8, 0,05М) концентрировали на колонке с целлюлозой ДЕ-52, .уравновешенной этим же буфером.

Очистка цитохромоксидазы. Полученные при гель-фильтрации чции, содержащие цитохромоксидазу, собирали, разбавляли вдвое ря и наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, ДЕ-52 (колонка 3 х 8см), уравновешенную O.OIM фосфатным буфером, рН 7,4. В этих условиях цитохромоксвдаза элюировалась без задержки, а на колонке адсорбировалась фракция с каталазной активностью.

Оксидазную фракцию диализировали против 2мМ буфера, рН 7.4 и вновь подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 (колонка 3,6-х 12см). Заряженную колонку промывали лиянейным градиентом фосфатного буфера от 0,01 до 0.IM обидам объемом 200мл. Фракции, содержащие цитохромоксидазу, объединяли, доводили их рН до 6.4 и подвергали хроматографии на КМ-пеллюлозе, СМ-32, уравновешенной 0,01М фосфатным буфером, рН 6,4. После исчерпывающего промывания колонки этим же буфером (100мл) фермент элюировали 0,05М буфером, рН 6.9. Полученный препарат цитохромоксидззы был электрофоретически гомогенным. Активность препарата (Ккат) при рН 6,0 и t=22°C по цитохрому с==1 составляла ИОмин"1, а по азурину - 90мин~? Цитохромоксвдаза из Рз. aeruginosa представляет собой двухгемовый белок, содержащий одновременно гемы типа с и типа d, имеющие «-полосы соответственно при 548нм и бЗОнм. На молекулярную массу 120кДа приходится по два моля гемов с и d. Полученный препарат цигохромоксвдазы обладает таза© свойствами ншритредуктазы, поскольку он способен к одноэлектронному восстановлению нитрита в- окись азота, причем донорами электронов как для цитохромоксидазной, так и шггрптредуктазноа реакция могут служить как цитохром с,^., так и азуркн. Для получения гема d4 фермент обрабатывали кислым ацетоном (0,01 И НС1) при 0°С» затем ШНТрйфугарОБЗШйК ОТЖ-ЗК™ остаток, представляющий собой гем с-содержащую часть

цитохромоксидазы. Надосадочную зеленоватую фракцию, содержат гем dt .пропускали через колонку с сефадексом IH-2I уравновешенную пирофосфатным буфером, рН 8,3, 0,05М. Белков, часть, содержащую гем с, еще раз обрабатывали кислым ацетона:

---------- — затем - суспендировали -в пирофосфатном _ буфере тог же молярности

рН для исследования его СОД-активности.

Очистка нового медьсодержащего белка. В ходе исследован анализа меди во фракциях экстракта было обнаружено, что поми азурина, медь содержится еш/з в одной фракции. Эту фраки собирали отдельно и адсорбировали на колонке с ДЭАЭ-целлюлоз DE-52 (1,5 х 3 см), уравновешенной фосфатным буфзром, рН 7, Колонку промывали буфером с градиентом молярности от 0,001 0,41,!, рН 7,4, общим объемом 100мл. Медьсодержащие фракг собирали, диализовали против 0,9$! буфера, рН 7,4, и пос концентрирования подвергали гель-фильтрации через сефадекс G-(сверхтонкий). В ряде экспериментов стадии гель- фильтрации хроматографии повторяли до тех пор, пока при гель-фильтрации получали одиночный пик. Такой препарат являе1 электрофоретически гомогенным. Для получения апоформы бе. ингибитора медь из него удаляли двумя методами. В первом из i препарат белка инкубировали в течение одного часа в кал] фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 1% KCN, и затем реакцион: смесь пропускали через колонку с сефадексом G-25 (тонки уравновешенную 0,01М К-фосфатным буфзром рН 7,0, содержащим 1С ЭДТА. Во втором методе белковый препарат диализировали против К-фосфатного буфера, содержащего 10~3М диэтилдитиокарбамата течение 24-х часов, затем против 0,005М К-фосфатного буфера, 7,0. После диализа проводили хроматографию на сефадексе G (тонкий), уравновешенном 0.00IM к-фосфатным буфером, рН 7 содержащим ЭДГА. Сравнение спектров поглощения холобелк

