Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии терминальной оксидазы bd-типа и сукцинатдегидрогеназы Escherichia coli при понижении протондвижущей силы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии терминальной оксидазы bd-типа и сукцинатдегидрогеназы Escherichia coli при понижении протондвижущей силы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

Ни правах рукописи

РЕ1УЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ТЕРМИНАЛЬНО!! ОКСИДАЗЫ bei- ПША II СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Escherichia coli ПРИ ПОНИЖЕНИИ Ш'ОТОНДППЖУUUiÜ СИЛЫ.

03.00.04 - биохимне

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата Гшолошчсских наук

Москва - 1'!Ч6

Работ;; вмселнепа ¡; отделе Сим тергешкн НИИ фишко-хнмическон litm юпш им. A.H.BeJioiepcKoro МГУ.

Научный руководитель: академик РАН,

профессор В.11. Скулаче»

Официальные оппоненты: доктор бнолошческнх наук,

профессор В.К.Акимепко

кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник В.Л.Габап

Ведущая организация: Институ! биохимии им. А.II. Баха l'Ail

Защита состоится -?' О*-*- 1996 года в Н^ГзОмин. ма заседании Специализированного Сонета Д.053.05.32 по присуждению ученой cieiiemi кандидата наук по адресу: 119899. г. Москва, Воробьевы Горы, Вполошчеемш факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факу n.ieia

МГУ.

Автореферат разослан '2У" с<ь<|^лД199б года

Ученый секретарь специализированного coi'c га кандидат биологических ьаук

М.В. Иванов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из значительных проблем, стоящих перед живыми организмами, является необходимость адекватного ответа на изменение многочисленных факторов внешней среды. В случае прокариотических клеток, из-за офаничешюсти их генома, наиболее целесообразным решением данной проблемы явился бы путь рецепции каких-либо интегральных параметров. В качестве такого параметра может выступать, например, протондвижущая сила. Действительно, из-за того, что Дрн* продуцируется на сопрягающей мембране за счет большого количества различных процессов, ее величина будет зависеть от концентрации всевозможных дыхательных субстратов, акцепторов элктороноБ для дыхательной цепи, присутствия различных ингибиторов электронного транспорта, а так же и от интенсивности сгета (для фототрофных микроорганизмов). В таком случае рецепция единственного фактора - ДДн+ - должна позволять бактериям ориентироваться в большом многообразии изменяющихся параметров среды обитания. Действительно, для НаЬЬаМегшт заИпапит было продемонстрировано наличке Дрц* -зависимой системы таксиса (В1Ыкоу е1 а1., 1991,1993). С другой стороны, если микроорганизм лишен возможности избежать неблагоприятных условий посредством таксиса, рецепция уровня протондвижущей силы могла бы давать сигнал также и для переключения метаболизма бактерии на альтернативные пути. К примеру, для поддержания высокой внутриклеточной концентрации АТФ в условиях иопч,кенноИ АЦц* достаточно было бы активизировать путь гликолиза и, соответственно, связанных с ним процессов субстратного фосфорнлирования. Способ этот, однако, недейственней в случае роста бактерий на несбраживаемых субстратах, таких, как, например, сукцинат. Альтернативным механизмом для поддержания уровня АТФ может служить переключение энергетики микроорганизма с протонного на натриевый цикл (,Чки1асЬе\\ 1984,1989).

За последние голы в нашей группе была показана возможность ф\ нкционирования пенротонного ("натриевого) цикла у Е.соИ и ВасШих РТи (/\\elisyan с! а1., 1991). Индукция нафий-транслоцируюшей дыхательной цепи у данных чикрооргантмон происходила именно при понижении Дрц+ на сопрягающей мембране (выращивание в присутствии разобщителей, цианида, а так же при высоких значениях рН) (Аветисян и др., 1990; 8етеукчпа&5ки!ас11еу, 1992). Также нами были

получены указания, что одним из генераторов Дрм/ в дыхательной цени Е.со яштяется терминальная оксидаза Ы-типа (Aveiisyan et al., 1992). В связи с ли интересным казался вопрос о том, что является сигналом для индукции тин фермента (то есть замены хинолоксидазы Ьо-типа (протонной помпы) i хинолоксидазу М-типа (предположительно натриевую помпу)). В группе Липа в 199 году была выдвинута гипотеза о влиянии окислительно-восстановительного состоит -компонентов-дыхагеяьной-цепи-на~ретуляцию экспрессии цитохрома d (Iuchi el al 1990a). В нашей группе, однако, были получены экспериментальные результат опровергающие данную гипотезу (Bogachev et al., 19936). Мы предположили, mi сигналом для индукции терминальной оксидазы bd-типа у E.coli является понижен! уровня протоццвижущей силы. Таким образом, основной целью настоящей работ явилось укснение во?можности функционирования Дрц* в качестве фактор регулирующего степень экспрессии цитохрома d.

В настоящее вре.чя известно, что уровень экспрессии терминальных оксидаз Ь и ¿d-типа у E.coii регулируется arc- и //¡/--системами (Iuchi et al., 1990; Spiro&Gue; 1991). Поэтому было бы также важным изучить, какая из этих регуляторпых систс ответственна за индукцию хинолоксидазы bd- типа при понижении ДДн* i сопрягающей мембране данного микроорганизма.

Целью настоящей работы было: 1) установить природу сигнал регулирующего уровень экспрессии терминальной оксидазы bd-тина у E.coli-, определить вклад arc- и fnr- регуляторпых систем в индукцию хинолоксидазы bd-тш при понижении уровня протондвижущей силы; 3) изучить регуляцию экспресс! основных ферментов E.coli, синтез которых опосредован влиянием я/г-системы, и| изменении различных факторов внешней среды.

