Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм функционирования терминальных оксидаз типа bd

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм функционирования терминальных оксидаз типа bd"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М В ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

БОРИСОВ Виталий Борисович

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ТЕРМИНАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ ТИПА Ы

03.00 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

0034470 1С

Москва-2008

003447010

Работа выполнена в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико-химической биологии им АН Белозерского Московского государственного университета им МВ Ломоносова

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр Николаевич

доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич

доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна

Ведущая организация- Институт химической физики им Н Н Семенова РАН

Защита состоится "17" ноября 2008 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д501 001 71 при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория ББА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан "_"_2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Медведева М В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Работа посвящена актуальной проблеме биохимии -изучению механизмов преобразования энергии у бактерий на молекулярном уровне Запасание энергии в дыхательной цепи аэробных бактерий осуществляется за счет электрогенного переноса ЬГ или Na+ из цитоплазмы в периплазматическое пространство Создаваемая при этом на цитоплазматической мембране протон- или натрий-движущая сила используется клеткой для энергообеспечения основных типов работы химической, осмотической, механической В дыхательной цепи электроны по градиенту редокс-потенциала последовательно передаются от НАДН на 02 с помощью нескольких ферментных комплексов Терминальная оксидаза является концевым ферментным комплексом дыхательной цепи Обнаружено два класса терминальных оксидаз гем/Си-содержащие ферменты и цитохромы bd Про гем-медные оксидазы известно уже довольно много В частности, с помощью рентгеноструктурного анализа удалось увидеть трехмерную структуру гем-медных оксидаз из сердца быка и ряда бактерий Цитохром bd не имеет гомологии с гем-медными оксидазами, не содержит меди, но способен генерировать мембранный потенциал По сравнению с гем-медными оксидазами, цитохром bd остается малоизученным ферментом Не известно, как устроен его активный кислородоредуктазный центр, является ли он биядерным, какие интермедиаты образуются в ходе его каталитического цикла, каков механизм образования мембранного потенциала, какие из частных каталитических стадий сопряжены с генерацией потенциала Цитохром bd является ключевым энергопреобразующим дыхательным ферментом как у микроорганизмов, безвредных для человека и животных, так и у бактерий, вызывающих различные заболевания, среди которых дизентерия, пневмония, сальмонеллез, периодонтит, бруцеллез, брюшной тиф, туберкулез Замечена положительная корреляция между вирулентностью бактериальных патогенов, ответственных за эти болезни и уровнем экспрессии цитохрома bd Именно поэтому изучение цитохромов bd представляет интерес не только для фундаментальной науки, но и полезно с медицинской точки зрения Полученные знания могут помочь созданию антибактериальных медицинских препаратов, используя в качестве мишени терминальные оксидазы ¿¿/-типа

Цель и задачи исследования Целью этой работы было изучение молекулярного механизма функционирования терминальных оксидаз типа bd Особое внимание было уделено исследованию цитохромов bd из Escherichia coli и Azotobacter vinelandu Требовалось понять, является ли наличие биядерного редокс-центра у терминальных оксидаз необходимым условием для восстановления кислорода до воды и если это так, то для какой из стадий каталитического превращения интермедиатов Альтернативой могла бы быть необходимость наличия второго редокс-центра для переноса протонов через мембрану Таким образом, установление роли высокоспинового гема ¿s95 у цитохрома bd представляет особый интерес Ставилась задача выявить и охарактеризовать основные интермедиаты каталитического цикла фермента, понять, каким образом цитохром bd генерирует потенциал в отсутствие механизма трансмембранной перекачки «помповых» протонов, определить устройство и механизм функционирования его активного кислородоредуктазного центра Изучение механизма образования цитохромом bd мебранного потенциала помогает понять, как именно бактерии, включая патогенные штаммы, запасают энергию при недостатке

кислорода и других неблагоприятных условиях Кроме того, выявление общих черт и различий в механизме восстановления кислорода до воды у цитохрома bd и основных протон-транслоцирующих терминальных оксидаз помогает установить принципиальные компоненты протон-переносящей «машины», присущей гем-медным концевым дыхательным ферментам

Научная новизна работы Впервые разработан удобный метод окисления цитохрома bd, что позволило провести систематическое исследование взаимодействия с лигандами не только восстановленного, но и окисленного фермента

Обнаружено, что в окисленном ферменте, 1Г202 реагирует с гемом d с кажущейся константой диссоциации (Kj) 30-40 мкМ, но не взаимодействует с высокоспиновым гемом ¿595 Реакция носит необратимый характер, приводя к образованию оксоферрильного комплекса гема d (Fe4+=02-) Показано, что как в мембранах, так и в выделенном цитохроме bd, СО и цианид связываются с гемом d Кажущаяся Kd гема d с СО составляет 70-80 нМ Существенно новым результатом работы является то, что связывание СО с гемом ¿595 не превышает 6% даже при низких температурах Предлагается модель устройства кислородоредуктазного центра, который состоит из близко расположенных (-10 А) гемов bs9s и d, проявляющих антикооперативность в связывании лигандов

Впервые идентифицирована индивидуальная полоса Соре восстановленного гема ¿595

Впервые разработан прямой метод определения сродства к кислороду гемопротеинов, способных образовывать устойчивые комплексы с О2 С помощью этого метода удалось определить сродство цитохромов bd из Е сой и А vinelatidu к кислороду Кроме того, измерены скорости связывания Ог с оДноэлектронным (MV) и полностью восстановленным (R) цитохромом bd В случае R формы цитохрома bd, скорость реакции возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации Ог Напротив, для MV фермента, такая зависимость не является линейной, а носит гиперболический характер Предполагается, что MV цитохром bd в равновесии существует в двух состояниях, но связывать Oj может только в одном из них

Впервые зарегистрирована быстрая кинетика генерации разности потенциалов цитохромом bd на мембране протеолипосом и последовательное образование спектрально различимых каталитических интермедиатов в пределах одного молекулярного оборота фермента Идентифицирован новый каталитический интермедиат, вероятно являющийся перекисным комплексом гема d (Fe3+-0-0-(H)) Показано, что связывание восстановленного цитохрома bd с кислородом и дальнейшее превращение оксикомплекса в перекисный комплекс не сопряжены с генерацией потенциала, тогда как две последующие каталитические стадии - переход перекисного комплекса в оксоферрильную и затем в окисленную форму, являются электрогенными Предлагается схема реакции полностью восстановленного цитохрома bd с кислородом

Измерены константы скорости спонтанной диссоциации 02, NO и СО от цитохрома bd в разных редокс-состояниях фермента NO и СО диссоциируют из цитохрома bd гораздо быстрее, чем из гем-медных терминальных оксидаз Диссоциация этих лигандов из MV формы цитохрома bd замедлена в сравнении с R ферментом Предполагается, что редокс-

состояние тема 6595 контролирует внутрибелковый путь ухода лиганда из акпшного центра цитохрома М

На основании сравнительной характеристики мутантной формы фермента Е445А и цитохрома М дикого типа предлагается модель внутрибелковых путей переноса электронов и протонов в цитохроме Ьс1

Практическая значимость исследования Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современные знания о свойствах и механизме функционирования терминального участка дыхательной цепи организмов и могут найти применение в исследованиях гемопротеинов дыхательной или фотосинтетической редокс-цепей Разработанный метод перевода оксигенированного цитохрома Ы в полностью окисленное состояние может быть использован для окисления других гидрофобных редокс-ферментов, не взаимодействующих с традиционными акцепторами электронов типа феррицианида или персульфата Разработанный прямой метод определения сродства цитохрома Ь<1 к кислороду может быть использован для определения сродства к Ог и других гем-содержащих белков, образующих стабильные комплексы с этим лигандом На основе цитохрома Ьс1 можно разработать биосенсоры 02, СО и N0 Информация о структуре и функционировании активного центра цитохрома Ы открывает возможности для использования оксидазы этого типа в качестве мишени при антибактериальной терапии

Материалы работы используются в учебном процессе на факультете Биоинженерии и биоинформатики и на Биологическом факультете МГУ Результаты исследований вошли в курс лекций по биоэнергетике

Апробация работы Материалы работы были представлены и обсуждались на 23-м, 26-м, 27-м, 29-м, 30-м и 32-м съездах Федерации европейских биохимических обществ -РЕВБ (Базель, 1995, Ницца, 1999, Лиссабон, 2001, Варшава, 2004, Будапешт, 2005, Вена, 2007), 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й, 14-й и 15-й Европейских биоэнергетических конференциях -ЕВЕС (Лёвен-ля-Нёв, 1996, Гётеборг, 1998, Сассекс, 2000, Аркашон, 2002, Пиза, 2004, Москва, 2006, Дублин, 2008), 2-м Европейском биофизическом конгрессе - ЕВ Б А (Орлеан, 1997), конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), 18-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов - ШВМВ (Бирмингем, 2000), конференции Федерации европейских микробиологических обществ -РЕМБ «Физиология, регуляция и биохимия электронного транспорта в катаболизме микробов» (о Терсхеллинг, 2001), 18-м Международном конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Киото, 2002), 2-й Международной конференции «Ферменты в окружающей среде активность, экология и приложения» (Прага, 2003), конференции «Российская биоэнергетика от молекул к клетке» (Москва, 2005), 2-й Всемирной конференции по стрессу (Будапешт, 2007), 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) Работа также была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ

Результаты, представленные в работе, удостоены Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся работы в области науки и техники для молодых ученых (1999), премии Биохимического Общества при Российской Академии Наук для

молодых ученых России (2000), премии им А Д Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИФХБ МГУ (2000), премии Академии наук высшей школы России (2000), премии в конкурсе молодых ученых МГУ (2001), премии Европейской академии для молодых ученых СНГ (2002) и премии им И И Шувалова МГУ (2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 23 статьи в рецензируемых журналах

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа содержит 232 страницы, 84 рисунка и 4 таблицы Список литературы включает 291 источник

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили как на бактериальных субклеточных пузырьках, так и на изолированном ферменте, - солюбилизированном в детергенте либо встроенном в искусственную фосфолипвдную мембрану (липосомы)

Штаммы бактерий Использовали оксидазы bd-типа, полученные из Escherichia coll и Azotobacter vmelandti Штамм G0105/pTKl Ecoh любезно предоставлен проф Р Теннисом (Иллинойский университет в Урбане-Шампейн, США), штамм МК8 A vinelandii - дар проф Р Пула (университет г Шеффилда, Англия) Эти штаммы удобны тем, что за счет введения плазмиды с геном цитохрома bd обеспечивается суперпродукция изучаемого фермента Вдобавок, в штамме G0105/pTKl Ecoli проведена деления в гене цитохрома Ьоз (вторая терминальная оксидаза у Ecoli), что дает возможность получения препарата цитохрома bd без примеси другой оксидазы Кроме того, исследования проводили на мутантных ферментах из Е colt - Е445А и «L65C» В мутантном ферменте «L65C» шесть эндогенных остатков цистеина заменены на серин либо аланин (субъединица I С128А, C396S, С479А, субъединица II C214S, C301S и C358S), также в субъедшшцу I введен один добавочный цистеин (L65C) В мутантной оксидазе «L65C» отсутствует гем d, но сохраняются гемы Ьм и

¿595

Выращивание теток Клетки Ecoli выращивали аэробно в ферментере, либо в колбах на качалке при температуре 37 "С Среда выращивания состояла из 80 мМ фосфата натрия, 2,5 мМ цитрата натрия, 19 мМ сульфата аммония, 1%-ного триптона, 0,5%-ного дрожжевого экстракта, 0,5%-ных казаминовых кислот, 0,01%-ного L-триптофана, 2%-ного глицерина, 0,8 мМ MgS04> 0,18 мМ FeS04 7H20, 0,1 мМ CuS04 5Н20, 0,005%-ного канамицина, 0,01%-ного ампициллина, рН 7,2

Клетки A vinelandu выращивали аэробно в ферментере, либо в колбах на качалке при температуре 30 °С Состав среды выращивания б мМ фосфат калия, 1,27 мМ сульфат натрия, 15 мМ ацетат аммония, 2%-ная сахароза, 3,3 мкМ СаС1г, 8,5 мкМ MgCh, 0,33 мкМ FeS04,0,097 мМ Na2Mo04,0,002%-ный рифампицин, 0,0001%-ный канамицин, рН 7,6

За ростом клеток следили по увеличению мутности при 600 нм Процесс культивирования обычно занимал 22-24 ч, На поздней логарифмической стадии клетки осаждали (5500 g, 10 мин, 4 С0) и дважды промывали в среде, содержащей 172 мМ NaCl, 5 мМ фосфат натрия и АЭБСФ, рН 7,5 {Ecoli), либо 50 мМ NaCl, 10 мМ фосфат калия, 1 мМ MgS04 и АЭБСФ, рН 7,5 (A vinelandii)

Получение мембран После промывки клетки Ecoh суспендировали в среде, содержащей 20 мМ трис, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ MgSOi,20 мМ бензамидин, 1 мкМ леупептин, рН 8,3 Непосредственно перед разрушением клеток в суспензию добавляли АЭБСФ, а также 1 мМ 1,4-дитиотреитол и ДНКазу I (0,01 мг/мл) Суспензию дважды пропускали через пресс

Френча Оставшиеся целыми и частично разрушенные клетки удаляли центрифугированием (14500 g, 15 мин, 4 Сс) Из полученного супернатанта улмраценгрифугированием осаждали субклеточные пузырьки (160000 g, 2 ч, 4 С0), которые затем гомогенизировали в среде требуемого состава

После промывки клетки A vmelandii суспендировали в среде, содержащей 20 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ MgS04, 20 мМ бензамидин, 1 мкМ леупептин, pH 7,5 Непосредственно перед разрушением клеток в суспензию добавляли АЭБСФ, либо спиртовой раствор фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) до конечной концентрации 0,3 мМ, а также 1 мМ 1,4-дитиотреитол и ДНКазу I (0,01 мг/мл) Суспензию пропускали один раз через пресс Френча Оставшиеся целыми и частично разрушенные клетки удаляли центрифугированием (17600 g, 7 мин, 4 С0) Из полученного супернатанта ультрацентрифугированием осаждали субклеточные пузырьки (160000 g, 2 ч, 4 С°)

Выделение фермента Цитохром bd из Ecoh выделяли и очищали по методу, описанному ранее Миллером и Теннисом [Miller and Gennis, 1986], с некоторыми модификациями. Размороженные мембраны Е coli гомогенизировали в среде для уравновешивания хроматографической колонки без детергента (50 мМ фосфат калия, 25 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, АЭБСФ, pH 6,5) К гомогенату добавляли монолаурат сахарозы до конечной концентрации 1,8% и инкубировали при перемешивании в бане со льдом в течение 2 ч Суспензию центрифугировали (160000 g, 60 мин, 4 °С), осадок отбрасывали, а супернатант наносили на колонку с ДЭАЭ-сефарозой Fast Flow, уравновешанную 50 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим также 25 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА, и 0,1%-ный монолаурат сахарозы, pH 6,5 Колонку промывали 100 мл этого буфера при скорости тока 100-120 мл/ч и температуре 4 °С (скорость тока задавали с помощью перистальтического насоса), затем проводили элюцию градиентом KCl (25-350 мМ) при скорости тока 90-100 мл/ч Собирали фракции объемом 7 мл, регистрируя поглощение при 405 нм Для дальнейшей работы отбирали фракции с соотношением оптических плотностей А412/А280 0,7 Эти фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией Полученный раствор диализовали при 4 °С против 50 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 5 мМ ЭДТА и 0,05%-ный JV-лаурилсаркозинат натрия, pH 7,0, с двукратной сменой буфера через каждые 5 ч Иногда диализ заменяли гель-фильтрацией на колонке PD10 с Сефадекс G-25