апоформы показывает, что наблюдающийся в спектре максимум 325-330нм обусловлен наличием меди, входящей в его состав, этом оказалось, что из двух использованных методов получе апоформы только обработка цианидом позволяла получить npenaj полностью свободный от меди. После обрабс цизтилдагиокарбаматом препарат белка содержал до 25% остаток меди, удаление которой требовало повторения процедуры и, вое говоря, было затруднено.

Свойства металлсодержащих белков Pseudomonas aeruginosa. Свойства Fe-СОД. Молекулярный вес бежа определяли двумя методами: а) методом гель-фильтрации; б) методом диск-гель-электрофореза в ПААГ по Веберу и Осборну. Оба метоода показали, что молекулярный вес Fe-СОД равен 40кДа.

Методом диск-гель-электрофореза в ПААГ по Веберу и Осборну был определен также субъедшичный состав белка и молекулярный вес субъедшшц. Оказалось, что Fe-СОД состоит из двух субъединиц с молекулярным весом 20кДа.

Содержание металла определялось атомно-абсорбционноя спектроскопией и химическим анализом, основанном на регистрации высокоспецифичного комплекса Те2* с о-фенантролином. Аналитические данные свидетельствуют, что препарат содержит ■1,8г-атома железа на моль фермента. Определение железа методом атомно-абсорбционноя спектроскопии показало его более высокое содержание в исследуемом препарате — 2,1г-атома на моль димерэ. Исследование препарата на содержание в нем таких металлов, как Ми, Со, Zn, Си, атомно абсорбсионноя спектроскопией показало, что содержание этих металлов в препарате соответствует концентрация'!, относимым к следовым количествам (менее 0,02г-атома).

Таким образом, СОД из Ps.aeruginosa содержит два атома железа в расчете на молекулярный вес 40кДа.

Сульфгидрильные группы СОД определялись при помощи реактива Illman'a. Оказалось, что фермент содержит две сульфгидрильнке группы на молекулу белка (40кДа).

Спектральные свойства. В ультрафиолетовой области СОД мз ?з. aeruginosa имеет выраженный максимум при 278нм и плечо при ЗЗйгл. 3 зтдапой области имеется широкая полоса поглощения иаксидуиг з области от ЗЗСнп до 350ея. При восстановлении белка дитионипг. ST-? полоса цсчезгзт. Она отсутствует также в спектре поглощения апс5элкз„ не преющего выраженного поглощения в видимой области. Б ультрафиолетовой области холофермент и апофермент имеют идентичные спектры. Иначе говоря, железо не вносит вклада в поглощение этой области. Коэффициент экстинкции, ^, полосы при 273пм олзктрофорэтически гомогенного препарата фермента оказался равным 40 0G0 И-1 см-1. В этих измерениях концентрация белка была

orrrvi ТТ=. ТО-Л о пг\ TTnirrvijr

l.J11-У f l.'ti. I

Магнитные свойства. ЭПР спектр СОД лежит в области

трехвалентного

железа, находящегося а поле лигандов с ромбическим искажен» симметрии, описываемым набором g-факторов: gl=4,81, g2=3,S ^=3,74.

При исследовании зависимости ЭПР спектра от рН среды удало выявить появление и изменение небольшого пика в спектрах Fe-C при g4=4,74. Оказалось, что изменения рН как в кислую, _так__и ы,елочную -сторону приводит к увеличению интенсивности этого пик которое имеет обратимый характер в оласти рН 2,5 - 10. П; добавлении роданида калия происходит падение активности фермент, но в спектре белка, кроме небольшого уширения в области g ~3,7' других изменений не наблюдается. Таким образом, хотя как фтори, так и роданид являются сильными ингибиторами фермент; однозначное доказательство, что их ингибирующий эффект связан < взаимодействием с атомами железа, входящими в активный цен' фермента, на основании ЭПР-данных было получено только д; фторида.

