Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение терминальных оксидаз алкалотолерантной бактерии Bacillus sp. FTU

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение терминальных оксидаз алкалотолерантной бактерии Bacillus sp. FTU"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ Г В О Л ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Р ' • им. М.В.ЛОМОНОСОВА

^ К'ии ■.. -

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.23

СКРШШИКОВА ЕЛЕНА ВАДИМОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ АЛКАЛОТОЛЕРАНТНОИ БАКТЕРИИ Bacillus sp. ftu

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. Ы.В.Ломоносова.

Научные руководители: академик РАН,

профессор В.П.Скулачев, к.б.н. М.С.Мунтян.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

доцент А.И.Нетрусов кандидат биологических наук В.Ю.Арцатбанов

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им.

М.М.Шемякина и В.А.Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится "25" декабря 1995 года в 15 часов 30 минут на заседании специализированного ученого совета Д 053.05.32. при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу:

119899 Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Мтуальносгь_проблемы. В последние два десятилетия убедительно доказана справедливость хемиоосмотической теории сопряжения (Mitchell, i96i, 1Э66). Согласно этой теории, энергия, освобождаемая дыхательной цепью митохондрий и хлоропластов (эукариот) и ряда бактерий (прокариот), используется для генерации разности электрохимических потенциалов ионов водорода (Д(1н+) на сопряг ащей мембране. Информация о том, что у некоторых представителей прокариот в отличие от эукариот имеются другие виды сопряжения энергии стала регулярно поступать с середины 80-х годов. Кроме обеспечения энергией за счет протонного сопряжения (работа протонных насосов), у ряда бактерий обнаружены варианты использования непротонного сопряжения (работа редокс петель и натриевых насосов) (skuiachev, i99i, 1994). Как правило, переключение бактериальной энергетики с протонной на натриевую происходит в условиях общего снижения дЛн+ на мембране (щелочные условия роста, действие разобщителей и некоторых ядов). Так, например, морские алкалофильше бактерии рода vibrio обладают генераторами Na+-потенциала в первом пункте сопряжения дыхательной цепи (Unemoto et al. , 1990). Ряд анаэробных бактерий, Klebsiella pneumoniae, Propionigenum modestum (Diinroth, 1987) обладают

ддыа+-генерирующими декарбоксилазами. Также сообщалось о выделении Na^-АТФаз из мембран этих бактерий, так же как и для лсесо-bacterium woodii (Reidliger and Muller, 1994, Forster et al., 1995) И Streptococcus faecalis (Kakinuma and Igarashi, 1980).

Кроме генераторов Na*-потенциала, в мембранах бактерий показано наличие потребителей энергии AiaNa+. У ряда алкалофильных бацилл

(Bacillus YN-1, Bacillus alkalophilus, Bacillus firmus RAB) В

том числе и у объекта настоящей работы алкало- и галотолерантной

Bacillus sp. ftu показано наличие Na+-M0T0pa, управляющего работой жгутика (Bogachev et al., 1993). ÄwNa+ ИСПОЛЬЗуетсЯ И при транспорте в бактериальную клетку ряда питательных веществ: Сахаров И аминокислот (Dibrov, 1991, Kakinuma and Unemoto, 1985) .

Недавно было показано, что при общем снижении AüNa+ на мембранах е. сои и бактерии Bacillus sp. ftu терминальный участок дыхательной цепи способен к транспорту ионов Na+ (Kostyrko et ai., 1991). Транспорт ионов Na+ ингибировался на порядок большими концентрациями цианида, чем транспорт протонов. До настоящего времени не было известно, какие терминальные оксидазы содержатся в мембранах Bacillus sp. ftu, и какие из них участвуют в транспорте Na+ и протонов. Сравнительных данных о респираторных мутантах е. сои, терминальный участок дыхательной цепи которых, как было показано (Avetisyan et al., 1991, 1992), также способен к транспорту Na+, и бактерий из рода Bacillus, до настоящего времени в литературе не было.

Цель работы - характеристика мембран бактерии Bacillus sp. ftu по цитохромному, составу, поиск терминальных оксидаз, отличающихся на порядок по чувствительности к цианиду, разработка методов выделения и очистки терминальных оксидаз и изучения индивидуальных свойств этих ферментов, а также сравнение с оксидазами других бактерий, имеющих функциональную гомологию. Новизна работы. В настоящей работе изучено соотношение цитохро-мов мембран Bacillus sp. ftu при различных условиях роста. Выявлены две терминальные оксидазы (саа3~ и ьь-типа,отличающиеся по чувствительности к цианиду на порядок), определены их кинетические характеристики, субъединичный состав. По ряду признаков проведено сравнение двух оксидаз Bacillus sp. ftu с функционально аналогичными терминальными оксидазами е. сои. Разработаны методики обогащения мембран по оксидазе £Ь-типа и очистки терминаль-

ных оксидаз дикого штамма Bacillus sp. ftu. Оксидаза саа3~ тша получена в гомогенном состоянии. Для двух субъединиц этой окси-дазы определена первичная структура n-концевых фрагментов. Практическое значение. Данные по динамике нарастания в мембранах бактерии оксидаз разного типа позволяют оптимизировать условия роста для препаративного выделения каждого фермента. Примененный в настоящей работе подход к исследованию множественных терминальных оксидаз и разработанный метод их выделения и очистки из мембран Bacillus sp. ftu могут быть использованы при исследовании терминальных оксидаз других бактерий. Установленные в работе аминокислотные последовательности n-концевых фрагментов оксидазы caa^-типа позволяют, во-первых, определить группу родственных ферментов (протон-переносящие оксидазы), и, во-вторых, уточнить систематическое положение штамма Bacillus sp. ftu. Кроме того информация о структуре n-концевых пептидов может быть использована для синтеза олигонуклеотидных зондов и установления структуры гена оксидазы саа3.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на теоретическом семинаре лаборатории биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова ( Москва, 1991, 1992, 1993 ), на 15 Международном биохимическом конгрессе (Иерусалим, 1991), на Европейской биоэнергетической конференции (Хельсинки, 1992) и на I и II Всероссийских конференциях "Белковая инженерия" (Москва, 1994 и 1995). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы и изложена на страницах машинописного текста, включая таблиц, рисунков, фотографии. Список цитируемой литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНИЯ.