Цитохром bd из A vmelandii выделяли и очищали по методу, описанному ранее Джунеманн и Рштлсвортом [Junemann and Wngglesworth, 1995], с незначительными модификациями Мембраны гомогенизировали в 20 мМ трис/HCl буфере, содержащем 10 мМ ЭДТА, 0,5 М KCl и АЭБСФ, pH 8,0, при этом концентрация белка составляла 10 мг/мл Гомогенат инкубировали 1 ч при перемешивании в бане со льдом и затем центрифугировали (168000 g, 2 ч, 4 °С) Супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в 100 мМ калий-фосфатном буфере, pH 7,2 (концентрация белка -10 мг/мл) К суспензии добавляли 10%-ный раствор холата натрия (до конечной концентрации 2%) и оставляли на ночь при перемешивании На следующий день полученную смесь центрифу1ировали (45000 g, 15 мин, 4 °С) Супернатант отбрасывали, а осадок, дважды промывали в 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,2), чтобы избавиться от следов холата натрия (режим центрифугирования был тем же - 45000 g, 15 мин, 4 °С) Затем осадок суспендировали в том же фосфатном буфере (концентрация белка - 10-15 мг/мл) и добавляли л-додецил-р-О-мальтозид до конечной концентрации 1,5% Суспензию инкубировали 1 ч при перемешивании в бане со льдом и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 °С) Осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли 4 М раствор сульфата аммония до 55%-ного насыщения при перемешивании в течение 2-3 минут Суспензию инкубировали 20 мин без перемешивания и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 °С) Осадок красного цвета отбрасывали, а к

супернатанту желто-зеленого цвета добавляли сульфат аммнония (в сухом виде, предварительно измельченный) до 80%-ного насыщения при перемешивании в течение 2-3 минут Полученную смесь инкубировали 20 мин без перемешивания и затем центрифугировали (45000 g, 15 мин, 4 °С) Плавающий осадок цитохрома bd осторожно извлекали и растворяли 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 0,02% и-додецил-р-Р-мальтозид Для удаления сульфата аммония применяли гель-фильтрацию на колонке PD10 с Сефадекс G-25

Определение степени чистоты препарата. Степень чистоты препарата изолированного цитохрома bd определяли по содержанию гема d в пересчете на мг белка Это соотношение, как правило, составляло 6-7 нмолей гема dim белка

Определение концентрации цитохрома bd. Концентрацию цитохромов bd дикого типа из Ecoli и Avmelandii определяли по разностным спектрам поглощения (восстановленные дитионитом минус «окисленные на воздухе»), используя значения миллимолярных коэффициентов экстинкции Ae6zs-«07 = 10,8 мМ 'см1 [Borisov et al, 1999] и Де628 605 = 9,5 mNT'cm'1 [Belevich et al, 2007] для ферментов из Ecoli и Avmelandii, соответственно Концентрацию мутантного цитохрома bd Е445А из Е coli определяли по абсолютным спектрам поглощения восстановленного дитионитом фермента, используя значение Л£б21-б70 = 25 мМ 'см"1 [Belevich et al, 2005] Концентрацию мутантного цитохрома bd L65C из Е coli определяли по абсолютным спектрам поглощения восстановленного дитионитом фермента, используя значение ДЕ531 = 9 мМ"'см"' для ß-полосы гема bat, измеренное относительно опорной линии, соединяющей точки при 505 и 544 нм [Arutyunyan et al, 2008]

Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли по методам Лоури [Lowry et al, 1951] и Брэдфорд [Bradford, 1976] используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта

Определение концентрации СО, NO и 02 Концентрацию СО и N0 определяли, принимая растворимость этих газов в воде при 20 "С и атмосферном давлении равной 1 мМ и 2 мМ, соответственно [Anderson and Antomni, 1968, Brunon et al, 1974, Brunori et al, 1997] Концентрацию O2 в воздухе, уравновешанной с воздухом воде и насыщенной кислородом воде при 21 °С принимали равной 8,6 мМ, 278 мкМ и 1,32 мМ, соответственно [Montgomery et al, 1964]

Встраивание цитохрома bd влипосомы Цитохром bd встраивали в липосомы двумя методами На начальном этапе исследований использовали диализный метод Рэкера [Racker, 1972] с некоторыми модификациями На более поздних этапах исследования стали применять более простой и эффективный метод Риго (Bio-Beads) [Rigaud et al, 1995], который успешно зарекомендовал себя в опытах на хинолоксидазе типа boj [Verkhovskaya et al, 1997]

Метод Рэкера Всю процедуру встраивания проводили в бане со льдом Азолектин (40 мг/мл) диспергировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, содержащем 2%-ный холат натрия и 2 мМ MgSO«, pH 7,5 После этого суспензию продували аргоном в течение 10 мин, чтобы уменьшить вероятность перекисного окисления Для формирования липидного бислоя суспензию озвучивали 2-4 раза по 20-30 с на ультразвуковом дезинтеграторе при токе 0,4 А и частоте 22 кГц до полного ее просветления Озвучивание проводили в ледяной бане с NaCl (температура « -15°) для предотвращения перегрева После озвучивания к суспензии добавляли выделенный цитохром bd, так, чтобы соотношение белка и липида составляло 1 40 и диспергировали под током аргона Для удаления холата смесь подвергнутых ультразвуковой обработке липвдов и фермента диализовали против 300-500 объемов того же

буфера, в котором проводили озвучивание, но не содержащем холата, с двукратной сменой буфера

Метод Риго Азолектин (8 мг/мл) диспергировали в 200 мМ Hepes-KOH буфере, содержащем 55 мМ л-октил-[Ч}-глюкозид, рН 7,4 После этого суспензию продували аргоном в течение 5-10 мин, чтобы уменьшить вероятность перекисного окисления Для формирования липидного бислоя суспензию озвучивали 3 раза по 20-30 с (с 1 мин перерывами) на ультразвуковом дезинтеграторе до полного ее просветления Озвучивание проводили в ледяной бане для предотвращения перегрева Все дальнейшие процедуры встраивания проводили при комнатной температуре После озвучивания к суспензии добавляли выделенный цитохром bd до конечной концентрации 0,2 - 0,8 мкМ и перемешивали в течение 15 мин После этого к суспензии добавляли предактивированные гранулы SM2 Bio-Beads фирмы "Bio-Rad" (80 мг гранул сырого веса/мл), инкубировали 30 мин при перемешивании и затем вносили вторую порцию 80 мг/мл Bio-Beads Вслед за новым 30 мин перемешиванием добавляли третью порцию 160 мг/мл Bio-Beads Такое же количество гранул Bio-Beads вносили еще через 1 час перемешивания После этого смесь инкубировали при перемешивании еще 2 часа для полного удаления детергента Жидкую фазу, содержащую протеолипосомы, осторожно изымали пипеткой с тонкой насадкой, не пропускающей гранулы Bio-Beads

Амперометрия Определение дыхательной активности Потребление Ог препаратами цитохрома bd определяли амперометрически при помощи закрытого электрода типа Кларка на полярографе Раствор в измерительной ячейке термостатировали при 25 "С и интенсивно перемешивали на магнитной мешалке Среда измерения активности субклеточных пузырьков содержала 50 мМ трицин, 50 мМ K2SO4, 10 мМ MgS04, 0,2 мМ ЭДТА, рН 8,0 Активность выделенного цитохрома bd определяли в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,0), включающем также 40 мкМ ЭДТА и детергент 0,05%-ный N-лаурилсаркозинат натрия (для фермента из Е colt), либо 0,02%-ный и-додецил-Р-О-мальтозид (для фермента из A vmelandii) В качестве субстратов использовали 250 мкМ убихинол-1 с 4 мМ дитиотреитолом либо 4-5 мМ аскорбат с 0,1-0,5 мМ ТМФД Реакцию начинали добавлением убихинола-1 или ТМФД Во всех случаях отдельно регистрировали скорость самоокисления субстратов, которую учитывали при расчете удельной активности

Амперомегпрические измерения в присутствии NO и Oj Метод амперометрии применяли также для изучения взаимодействия цитохрома bd с NO как без кислорода, так и в присутствии разных его концентраций в среде измерения Для этого использовали специальные Ог- и NO- электроды встроенные в одну и ту же полярографическую ячейку и соединенные с компьютером, что позволяло одновременно следить за изменением концентрации О2 и NO в пробе [Borisov et al, 2004]

Электрометрия. Быструю кинетику образования разности потенциалов бактериальным ферментом на мембране протеолипосом регистрировали прямым электрометрическим методом с разрешением 100 не [Drachev et al, 1979, Drachev et al, 1989], адаптированным для измерений на протеолипосомах с цитохромоксидазой [Jasaitis et al, 1999, Verkhovsky et al, 1997] На отверстие (d=4 мм), разделяющее два отсека тефлоновой ячейки для электрометрических измерений, наносили пленку, смоченную в декановом растворе фосфолипида Ячейку заполняли 100 мМ бис-трис-пропан/HCl буфером, рН=7,0 В один из отсеков ячейки вносили липосомы с оксидазой, добавляли в оба отсека 15 мМ СаС12 и инкубировали 1,5-2 часа при постоянном перемешивании В этих условиях липосомы со встроенным ферментом сорбировались на поверхности мембраны, разделяющей два отсека ячейки После инкубации липосомы, не связавшиеся с мембраной, удаляли путем замены объема ячейки с помощью перистальтического насоса, и оба отсека заполняли конечной буферной средой для измерений (100 мМ MOPS/KOH, рН = 7,0)

Электрометрическую ячейку помещали в газонепроницаемый футляр, уравновешивали с атмосферой аргона и для достижения полного анаэробиоза добавляли 50 мМ глюкозу, 50 мкг/мл каталазу, 130 мкг/мл глюкозоксидазу Затем пробу инкубировали в атмосфере СО В опытах по взаимодействию восстановленого цитохрома bd с кислородом в ячейку добавляли также 10 мкМ ТМФД Требуемое количество кислорода впрыскивали в виде насыщенного 02 буферного раствора, используя управляемый компьютером насос со шприцем и присоединенную к шприцу длинную иглу Струя от иглы была направлена на измеряющую мембрану, что создавало высокую локальную концентрацию кислорода во время реакции Разность потенциалов в отсеках регистрировали при помощи защищенных от света хлор-серебряных электродов Изучаемые реакции запускали лазерной вспышкой, вызывающей фотодиссоциацию СО из фермента

Методы спектроскопии Регистрация изменений поглощения Поглощение регистрировали на соединенных с компьютером двухлучевых/двухволновых спектрофотометрах Aminco-SLM DW-2000, Сагу 300 UV-Vis, Shimadzu UV-vis 1601, Jasco V-550, Unisoku Instruments (Киото, Япония), HR2000+ (Ocean Optics Inc, США) Использовали кюветы различных типов с длиной оптического пути 0,1-1 см Регистрацию быстрой кинетики взаимодействия цитохрома bd с лигандами методом быстрого смешивания первоначально осуществляли с использованием приставки к Aminco DW-2 Aminco-Morrow J4-9602 Stopped flow Впоследствии стали использовать спектрофотометр с диодной матрицей (DX 17MV, Applied Photophysics, Великобритания), позволяющей записывать с миллисекундным временным разрешением спектры поглощения фермента целиком (350-800 нм), а не по отдельным точкам, как в случае приставки Ammco-Morrow В опытах по взаимодействию фермента с кислородом применили установку по быстрому смешиванию с матрицей DV420-UV-FK (Andor Technology, Северная Ирландия), что позволило записывать спектры поглощения целиком с интервалом 1 мкс [Belevich et al, 2007] Для исследования быстрых изменений поглощения света фоточувствительными комплексами частично или полностью восстановленного цитохрома bd с лигандами проводили эксперименты по фотолизу лазерным светом с использованием следующих подходов (I) Для изучения вызываемых светом спектральных изменений и их рекомбинации в микро/мимисекундной временной шкале была задействована неодимовая лазерная установка Y AG (Quantel 481, вторая гармоника, длина волны 532 нм, длительность импульса 15 не, мощность вспышки 40-120 мДж) [Azarkina et al, 1999] Мониторный свет от галогеновой лампы мощностью 75 Вт попадал в термостатируемое иоветное отделение после решеточного монохроматора фирмы Jobin Yvon с шириной щели 2-8 мм Пройдя через образец, свет поступал через призменный монохроматор на фотоумножитель Отцифровка сигнала с фотоумножителя происходила с помощью аналого-цифрового преобразователя DL-1080 (Datalab, Англия) Далее сигнал поступал в компьютер Для увеличения отношения сигнал/шум проводили накопление 50-250 кривых с интервалом 5 с Возбуждающий свет с помощью отражающего зеркала подавался в иоветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света перпендикулярно последнему (2) Для исследования сверхбыстрых процессов (фемто/пикосекунды) применяли фемто/пико-секундную лазерную абсорбционную спектроскопию [Martin and Vos, 1994], которая позволяла записывать непрерывные спектры поглощения как в полосе Соре, так и в видимой области Длина волны возбуждения находилась в области 590 нм, 620 нм либо 655 нм, что давало возможность следить за поведением отдельных гемовых центров в фемто-пикосекундном временном интервале [Vos et al, 2000] (S) Наносекундная лазерная спектроскопия отличается очень высоким оптическим разрешением (0,00001 OD) Сочетание вышеупомянутых подходов позволило наблюдать за динамикой поведения редокс-центров цитохрома bd во всем значимом для

поставленных целей и задач временном диапазоне - от нескольких фемтосекунд до нескольких часов

Низкотемпературная абсорбционная спектроскопия Изучение взаимодействия восстановленного цитохрома bd с СО при низких температурах (в основном от -70 до -100 °С) проводили как описано в работах [Borisov et al, 2001, Chance et al, 1975, Kalnenieks et al, 1998, Poole et al, 1994] Типичный эксперимент выглядит следующим образом Выделенный фермент, содержащий 30%-ный этиленгликоль, восстанавливали в кювете с оптическим путем 2 мм в течение 15 мин небольшим количеством сухого дитионита натрия, либо 10 мМ аскорбатом/50 мкМ ТМФД в течение 25 мин, и затем образец продували СО в течение 2 мин при комнатной температуре После этого кювету с образцом в условиях полной темноты переносили в термос, содержащий смесь сухого льда с этанолом при -78 "С и быстро замораживали Фотолиз СО проводили с помощью освещения образца сфокусированным лучом от 150-Вт вольфрамовой лампы в течение 3 мин, после чего регистрировали во времени разностные спектры поглощения (против записанной прежде и хранящейся в памяти базовой линии), Параллельно готовили и замораживали образец восстановленного фермента без СО, чтобы иметь базовую линию для слежения за изменениями поглощения при связывании СО с ферментом и для сравнения с соответствующими спектральными изменениями, индуцированными фотодиссоциацией СО от цитохрома bd

Спектроэлектрохимическое редокс титрование цитохрома bd проводили с помощью оптически прозрачной тонкослойной электродной ячейки (OTTLE) В ходе как окислительного, так и восстановительного титрования устанавливали потенциалы с шагом ± 20 мВ в диапазоне от -100 до +450 мВ (относительно стандартного водородного электрода) с использованием потенциостата PAR263A (Princeton Applied Research) На каждом шаге потенциала определяли начало установления равновесия на рабочем электроде Двухслойная сеточка из золота служила в качестве рабочего электрода В качестве измеряющего электрода использовали платиновую проволоку, погруженную в раствор 3 M КС1, хлор-серебряный электрод являлся электродом сравнения В качестве редокс-медиаторов использовали гексааминорутений (£с = +50 мВ), пентааминопиридинрутений (£с = +250 мВ) и ферроценилэтанол (Ес = +430 мВ), все - в концентрации 200 мкМ

Измерение МКД и КД Регистрацию спектров МКД проводили при комнатной температуре в кюветах с оптическим путем 10 мм на соединенном с компьютером дихрографе, сконструированном A M Арупоняном (Москва) Спектр МКД получали, вычитая из спектра, записанного в прямом поле, таковой в обратном поле (Н « 0,7 Т) Спектры КД записывали с помощью соединенного с компьютером дихрографа Mark V (Jobin Yvon, Франция)

Спектроскопия ЭПР Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре ESP-300 фирмы Bruker Частота модуляции 100 кГц Температуру образца контролировали с помощью криостата с жидким гелием ESR 900 и температурного контроллера ITC4 (Oxford Instruments) Данные ЭПР корректировали, вычитая контрольную пробу (сигнал ЭПР трубки с буфером) Условия регистрации спектров ЭПР СВЧ мощность 2 мВт, СВ частота 9,429 ГТц, амплитуда модуляции 1,2 мТл, температура 12 К

