Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурных и ионтранспортных свойств терминальных оксидаз щелочеустойчивой бактерии Bacillus sp. FTU

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурных и ионтранспортных свойств терминальных оксидаз щелочеустойчивой бактерии Bacillus sp. FTU"

од

3 ФЕВ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА,

ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

ШОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УСТИЯН Владимир Степанович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ И ИОНГРАНСПОРТНЫХ СВОЙСТВ ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ ЩЕЛОЧЕУСТОИЧИВОИ БАКТЕРИИ Bacillus sp. FTU.

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

академик РАН, профессор В.П.Скулачев,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.К.Акименко; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В.Ю.Арцатбанов

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится "24 " февраля 1997 года в 15— на заседании диссертационного совета Д.053.05.32. при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Еиологическо-го факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " января 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук старший научный сотрудник

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Гемсодерясащие оксидазы (комплекс iv) являются заключающим звеном дыхательной цепи живой клетки и катализируют реакцию восстановления кислорода до вода. Химические процессы, протекающие при восстановлении кислорода, приводят к образованию на мембранах живых организмов градиента протонов и запасанию энергии в виде разности электрохимических потенциалов ионов водорода на мембране. Запасание энергии в виде разности электрохимических потенциалов ионов водорода на мембране (дйн+) является одним из важнейших положений хемиосмотической теории Митчелла (Mitchell 1961, 1966), которая получила множественное экспериментальное подтверждение за последние 20 лет. Кроме того, было показано, что некоторые оксидазы являются истинными протонными переносчиками и переносят протоны с внутренней стороны мембраны наружу (Puustinen et al., 1991; Wikstrom et al., 1979; 1984). Бактериальные ОКСИДЭЗЫ OT-личаются большим разнообразием по сравнению с эукариотическими. По специфичности к природному донору электронов бактериальные оксидазы делятся на вдтохром-с- и хинолоксидазы. Ферменты обеих групп входят в состав надсемейства протонпереносящих оксидаз, содержащих би-ядерный гем-медный центр, в котором происходит восстановление кислорода до воды. Существуют оксидазы, не входящие в надсемейство оксидаз. В качестве примера можно привести оксвдазу м-тша классического объекта исследований Escherichia coii. Эта хинолоксидаза не содержит меди И не переносит протоны (Puustinen et al., 1991). Возможно, в качестве сопрягающего иона используется не протон, а натрий. Такое предположение было выдвинуто В.П.Скулачевым (skuiachev, 1989, 1991, 1994) в рамках теории натриевой биоэнергетики, призванной объяснить ряд затруднений, возникающих при описании с помощью

хемиосмопиеской теории Митчелла биоэнергетических процессов у бактерий, живущих при пониженных значениях лДн+.

Объектом наших исследований была гало- и алкалотолерантная бактерия Bacillus sp. ftu (Bacillus halodurans ftu)*, обнаруженная и описанная в лаборатории биоэнергетики (Верховская и др., 1988). На терминальном участке дыхательной цепи этой бактерии были обнаружены протон- и натрийспецифичные составляющие дакания (Kostyrko et ai., 1991). Было показано, что транспорт протонов суббактериальными частицами ингибировался цианидом в микромолярных концентрациях, тогда как для подавления транспорта ионов натрия требовались на порядок больше концентрации (Kostyrko et ai., 1991). В нашей группе было показано, что данная бактерия содержит оксидазы двух типов: саа3-тшз и (предположительно) о-типа, на порядок различающиеся по чувствительности к цианиду (Мунтян и Скрипникова, 1993). Какая из двух обнаруженных оксидаз ответственна за транспорт протонов, а какая - за транспорт ионов натрия, установлено не было. Данный вопрос служил предметом дискуссий.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. В задачу данной работы входило изучение просте-тических групп и ионтранспортных свойств оксидаз B.halodurans ftu и их сравнение с хорошо изученными оксидазами ъо- и ьз-типов e.coü с целью установления ионной специфичности оксидаз B.halodurans ftu.

НОВИЗНА РАБОТЫ. Установлен гемовый состав двух ранее обнаруженных оксидаз B.halodurans ftu. В соответствии с гемовым составом оксидаза с высокой чувствительностью к цианиду отнесена к саа3-ти-пу, а оксидаза с низкой чувствительностью к ингибитору, ранее описанная как о-типа, - к ьь-типу.

* В 1996 году бактерия Bacillus sp. ftu определена до вида и названа Bacillus halodurans ftu (ГрИНКвВИЧ и до., в ПвЧЗТИ).

Установлено, что оксвдаза саа^-типа, в отличие от оксидазы ъь-тша, принадлежит к надсемейству оксидаз с гем-медным биядерным центром.

Показано, что оксвдаза саал-типа переносит до двух н+ на один потребленный атом о. Соотношение н+/о для оксидазы £>ь-типа близко к нулю, что позволяет отнести оксидазу ьь-типа к непротонным генераторам энергии.

