Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция хинолоксидазы bd-типа в клетках Escherichia coli при различныхусловиях роста и ее функциональное значение

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Индукция хинолоксидазы bd-типа в клетках Escherichia coli при различныхусловиях роста и ее функциональное значение"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

Р Г 5 ОД

1 3 ОЕЗ ISiiS На правах рукописи

МУРТАЗИНА Рахиля Ахметалимовна

ИНДУКЦИЯ ХИНОЛОКСИДАЗЫ bd-ТИПА В КЛЕТКАХ Escherichia coli ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ РОСТА И ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1996

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической Биологии им. А. Н. Белозерского МГУ.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

академик РАН, профессор В. П. Скулачев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор В. Д. Самуилов

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник В. Л. Габай

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт Биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится « ^ » 1995 года в ¡5 ч 39 мип

на заседании Специализированного Совета Д.053.05.32 по присуждению ученой степени кандидата наук по адресу: 119899, г. Москва, Воробьевы Горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » 1996 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

М. В. Иванов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуально^ рроЯлсчты. Известно, что дыхательная цепь Escherichia coli содержит две терминальные оксидазы: хкнолоксидазу fro-ткпа и хинолакскдазу Ы-типа, уровень экспрессии которых зависит от различных условий роста, таких как, например, фаза роста, условия аэрации и др. (Ingledew&Poole,1984;Gennis,1987). Преимущественная экспрессия одной из альтернативных терминальных оксвдаз E.coli в определенных условиях, по-видимому, может объясняться различиями в их биохимических свойствах и функциональной роли. В настоящее время причина существования, функциональная роль И физиологическое значение разветвленности дыхательной цепи на терминальном участке у данного микроорганизма остаются неизвестными.

С одной стороны, данные, полученные Теннисом и соавтор, при изучении характеристик роста мутантных штаммов E.coli, содержащих только одну из двух терминальных оксидаз, позволили авторам выдвинуть предположение о функциональной идентичности ферментов Ьо- и bd-типа (Green&Gennis,1983;Au et aJ.,1985). Однако позднее, в Лаборатории Викстрема было показано, что, хотя, как хинолоксидаза bo-, так и bd-типа катализирует редокс-реакцию четырехэлектронного восстановления кислорода до НгО с образованием Дрн\ но при этом терминальная оксидаэа типа Ьо функционирует как протонная помпа, а оксид аза bd-mm образует Арн* только за счет скалярных процессов по обе стороны мембраны (Puustinen et al.,1991).

В то же время, в нашей лаборатории были получены данные, показывающие, что клетки E.coli содержат Na+ -транспортирующую терминальную оксидаэу при росте в условиях, сопровождающихся понижением уровня ДРн* на плазматической мембране данной бактерии (Avetisyan et al,1989,1991). Естественно встает вопрос: какая из двух альтернативных терминальных оксидаз этого микроорганизма ответственна за использование иона натрия в качестве сопрягающего иона, и каким образом регулируется переключение работы терминального участка дыхательной цепи E.coli на натриевый режим?

В настоящее время известно, что уровень экспрессии оксвдаз Ьо- и bd-mm регулируется arc' -и Jhr" -системами (luchi et al.,1990;Spiro&Guest,199l). Показано, что air-система принадлежит к семейству так называемых двукомпонентных регулггорных систем и состоит из рецепторного белка АгсВ и белка регулятора АгсЛ (Iuchi&Lin,1988;luchi et а),1989). Природа сигнала, репетируемого этой системой, на данный момент неизвестна. Первоначально предполагали, что индукция терминальных

'arc (от serobic respiratory tontrol) "fnr (err fumarate nitrate reductase)

оксндаз bo- и bd-типа регулируется непосредственно содержанием кислорода в среде роста. Впоследствии было продемонстрировано, что кислород рецептируется на уровне дыхательной цепи и, исходя из этого, выдвигалось предположение, что увеличение уровня восстаиовленности одного из ей компонентов служит сигналом для агс-спстты (luchi et al,l990).

Следует также отметить, что при неблагоприятных условиях роста в клетках E.coli наблюдается преимущественная экспрессия терминальной оксидазы bd-типа: [например, при лимитировании роста содержанием источника серы (Poole&Haddock,1975)!' при смене акцептора электронов (Ing!edew&Poole,l984); при росте в присутствии цианида (Ashcroft&Haddock,1975); при различных мутационных повреждениях компонентов дыхагелыю« цепи (Сох е! a!,1970;Iuclii el а!,1990)]. Все зтн факторы могут приводить как к повышению уровня восстаноаленности компонентов дыхательной цепи бактерии, так и к падению Л(1ц* на плазматической мембране. В связи с этим снижение уровня ДДн* на сопрягающей мембране клеток также может рассматриваться в качестве сигнала для arc-системы, регулирующей экспрессию альтернативных терминальных оксндаз E.coli.

Пслыо настоящей работы было определить 1) оксид« E.coli, хинолоксидаза bo-типа или хинолоксидаза bd-типа, способна использовать ион Nu* в качестве сопрягающего иона; 2) существует ли корреляция между уровнем экспрессии соответствующей терминальной оксидазы E.coli в условиях роста, снижающих ДРн* на плазматической мембране, и ее способностью переключаться на работу в "натриевом" режиме и, если существует, то 3) попытаться выяснить природу сигнала, ■регулирующего экспрессию терминальных оксндаз в клетках E.coli и идентифицировать регуляторную систему, принимающую участие в этом процессе.

Научная новизна работы. В ходе исследований впервые обнаружено, что терминальная оксидаза Ы-типа, в отличие от оксидазы Ьо-типа, вовлечена в процесс первичного транспорта Na+ в клетках E.coli, выращенных в условиях, снижающих ДРн* на сопрягающей мембране бактерий. В этих условиях определена положительная связь.между индукцией хиколокендазы М-типа к появлением устойчивого к действию протокофора транспорта нонов натрия на терминальном участке дыхательной цепи хлеток данного организма. На основе данных, полученных при изучении индукции хинолоксид'азы М-типа в клетках E.cali при различных- условиях роста, предложена гипотеза о роли Дрн* в качестве сигаала для переключения экспрессии терминальных оксидаз в клетках данного микроорганизма, а также показано участие arc-системы в, осуществлении такого типа рецепции.

Обнаружение способности терминальной оксидази М-типа в клетках E.coii демонстрировать феноменологию Первичной натриевой помпы расширяет круг ферментов, способных к транспорту Na+ за счет энергии редокс-реакций у бактерий. Полученные результаты облегчают понимание путей адаптации энергетического метаболизма и era регуляции в клетках прокариот, способных к росту о условиях, понижающих Дрн* на сопрягающей мембране мнхроорганизмов. Данные о участии агс-системы в процессе переключения синтеза альтернативных терминальных оксндаз при росте клеток без протондвижущей силы могут иметь значение для понимания природы репетируемого сигнала этой регуляторной системой. '

Апройцпия работы. Результаты исследований были представлены на 7.-ой Европейской биоэнергетической конференции (Хельсинки, Финляндия,1992), на конференции ШРАВ, "Major electron transport complexes in photosynthesis and respiration" (Гмундсн, Австрия,1993), »a l и II Всероссийских конференциях "Белковая инженерия" (Москва, 1994,1993), на российско-германском симпозиуме молодых ученых (Оснабрюк, Германия,1994). Работа также была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В Ломоносова (Москва, 1992,1993).

, По материалам диссертации опубликовано б работ.

, Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включающей разделы "Материалы и методы", "Результаты", и "Обсуждение"), выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ЛУд*тк<г;фг»!пнгц бактерий. В работе использовали 10 различных штаммов Escherichia coll. Характеристики штаммов приведены в таблице 1.