Исследование ферментативной активности Fe-СОД. На графи» зависимости степени подавления образования формазана с концентрации Fe-СОД 50%-ое подавление реакции образована формазана наблюдается при концентрации фермента 2xI0~aM Апофермент ингибирующей активностью не обладает. Добавление F~ 1000-кратном молярном избытке по отношению к ферменту приводит подавлению актианости на Ш5, а роданида в том же соотношении -практически полной потере ферментативной активности. В то ж время цианид в том же соотношении не оказывал ингибирующег влияния на фермент.

Обсуждение. При сравнении Fe-СОД из Рз. aeruginosa с уж: известными железо-содеркащими СОД из разных источников, н; основании полученных данных можно сделать вывод, что фермент и; этого источника является типичным представителе!

супероксиддисмутаз, содержащих в активном центре железо. Так, егс субъединичный состав, содержание металла, влияние ингибиторов, резистентность к цианиду, форма и параметры ЭПР спектров, оптические свойства являются довольно характерными для этогс класса супероксиддисмутаз.

Свойства цитохромоксидззы (цитохрома cdx, нитритредуктазы). Известно, что многие терминальные медь-содержавде оксидазы, как синие, так и несиние, как растворимые, так и мембранные проявляют некоторую сод активность. Установлено, что: СОД активность

снозноп тер:ушалькой окспдазы - цнтохром - с - оксидазы. одержадзп как гвкя еа , так и ::едь, обусловлена в основной здью. 3 то же время, терт-шальная оксздаза из Ps. aeruginosa одзржут дза разных гет'.а с и d, и не содержит кади. В этой связи а изучили СОД активность щггохрочоксидазы из Ps. aeruginosa, казалось, что эта вдтохромоксидаза также *шгибирует реакцию Зрзгозания форт'азана, образующегося в результате взаимодействия упэрокспдных радикалов с тетразолиэм. Оказалось,что 50%-ое зпайфовзшэ нсб;:.эд£этся при концентрата? фермента ю*®!Д, а для VZn СОД - 5--10~э,г'. Тахш образом СОД активность ггохромоксвдззы всего на одкн порядок иенывэ активности Cu/Zn )Д и сравнена с •".ктпвность'-э ?е-СОД '"з гззфоорганизмов. В зльнейшем, для выяснения роли гемов в СОД-активности )лоферпента г.:ы экстрагировали и очистили гем d из фермента и гем -содержаний остаток цитохромоксидазы.

Основной вклад в СОД-активность цитохромоксидазы принадлежит iMy d . График зависимости подавления образования формазана от 'нцентрации цитохромоксидазы имеет несколько атипичную для Д-актиБности сиплоидальную форму. Возможно, это связано с ложением активности гема и гем с-содержащего остатка, лэдзвсего способностью улавливать супероксидаый радикал, то ть быть скевендкерои О;-.СОД-активность цитохромоксидазы, ре деленная формазановын петодом, является цданидзаввсткоа, « I0_c*s" цианида полностью инга5ирукгг активность. Среди следованны:: анионов и SCT также являются ингибиторами, ~отя того :;еке? оффзкгзнкгт» тогда как IT" на обладает ~л5:ггсрзыж свсУстга:::;. ССД-.хспзность гепа d так.» "".З.УТЗТСя цугЕцвэ:?.

Сбсу:::г.5н::з уззультатоз. Вез до сих пор известные

_ . у.:-?., У су;; ':; j^ycv. ü дсоторыя непосредственно . • . .г.т.-с.т с . -»л у:ттрхгол в ходе окспдазнса кга

. у.у""-'.:т; уу: . уууу.у::уу уу.ыюго феруента, В отаичке от - уу угтсту ;\,:.V-:c::„ уууууостъ гема d инпйируется не "'.с :г"уууууу ус у утопут;:. А в отличие от Fo-СОД из Р?