Определены природные (непроникащие) доноры электронов для оксидазы саа3-типа, что позволит провести работу по изучению ионной специфичности оксидазы, встроенной в протеолипосош. Разработаны метода выделения мембранного и растворимого цитохромов с из бактерии В.Ьа1ос1игапз яти,

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Проведенные исследования позволили выявить новые фундаментальные закономерности в организации оксидаз микроорганизмов и предоставили новые подхода к систематике бактериальных оксидаз, отличающихся большим многообразием. Углубление знаний о терминальных оксидазах бактерий позволяет оптимизировать условия выращивания важных для промышленности микроорганизмов и разрабатывать новые средства борьбы с патогенными бактериями.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы были представлены на научных семинарах лаборатории биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1994, 1996), на 7-ой (Хельсинки, 1992) и 9-ой (Лоуван-ла-Нев (Бельгия), 1996) Европейских биоэнергетических конференциях, на Мевдународной встрече "Основные электрон-транспортные комплексы в фотосинтезе и дыхании" (Гмунден (Австрия), 1993), на I и п Всероссийских конференциях "Белковая инженерия" (Москва, 1994, 1995), на Мездународ-ном совещании "Мембранная биоэнергетика" (Москва, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 работ и одна статья находится в печати.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация включает рисунков, таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали штамм бактерии B.haiodurans ftu, выделенный в лаборатории биоэнергетики НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ (Верховская и др., 1988) и штаммы е.соИ gr70n, goio2, goio3, goio4, любезно предоставленные Р.Геннисом (Урбана, США). B.haiodurans ftu культивировали, как описано ранее (Верховская и др., 1988). Штаммы е. coi i выращивали на богатой среде lb с антибиотиками согласно описанию каждого штамма. Все перечисленные микроорганизмы выращивали аэробно при 37°С на круговой качалке.

Суббактериальные частицы получали по методике, предложенной СемеЙКИНОЙ и соавт. (Semeykina et al., 1989) С МОДИфИКаЦИЯМИ (МуН-тян и Скришикова, 1993).

Мембранные белки экстрагировали 30 мМ октилглюкозидом и очищали путем ионообменной хроматографии на носителях DEAE-sephacei и DEAE-Toyopeari, а на заключительном этапе - на ионообменной колонке mono-q ("LKB-Pharmacia").

Гемовый состав образцов определяли хроматографически в обращенных фазах с использованием колонки "Диасорб CI6" ("Элсико", Российская Федерация). Гемы экстрагировали из образцов по методике,

ОПИСаННОЙ СОНЭ И СОаВТ. (Soné et al.,1991).

Содержание меди в препаратах оксидаз определяли с помощью

атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (Седых и др., 1991). За помощь при определении меда автор выражает искреннюю благодарность ст.н.с. НИИ ГЕОХИ РАН Н.П.Старшиновой.

Спектральные характеристики бактериальных мембран и выделенных цитохромов получали на двухлучевом спектрофотометре Hitachi и-3400.

Выброс протонов бактериальными клетками регистрировали по изменению рн реакционной смеси с помощью рн-метра и комбинированного микроэлектрода.

Электрофорез в денатурирующих условиях (ДСН-электрсфорез) проводили ПО методу Лэшли (Laemmly, 19 70). Нвденатурирущий ЗЛвКТрО-форез проводили в 4-9% градиенте ПААГ. Гели после неденатурирующе-го электрофореза окрашивали либо на ТМФД-оксидазную активность,

либо на гем (Thomas et al., 1976).

Оксидазную активность измеряли закрытым электродом Кларка при помощи полярографа lp-7E.

Концентрации белка определяли по модифицированному методу Лоу-

ри (Markwell et al., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Ранее в нашей группе было показано, что на начальных стадиях роста культуры B.haiodurans ftu преобладает оксидаза caay-тша, тогда как в стационарной фазе роста - оксидаза о-тила* Оксидаза саа3-типа более чувствительна к цианиду, чем оксидаза ьь-типа, разница концентраций ингибитора - на порядок (Muntyan and Skripnikova, 1993). На субОактериальных частицах B.haiodurans ftu был цродемон-* иксидаза о-пша B.haiodurans ftu в ходе настоящего исследования (см.Результаты, раздел ш) была переименована в оксидазу ьь-тлпа. Далее везде используется последнее название.

стрирован первичный транспорт ионов Н+ и Na+ на терминальном участке дыхательной цепи, причем транспорт протонов ингибировался на порядок меньшими концентрациями цианида, чем транспорт ионов натрия (Kostyrko et ai., 1991). Константы ингибщхэвания ионного транспорта и оксидаз сравнимы, что дало возможность предположить связь протонного транспорта с оксидазой саа3-типа, а выброса ионов натрия с оксидазой ьь-типа.

Известно, что у е.сои также наблюдается преобладание одной из оксидаз в зависимости от стадии роста культуры: оксидаза ьо-типа доминирует на ранних этапах роста, тогда как оксидаза bd-тша - на ПОЗДНИХ (в стационарной фазе) (Ingledew and Poole, 1984). При этом оксидаза Ьо-типа на два порядка чувствительнее к цианиду, чем оксидаза bd-типа (Kita et al., 1984(a)).

Для E.coii было показано, что оксидаза ьо- типа переносит протоны, а оксидаза м-типа не способна к подобному транспорту (puus-tinen et ai., 1991). Недавно получены указания, что оксидаза м-типа е,coli участвует в переносе ионов натрия через мембрану (Aveti-syan et al., 1991).

К наблюдаемым чертам сходства оксидаз, преобладающих на начальных этапах ростового цикла (саа3-тша в.halodurans ftu и Ьо-типа E.coii), с одной стороны, и оксидаз, характерных для конца ростового цикла (ЬЬ-типа B.halodurans ftu И bd-ТИПа E.coii), С ДРУГОЙ, нужно добавить еще одно интересное свойство. Оксидазы, характерные для начальных фаз ростового цикла бактерий, реассоциируют с монооксидом углерода (со) с монофазной кинетикой при близких значениях т. Оксидазы, преобладающие в конце ростового цикла, реассоциируют с со по-другому, кинетический процесс в этом случае описывается трехфазной кривой, причем значения г каждой соответствующей компоненты для

оксидаз оказываются также близкими (Muntyan et al., 1993 (a,b); Muntyan et al., 1994).

Обнаруженное сходство пар оксидаз B.halodurans ftu и E.coli no ряду признаков сделало интересным и обоснованным дальнейшее изучение оксидаз B.haiodurans ftu в сравнительном аспекте с оксидазами E.coií для установления природы простетических груш и сопрягающего иона у каздой из бациллярных оксидаз.