Культивирование бактерий. В работе использовали культуру алкало- и галотолерантной бактерии Bacillus sp. ftu, выделенную в НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ (Верховская и др., 1989), и мутантные штаммы Escherichia coli ( G0103 - не содержащий цито-хрома d, и g0104 - не содержащий цитохрома о ), предоставленные проф. Теннисом (США). Для культивирования Bacillus sp. ftu использовали минеральную среду следующего состава: 0,5 M Nací, 10 мМ KCl, 5 мМ Mgso4, 15 мМ (nh2)so4, I мМ kh2po4, 0,01 мМ FeS04, 0,1 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-нс1 (pH 8,6) с добавлением сукцината в качестве источника углерода и энергии ( Верховская и др., 1989). Штаммы е. coli растили на стандартной среде lb. Бактерии обоих видов выращивали аэробно при 37°С.

Суббактериальные мембранные частицы получали по методике, описанной Семейкиной И соавторами (Semeykina et al., 1989) В нашей модификации. Осажденные промытые клетки Bacillus sp. ftu использовали для получения сферопластов с помощью обработки лизоцимом. Для разрушения клеток использовали охлавденную до 4°С ячейку пресса Френча цри давлении 1070 атм (16000 psi). После удаления обломков клеток мембранные фрагменты осаждали центрифугированием при 200 000g и 4°С в течение 2 часов. Полученные частицы хранили в жидком азоте в среде Д, содержащей 25% глицерин. Среда Д содержала 0,1 M k2so4, 10 мМ Mgso4, 2,5 мМ Na2so4, 0,5 мМ ЭДТА, трицин-кон 50 мМ (pH 8,2).

Ферментные дыхательные комплексы Bacillus, sp ftu экстрагировали 30 мМ октилглюкозидом при 30°С в среде Д.

Дробное высаливание экстрагированных мембранных белков проводили сульфатом аммония.

Активные фракции хроматографировали на колонках с deae-

Sephacel ("Sigma") И DEAE-Toyopearl ("Toyo-Soda").

Оксидазаую активность мембран и препаратов оксидаз измеряли с помощью стандартного платинового электрода Кларка в ячейке закрытого типа на полярографе LP7e при температуре 25°С в системе содержащей 2,5 мМ ТМФД и 10 мМ аскорбат в среде Д.

Цитохромы определяли спектральными методами при помощи спектрофотометра Hitachi и-3400.

Электрофорез проводили ГО методу ЛЭММЛИ (Laemmly, 1970).

N-концевые аминокислотные последовательности определяли по методу Эдмана с модификациями (Гринкевич и др., 1979).

Концентрацию белка определяли по методу Лоури в модификации Марквелла (Markwell et al., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение цитохромов, содержащихся в__мембранах__Bacillus

sp. FTu. Спектральными методами показано, что при выращивании культуры в колбах в стандартных условиях до конца экспоненциальной фазы роста в мембранах Bacillus sp. FTU содержатся цитохромы а, ь, с и о (Рис. I А-Е). Однако, хроматографический анализ не подтвердил наличия В мембранах цитохрома о (Myntyan et al., 1995), ИЗ чего сделан ВЫВОД, ЧТО В мембранах Bacillus sp. FTU присутствует(ют) С0-связывавдий(ие) цитохром(ы) ь, спектрально сходные с цитохромом о.

С целью выяснения возможности обогащения бактериальных мембран цитохромами какого-либо типа (или индукции других цитохромов) при культивировании варьировали некоторые параметры внешних условий: время выращивания, аэрацию, или вносили в ростовую среду разобщители или цианид. Из разностных (восстановление минус окисление) спектров поглощения и СО-разностных спектров поглощения препаратов МеираННЫХ ЧаСТИЦ Bacillus sp. FTU (Рис. I, табл.1) видно,что на начальных стадиях роста культуры (когда содержание растворенного в среде кислорода велико (Рис.2) ) в мем-

©J

Л, HM

А а.

Рис.1. Разностше спектры поглощения (воостановление минус окисление) ( А-В ) и СО-разностные спектры поглощения ( Г-Е ) мембранных частиц из клетов Bacillus sp. ftu, отобранных в логарифмической фазе ( А,Г ), в конце логарифмической фазы ( Б,Д ) и в стационарной фазе ( В,Е ). Концентрация белка составляла 1,3 мг/мл для ( А,Г,Д,Е ) и 0,8 мг/мл для ( Б,В ).

*я»

Рис.2. Кривые роста культуры Bacillus sp. ftu, выращенной в ферментере при стандартных"!' условиях в линейных (D и полулогарифмических (2) координатах . (з)-концентрация растворенного в ростовой среде кислорода.