Ii

aeruginosa, активность тема ^ ингийируется не только фторидом, но и цианидом. Таким образом, имеется определенная особенность в ингибировании этого фермента анионами. Важно подчеркнуть, что СОД-активностъ гомогенатов Ps. aeruginosa может быть связана не только с Fe-СОД, но и с цитохромоксидазов, причём СОД-активность обоих ферментов соизмерима. ________ ______________ ______

Свойства'нового медьсодержащего белка. Выше говорилось об обнаружении в экстрактах Ps. aeruginosa нового медьсодержащего белка, отличного от азурина. Для выяснения функции этого белка необходимо было более подробно изучить его свойства. Молекулярный вес белка, определенный методом гель-фильтрации и диск-гель-электрофореза в ПААГ оказался равным 20кДа. На основе данных диск-гель-электрофореза по Веберу-Осборну мы предположили, что белок состоит из 2-х равных субъединиц по 10кДа..

Аминокислотный состав, содержание углеводов и сулъфгидриль-ных груш, определение металла. Анализ аминокислотного состава белка проведали после его 48- и 72- часового гидролиза. Определение триптофана NBS-ом показало, что в молекуле белка имеется также по крайней мере один остаток триптофана. Количество сульфгидрильных груш, определённое методом Эллмана, показало, что на одну молекулу белка (на молекулярную массу 20 кДа ) приходится одна сульфгвдрильная груша.

На наличие меди в белке указывал характерный для меди типа II сигнал ЭПР меда. Количество меди мы определяли также химически, используя комплексообразование с

тетразтилтиурамдисульфидом . Согласно полученным данным на моль белка (20 кДа) приходится два г.-атома меди. Содержание железа в белке, определенное химическим анализом, оказалось следовым. Препарат на содержание других металлов не тестировали.

Спектральные свойства. Белок имеет широкий максимум поглощения при 258нм и поглощение в ближней УФ области при 325нм. Апобелок не имеет поглощения при 325нм, при удалении металла в УФ области максимум смещается на 2-Знм в сторону длинных волн. Разностный спектр белка ("апо" минус "холо") имеет узкий пик при 278нм и минимум при ЗЗОнм. Адсорбционный спектр бежа в ближней УФ области зависит от рН . Мы рассчитали для каждого

значения рН и построили график зависимости от рН.

Оказалось, что кривая рН-титрования имеет точку перегиба в области рН от 7,8 до 8,2. Медь в белке находится в парамагнитной,

двухвалентной форме и обнаруживает ЭПР спектр со следующими параметрами: 2,07; g„= 2,23; А,= 180 G. Форма и параметры сигнала, как оказалось, зависят от рН. При качественном анализе препарата медьсодержащего белка на углеводы оказалось, что белок содеркит фруктозу. Таким образом, его можно рассматривать как гликопротеид. Изоэлектрическая точка гликопротеина, определенная элекгрофоретически, оказалась в районе 3-4, то есть он обнаруживает весьма кислые свойства.

Возможная физиологическая роль нового медьсодержащего белка. Мы обнаружили, что окисление азурина, так же как и цитохрома е551, катализируемое цитохромоксидазой, ингибируется желтым медьсодержащим гликопротеином из Ps.aeruginosa. Эти данные приведены на Рис.1а и 1Ь. Для определения константы ингибирования иы провели серию экспериментов с разными концентрациями субстата (цитохрома сЯ51) и ингибитора. Данные представлены в Диксоновских координатах на Рис.1с. Константу ингибирования определили графически, как показано на рисунке. Она оказалась равной 1=2,5-Ю'^М. Ингибирующее влияние белка было полностью збратимым, поскольку удаление его из реакционной среды тосредством гель-фильтрации приводило к полному восстановлению активности цитохромоксидазы. Никаких изменений с восстановленными im окисленными белками, служащими субстратами для цггохромоксидазы (азурин, цитохром са31), не происходит при убавлении желтого белка. .Спектральных изменений не наблюдается ■акже и в спектре цитохромоксидазы при добавлении к ней белкового шгибитора - желтого белка. Никаких изменений в спектрах субстратов и цитохромоксидазы не наблюдалось также под влиянием побелка, который явлется столь же эффективным ингибитором лтохром- и азурин- оксидазноя активности цитохромоксидазы, как и олобелок. Тем самым исключается участие медной компоненты белка ингибировании цитохромоксидазы.