Научная новизна работы. В ходе исследований впервые пзмерс! индуцирующие цито/фом d и Дрп'-Диссипирующие активности различи! разобщителей на интактных клетках E.coli. Полученые данные подтверждают гипотс о роли понижения уровня ДРн* в индукции синтеза терминальной оксидазы bd-тш Установленно также, что «гс-система (в отличие от //¡/--системы), вовлечена в проце повышения уровня экспрессии цитохрома d под действием разобщителей. Анал регуляции экспрессии цитохрома d и сукцинатдегидрогеназы при изменен различных факторов внешней среды позволяет выдвинуть предположение

существовании у E.coli какой-то дополнительной регуляторной системы (отличной от arc-, fnr- и аррУ-систем). Эта система, по-видимому, участвует в регуляции экспрессии сукцинатдещдрогеназы; сигналом для ее активации служит повышение уровня постановленное™ какого-то компонента дыхательной цепи.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты облегчают понимание процесса адаптации энергетического метаболизма E.coli как при переходе из аэробных условий роста в анаэробные, так и при росте клеток в условиях, сопровождающихся понижением протондвижущей силы на циго плазматической мембране данного микроорганизма. Данные, указывающие на существование у E.coli какой-то дополнительной, на настоящий момент неизвестной регуляторной системы, мо1ут служить стимулом для поиска и идентификации этого регуляторного компонента.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на российско-германском симпозиуме молодых ученых (Оснабрюк, Германия, 1994) и на Международной конференции "Мембранная биоэнергетика" (Москва, 1995). Работа также была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включающей разделы "Магериалы и методы", "Результаты" и "Обсуждение"), выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование бактерий. Характеристика использованных в работе штаммов E.coli приведена в Таблице 1.

Условия выращивания клеток. Для выращивания клеткок E.coli различных штаммов использовали жидкую среду (среда А) следующего состава: 22мМ КН2РО4, 20мМ Na:IIP04, ШмМ NaCl, 1<)мМ (NH4):S04, 0,4% (объем/объем) глицерин (или 0,4% мальшза), 0.05% дрожжевой экстракт, 1мМ MgS04 и 1мкг/мл тиамин (pH 7,4). Клетки /•.'.( "Ii выращивали в аэробных условиях на качалке "Quens Orbital Shaker" (Англия) в качаючных колбах обьемом 250мл с 20мл питательной среды при 200 об/мин и 37ÜC. При изучении влияния различных веществ на уровень экспрессии цитохрома d или сукшшатдспщрогеиазы суспензию клеток E.coli культивировали, пока концентрация

клеток не достигала величины ixlO8 кл./мл. Далее после добавления к суспап используемых индукторов г.летки 1<1:кубирова ш в течение 2х часов. Но исс.х стуча конечная концентрация kju юк не превышала 5x10s кл./мл. чго соотвекчвуе! серели логарифмической фазы роста Е.со/,. При н¡учении экспрессии фермешов Г.лоИ анаэробных условиях, kjicikii расти 11 в полностью заполненных шпагелмюн срел пробирках объемом 40мл i притертми пробками при 37' С в среде Л, с добавлепн -6ОмМ-ДМ€0-и—Н1кМ-мггшбда,га—ачмоншП При изучении влияния Na+ па уроне экспрессии цнтохрома d или сукипнатдегидрогеназы клетки выращивали ajpofmo среде А, где все натриевые соли были заменены на соответствующие каливые со (остаточная концентрация Na+ не превышала 1,5мМ).

Таблица 1. Штаммы E.coli, используемые в работе.

Штамм E.coli Генотип Ссылки

GR70N /•'" thi rpsl. ,ца1(?) StrK Oden et al..!990

1:CL5-17 B( 1.525*; sdh^(sdh-lac) SirR luchi&Lin,19S8

всим EC1.S25*; sdli+ ^(sdh-lac) arcBl SnR Iuchi et al.,1989

ECL9o8 stt.:i+$(sdh-Uic) urcA131 SirR Iuchi&Lin, 1992a

f.CL901 f('i.525*; let* $(lctD-lac)SlrK luchi et al.,199 i

ECL942 ECL943 ECL944 ECl.Sii*; cyd* i)(cyd-laci bin* I-CL942; ип Л \ zjj\:TnIO HCL942; w.B 1 ад::Тп10 Iuchi&Lin, 1992a

МС41 00(A.GC 1001) МОИХ)" cyd' ф(cyd-lac) bia Cotter&Gunsalus,! 992

PC2 MC4100(M;CI001); &Jnr

Примечания: I. ecl525 faraDI.!» A(argF-ltu) U169 r/isLlSO rclAl flb-530! pnF2S

deoCI &I>J-I0l

2. MC4I00 ' F'araDI.-1) AfargF-lac) Ulb9 rpsl.150 relM jlb-5.IO{ pi\F25 deoCI rbsR, thi

Определение Р-галактозидазной активности в клетках Е.соИ проводили модифицированному методу Миллера (Миллер, 1976). Для увеличения проннцасмс

мембраны E.coli клетки обрабатывали хлороформом в присутствии додецилсульфата натрия.

Скорость движения клеток E.coli GR70N измеряли по методу Щусмита (Shoesmith, I960) с модификациями, описанными в (Bogacliev et al., 1993а). Измерения проводили при комнатной температуре, используя оптический микроскоп МБИ-3 с фазово-коптрастным устройством КФ-4. Концентрация клеток в ходе опыта была 1х108 клеток на миллилитр.

Концентрацию бактериального белка определяли микробиуретовым методом, используя дезоксихолат натрия для солюбшшзации клеток. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (Merck).