~I

25

Врет, чаш

бранах Bacillus sp. ftu количественно преобладают цитохромы а, а количество СО-связывающих цитохромов ь крайне мало. В конце ростового цикла (когда значительно возросшая биомасса активно потребляет растворенный кислород) соотношение цитохромов а и СО-

связывающих цитохромов ь меняется на противоположное. Подобную картину можно наблюдать у е. сои, для которой известно, что в условиях интенсивной аэрации в ее мембранах доминирует один из двух имеющихся типов оксидазных комплексов, а именно комплекс цитохрома о, а при низком уровне кислорода в среде - комплекс цитохрома d (ingledew and Poole, 1984).

При переходе культуры Bacillus sp. FTU в позднюю логарифмическую и стационарную фазы роста наблюдается увеличение общего содержания цитохромов в мембранах примерно на 30%. Аналогичные данные получены ДЛЯ термофильной бактерии Bacillus PS3 (Sone et ai., 1983), у которой в сходных условиях происходит двукратное

Таблица 1. Зависимость содержания цитохромов и скорости дыхания мембран Bacillus sp. FTU от фазы роста бактериальной культуры.

Удельное содержание цитохромов (нмольХмг белка) Соотношение цитохромов V max

а (Ь-ю') О* ~ С

Положение максимумов (нм) 601-620 560-575 415-432 533-537 а:(Ь+о):с

Логарифмическая фаза роста 0,37 1,38 2,2 1:3,7:5,9 5.0 мкмоль О, мин-мг белка 13.9 мкмольО, мин-нмоль гема а

Конец логарифмической фазы роста 0,2 2.2 0,17 2,5 1:11,0:12,5 -

Стациронарная фаза роста 0,03 1,9 0,25 2,7 1:63,3:90,0 0.59 мкмольО-мин-мг белка

2.4 мкмольО, мин-нмоль гема о*

" _ " ■ не определяли

*) Описанные нами ранее "цитохромы о" ( по своим спектральным свойствам и способности связывать СО), в действительности являются СО - связывающими цитохромами Ъ-тапа, поскольку показано, что геи О не входит а состав мембран Bacillus sp. FTU ( Muntyan et. (995). ") Содержание цитохромов (a+aj принято за 1.

увеличение содержания цитохромов. Однако, присутствие разобщителя или цианида в растущей культуре Bacillus sp. ftu вызывает лишь незначительные изменения общего содержания цитохромов.

Во всех случаях культивирования Bacillus sp. ftu, включая выход культуры в глубокий стационар (рост 72 часа), в мембранах бактерии не было обнаружено цитохромов, отличных от описанных раньше, в частности цитохрома d, хотя в литературе есть данные об индукции у вас. firmus of4 оксидазы d-типа в дополнение к двум имеющимся оксидазам саа^- И о-типа (Hicks et al., 1992) .

Сравнительный анализ показывает, что по суммарному содержанию цитохромов а, ъ и с бактерия Bacillus sp. ftu занимает промежуточное положение между нейтрофильными и алкалофильными бактериями (0,6-1 нмоль/мг белка для нейтрофильных Bacillus subti-lis, Bacillus cereus и е. coli; 3-3,5 нмоль/мг бежа для Bacillus sp. ftu; 5,5 нмоль/мг белка для алкалофильных Bacillus alhalophilus и Bacillus firmus rab) . это Хорошо согласуется с определением этой бактерии как алкалоголерантной.

Соотношение цитохромов в мембранах Bacillus sp. ftu. Для характеристики цитохромного состава мембран использовано соотношение цитохромов а-.ъ-.с. Это соотношение, как нами выяснено, не зависит от колебаний содержания мембранного белка, вызванных использованием различных методик выделения мембран и определения количества белка, и позволяет проводить сравнение данных, полученных из разных работ. Из опубликованных данных следует, что соотношение цитохромов а:ь:с в мембранах нейтрофильных бактерий

(Doi and Halvorson, 1961; Arima and Sato, 1970, И ДР) И МУТЭНТ-

вых штаммов алкалофильных бактерий (Lewis et ai., 1980), которые не способны к росту в щелочных условиях, составляет i •. (1,2 -2,4) : (1,0 - 2,2), что значительно отличается от соотношения для алкалофильных штаммов: i •. (4,3 - 4,7) -. (5,1 - 6,7). Ука-

зэнное соотношение цитохромов близко к таковому в мембранах Bacillus sp. ftu В условиях ЭКСПОНеНЩЭЛЬНОГО роста: 1 : (3,7 -6,7) : (5,9 - 7,0) (табл. I). Обращает на себя внимание факт, что при условиях выращивания Bacillus sp. ftu, использованных в настоящей работе, соотношения цитохромов, характерного для нейтрофилов, получено не было.

Показано, что сильное отклонение от описанных выше соотношений цитохромов, а именно 1 : (11,0 - 20,5) : (12,5 - 24,4), ВЫЗЫвается снижением аэрации или естественным дефицитом кислорода (Табл. I), а также присутствием СССР в ростовой среде для Bacillus sp. ftu. Ярко выраженное изменение в соотношении цитохромов Bacillus sp. ftu происходит при переходе культуры в стационарную фазу роста: i : 63,3 : 90,0 (Табл. I). Во всех случаях изменение соотношения цитохромов в мембранах Bacillus sp. ftu происходило за счет увеличения доли цитохромов ь и с и репрессии синтеза цитохрома а.

Таким образом, по соотношению цитохромов а-.ь-.с в составе мембран Bacillus sp. ftu отличается от нейтрофильных бактерий рода Bacillus (Вас. subtilis И Вас. cereus), И ОТ МУТЭНТНЫХ ШТЭММОВ

алкалофильных бацилл, не способных к росту в средах с щелочными значениями pH. В то же время по этим характеристикам штамм Bacillus sp. ftu близок к алкалофильным бактериям Bacillus yn-2000, Вас. alkalophilus И Вас.firmus RAB.