Мы исследовали также влияние желтого бежа на упероксидписмутазную активность цитохромоксидазы

нитритредуктазы). Полученные данные в графическом виде приведены а Рис.2 (2 и 3). Супероксидцисмутазная активность

итохромоксвдазы при добавлении 2 * Ю7М желтого белка кеяыпается только на 5%, а сигмоидальность кривой зависимости эдавления образования формазана от концентрации нитритредуктазы зсколько сглаживается. Таким образом, ложно сделать вывод, что

Рис.1 . Влияние медного белка на окисление цитохрсиа с-551 (А) и азурина (В) нитритредуктазой.

Данные для окисления цитохрома с-551 пр:~;с~е::с и ¿сасонсзскш:

координатах (С). Концентрация з (l] :: (3)

—7

1,5 х 10 М. Для кривых I и 2 копис;;трг1ГГ-: ;. ч

азурина соответственно равнялись 1,6 :: :; 2. ¿ó :: 10 '

Кривые 2 снимались после добавлзнг: нэлтсго белка з концентрацией последнего a рсгглссглсЛ 4,4 :: 'ССГ':.!

Пунктирные 'линии - это ксптрс,~:-1£. кксли:.;.; цт..\

с-551 и азурина без дсбазлошхс ¡mxpcspo.vzzvszzi. В ( С ) концентрации цитохролй с-551 н {тритрэдусгаой сссти-ь^их:, следуюаие : 3,2 х Ю-0 г 1,5 х 10"' М.

Рис. 2. Ингибироваяие образования формазана из нитротетразолие-вого синего нзтритрадуктазой (I) и влияние на СОД-активность шггр1ггрэд?ктазц белха-нггяблтора при концентрации Ю-7?.! (2)

п

л 240" М (3). По оси абсцгсс отлояеяа концентрация нитритре-дуктазы.

о— Л

, 1

ль ■■ ^•»

СОД-активность цитохромоксидазы существенно не изменяется под действием медного гликопротеина.

Мы также допустили возможность переноса меди от желтого белка азурину, то есть предположили, что Cu-белок может служить переносчиком меди. С целью проверки этого предположения_апоазурин инкубировали с зквимолярным количеством желтого белка, а также с его избытком. Затем смеси пропускали через колонку с сефадексом G-50 и во фракции с апоазурином определяли содержание меди. При этом оказалось, что в апоазуриновог фракции медь не обнаруживается. Тем самим может быть исключена возможная роль Cu-белка как донора меди для апоазурина.