Cjffim. В зависимости от поставленных задач клетки бактерий E.coii различных штаммов выращивались в жидких средах следующего состава: среда (А) - 22мМ КН^Од, 20мM NajHPO^, ЮмМ NaCl, ЮмМ (NfyhSO^ 50мМ сукцинат натрия, 0.05% дрожжевой экстракт, 50мМ гаишш-гаицин, 1мМ MgS04, рН 8.6 или 7.2. В среду (А) доб&влми тиамин а концентрации 1мкгУмл, стрептомицин (ЮОмкг/мл), в случае с клетками штамма GR70N, а для выращивания штаммов ООЮЗ и G0104 также вносили кднамипин (50мкг/мл). . Среда (Б) содержала: 22мМ КН,Р04, 20мM Na2HP04, 34мМ NaCI, 10мМ (NH4)jS04, 0.4% (y/v) глицерина, 0.1% триптона, 0.05% дрожжевого экстракта. 10мМ тицил-глицииа, 1мМ MgSOi. рН 7,2. Среда рост» (В) дц штамма GR70N содержала

также тиамин (Ыкг/мл), стрептомицин - (100мкг/мл), Но не содержал» триптон. В среду роста (Б) для штаммов ЕСЬ547, ЕСХ590, ЕСХ968 добавляли стрептомицин (_100мкг/мл), для штаммов В4089, В4093, В4094 - тиамин (Шикг/мл), а для двух последних штаммов -канамицин (50мкг/мл). В средах (С) и (Д) все натриевые соли были заменены иа калиевые, в остальном среды содержали те же компоненты, что среды (А) и (Б) (рН 7.2), соответственно. - .

Штамм E.coU Генотип ---------- ------ Источникссылок

GR70N GO 103 GO 104 F- thí rpsL gal(?) StrR GR70N; Дcyd::kan Str^KanR GR70N; ácyo;:kan Str^KanR Oden et al,1990

ECL547 ECL590 ECL968 i ECL525*; <фsdh+ (sdh-lac) StrR ECL52J*; $sdh+ (sdh-lac) arcBl StrR sdh+ ^(sdh-lac) arcA13¡ StrR Iuchi&Un, 1988 luchi et al, 1989 Iuchi&Un, 1992

В4089 В4093 В4094 F~ ihi hsdR hsdM B4089; r/fcC.vTnS Kan& B4089; riM.'.'Tn5 KanR Бадрин и др., 1979

LE392 F~ supF supE hsdR galK trpB iacY lonA A(uncB-uncD) Brusilow, 1987

' Примечание: ECL525* Г ífrd -101 araDI39 (argF-lac) U169 rpsLlSO relAl flb-5301 ptsF25 deoCl

Условия выращивания клеток. Клетки всех штаммов растили на качалке "Quetis Orbital Shaker" (Англия) в качалочных колбах Эрленмейера с 200 мл питательной среды, при t=37 «С и 200 об/мин до середины логарифмической фазы роста. Для серии опытов клетки штамма GR70N и G0104 растили на ферментере фирмы "В.Е. Maribushi MD-500 "(Япония), концентрация буфера в среде роста при этом была снижена до 10мМ.

Для некоторых экспериментов все штаммы клеток Е.соЧ, кроме В4089, В4093, В4094, выращивали в средах (А, Б и С и Д) при pH 7.2, с добавлением протонофора пентахлорфенола (ПХФ). В этом случае клетки растили до Agoo=0.15-0.2, вносили в среду 80-100мкМ ПХФ и доращивали их до середины логарифмической фазы роста (для всех штаммов этот показатель был примерно .одинаковым и составлял 0.8-1.0 ед оптической плотности). В ряде случаен клетки щаммов GR7QN, ECL547, ECL590, ECL968 выращивали в среде (Б) в присутствии 2.5мМ феррициашща и 15мкМ

феназинметосульфата (ФМС). В данных опытах клетки растштн до Абоо=0.5, вносили реагенты и затем инкубировали с ними клетки в течение двух часов в темноте.

Штаммы E.coli, неспособные синтезировать рибофлавин - В4093 и В4094," выращивали в среде (Б), которая содержала рибофлавин в концентрации 20 мкг/мл для клеток штамма В4093 и 5 или 200мкг/мл для клеток штамма В4094.

_ Определение скорости роста различных штаммов E.coli в жидких средах (А), (Б), (С) и (Д) проводили по измерению светорассеяния суспензии клеток при 600 им на спектрофотометре СФ-4А (JIOMO, Ленинград).

Скорость движения метек E.toli QR70N, выращенных в среде (А) в присутствии различных концентраций ПХФ, измеряли по методу Шусмита (Shoesmith.1960). Измерения проводили при комнатной температуре, с использованием оптического микроскопа МБИ-3 с фазово-кокграстным устройством КФ-4. Концентрация клеток в ходе опыта была (1-2)х 108 кл/мл. . ,

Концентрацию бактериального белка определяли по модифицированной методике Лоурн (Lowry et al,1951), используя дня разрушения хлеток додецилсульфат натрия. .

- Регистрацию дыхания клеток Ecoli проводили с помощью электрода Кларка закрытого типа. Электрод был присоединен к петрографу LP 7е (Чехославакия), а сигнал регистрировали на самописце "Ifelec" (Jobin-Ivoa, Франция).

' Выделение субСактериалъпых частиц (СЕЧ) из клеток E.coli основано на методике разрушения целых клеток при большом давлении (16.000psi) с помощью Френч-пресса (Aminco, США). Субклеточные частицы осаждали центрифугированием при 50.000g, 90 мин, 2"С, суспендировали в средах, состав которых различался в зависимости от цели исследований, замораживали и хранили в жидком азоте.

Регистрацию поглощения Na+ СЕЧ иг E.coli проводили с помощью модифицированного метода Пенефски (Penefsky,1977). Аликвоты суспензии СБЧ, 'энергизованных внесением субстратов дыхания, через определенные интервалы времени наносили на колонку с сефадексом G-50 coarse и центрифугировали 1.5 мин в бакет-роторе при 700g. Элюат, содержащий отмытые от внешней среды СБЧ, разводили в 10 раз бвдистиллированной водой и измеряли в нем концентрацию Na+ с помощью пламенного фотометра ПФМ, В этой же пробе измеряли концетрацию белка и полученные результаты •выражали отношением количества Na+ в нмолях к количеству белка в мг.

штаммов проводили спектрофотометрическн. Для этого суспензию СБЧ разводили средой, содержащей 50мМ K2S04, 5мМ Na2S04, ЗОмМ MgS04, 0.2мМ ЭДТЛ и К'ЮмМ

трицин-КОН, pH 7.75, до концентрации 2-5 иг/мл. В качестве восстановителя использовали дитионит натрия, а окислителя- феррицианвд калия. Измерения проводили на приборах "Hitachi-557" (Япония) и "Aminco DW-200" (CÜIA). Коэффициенты миллимолярной экстинции для цитохромоа Ь й d принимали: £550.575=17.5 и ЕбЗО-615 »8.5, соответственно (Haddock, Schairel,1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ИдеигнфикамЦ_Na+ -транспортирующей терминальной дксиапзы д

дыхательной "gnu E.coli. Ранее в нашей группе Аветисян и соавторами (Avelisyärt ei al., 1989,1991) были получены данные, указывающие на наличие Na+- насосов в СбЧ из клеток E.coli Doc-S, выращенных в условиях, снижающих Дрн* Иа сопрягающей Мембране клеток бактерий. В клетках данного микроорганизма обнаружено два участка Na+-сопряжеиия в дыхательной цепи: NADH:xhhoh оШЩоредуктаза it терминальная оксидаза. Как известно, в дыхательной цепи E.coli существуют две терминальные хинолоШшазк bo-и М-тииа (Ingledew&PooIe,l984), Перед нами стояла задача определить, какая из двух терминальных оксидаз ответственна за первичный транспорт Na^ В клетках данного микроорганизма. Исследования по идентификации Ыа+-транспортнрующеП терминальной оксидазы в клетках Е.соИ во многом облегчались наличием & нашей распоряжении мутантных штаммов, полученных на основе клеток штамма E.coli K-I2 GR70N, не содержащих либо хинолоксидазу Ьо-типа (G0104), либо хинолоксидазу Ы-типа (СОЮЗ).