Изучение дыхательной активности мембранных препаратов Bacillus sp. ftu в различных фазах ростового цикла. Дыхательная активность мембран (Рис. ЗА, табл.1), выделенных из клеток стационарной фазы роста, в системе с ТМФД и аскорбатом характеризуется на порядок меньшим значением кажущейся v „ (0,59 мкмоль 0о

ШаХ

/мин мг белка), чем мембран логарифмической фазы (5,0 мкмоль 02 /мин мг бежа). При этом мембраны Bacillus sp. ftu в логарифми-

ческой фазе роста содержат главным образом оксидазу аа3-типа (табл.1), а в стационарной фазе - в основном оксидазу ь-типа*. Приведенные факты дают основание полагать, что оксидаза аа3-типа гораздо эффективнее окисляет ТМФД, чем оксидаза ьь-типа.

Представление данных, изображенных на рис. ЗА, в системе двойных обратных координат (Рис. ЗБ) позволяет обнаружить в случае мембран логарифмической фазы две составляющие компоненты активности: с кт = 2 мМ и кщ = 0,7 мМ. Одна из составляющих с кщ = 0,7 мМ совпадает с основной составляющей активности мембран стационарной фазы роста. Следовательно, оксидаза аа3~типа окисляет ТМФД с кт = 2 мМ, а оксидаза ьь-типа - с кт = 0,7 мМ.

При изучении ингибирования дыхательной активности мембран Bacillus sp.ftu логарифмической фазы роста цианидом калия (рис.4) обнаружен отчетливый излом на кривой титрования, что свидетельствует о существовании в составе мембран по крайней мере двух различных оксидаз. Одна из оксидаз (к±=20мкМ) имеет чувствительность к цианиду на порядок меньшую, чем другая (к±=2мкМ). Зная, что в мемранах логарифмической фазы количественно преобладает оксидаза aa-j-типа , логично предположить, что именно она является более чувствительной к цианиду. Следовательно, величина относительного вклада vmax оксидазы аа3-типа в общую дыхательную активность мембран составляет 80-85% ( 10,8-11,5 мкмоль 02/мин нмоль гема а) в логарифмической фазе и уменьшается до 5-10% при переходе культуры в стационарную фазу роста. Вклад оксидазы ¿-типа, напротив, составляет 15-20% от общей активности в тех же условиях измерения в мембранах логарифмической фазы и 90-95% ( 2,1-2,3 мкмоль

02/мин нмоль гема о*) в мембранах стационарной фазы роста. *)------------------------------------------------------------

Мунтян и соавторами (Muntyan et ai., 1995) показано, что гем О не содержится в мембранах Bacillus sp. ftu, и описанная нами ранее оксидаза о-типа (Мунтян и Скрипникова, 1993 и др.) в действительности является оксидазой ьь-типа.

Рис.3. Зависимость дыхания мембранных частиц Bacillus sp. ftu от концентрации ТМФД. Мембранные частицы выделены из клеток, отобранных в логагифлической фазе роста ( А ) и в стационарной фазе роста ( ® ). Среда инкубации с добавлением 10 мМ аскорбат-триса и 0,1-10 мМ ТМФД. Реакцию начинали добавлением мембранных частиц: ОД ( А ) и 0,11 ( О ) мг белка/мл.

РИС.4. ИНГИбИрОВаНИе ДЫХаНИЯ МеМбраННЫХ ЧаСТИЦ Bacillus sp. FTU цианидом. Мембранные частицы выделены из клеток, отобранных в логарифмической фазе ( А ) и в стационарной фазе роста ( • ). Среда инкубации с добавлением 10 мМ аскорбат-триса и 0,05 ( А ) или 0,11 ( • ) мг бежа мембранных частиц/ мл. Реакцию начинали добавлением 1мМ ТМФД. 100% дыхательной активности соответствуют I,14 ( ▲ ) и 0,25 ( • ) мкмоль 0 / мин мг белка.

Ii

Сравнительный анализ кинетических характеристик оксидаз Bacillus sp. FTU И Escherichia coli. ИЗВвСТНО, ЧТО В процессе

роста культуры е. сои оксидаза Ьо-типа преобладает в логари$н мической фазе, а оксидаза bd-типа индуцируется позднее (ingiedew and Poole, 1984). Для более детального сравнения их с океидазами Bacillus sp. ftü использовали мутантные штамш'е. сои g0103 и е. сои goio4, содержащие, соответственно, только оксидазу ьо-типа или оксидазу bd-типа.

Величины кажущихся v „ составили, соответственно, I мкмоль

шал

Og/MHH нмоль гема о для штамма е. coli G0103 и 0,15 мкмоль 02/мин нмоль гема d для штамма е. сои g0104. По данным Кита и соавт. (Kita et al., 1984) ОКСИДаза Ьо-типа е. coli (к^=юмкМ) является более чувствительной к цианиду, чем оксидаза bd-типа (к±=2мм).

Суммируя эти данные можно провести сравнительную аналогию между двумя группами оксидаз бактерий Bacillus sp. ftu и е. сои. Оксидазы одной группы преобладают на ранних стадиях ростового цикла, когда в ростовой среде имеется избыток растворенного кислорода, они имеют большие по значению величины кажущейся v и

max

чувствительнее к цианиду, чем оксидазы второй группы, которые

Рис.5. Зависимость дыхания мембранных частиц штаммов е. сои от концентрации ТМФД. Штамш е. сои союз ( ▲ ) и е. сои воин (•). Среда с добавлением 10 ыМ аскорбат-триса и 0,1-10 мМ ТМФД. Реакцию начинали добавлением мембранных частиц.