Обсуждение результатов. Подученные данные по определению молекулярного веса свидетельствуют о том, что белок состоит из двух, вероятнее всего, идентичных субъединиц с молекулярным весом 10кДа и содеркит 2,2 - 2,4 г-атома меди на молекулу белка. Дисульфидный мостик имеющийся в каждой субЪздинице, вероятно, недоступен для растворителя, так как субъединица с молекулярным весом 5кДа появляется только после обработки белка 8М мочевиной и /э-меркагггоэтанолом. Роль, способ связи и количественное содержание углеводной компоненты остаются невыясненными. Неясно, присоединены ли углеводы ковалентно иди же являются только инклюзией. Поскольку данные по аминокислотному составу дз:от примерно то же значение молекулярного веса для одной субъединицц, можно предположить, что содержание углеводов нев&лгко. Фактически, при их содержании более 10% наблюдались бы заметные отклонения в аминокислотном составе, а также отмечались разночтения в величине молекулярного веса, определенного электрофоретически и • гель-фильтрацией. Как уг.г отмечалось,максимум поглощения белка в УФ области находится пр:: 260нм. Такое положение максимума является нетипичным для белке:., для которых более характерно поглощение при 275-2£5;i;: обусловленное ароматическими аминокислотами. Максимум при 26Q;i:; наблюдался также у металлотионеинэ и нейрокупреина. Однако, в первом случае он обусловлен наличием связей металл-сера, тогда как во втором случае -. наличием органического кофактора неизвестной природы. У белка из Рз. aeruginosa эта полоса не связана с присутствием меди, поскольку после удаления кеда она сохраняется. В то же время поглощение при 325нм исчезает после удаления меди, что ясно свидетельствует ■ о принадлежности этой

полосы медному центру. Зависимость интенсивности поглощения при 324нм от рН при неизменности поглощения в УФ области, может косвено указывать на наличие у меди титрующейся лигандной группы. Исходя из значения рКа=8,3 взято значение точки перегиба на графике зависимости от рН, можно предположить, что этим

лигандом является SH-группа цистеина. Как установлено, ЭПР спектр Cu-белка характерен дая меди типа II , находящейся в ромбически искаженном лигандном окружении. Интенсивность сигнала при низких рН падает, что может говорить о частичном восстановлении меди одной тиоловой группой. В пользу предположения, что основной функцией желтого белка является его способность ингибировать цитохромоксидазу говорит тот факт, что его сродство к цитохромоксидазе даже сильнее сродства азурина или цитохрома с » являющихся субстратами этого фермента. Желтый белок является металлопротеином, однако наличие металла не играет никакой роли в процессе этого ингибирования: апобелок так же эффективно ингибирует цитохромоксидазу, как и холобелок. Следовательно, медь не имеет здесь структурной и окислительно-восстановительной роли. Кроме того, в окислительно-восстановительных процессах с цигохромоксидазой этот белок не участвует. Он также не переносит металл на азурин. Все эти результаты позволяют рассматривать этот белок как регулятор нитригредуктазной активности в Ps. aeruginosa. В отличие от азурина и цитохрома c5si - электронных доноров цитохромоксидазы, желтый белок сильно кислый и не исключено, что имеет опреднленные связывания на цитохромоксидазе. Взаимодействие белка с цигохромоксидазой приводит к прекращению доступа электронов от азурина или цитохрома c5Sl. В пользу такого предположения говорят также результаты влияния желтого белка на супероксидцисмутазную активность цитохромоксидазы. Действительно, если сигмоидальность кривой этой активности для цитохромоксидазы является результатом суммирования действий двух независимых активных центров (цитохрома с и гема d), то исключение одного из них привело бы к сглаживанию кривой и к уменьшению активности на определенное постоянное значение после насыщения ингибитором, что и наблюдалось в эксперименте (Рис.2). Так как основная СОД-активность 'цитохромоксидазы обусловлена гемом а, ,а не цитохромом с, то-можно предположить, что под влиянием ингибитора "выключается" именно гем с,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Феномен нитратного (нитритного) дыхания, при котором наблюдается переход от использования в качестве терминального акцептора электронов азотсодержащих соединений вместо кислорода, - является -все - еще - загадочным. -Каковы биологические механизмы переключения системы от использования одного акцептора к другому, в чём состоит значение этих переключений, какие конкретные процессы вовлекаются в механизм трансформации, какова их роль для окружающей среды - вот только небольшой круг вопросов, требующих рассмотрения в первую очередь.