г. ОЧИСТКА ОКСИДАЗЫ саа^-ТША В.halodurans ftu.

Процедура очистки для оксидазы отличалась от описанной ранее (Скрипникова, канд.дасс., Москва, 1995). Оксидазу после третьей стадии очищали в три этапа. Сначала хроматографией на носителе DEAE-Toyopeari с элюцией сорбированных белков линейным градиентом Nací в присутствии 15 мМ ОГ и затем повторной хроматографией на том же носителе с элюцией градиентом Nací в присутствии 3 5 мМ ОГ. На

Табл.1. Очистка оксидазы саа3-типа B.balodurans FTU.

Стадия очистки Гем а оелок' нмоль мг Удельная активность, мкгатО мин.мг Удельная активность, мкгатО мин.нмоль а Общий гем а, нмоль Общий белок, мг Общий белок, %

1.СБЧ* 0,23 5 1 I8J5 82,8 360 100

2. 0Г-* экстракт 1.0 14-23 | 13,8-23 90,0 90 25

3.Высаливание 4,0 32,5 | 9,5 12,4 3,1 0,9

4.DEAE-Toyopearl 5,2 42,0 J 8,1 9,36 1,8 0,5

5.DEAE-Toyopearl 7.2 30,2 Г 4,2 4,54 0,63 0,18

В•ВЭЖХ, MONO-Q 19 20 1 1,05 | - j -

* - суббактериальные частицы - не определяли

** - п-октшцз-о-глюкопиранозид

завершающем этапе очистку проводили в условиях ВЭЖХ на ионообменной колонке мош-о. Результаты очистки оксидазы саа3-тша приведены в таблЛ. ДСН-злектрофорез препаратов оксидазы саа3-типа на разных стадиях очистки с последующей окраской гелей на белок и гем (РисЛ) показал, что при очистке в препарате уменьшается как общее количество белков, так и гемсодернаяда в частности. Сначала отделяется гемсодержапдай белок мг-25 кДа, а на пятой стадии, связанной с частичной потерей активности (Табл.1) - гемсодержапдай белок мг-20 кДа (Рис.ХА, дорожка 5). Данные Рис. 1А свидетельствуют, что указанные белки (мг-25 кДа и мг-20 кДа) содержат гем с. В отличие от гемов а, ь, о и <1, гем с связан с белком ковалентно, поэтому в условиях ДСН-электрофорезз гем с является единственным не диссоциирующим гемом, который мигрирует вместе с полипептидными молекулами. Согласно спектральным данным основной белковый пик, полученный при элюции на пятой стадии очистки, содержит цитохром саа3, но молярное соотношение гемов с и а в цитохроме на этом этапе снизилось до I против 2 на предыдущем этапе. Отделяющийся полипептид, как и ожидалось из данных рис.1, поглощает не только при 280нм, но и при 406нм, что

Рис.1. Электрофорезе 14,2% ДСН-ПААГ препаратов оксидазы ам_?-типа В.Иа1о^гап$ ГШ на разных этапах очистки. Гели окрашивались на гем (А) и белок (Б).

Дорожки 1,6: преокрашенные белки-маркеры, белки-маркеры.

Дорожки 2,7: СБЧ.

Дорожки 3,8: оксидаза после первой колонки ВЕАЕ-Тоуореаг1.

Дорожки 4,9: оксидаза после второй колонки ОЕАЕ-Тоуореаг!.

Дорожка 5 : цитохром с, отделенный от оксидазы сааз-типа на второй колонке ОЕАЕ-Тоуореаг1.

А. Окраска на гем. кДа 1 2 3 4 5

180,0- "'Л— Н

116,0- .-.'О -"*< 84,0- .

58,0— . ; 48,5-, . - .

36,526,6-

Б. Окраска на кДа 6 7 8

66,0— 45,036,0- «

■ %

29,0—' 24,0-};^

М1И> ш

ШЯт

■А':

20,1-

14,2-'*

свидетельствует о возможном содержании в нем гема. Спектр этой фракции показал присутствие спектрально чистого цитохрома с с максимумом поглощения в а-полосе при 552,5 нм. Добавление этого цихрома к полученной таким образом оксидазе саа3-типа ведет к восстановлению дыхательной активности препарата в присутствии ТМФД. Рассмотренные данные согласуются с результатами, описанными в разделе и (см. ниже, Рис.2). Как будет отмечено ниже, комплекс оксидазы саа3-типа, более интенсивно окрашивающийся на активность с помощью ТМФД, содержит третью субъединицу с мг - 20 кДа, что соответствует значению мг отделенного на пятой стадии очистки цитохрома с. Совокупность приведенных данных позволяет сделать заключение о важной роли цитохрома 5 в нормальном функционировании оксидазы саа3-пта.

Кроме того, полученные результаты свидетельствуют, что изучаемая оксидаза относится именно к саа3~, а не аау-типу, так как окрашивание на гем субъеданицы и оксидазы с мг-3? кДа означает присутствие в субъединице гема с (Рис.1, дорожки 2-4). С описанными данными согласуются сделанные ранее в нашей группе наблюдения о том, что после проведения гель-фильграции высокоочищенного препарата оксидазы саа3-типа в присутствии ряда детергентов и при повышенной ионной силе фермент все еще имеет в своем составе цитохром с в соотношении - 1:2 по отношению к цитохрому а, как и до гель-фильтрации (Скршшикова, канд.дисс., Москва, 1995). Совокупность всех данных показывает, что цитохром с входит в состав и субъединицы оксидазы.

Сравнительный анализ разностных спектров поглощения оксидаз саа3 типа в.ьа1о<1игапв гти и аа^-типа из сердца быка в присутствии пиридина показал, что молярный коэффициент экстинкции гема а для оксидазы саа3-типа составляет 20 против 13 для оксидазы из сердца быка.