нируют в условиях дефицита кислорода. К первой группе, таким образом, будут отнесены оксидаза аа3-типа Bacillus sp. FTU и окси-даза Ъо е. coli, а ко второй группе - оксидаза ьь-типа Bacillus sp. FTU и оксидаза bd-типа е. coli.

Предположение О попарном сходстве оксидаз Bacillus sp. FTU и е. сои получили подтверждение в работах Мунтян и соавт. (Muntyan et ai., 1993 аб). Показано, что оксидазы саа3-типа Bacillus sp. ftu и ьо-типа б. coli имеют одинаковую монофазную кинетику реассоциации с монооксидом углерода с г=25-30 мкс после диссоциации СО и молекулы оксидазы, возникающей под воздействием вспышки лазера. Характер и кинетика реассоциации этих двух оксидаз и СО отличались от таковых для оксидаз bd-типа е. сои и о-подобной Bacillus sp. FTU. Для последних показана трехфазная кинетика реассоциации с т=35-70 мкс, т=250-500 мкс и т=2-5 мкс.

Данные Об ОТЛИЧИИ ОКСИДаЗЫ Ьо-ТИПа е. coli И ЬЬ-ТИПа Bacillus sp. FTU особенно ванны при сравнении с данными для метило-трофной бактерии Methylobacillus flagellatum kt (Muntyan et al., 1994). В ее мембранах одновременно присутствуют две оксидазы со спектральными характеристиками близкими к таковым у оксидазы Ьо-

ТИПЭ Е. coli. Как И В Случае ОКСИДаЗЫ bb-ТИПа Bacillus sp. FTU,

o-подобная оксидаза с меньшей чувствительностью к цианиду м. flagellatum кт, преобладающая в стационарной фазе роста, обнаруживает трехфазную кинетику реассоциации с СО с близким значением констант реассоциации. Вторая оксидаза м. flagellatum кт, более чувствительная к цианиду и преобладающая в клетках экспоненциальной фазы роста, так же, как оксидаза Ьо-типа е. сои, обладает монофазной кинетикой реассоциации с СО с г=25-30 мкс.

Солюбилизацию мембран Bacillus sp. FTU проводили октилглю-козидом при концентрации 30 мМ. На этом этапе белок был очищен в 3-4 раза без потери дахательной активности.

При фракционировании экстракта мембран Bacillus, sp. ftu в растворах сульфата аммония 50-55% от насыщения происходит цреци-питация оксидазы ьь-типа, а в растворе 70-75% - оксидазы аа3~ типа. Линейный характер кривых титрования активности этих препаратов цианидом (Рис.6) свидетельствует о том, что в состав каждого из них входит по крайней мере одна оксидаза, а их константы ингибирования совпадают со значениями констант, полученных для мембран Bacillus sp. ftu (Рис.4). Это позволяет сделать вывод, что цри фракционировании мембран сульфатом аммония происходит разделение оксидаз аа3~ и ьь-типа.

Для дальнейшей очистки оксидаз была применена хроматография на DEAE- Sephacel И DEAE-Toyopearl.

10 20 30 40 ГКСМ,м!1'

Рис.б.Ингибирование дыхания препаратов оксидаз и мембранных очищенная o-подобная оксидаза ( ), мембранные частицы ( ). Среда инкубации с добавлением 10 мМ аскорбат-триса. Реакцию начинали добавлением I мМ ТМФД.

Оксидазу ьь-типа после диализа наносили на колонку с deae-sephacel (1x12 см), уравновешенную буфером, содержащим трис-нс1 50 мМ (рН 7,4),ЭДТА I мМ, Nací 50 мМ и октилглюкооид 30 мМ. Элюцшо фермента проводили линейным градиентом Nací от 50 до 500 мМ. Фермент элюировался при концентрации Nací 400 мМ. Далее фермент переводили в буфер, содержащий трис-нс1 50 мМ (рН 7,8), ЭДТА i мМ, Nací юо мМ и октилглжозид ю мМ и наносили на колонку с deae-Toyopearl (1x5 см), уравновешенную этим буфером.

А

Б

В

I.-2 345678

20.1

I 2 s

130 кДа 67 кДа 45 кДа !-

25 кДа 12,3 кДа.

12 3 4

75 kDa •

45 ма 3710)3 - vu i

a Ha 4f. ь 17 kDa-**^^^

ДА 0.06

I

400

гис.7.

" i

450

— I

sso

I

650

a-sds-электрофорез препаратов оксидазы ьь-типа Bacillus sp. ftu на разных стадиях очистки. 1,5 - белки-маркеры;2-3 - препарат оксидазы ьь-типа после хроматографии на deae-sephacei; 6-8 -оксидаза ьь-типа после хроматографии на deae-sephacei и deae-

Toyopearl.

B.SDS-Электрофэрез оксидазы о-типа ИЗ Sulfolobus acidocaldarius (Becker and Schäfer, 1991) - 2; S - белки-маркеры.

В. SDS-Электрофорез o-шдобной оксидазы из Bacillus PS3 (Sone et ai., 1990) - 2-4; I - белки-маркеры.

Г.Разностный (восстановление минус окисление - сплошная линия) и СО-разностный (пунктирная линия) спектры поглощения очищенной оксидазы ьь-типа Bacillus sp. ftu. Концентрация бежа 0,2 мг/мл.