Обнаружение и изучение свойств СОД в Ps. aeruginosa показывает, что денитрифицирующие микроорганизмы надежно защищены от супероксидных радикалов и, следовательно, это косвенно означает также, что в ходе метаболизма денитрификаторов возможно образование этих реакционноспособных радикалов. Более того, сама терминальная система (цитохромоксидаза, нитритредуктаза, цитохром cdt) этих микроорганизмов также обладает значительной СОД-активностью, связанной, как было выяснено, преимущественно с гемом который фактически и выступает как терминальный, то есть непосредственно взаимодействующий с кислородом (нитритом) компонент данного фермента-. Тем самым впервые удалось показать, что гем типа d , являющийся одним из самых распространенных в микроорганизмах терминальных гемов, способен выступать как фермент, катализирующий дисмутацию супероксида на свободный кислород и перекись водорода. В то же время гем с в цитохромоксидазе, подобно гемам с из других источников (практически любые цитохромы типа с ), функционирует как одноактный скзвендаер супероксидных радикалов, восстанавливаясь при этом, а не является катализатором процесса их дисмутации.

Хотя точное физиологическое значение наличия СОД активности гема d у Ps. aeruginosa в настоящее время неясно, тем не менее уже сейчас можно высказать предположение, что оно отражает механизм восстановления кислорода на этом ферменте, которь;:. логически должен быть одноэлектронным. Это означает, что механизм восстановления нитрита, по всей вероятности, также является одно электронным:

ГКГ + ¡Г + е -» N0 + ОН".

Наличие СОД-активности гема d поднимает также вопрос о

эзможности дисмутации нитрита на гене d:

2NO~ + ZH+ -► КО + NO + Н О.

2 2 2

га возможность, однако, может быть проверена лишь в последующих эленаправленных исследованиях.

Каковы бы ни были механизмы денитрификации или зсстановления кислорода и переключения этих активностей на итохроме cd4 у Рз.aeruginosa, любые предполагаемые схемы должны удут учитывать наличие у этого организма кислого медьсодержащего ликопротеина, выступающего как эффективный природный ингибитор ксидазной активности цитохрома сс^. Характерно, что этот белок з обладает заметной СОД-активностью и, следовательно, сн не ожет выступать как конкурент за супероксидные радикалы, Зразующиеся при восстановлении кислорода на цитохроме cdj. Кроме ого, медь в белке не вовлекается в процесс ингибирования, оторое обусловлено белок-белковым взаимодействием между ерментом и ингибитором, а не связано с оттоком электронов на едь. Поскольку этот белок не влияет на СОД-активность цитохрома d1, а только на его оксидазную функцию, его участок аимодействия с цитохромом cti^ должен лежать не на терминальном еме d, а на участке ближе к гему с, или даже непосредственно на ем. Таким образом, благодаря действию этого белкового нгибигора, по-видимлому, прерывается внутриферментный поток лектронов от гема с к гему d.

Такой механизм ингибирования свидетельствует о чрезвычайно ажной роли белков этого типа в регуляции активности цитохрома dj и его переключении от оксидазной к нитритредуктазной функции. Когда данная работа была закончена, появилось сообщение о .аличии сходного по свойствам белка в других денитрифицирующих икроорганизмах, что подтверждает наши результаты и :видетельств.ует о распространенности этого белка в других сенигрификаторах и его вовлеченности в процессы регуляции ^нитрификации.

вывода

I. Разработана методика выделения и очистки Fe-содержащей СОД в высокоочищенном состоянии из денитрифицирующих бактерий Pseudomonas aeruginosa.

-— 2. Изучены-.физико-химические^ свойства Fe-СОД. Получена апоформа фермента и произведена его реконструкция. Определен молекулярный вес, субъеданичный состав, содержание металла, коэффициент зкстинкцки характерных полос поглощениям. Изученс влияние рН и различных анионов на ЭПР -спектры и влияние анионог на активность фермента.

3. Обнаружен новый тип активности (супероксиддисмутазная) i нитритредуктазы из Pseudomonas aeruginosa. Показано, что зт; активность связана с гемом й нитритредуктазы. Изучено влияние неорганических анионов на СОД активность гэма : нитритредуктазы.