Рост клугпк E.coli GR70N, ООЮЗ и 00104 в рамнчнМх условиях. Согласно данным, полученным в группе Генкиса (Green&Gennis, I983; Au et а!,1985), мутаты E.coli, содержащие только одну из альтернативных терминальных оксидаз, способны расти, не проявляя заметных различий, в средах с нейтральным значением pH на йесбражИваемых субстратах в качестве источника углерода и энергии. ' Эти результаты позволили авторам высказать предположение о функциональной идентичности терминальных оксидаз Ье- и

М-типа. Однако недавно в лаборатории Викстрема (Puustmen et al,1991) при измерении

*

соотношения И+/е" на терминальных океидззах E.coli было показано, что оксид аза бо-типа демонстрирует Н+/е' =2, то есть является Н+-помпой,-з bd-типа ( Н+/е" =1 ) - образует Арн* только за счет скалярных'процессов по обе стороны Мембраны. Полученное авторами данные свидетельствуют о различии в функционировании терминальных оксидаз дыхательной цепи E.coli. Для описанных выше экспериментов клетки E.coli выращивались в синтетических минеральных срезах при нейтральных значениях pH. В связи с предположениями о способности одной из двух альтернативных терминальных оксидаз E.coli использовать не протонное, а натриевое сопряжение при росте ' в условиях.

сникающих протондвижущую силу не мембране бактерий (Avetisyan et at.. 1989,1991), нас интересовало поведение мутантных штаммов, не содержащих одну из двух терминальных оксидаз при росте в данных условиях. Для »того мы снимали кривые роста клеток E.coii штаммов: дикого типа - GR70N и мутантов G01Q3(Ac></) и G0104(Acyo), при выращивании их в условиях, снижающих Дрн* на сопрягающей мембране, т.е. в средах с щелочным значением рН (8.6) или с нейтральным значением рН (7.2), но в присутствии протонофора-разобщителя пентахлорфенола (ПХФ). Для контроля клетки трех штаммов растили в среде с рН 7.2 в отсутствие ПХФ. Во всех случаях в качестве единственного источника углерода ц энергии использовали сущинат (50мМ), что предполагало обязательным вовлечение окислительного фосфорилирования в процесс обеспечения клеток АТФ.

На рис. 1А видно, что клетки E.coii дикого типа GR70N имели максимальную скорость роста в среде с нейтральным значением рН (7.2), в то же время штаммы G0103(Acyrf)

G0104 р GF70H

,1,41111

Рнс. I. Кривые роста клеток E.coii штаммов GR70N (дикий тип), G0l03(o+rf-) и G0104(o"d+), выращенных при рН 7.2 (А), рН 8.6 (Б) и при рН 7.2 в присутствии 80икМ ПХФ (В) (стрелкой отмечен момент добавки ПХФ).

Клетки растили аэробно при 37®С в синтетической солевой среде следующего состава: 22мМ КН2Р04, 20мМ Na2HP04, 10мМ NaCl, ЮмМ (NH4)2S04. 1иМ MgS04, 50мМ сукцмната натрия, 0.05% дрожжевого экстракта, 50мМ глицил-глицина и тиамина (1мкг/ил).

и G0104(Af)") практически не рагшчалис!.

между собой по схоросги роста в данных условиях и лишь незначительно отставали в росте от клеток штамма дикого типа. Полученные нами результаты по росту трех различных штаммов в среде с рН 7.2 на сукцинате в качестве источника ^углерода и энергии не противоречат описанным выше данным, полученным в группе Генииса.

Картина роста клеток трех различных штаммов менялась в средах с щелочным значением рН (8.6), (рис.1,Б). В данных условиях клетки дикого типа Е.соН СИ70К и клетки мутанта СОЮ4(Дсуо) росли Примерно с одинаковой скоростью, тогда как клетки Е.соН СОЮЗ(Дсу^) отставали в росте (время удвоения этого штамма было приблизительно в 2 раза большим по сравнению с двумя другими). Различия между штаммами Е.соН становились более явными при росте клеток в присутствии ПХФ (80мкМ) в среде с нейтральным значением рН (рис.1,В). После добавки разобщителя рост штаммов СЯ7(Ж (дикий тип) и С0104(Дс>'о) замедлялся, но оставался достоверно измеримым, в то время как рост штамма СОМЗ(ДсуЛ) полностью прекращался. Используемая концентрация ПХФ не оказывала ингибирующего действия на дыхание (данные не представлены). В связи с этим возникает вопрос: достаточно ли эффективен разобщитель ПХФ в использованной концентрации? Решение этой проблемы особенно важно в связи с предположением о том, что в условиях роста, сопровождающихся снижением ЛЦн* на мембране клеток Е.соН, происходит переключение энергетики с протонной на натриевую (АуеЦзуап И а!., 1989,1991).

К сожалению, измерить точную величину Дрн* в нативных клетках Е.соН в среде роста не представляется возможным из-за наличия внешней мембраны, характерной для всех грамотрицатсльных бактерий, которая непроницаема Вдя многих соединений различной химической природы. В основу теста, позволяющего косвенно следить за снижением .протонного потенциала на сопрягающей мембране клеток, растущих в присутствии разобщителя, были положены следующие факты. Известно, что такая функция бактериальных клеток, как движение, имеет низкий энергетический порог (и 20мВ), и в случае таких бактерий, как Е.соН, движение которых поддерживается трансмембранноп разностью электрохимических потенциалов конов водорода, введение в среду разобщителя-прогонофора в достаточной концентрации мгновенно останавливает клетки из-за немедленной диссипации Дрн* (Белякова и др.,1976). Для клеток Е.соИ в работах Макнаба н соавторов (КЬап&МаспаЬ,1980) также показано, что скорость движения бактерий «а:меп~к линейной функцией протондвнжущен силы. Из изложенного следует, что тмерение скорости движения бактерий яатается удобным способом наблюдения за чиергииши-й мембраны клеток.

Влияние ВХФ на гтет я поддилшость плеток Е,саИ Сй7АМ| Подвижные клетки штамма GR70N растили в синтетической солевой среде (рН 7.2) в присутствии различных концентраций ПХФ. Измерения оптической плотности суспензии и скорости движения клеток при росте в среде, содержащей различные концентрации разобщителя, проводили в одной и той же. пробе. Зависимость роста и скорости движения клеток данного штамма от концентрации разобщите« показана на рис.2. Из результатов, представленных на рисунке, видно, что одни и те же концентрации ПХФ оказывают различное влияние на рост и скорость движения клеток бактерий. Так, например, добавка ПХФ в среду роста в концентрации 50 мкМ приводит к 80% ингибированию скорости движения, в то время как рост подавляется только на 35%. Данные, полученные в ходе опыта, свидетельствуют об эффективности действия ПХф ках разобщителя, а не о его неспецнфнческом влиянии на мембрану клеток Е.со11. Введение в среду роста 80мкМ данного разобщителя приводит к диссипации ДРн* на сопрягающей мембране бактерий, что подверждают результаты по

Рис; 2. Зависимость росте и скорости движения клеток E.coli штамма GR70NCoHKHft тип) от действия разобщителя-протонофором ПХФ.