XI. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ ОКСВДАЗ B.halodurans FTи И E.coli.

При проведении электрофореза в неденатурирующих условиях препаратов частично очищенных оксидаз B.halodurans ftu с последующей окраской гелей на оксидазную активность и на гем было обнаружено следующее. Оксидаза саа3-тша дает в описанных условиях 3 полосы, окрашивающиеся на активность и гем: одну медленно мигрирующую в геле зону, интенсивно окисляющую ТМФД, и две более подвижные зоны, слабее красящиеся на активность и гем (Рис.2А, дорожки 1,2). Последующий анализ субъединичного состава всех трех зон при помощи ДСН-электрофореза показал, что менее подвижная, но сильнее красящаяся на активность полоса содержит белковые субъединицы трех типов с молекулярными массами 51, 37 и 20 кДа (Рис.2Б, дорожка 2), тогда как две более подвижные, но менее активные полосы имеют в своем составе субъединицы только двух типов: 51 и 3? кДа (Рис.2Б, дорожки 3 и 4). Субъединица массой 20 кДа является цитохромом с, восстанавливающим активность фермента (см.раздел i).

Частично очищенная оксидаза ьь-типа в неденатурирующих услови-

Рис.2. Оксидаза caaj-mna B.halodurans А. Окраса Окраска на Окраска Б. Окраска на б

БТи на разных стадиях очистки.

А. Электрофорез в 4-9% ПААГ в не-денатурирующих условиях. Окраска на ТМФД-оксидазную активность (дорожки 2-5) и на гем (дорожки 1, 6, 7). »

Дорожки 1-3: Фракция белков, высоленных (70-75%) из экстракта мембран.

Дорожки 4-7: Очищенная оксидаза сааз-типа после колонки ТБК-ЗООО.

Б. Электрофорез в 14,2% ПААГ с ДСН. Окраска на белок. На врезке снизу показана электрофореграмма, аналогичная дорожке 2(А). Дорожка 1: белки-маркеры.

Дорожки 2-4: субъединичный состав оксидазы сса^-типа; второе направление для трех зон, показанных на врезке: верхней (дорожка 2) и двух нижних (дорожки 3,4).

на геи. активность 1 2 3 4 5

на гем. 6 7

f« «1

кДа 12 3

66,0— ¡м"» : 45,036,0 —'

29,0-i—

24.0— уу j

'№. v. i

20.1— 14Д — Ш>

JL

ях дает две полосы при окрашивании гелей на активность и гем (Рис. 3, дорожки 5-11). Более подвижная полоса сильнее окрашивается на активность (Рис.3, дорояски 5-8), но слабее - на гем по сравнению с менее подвижной полосой (Рис.3, дорожки 9-П). Характерной чертой является увеличение злектрофоретической подвижности медленно мигрирующей зоны при увеличении количества бежа, вносимого в лунку геля. Таким образом, при раститровке медленно мигрирующая полоса образует "лестницу" (Рис.3). При дальнейшей очистке препарата оксида-зы ьь-типа обнаруживается, что более подвижная и активная полоса содержит в своем составе цитохром с.

При сравнении степени и интенсивности окрашивания препаратов оксидаз в.ьа1обигапз гти после проведения неденатурирухвдего электрофореза следует отметить, что оксидаза саа^-типа окрашивается на активность значительно быстрее и интенсивнее оксидазы ьь-типа. Однако с течением времени (10-20 мин) интенсивность окрашивания оксидазы ьь-типа достигает уровня, сравнимого со степенью окрашивания для оксидазы саа^-типа. Это свидетельствует о более низком значении V для ТМФД у оксидазы ьь-типа по сравнению с оксидазой саа7-ти-

шях

па. Отмеченный факт согласуется с опубликованными данными, согласно

А. Окраски на активность.

Рис.3. Оксидаза ¿й-типа В.каШи-гат Пи на разных стадиях очистки. Электрофорез в неденатури-рующих условиях в 4-9% ПААГ. Окраска на ТМФД-оксидазную активность (А) и на гем (Б).

Дорожки 1-4: экстракт СБЧ из клеток в стационарной фазе роста.

Дорожки 5-11: Фракция белков, высоленных (50-55%) из экстракта мембран.

Б. Окраска на гем. 9 10 И

♦ I

которым значение v „ для ТМФД у оксидаз саа,- и ьь-типа составля-

гоох о

ет, соответственно, 5,0 И 0,59 НМОЛЬ О^МИН.МГ белка (Muntyan and SJcripnikova, 1993).

Для сравнения в качестве контрольных использовали хорошо изученные оксидазы Ьо- и м-типов е.со л: мутантный штамм g0102 не содержит оксидазы ьо-типа, goio3 не содержит оксидазы м-типа. При изучении данных штаммов с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях обнаружилось, что оксидаза £>о-типа значительно быстрее и интенсивнее окрашивается на активность, чем оксидаза м-типа (Рис. 4А) при сравнимой окраске на гем (см. Рис.4Б). Проверка целых клеток, а также мембранных частиц из клеток мутантных штаммов е.соИ g0104, g0102 (содержат оксидазу только м-типа), g0103 (содержит оксидазу только ьо-типа) и gr70n (фенотип дикого типа) на способность окислять ТМФД подтвердила большую эффективность оксидазы м-типа по сравнению с оксидазой м-типа при окислении ТМФД. Таким образом, наблюдается попарное сходство в способности окислять ТМФД у оксидаз саа3-типа B.halodurans FTO И Ьо-ТИПа E.coli, С ОДНОЙ СТОРОНЫ, и оксидаз ьь-типа и м-тша, соответственно,- с другой стороны.