Регистрацию дыхания клеток E.coli проводили с помощью электрода Кларка закрытого тина и полярофафа LP 7е (Чехословакия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами была выдвинута гипотеза о возможной роли уровня Дрн*, генерируемой на цитоплазматической мембране Escherichia coli, как фактора, регулирующего синтез терминальных оксида! в клетках данного микроорганизма (Bogachev et al., 19936). В связи с этим важно было исследовать действие Арн+ -дг.ссипирующих агентов, а именно разобщнтелей-протонофоров, на уровень экспрессии хииолокендазы /«/-типа у E.coli.

Однако необходимо было учесть, что любые проюнофоры, помимо понижения уровня АДн*, могут оказывать побочные воздействия на метаболизм микроорганизмов. Например, нельзя исключить изменения редокс-соетояпня компонентов дыхательной цепи E.coli в присутствии данных агентов, так как у этой бактерии протондвижущая сила генерируется в основном за счет окислительно-восстановительных реакций. По пому факт индукции терминальной оксида и,г М-тииа разобщителями сам по себе пс может являться однозначным доказательством того, что уровень экспрессии пшохрома d регулируемся именно величиной Лиц*.

Мы решили исследован. влияние нескольких структурно различных ироюпофоров, значше п,по обличающихся по эффективности диссипации Лрп*. Особое внимание уделяли вопросу, будет ли наблюдаться корреляция действующих концентраций каждою протонофора в случае процесса снижения уровня Лрн* и в случае процесса индукции экспрессии терминальной оксидазы bd-типа в клетках

Е.соИ. И только при хорошей корреляции между индуцирующим и разобщают!): эффектами у разных нротонофоров можно будет сделать вывод о том, что имени понижение уровня ДДн* является сшналом для индукции терминальной окешш 11.1 Ы, типа.

1. Эффективность различных протонофоров в качестве индукторов пр.мшппышп _оксидачы Ы-типа.-

В нашем распоряжении имелись штаммы Е.соИ, в которых генетическим методами были соединены гены сус1АВ (кодирующие терминальную оксидазу /л/-тип; и 1асХ (кодирующий фермент Р-галактозидазу). Таким образом, определяя [ галактозида:<ную активность в клетках этих штаммов, выращенных при различи!/ условиях, можно судить об уровне экспресс» цитохрома г/.

- хло рлмфеыикол ---------

Л

Рисунок 1. Зависимость урош экспрессии цигохроа (/ ( времени роста и нрисутсгш протонофора ПХФ у /:. а ЕСЬ942 при выращивании аэробных условиях глицерине.

Добавки: хлор^мфеникол (л бавлен в нулевой моме времени) - 0,1 мг/мл; ПХФ - ( мМ.

Время О^ии)

Зависимость Р-галактозидазной активности (а, следовательно, п урон экспрессии цитохрома с/) от времени роста Е.соИ в присутствии разобщителя П> представлена на Рис.1. Как видно, после внесения протонофора ПХФ в среду ро< наблюдалась индукция хинолоксидазы ¿¿-типа без сколько-нибудь значительной л фазы. В тоже время при инкубации в присутствии антибиотика хлорамфенико

блокирующего синтез блка у прокариот, не происходило повышения р-галакгозидазной активности после добавки ПХФ. Таким образом, можно сделать

I е с

5 о-)—.—|—■—|—■—|—■—|—I—|—■—|

« о £00 400 600

[ТТРЕ] (мг.М)

[ПХФ] (мкМ)

Гтмкж 2. Ъшкимпс! к уропня жепресеии гсрмнналыюи скатан.! М-тнпа от коицетрации р.и [|ги||.|\ ирикшофорин и среде роста при выращивании I. шробпмч условиях на глицерине к ] с! о к /..,,)/) ппаммон 1.С1.9!: (диким тип), ЕС1.')4МЛапА) и Е СиШ(АчгсВ).

вывод, что повышение |)-галакн>1идазной активности под действием ПХФ спя кию исключительно с индукцией синтеза этого фермента, а не с увеличением cm ферментативной активности. В отсутствие х.торамфенпкола полумаксима и.мое увеличение экспрессии цитохрома d наблюдалось па 2()й минуте инкубации клетк с ПХФ, а после двух часов роста с этим агентом содержание цитохрома d и клс1ка\ >же не изменялось значительным образом. В дальнейшем при исследовании дейавия различных протонофоров на экспрессию цитохрома d мы выращивали клетки i присутствии данных агентов в течение двух часов.

На Рис.2 представлена зависимость ß-галактозидазнои активности в клока* E.coli от концентрации различных протонофоров в среде роста. Как видно из ли* данных, все использованные разобщители в той или иной степени повышали уровеш экспрессии хинолоксидазы М-типа: наиболее эффективными индукторами оказалпа протонофоры ХКФ и ПХФ (С()5 - 15 и 40 мкМ, соответственно). В то же врем; нротоиофоры TTFB и ДНФ демонстрировали очень слабый по огношению i цитохрому d индуцирующий эффект и поьышагш экспрессию данного фермента шпи при концентрациях, больших чем 100 мкМ. Таким образом, полученные резулыап позволяют расположить протонофоры в следующей последовательности (в зависимосп от их индуцирующей активности) : ХКФ > ПХФ > TTFB > ДНФ. Прнвсденна: последовательность отличается от той, в которой были бы расположены даннм разобщители в зависимости от их протонофорных активностей, измеренных па закп классических объектах биоэнергетики, как митохондрии или черная мембрана (ХКФ : TTFB > ПХФ > ДНФ). Однако в случае E.coli ряд протонофорных активностей цл этих разобщителей может значительно отличаться от соответствующего ряд; полученного на других объектах. Поэтому следующим этапом нашей работы был измерение г.рогонофориой активности различных разобщителей на натнвных клетка E.coli.