Клетки растили аэробно при 37°С в синтетической солевой среде (А) (см."Материалы и методы") в присутствии различных концентраций ПХФ.

100% соответствуют в случае роста клеток: |/время генерации = 0.55 ч'1 ; В случае движения клеток -21 тем сек'1.

Скорость движения клеток определяли по методу Шусмита (Shoesmith,|960).

Очевидно, что если устойчивость роста клеток дикого типа и мутанта, содержащего только терминальную оксидазу М-типа, к ПХФ не объясняется его неэффективностью как разобщителя-протонофора, то альтернативным объяснением будет предположение о способности хиналоксидазы М-типа использовать в качестве сопрягающего иона - ион Na*, а не протон. Наблюдаемые нами различия при росте клеток мутантных штаммов в среда*, понижающих Дрн* на сопрягающей мембране Е. coli (см. рнс.1БЗ и рис.2), позволиот нам сделать предположение о том, что хинолоксидаза типа bd обеспечивает рост клеток E.coli в данных условиях в противоположность оксидазе ¿о-типа, т.к. клетки мутанта, содержащего

ЛХ* ( икМ )

только терминальную оксвдазу fco-типа, не растут в присутствии разобщающей концентрации ПХФ (рис. 1В).

Из предположения о способности оксидазы bd-типа использовать не прогонное, а, по-видимому, натриевое сопряжение, прежде всего, следует, что ионы натрия необходимы для поддержания роста бактерий и нормального функционирования хинолоксидазы типа bd в среде, содержащей разобщитель. В связи с этим нами било исследовано влияние различных концентраций ионов Na+ на рост клеток E.coli штамма GR70N 8 среде с нейтральным значением pH (7.2) в присутствии разобщающих концентраций ПХФ (80мкМ).

Влиянии чпнпп Nil* иа рост клеток E.cnll. Как видно из рис. 3, клетки Exoli в присутствии около 200мМ Na+ растут на фоне ЯОмкМ ПХФ без лаг-фазы. Уменьшение концентрации Na+ в среде пр!шерно до 2мМ приводит к полному прекращению роста бактерий. Таким образом, снижение концентрации Na* в среде роста вызывает повышение чувствительности клеток этого штамма к ПХФ, а ионы натрия защищают клетш от действия разобщителя. Аналогичные данные о защитной роли ионов Na+ при росте клеток в протонофорсодёржащнх средах получены в нашей лаборатории и на другом штамме E.coli Doc-S (Avetisyan et al;,1989), а также на клетках представителя рода Bacillus • Bacillus FTU (Semeykina et al,1989).

lOOnWIa

^ 2rM)\i

Рис 3. Действие разобщителя ПХФ на рост клеток Е.соИ ОК70/М(ди/скй тип) в зависимости от содержания в среде роста. Бактерии растили в минеральной солевой среде (состав среды см. рис.1) при рН 7.2, где Ка+ заменяли «а К+.

Стрелкой отмечен момент добавка ПХФ до конечной концетрации 80мкМ,

Исходя из данных, полученных в ходе экспериментов по росту клеток трех штаммов Е.соИ вКТОЫ, СОЮЗ, 00104 в различных условиях, можно сделать предположение о том, что, по-видимому, хинолоксидазы Ьо- и М-типа функционально различаются при росте клеток Е.соИ в условиях, снижающих Дрн* на мембране этого микроорганизма. Об этом особенно ярко свидетельствует опыт по выращиванию клеток

трех различных штаммов в среде с рН 7.2 в присутствии разобщителя ПХФ (см. рис.1,В). Наши предположен«» о функциональном различии альтернативных терминальных оксвдаз в клетках Е.соИ, выращенных при неблагоприятных для данного микроорганизма условиях, не противоречат данным, описанным в литературе. Так, например, при изучении чувствительности роста клеток E.coli к повышению температуры роста (с 30°С до 42°С), а также присутствию в срвде роста некоторых ингибиторов дыхания (цианида, азида и ионов цинка) было показано, что мутанты, не содержащие хиналоксидазу М-типа, не растут в данных условиях, в отличие от мутантов, не содержащих хинодоксидазу Ьо-типа (Wall el al,1992, Delaney et al,1993). Такие'отличия при росте мутантов авторы объясняют тем, что хинолоксндаза М-тнпа, по-вцдимому, имеет иное, отличное от терминальной охсилазы Ьо-типа, физиологическое значение.

Анализ кривых роста различных штаммов Е.соИ позволяет нам сделать заключение, что. хинолохсидаза типа bd защищает клетки от неблагоприятных воздействий при росте в . условиях, снижающих ДРн* на мембране этого микроорганизма, тогда как фермент Ьо-типа, по-видимому, не способен запасать энергию в данных условиях. Этот факт может быть объяснен, если предположить, что хинолоксндаза bd -типа способна использовать ионы иатрия вместо протона и функционировать в качестве первичной Ыа+-помпы.

" Эцергозпвнсимре поглощение Na+ суббактернальнымн чаепшпмн. выделенными in клеток E.coli OR7QN, ПОЮЗ к GQ104. Очевидно, что наиболее веским доказательством существования первичной №+-помпы на терминальном участке дыхятелъноП цепи E.coli явилась бы демонстрация транспорте Na+ против концентрационного градиент» в отсутствие AfTa*. Для изучения того, какая из двух хинолоксидаэ Ьо -или bd -типа может функционировать в качестве первичной Ь'а+-помгга, мы выбрали модель вывернутых суббахтериальных частиц (СБЧ). Эта Модель, являясь более простой по сравнению с целыми клетками, дает возможность детального исследования работы как всей дыхательной цепи, так и отдельных ее компонентов.

* . Как мы.уже ранее отметили, а нашей группе было показано, что СБЧ, выделенные ' из клеток E.cçll, выращенных в условиях, снижающих ЛДн* на мембране, обладают способностью к первичному транспорту . Na+, сопряженному с окислением аскорбата+ТМФД (Avetisyan et al,199I). Мы получили сходные результаты на штамме Е.соЦ GR70N (дикий тип). -,

. Как видно из pitc.4A, СБЧ, выделенные из клеток этого штамма, выращенного при рН 8.6, ' накапливают Na+ при окислении ТМФД ■ присутствии аскорбата. Процесс аккумуляции Na+ везикулами стимулируется диссипирующиы ДРн' протонофорои-разобщителем ХКФ. что говорит о первичности генерации

СБЧ, вщеленные из штампа E.coli GOK^CAcyd), выращенного при рН 8.6, накапливают Na+ при окислении NADH в присутствии ЮмхМ ХКФ (рис.4Б), что свидетельствует о первичности транспорта Na+ на NADHixhhoh окскдоредуктазном участке дыхательной цепи клеток данного штамма. ХКФ-стимулируемый транспорт натри« при окислении NADH ингибировался №+-ионофором ЁТН157

1>ск

л шш

\

а /

/Ь

/ v НЩШИПИ

■А—*

штма t

1,см

120

Рис. 4. Поглощение Na+ СБЧ из клеток E.coli штаммов GR70N(!WKHtt тип) (А), ООЮЗ(о+^) (В) И G0104(o-d+) (В) при окислении ТМФД (А,Б,В) и NADH (Б). Клетки растили в синтетической солевой среде при рИ 8.6.