Обработка данных. Обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием программ GIM (Scientific Graphic Interactive Management System, разработана AJI Драчевым в НИИФХБ МГУ), Discrete [Provencher, 1976], MatLab (MathWorks Inc, США), Pro-Kineticist (Applied Photophysics Ltd, Англия), Origin 7 0 (OnginLab Corporation, США) Спектры КД и МКД анализировали с использованием программ RDA и WTEST, разработанных И Хоменковым и A M Арутюняном (Москва)

Определение кажущейся константы диссоциации комплекса гема d с кислородом (Kd[Q2)} * одноэлектронной форме цитохрома bd. Выделенный цитохром bd в аэробных условиях находится преимущественно в форме оксикомплекса, где гем d восстановлен и связан е Oj. Чтобы определить K<j(o2), вначале получали одноэлектронную форму фермента без связанного кислорода Для этого образец помещали в газонепроницаемую кювету флуоресцентного типа, приспособленную для соединения с газовой/вакуумной линией С помощью последней образец переводили в атмосферу аргона [Belevich et al, 2005] Об удалении кислорода с гема d судили по смещению полосы поглощения гема d- от 648 нм до 629 нм Затем проводили титрование анаэробного одноэлектронного фермента возрастающими добавками воздуха Воздух добавляли в виде газа или уравновешанной с воздухом воды Концентрацию О: в воздухе и уравновешанной с воздухом воде при 21 "С принимали равной 8,6 мМ и 278 мкМ, соответственно [Montgomery et al, 1964] Обычно эксперимент ставили следующим образом Порцию воздуха вносили против тока аргона с помощью газонепроницаемого микрошприца с длинной иглой непосредственно на дно кюветы (в жидкую фазу) Затем кювету перемешивали путем качания до тех пор, пока не устанавливалось равновесие между жидкой и газовой фазами За наступлением равновесия следили по степени интенсивности полосы поглощения при 648 нм, то есть кислород распределялся между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения, примерно равным 31 Поскольку концентрация Ог и объем газовой фазы кюветы были намного выше таковых жидкой фазы, газовая фаза над образцом служила в качестве кислородного буфера, поддерживая концентрацию кислорода в жидкой фазе Значение Kd<o2) определяли в соответствии с уравнением

где [<£*-Oi\ - фракция оксикомплекса гема d, [Ог] - концентрация свободного (несвязанного) кислорода в растворе образца

Определение кажущейся константы диссоциации (Кц) комплекса гема d с СО Кажущуюся Kj комплекса гема d с СО определяли по формуле [Mb-СО] Ш-ld-CO}) 1 [d~CO-]({Mbl-[Mb-CO]) ' где Ki - кажущаяся константа диссоциации для комплекса миоглобина с СО, Кг - кажущаяся константа диссоциации для комплекса гема d с СО, [d\a - общая концентрация цитохрома d, [Mb]0 - общая концентрация миоглобина, которую определяли из ДЕ579 594 = 6,4 мМ"'см'' для разностного спектра (карбоксимиоглобин (Fe2+-CO) минус деоксимиоглобин (Fe2+)), ДЕ435-480 = 121 мМ"'см1 для абсолютного спектра востановленного миоглобина (деоксимиоглобина), а также из Assomoo = 10,2 мМ"'см"' для абсолютного спектра окисленного миоглобина (Fe3~), значения As для Mb взяты из работы Вуда [Wood, 1984], [МЬ-СО] - концентрация комплекса миоглобина с СО, которую определяли как [МЬ]0 (ДА579 59* * мкМ С0)/(ДА579-594' мМ со), ДА брали из разностного спектра (СО+восстановленный минус восстановленный), [rf-CO] -концентрация комплекса гема d с СО, которую определяли как [d\„ (ДАб4э-б2з *мкМ со)/(ААб43 623 ' мМ со), ДА рассчитывали из разностного спектра (СО+восстановленный минус восстановленный), [СО]„ - концентрация добавленной окиси углерода

Обработка кривых титрования СО спектральных изменений цитохрома bd. Кривые титрования СО спектральных изменений восстановленного дитионитом цитохрома bd обрабатывали в программе GIM по формуле

А = 0,5 f (Kd +[</]„ + [CO]0-V(^+m+[COL)2-4 [d)c [СО\) ,

где А - ДАб44-б24> разность поглощения восстановленного дитионитом цитохрома bd в присутствии и отсутствие СО, £ - коэффициент экстинкции комплекса гема d с СО (Леем-огО, Ка - кажущаяся константа диссоциации комплекса гема d с СО, [d]0 - общая концентрация цитохрома d, [СО]0 - концентрация добавленной окиси углерода При обработке кривых титрования s и Kd задавали в качестве параметров

Определение кажущейся константы диссоциации (KJ комплекса гема d с Н202 Кажущуюся константу диссоциации комплекса гема d с Н2О2 рассчитывали в программе GIM по формуле . е И [ЯД], ...

А = — ■ -'-'д , где А - ДАбво, которую измеряли относительно опорной линии, Ка+[НгОг]0

соединяющей точки разностного спектра цитохрома d (обработанный Н2Ог минус окисленный BQCU), е - коэффициент экстинкции для комплекса гема d с Н2О2 (Aesso), Kd -кажущаяся константа диссоциации для комплекса гема d с Н2О2, Ио - общая концентрация цитохрома d, [Н2О2]0 - концентрация добавленной перекиси водорода

РЕЗУЛЬТАТЫ ОКИСЛЕНИЕ ГЕМА d

Цель- найти способ быстрого и эффективного окисления цитохрома bd Изолированный цитохром bd обнаруживает интенсивную полосу поглощения с максимумом при 648 нм, которая характеризует оксикомплекс восстановленного гема d (d2*-О2) (рис 1, спектр 1) Признаки восстановления гемов Ьщ и Ьм отсутствуют Таким образом, выделенный фермент находится большей частью в оксигенированном состоянии i>sss3+ bs9s3+ d2' -О2 Окислители феррицианид калия и персульфат аммония не изменяют исходный спектр цитохрома bd (рис 1, спектры 2 и 3) Данный факт указывает на неспособность этих веществ разрушить оксикомплекс гема d, несмотря на то, что они являются весьма эффективными акцепторами электронов Ввиду того, что субстратом оксидазы М-типа служит липофильный хинол, можно ожидать, что активный центр фермента находится в гидрофобном окружении и потому плохо взаимодействует с заряженными донорами и акцепторами электронов вроде феррицианида или персульфата Мы предположили, что гидрофобные окислители соответственно могли бы более эффективно окислять гем d

Рис 1 Действие различных окислителей на оксикомплекс цитохрома bd Ecoh Приведены абсолютные спектры 1 - без добавок, 2 - 30 мин с 0,2 мМ K3[Fe(CN)s], 3-30 мин с 0,1 мМ персульфатом аммония, 4 - 1 мин с 15 мкМ ФМС, 5-5 мин с 15 мкМ BQ, 6 - 20 мин с 40 мкМ феррицинием и 0,1 мМ персульфатом аммония, 7 -1 мин с 16 мкМ BQCU

[Ьшяатшш

Действительно, при добавлении таких липофильных акцепторов электронов, как феррициний или BQCU наблюдается исчезновение интенсивной полосы при 648 нм в абсолютном спектре поглощения фермента, что говорит о распаде оксикомплекса и окислении гема d Инкубация гемопротеина с BQ или ФМС также приводит к частичному разрушению оксикомплекса Среди исследованных липофильных акцепторов электронов BQCI4 оказался наиболее эффективным Довольно хорошо действует также феррициний, особенно в присутствии 0,1 мМ персульфата аммония Окисление оксикомплекса гема d BQCI4 происходит достаточно быстро (fc,ф = 6х104 М"'с'') Феррициний действует примерно в 300 раз медленнее (&эф = 2x102 М"'с'') BQ и PMS вызывают лишь частичное окисление оксикомплекса, но действуют довольно быстро (£зф соответственно около 103 и 104 М"'с"') Ингибитор хинолоксидазной активности цитохрома bd пентахлорофенол сильно тормозит окисление оксикомплекса гема d как BQCU, так и феррицинием Такое наблюдение свидетельствует о том, что гидрофобные акцепторы окисляют гем d через хинолоксидазный центр

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА MC Нг02

Цель - определить, какие из трех гемовых центров цитохрома bd взаимодействуют с Н2О2 и какие спектрально различимые интермедиаты при этом образуются

Описанный нами метод перевода цитохрома bd в полностью окисленное состояние позволил исследовать взаимодействие Н2О2 с окисленной формой фермента При добавлении Н2О2 к оксикомплексу цитохрома bd регистрируется разностный спектр с максимумом при 680 нм и минимумом около 650 нм Форма этого спектра схожа с таковой "перекисного состояния" комплекса bd, описанного Лоренсом и Теннисом [Lorence and Gennis, 1989] Перекись водорода, добавленная к окисленному BQCU или феррицинием цитохрому bd, также вызывает появление пика при 680 нм Форма разностного спектра (обработанный Н2О2 минус окисленный) напоминает спектр так называемого "перекисного интермедиата", описанного в работе Лоренса и Тенниса [Lorence and Gennis, 1989] и остается постоянной во всем исследованном нами диапазоне концентраций Н2О2, 5 мкМ-5 мМ Разность между спектрами продуктов взаимодействия Н2О2 с оксигенированной и полностью окисленной формами фермента близко напоминает разность между спектрами окисленного и оксигенированного цитохрома bd Таким образом, добавление Н2О2 как к оксигенированному, так и полностью окисленному ферменту приводит к возникновению интермедиата с максимумом при 680 нм

При добавлении Н2О2 к полностью окисленной форме фермента в разностном спектре поглощения также регистрируется минимум около 740 нм, обусловленный исчезновением полосы переноса заряда высокоспинового окисленного гема d (рис 2) В предшествующих работах исследования взаимодействия перекиси водорода с цитохромом bd ограничивались видимой областью спектра поглощения Мы обнаружили, что увеличение экстинкции при 680 нм в спектре окисленного цитохрома bd под действием Н2О2 сопровождается спектральными изменениями и в полосе Соре При внесении в образец Н2О2 в 7-сбласти возникает разностный спектр с пиком при 440 нм и провалом в области 405-410 нм, соответствующий длинноволновому сдвигу полосы Соре (рис 2) Изменения поглощения в

Соре и при 680 нм сравнимы по величине, тогда как в случае гемов типа а, Ъ или с ответы в у-области, как правило, в 5-10 раз больше, чем в видимом диапазоне длин волн [Poole, 1988] Это указывает на то, что вызываемые перекисью водорода оптические изменения в области полосы Соре, сопутствующие возникновению максимума при 680 нм, принадлежат гему d

Кривая титрования спектральных изменений цитохрома Ьd при 680 нм перекисью водорода имеет вид изотермы адсорбции Величина кажущейся константы диссоциации (К^) составляет 30-40 мкМ Изучение кинетики взаимодействия Н2О2 с окисленным цитохромом bd проводили с использованием метода быстрого смешивания На рис 3 представлена типичная кривая при конечной концентрации Н2О2 после смешивания 5 мМ Обнаружено, что скорость реакции удовлетворительно описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой и возрастает пропорционально увеличению концентрации Н2О2 (рис 3, вставка) Значение константы скорости второго порядка для цитохрома Ъй составляет 600 М"'с 1

Рис 2 Сопоставление вызываемых Н2О2 спектральных ответов цитохрома bd Е coli в видимой области и полосе Соре Фермент прединкубировали 5 мин с 28 мкМ BQCLt Представлены разностные спектры, записанные через 5 мин после добавления 40 мкМ (а) и 0,5 мМ Н2Ог (б)

500

700

с

О 0 2 0 4 0 6 1рем, с

Рис 3 Кинетика реакции Н2О2 с окисленным цитохромом bd Цитохром bd прединкубировали 5 мин с 28 мкМ BQCU с последующим быстрым

смешиванием с Н2О2 (конечная концентрация после смешивания -5 мМ) Кинетику реакции отслеживали при 680 нм относительно 720 нм Вставка зависимость константы скорости реакции первого порядка от [Н202]

is

Таким образом, мы установили, что перекись водорода, добавленная к окисленному цитохрому bd, взаимодействует исключительно с гемом с?*, переводя его в оксоферрильную форму {с?*=02~)

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЛОСЫ СОРЕ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЕМА 6595 Цель - вычленить индивидуальную полосу Соре восстановяеннозо 2вма bsas из спектра цитохрома bd методом фемто/пикосекундной спектроскопии

На рис 4 представлены изменения в области Соре спектра поглощения полностью восстановленного несвязанного с лигандами цитохрома bd, вызванные возбуждением при 590 нм, - вблизи максимума а-полосы восстановленого гема bs9s В течение первых 0,5 пс в разностном спектре наблюдается падение поглощения при 438 нм Затем это выцветание полосы частично обращается и абсорбционные изменения трансформируются в "красный" сдвиг полосы при 440 нм в пикосекундной временной шкале «Глобальный» компьютерный анализ (global fitting) полученного массива спектров выявляет две основные фазы фотовыцветания с т 460 фс и 4 пс В принципе, субпикосекундные спектральные компоненты должны включать вклад поглощения возбужденного состояния Однако, для субпикосекундных спектральных компонентов (к примеру, для 460-фс компонента полностью восстановленного цитохрома bd) такое поглощение не велико и сильно смешено в "красную" область, поэтому оно не оказывает существенного влияния на форму спектра выцветания основного состояния Однако таким вкладом уже нельзя пренебречь для более медленного компонента возбужденного состояния, который демонстрирует отчетливый спектральный сдвиг (см рис 4, спектры при 1,4 и 2 пс)

Г ------j--г- | ---г г полностью восстановленный

фермент

возбуждение при 590 ИМ

JAA = 0,005V^

— •—330 фс И

— о—600 фс V

— - — 870 фс \

— — 1 4 ne

—« — 2 пс

438 —i---1---1-.—j-»—

410 420 430 440 450

Длина волны, нм

Рис 4 Спектральные изменения во времени, вызванные фемтосекундным возбуждением полностью восстановленного цитохрома bd Е coli при 590 нм Разностные спектры были записаны против стационарной формы R в указанные временные интервалы после

фотовозбуждения

На рис 5 показан 460-фс спектральный компонент, представляющий собой обесцвечивание полосы около 440 нм и удовлетворительно описываемый функцией Гаусса (сплошная линия) Мы приписываем этот спектр выцветанию полосы Соре восстановленного гема ¿535 Полоса Соре гема А595, идентифицированная в этой работе, имеет тот же экстремум, что и соответствующая полоса восстановленной цитохром с пероксидазы (фермента, содержащего высокоспиновый гем Ь) Идентификация индивидуального спектрального вклада гема Ьщ в полосу Соре цитохрома Ъ<1 необходима для интерпретации сложных спектральных изменений, вызываемых связыванием лигандов с восстановленным ферментом

5

Рис 5 у-полоса поглощения восстановленного гема Ьщ цитохрома bd Е cob, вычлененная путем фотовыцветания формы R при 590 нм-возбуждении (х) и описанная функцией Гаусса (сплошная линия)

410 420 430 440 450 Длина волны,нм

РЕАКЦИЯ ЦИТОХРОМА bd С СО

Цель - выяснить, какие из трех гемоеых центров цитохрома bd способны взаимодействовать с СО

Взаимодействие СО с мембранной формой цитохрома bd Добавление СО к связанному с мембраной восстановленному цитохрому bd вызывает в видимой области разностного спектра поглощения появление полосы с ХтМ = 644 нм и = 624 нм, которая сопровождается пиком при 540 нм и W-образным ответом в области Соре Красный сдвиг полосы поглощения около 630 нм обычно приписывают гему d Что касается изменений в области Соре, то они, по мнению ряда авторов, объясняются вкладом гема 6595 [Poole, 1994]