2. Измерение Дрн* -диссипирующей активности разобщителен на ингактных

клетках E.coli.

E.coli, являясь грамотрицательной бактерией, обладает перннлазматичсско мембраной, которая служит барьером для проникновения в клетку многи гидрофобных соединений. В связи с этим использование такого классического мето; детекции величины Дер, как измерение распределения липофилыюго катнеи

тетрафенилфосфония (ТФФ+), не представляется возможным. Более того, до настоящего времени не был разработан способ прямого измерения величины Дрн* на нативных клетках Е.соИ. Нами был предложен метод качественной оценки протондвижущей силы, базирующийся на принципе измерения подвижности клеток Е.саН. Как известно (КЬап&МаспаЬ, 1980), скорость движения Е.соН является линейной функцией Дрц+ при надпороговых значениях этой величины (для Е.соИ приблизительно при Дрц* > 20-30 шУ). Таким образом, измеряя ингибирующий эффект различных разобщителей на подвижность клеток Е.соИ, можно судить о протонофорной активности данных соединений. На Рис.3 представленны данные о влиянии различных протонофоров на скорость движения клеток Е.соН. По полученным результатам можно расположить разобщители следующим образом в зависимости от их протонофорной активности: ХКФ > ПХФ > ТТИЗ > ДНФ.

100

Ю1"

ДНФ

ТТГВ*

10

~г2~ 10

10"

[протонофор] (мкМ)

Рисунок 3. Зависимость скорости движения клеток Е.соИ 0170Ы от концентрации различных протонофоров. 100% скорости движения , соответствовало 20 мкм/сек.

Если сравнить данный ряд с последовательностью, в которой располагаются изученные протонофоры в зависимости от их способности индуцировать экспрессию цигохрома (!. можно обнаружить хорошую корреляцию между этими эффектами (Рис. 4а). Более того, выбранные нами разобщители повышали экспрессию терминальной окснлазы /«/-типа в том же диапазоне концентраций, в каком они влияли на уровень прогондвижущей силы (см., например, Рис.4б).

150даяиигибироЕзния движения [ПХФ] (мкМ)

(мкМ про : оно фора)

Рисунок 4. Соответствие, индуцирующего цитохром <1 и Дрц+ - диссшшрующего >ффсКН различных прогонофоров.

А: Соответствие концентрации различных разобщителей, необходимой для 50 повышения степени экспрессии терминальной оксидазы Ы-типа и для 50% поиилеш скорости движения у Е.соИ.

Б: Зависимость уровня экспрессии цитохрома с1 и скорости движения от концентрат протонофора ПХФ:

а - р-галактозидазная активность; б - скорость движения.

Итак, • совокупность приведенных данных говорит о том, что протопофоры разной химической структурой вызывают у Е.соИ, одновременно с понижением Др| повышение экспрессии терминальной оксидазы ¿¿/-типа. Таким образом, ипдукц; цитохрома д. под действием протонофоров, скорее всего, опосредована падеиш уровня Дрн* 113 цитонлазматической мембране, а не каким-то нсспсцифнчссю эффектом этих веществ на клетки Е.соИ.

В то же время мы должны учесть, что от уровня Дрн* на сопрягающей мсмбра также может зависеть и редокс - состояние компонентов дыхательной цепи (в случ наличия у клеток Е.соИ дыхательного контроля). В таком случае индукция цигохро с/ может не напрямую зависеть от понижения уровня протондвижущей силы, а бь опосредованной изменением окислительно-восстановительного состояния дыхательн цепи. Однако, как известно из литературных данных (ТБисМуайКозеп, 1980) и

нашим собственным наблюдениям, клетки E.coli, находящиеся в логарифмической фазе роста (то есть в условиях, при которых проводились все эксперименты), практически не повышают скорости дыхания при добавлении разобщителей, то есть не обладают способностью демонстрировать дыхательный контроль. К тому же, если бы индукция хинолоксидазы bd- типа у E.coli была бы опосредована переходом дыхательной цепи из состояния 4 в состояние 3, то процесс повышения экспрессии этот фермента достигал бы насыщения при низких концентрациях разобщителей, при которых только начинается снижение уровня протондвижущей силы. Однако из полученных нами данных следует, что повышение экспрессии цитохрома d наблюдается во всем диапазоне концентраций разобщителей, при которых они оказывают воздействие на уровень Дрц+ (см., например, Рис.4б). В свете описанных результатов гипотеза об индукции цитохрома d под действием изменения редоке-состояния компонентов дыхательной цепи представляется маловероятной.

Итак, подводя итог данному разделу, мы можем заключить, что наши •эксперименты подтверждают правильность гипотезы о роли Дрн* как фактора, регулирующего уровень экспрессии терминальной оксцдозы bd-типа.

3. Роль arc и fnr регуляторных систем в индукции цитохрома d под действием

протонофоров.

Как известно, регуляция экспрессии терминальной оксидазы М-типа осуществляется под действием двух регуляторных систем - arc и fnr (Iuchi et al., 1990; Spiro&Guest, 1991). Нам показалось интересным установить роль этих систем в процессе индукции цитохрома d различными разобщителями. Как видно на Рис.2, у мутантных штаммов E.coli, не содержащих белков art-системы, все использованные раюбщители не вызывали повышения уровня экспрессии хинолоксидазы М-типа. В то же время у мутаптного штамма, не содержащего белка FNR, индукция цитохрома d ироншофором ПХФ совершенно не отличалась от подобной индукции этого фермента на nioiennoM штамме дикого тина (Рис.5). Таким образом, из полученных данных можно сделать заключение об участии art-системы (но не /яг-системы) в процессе повышения уровня жспрсссии терминальной оксидазы /«/-типа под действием рагшчных разобщителей. Можно было бы предположить, что сенсорный белок arc-

системы - АгсВ функционирует в качестве "нрогомстра", то есть рецептора урони: протоидвплущей силы.