Состав среды инкубации . СБЧ: 50мМ K2SO4, 5мМ Na2S04, 5мМ КН2РО4, ЗОмМ MgS04, 0.2мМ ЭДТА, 100мМ трйцин-КОН, рН 7.75, 10мМ аскорбат-трис.

Концентрация белка 4.5-5мГ/мл. Реакция начинается добавкой в нулевой момент 500мхМ ТМФД (А,Б,В) или ЗмМ NADH ( Б ).

Добавкй: ЮмкМ ХКФ, 200мкМ ЕТН157. СБЧ во всех случаях предобработаны ДЦКД (ЗО-бОимоль/мг белка) 5 мин при 25°С.

» в а 90 1Д 1,с*

Наши результаты согласуются с данными, ранее полученными в нашей группе. Как было показано в работе Аветисян и со авт. (Avetisyan et al,1989), СБЧ из клеток E.coli, выращенных в условиях, понижающих ДРн* на мембраие бактерий, индуцируют транспортирующую ноны Na+ NADH:xhhoh .оксидоредуктазу. Однако данные частицы не способны транспортировать попы Na+ против градиента при окислении аскорбата+ТМФД, а наблюдаемой при окислении сукцината транспорт ингнбнруется протонофором Х".Ф (рис.5А). Этот факт говорит о генерации

fit «Sa«

1,сяг

Дрн.'- за счет работы Ыа+Ж+-обметшка, использующего энергию Лрн*. созданную терминальной оксидазой Ьо-типа.

СБЧ, выделенные из Мутанта без хинолоксидазы Ьо-типа (E.coii G0104), выращенного в среде с pH равным 8.6, обладали способностью к первичному- транспорту Na+ против градиента, сопряженному с окислением аскорбата+ТМФД (рис.4В). Накопление везикулами ионов Na* активировалось протонофором ХКФ и ингибировалось

А Na+-иoнoфopoм ETHI57. Ингибирование транспорта Na* ионофором на фоне ХКФ указывает на то, что ионы натрия транспортируются против градиента концентрации (в противном случае ЕТН157 стимулировал бы наблюдаемый процесс). СБЧ, выделенные из клеток этого цггамма, транспортировали ионы Na+ в присутствии JOs«M ХКФ я при окислении сукцината (рис.ЗБ). ХКФ-стимулируемый ( транспорт ионов натрия, сопряженный с окислением ТМФД в присутствии аскорбата или при окислении сукцината, позволяет предположить, что хийолоксидаза типа bd может использовать в качестве сопрягающего иона - ион Na+, а не протон и демонстрировать феноменологию первичной натриевой помпы.

В ходе изучения транспорта Nt* СБЧ, выделенными из различных штаммов E.coii, мы получили данные, свидетельствующие о том, что,-при выращивании клеток данного микроорганизма в средах с pH 8.6, в мембране бактерий индуцируется первичная натрий-транспортирующая помпа на терминальном участке дыхательной цепи, & именно, терминальная оксидаза М-типа.

Кроме того, данные, полученные при изучении кривых роста трех штаммов E.coii GR70N, GO 103 и G0104 в условия«, снижающих ¿Рн* на сопрягающей мембране

л I.« <9

Рис. S. Поглощение Na+ СБЧ из клеток E.coli G0103 (о+</-) (А) » G0104 (o-d+) (В) при окисления сукцината. Клетки выращивали в среде с рН 8.6.

Соста» среды инкубации СБЧ: ЗОмМ K2S04, ЗмМ Na2S04, ЗмМ КН2Р04, ЗОмМ MgS04, 0.2мМ ЭДТА, 100мМ трицнн-КОН. рН 7.7J

Концентрация белка 4.3-5мг/мл.

Реакция начинается добавкой * нулевой момент времени 20мМ сукцината-К+.

Добавки: ЮмкМ ХКФ, 200мкМ БТН157. СБЧ преяобработаны Д11КД (30-60нмол»/мг белка ) 5 мин при 25°С

клеток данного микроорганизма (см. рис.Ш, 3), также позволяют предположить, что терминальная оксндаза Ы -типа защищает клетки и тем самым обеспечивает, их рост в этих условиях.

В связи с этим нам интересно было посмотреть, что происходит с содержанием цитохромов Ь и с! в плазматической мембране клеток Е.саН, выращенных при различных условиях.

Содержание иитохромов 6 н ё в плазматической мембране ¡слеток К.епИ при рыршпнванни в различных условиях. Работа по изучению цнтохромного состава проводилась на штамме дикого типа Е,со11 ОЯ70К. Содержание цитохромов Ь и Л в мембранных препаратах иэ клеток этою штамма, вырешенных в средах с нейтральным (7.2) значением рН, а также в среде с рН 7.2, но в присутствии 80мкМ разобщителя ПХФ, приведено в табл. 2.

Тиблнцв.2. Содержание иитохромов Ь и d в мембране клеток E.coli GR70N, выращенных в

различных условиях.

Штамм E.coli Условия росте Содержание цитохромов нмоль / мг белка . »

- d № '

GR70N (дикий тип) рН=»7.2 рН»7.2+ПХФ 0,098*0.020 0.206±0.018 0.500±0.080 0.630±0.|14 0.195±0,005 ; 0.32710.032

' G0104 (суо*) рН*8.б 0.176 0,331 0.J00 /

СОЮЗ (cyd~) рН*8.6 .0 0.787 - ; 0

Из данных, представленных а таблице видно, что присутствие протонофора п среде роста с нейтральным значением рН приводит к увеличению содержания цитохрома <1 в плазматической мембране E.coli GR70N. При пышенздаженных условиях роста бактерий, происходит также увеличение отношения содержания цитохрома d к содержанию uuroxpoMot Л, что говорит 0 преимущественной замене хинОлохсндиы Ьо -типа ^«•рментом М-типа, я не о совместном увеличении содержания двух терминальных окендаз н кленах E.ioU. Для сравнение «таблице приведены данные о цитохромном составе MviuiiTiiux HiTíMMiiB E.cnli GOIOÍ и G01ÍV4.

Инлукпш первичного транспорта Ш* при аыряшимнии Е.соИ GR7QN в прптонофорсодср№"М"» грепшг- Мы попытались установить, существует ли корреляция Между уровнем содержания цитохрома </ в клетках Е.соИ и появлением первичного транспорта ионов Ыа+ на терминальном участке дыхательной цепи при выращивании бактерий в различных условиях.

Рис. 6. Поглощение СБЧ из клеток Е.соИ аК70»(дикн1\ тип), выращенных при рН 7.2 (А) и при рН 7.2 в присутствии ЮОмкМ ПХФ (Б) при окислении ТМФД (Б) и (А), 1

Состав среды инкубации СБЧ: 50мМ ^Оф 5мМ N82804, 5мМ КН2РО4, ЗОмМ 1^С>4, 0.2мМ ЭДТА, 100мМ трпцлн-КОН, рН 7.75, 50мМ аскорбат-трис ( Б ).

Концентрация белка 4.5-5мг/мл. Реакция начинается добавкой в нулевой момент времени 500икМ ТМФД (Б) и ЗмМ ^БН (А).

Добавки: ШмкМ ХКФ, ШмкМ иалшюмицина ( Уа1), 20мкМ моненсина.

СБЧ предобработаны ДЦКД ( ЗО-бОнмоль/мг белка ) 5 мин при 25°.