Элгацию фермента проводили линейным градиентом октилглюкозида от 10 до 40 мМ в буфере уравновешивания. Океидаза ьь-типа элюировалась при концентрации октилглюкозида 35 мМ. Полученный препарат оксидазы ьь-типа при электрофоретическом анализе (рис. 8А) обнаруживает в своем составе три полипептида с молекулярными массами 20, 30 и 66 кДа. Видно (Рис.7А), что с углублением очистки препарата увеличивается вклад полипептида с молекулярной массой 66 кДа. Обнаружено, что при увеличении концентрации детергента удается частично разрушить комплекс с молекулярной массой 66 кДа без появления отличных от наблюдаемых ранее полипептидов с молекулярными массами 20 и 30 кДа. Поэтому сделано предположение, что по мере очистки фермента происходит агрегация его субъединиц.

Выделенная из мембран Bacillus sp. FTU океидаза ьь-типа и ОКСИДаЗЕ о-ТИПа ИЗ термОфИЛЬНОЙ бактерии Bacillus PS3 (Sone et al., 1990, РИС.7Б) И архебактерш Sulfolobus acidocaldarius (Becker and Shafer,1991, РИС.7В) Обнаруживают бОЛЫЮе СХОДСТВО

субъединичного состава. Более того, продемонстрировано преобладание оксидазы о-типа в мембранах Bacillus рбз в конце экспоненциальной фазы роста и усиление ее синтеза при низких концентрациях кислорода в ростовой среде (Sone et ai., 1990) .

В таблице 2 обращает на себя внимание низкая удельная активность фермента. Этот факт дает основание предполагать потерю элементов ферментного комплекса в процессе очистки. По предварительным данным, ими могут являться цитохромы с, которые отделяются на начальных этапах очистки: cJ52 и с553. Добавление их к высокоочищенному препарату оксидазы ъъ-типа восстанавливает ее дыхательную активность.

Оксидазу аад-типа (препарат, полученный при высаливании в 70-75% растворе сульфата аммония) наносили на колонку с deae-Toyopeari (1x10 см), уравновешенную буфером, содержащим трис-нс1

A kDa 12 3

66- .— 45- _

36--«К*--

29__

24- —

20- _ 14 _ w

РИС.8.

A.SDS-электрофорез очищенной ОКСИДЭЗЫ саа3-типа Bacillus sp. ftu. I - белки-маркеры, 2,3 - препарат оксидазы саа3 после хроматографии на - deae—Toyopeari и повторного фракционирования сульфатом аммония.

Б.Разностный (восстановление минус окисление - сплошная линия) и СО-разностный (пунктирная линия) спектры поглощения очищенной оксидазы саа^—типа Bacillus sp. ftu. Концентрация белка ОД мг/мл.

50 ММ (рН 7,8), NaCl 200 мМ, ЭДТА I мМ, октилглюкозид 30 мМ. Элю-цию белков проводили линейным градиентом Nací от 200 мМ до iM. Элюцию оксидазы наблюдали при концентрации Nací 480 мМ. Ни одна из фракций, кроме тех, которые обладали характерными спектраль-

Таблица 2. Основные характеристики терминальных оксидаз Bacillus sp. ftu на разных этапах очистки.

Стадия очистки Удельная дыхательная активность мкг ат 0 (в--) мин-мг белка Содержание гема (в нмоль/мг бежа)

Мембранные частицы 4-5 0,15 (гем а)

Экстракт мембран 15 - 20 1,1 (гем а)

Фракционирование сульфатом аммония:

оксидаза саа3-типа 25 - 30 _

оксидаза ьь-типа 0,6 _

После хроматографии на колонках:

оксидаза саа^-ТИПа 20 19 (гем а) 21,5 (гем с)

оксидаза ьь-типа 0,34 3,4 (в присутствии вдтохрома с ) 14-15 (гем Ь)

ными свойствами, дыхательной активности не проявляла. Фракции, обладающие дыхательной активностью, объединяли и подвергали повторному фракционированию сульфатом аммония. Видно (Рис. 8Б), что при ионообменной хроматографии происходит эффективное отделение цитохромов ь и с. При повторном высаливании удается избавиться от цитохромов ь. Из данных таблицы 2 видно, что соотношение гемов а и с в полученном после нескольких стадий очистки препарате близко к 1:1.

Электрофоретический анализ (Рис.8А) показывает, что получен-

ный препарат оксидазы аа3-типа содержит два полипептида с молекулярными массами 3? и 51 кДа.

Препарат оксидазы аа3-типа после хроматографии на deae-тоуо-peari подвергли гельфильтрации высокого давления на колонке tsk-gei G3000SW. Молекулярная масса оксидазного комплекса, рассчитанная по времени выхода с колонки, составила 85*5 кДа. Электрофоре-тический анализ показал, что в полученном препарате оксидазы после гельфильтрации содержатся те же полипептиды (37 и 51 кДа), что и в препарате после ионообменной хроматографии. При этом по данным разностных спектров поглощения в препаратах оксидазы аа3-типа после гельфильтращпт содержатся цитохромы а и с. Для выяснения принадлежности цитохрома с молекуле фермента гельфильтрации проводили в нескольких вариантах - с использованием различных детергентов ( октилглхжозида (30 мМ), Тритона X-I00 (1% w/w), холата натрия (14 мМ)), при различной ионной силе (50 и 200 ММ Nací). Во всех случаях фермент после гельфильтрации характеризовался одним и тем соотношением цитохромов а и с, а именно i:i, что и до гельфильтрации ( после ионообменной хроматографии). Поэтому сделано предположение, которое поздее было подтверждено (Мунгян и Устиян, не опубликовано), что очищенный фермент содержит гем С и его правильнее было бы называть оксидазой саа^-типа.