Рисунок 5. 'Зависимое! i. \powi •жснресеии цитохрома J и концентрации ПХФ и среде роч

при выращивании в аэробны условиях на глицерине еледуюшп штаммов E.coli:

Д - МС4100 (дикий гни) □ - РС2 (Afnr)

ЮС

[ПХФ] (мхМ)

Интересно отмстить, что структурные свойства данного белка делают бол» вероятным его участие именно в процессе рецепции протондвижущей силы, неже.1 каким-либо др>гам функциям. Это утверждение связано с тем, что рецептор Arc содержит только "передающий" и "принимающий" цитоплазматические домены, в время как ларактерным для белков данного класса периплазматический сснсорнь домен отсутствует. Таким образом, остается предположить, что за функцн рецептиропания каких-то сишалов внешней среды ответственней небольшой, учаск белка АгсВ, состоящий из двух трансмембранных а-спиралей. Это предположен! хорошо согласуется с гипотезой о рецепции белком АгсВ уровня ДГ'н\ гак к измерение протондвижущей силы сенсорным белком возможно лишь на урон сопрягающей мембраны. Интересно отметить, что в составе рецептора Ап отсутствуют редокс-активные простетические группы (то есть FeS-кластср цитохромы, флавины или существенные для осуществления рецепции остат цистеина), которые могли бы делать данный белок чувствительным к изменеш окислительно-восстановительного состояния дыхательной цепч. Кроме toi описанный белок, как уже говорилось, лишен рецепторного домена, посредств которого возможно было бы избирательно связывать окисленные или восстановлен)!

формы какою-либо компонента дычаюлыюн пени. Все это делает крайне макшеронпюи пнкнау о ноjmoaiiocmi функционирования белка АгсВ в качестве "ре.юксомсфл"

Хочек'я оiмеI и 1 ь. чю мн я и данной работе мы все время оперировали 1 uInvi11!см .Арц'. > II.к' iKi какич-шбо данных о iiK.i;uie различных составляющих проишдвижушеи ей n.i (Aip и АрП) в роуляшно экспрессии цитохрома d. Однако, так как все эксперпмет ы по индукинн хиполоксидазы bd- типа проводились при нсГпральных значениях рП среды роста (то есть в условиях, когда ДрН~0 и практически вся Дрц4 находилась в виде Дф), можно заключить, что, по крайней мере, понижение уровня Дф вовлечено в процесс индукции цитохрома d. В то же время роль АрН остается на сегодняшний день невыясненной, и, таким образом, неизвестно, выступает ли белок АгсВ в качестве "Арц* -метра" или "Дф -метра". Теоретически первая возможность представляется предпочтительной, так как переключение с прогонной энергетики на натриевую требует измерения Дрц*, а не Дф.

4. Регуляция экспрессии сукцинатдегндрогсназы под действием протонофоров и цианида при различных условиях выращивания.

Итак, нами показано, что рост E.coli в присутствии протонофора ПХФ на глицерине в аэробных условиях приводит к увеличению степени экспрессии цитохрома d. Подобного эффекта не наблюдалось у мугантых штаммов, не содержащих белков г/гс-снстемы. Из этих данных мы делаем вывод о возможности функционирования белка АгсВ в качестве сенсора уровня Дрц+- В то же время известно, что arc система ответственна не только за индукцию терминальной оксидазы bd-типа, но также и за репрессию большого количества ферментов аэробного метаболизма, таких как сукципатдегидрогеиаза, мембрансвязанная лактатдегадрогеназа, цитохром о и так дааее (Lin&Iuchi, 1991). Таким образом, если гипотеза о функционирования белка АгсВ к качестве "протометра" верна, то понижение уровня Дри* на цитоплазматпческон мембране E.coli должно приводить к репрессии синтеза, например, сукцииатдегидрогеназы.

На Рис.6 представлена зависимость |$-галактозидазной активности клеток E.coli мутантного штамма со слитыми генами sdhCDAB (кодирующие фермент

сукцинатдегидрогеназу) и 1ас2 (кодирующим фермент р-галактозидазу), соответственно, и уровня экспрессии сукцинатдсгвдрогеназы от концентра] протонофора ПХФ в среде роста. Как видно, содержание сукцинатдепщрогепазы менялось при росте Е.соН в присутствии вызывающих индукцию цитохром; концентраций ПХФ (Рис.6) и ХКФ (данные не представлены). Однако, как показ на Рис.7, при росте клеток Е.соН в присутствии цианида наблюдалось как повыше содержания цитохрома с1, так и понижение содержания еукцинатдегндроген; Особенно хочется отметить, что цианид вызывал индукцию терминальной оксид Ьс1-типа и репрессию сукцинатдепщрогепазы в совершенно одинаковом дианач концентраций, что говорит об ответственности одной и топ же регуляторной сисп за осуществление этих двух процессов.

Рисунок 6. Зависимость уровня жснрессии сукцинатдегидрогенан концентрации ПХФ в среде р при выращивании в аэроГ условиях на глицерине кл следующих штаммов Е.соН:

А - ECL547 (дикий гни);

□ - ECL969 (ЛагсА)

) 1500-

с «

i

3 1000-

500-

• i ■

20

■-1—г 40

60

• I ' 80

"юо

[ПХФ] (мкМ)

Сходные результ аты но деист пню paio6iniiie.4cii и цианида на уро экспрессии цитохрома d и сукпшшлспиротши бьпи получены нами и выращивании клеток Е.соН и прнсунчвни 1лм>ю сбраживаемою чыевода. мальтоза. Также хочекя oimciiiii.. чю рс1>1яция мембраневя tai лактатдепщрогеиазы ( ю ссп, еще одною <ii i - i.iiuk нмш о фермен ial. по вн шм очень похожа па рауляцню c\MHiiiai.u-iii.ipoicnaiu. Уровень ичпрс лактатдегидротеиазы поннжачея при а)робном вырашивапнн Е.соН в npiu\ic

ппанида и совершенно не п ¡меня ich при аэробном выращивании в присутствии ироюпофора ПХ<1>.