Мы обнаружили, что изменения в Соре, равно как и развитие пика при 540 нм, титруются СО параллельно с увеличением поглощения а-полосы комплекса гема А с СО и достигают насыщения при 3-6 мкМ СО В области Соре наблюдается также вторая фаза спектральных изменений, которая не достигает насыщения даже при концентрации СО 1 мМ и не вносит существенного вклада в полученную концентрационную зависимость спектральных изменений цитохрома с! Эта фаза отражает взаимодействие с лигандом незначительной части гема ¿558 (1-3%) Мы определили кажущуюся Ка комплекса СО с гемом d бактериальных мембран Для этого проводили титрование СО спектральных изменений цитохрома Ьс1 и МЬ, находившихся в одном растворе, следя за распределением лиганда между этими гемопротеидами и принимая К<) МЬ равной 37 нМ Величина Ка составляет около 70 нМ

Взаимодействие СО с изолированным цитохромом Ы. Разностный спектр изолированного фермента при низкой концентрации СО (рис 6, спектр а) напоминает таковой комплекса СО с цитохромом Ы бактериальных мембран Однако в случае изолированного фермента отличия между спектрами при высокой (1 мМ) и низкой (20 мкМ) концентрации СО гораздо более выражены соответствующий разностный спектр представлен полосой с максимумом при 422 нм, минимумом при 434 нм и небольшим плечом около 440 нм в полосе Соре и двумя провалами, при 562 и 531 нм, в видимой области (рис 6, кривая в)

Ллнна »мни, ни

Рис, 6 Спектральные изменения изолированного цитохрома bd, вызываемые СО Представлены разностные спектры поглощения цитохрома bd Е cob

обработанный 20 мкМ (а) и 1 мМ СО (б) после восстановления дитионитом минус

восстановленный дитионитом, в -разность между (б) и (а)

Спектральные изменения изолированного цитохрома bd при 540 нм и 644-623 нм, как и в случае с мембранным ферментом, титруются одновременно, имеют вид кривых с насыщением и отражают один и тот же процесс - связывание СО с гемом d (рис 7, кривые б и в) Пик при 540 нм может быть как р-полосой комплекса гема d с СО, так и частью его расщепленной а-полосы Концентрационная зависимость спектральных изменений в Соре

имеет ярко выраженный двухфазный характер первая фаза соответствует наблюдаемым изменениям в видимой области, вторая фаза не насыщается даже при 1 мМ СО и вносит больший вклад в суммарную амплитуду изменений в у-полосе, чем в случае мембранной формы фермента (рис 7, кривая а) Амплитуда второй фазы соответствует взаимодействию лиганда с некоторой частью гема Ъщ (около 10-15%) Кажущуюся К<| изолированного цитохрома с] с СО определяли как и для мембран Ее значение оказалось равным ~80 нМ

Рис 7 Зависимость спектральных изменений изолированного

цитохрома Ъ<1 в разных диапазонах длин волн от концентрации СО Представлены кривые,

полученные после обработки соответствующих разностных спектров поглощения а - 470-444 нм, б - 644-624 нм, в - 540 нм

Исследование магнито-оптической активности изолированного восстановленного цитохрома bd и его комплекса с СО Спектроскопия МКД все шире применяется при изучении гемопротеинов В частности, она позволяет следить за изменением спинового состояния гемов при связывании лигандов Спектр МКД восстановленного цитохрома bd, записанный при комнатной температуре, показан на рис 8 сплошной линией (кривая 1) На спектре можно выделить 3 основных сигнала. В видимой области основной вклад вносит сигнал типа А с центром при 560,7 нм (рис 8,6, кривая 1) Этот сигнал принадлежит низкоспиновому гему bas2* Отрицательная полоса с минимумом около 600 нм по форме и положению типична для высокоспинового гема bJ\ соответствуя высокоспиновому гему b$952+ В области Соре наблюдается асимметричный сигнал с максимумом при 437 нм (рис 8,а), также напоминающий по форме и величине сигнал высокоспинового гемопротеида Этот сигнал может включать вклады каждого из трех гемовых центров фермента

Добавление 20 мкМ СО вызывает сужение сигнала в области Соре, что выражается в разностном спектре МКД кривой W-образной формы При этом не наблюдается изменений сигнала типа А гема bas и отрицательной полосы при 600 нм гема ¿595 Поэтому наиболее вероятно, что эти изменения МКД в области Соре отражают образование комплекса

низкоспинового гема <1 с лигандом, с?*-СО Увеличение концентрации СО до 1 мМ приводит к уменьшению сигнала А-типа низкоспинового гема Ьнг2* (рис 8,6), что соответствует переходу 15% этого гема в комплекс с СО, ¿5582+-СО в то же время мы не обнаружили изменения формы или интенсивности сигнала МКД гема ¿595 при 600 нм в полосе Соре наблюдаются лишь незначительные добавочные изменения, главным образом выражающиеся в небольшом нарастании провала при 430 нм (рис 8,а) При этом величина минимума при 442 нм практически не меняется

Таким образом, все вышеизложенное свидетельствует об отсутствии взаимодействия большей части (>95%) высокоспинового гема ¿5952+ с окисью углерода

Рис 8 Изменения сигнала МКД цитохрома bd в полосе Соре (а) и видимой области (б), вызываемые 1 мМ СО Представлены спектры МКД изолированного фермента 1 - восстановленный дитионитом (сплошная линия), 2 - после добавления СО (пунктирная линия), 3 - разность между 2 и 1

Взаимодействие СО с изолированным цитохромом bd при низкой температуре Мы сравнили спектральные изменения, обусловленные связыванием и фотодиссоциацией СО при комнатной и низкой температурах, используя один и тот же препарат изолированного цитохрома bd A nnelandu Освещение замороженного комплекса восстановленного цитохрома bd с СО сфокусированным белым светом в течение 3 мин вызывает изменения поглощения, указывающие на красный сдвиг полосы Соре Форма этого спектра типична для фотодиссоциации СО от высокоспинового гема b В этих условиях, фотоиндуцируемых изменений гема d в длинноволновой области не наблюдается по причине парной рекомбинации СО с гемом d, скорость которой очень высока даже при -100 °С [Poole, 1988] Благодаря этой особенности, исследования низкотемпературной фотодиссоциации являются селективными по отношению к гему 6595 Таким образом, диссоциация СО от высокоспинового гема Ъ595 - единственное событие, которое выявляют индуцированные светом спектры цитохрома bd при -100 °С Нормированные фотоиндуцированные изменения поглощения гема ¿595 соответствуют фотодиссоциации СО от ~6% гема ¿595 при -70 °С и даже от меньшей фракции (~4%) при -100 °С

Рекомбинация СО с восстановленным цитохромом bd A vmelandii в микро/миллисекундной временной шкале при комнатной температуре. Независимое подтверждение связывания СО с небольшой фракцией гема ¿595 в том же препарате цитохрома bd A vinelandn получено при исследовании рекомбинации СО с восстановленным цитохромом bd в микро/миллисекундной временной шкале вслед за индуцированным лазерным светом фотолизом комплекса фермента с лигандом при комнатной температуре Рекомбинация проходила в несколько фаз Быстрая фаза хорошо разделялась кинетически с характеристическим временем т=18±3 мкс при -1 мМ СО (константа скорости второго порядка - 5,5x10s М"'с ') Разностный спектр быстрой фазы типичен для связывания СО с гемом d Более медленная часть рекомбинации включает 2-3 фазы со значениями г в пределах 0,2-2,3 мс, однако разностные спектры этих фаз схожи между собой и указывают на связывание СО с гемом типа b Из общей амплитуды спектральных изменений в медленной части ответа следует, что с СО при комнатной температуре взаимодействует не более 2-3% гема 6595

Изучение фотодиссоциации СО из комплекса с изолированным цитохромом bd Е coll, находящимся в полностью восстановленной форме (R) либо в состоянии смешанной валентности (MV) в пикосекундной временной шкале

Мы сравнили изменения поглощения, вызываемые фотодиссоциацией СО от цитохрома bd Е coli в разных состояниях окисления в пикосекундной временной шкале На рис 9 приведены спектры фотолиза комплексов R-CO и MV-СО фермента Как форма, так и динамика спектральных изменений заметно отличаются в этих двух комплексах Разностные спектры фотодиссоциации СО, наблюдаемые в области Соре для формы R-CO фермента после завершения электронных релаксаций, показана на рис 9А Форма абсорбционных изменений напоминает обращенный разностный стационарный спектр, вызываемый связыванием СО с восстановленным цитохромом bd с его типичной W-образной формой Напротив, ответ комплекса MV-СО фермента характеризуется разностным спектром более простой формы, соответствующим нарастанию широкой полосы с максимумом при 431-434 им (рис 9Б) Мы склонны приписать эту полосу промежуточно генерируемому гему d, несвязанному с лигандами Таким образом, впервые удалось зарегистрировать спектры изменения поглощения в области Соре при фотодиссоциации СО от цитохрома bd в MV состоянии

8| 42S А

V * 1 R-CO

\ 20 пс

250 nc \

4Э4 Рис 9 Фотодиссоциация СО из R (А)

х 2 ± Б а / ' по и MV (Б) редокс-состояний

/гзо пЛ MV-CO изолированного цитохрома bd Е coli

- \ Амплитуда изменений поглощения,

--- ' ""ч \ , »»»-« - s наблюдаемая у MV-СО комплекса,

увеличена в 2 раза Длина волны

410 Л20 ДЗО 440 450 4вО 47С Длина волны нм возбуждения - 620 нм

При сравнении изотропных пикосекундных спектров фотодиссоциации СО из комплексов R-CO и MV-СО фермента установлено, что взаимодействие СО с гемом d влияет на восстановленный гем ¿595, вызывая изменение поглощения в области 435 нм в пикосекундной временной шкале Это свидетельствует о близком расположении гемов d и Ь;95 и о формировании ими совместного двухъядерного центра восстановления кислорода ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С ЦИАНИДОМ Цель - изучить особенности реакции ципюхрома bd с цианидом, установить, взаимодействует ли этот лиганд с окисленным гемом bsss мембранной и изолированной форм фермента

Реакция KCN с цитохромом bd бактериальных мембран Добавление 50 мМ KCN к субклеточным пузырькам Е coli, содержащим цитохром bd, вызывает распад оксикомплекса гема d (падение поглощения при 648 нм) При этом наблюдается не описанный ранее длинноволновый сдвиг полосы Соре и рост поглощения при 562 нм Увеличение амплитуды разностного спектра в Соре коррелирует во времени с нарастанием оптической плотности при 562 нм, но не совпадает с возникновением провала при 648 нм Большая часть изменений в -/-полосе отражает восстановление гема Ьщ эндогенными источниками электронов, а не собственно связывание лиганда Прединкубация мембран с окислителями феррицинием и персульфатом не вызывает окисления гема d При добавлении KCN к таким мембранам вслед за описанным выше увеличением амплитуды разностного спектра в Соре в течение первых 45 мин происходит медленное обращение спектральных изменений и в конце концов возникает устойчивый ответ с Дг^мю ~ 20 мМ'см"1 Его небольшая величина свидетельствует о связывании цианида преимущественно с гемом d

Реакция KCN с окисленной формой изолированного цитохрома bd. На рис 10 представлен разностный спектр поглощения фермента (обработанный KCN минус окисленный BQCI4) В видимой области добавление субмиллимолярных концентраций KCN приводит к появлению полосы с максимумом при 624 нм и небольшими провалами около 597 и 650 нм, а также пика при 577 нм (рис 10,6, спектр 1) Кроме того, наблюдается исчезновение полосы при 740 нм, являющейся полосой переноса заряда высокоспинового

окисленного гема d В области Соре регистрируется небольшой длинноволновый сдвиг с максимумом при 431 нм и минимумом при 409 нм с Лздм!» - 25-28 мМ"'см' (рнс 10,а, кривая 1), напоминающий таковой у цитохром с1 - содержащих мембран в присутствии окислителей Небольшая величина изменений в Соре указывает на отсутствие взаимодействия цианида с темами типа Ъ при данной концентрации лиганда Повышение концентрации Ii.CN до 50 мМ приводит к увеличению амплитуды ответа в Соре и появлению пика при 537 нм (рис 10, кривая 2) Приращение спектральных изменений в у-полосе отражает связывание цианида дополнительно с частью (~ 15%) низкоспинового гема Ьщ

4 А 6

К BIT / \

ш XJ V "

"T""^ 1 r\tM

\\F v \i A \J *

\

V \i T г

Y

JiA=a,05

5dd 600 7dü Опина волны ни

Рис 10 Сопоставление вызываемых цианидом

спектральных ответов

изолированного окисленного цитохрома bd Е coli в полосе Соре (а) и видимой области (б) Представлены разностные

спектры, записанные через 30 мин после добавления 0,5 мМ KCN (1) и через 10 мин после добавления 50 мМ KCN (2)

Исследование магнито-оптической активности изолированного полностью окисленного цитохрома Ьй и его комплекса с цианидом Мы исследовали сигналы МКД изолированного полностью окисленного цитохрома bd и его цианидного комплекса при комнатной температуре В области Соре спектра МКД окисленного цитохрома bd наиболее выражен характерный для низкоспинового гема Ь3г интенсивный сигнал типа А (рис 11, кривая 1) Этот сигнал в основном относится к низкоспиновому тему Ь55в3+ Добавление 0,5 мМ КСК к окисленному ферменту не вызывает изменений в спектре МКД Отсутствие значительных изменений в сигнале МКД окисленного фермента после добавления субмиллимолярных концентраций лиганда однозначно свидетельствует против того, что какая-либо существенная фракция гема типа Ь связывает цианид Сигнал гема d, по-видимому, очень мал 50 мМ цианид, добавленный к ферменту, вызывает некоторые изменения сигнала МКД, которые выражаются в появлении полосы с максимумом при 420 нм и минимумами около 412 и 433 нм в разностном спектре МКД (рис 11, кривая 3) Это соответствует переходу 15-17% низкоспинового гема Ьщ1* в комплекс с цианидом Хотя мы не можем исключить, что небольшая фракция высокоспинового окисленного гема Ь (<5%) также взаимодействует с цианидом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что большая часть гема Ьт не связывает КСЫ даже при высокой концентрации лиганда

-ISO

Рис 11 Изменения характеристик МКД цитохрома Ы, вызываемые 50 мМ цианидом Представлены спектры МКД изолированного фермента 1 - окисленный (сплошная линия), 2 - после добавления КСИ (пунктирная линия), 3 - разность между 2 и 1

Длина волны, ни

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С КИСЛОРОДОМ

Цель - определить сродство цитохрома bd к кислороду, сравнить кинетику связывания разных редокс-форм фермента с О2, охарактеризовать основные каталитические интерчедиаты, выяснить, кате из стадий каталитического цикла фермента сопряжены с генерацией мембранного потенциала

Определение кажущейся константы диссоциации (Kd[02) комплексов изолированного цитохрома bd E.coli и A.vinelandii с кислородом. В отличие от гем-медных терминальных оксидаз, изолированный цитохром bd находится преимущественно в виде стабильного оксигенированного комплекса {bsss^bs^^-Oi), который характеризуется полосой поглощения при 645-650 нм Оксигенированный цитохром bd может быть легко переведен в одноэлеиронную форму без кислорода путем уравновешивания образца с атмосферой аргона За уходом кислорода от гема d можно следить по сдвигу а-полосы поглощения гема от 645-648 нм в область 626-630 нм Оксикомплекс гема d можно регенерировать путем титрования анаэробного одноэлектронного (MV) фермента кислородом Добавление возрастающих концентраций О2 к анаэробной MV форме цитохрома bd Ecoli вызывает пошаговое увеличение амплитуды разностных спектров поглощения, соответствующее красному сдвигу а-полосы поглощения гема d Зависимость спектральных изменений фермента Е coli при 648-626 нм от концентрации кислорода имеет вид кривой с насыщением, соответствуя кажущейся = 280 нМ для оксикомплекса гема d Таким же способом определили кажущуюся для фермента А vinelandu Ее значение составило 0,5 мкМ Таким образом, оксидазы W-типа этих двух бактерий имеют сходное и довольно высокое сродство к кислороду

Кинетика связывания кислорода с изолированным цитохромом bdA.vmelandic. На рис 12А показаны типичные кинетические кривые связывания Ог с MV формой фермента после фотолиза СО при разных концентрациях кислорода Скорость реакции описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой Кинетический спектр реакции (рис 12Б) идентичен стационарному разностному спектру, характеризующему образование оксикомплекса гема d Скорость реакции возрастает с увеличением концентрации Ог, однако