Регистрируемый транспорт ионов Иа+ при окислении ЫАОН на СБЧ, выделенных ■ из клеток, выращенных при нейтральных значениях рН (7.2), ннгибируется ХКФ (рнс.бА). Вашшомиюш + К+" стимулируют накопление Ка+ в СБЧ, снимая Л'р, образованную на мембране в результате' работы дыхательной цепи. Подавление транслокацин нонов разобщнтелсм-протонофором указывает на вторичность образуемой ДрЫа.

Как показано ранее в нашей группе (Ауе^уап е1 а1,1989,1991), первичный транспорт Ка"1" наблюдается на СБЧ, выделенных из клеток Е.соИ, выращенных при щелочных значениях рН. Мы получипа аналогичные данные на СБЧ, выделенных из клеток Е.соИ штамма ИШИ, выращенного в среде (рН 7.2) с разобщителем-протонофором ПХФ.

СБЧ, выделенные из клеток Е.соИ аООЫ, выращенных в среде с нейтральным значением рН (7.2), но в присутствии разобщающих (80мкМ) количеств ПХФ, способны к накоплению ионов Ка+ в присутствии ЮмкМ ХКФ, сопряженному с окислением аскорбата+ТМФД (рис. 6Б). Активный транспорт На^ иншбировался искусственный ?\,а+/Н+ обменником- моненсином в присутствии ХКФ. Активация аккумуляции нонов

везикулами в присутствии разобщителя ХКФ и ингибирование этого процесса моненсннрм свидетельствует о первичной генерации лрЫш*.

Таким образом, при выращивании бактерий, в описанных условиях наблюдалась определенная положительная связь между повышением уровня содержания цитохрома d а клетках E.coli и появлением первичного транспорта Na*. Снижение ДДН* на сопрягающей мембране клеток E.coli приводит к повышению содержания цитохрома d в плазматической мембране этого микроорганизма, а повышение отношения содержания цитохрома d к содержанию цитохромов Ь говорит о замене хинолоксидазы ¿o-типа на хннол оксид азу bd-тила, способную переключаться на работу в "натриевом режиме".

2. Изучение индукции хинсшпксизазы ¿J-тнпа и клетках E.coli при раадиутц условиях. Природа сигнала для этой индукиии. Известно, что хинолокскдаза ¿¿-типа в доазматической мембране клеток E.coli индуцируется при достаточно разнообразных условиях: при лимитировании роста клеток содержанием кислорода (Rice&Hempflig, 1978), источника серы (Poole&Haddock,1975), при росте в присутствии . цианида (Abheroft&Haddock,1975), при повышении температуры роста (Wall et al.,1992), при смене акцептора электронов (lngledew&Poole,1984), а также при различных мутационных повреждениях компонентов дыхательной цепи (Сох el «1,1970ДисМ et al.1990). Уровень

экспрессии терминальных оксидаз в клетках E.coli регулируется ere - Н fitr -системами

»

(Iuchi et al.,1990; Spiio&Guest,1991). Агс-система состоит из рецепторколо белка ArcB и белка регулятора Are A (Iuchi&I.in, 1988;1асЫ et al.,1989). Природа сигнала ДЛЯ йгс-сисггемы, приводящего к экспрессии хинолоксидазы М-типа, не известна. Первоначально предполагали, что оксидаза (/-типа индуцируется непосредственно понижением концентрации кислорода в среде роста. Однако впоследствии было продемонстрировано, что кислород сам по себе не является сигналом, а опосредованно рсцептируется на уровне дыхательной цепи. Исходя из этого, Ючи с соавт. (Iuchi et,al, 1990) предположили, что рецептируемым сигналом для агс-системи является, увеличение уровня восстановленносги одного из компонентов дыхательной juenn. Мы в данной работе .показали, что при росте клеток E.coli в условиях пониженной А[1н* на мембране, индуцируется хинолокендаза d~ типа, демонстрирующая феноменологию первичной Ка+-помпы. В кашей группе ранее было продемонстрировано, что индукция Nat-энергешки у различных микроорганизмов происходит при- понижении ДРн* 'на сопрягающей мембране (Avetisyan .et , al,1991;Semeykina&Skulachev,1992). Для клеток E-coli этот процесс, коррелировал С увеличением содержания цитохрома d (см.табл.2). Полученные нами результаты позволяли (ыдвннуть предположение, что сигналом для индукции терминальной окснаазы ¿-тина -«клеется снижение ДРн* на мембране клеток Exoli. В пользу этого предположения говорят

данные об описания подобного типа рецепции в системе таксиса у представителя ахебактернй - НЫоЬааепит ¡аПпаг'шт (ВПпкоу е1 а1, 1991,1993).

Подбор условий выраптвания и выбор ппаммоп Е.соН. Такие факторы, как понижение концетрацин кислорода, присутствие цианида, смена физиологических акцепторов электронов или нарушение в функционировании средних или терминальных участков дыхательной цепи в результате мутационных повреждений могут одновременно понижать Арн* и повышать уровень восстановленностн ее компонентов. Для разрешения дилеммы о том, какая из двух гипотез о природе сигнала для замены хинолоксидазы Ьо-типа на оксидазу М-типа ближе к истине (перевосстанопление хакого-либо компонента дыхательной цепи бактерий или снижение Дрн* на сопрягающей мембране), мы подобрали условия роста клеток Е.соН, при которых попытались развести эти два фактора.

Во-первых, это рост клеток Е.соН о присутствии искусственного акцептора электронов - феррициамща и проникающего медиатора феназинметосульфата (ФМС). Концентрации феррицианида и ФМС, при котором рост бактерий замедлялся, но при этом оставался достоверно измеримым, составляли 2.5мМ и 15мкМ, соответственно. Феррициашщ восстанавливался дыхательной цепью клеток Е.соН за счет работы проникающего медиато' ФМС со скоростью приблизительно равной 0.7 мкмоль/мин х мг белка. Рост клеток в присутствии этих реагентов приводил к одновременному снижению Дрн* на мембране и понижению уровня восстановленностн всех компонентов дыхательной цепи данного микроорганизма.

Во-вторых, мы исследовали щггохромный состав двух различных штаммов Е.соН В4093 и В4094, мутантов по генам различных ферментов синтеза рибофлавина: ЫЬС и лЪА, соответственно. Клетки этих двух штаммов не способны синтезировать этот витамин н не могут расти при его отсутствии в среде роста. Как известно, все депвдрогеназы дыхательной цепи клеток Е.соИ содержат ФАД, либо ФМН в качестве кофакторов, для синтеза которых необходим рибофлавин. Таким образом, дефицит по рибофлавину у этих штаммов приведет к блокированию входа восстановительных эквивалентов в начальных участках дыхательной цепн, и, как следствие, в клетках будет происходить понижение уровня восстановленностн всех компонентов дыхательной цепи, а также снижение АДн* на сопрягающей мембране. О последнем говорят данные по измерению дыхания на целых клетках штаммов Е.соН В4094(п'М") и В4089(дикий тип). Скорость дыхания клеток, не содержащих гена лЪА (штамм В4094), значительно снижена ( более, чем в 5 раз ), по сравнению с клетками дикого типа. Таким образом, выращивая клетки мутантпых штаммов Е.соН В4093 и В4094 при лимитирующих концентраДшх рибофлавина, мы создавали

условия, когда одновременно понижался уровень восстановленности всех компонентов дыхательной цепи и Дрн* на мембране клеток данных штаммов.

В третьих, нами было исследовано действие разобщителя ПХФ, который значительно снижает Дрн* и не должен приводить к значительным изменениям уровня восстановленности компонентов дыхательной цели.