\

и

I

с

я X

5 ,,____

0 ^

t, X

§1500

1

>4

I юоо

I

I 500 о

X А

S s

пигохроы d

с укплнатде гвдроге нам

■ I •

25

50 75 100 125 150 [NaCN] (l-ir.M)

Рисунок 7. Заиисимосп. уровня жспрессии цнтохрома d и сукшшат-jiei luipoi сназы от концентрации цианида в среде роста при нырашлнашш и аэробных условиях па глицерине клеток следующих штаммов E.colv.

□ - ЕСЬ942(ф(су</-/асг)) Д - Е(Х547(ф(лс/Л-/а«))

Итак, ннтохром d нндуцпрусчся протонофорамн при участии иге системы, в то время как уровень экспрессии сукцинатдепщрогеназы и лактатдешдрогеназы не изменяется в присутствии этих веществ, хотя регуляция двух последних ферментов несомненно осуществляется посредством «гс-системы (Lin&Iuchi, 1991). Таким образом, наблюдается совершенно явное противоречие, объяснить которое можно двумя способами: I) повышение содержания цнтохрома d в клетках E.coli иод воздействием разобщителем опосредовано не arc, а какой-то другой регуляторной системой, присутствие же «гс-системы лишь необходимо для развития данного эффекта; 2) регуляция экспрессии сукцинатдспщрогеназм и лактатдешдрогеназы построена более сложным образом, и для развития действия сиги ала о падении Дрц\ опосредованного шг-еистемой, необходимо воздействие еще какой-то регуляторной системы. Если второе предположение верно, то эта неизвестная регуляторная система должна "включаться" в присутствии цианида и быть в "выключенном" состоянии в присутствии разобщителей. Основным отличием этих эффекторов (то есть разобщителей и цианида) является то, что хотя все они приводят к падению уровня Дрн*, но действие цианида также (и и отличие от действия протонофоров) приводит еще и к значительному перевосстановленню различных компонентов дыхательной цепи из-за ингибирования этим реагентом терминальных окендаз E.coli.

Таким образом, если приведенная выше цепь рассуждений верна, то уров сукцинатдегидрогеназы у Е.соП должен понижаться под воздействием разобщите только при восстановлении компонентов дыхательной цепи, например при низ значениях окислительно-восстановительного потенциала среды роста, то ест1 анаэробных условиях. Однако при росте в анаэробных условиях без акцепте электронов клетки Е.соП поддерживают крайне низкий уровень АДн* (Ka.shkel.1981 соответственно и низкий уровень сукцинатдегидрогеназы. Поэтому в качестве уело выращивания Е.соП нами был выбран анаэробный рост этого микроорганизм присутствии ДМСО в качестве акцептора электронов. Подобные условия приводя одной стороны, к довольно низкому окислитлыю-восстановительному потенщ среды выращивания, и, с другой стороны, к достаточно высокому уровню содержа сукцинатдегидрогеназы.

40 60 80 [ПХФ] (мкМ) [ГИФ] (мг.М)

Рисунок 8. Зависимость уровня экспрессии сукцинатдешдрокчкпы ог концсшрацин II! среде роста при выращивании в анаэробных условиях ма матькне клеток Е.соП следу« штаммов:

А: ЕСЬ547 (дикий тип)

Б: Д - ЕСЬ968 (Дг1/гЛ);С- ЕС1.5'Х) (ДагсН)

Как показано на Рис.В, выращивание клеюк Е.сок и данных условиях (н> при анаэробиозе и в присутствии ДМСО) приводило к устойчивому нопиж! уровня сукцинатдегидрогеназы под действием протонофора ПХФ. Хочется огме

чю данный эффсм репрессии сумипкидсч njipoieiiaibi наблюдался при тех же коннеш рациях рлшбшшс 1я ИХ1!1, при котрых он индуцирует терминальноую оксид.п\ /'(/-шил и uní itt)iip\с1 подвижное! ь клеть E.coh. '-Это наблюдение указывает на рои. уменьшения не шчпны \цц. >< данном процессе. И то же время понижения чроннч жепрессни с\ кпнпл i.iei n.ipoi сна ii.i не наблюдалось на штаммах E.coli, не содержащих белкои ДгсА или ДгсВ, чю полюляст предположить участие «гс-системы ii peiv дягорном коздеиепшн на экспрессию лого фермента при понижении уровня Аре»- Приведенные данные подтверждают выдвинутое предположение об участии какой-то неизвестной (по-видимому, редокс-чувствительпои) релуляторнон системы в peí уляцин экспрессии еукшшатдепшрок-назы.