эта зависимость не является линейной, но описывается гиперболической функцией (рис 12В) Реакция кислорода с Я формой цитохрома Ьс1 не останавливается на стадии образования оксикомплекса, а идет дальше с образованием других интермедиатов Остановимся на самой первой стадии реакции Я формы фермента с 02 - образовании комплекса 02 Кинетический спектр этой фазы идентичен таковому для МУ формы фермента В отличие от МУ формы цитохрома Ьс1, скорость образования оксикомплекса у Я формы фермента возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации 02 без признаков насыщения (рис 12В) Полученное значение константы скорости второго порядка (коп) для Я формы цитохрома bd составляет 1,96x10® М 'с 1 Это очень близко по величине к пределу, контролируемому диффузией кислорода в воде (6,5x10' М"'с ')

Рис 12 Кинетика связывания кислорода с цитохромом Ьд А \inelandu (А) Кинетические кривые связывания 02 с МУ формой фермента при 650минус 630 нм, [02] - 50, 100, 195 и 380 мкМ (Б) Кинетический спектр реакции для МУ формы фермента (В) Зависимость наблюдаемой скорости реакции от концентрации 02 (Я форма - квадратные символы, МУ форма - символы-кружки) Сплошные линии представляют собой теоретические кривые

Четыре последовательные стадии каталитического цикла цитохрома bd. Обнаружение нового интермедиата - переписного комплекса гема d На рис 13А показаны оптические изменения в течение первых 100 мкс реакции дчя фермента Ecoli в форме R с кислородом Начальное, неразрешаемое во времени падение поглощения отражает фотолиз СО из восстановленного фермента (R-CO—»R переход), вслед за которым наблюдаются еще три перехода, которые хорошо разрешаются во времени (рис 13Б) Эти три перехода описываются тремя последовательными стадиями с т 1,4,4,5 и 47 мкс (рис 13Б, главная панель) Соответствующие разностные кинетические спектры этих фаз представлены на рис 13В Спектр 1,4-мкс фазы имеет минимум при 630 нм и максимум при 654 нм, что характерно для образования оксикомплекса - интермедиата А (R—»A переход) Спектр 4,5-мкс фазы имеет минимум при 654 нм (исчезновение интермедиата А) и максимум при 635 нм, который отражает образование интермедиата, не зарегистрированного ранее Мы обозначили этот новый интермедиат «Р» и 4,5-мкс фазу как А—»P переход В ходе А-»Р перехода гем ¿1595 окисляется Спектр 47-мкс фазы имеет минимумы при 561 нм (окисление гема Ьщ) и 640 нм (распад интермедиата Р) и максимум при 680 нм Пик при 680 нм характерен для оксоферрильного комплекса гема d (интермедиат F), таким образом, 47-мкс фаза соответствует Р—>F переходу Как показано во вставке к рис 13Б, изменения

поглощения цитохрома bd A vmelcmdii, вызванные кислородом, очень напоминают таковые для фермента Е coli

Поскольку цитохром bd несет три редокс-группы, R является трехэлектронной формой восстановленного фермента Реакция трехэлектронной формы восстановленного фермента с кислородом останавливается на стадии образования интермедиата F Однако при определенных условиях возможно получить изолированный цитохром bdЕ coli, содержащий некоторое количество связанного хинола Такая форма восстановленного фермента содержит пять восстановительных эквивалентов и реакция с кислородом идет дальше образования Г Наши эксперименты с таким препаратом фермента выявляют дополнительную фазу с т = 1,1 мс Спектр 1,1-мс фазы имеет минимум при 680 нм и максимум при 645 нм (рис 13В), что может соответствовать превращению F в полностью окисленный фермент (О) или, скорее, в оксикомплекс(А)

550 600 650 ТОО длина волны, нм

0 50 100

время, мкс

550 600 650 700 длина волны, нм

Рис 13 Реакция полностью восстановленного изолированного цитохрома bd с кислородом при 21 °С (А) Спектральные изменения во времени после индуцированной лазерным светом диссоциации СО из фермента Е coli в присутствии О2 (Б) Кинетические кривые реакции при 654 минус 635 нм для цитохромов bd Ecoli (главная панель) и Avinelandu (вставка) Теоретическая кривая, описывающая экспериментальные данные (точки), показывает, что за неразрешаемой во времени фазой фотолиза СО (R-CO—>R) следуют три экспоненциальных перехода с т 1,4 мкс (R—>А), 4,5 мкс (А-»Р) и 47 мкс (Р—>F) (В) Разностные кинетические спектры четырех фаз в видимой области 1,4-мкс (мелкопунктирная линия), 4,5-мкс {сплошная линия), 47-мкс (крупнопунктирная линия) и 1,1-мс (сплошная линия серого цвета)

Сравнение электрометрической и оптической кривых во времени дчя реакции восстановленного цитохрома bd с кислородом На рис 14 сопоставлены кинетики образования мембранного потенциала (пунктирная линия) и спектральных изменений при ААб54-б35 (сплошная линия) в ходе каталитического акта фермента Электрометрический ответ

в ходе одного молекулярного оборота дитохрома bd зарегистрирован нами впервые. Он состоит из начальной неэлектрогенной фазы, за которой следует фаза электрогенная. Анализ электрометрической кривой с использованием констант скоростей, полученных в спектрофотометрических измерениях, показывает, что первые два процесса, приписываемые образованию интермедиата А, за которым следует А—>Р переход, не являются электрогенными. Таким образом, как Л—»А, так и А->Р переход не сопряжены с переносом заряда поперек мембраны. В трехэлектронной форме восстановленного цитохрома Ъс1 (без связанного хинола), за неэлектрогенным плато следует электрогенная фаза (рис. 14, пунктирная линия), которая развивается параллельно с 47-мкс фазой, наблюдаемой в спектрофотометрическом эксперименте (рис. 14, сплошная линия). Таким образом, эта электрогенная фаза соответствует превращению интермедиата Р в форму Ж переход).

В случае, когда фермент содержит связанный хинол, наблюдается дополнительная электрогенная фаза с т 0,6-1,1 мс. Эта медленная электрогенная фаза совпадает во времени со спектральной фазой, отражающей Р—>А переход.

Рис. 14. Сравнение

электрометрической и оптической кривых во времени для реакции трехэлектронной формы

восстановленного цитохрома bd Е.соН с кислородом.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА bd С NO

Цель - исследовать механизм ингибирования активности цитохрома bd окисью азота; выяснить, с какими формами фермента способен взаимодействовать N0.

Связывание NО с MV и R формами цитохрома bd. Цитохромы bd из Е.соН и A.vinelandii как в состоянии смешанной валентности, так и полностью восстановленной форме способны связывать N О. N0 связывается с восстановленным гемом d, образуя нитрозильный комплекс (Fe2+-NO).

Ингибирование активности цитохрома bd окисью азота. N0 является сильным ингибитором Ог-редуктазной активности цитохрома bd E.coli. Кажущаяся константа ингибирования (Ki) дня N0 составляет 100 ± 34 нМ (п = 10) при [02] ~ 70 мкМ. Эта величина не сильно отличается от таковой для фермента А. vinelandii. При более высокой концентрации 02 (~ 1мМ О2) измеряли значительно большую величину Ki (~ 230 нМ N0), что свидетельствует о конкуренции между N0 и 02. В аэробном растворе N0 спонтанно деградирует, реагируя с кислородом. Когда концентрация NO падает ниже 200 нМ,

происходит обращение ингибирования цитохрома bd и фермент постепенно восстанавливает первоначальную (до добавления N0) активность. Кинетику восстановления активности измеряли с использованием окси-Hb в качестве «утилизатора» N0. При исчерпании N0 после добавления Hb наблюдается быстрое и полное восстановление 02-редуктазной активности цитохрома bd Е. coli. То же наблюдали для фермента, выделенного из А. vinelandii.

Тест на NO-редуктазную активность цитохрома bd. Способность терминальных оксидаз типа bd из E.coli и A.vinelandii катализировать восстановление N0 в анаэробных восстанавливающих условиях проверяли амперометрически при концентрациях N0 3-30 мкМ, используя в качестве восстановителей ДТТ/Qi, либо пару аскорбат/ТМФД. Такая активность у фермента E.coli не обнаруживается; схожие результаты получены и для оксидазы A.vinelandii. В присутствии избытка восстановителей, N0 действительно медленно разлагается, однако скорость этого процесса не меняется при добавлении как выделенного, так и предварительно восстановленного фермента.

Взаимодействие N0 с оксоферрильным интермедиатом цитохрома bd. Добавление цитохрома bd A.vinelandii в форме F к анаэробному буферу, содержащему избыток NO, вызывает исчезновение из раствора примерно равного количества N0 (1,04 ± 0,08 (п = 12) моль N0 на моль фермента). При смешивании в анаэробных условиях с буфером, содержащим 100 мкМ NO, F состояние фермента исчезает в пределах 1 с и вместо него появляется форма с широкой полосой около 625 нм (рис. 15А). Реакция описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой. Константа скорости псевдо-первого порядка линейно зависит от концентрации N0 (рис. 15Г). Полученное значение константы скорости второго порядка (Ао„) составляет 1,2 ± 0,1 х 105 М'1 с"!. Продукт реакции оксоферрильной формы (F) цитохрома bd с N0 является комплексом полностью окисленного фермента (О) с нитритом, по-видимому связанным с гемом ¿t*.

[N01. мкМ

Рис. 15. Кинетика реакции оксоферрильной формы цитохрома bd A.vinelandii с N0. (А) Абсолютные спектры поглощения после смешивания К с 100 мкМ N0. (Б) Разностные спектры поглощения. (В) Теоретическая кривая. Вставка: кинетический спектр, полученный при анализе. (Г) Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции от [N0].

ДИССОЦИАЦИЯ ЛИГАНДОВ (02, N0, СО) ОТ ГЕМА d

Цель - изучить диссоциацию Oj, N0 и СО от цитохрома bd, выяснить, зависит ли скорость диссоциации лиганда отредокс-состояния фермента

Диссоциация Ог После смешивания изолированного цитохрома bd Ecoh (представленного в основном формой MV-Ог) с избытком N0, во времени разрешаются два процесса Менее чем за 100 мс, исходная а-полоса гема d уменьшается по величине и смещается от 645 до 641-642 нм, после чего наблюдается ее дальнейший синий сдвиг до 636 нм, одновременно с исчезновением плеча при 680 нм Первый интермедиат реакции, детектируемый через 75 мс после смешивания, является ферментом в MV форме, в которой N0 связан с восстановленным гемом d (MV-NO) Таким образом, после смешивания с N0, О2, связанный с гемом d2*, быстро диссоциирует, замещаясь NO, без редокс изменений на уровне гемов Происходящее вслед за этим исчезновение полосы 680 нм свидетельствует о том, что после обмена лигандов (O2/NO) происходит медленная (несколько секунд) реакция N0 с маленькой фракцией оксоферрильного (Г) фермента, присутствующая в цитохроме bd при выделении Кинетические кривые изменения поглощения при 649 нм при разных концентрациях N0 описываются суммой двух экспонент Первая фаза соответствует обмену лигандов (O2/NO) на геме , с константой, достигающей порогового значения (плато) 78 с"1 при 1 мМ N0 Эту скорость-лимитирующую величину мы приписываем клг для О2 связанного с гемом <?* в MV ферменте Вторая фаза линейно зависит от концентрации N0, соответствуя реакции N0 с фракцией оксоферрильного фермента

Диссоциация NO Связанный с N0 цитохром bd быстро смешивали с уравновешенным с воздухом буфером, содержащим МЬ-02 и об высвобождении N0 из фермента судили по появлению мет-Mb при 581 нм Свободный N0 убирался из раствора при взаимодействии с МЬ-02 за время перемешивания (< 2 мс), после этого N0, связанный с гемом d1*, вытеснялся диссоциировал и окислял МЬ-02 Диссоциация N0 протекает моноэкспоненциально с к = 0,133 ± 0,005 с1 и 0,036 ± 0,003 с1 из R и MV форм цитохрома bd, соответственно (рис 16) После замещения N0 с MV ферментом не происходит ничего, тогда как в случае R фермента, за NO/O2 обменом следует полное окисление цитохрома bd

1СЮ

о-

О 20 40

60 60 100

Рис 16 Диссоциация N0 Приведены кинетические кривые диссоциации N0 от цитохрома bd Регистрировали изменения поглощения при 581 нм после смешивания связанного с N0 фермента с уравновешенным с воздухом буфером, содержащим МЬ-Ог Вставка разностный спектр поглощения - МЬ-Ог минус мет-МЬ

Время с

Диссоциация СО В похожем эксперименте исследовали кинетику диссоциации СО из цитохрома bd, при этом в качестве замещающего лиганда использовали Ог О вытеснении СО из MV фермента судили по моноэкспоненциальному падению поглощения при 632 нм и его одновременному увеличению при 648 нм, при этом величина к сотавила 4,20 ± 0,34 с"' Реакция Ог с СО-связанным ферментом в R форме, измеряемая при 632 и 560 нм, протекала быстрее, моноэкспоненциально (к - 6,0 ± 0,2 с'), и являлась скорость-лимитирукнцей стадией для полного окисления фермента кислородом

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНОЙ ФОРМЫ ФЕРМЕНТА Е445А И ОКСИДАЗЫ ДИКОГО ТИПА

Цель - с помощью каталитически неактивного мутаптного фемента Е445Л выяснить роль гема 6595 в активном центре, а также специфическую функцию высококонсервативного остатка Е445 в сопряжении электронного транспорта с переносом протонов в цитохроме bd

Недавно вышло сообщение о том, что точечная замена глутамата-445 на аланин в субъединице I цитохрома bd Е colt приводит к инактивации фермента и потере гема ¿595 [Zhang et al, 2001] В данной работе мы показали, что гем ¿>595 в мутанте Е445А сохраняется, ио теряет способность к восстановлению даже в присутствии сильного восстановителя (дитионита) Столь уникальная возможность получить двухэлектронную форму фермента была использована для анализа роли гема ¿595

Гем ¿595 присутствует в мутантной фор не E44SA цитохрома bd При сравнении изменений поглощения после фотолиза СО из гема if* в восстановленных дитионитом ферментах дикого типа и мутантном Е445А оказалось, что в случае дикого типа, разностный спектр рекомбинации СО в присутствии 1% СО имеет минимум при 642 нм и максимум при 622 нм, что соответствует ресвязыванию СО с гемом d2* Напротив, в мутантном ферменте, спектр фазы рекомбинации СО включает не только связывание СО с гемом г/2+, но также и некоторое перераспределение электрона, соответствующее переносу электрона от восстановленного гема 6595 к окисленному гему d Разностный спектр рекомбинации СО мутанта Е445А и дикого типа имеет максимумы при 595 и 562 нм и минимум при 630 нм, что очень напоминает «восстановленный минус окисленный» спектр гема ¿595, с добавлением провала при 630 нм, свидетельствующего об окислении гема d при фотолизе СО у мутанта Таким образом, гем ¿595 в мутантном ферменте присутствует Применение метода пиридин-гемохромогена подтвердило этот вывод как в мутантном ферменте, так и в оксидазе дикого типа, стехиометрия гемов bag/d составляет 1 и обшее отношение гемов b к гему d равно 2 Заключение о том, что гем ¿595 присутствует в мутанте Е445А, но сохраняет высокоспиновую окисленную форму даже в присутствии избытка дитионита, подтверждается данными ЭПР После добавления дитионита, сигналы ЭПР у дикого типа не обнаруживаются, поскольку все три гема восстанавливаются до ЭПР-«молчащих» ферроформ Однако, в случае мутанта, регистрируется сигнал с g-фактором ~6 (рис 17), принадлежащий высокоспиновому окисленному гему b несмотря на присутствие дитионита

g-фактор

8 4121_6 7267_»6081_4 8069

800 300 1000 1100 1200 1300 1400

Магнитное поле, Гаусс

Рис 17 Спектры ЭПР «окисленного на воздухе» (пунктирная линия) и восстановленного дитионитом (сплошная линия) мутантного фермента Е445А Спектр, обозначенный сплошной линией, получали в присутствии 5 мМ дитионита натрия