Первичная структура N-концевых фрагментов субъединиц оксидазы Саад Bacillus sp. FTU. В сотрудничестве с В.А.Гринкевичем (каф. биоорганической химии биологического факультета МГУ) наш установлены последовательности тридцати N-концевых аминокислот для полипептидов с молекулярными массами 51кДа (субъединица I) и 37 кДа (субъединица II) оксидазы саа3. Сравнительный анализ полученных последовательностей и аминокислотных последовательностей белков из Swiss Prot банка показал, что они совпадают с пос-

ледовательностями субъединщ I и II оксидазы саа3-типа бактерии Bacillus firmus OF4 (Quirk et ai., 1993). Кроме того наблюдается гомология этих пептидов с n-концевыми фрагментами субъединиц I и II оксидаз из бактерий рода Bacillus и в меньшей степени - с комплексом хинолоксидазы из Вас. subtHis (Hicks and Krulwich, 1995). Основываясь на данных о структуре генов ctaD и ctac из вас. firmus 0F4 (Quirk et al., 1993) МОЖНО ПреДПОЛОЖНТЬ, ЧТО В комплексе саа3 оксидазы Bacillus sp. FTU происходит посттрансляционное отщепление n-концевого остатка метионина у субъединицы I и лидерного пептида из 21 аминокислоты у субъединицы II. Подобное отщепление также показано для субъединиц I и II комплекса саа3 оксидазы Bacillus PS3 (ishizuka et al., 1990) И Постулировано ДЛЯ вас. subtiiis (Quirk et al., 1993). Интересно, что в окружении n-концевого цистеина субъединицы II вас.firmus of4 находится консенсусная последовательность ltgclg, характерная для липо-протеинов ряда бактерий (Santana et ai., 1992). Можно предположить, что субъединица II Bacillus sp. FTU также является липоцро-теином, а ее лидерный пептид содержит такую же последовательность, которая необходима для посттрансляционной модификации n-концевого цистеина остатками жирных кислот.

Однако, несмотря на то,что N-концевые последовательности двух субъединиц выделенной оксидазы саа3-типа совпадают с аминокислотными последовательностями субъединиц I и II оксидазы саа3-типа бактерии вас.firmus 0F4 нет основания полагать, что эти бактерии являются одним и тем же штаммом. Ряд существенных отличий, касающихся особенностей роста этих микроорганизмов (разная

Область pH - ОПТИМУМОВ: 10,0-11,0 ДЛЯ Вас. firmas 0F4 (Hicks and Krulwich, 1995) И 8,0-9,0 ДЛЯ Bacillus sp. FTU (ВерХОВСКЭЯ И

др., 1989)) и их морфологии (различное расположение спор в спорангиях), с определенностью относит их по крайней мере к разным

штаммам и, возможно, даже к разным видам.

Также при сравнении последовательностей 5S РНК представителей рода Bacillus Bacillus sp. FTu и вас. firmus были определены как близкородственные, НО не идентичные штаммы (Semeykina et al., 1989). Наиболее близкими видами К Bacillus sp. FTU по этому признаку оказались Вас. subtills И Bacillus licheniformis.

Кроме того, следует отметить существенное отличие молекулярных масс субъеданиц I этих микроорганизмов (44 кДа для вас. firmus 0F4 (Quirk et al., 1993) И 51 КДа ДЛЯ Bacillus sp. FTU). Этот факт дает основание предполагать, что оксидазы саа3-типа этих бактерий являются различными белками.

Субъединица I

Bacillus sp. FTU Вас. firmus ON Bacillus PS 3 Bac.subtilis Т. thermophilus P. denitrificans Bac.subtilis Qox ATQKQEKSV1 W/D DWLTTVDXKKIAIMYLXAG-MATQKQEKSVI W DWLTTVDHKKIAIMYLIAG -MST 1ARKKGVGAVL W DYLTTVDHKKIAHLYLISG-MLNALTEKRTRG SMLW DYLTTVDHKKIA ILYLVAG-MAITAKPKAGVWAVLW DLLTTVDHKKIGLMYTATA-MADAAVHGHGDHHDTRGFF T RWFMSTNHKDIGILYLFTA-LTYFKKWKWLW S EWITTVDHKKLGIMY1ISA-

Субъедпнвца Ц

Bacillus sp. FTU Вас. firmus OF4 Bacillus PS 3 Bac.subtilis CLGEENLTALDPKGPQAQWIYDNM 1 LSII XM- MKLWKTASRFLPLS F LTLFLTGCLGEENLTALDPKGPOAQWIYDNM 1 LSII VM- t MNKGLCNWRLFSUFGMMALLLAGC-GKPFLSTLQPAGEVADMQYSLMLLSTSIM-MVKHWfiL 1 LLLAL V PLLLSGC- GKPFLSTLKPAGEVADMQYDLTV LSTLIM-

Рис.9. м-концевые аминокислотные последовательности субъе-ление аминокислотной последовательности) и оксидаз некоторых редставителей рода Bacillus и других бактерий (предсказанное из последовательностей нуклеотидов). Стрелкой указано место, по которому происходит отщепление лидерного пептида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из приведенного в настоящей работе сравнительного анализа n-концевых аминокислотных последовательностей следует, что цито-хром саа3 Bacillus sp. FTU можно с уверенностью отнести к семейству н+-транспортирующих терминальных оксидаз, куда также относится И цитохром Ьо Е. coli.