Рисунок 9. Зависимость уровня экспрессии цитохрома <1 от кон-пенфацин ПХФ в среде роста при выращивании в анаэробных условиях на мальтозе клеток E.coli ECL942

В то же время, как показано на Рис.9, при анаэробных условиях роста, в отличие от аэробных (см. Рис.2), теперь уже уровень цитохрома сI не изменялся при выращивании в присутствии протопофора ПХФ. Подобная зеркальная регуляция экспрессии цитохрома </ и сукцинагдешдрогепазы, позволяет выдвинуть предположение, что рс1уляторнон системой, не позволяющей ягс-еистсме понижать уровень экспрессии сукцинатдегидрогеназы и аэробных условиях, является /«/-система, так как именно эта регуляторная система ответственна за контроль над синтезом цитохрома (I в анаэробных условиях (Оип8а1и8, 1992; 8р1го&Сиек1 1991). Однако мутантпме штаммы Е.соИ, не содержащие белка РЫЯ, демонстрировали аналогичное

4 X С

а а

U I X 3 I I \ >4

С «

X

3

800

600* Г

400-

Й 2.00

—i—1 2Q

—,—|—,—,—,—|—, 40 60

[ПХФ] (мкМ)

8(

изогенным штаммам дикого типа изменено содержания цигохрома i сукцинатдегидрогеназы иод действием как протонофора ПХФ (Рис.5), гак и цна Эти данные означают, что при аэробном выращивании E.coli в присутствии ни: //¡/-система остается в "выключенном" состоянии, иначе мы вы нпб.чи повышенную по сравнению с мутантпым по белку F;NR штаммом E.coli инду терминальной оксидазы М-типа на шгамме дикою тина (так как //¡/-систем;!

"включении" репрессирует синтез ииюхрома <1). Таким образом, ра 1л1 воздействие протопофоров на цитохром <1 и сукцнпатдсшдрогеназу в аэрс условиях нельзя объяснить влиянием //¡г системы (и прежде всею из-за тою чн> наших рассуждений о возможности существования пеидентифиниров; регуляторной системы опиралась на постулирование ее "включения" в ирисуi цианида). Итак, полученные данные попюляют предположить существование как третьей (отличной от иге п Jhr и па настоящий момент не описанной) i лоба. регуляторной системы, принимающей участие в релуляции экспрессии icnoi переходе E.coli из аэробных условий pocia л анаэробные и. но-вилн реиентирующей уровень востаноштенности какою-то компонента дыхательной не В заключение следует отмстить, чю индукция хпполокендазы Ы-тнна у при понижении нротондвижушей силы имеет определенный физиологический i А как с позиции функционирования натриевого цикла Оак как пиюхр<

i предположительно является натриевой помпой), так и с точки зрения вклю

альтернативного ответвления дыхательной цени с более высоким сродств Ii кислороду и меньшей чувствительное п.м ко всевозможным ингибиторам (ни;

;■- азиду, ионам цинка и так далее). В ю же время фишолошчсски оправдан и

остальных регуляторных систем. Так, с одной стороны, //[/-система не пошоляс

Гч системе переггродупиропагь иигохрои d и oicvicinne кислорода (го ecir.

i

к присутствие оксидазы не является необходимым), а. с друюи стороны, пси mcci

система не позволяем и/г-снсчеме попижап, уровень су ышиагдел icipni ем; аэробных условиях даже при шпкнх шачеипях \иц' п. мким обраюм. шччпе f- протекание цикла Кребса (последнее, имени.то. '.ииясия при а)ро('шы\ у

предпочтительней брожения в свяш i окчкптем h.ikoii !спня болыинх ки i | токсичных метаболию» (оришичсскп\ кпски и или» ми Мшересным k.iaci

У. факт, что регуляция жсирсссни ферменюв. вовлеченных в мстаболшм а >роГн

>

анаэробного тина, построена 1аким омюспkvimio сложным способом. Iie;u, па i

Ü'

вилял для данных целей кажется иполне достаточным иметь единственную pci у im i opi lyio cHcicMv. окмежпнающую концентрацию кислорода в среде роста. Однако у E.adi. по-видимому. инк систем как минимум три, и в регуляцию фермешов J11 с р i с 11111 с к о и ) обмена кроме "кислородометра" вовлечены также системы, peaiируюшие на понижение прогондвижушеп силы и восстановление дыхательной цени. Причина laKoio сложною уироиства механизма рефляции путей метаболизма при переходе к анаэробиозу кроется, скорее всею, в большом разнообразии шчмижнмх условий анаэробною роста E.coli. Так, рост в присутствии нитрата не должен сопровождаться значительной репрессией синтеза ферментов аэробного метаболизма (за исключением терминатгных окендаз) даже в отсутствие кислорода. В ю же время при роете в отсу тствие акцепторов электронов для дыхательной цепи подобной репрессии следует быть максимальной. Промежуточные этим двум условиям, 'то есть условия рост в присутствии акцепторов электронов с низким окислительно-восстановительным потенциалом (таких, как, например, фумарат, диметилсульфоксид или триметил N-оксид), должны приводить и к промежуточной репрессии синтеза ферментов аэробною метаболизма. Такая сложная, в зависимости от условий внешней среды, регуляция экспрессии возможна, по-видимому, только за счет функционирования по крайней мере трех независимых, то есть рецеитирующих разные сигналы, ре1уляторных систем.

С другой стороны, данный тип рефляции, по сравнению с эукарпотами, все-таки относительно прост. Подобная простота достигается, возможно, за счет склонности различных прокариот и, в данном случае E.coli, к рецептированию наиболее общих, интегральных параметров условий роста, таких как протондвижущая сила или перевоссгапоБлеиие дыхательной цени. При использовании этого пути отпадает необходимость репетирования отдельно каждого конкретного фактора внешней среды, что приводит к значительному количественному упрощению системы рефляции. Для прокариот такое упрощение, по-видимому, крайне важно, и ,в первую очередь, в связи с ограниченностью размеров бактериального генома.

5. Влияние [Na+] на уровень экспресса терминальной оксидазы bd-типа.