Замена Е445А сильно ипгибирует перенос заряда поперек мембраны, сопряженный с окислением цитохрома bd кислородом. Проведены электрометрические измерения генерации ДЧ', ассоциированной с реакцией мутантной оксидазы и фермента дикого типа с кислородом в одинаковых экспериментальных условиях Кинетика электрометрического ответа полностью восстановленного фермента дикого типа (рис 18, кривая 1) хорошо моделируется четырьмя последовательными реакциями Первые два перехода не являются электрогенными и соответствуют образованию оксикомплекса фермента (И—»А переход) и его превращению в перекисный комплекс (А—>Р переход) Третья фаза является электрогенной (т ~ 90 мкс, амплитуда, -3,2 мВ) и отражает переход перекисного комплекса в оксоферрильную форму (Р—»К переход) Поскольку в этом эксперименте фермент содержит связанный хинол, наблюдается дополнительная, четвертая фаза, являющаяся электрогенной (т ~ 600 мкс, амплитуда, -1,6 мВ) Эта самая медленная, электрогенная фаза отражает переход оксоферрильного (Ж) фермента дикого типа в окисленную (О) и/или оксигенированную (А) форму Как и в случае цитохрома Ьс1 дикого типа, в реакции восстановленного мутантного фермента Е445А с кислородом наблюдается начальная неэлектрогенная стадия Однако мутант, в отличие от дикого типа, не выявляет какой-либо микросекундной фазы генерации Вместо этого у мутанта наблюдается более медленная, небольшая электрогенная фаза (т ~ 1,3 мс, амплитуда, -0,36 мВ), за которой следует электрогенный переход гораздо большей амплитуды (т ~ 12,5 мс, амплитуда, -1,7 мВ), что видно на рис 18 Обе электрогенные фазы скорее всего отражают Р—>Р переход в разных субпопуляциях фермента

— -

\ 0 Л

\

\ S

\---

с го *о

Время мс

1

Время, мс

Рис 18 Генерация мембранного потенциала в реакции восстановленного цитохрома bd Е colt с кислородом Кривая 1 - фермент дикого типа, кривая 2 -мутантный фермент Е445А Вставка генерация ДО в реакции восстановленного мутантного цитохрома bd с Ог во временной шкале 0 ->• 40 мс

Замена Е445А не ингибирует обратный перенос электрона с гема ¡Р* на гемы ¡¡¡я и ¿>595, вызванного фотолизом СО от гема г/2* в однозлектронной форме цитохрома Ь(1 Мы сравнили реакции обратного переноса электрона для ферментов дикого типа и мутанта Е445А Удивительно, но полученные данные оказались очень схожими Рекомбинация СО с гемом А после фотолиза однозлектронной формы цитохрома Ъ<1 включает (а) ресвязывание СО с гемом с! после вспышки и (б) возврат электронов из временно восстановленных гемов ¿558 и ¿595 на гем с! Поэтому спектр ресвязывания СО для однозлектронной формы фермента состоит из спектральных изменений, индуцируемых связыванием СО с гемом с1, а также изменений, вызванных перераспределением электрона, сопровождающим это связывание Спектральный вклад, вызванный оксидоредукцией гемов демонстрирует восстановление гема с1 и сопутствующее окистение гемов Ьщ и ¿595 Примерно 25% гема й подвергается редокс-превращению в результате фотолиза Если количество гема с1, которое подвергается восстановлению при ресвязывании с СО, принять за 100%, получается, что только ~20% этого восстановительного эквивалента соответствует окислению гема Ьц% в оксидазе дикого типа и -18% в мутантном ферменте Другим источником электронов, возвращающихся на гем с1, должен быть гем ¿595 Таким образом, в обоих ферментах, фотолиз СО от гема с?+ в однозлектронной форме оксидазы приводит к частичному восстановлению гемов и ¿595, причем большая часть электрона (~80%) оказывается на геме ¿595

Замена Е445А не ингибирует генерацию мембранного потенциала, сопряженную с внутримолекулярным перераспределением электрона между гемами и ¿558 Перераспределение электронов также сопряжено с перемещением протонов поперек мембраны, приводя к генерации ДУ обратного знака по-сравнению с наблюдаемой в прямой реакции оксидазы с кислородом Разделение зарядов в цитохроме М вызывается трансмембранным перемещением именно протонов, а не электронов Анализ кинетических кривых генерации ДО после фотодиссоциации СО из одноэлектронного фермента дикого типа выявляет две электрогенные фазы с Т1 = 112 мке и т2 = 385 мке Соответствующий электрогенный ответ мутантного фермента Е445А также описывается двумя экспонентами с Т1 = 83 мке и т2 = 278 мке Значения этих констант скоростей близки к таковым для фермента дикого типа Этот результат расходится с данными по генерации ДЧ* в реакции 02 с восстановленными ферментами, где электрогенные процессы, наблюдаемые при окислении мутанта, существенно замедлены по-сравнению с таковыми у цитохрома ¿с? дикого типа

Сравнение стационарных спектров поглощения мутантного фермента Е445А и цитохрома Ьй дикого типа. Мы сравнили абсолютные спектры поглощения восстановленных дитионитом мутантного фермента Е445А и оксидазы дикого типа Полосы поглощения гемов с1 (630 нм) и ¿558 (561 и 531 нм) в мутанте сохраняются Однако, отсутствие полосы при 595 нм, заметное уменьшение пика при 561 нм и исчезновение плеча около 440 нм в полосе Соре указывают на потерю вклада восстановленного гема ¿595 в суммарный спектр поглощения мутанта Этот вывод полностью согласуется с нашими данными ЭПР-спекгроскопии и фотолиза СО, изложенными ранее Итак, гем ¿595 в мутантном ферменте Е445А присутствует, но не восстанавливается дитионитом

Спектры кругового дихроизма (КД) мутантного фермента E44SA и цитохрома bd дикого типа: экситонные взаимодействия между восстановленными гемами d и ¿595. Оптическую активность цитохрома bd ранее не исследовали Спектр КД фермента дикого типа (рис 19А, сплошная линия) характеризуется максимумом при 629 нм, а также интенсивным асимметричным сигналом в области Соре с минимумом при 440 нм и небольшим максимумом при 416 нм с плечом при 397 нм Интенсивность сигнала КД в области Соре (Дешб-440 ~ 400 мМ"'см') исключительно велика для гемопротеинов с единственным (например, цитохром с или миоглобин) или несколькими, слабо взаимодействующими гемами (к примеру, гемоглобин) Обычно такие значения As составляют 10-50 mM"W [Муег, 1985, Palmer and Esposti, 1994] Полученные данные указывают на то, что в спектре КД цитохрома bd преобладает оптическая активность гсма d, тогда как вклад гемов bat и ¿395 незначителен Этот вывод хорошо иллюстрируется спектром КД восстановленного мутантного фермента L65C, у которого имеются гемы b$ss и ¿595, но отсутствует гем d (рис 19А, крупно-пунктирная линия) На рис. 19А (мелко-пункгирные линии) представлены спектры КД мутантной формы фермента Е445А В дальней «красной» области, спектры КД мутанта и дикого типа идентичны, - как в восстановленном дитионитом (главная панель), так и в «окисленном на воздухе» состояниях (вставка) Это наблюдение согласуется с данными абсорбционной спектроскопии В то же время, мутация Е445А вызывает существенные изменения в области Соре спектр уменьшается по амплитуде и сдвигается в коротковолновую область

Разность между спектрами КД восстановленных дитионитом ферментов дикого типа и мутанта Е445А (рис 19Б) представляет собой кривую с амплитудой (ÄE426-442 ~ 300 мМ 'см '), близкой к таковой исходных спектров КД сигнал столь высокой интенсивности беспрецедентен для изолированного гема в белке [Mycr, 19S5, Palmer and Esposti, 1994] Индуцированные сигналы КД глобинов или комплексов гем-пептидов обычно гораздо меньше (< 50 мМ"'см"') и очень асимметричны [Blauer et al, 1993, Goldbeck et al, 1997] С другой стороны, сигнал такой формы и амплитуды следует ожидать в случае экситонного расщепления электронных переходов двух взаимодействующих хромофоров Такие взаимодействия наблюдали в спектрах КД двухгемового цитохрома b хромаффинных гранул [Degh Esposti et al, 1989], комплексов II [Esposti et al, 1991] и III [Degh Esposti et al, 1989] дыхательной цепи и в комплексе b(f хлоропластов [Schoepp et al, 2000] Поэтому можно сделать заключение, что интенсивный разностный спектр КД, представленный на рис 19Б, отражает экситонное взаимодействие между восстановленными гемами d и ¿595 в цитохроме bd дикого типа Такого рода взаимодействия не наблюдаются в мутантном ферменте Е445А, поскольку гем 6595 остается в окисленном состоянии несмотря на присутствие избытка дитионита

"Диадй Turf'

L65C

629 яХ.

Оксикомплвкс

E44SA

.Ц

■aerntuf

£20 640 660

600 600 Длина волны, нм

"Дииий тип" 426 л Е445А Б 435 /

Г 42

700 35 0 4 00 4 50 500

Длина волны,нм

Рис 19 Спеюры кругового дихроизма восстановленных дитионитом цитохромов bd (А) Абсолютные спектры КД ферментов дикого типа (сплошная линия), а также мутантных форм Е445А (мелко-пунктирная линия) и L65C (крупно-пунктирная линия) Вставка ближняя инфракрасная область КД тема d из спектров «окисленных на воздухе» ферментов дикого типа и мутанта Е445А (Б) Разность между нормированными спектрами КД восстановленных дитионитом ферментов дикого типа и Е445А в области Соре

Моделирование экситонных взаимодействий между темами d и 6595 позволяет оценить расстояние между этими темами Расчетное расстояние между гемовыми атомами железа (Fej595—Fe¿) оказалось равным ~10 А

ОБСУЖДЕНИЕ

Почему MV и R формы цитохрома bd имеют разные концентрационные зависимости наблюдаемых скоростей связывания О27 Концентрационные зависимости наблюдаемых скоростей связывания кислорода с гемом для MV и R форм цитохрома bd A vinelandu заметно отличаются Для R формы, зависимость имеет линейный характер и хорошо описывается простой одноступенчатой реакцией связывания кислорода с = 1,96x10® M"V Напротив, когда цитохром bd A vinelandii находится в MV форме, зависимость наблюдаемых скоростей связывания от концентрации Ог носит явно гиперболический характер Эти данные могут означать, что (а) реакция 02 с MV формой фермента включает более чем одну стадию,

так что модель простого одностадийного связывания недостаточна для описания этого процесса, либо (б) ход реакции связывания кислорода с гемом контролируется редокс-состоянием гема(ов) Ъ

Кп К

Х + 02 О Х-02 => d1* -Ог > Схема 1

Ir

V

^2 Кп

bdc,oseá о bd°pen + 02 о

^-2

-»

bd°pen - Ог, Схема 2

Можно рассмотреть две модели (см Схемы 1 и 2) Согласно первой модели (Схема 1), существует спектрально неразличимое предсвязывание кислорода с центром Л1 (отличным от гема <?*), из которого молекула Ог в дальнейшем переносится на гем Поскольку такое связывание Ог с центром X не сопровождается спектральными изменениями, маловероятно, что X - один из гемовых центров Кроме того, в МУ форме фермента темы 6558 и ¿595 находятся в окисленном состоянии и потому не могут принимать участие в связывании кислорода Более вероятно, что в качестве X выступает некая полость, расположенная недалеко от гема Л

Согласно Схеме 1, наблюдаемые кинетики будут почти моноэкспоненциальными , определяемая из формулы

кГ~к,х-

[0,1

есть наблюдаемая скорость связывания Ог с гемом d1*, K¡kx) - равновесная константа диссоциации для комплекса Х-Ог Из анализа зависимости [Ог] от к°ь„' по указанной выше формуле следует, что значение при максимальной [02] соответствует константе

скорости k¡ - 7,2х105 с"', кажущаяся константа диссоциации К^х) = 5,5x1o-4 М, а касательная к начальному участку соответствует бимолекулярной константе скорости

1,3x10® М"'с"'

Последнее значение определяет верхнюю границу для истинной константы скорости связывания кислорода (4™)

Согласно второй модели, MV цитохром bd в равновесии существует в двух состояниях, но связывать Ог он может только в одном из них (Схема 2) Находясь в «закрытой» (closed) конформации, MV цитохром bd не обеспечивает доступ кислорода к гему тогда как в «открытой» (open) конформации кислород легко связывается Полностью

восстановленный фермент (R) всегда находится в «открытой» конформации Доля «закрытой» конформации в MV ферменте (или Кг для Схемы 2) определяется через отношение konMV/konR = 0,67 (то есть, Кг = 1,5) Анализ кинетических кривых в соответствии со Схемой 2 при разных концентрациях 02 дает fc = 5,1x10s с"! BR форме цитохрома bd, доступ Oi к тему d все время открыт и фермент по-видимому постоянно пребывает в «открытой» конформации, тогда как в MV форме (гем ¿595 окислен) происходит переход между «открытой» и «закрытой» конформациями Оценочное время открытия и закрытия канала для доступа кислорода составляет 2 мкс (Ш2) и 3 мкс (Кг/fe), соответственно Два сделанных нами наблюдения говорят в пользу вышеизложенной гипотезы (а) Фотолиз комплекса СО с Я цитохромом bdE colt приводит к полной фотодиссоциации молекулы СО в водную фазу Если эксперимент повторить с MV-СО комплексом, значительная часть СО, «отстреленной» от гема (до 70%), не покидает молекулы белка и вступает в парную рекомбинацию с гемом в суб-наносекундной временной шкале (б) Кажущиеся константы скорости самопроизвольной диссоциации лигандов, таких как СО или N0, от гема заметно ниже для MV формы цитохрома bd Е coli по сравнению с R формой фермента Мы полагаем, что у цитохрома bd, редокс-состояние гемов типа b (скорее всего, гема Ьщ) контролирует путь, по которому происходит перемещение лиганда между гемом d и водной фазой

Обнаружение нового интермедиата каталитического цикла - перекисного комплекса (Р) Полагают, что гем-содержащие ферменты (пероксидазы, каталазы, цитохромы Р450 и терминальные оксидазы) имеют очень похожие каталитические интермедиа™, а именно, перекисный и оксоферрильный Реакция пероксидаз с Н202 приводит к последовательному образованию перекисного комплекса (Соединение 0, Fe3+-OOH) и двух оксоферрильных интермедиатов - Соединение I (Fe4+=0 R*, где R' - порфириновый или аминокислотный радикал) и Соединение II (Fe4+=0) Соединение 0 смогли зарегистрировать при низких температурах [Baek and Van Wart, 1989], но не при комнатной температуре [Shmtaku et al, 2005] При изучении терминальных оксидаз гем-медного семейства выявили интермедиаты, аналогичные Соединению I (Рм) и Соединению II (Pr и F) Промежуточное образование перекисного интермедиата (Соединения 0) у гем-медных оксидаз предполагали, но никогда не регистрировали

Мы исследовали реакцию цитохромов bd из Ecoli и Avinelandu в форме R с кислородом Согласно ранее опубликованным данным, в этой реакции первоначально образованный интермедиат А переходит непосредственно в F, без какого-либо промежуточного интермедиата между А и F [Hill et al, 1994] Это противоречит той же самой реакции, катализируемой цитохром с оксидазой, в которой при идентичных условиях между А и F наблюдается промежуточное образование интермедиата Pr [Morgan et al, 1996] Считалось, что в реакции цитохрома bd с кислородом между А и F совсем не образуется интермедиата, либо такой интермедиат имеет слишком короткое время жизни, чтобы быть зарегистрированным Нам удалось разрешить во времени промежуточное образование спектрально-различимого интермедиата между А и F с т=4,5 мкс при 21 "С, который обозначили «Р» Мы полагаем, что Р не был замечен прежде [Hill et al, 1994] из-за некоторых ограничений в использованном методе исследования