Особого обсуждения заслуживает ш+-составляющая ионного транспорта терминального участка дыхательной цепи бактерии Bacillus sp FTU (показанная для целых клеток (Верховская и др., 1989), и субклеточных мембранных пузырьков (Kostyrko et ai., 1991)). В последней работе показано, что иа+-составляющая ионного транспорта на порядок менее чувствительна к цианиду, чем протонная составляющая. Изучение действия цианида на дыхательную активность выделенных оксидаз саа3- и ьь-типа Bacillus sp. FTU показало, что именно эти два фермента дают основной вклад в дыхательную активность мембранных препаратов. Поскольку чувствительности к цианиду двух компонент дыхания мембран, двух выделенных ферментов и двух видов ионного транспорта (протонного и непротонного, натриевого) совпадают, можно предполагать наличие связи ионного транспорта с работой двух оксидаз в мембранах. При этом, по-видимому,

Нет ОСНОВаНИЯ Полагать, ЧТО ОКСИДЭЗа ЬЬ-ТИПа Bacillus sp. FTU

участвует в транспорте протона, так как показано (Kostyrko et ai., 1991), что последний полностью (на 100%) ингибируется при концентрации цианида 10 мкМ. Интересно отметить, что н+-помпа отсутствует в оксидазе м-типа е. coli (puustinen et ai.,i99i) и о-П0Д0бН0Й оксидазе термофильной бактерии Bacillus PS3 (Sone et al.,1990), которые Обладают СХОДСТВОМ С оксидазой ЪЬ~типа Bacillus sp. ftu. Однозначно и окончательно, однако, решить вопрос о природе ионного транспорта в мембранах бактерии Bacillus sp. ftu станет возможно только после реконструкции ферментов в липосомы.

выводы

1. Показано, что мембраны алкало- и галотолерантной бактерии Bacillus вр. ftu содержат цитохромы а, ь и с. По общему содержанию цитохромов (3-3,5 нмоль/мг мембранного белка) бактерия занимает промежуточное положение между нейтрофильными и алкалофильными бактериями.

2. Исследовано влияние условий роста на соотношение цитохромов в мембранах бактерии Bacillus sp. ftu. Показано, что долевой вклад цитохромов ь и с возрастает при одновременной репрессии- синтеза цитохрома а в условиях перехода культуры в стационарную фазу роста, дефицита по кислороду, а также при культивировании в присутствии разобщителя и цианида.

3. В мембранах бактерии Bacillus sp. ftu выявлены две терминальные оксидазы: саа3-типа с высокой чувствительностью к цианиду (Ki= 2 мкМ) и ьь-типа с более низкой чувствительностью к цианиду (к^= 20 мкМ). Показано, что оксидаза саа3 преобладает в культуре экспоненциальной фазы роста, а оксидаза ьь-типа - в конце экспоненциальной и в стационарной фазе роста.

4. Определен субъединичный состав оксидазы саа3-типа. Показано, что молекула фермента состоит из двух субъединиц с молекулярными массами 37 и 51 кДа, а молекулярная масса всего комплекса по данным эксклюзивной хроматографии сотавляет 85 кДа.

5. Установлено, что молекула оксидазы ьь-типа Bacillus sp. ftu содержит субъединицы двух видов: с молекулярными массами 20 и 30 кДа. Субъединичный состав оксидазы ьь-типа Bacillus sp. ftu обнаруживает сходство с оксидазами о-типа из термофильной бактерии Bacillus ps3 и архебактерии Sulfolobus acidocaldarius.

6. По чувствительности к цианиду две оксидазы Bacillus sp. ftu, саа3- и ьь-типа обладают сходством соответственно с первичным н4"- и ма+-транспортом в мембранах бактерии, обнаруженным

Косгырко И соавторами (Kostyrko et al., 1991).

7. Определена первичная структура N-концевых фрагментов двух субъединид оксидазы саа3-типа. Показана гомология н+-транспортирующим оксидазам саа3~ и аа3~типа представителей рода Bacillus.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Muntyan M.S., Skripnikova E.V. "The cytochrome o-type oxidase in the aerobic alkalo- and halotolerant bacterium Bacillus FTU respiratory chain."// Abstracts of 15th Iternational Biochemical Congress, Jerusalem. 1991. P.190.

2. Muntyan M.S., Skripnikova E.V., Ustiyan V.S. "Two types о£ cytochrome oxidase in alkalotolerant bacterium Bacillus FTU respiratory chain."// Short Reports of 7th European Biochemical Energetical Conference, Helsinki. 1992. V. 7. P.69.

3. Мунтян Ы.С., Скрипникова E.B. "Изучение свойств терминального участка дыхательной цепи алкалотолерантной бактерии Bacillus ftu в различных фазах роста."// Биохимия. 1993. Т 58. n 8. С. 1290-1295.

4. Muntyan M.S., Skripnikova E.V. "Two types of terminal oxidase in alkalotolerant bacterium Bacillus FTU,"//Biochim. et Biophys. Acta. 1993. V. 1143. N 2. P. 142-146.

5. Аветисян А.В., Ацаркина H.B., Богачев А.В., Белогрудов Г.И., Гринкевич В.А., Муртазина Р.А., Мунтян М.С., Скрипникова Е.В., Скулачев В.П., Устиян B.C. "Сравнительное исследование протонных и натриевых генераторов трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов Na+ и н+ в бактериях."// Тезисы I Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Белковая инженерия", Москва. 1994. С. 4.