А. Окраска на активность. Окраска па гем,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Рис.4. Идентификация оксидаз в мембранах E.coli. Электрофорез

в неденатурируклцих условиях в ;

4-9% ПААГ.

Окраска на активность (А) и " гем (Б).

Дорожки 1-2, 6-8: мембраны , E.coli GO 103.

Дорожки 3-5. 9-11: мембраны E.coli GO 102.

Ш?

Представленные результаты показывают, что ТМФД-оксидазная активность изолированных препаратов оксидэз саа3~типа B.halodurans ftu и ьо-типа E.coii выше, чем, соответственно, оксидазы ьъ-типа B.halodurans ftu и оксидазы bd-типа E.coii. Интересно, что и по чувствительности к дыхательному яду цианиду рассматриваемые оксидазы делятся на те же пары: более активные в отношении окисления ТМФД оказываются и более чувствительными к цианиду.

Сравнительный электрофоретический анализ оксидаз позволил увидеть, что оксидазы B.halodurans ftu в отличие от оксидаз E.coii образуют суперкомплексы с цитохромами с. Это означает, что при очистке необходимо учитывать сложность бациллярных дыхательных комплексов для получения активных препаратов ферментов.

iii. АНАЛИЗ ГЕМОВОГО СОСТАВА ОКСИДАЗ B.halodurans ftu.

Исследование экстрактов суббактериальных частиц B.halodurans ftu, полученных из культур на разных стадиях роста, показало наличие в мембранах бактерии гемов а, в и с (Рис.5). Мембранные препараты отличались соотношением содержащихся гемов див: СБЧ, полученные из клеток на ранних стадиях роста, содержали - в з раза больше тема а, чем СБЧ, полученные из клеток в стационарной фазе роста, что согласуется с данными по преобладанию оксидаз саа^-типа B.halodurans ftu В экспоненциальной фазе роста культуры (Muntyan and skripnikova, 1993). Из данных Рис.5 (А, Б) следует, что экстракты СБЧ B.halodurans FTU не содержат гемов о и d. Анализ гемово-го состава препарата очищенной оксидазы ьь-типа, ранее отнесенной к о-типу на основании спектральных данных, также показал отсутствие у оксидазы гемов о и d и наличие гемов вис. Исходя из вышеизложенного, оксидаза B.halodurans ftu, ранее описанная как о-типа, была отнесена к ьь-типу. Следует отметить, что при анализе экстрактов

»0,00 г

аА >0,007

®

дЛ|> 0,003 © ' | Л Л

ЛАрО.ОИ © ] ^ , Л

ДА|» 0,021 ® У А

®! ] В 1°

дА1«0.0 1Г ® В

Л А 0,002 ____--""* Iе

10 20 30 40 50

Вреш (МИН)

90 § си

70 И

60 | ш

зо |

Рис.5. Профили элюшш гемов при ВЭЖХ в обращенных фазах. Поглощение контролировали при 406 им. Скорость элюции 1мл/мин. Пунктирная линия показывает градиент концентрации (30-100%) ацетонитрила в воде, содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты. А, В, О, О и С указывают пики элюции стандартных гемов А, В, О, О и С, соответственно. Гемы экстрагировались из мембран ВМЫигапх ИИ в экспоненциальной (А) и стационарной (Б) фазах роста, из очищенных оксидаз ВЫШигапх БТи ¿Ь-типа (В) и сааз-типа (Г), из очищенной оксидазы ааутта сердца быка (Д), из мембран Е.соИ СОЮЗ (Е) и С0104 (Ж) и из цигохрома с сердца лошади (3).

образцов, содержащих цитохром с, обнаруживается присутствие продукта гидролиза тема с, хотя гем с связан с белком ковалентно. Обнаруживаемые количества продукта гидролиза гема с очень малы по сравнению с количеством материала, из которого происходит экстракция, что свидетельствует о том, что лишь небольшая часть гема с отщепляется от белка, вероятно, вследствие медленного гидролиза соляной кислотой.

IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ 1ЩИ В ОКСИДАЗАХ B.haiodurans FTU^

Важным отличительным свойством нздсемейства протонперенося-щих оксидаз является наличие в их молекулах ионов меда. В ряде исследований (Iwata et al.,1995; Ishikawa et al., 1995, 1996), было показано, что оксидазы надсемейства во всех случаях содержат I ион меди в составе биядерного гем-медного центра (Cus); еще 2 иона меди, образующих бимедный центр в субъединице и (сиА), являются необязательным компонентом ферментов. Они обнаружены только в цито-хром-с-оксидазах, но не в хинолоксидазах. У оксидазы м-типа е. coli, не способной к трансмембранному переносу протонов, было обнаружено отсутствие конов меда (Trumpower et ai., 1994). Изложенные факты послужили предпосылкой к исследованию содержания меди в препаратах очвденных оксидаз B.haiodurans ftu. Результаты представлены в табл.2.

Согласно приведенным данным, оксидаза саа3-тша B.haiodurans ftu содержит, как и оксидаза aa^-типа из сердца быка, около 3 атомов меди, тогда как оксидаза ьь-тша B.haiodurans ftu содержит суб-стехиометрические количества меди. Полученные результаты дают дополнительное свидетельство в пользу предположения о том, что оксидаза саа,,-тйпз B.haiodurans ftu принадлежит к надсемейству оксидаз с каталитическим гем-медным биядерным центром, тогда как фер-

мент ьь~типа обладает сходством с оксидазой ьа-типа е.соИ и не содержит атомов меди.

Табл.2. Содержание меди в различных оксидазах, определенное методом атомно-змиссионной спектроскопии (с индуктивно связанной плазмой).

Оксидаза Содержание гема, нмоль/мг белка Медь. I моль/моль фермента!