В ходе реакции восстановленного цитохрома bd с О2, Соединение А распадается до интермедиата (обозначенного «Р») с максимумом поглощения при 635 нм с характеристическим временем 4,5 мкс А—>Р переход совпадает с окислением гема ¿595 Восстановление Oj двумя электронами достаточно для генерации двухэлектронной формы восстановленного Ог в активном центре, то есть, связанной (гидро)перекиси Однако, не вполне ясно, расщепляется ли 0-0 связь на этой стадии реакции Если О-О связь все еще цела, Р соответствует Соединению 0 в пероксидазах, то есть, истинному перекисному комплексу (Fed3+-0-0-(H)) Соединение 0 наблюдали у пероксидаз при низких температурах [Baek and Van Wart, 1989], но никогда не регистрировали у цитохром с оксидазы

Если 0-0 связь уже разрушена, Р является огсоферрильным комплексом Для образования оксоферрильной формы требуется четыре электрона, чтобы разрушить 0-0 связь В состоянии Р, два электрона могут прийти от гема d и один - от гема ¿555 Однако, четвертый электрон не может быть взят от гема Ьцг, поскольку на этой стадии реакции окисления гема Ьцj не наблюдается Следовательно, если Р является оксоферрильным комплексом, четвертый электрон должен прийти от находящейся рядом группы, - скорее всего, от аминокислотного остатка (Ре/+=02' R") В последнем случае, Р должен быть аналогом Соединения I цитохром с пероксидазы или интермедиата Рм цитохром с оксидазы Однако, изъятие электрона от аминокислотного остатка требует довольно высокого редокс потенциала, обычно выше +0,8 В [Stubbe and van Der Donk, 1998], и в этом случае окисление гема ¿558 (Ес - +0,17 В) было бы более предпочтительным (разница в потенциалах ~ 0,63 В) В то же время, в наших экспериментах образование Р не сопровождается окислением низкоспинового гема, которое, к примеру, наблюдается в ходе образования оксоферрильного комплекса Pr у гем-медных оксидаз Окисление низкоспинового гема bsss регистрируется только в процессе распада Р, то есть, на следующей стадии реакции Именно по этой причине мы считаем, что в случае цитохрома bd, Р является истинным перекисным интермедиатом Поскольку интермедиат, спектрально и кинетически очень схожий с Р цитохрома bd Е coli, также наблюдается у фермента A vinelandu, Р скорее всего является каталитическим интнрмедиатом, присущим всем терминальным оксидазам класса bd

Предлагаемая схема реакции полностью восстановленного цитохрома bd с кислородом На рис 20 показана схема, описывающая реакцию фермента в полностью восстановленном состоянии с кислородом Первоначальный комплекс R формы цитохрома bd с СО (R-CO) подвергается фотолизу в присутствии кислорода Свободная от лиганда форма R фермента, генерируемая фотолизом, связывает Ог с высокой скоростью, образуя оксикомплекс восстановленного гема d (A) R—»A переход не является электрогенным процессом и его скорость пропорциональна [Ог] (ко„ = 1,9 * 10® М"'с"') За образованием А следует перенос электрона от гема Ьж, чтобы получить Р А—>Р переход происходит с к = 2,2 х 10s с1 и также не является электрогенным процессом Как показано на схеме, Р вероятно является перекисным комплексом окисленного гема d Если это так, связанная перекись вероятно не находится в полностью анионной форме, а по крайней мере частично протонирована Протон мог бы прийти от одной из двух протонируемых групп, сопряженных с 6595/1/ двухъядерным центром при его окислении Мы не можем исключить, что в состоянии Р 0-0 связь уже разрушена и Р напоминает интермедиат Рм цитохром с оксидазы, хотя это

явно не соответствует происходящему в той же реакции, катализируемой формой R цитохром с оксцдазы, где не наблюдали образования интермедиата, похожего на Рм, которое бы предшествовало образованию Pr [Morgan et al, 1996] Интермедиат P в дальнейшем превращается в F с к = 2,1 х 104 с1 Это сопровождается окислением гема Ьц% Образование Г сопряжено с генерацией мембранного потенциала Нет сомнений, что в состоянии F гемы Ъ окислены, а гем d находится в форме оксоферрильного комплекса В случае, когда цитохром bd содержит связанный хинол, реакция проходит дальше и образуется окисленный фермент (О) Переход F—»А происходит с к = 0,9 х 103 с"1 и является электрогенным

R-CO

о о к IN СМ

О

Ь

X

О

о

0> о

d Ii ■X b¡¡,bm d II Je *>»<>«» d II -X bsabji» d II ■se ЬыЬт ü

— Н- Mb н;е Mí

0=0 но-о 0' HO

R

Рис 20 Схема реакции Три ромбических символа обозначают соответственно гемы bssi, ¿>595 и d Знак «-» показывает, что гем находится в восстановленном состоянии Константы скорости относятся к цитохрому bdЕ coli

Взаимодействие цитохрома bd с окисью азота Поскольку N0 продуцируется «хозяином» как часть иммунного ответа против бактериальных инфекций, а цитохром bd играет важную роль у патогенных микроорганизмов, мы сочли уместным исследовать реакции N0 с цитохромом bd Мы показали, что MV и R формы цитохрома bd связывают N0 на уровне восстановленного гема d Подобно СО и О2, связывание N0 вызывает красный сдвиг полосы гема d при ~630 нм Ог-редуктазная активность цитохромов bd из Ecoli и A vmelandu быстро тормозится N0 Таким образом, в оксидазах типа bd ингибирование N0 происходит в конкуренции с О; и м vivo при очень низкой концентрации Ог ингибирование N0 должно быть даже более эффективным Если N0 и О2 связываются с восстановленным гемом d со схожими скоростями, быстрое начало ингибирования N0 даже в присутствии большого избытка Ог может свидетельствовать о существовании по крайней мере одного

каталитического интермедиата, более склонного реагировать с N0, чем с 02 Эта гипотеза нашла полное подтверждение

Ингибирование N0 цитохромов bd полностью обратимо Вслед за исчерпанием N0 после добавления избытка окси-Hb, восстановление активности у оксидаз типа bd происходит быстрее, чем в сходных условиях (те, в присутствии избытка восстановителей) у митохондриальной цитохром с оксидазы В таких условиях, восстановление активности митохондриалыюго фермента лимитируется скоростью диссоциации N0 в водную фазу [Sarti et al, 2000] Более быстрое восстановление активности должно коррелировать с более высокой величиной &ofr для диссоциации N0 из восстановленного цитохрома bd, что и обнаружено в нашей работе

В отличие от ряда бактериальных гем-медных оксидаз, оксидазы типа bd, изученные в этой работе, не проявляют NO-редуктазной активности (<0,1 моль NO/моль bd х мин, что можно сравнить, к примеру, со значением -100 моль NO/моль фермента х мин, измеренным для ebb} оксидазы из Pseudomonas stutzen [Forte et al, 2001]) Неспособность цитохрома bd катализировать восстановление N0 до N20 указывает на то, что Сив играет ключевую роль в этой реакции По-видимому, присутствие негемового иона металла в активном центре (Fea в бактериальной N0 редуктазе, либо Сив в гем-медных оксидазах) является необходимым условием для NO-редуктазной активности у терминальных оксидаз Отсутствие такой активности у митохондриальной цитохром с оксидазы из сердца быка [Stubauer et al, 1998] и «гомолога N0 редуктазы» из Roseobacter demtrificans [Matsuda et al, 2004], содержащих ион меди в двухъядерном центре, может свидетельствовать о том, что восстановление NO терминальными оксидазами требует особых структурных черт окружения Сив, возможно модулирующих сродство Сив+ к N0

Мы показали, что каталитический интермедиат F цитохрома bd А vmelandu быстро реагирует с N0, со стехиометрией 1 1 Реакция протекает с коп = 1,2 ± 0,1 х Ю5 М"' с"1, что даже быстрее, чем аналогичная реакция, описанная для интермедиата F бычьей цитохром с оксидазы (£,п ~ 1 - 2 х 104 М"1 с 1 [Giuffre et al, 2000]) Продукт реакции демонстрирует абсорбционные характеристики комплекса полностью окисленного фермента с нитритом, связанным с гемом d, состояние, которое, как ожидается, является заингибированным

Сравнительно высокая стабильность интермедиата F в аэробных условиях и в то же время его повышенная реакционоспособность по отношению к N0 делают форму F вероятным кандидатом на взаимодействие с N0 при работе фермента Эта реакция вероятно ответственна за быстрое начало ингибирования, наблюдаемое при низких соотношениях [N0]/[02] Быстрая реакция N0 с интермедиатом F цитохрома bd могла бы отчасти объяснить низкую величину ЛГ, (-100 нМ при -70 мкМ 02) Поскольку цитохром bd патогенных бактерий, как полагают, задействован в развитии инфекционного процесса [Baughn and Malamy, 2004, Endley et al, 2001, Jones et al, 2007, Shi et al, 2005, Way et al, 1999], ингибирование оксидаз типа bd окисью азота могло бы быть использовано «хозяином» для противодействия бактериальной пролиферации и/или переходу в вирулентное состояние

В случае бычьей цитохром с оксидазы предположили, что в реакцию интермедиата F с N0 вовлечена окисленная Сив (Схема 3), N0 отдает один электрон на Сив2+, приводя к возникновению иона нитрозония (NO+) и Сив+ Восстановленная Сив затем быстро

реокисляется находящимся рядом оксоферрилом гема аз, переходя в окисленное состояние при этом N0 гидратируется до нитрита (HNOiflNOi"), который связывается с Fe«j , вызывая ингибирование фермента Однако Сив отсутствует у оксидаз типа bd, поэтому результаты, полученные нами на цитохроме bd А vinelandu, могут подвергнуть сомнению вышеописанный механизм Нельзя исключить что в реакции N0 с интермедиатом F, гем й595 в цитохроме bd выполняет роль Сив в цитохром с оксидазе (Схема 4) Однако мы не наблюдали изменений поглощения, отражающих связывание N0 с гемом 6595 ни в одном из его редокс-состояний Поэтому мы полагаем, что гораздо более вероятна прямая реакция N0 с оксоферрильной формой гема d (Схема 5) Такой механизм реакции гораздо проще и согласуется с механизмом, предложенным для миоглобина и гемоглобина [Herold and Rehmann, 2001]

Схема 3

[Fea34+=02" CuB2+] + NO -> [Fed4+=02" CuB1+ N0+] + H20-> [Fea33+ HN02 CuB2+] + OH"

Схема 4

[Fe/+=02 Feb 5953+] + NO [Fe/+=02" Feb-s952+'N0+] + H20 -> [Fed3+ 'HN02 Feb S953+] + OH

Схема 5

Fed4+=02 + NO -> Fed3"-N02"

Диссоциация лигандов из цитохрома bd Мы обнаружили, что в R состоянии фермента, N0 диссоциирует из гема dг+ с необычайно высокой скоростью (Abs = 0,133 ± 0,005 с ') Эта величина примерно в 30 раз больше, чем константа скорости диссоциации, измеренная в сходных экспериментальных условиях для восстановленного гема аз митохондриальной цитохром с оксидазы (коg - 0,004 с1 [Sarti et al, 2000]) Аналогично, диссоциация СО из полностью восстановленного цитохрома bd происходит гораздо быстрее, чем в случае полностью восстановленной цитохром с оксидазы из быка Возможно, в гем-медных оксидазах Сив служит воротами, контролирующими связывание лиганда с гемом в активном центре Другое интересное наблюдение при изучении диссоциации лигандов из цитохрома bd состоит в том, что значения кси, полученные для N0 и СО в MV ферменте, хотя достаточно высоки в сравнении с гем-медными оксидазами, тем не менее значительно ниже, чем ¿¡л, измеренные для R формы цитохрома bd Это свидетельствует о том, что редокс-состояние гемов b (скорее всего, гема 6595) контролирует кинетический барьер для диссоциации лиганда из активного центра цитохрома bd Необычайно высокие скорости диссоциации N0 из цитохрома bd Е coli могли бы объяснить наше наблюдение, что «отравленный» окисью азота

цитохром bd восстанавливает свою дыхательную функцию гораздо быстрее, чем митохондриальная гем-медная цитохром с оксидаза Как известно, N0 вовлечена в часть иммунного ответа против бактериальных инфекций, поэтому необычно высокая скорость диссоциации N0 из оксид аз bd-типа, приводящая к быстрому восстановлению дыхания, может быть связана с патофизиологией бактериальной инфекции Можно ожидать, что экспрессия оксидаз bd-, а не гем-медного типа усиливает устойчивость бактерии к нитрозирующему стрессу, тем самым способствуя патогенности микроорганизмов Это предположение представляется весьма вероятным в свете недавних данных о том, что (а) у мутантов патогенных бактерий (таких, как Brucella abortus, Shigella jlexneri и Mycobacterium tuberculosis), лишенных цитохрома bd, вирулентность заметно снижена [Endley et al, 2001, Shi et al, 2005, Way et al, 1999], (б) экспрессия цитохрома bd у M tuberculosis носит временный характер и увеличение транскрипции сопряжено только с одной специфической фазой инфекции [Shi et al, 2005], (в) под воздействием сублетальных концентраций NO, у М tuberculosis [Shi et al, 2005] и Staphylococcus aureus [Richardson et al, 2006] наблюдается усиление экспрессии цитохрома bd

Почему гем Í595 "е восстанавливается дитионитом в мутантном ферменте Е445А7 Возможная модечь путей переноса электронов и протонов в цитохроме bd Чтобы объяснить, почему гем Ьщ не восстанавливается дитионитом в стационарных условиях, но способен к промежуточному восстановлению после отстрела СО от гема d, мы предлагаем следующую модель (рис 21) (а) Гемы d и b¡9¡ расположены близко к друг другу и функционально сопряжены, образуя двухгемовый центр восстановления кислорода (б) Имеются две протонируемые группы, которые сопряжены с темами d и 6595 Одной из таких групп как раз и является Е445, другую, пока неидентифицированную, обозначим ХР (в) Сродство к протону группы Хр выше, чем Е445 Имеется также протонируемая группа XN (по нашим предварительным данным - это аминокислотный остаток Е107 субъединицы I), которая является концом длинного протонного канала, идущего от цитоплазматической стороны мембраны Группа Xn сопряжена с группами Хр и Е445 (рис 21)

Как в мутанте, так и в диком типе, первый электрон, пришедший в двухъядерный центр от гема b¡¡s, распределяется между темами d и 6595 в соответствии с их редокс-потенциалами, так что 80% электрона оказывается на теме d, и 20% - на геме ¿595 Приход электрона в биядерный центр компенсируется электрогенным захватом протона группой ХР В диком типе, приход второго электрона завершает восстановление биядерного центра, что сопровождается захватом второго протона - на сей раз группой Е445 У мутанта восстановления биядерного центра вторым электроном не происходит, так как это восстановление нельзя компенсировать захватом второго протона

В момент, когда СО отстреливается от гема d в мутанте, в биядерном центре находится один электрон и один протон Отстрел СО понижает редокс-потенциал гема d, поэтому часть электронов с гема d уходит на гем 6595, однако для этого не нужно подавать протон на группу Е445, поскольку это перемещение происходит в пределах биядерного центра и электрон уже скомпенсирован протоном на группе Хр Такое объяснение действительно подтверждается экспериментальным фактом, что перенос электрона между

темами <1 и 6595 не сопряжен с генерацией мембранного потенциала, то есть с электрогенным захватом протона

Н'

х. г

Периплазма

6«

"595

Е445

(ХР)

н*

Цитоплазма

Рис 21 Предполагаемая схема внутрибелковых путей переноса электронов и протонов в цитохроме М Мутация по аминокислотному остатку Е445 предотвращает полное

двухэлектронное восстановление

дитионитом двухгемового центра

ВЫВОДЫ

1 Разработан простой и быстрый метод перевода оксигенированного цитохрома bd в полностью окисленную форму с использованием липофильных акцепторов электронов Проведено систематическое исследование взаимодействия окисленного, а также частично и полностью восстановленного фермента с лигандами - перекисью водорода, окисью углерода, цианидом, кислородом и N0 с применением различных методов спектроскопии, электрометрии и амперометрии с высоким временным разрешением

2 В окисленном ферменте, Нг02 реагирует с гемом d с кажущейся константой диссоциации (Kd) 30-40 мкМ, но не взаимодействует с высокоспиновым гемом 6595 Реакция носит необратимый характер, приводя к образованию оксоферрильного комплекса гема d (Fe4+=02") Константа скорости второго порядка (£„„) реакции перекиси с окисленным цитохромом bd оказалась равной 600 М"' с"1

3 Как в мембранах, так и в выделенном цитохроме bd, СО и цианид связываются с гемом d Кажущаяся Kd гема d с СО составляет 70-80 нМ При высокой концентрации СО и цианида, в реакцию может вступать часть низкоспинового гема ¿55s (-10-20%) Связывание СО с гемом b59s не превышает 6% даже при низких температурах Предлагается модель устройства кислородоредуктазного центра, который состоит из близко расположенных (-10 А) гемов А595 и d, проявляющих антикооперативносгь в связывании лигандов

4 Методом фемто/пикосекундной спектроскопии идентифицирована индивидуальная полоса Соре восстановленного гема bus с максимумом поглощения около 440 нм

5 Разработан метод определения сродства терминальных оксидаз типа bd к кислороду Определено сродство цитохромов bd из Е coli и A vmelandn к О2 Кажущиеся значения Kd для оксикомплекса гема d составляют 280 и 500 нМ соответственно Измерены скорости связывания Ог с одноэлектронным (MV) и полностью восстановленным (R) цитохромом bd В случае R формы цитохрома bd, скорость реакции возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации О2 Напротив, для MV фермента, такая зависимость не является линейной, а носит гиперболический характер Предполагается, что MV цитохром bd в равновесии существует в двух состояниях, но связывать Ог может только в одном из них

6 Зарегистрированы быстрая кинетика генерации разности потенциалов цитохромом bd на мембране протеолипосом и последовательное образование спектрально различимых каталитических интермедиатов в пределах одного молекулярного оборота фермента Идентифицирован новый каталитический интермедиат, вероятно являющийся перекисным комплексом гема d (Fe3+-0-0-(H)) Связывание восстановленного цитохрома bd с кислородом и дальнейшее превращение оксикомплекса в перекисный комплекс не сопряжены с генерацией потенциала, тогда как две последующие каталитические стадии -

переход перекисного комплекса в оксоферрильную и затем в окисленную форму, являются электрогенными Предлагается схема реакции полностью восстановленного цитохрома М с кислородом.