В наших экспериментах мы попытались также установить роль вгс-системы в изменении цитохромного состава клеток E.coli при выращивании их в условиях, когда при одновременном понижении уровня восстановленности всех компонентов дыхательной цепи понижается и ДДн* на мембране. В нашем распоряжении имелись штаммы: ECL968 и ECL590 - мутанты по белкам АгсА и АгсВ, соответственно, и штамм дикого типа ECL547. lia этих штаммах мы проводили измерения содержания цитохрома d в клетках, . выращенных при вышеперечисленных условиях.

Содержание цитохрома 4 ut я СЕЧ из клеток g.cgff. выращенных в различных условиях. В табл. 3 (серия 1) приведены данные содержания цитохромов d и b, а также отношение содержания цитохрома d к содержанию цитохромов Ь в мембранных препаратах из клеток E.coli штамма GR7QN. Из данных, представленных в таблице, видно, что при росте клеток данного штамма в присутствии 15мкМ ФМС и 2.5мМ феррицианида содержание цитохрома d увеличивалось, также параллельно увеличивалось и соотношение d/b, что свидетельствует о замене хинолоксидазы бо-типа на хинолоксидазу bd-типа. Наиболее значительно эти показатели повышались при росте клеток E.coli GR70N в присутствии 80мкМ ПХФ. В связи с выдвижением гипотезы о функционировании хинолоксидазы ¿»/-типа в качестве первичной Na+ -помпы, мы пытались установить, необходимы ли ионы Na+ в среде роста для индукции оксцдазы bd-типа протонофором ПХФ. Как видно из табл.3, действительно, содержание цитохрома d (а также отношение dJb) в мембране клеток E.coli, выращенных в присутствии 80мкМ ПХФ, выше при росте в натриевой среде (примерно 100мМ №+), чем в калиевой ' среде (примерно 2мМ Na+), хотя этот эффект и незначителен (рис.7).

В табл.3 (серия 2) и на рис.8 представлены данные экспериментов, в которых шучалось содержание цитохромного состава мембранных препаратов, полученных из клеток двух независимых мутантов E.coli, неспособных к синтезу рибофлавина (84093 и В4094), и клеток дикого типа (В4089). Из результатов, приведенных в таблице, видно, что рост иутантиых штаммов в присутствии лимитирующих концентраций рибофлавина приводи! к значительному повышению содержания цитохрома d (а также и d/b) по сравнению со штаммом дикого типа. Рост клеток E.coli В4093 8 присутствии высоких

концентраций данного Витамина (200мкг/мл) Приводил к уменьшению содержания цитохрома d и соотношения d/b. .

Таблица 3. Содержание цитохромов Ь и Л в мембранах клеток различных штаммов Е.соН в зависимости от условий роста бактерий. (Концентрации добавок в среде роста: ПХФ 80мкМ, ФМС 15мкМ, Кл[Ре(СМ)й] 2.5мМ)

Штамм Е.соН Добавки в среду роста Содержание цитохромов нмоль / иг белка

d ut> м

СшШ-1 GR70N Нет ПХФ 2мМ [Na+]+ ПХФ K3IFe(CN)6l, ФМС 0.077±0.027 0.244±0.ÖJ5 0.129±0.028 0.187±0.028 0.489±0.108 0.428±0.102 0.405±0.110 0.501 ±0.099 0.153±0.022 0.571±0.006 0.342±0.023 0.373±0.000

Сши-1 В4089 (дикий тип) нет 0.12б±0.050 0.384±0.074 0.315±0.070 1

В4093 (Н6С) рибофлавин, 20мкг/мл 0.252±0.050 0.352±0.070 0.71б±0.070

В4094 СПЬА") рибофлавин, 5мкг/мл рибофлавин, 200мкг/мл 0.453±0.09б 0.203±0.049 0.584±0.117 0.422±0.089 0.77б±0.070 0.477±0.01б

Серия 3 ' ECL547 (дикий тип) нет ПХФ K3[Fe(CN)6). ФМС 0.217±0.00б 0.519±0.026 0.21б±0.011 0.456±0.044 0.635±0.130 0.408±0.021 0.477±0.034 0.817±0.041 0.530±0.027

ECL968 (агсА'} нет ПХФ K3[Fe(CN)61, ФМС 0.173±0.030 0.098*0.011 0.01б±0.005 0.547±0.0б8 0.522±0.09б 0.322±0.018 0.299±0.01б 0.191±0.014 0.048±0.011

ECL590 (агсВ-) нет ПХФ K3IFe(CN)6), ФМС 0.194±0.022 0.185±0.014 0.043М.026 0.502±0.038 0.513±0.062 0.334±0 002 0.385М.014 0.305+0.134 0.127+0.078

CzsmA LE392 (ЬипсВ-D) нет ПХФ 0.289-Ш.012 0.532±0.028 0.51710.023 0.705*0.002 0.561 ±0.048 0.75410.041

Однако содержание цитохрома <1 и отношение ШЬ в мембранных препаратах из этого

штамма в данных условиях не достигало значений, полученных в опыте с препаратами из.

клеток дикого типа (ЕхоИ В4089). Это, очевидно, объясняется плохой проницаемостью / * -мембран клеток Е.соИ для этого витамина (Бадрин и др.,1983). .■'-...'

Рис.7. Разностные (спектр восстановленного днтионитом образца минус спектр образца, окисленного феррицианвдом) спектры СБЧ из . клеток Е.соИ GR70N (дикий тнп). СБЧ выделены из клеток, выращенных в синтетической минеральной среде (Б), pH 7.2:

А - в присутствии [Na+]out = ЮОмМ; Б - в присутствии [Na+]out = ЮОмМ и ДОмкМ ПХФ;

В - в присутствии |Na+]uut = 2мМ и 80мкМ ПХФ;

Концентрация белка: 3.1 мг/мл (А) 4.0 мг/мл (Б) 4.5 мг/мл (В) .

Рис.8. Разностные (спектр восстановленного днтионитом образца минус спектр образца, окисленного феррицианидом) спектры СБЧ из клеток Е.соИ штаммов В4089(А), В4094(г|7>Д'ХБ,В) и В4093(г|6С')(Г). СБЧ выделены из клеток, выращенных в синтетической минеральной среде (Б), рН 7.2; А - без добавок; Б - в присутствии 5мкг/мл рибофлавина; В -в присутствии 200мкг/мл рибофлавина; Г • в присутствии 20 мкг/мл рибофлавина. Концентрация белка: 2.1 мг/мл (А)

2.8 мг/ыл (Б); 2.9 мг/мл (В) 3.5 мг/мл (Г)

В следующей серии экспериментов мы попытались установить роль агс-системы в изменении цнтохромного состава клеток Е.соИ. Для этого мы исследовали содержание цитохромов в мембранных препаратах, выделенных из клеток Трех штаммов ЕСЬ547(дикий тнп), ЕСЬ968(АгсА) и ЕСЬ590(АгсВ ), выращенных в условиях, приводящих к снижению Лцц* и понижению уровня восстановленностн компонентов дыхательной цепи.

I Е.соИ ЕСЬМ7 Е.со11 ЕСЬ968

Е.соН ЕСХ590

Рис. 9. Разностные (спектр восстановленного дитиоиитом образца минус спектр образца, окисленного феррицианидом) спектры СБЧ из клеток Е.соИ ЕСХ547 (дикий тип), ЕСЬ968 (АгсА") и Е.соН ЕС1.590 (АгсВ"). СБЧ (для всех штаммов) выделены из клеток, выращенных в гиитетической минеральной среде (Б), рН 7.2: А - без добавок; Б - в присутствии 80мкМ ПХФ; П-в присутствии 2.5мМ Кз[Ре(СЫ)(;] н 15мкМ ФМС. Концетрация белка: для СБЧ из клеток штамма ЕСЬ547: 4.0 мг/мл (А), 5.1 мг/мл (Б) 4.9 мг/мл (В); для СБЧ из клеток штамма ЕС1.968:

3.5 мг/кл (А), 3.6 мг/мл (Б), 3.1 мг/мл (В);, для СБЧ из клеток штамма ЕС1.590:

4.6 мг/мл (А), 3.7 мг/мл (Б), 3.1 мг/мл (П).