ааз-типа сердца быка 9.4' 2.7 |

м-типа е. сои ! 5.8** ^ 0.2 |

сааз~ТИПа В.Ьа1оФлгапз ртц: |

частично очищенный фермент (после высаливания сульфатом аммония) 4.1* 3.3

очищенный фермент 19* 2.7

ЬЬ-ТШа В.ЪаЪойигапэ РТ1Г:

частично очищенный фермент (после высаливания сульфатом аммония) 5"* 0.4

очищенный фермент 15*** 5 0.2 |

Определялось содержание гемов а о, <1 <••) и £>(•••). Содержание фермента оценивалось, исходя из предположения, что два моля тема а ПРИСУТСТВУЮТ В ОКСИДазаХ саа -ТШа Сердца быка И В.Ьагойигапэ РТО, один моль гема а - в оксидазё м-типа е.сои и три моля тема ь - в оксидазе ьъ-типа в.Па1ойигапз га.

у- ОПРЕДЕЛЕНИЕ к-КОНЦЕШХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ СУБЪЕДШИЦ ОКСИДАЗЫ саа^-ТИПА В.Ъа1ойигапз РТЦ-

В сотрудничестве с В.А.Гринкевячем (биол. ф-т МГУ) были определены ы-концевые аминокислотные последовательности двух субъединиц оксидазы саа3-типа в.ьа1ойигапз гти: субъединицы I (Мг=51кДа) и субъединицы и (мг=37кДа). Результаты представлены в табл.3.

Как видно из приведенных данных, определенные ы-концевые аминокислотные последовательности обеих субъединиц оксидазы саа3-типа в.ьа1ойигапэ гти имеют большую степень гомологии с соответствующими

последовательностями оксидазы саа3-типа Bacillus firmus 0f4. Однако, по целому ряду признаков (морфологических, физиологических, биохимических) эти два микроорганизма различаются, что позволяет сделать заключение о принадлежности бацилл к разным видам. Геномная характеристика штамма и результаты ДНК-ДНК гибридизации позволили определить его как Bacillus halodurans FTU. О ВЫСОКОЙ степени ГОМОЛОГИИ оксидаз саа3-пта по N-концевым фрагментам (по 2 замены в субъедда-ницах i и и на участке из 30 аминокислотных остатков) сообщалось недавно ДЛЯ двух штаммов Bacillus stearothermophilus К1041 И Bacillus PS3 (Kusano et al., 1996).

Табл.з.ы-концевые аминокислотные последовательности субъединиц оксидазы саа -типа в.halodurans ftu (прямое определение аминокислотной последовательности), оксидаз некоторых представителей рода Bacillus и других бактерий (предсказанные из последовательностей нуклеотидов). Стрелкой указано место, по которому происходит отщепление лидерного пептида.

Субъедшгаца I

.halodurans FTU -ATQKQEKSVI W/D DWLTTVDJOOKIAIMYbX&G-

acillus firmus OF4 HATQKQEKSVI W DWbTrVDHKKIAXMYLIAG-

acillus sp. PS3 HSTIARKKGVGAVb H DXLTTVDHKKIAHLYLISG-

acillus sublilis MbNAIiTEKRTRGSML W DYIiTTVDHKKIAILyLVAG-

kermus thermophilus MAITAKPKAGVWAVIi W DliLTTVDHXKIGLMYTATA-

aracoccus denitrijicans MADAAVHGHGDHHDTRGFF T RWFMSTHHKDIGILYLFTA-

acillus sublilis Qox LTYFKKWKHLW s EWITTVDHXKLGIMYIISA-

Субъединица II

-CLGEENLTÄbDPKGPQÄQWIYDNMILSIХХМ-HKbHKTASRrLPLSFLTLFLTGCLGBENXTALDPKGPQÄQWIYDNMXbSIIVM-KNKGLCNWRLFSLFGHMAbLrAGC-GKPFI.STIKJPAGEVADMQYSLMLr.STSIM-KVKEWRLILLXiALVPIJjLSGC-GKPFXiSTLKPAGEVADKQ'JfDLTVXiSTLIM-

. halodurans FTU acillus firmus OF4 acillus sp. PS3 acillus sublilis

Кроме того, по N-концевым аминокислотным последовательностям две большие субъединицы оксидазы саад-типа B.halodurans FTU имеют большую степень гомологии с субъединицами i и и ряда других; бактериальных цитохром-с-оксидаз (саа3- и аа3-тила), принадлекащих к надсемейству ферментов с гем-медным биядерным центром: Bacillus PS3, Bacillus subtilis, а ТЭКЖЗ Thermus thermophilus И Paracoccus denitrificans. Меньшая степень гомологии наблюдается с хинолоксида-зами того же надсемейства: аа^-типа из B.subtnis, ъа3-типа p.deni-trificans, bo3~типа E.coli.

Большая степень гомологии N-концевых аминокислотных последовательностей Обеих субъединиц оксидазы саа^-ТИПа B.halodurans FTU С соответствующими последовательностями ряда протонпереносящих бактериальных оксидаз с гем-медным биядерным центром позволила предположить принадлежность указанной оксидазы к надсемейству протонпереносящих ферментов.

VI. ИЗУЧЕНИЕ ИОНТРАНСПОРТНЫХ СВОЙСТВ ОКСИДАЗ B.halodurans FTU.

На первом этапе изучение ионтранспортных СВОЙСТВ оксидаз B.halodurans FTU проводили на целых клетках методом кислородного пульса. Оксидазную реакцию запускали добавкой кислорода (раствор kci) к суспензии клеток, находящихся в условиях анаэробиоза. При этом наблюдалось закислевде внешней среды. В опытах использовали клетки на разных стадиях ростового цикла, так, чтобы преобладала одна из терминальных оксидаз. Характерные кривые ответов для клеток логарифмической фазы роста (доминирует оксидаза саа3-типа) и клеток стационарной фазы роста (оксидаза саа^-типа практически отсутствует, преобладает фермент ъь-типа) представлены на Рис.6.