4. В лизатах клеток обнаружен новый медьсодеркащи гликопрогэин. Разработана методика его выделения и очистки д злектрофоретически гомогенного состояния этого гликопротеина.

5. Изучены физико-химические свойства нового медьсодержащег белка. Определены молекулярный вес, субЪэдиничнь состав.содержание металла, аминокислотный состав этого белкг Разработаны метода получения апобелка и его реконструкцт Изучено влияние рН на оптический спектр поглощения и i ЭПР-спектр медьсодержащего гликопротеина.

6. Показано ингибирующее влияние желтого медьсодержаще] гликопротеина и его апобелка на "азуриноксидазную" и "цитохр< с551-оксидазную" активности нитритредуктазы. Доказано,что медь белке не влияет на ингибиторную активность этого гликопротеина.

7. Изучено влияние жёлтого гликопротеина на СОД-активнос нитритредуктазы. На основе полученных данных выдвину представление о возможном механизме взаимодействия электронн переносчиков (азурина и цитохрома cssi) с нитритредуктазой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.В.Карапетян, М.А.Симонян, Р.М.Налбандян. Взаимодействие супероксиддисмутазы с антителами. Тезисы 4-ого авсесоюзного биохимического съезда.

2. А.В.Карапетян, Н.И.Мкртчян. Железосодержащая супероксиддасмутаза из Ps.aeruginosa. Тезисы I Республиканской молодежной конференции по биохимии, биофизики и молекулярной биологии, посвещенная 60-летию Советской Армении. Цахкадзор, 24-26 декабря 1980г., стр.3.

3. А.В.Карапетян, Н.И.Мкртчян, Г.Н.Надаарян. ЭПР-спектры железосодержащей супероксиддисмутазы из Рз. aeruginosa. Тезисы всесоюзной конференции по магнитному резонансу, Черноголовка, 1981г. стр.73.

4. A.V.Karapetian, R.M.Nalbandian. A Novel Copper Cotaining Protein Iroin Ps.aueroginosa, USSR-Sweden III symposium on Physico-Chemical Biology, Abstracts, Tbilisi, 1931, p.153.

5. М.Г.Камалян, А.В.Карапетян. Получение и некоторые свойства компонентов дыхательной цепи денитрифицирующих бактерий Ps.aeruginosa. Тезисы III республиканской молодежной конференции по физико химической биологии, Агверан, 1985, с.28

6. М.Г.Камалян, А.В.Карапетян, Р.М.Налбандян. Металлсодержащие белки и ферменты денитрифицирующих микроорганизмов. Их свойства и роль. Тезисы республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван, 1988, с.22.

. М.Г.Камалян, А.В.Карапетян, Р.М.Налбандян. Растворимые металлсодержащие белки Ps.aeruginosa. Биохимия, (1986), _51_, В.9, стр.1420-1425.

. A.V.Karapetian, M.G.Kamalian, R.M.Nalbandian. On the Superoxide Dismutase Activity of Cytochrome Oxidase from Ps.aeruginosa. Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemistry, Biology and Medicine; ed. G.Rotilio, Ilsevier/ Science Publisher B.V.(Biochemical Division), Amsterdam, (1986), pp.72-74.

9 V.Karapetian, M.G.Kamalian, R.M.Nalbandian. A Copper Containing Protein that Inhibits Nitrite Reductase from Ps.aeruginosa.FEBS Lett., (1986), n.2, pp.131-134.

.10. А.В.Карапетян, Р.М.Налбандян. Свойства бежа ингибитора нитритредуктазы из Ps.aeruginosa. Биохимия, в печати.

^/У А „ . .J

Технический редактор А.С.Абрапян

Подписано'в печать 30.'1J.92г. Форкат 60x84x16

ифсеткая печать. Тираж 100 экз.

Зак.тип. 061

Отпечатано в Еревзкскоп физз«с.счоа институте Ереван-36, ул. Братьев Алиханян 2.