Как показано в табл.3 <серия и на рис.9, цитохромный состав штамма ECL347 изменялся сходным образом со штаммом E.coll QR70 при воздействии феррицианида+ФМС или ПХФ, за исключением того, что базовый уровень цитохрома d у данного штамма был более высоким. В мутантных штаммах по белкам АгсВ и АгсА не только не увеличивалось содержание цитохрома d (и dlb) при данных воздействиях, а понижалось по сравнению с контролем. Наиболее заметно это в случае воздействия на клетки присутствия феррицианида + ФМС в среде роста. Таким образом, данные полученные в этой серии экспериментов прямо свидетельствуют о том, что arc система необходима для регуляции уровня экспрессии терминальной оксидазы Ы-типа в данных условиях.

Результаты заключительной серии экспериментов представлены в табл.3 (серия 41. В этой серии мы изучали индукцию цитохрома d пентахлорфенолом на штамме E.coll 1.Е392(Дилс), в котором делегирован unc-оперои, кодирующий Р0Р|-АТФазу. Изучение изменения цитохромного состава в клетках данного штамма проводилось в связи с предположением о том, что в качестве сигнала для синтеза цитохрома d вместо снижения Дрн* на мембране клеток E.coll может выступать понижение уровня АТФ в клетке. В клетках этого штамма падение Дрн* на плазматической мембране не сопровождается измненнями внутриклеточной концентрации АТФ в клетке из-за отсутствия F¿R)-ATOa3u. Как видно из табл., содержание цитохрома d увеличивалось при росте бактерий в присутствии' 80мкМ ПХФ, по. сравнению с клетками, выращенными D среде без разобщителя. Так как ПХФ индуцировал синтез цитохрома d и на клетках клс-мутанта, то гипотеза о понижении Дрц* на Мембране в качестве сигнала кажется нам наиболее вероятной.

Таким образом, результаты, полученные при изучении цитохромного состава в клетках различных штаммов, позволили нам сделать вывод о том, что сигналом для синтеза хинолоксидазы Ы-типа служит не повышение уровня восстановлецностн одногр из компонентов дыхательной цепи, т.к? индукция этого фермента наблюдается и при снижении уровня восстановленное™ всех компонентов электроитранспортиой цепи E.coll. Данные нашей работы позволяют усомниться в правильности гипотезы о рецепции arc-системой редоке-состояниа одного из компонентов дыхательной цепи, а именно, уровня его псревосстаиовленностн, и выдвинуть предположение о рецепции этой системой Дрн* (

илиЛч,)- пыводьГ

I. Способность клеток Escherichia coll к росту при пониженной протондвижущей cine зависит от тина терминальной оксидазы дыхательной цепи. Хинолохсндаза М-типа

обеспечивает рост клеток в этих условиях в противоположность терминальной оксидазе fro-типа.

2. При росте клеток E.coli в условиях, понижающих ДЦп* на плазматической мембране, наблюдается положительная корреляция между повышением уровня экспрессии хинолоксидазы М-типа и появлением первичного транспорта Na+ па терминальном участке дыхательной цепи этого микроорганизма.

3. Сопряженный с окислением ТМФД или сукцината транспорт Na+ суббактериальнымн частицами из мутантного штамма E.coli, содержащего только оксидазу М-типа, стимулируется разобщителем ХКФ, а отличие от СБЧ из мутанта, содержащего только оксидазу fco-типа, где разобщитель ингибнрует процесс аккумуляции Na*. Полученные данные позволяют Предположить, что при росте клеток в средах с высоким значением pH или в присутствии разобщнтеля-протонофора хиполоксидаза Ьг/-типа способна использовать ион натрия в качестве сопрягающего иона и, таким образом; функционировать в качестве первичной электрогенной Ыа+-помпы.

4. Индукция терминальной оксидазы М-типа в клетках E.coli осуществляется независимо от редокс-состояния компонентов дыхательной цепи данного микроорганизма.

5. Полученные нами данные по изучению экспрессии хинолоксидазы М-типа у E.coii позволяют выдвинуть предположение, что понижение уровня Д(Тн* на плазматической мембране может являться сигналом к индукции данного фермента.

6. Регуляция уровня экспрессии терминальной оксвдази М-типа в условиях роста, сопровождающихся понижением протошшижущей силы на плазматической мембране клеток E.coli, осуществляется при участии агс-системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Аветисян A.B., Ацаркнна Н.В., Богачев A.B., Белогрудов Г.И., Гринкевич В.А.,

Муртазнпа P.A., Мунтян М.С., Скрнпннкова Е.В., Скулачев В.П., Устияц B.C. Сравнительное исследование протонных и натриевых генераторов трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов Na+ и Н+ в бактериях. 1 Всероссийская конференция "Белковая инженерия", Москва, 1994, стр.4.

2. Avetisyan A.V., Bogacliev A.V., Murtasina R.A. and Skuiachcv V.P. involvement of a d-

type oxidase in the Na+ -motive respiratory chain of Escherichia coli growing under

IowAJIh* conditions. FEBS Lett. 1992, v.306, pp. 199-202.

. 3. Bogachev A.V., Murtasina R.A., Shestopalov A.I. and Skulachev V.P. The role of proton and

** ß sodium potentials in motility of Escherichia coli and Bacillus FTU. Biochim.Biophys.Acta.

1993, v.l 142-, pp.321-326.

4. Bogachev A.V., Murtasina R.A. and Skulachev V.P. Cytochrome d induction in Escherichia

coli growing under unforable conditions. 1993, FEBS Lett, v.336, 75-78

5. Avetisyan A.V., Bogachev A.V., Murtasina R.A. and Skulachev V.P. Involvement of a d- '

type oxidase in the Na+ -motive respiratory chain of Escherichia coll growing under low ДЦн* conditions. 1992, EBEC Reports, 1992, v.7, p.57.

6. Avetisyan A.V., Bloch D.A., Bogachev A.V., Drachev L.A., Muntyan M.S., Murtasina R.A.,

Skulachev V.P. and Ustiyan V.S. The proton-motive and sodium-motive terminal oxidases of Bacillus FTV and Escherichia coli. IUPAB Conference "Major electron transport complexes in photosynthesis and respiration'', Gmunden, Austria, 1993, p.9.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТФ- аденозинтрифосфат; ДЦКД - N,N'-дицииогексилкарбодиимид; ЕТН157 -N.N',-д)10сшил-К,М',-дифенкл-1,2-фЁншендиацетаыид; НАДН - никотинамкдадениндинуклеотид восстановленный; СБЧ - суббактериальные частицы; ПХФ- пентахлорфенол; ТМФД - N.N^N'.N',-тетрамегнл-п-фенилендиамин; грицин Ы-трис(гидрож:симетил)метклглицин; трис

трис(гидроксиметил)аминометая; ФАД - флавннадеииндину1леотид; ФМС - феназинметосульфат; ФМН - флавиниононуклеотид; ХКФ( - м-хлоркарбоннлциашшфежлщар&зон; ЭДТА этилендиаминтетраацегат; Л»,' ■ трансиембранная разность электрических потенциалов; ДДц»+ -трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов натрия; ДДн+ - трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода

3,1. Ш> т if. ¡00 тмк