Значения соотношений н+/о для каждого из указанных случаев представлены в табл.4. Как видно из приведенных результатов, для

Рис.6. Характерные кривые изменения рн в анаэробной суспензии клеток B.haiodurans ftu в ответ на добавку кислорода (указана стрелкой). Каждая добавка составляет 2,85 нгат о. А. Изменение рн при функционировании полной клеточной дыхательной цепи. Б. Изменение рн при работе терминального участка бактериальной дыхательной цепи. Верхние рисунки относятся к клеткам логарифмической фазы роста (преобладает оксвдаза саа -типа), нижние рисунки относятся к клеткам стационарной фазы роста (преобладает оксидаза ¿ь-типа). Состав среда измерения: 0,25 мМ трицин-кон, 140 мМ KCl, 50 мМ кscn, 0,5 мкМ валиномицина; Б. + 5 мкМ hoqno, Ю мМ аскорбата, 50 midi ТМФД.

клеток с преимущественным содержанием оксидэзы саа3-тша соотношение н+/о как для полной дыхательной цепи, так и для ее терминального участка вдвое больше, чем аналогичные значения для клеток с преобладанием оксидазы ¿ь-ша. в присутствии 2 мкМ ссср на терминальном участке дыхательной цепи в ответ на добавку ог не наблюдалось ни закисления, ни защелачивания среды клетками. Из этого наблюдения

Табл.4. Соотношения н+/о для клеток в.ьа1оаигапз гти с преобладанием одной из оксидаз, измеренные с помощью метода кислородного пульса.

I Фаза роста B.haiodurans ftu Соотношение н /о

на целой ц на терминальном дыхательной цепи | участке II дыхательной цепи

Логарифмическая фаза 1 8,5 I 4,26

Стационарная фаза 4,3 | 2,13

следовало, что при расчете значений соотношения н+/о для терминального участка дыхательной цепи с использованием в качестве субстрата системы ТМФД-аскорбат следует вносить поправку в количество протонов, вызывающих закисление внешней среды. Из полученных значений соотношения н+/о для терминального участка дыхательной цепи вычитали 2, что соответствует двум протонам, образующимся в ходе химических реакций окисления аскорбата и не являющимся векторными (soné et ai., 19 87). Значения н+/о при этом составили соответственно 2,26 и 0,13 для клеток с преимущественным содержанием оксидазы саа3- и ьь-типа. Соответствующие значения н+/ё составили 1,13 и 0,06. Для ци-тохром-с-оксидаз, являющихся векторными переносчиками н+, соотношение н+/ё равно I (wiJcstrom, 1984). Таким образом, данные, полученные на целых клетках, свидетельствуют в пользу того, что оксидаза саа^—типа является истинной протонной помпой, тогда как фермент ьь-тапа относится к непротонным оксидазам. Способность клеток B.haio-durans ftü к выбросу н+ на терминальном участке дыхательной цепи в присутствии ТМФД и аскорбата была исследована на чувствительность к цианиду. На клетках экспоненциальной фазы роста выброс н+ оказался на порядок чувствительнее (к..- 2-5 мкМ) к ингибитору, чем на клетках стационарной фазы (kí- 25-35 мкМ). Эти результаты находятся в Хорошем соответствии С даННЫМИ КОСТЫрКО И СОЭВТ. (Kostyrko et al., 1991). Б отличие от наших экспериментов, где выброс н+ измеряется прямым методом, в цитируемой работе закисление от ТМФД и аскорбата внутри вывернутых суббактериальных пузырьков регистрировали по тушению флуоресценции акридинового оранжевого. При этом цианид в концентрации 1-2 мкМ снижал закисление наполовину, а в концентрации 10 мкМ предотвращал эффект.

Интересно, что в наших экспериментах на клетках стационарной

фазы роста закисление внешней среды, наблюдаемое на терминальном участке (Рис.бБ, снизу) в результате окисления аскорбата оксидазой ьь-типа, не ингибировался цианидом в пределах концентраций 1-15 мкМ. В этом случае полумаксшлальное ингибирование вызывает цианид в концентрациях 30-40 мкМ. В работе Костырко и соавг. накопление ыа+ вывернутыми суббактериальными пузырьками в ответ на добавление ТМФД и аскорбата было не чувствительно к 10-20 мкМ цианида и ингибирова-лось наполовину несколькими десятками мкМ цианида.

Результаты, полученные в экспериментах по ионному транспорту на терминальном участке дыхательной цепи в.Ьа1ойигапз гти, согласуются с данными для двух терминальных оксидаз, обнаруженных у этой бактерии. Дыхательная активность оксидазы саал-тина ингибируется наполовину цианидом в концентрации -2 мкМ, как в СБЧ, так и в выделенном и очищенном состоянии (результаты получены в ходе настоящего исследования). Для второй оксидазы ьь-типа, как в мембранах, так и в выделенном состоянии, аналогичный эффект вызывает цианид в концентрации 25-30 мкМ.

Анализируя наши данные и данные Костырко и соавт., можно заключить, что в клетках в. Ьа1 оЛл-аля ити на терминальном участке дыхательной цепи работает истинный протонный насос, в роли которого выступает оксидаза саа3-тш1а. Оксидаза ьь-типа не переносит протоны через мембрану. Возможно, в определенных условиях выращивания она осуществляет выброс ионов Ыа+ из клеток.