В связи с выдвинутым ранее предположением о способности цитохрома d функционировать в качестве первичной натриевой помпы (Avetisyan et а!., 1992), нам представлялось интересным установить влияние изменения концентрации ионов

натрия в среде роста на уровень экспрессии этого фермента. Как видно из Рис увеличение [ЫаС1] в среде роста вызывает повышение содержания цитохрома клетках Е.соН, хотя данный эффект и не очень велик. В то же время КС1 не о к аз г подобного влияния на уровень экспрессии данною фермента, что 1 опори специфическом действии именно ионов натрия. Полумаксимальная ипдуь цитохрома с1 под действием Ыа+ наблюдалась при при [Nа+ ] ~ 12мМ. Повыше уровня экспрессии цитохрома <7 под действием других индукторов также зависел! концентрации ионов натрия в среде роста. Так, индукция этого фер\и протонофором ПХФ более выражена при высоких [№+|. Хочется отметить, что повышении концентрации ионов натрия в среде роста повышение содсрж; цитохрома (I в клетках Е.соН происходит независимо от шг-системы, так как мутантных штаммах, не содержащих белка АгсА или АгсВ. увеличение концстр; ионов натрия в среде роста также вызывало индукцию лого фермента. Интерес также кажется тот факт, что увеличение |Ыа+] в среде роста не оказывало скол нибудь серьезного влияния на уровень экспрессии сукцинагдепшрогеназы.

Рисунок 10. Зависимость уровня экспрессии цшохрома с! у ЕлчП НС'1.942 о! количества ЫаП ни добавленных в среду рос1а.

[ЫаС1] или [КС1] (мМ.1

В данном месге хочечея шменш.. ч|и шик .нмн.к ш.нме и' пиши пн 1\ терминальной окендазы /х/лнпа (ю ее и. мри иппил-шш протндвпжипен >1111.1 1 повышении . концентрации ионов шпрня в среде рои,и хорошо сомливч вьщвинутым ранее предположением о возможной!! ф\пмпюннровання лит фер' в качестве первично!! натриевой помпы.

выходы

1. Проведено t равнение пнл\mips ыщнч шпохром d и Дрц*-диссипирующих ,iK I iiiiHtiL'icii pa 11111111! >1 \ paioimimcicn на пнгакшых клетках E.coli. Получение данные ло.пвержлаип mnoieis о ihm, ню понижение уровня прогондвижущей силы может шран. роль фамора. iih.iv пирующею сита терминальной оксндазы М-тппа.

2. Установлен!«), чю «rc-снстема, и отличие от /яг-системы, вовлечена в процесс повышения уровня экспрессии номинальной оксндазы bd-типа под действием ра¡общителен. Эш данные позволяют выдвинуть предположение о возможности (функционирования белка АгсВ в качестве "проюметра".

3. Полученные данные по изучению рефляции экспрессии хинолоксидазы М-типа и сукцинатдегидрогеназм при изменении различных факторов внешней среды позволяют сделать заключение о существовании у E.coli дополнительной (отличной от arc- и jhr-систем) регуляториой системы, участвующей в рефляции экспрессии сукцинатдегндротеиачы и, по-видимому, рецепгирующей уровень востановленности какого-то компонента дыхательной цепи.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Аветисян A.B., Ацаркина Н.В., Богачев A.B., Белогрудов Г.И., Гринкевич В.А.,

Муртазина P.A., Мунтян М.С., Скриппикова Е.В., Скулачев В.П., Устиян B.C. Сравнительное исследование протонных и натриевых генераторов трансмембраннон разности электрохимических потенциалов ионов Na+ и Н+ в бактериях. I Всероссийская конференция "Белковая инженерия", Москва, 1994, стр.4.

2. Avetisyan A.V., Bogacliev A.V., Miiria.sina R.A. and Skulachev V.P. involvement of a

(/-type oxidase in the Na+ -motive respiratory chain of Escherichia coli growing under low Дрц+ conditions. 1-EBS Lett. 1992, v.306, pp.199-202.

3. Bogachev A.V., Mtirtasina R.A., Sliestopalov A.l. and Skulachev V.P. The role of

proton and sodium potentials in motility of Escherichia coli and Bacillus FTU. Biochiin.Biophys.Acta. 1993, v. 1142, pp.321-326.

4. Bogachev A.V., Murtasina R.A. and Skulachev V.P. Cytochrome d inductior

Escherichia coli growing under unforable conditions. 1993, FEBS Lett. v.336, 75-1

5. Avetisyan A.V., Bogachev A.V., Murtasina R.A. and Skulachev V.P. Involvement

d-type oxidase in the Na+ -motive respiratory chain of Esclicrichia coli growing u low Дрн+ conditions. 1992, EBEC Reports, 1992, v.7, p.57. "6,—Avctisyan-ArVTr-BlochDA—BogachevA.V--Drachcv-L.A.,-Muntyaii-M.S.,-\liiFt; R.A., Skulachev V.P. and Ustiyan V.S. The prolon-motive and sodium-inotivc tern oxidases of Bacillus FTU and Escherichia coli. IUPAB Conference "Major elcc transport complexes in photosynthesis and respiration", Gmunden, Austria, 1993, p 7. Bogachev A.V., Murtasina R.A., Shestopalov A.I. and Skulachev V.P. Induction o! Escherichia coli cytochrome d by low Др()* and by sodium ions." Enr.J.Hioci 1995, v. 232, pp. 304-308.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат, ДМСО - диметилсульфоксид, ДНФ -динитрофенол, ОНФГ - о-нитрофепил-[5-0-галактопиранозид, ПХФ - пептахлорфе трис - трис(гидроксиметил)аминометан, ХКФ - м-хлоркарбонилнианидфешшгидр; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат, TTFB - 4.5,6,7,-тстрахло[ трифторметилбензимидазол, Дф - трапемембранная разность элсктрпчс потенциалов, ДрН - трансмембраиная разность значении рН, Др^+ - трансмсмбра разность электрохимических потенциалом ионов натрия, Дрц+ - трансмсмбра разность электрохимических потенциалом попов водорода.