Для исследования ионгранспортных свойств оксидаз на уровне протеолипосом необходимо было подобрать непронякающие субстраты для оксидаз. Как уже отмечалось выше (см. разделы I и хх), в оптимальном функционировании оксидазы саа^-ТИПа В.ЬааоЛп-апэ кти важную роль играет мембранный цитохром с. На основании гомологии ы-конце-

вых аминокислотных последовательностей субъединиц изучаемой оксида-зы и ряда других цитохром-с-оксидаз можно было предположить, что в качестве донора электронов может служить и водорастворимый цитохром

с В.Ъа1ойигапэ РТи, ЛИбО ЦИТОХрОМЫ с ИЗ ДРУГИХ ОРГЭНИЗМОВ. ДЛЯ Проверки предположения использовали цитохромы с из дрожжей и сердца лошади, помимо водорастворимого цитохрома с в.Ьа1оаигапя гти. рн-Зависимости активности оксидазы саа^-типа приведены на Рис.7. Значения активностей приведены в табл.5. Для дальнейшей работы был выбран цитохром с сердца лошади, ввиду его большей доступности (коммерческий препарат).

Р"

РИС.7. рН-заВИСИМОСТИ ОКИСЛеНИЯ раСТВОрИМЫХ ЦИТОХрОМОВ с В.Ьа1о&I-гапя Рти (О), дрожжей (О) И лошади (Д) оксидазой саа -типа В.ЛаХо-йигапз РТЫ.

Табл.5. Окисление растворимых цитохромов с оксидазой саа -типа

В.ЬаХойцгапя рти.

Цитохром с Активность оксидазы,

моль гема с

мин.моль гема а

В.Ъа1о(1игапз РТЦ 101,5

СапсИ(1а Йгсхге! ! 50,3

сердце лошади 37,8

* Реакцию начинали добавкой цитохрома с, восстановленного 20 мМ аскорбатом, до конечной концентрации 25 мкМ.

шводы.

1. Установлен гемовый состав двух ранее обнаруженных оксидаз в.Ьа1обигапг гти, в соответствии с которым одна оксидаза содержит темы А и С и отнесена к саа3-тшу, а вторая оксидаза содержит темы В и С и отнесена к ьь-типу.

2. Показано, что в качестве простетических групп, кроме гемов, в оксидазах саа3-типа выступают ионы меди, соотношение которых составляет 3 иона на молекулу фермента. Оксидаза ьь-тша содержит субстехиометрические количества ионов меди.

3. По первичной структуре »-концевых доменов субъединиц фермента, а также по составу простетических групп оксидаза саа3-типа отнесена к надсемейству оксидаз с гем-медным биядерным центром.

4. Показано, что оксидаза саз3-типа является цитохром-с-окси-дазой.

5. На целых клетках в.ьагойигапз рти в условиях преимущественного содержания оксидазы саа3-типа показано, что соотношение выбрасываемых ферментом прогонов к электрону равно I, что позволяет считать оксидазу саа3-типа истинной протонной помпой.

6. В условиях преимущественного синтеза оксидазы ьь-типа на целых клетках а.Ла1осГигапя рти соотношение выбрасываемых протонов к электрону на терминальном участке дыхательной цепи близко к 0. Поэтому оксидаза ьь-тша отнесена к ферментам непротонного типа.

список: ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Muntyan M.S., Skripnikova E.V., Ostijan V.S. "Two types of cytochrome oxidases in alkalotolerant bacterium Bacillus FTU." //EBEC Short Reports, Helsinki, 1992, V.7, p.69.

2. Muntyan M.S., Bloch D.A., Ustiyan V.S., Drachev L.A. "Kinetics of CO binding to H -motive oxidases of the caa^-type from Bacillus FTU and of the o-type from Escherichia coli." //FEBS Lett., 1993, v.327, N-3, p.351-354.

3. Avetisyan A.V., Bloch D.A., Bogachev A.V., Drachev L.A., Muntyan M.S., Murtazina R.A., Skulachev V.P., Ustiyan V.S. "The proton-motive and sodium-motive terminal oxidases of Bacillus FTU and Escherichia coli. " //Abstracts, IUPAB Sat.Meeting "Major electron transport complexes in photosynthesis and respiration", Gmunden (Austria), 1993, p.9.

4. Аветисян А.В., Ацаркина H.В., БогачевА.В., Белогрудов Г.И., Гринкевич В.А., Муртазина Р.А., Мунтян М.С., Скрипникова Е.В., Скулачев В.П., Устиян B.C. "Сравнительное исследование протонных и натриевых генераторов трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов ыа+ и н+ в бактериях." //Тезисы докладов i Всероссийской конференции "Белковая инженерия" (раздел "Новейшие методы биоинженерии"), Москва, 1994, стр.4.

5. Muntyan M.S., Ustiyan V.S., Viryasov M.B., Skulachev V.P. "Oxidases of the bb- and caa^-types in Bacillus sp. FTU." //Bio-chem.Biophys.Res.Comm., 1995, v.207, N-l, pp.55-61.

6. Аветисян А. В., Ацаркина H.B., БогачевА.В., Белогрудов Г. И., Гринкевич В.А., Муртазина Р.А., Мунтян М.С., Скрипникова Е.В., Скулачев В.П., Устиян B.C. "Сравнительное исследование протонных и натриевых генераторов трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов Na+ и н+ в бактериях." //Тезисы докладов и Всероссийской конференции "Белковая инженерия" (раздел "Новейшие методы Оиоинженерии"), Москва, 1995, стр.5.

7. Muntyan M.S., Ustiyan V.S., Bloch D.A., Skulachev V.P. "Comparative study of the alternative terminal oxidases." //EBEC Short Reports, Louvain-la-Neuve (Belgium), 1996, V.9, p.101.

8.' M.C.Мунтян, Д.А.Блох, В.С.Устиян, "Два семейства терминальных оксидаз и их роль в энергетике микроорганизмов" (1996), в кн. Российская паут. Выстоять и возродиться., Москва, изд. Наука -Физматлит, (в печати).