7 Показано, что N0 взаимодействует с гемом с! в МУ, Я и оксоферрильной формах цитохрома Ьс! В МУ и Я ферментах, связывание N0 приводит к образованию нитрозильного комплекса гема <1 (Ре2+-КО) N0 реагирует с оксоферрильным интермедиатом цитохрома Ьс/с кт = 1,2 х 105 М"1« с"1, образуя комплекс окисленного гема с! с нитритом Активность цитохрома М ингибируется N0 с кажущейся константой ингибирования -100 нМ при концентрации Ог ~70 мкМ

8 Определены константы скорости спонтанной диссоциации Ог, N0 и СО от цитохрома Ьс! в разных редокс-состояниях фермента N0 и СО диссоциируют из цитохрома Ъд. гораздо быстрее, чем из гем-медных терминальных оксидаз Диссоциация этих лигандов из МУ формы цитохрома М замедлена в сравнении с Я ферментом Предполагается, что редокс-состояние гема 6595 контролирует внутрибелковый путь ухода лиганда из активного центра цитохрома Ы

9 Проведена сравнительная характеристика мутантной формы фермента Е445А и цитохрома Ъй дикого типа Мутация по высококонсервативному аминокислотному остатку Е445 предотвращает полное двухэлектронное восстановление дитионитом двухгемового центра фермента Замена Е445А сильно тормозит перенос заряда поперек мембраны, связанный с окислением цитохрома М кислородом, но не ингибирует генерацию потенциала, сопряженную с внутримолекулярным перераспределением электрона между гемами <1 и ¿558 Е445 является одной из двух протонируемых групп, сопряженных с гемами ¿595 и Л в активном центре Анализ спектров кругового дихроизма цитохрома ¿с/ указывает на экситонные взаимодействия между восстановленными гемами ¿595 и с! Предлагается модель внутрибелковых путей переноса электронов и протонов в цитохроме М

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Борисов В Б, Смирнова И А, Красносельская И А, Константинов А А (1994) Оксигенированный цитохром bd из Escherichia coli может быть превращен в окисленную форму липофильными акцепторами электронов Биохимия, 59, 598-606

2 Борисов В Б, Геннис Р Б , Константинов А А (1995) Взаимодействие цитохрома bd из Escherichia coli с перекисью водорода Биохимия, 60,315-327

3 Borisov V, Genms R, Konstantinov А А (1995) Peroxide complex of cytochrome bd kinetics of generation and stability Biochem Mol Biol Int, 37,975-982

4 Борисов В Б (1996) Цитохром bd строение и свойства Биохимия, 61,786-799

5 Azarkina N , Borisov V, Konstantinov А А (1997) Spontaneous spectral changes of the reduced cytochrome bd FEBSLett, 416, 171-174

6 Borisov V, Arutyunyan A M, Osborne J P, Genms R В , Konstantinov A A (1999) Magnetic circular dichroism used to examine the interaction of Escherichia coli cytochrome bd with ligands Biochemistry, 38, 740-750

7 Azarkma N , Siletsky S, Borisov V, Wachenfeldt С, Hederstedt L, Konstantinov A A (1999) A cytochrome bb -type quinol oxidase m Bacillus subtihs strain 168 J Biol Chem, 274, 32810-32817

8 Vos M H , Borisov V В , Liebl U, Martin J -L, Konstantinov A A (2000) Femtosecond resolution of hgand-heme interactions in the high-affinity quinol oxidase bd a di-heme active site? Proc Natl Acad Sei USA, 97, 1554-1559

9 Jasaitis A, Borisov V В , Belevich N P, Morgan J E, Konstantinov A A, Verkhovsky M1 (2000) Electrogenic reactions of cytochrome bd Biochemistry, 39,13800-13809

10 Borisov VB, Sedelnikova SE, Poole RK, Konstantinov A A (2001) Interaction of cytochrome bd with carbon monoxide at low and room temperatures Evidence that only a small fraction of heme 6595 reacts with CO J Biol Chem, 276,22095-22099

11 Borisov V В (2002) Defects in mitochondrial respiratory complexes III and IV, and human pathologies Mol Aspects Med, 23,385-412

12 Borisov V В, Liebl U, Rappaport F, Martin J -L, Zhang J, Genms R В , Konstantinov A A, Vos M H (2002) Interactions between heme d and heme Ьщ in quinol oxidase bd from Escherichia coli a femtosecond photoselection study Biochemistry, 41,1654-1662

13 Borisov V В (2004) Mutations in respiratory chain complexes and human diseases Ital J Biochem, 53,34-40

14 Borisov V В, Forte E, Konstantinov AA, Poole R.K, Sarti P, Giuffre A (2004) Interaction of the bacterial terminal oxidase cytochrome bd with nitric oxide FEBS Lett, 576,201204

15 Belevich I, Borisov VB, Zhang J, Yang K, Konstantinov AA, Genms RB, Verkhovsky MI (2005) Time-resolved electrometric and optical studies on cytochrome bd suggest a mechanism of electron-proton coupling in the di-heme active site Proc Natl Acad Sei USA, 102, 3657-3662

16 Belevich I, Borisov V В, Konstantinov A A, Verkhovsky MI (2005) Oxygenated complex of cytochrome bd from Escherichia coll Stability and photolabihty FEBS Lett, 579, 4567-4570

17 Borisov V В, Forte E, Sarti P, Brunori M, Konstantinov A A, Giuffre A (2006) Nitric oxide reacts with the ferryl-oxo catalytic intermediate of the Cug-lacking cytochrome bd terminal oxidase FEBS Lett, 580,4823-4826

18 Borisov VB, Forte E, Sarti P, Brunori M, Konstantinov AA, Giuffre A (2007) Redox control of fast ligand dissociation from Escherichia coh cytochrome bd Biochem Biophys Res Commvn, 355,97-102

19 Belevich I, Borisov V В , Bloch D A, Konstantinov A A, Verkhovsky MI (2007) Cytochrome bd from Azotobacter vinelandu evidence for high-affinity oxygen binding Biochemistry, 46,11177-11184

20 Belevich I, Borisov VB, Verkhovsky MI (2007) Discovery of the true peroxy intermediate in the catalytic cycle of terminal oxidases by real-time measurement J Biol Chem, 282,28514-28519

21 Arutyunyan A M, Borisov V В , Novoderezhkm VI, Ghaim J, Zhang J, Genms R В, Konstantinov A A (2008) Strong excitomc interactions in the oxygen-reducing site of bd-type oxidase the Fe-to-Fe distance between hemes d and ¿595 is 10 A Biochemistry, 47, 1752-1759

22 Борисов В Б (2008) Взаимодействие хинолоксидазы типа bd из Escherichia coli и окиси углерода тем d связывает СО с высоким сродством Биохимия, 73,18-28

23 Borisov V В, Belevich I, Bloch D А, Mogi Т, Verkhovsky МI (2008) Glutamate 107 in subunit I of cytochrome bd from Escherichia coh is part of a transmembrane mtraprotem pathway conducting protons from the cytoplasm to the heme ¿595/heme d active site Biochemistry, 47, 7907-

7914

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 03 09 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 2,5 Тираж 100 экз Заказ 479 Тел 939-3890 Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Борисов, Виталий Борисович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ЦЕПИ БАКТЕРИЙ: АЭРОБНЫЕ ЭЛЕКТРОН

ТРАНСПОРТНЫЕ ЦЕПИ Escherichia coli и Azotobacter vinelandii.

Глава 2. ТЕРМИНАЛЬНЫЕ ОКСИДАЗЫ И ИХ ПРОСТЕТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ

Глава 3. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ЦИТОХРОМА bd.

3.1. Физиологические функции цитохрома bd.

3.2. Торможение дыхательной активности цитохрома bd.

3.3. Генетика.

3.4. Вторая терминальная оксидаза типа bd (СухАВ) у Е. coli.

3.5. Простетические группы цитохрома bd.

3.6. Предполагаемая структура цитохрома bd.

3.7. Предполагаемый механизм функционирования цитохрома bd.

3.8. Данные ЭПР-спектроскопии.

3.9. Взаимодействие цитохрома bd с лигандами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Реактивы.

4.2. Растворы.

4.3. Штаммы бактерий и выращивание клеток.

4.4. Получение мембран.

4.5. Выделение и очистка комплекса bd.

4.6. Определение степени чистоты препарата.

4.7. Определение концентрации цитохрома bd.

4.8. Определение концентрации белка.

4.9. Определение концентрации СО, NO и О2.

4.10. Встраивание цитохрома bd в липосомы

4.11. Амперометрия.

4.12. Электрометрия.

4.13. Методы спектроскопии.

4.14. Обработка данных.

4.15. Определение кажущейся константы диссоциации комплекса гема с1 с кислородом (Ка(о2)) в одноэлектронной форме цитохрома Ъс1.

4.16. Определение кажущейся константы диссоциации (К^) комплекса гема с/ с СО

4.17. Обработка кривых титрования СО спектральных изменений цитохрома Ьс1.

4.18. Определение кажущейся константы диссоциации (К<]) комплекса гема с/ с перекисью водорода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 5. ОКИСЛЕНИЕ ГЕМА г/.

Глава 6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА МС Н202.

Глава 7. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЛОСЫ СОРЕ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЕМА

Глава 8. РЕАКЦИЯ ЦИТОХРОМА МС СО.

Глава 9. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА МС ЦИАНИДОМ.

Глава 10. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА Ъй С КИСЛОРОДОМ.

Глава 11. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА МС N0.

Глава 12. ДИССОЦИАЦИЯ ЛИГАНДОВ (02, N0, СО) ОТ ГЕМА

Глава 13. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНОЙ ФОРМЫ

ФЕРМЕНТА Е445А И ОКСИДАЗЫ ДИКОГО ТИПА.'.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный механизм функционирования терминальных оксидаз типа bd"

Работа посвящена важной проблеме биохимии и молекулярной биоэнергетики -изучению механизмов преобразования энергии у бактерий на молекулярном уровне. Запасание энергии в дыхательной цепи аэробных бактерий осуществляется за счет электрогенного переноса ионов водорода или натрия из цитоплазмы в периплазматическое пространство. Создаваемая при этом на цитоплазматической мембране протон- или натрий-движущая сила используется клеткой для энергообеспечения основных типов работы: химической (синтез АТФ), осмотической (накопление различных веществ), механической (вращение жгутика). В дыхательной цепи электроны по градиенту окислительно-восстановительного потенциала последовательно передаются от НАДН на молекулярный кислород с помощью нескольких ферментных комплексов.

Терминальная оксидаза является концевым ферментным комплексом дыхательной цепи, катализирующим четырехэлектронное восстановление кислорода до воды. Обнаружено два класса гемовых оксидаз. К первому относится многочисленное семейство гем/Си-содержащих ферментов, функционирующих как протонные насосы и имеющих в своем составе двухъядерный кислородоредуктазный активный центр, представленный высокоспиновым гемом и ионом меди. В качестве донора электронов гем-медные оксидазы используют цитохром с либо хинол. Второй класс терминальных дыхательных ферментов составляют хинолоксидазы типа Ьс1 (цитохромы Ьс1). Про гем-медные оксидазы известно уже довольно много. В частности, с помощью рентгеноструктурного анализа удалось увидеть трехмерную структуру оксидаз из сердца быка и ряда бактерий. По сравнению с гем-медными оксидазами, цитохром Ьё остается малоизученным ферментом.

Цитохром Ьс1 не имеет гомологии с гем-медными оксидазами, не содержит меди и способен генерировать мембранный потенциал, не задействуя механизм протонного насоса. Фермент обладает необычно низкой чувствительностью к цианиду и азиду. Изолированный белок представлен стабильным оксигенированным комплексом, что вероятно объясняется высоким сродством гема с/ к кислороду.

Терминальная оксидаза Ъй-типа является ключевым энергопреобразующим дыхательным ферментом как у микроорганизмов, безвредных для человека и животных, так и у бактерий, вызывающих различные заболевания, такие как дизентерия, пневмония, сальмонеллез, периодонтит, бруцеллез, брюшной тиф, туберкулез. Замечена положительная корреляция между вирулентностью бактериальных патогенов, ответственных за эти болезни и уровнем экспрессии цитохрома Ьа1.

Содержание цитохрома М возрастает в неблагоприятных условиях: при понижении концентрации кислорода, наличии в среде ядов, разобщителей-протонофоров, резком изменении температуры окружающей среды и в ряде других случаев, при которых традиционные терминальные оксидазы не способны нормально функционировать, а «альтернативный» цитохром Ьс1 успешно работает. У азотофиксирующих бактерий цитохром Ъй принимает участие в дыхательной защите нитрогеназы от кислорода. Цитохром Ьс1 Е. соИ участвует в регуляции процесса образования дисульфидных связей при сворачивании белков в клетке.

Фермент состоит из двух мембранных субъединиц, несущих три гема: 6558, 6595 и с1. Низкоспиновый гем 6558, по-видимому, вовлечен в окисление хинола. Высокоспиновый гем с? связывает О2 и, вероятно, принимает участие в кислородоредуктазной реакции. Роль высокоспинового гема 6595 до сих пор остается невыясненной. Ряд авторов полагает, что гем ¿595 участвует в восстановлении кислорода, образуя вместе с гемом с1 двухъядерный кислородоредуктазный центр, аналогичный таковому у гем-медных оксидаз. По мнению других исследователей, функция гема 6595 ограничивается переносом электрона с гема на гем (1. Некоторые авторы полагают, что гем ¿595 образует второй центр, способный реагировать с кислородом.

Важно понять, является ли наличие биядерного редокс-центра у терминальных оксидаз необходимым условием для восстановления кислорода до воды и если это так, то для какой из стадий каталитического превращения интермедиатов. Альтернативой могла бы быть необходимость наличия второго редокс-центра для переноса протонов через мембрану. Таким образом, установление роли высокоспинового гема ¿595 представляет особый интерес.

Целью этой работы было изучение молекулярного механизма функционирования цитохромов типа Ьс1. Предстояло выявить и охарактеризовать основные интермедиа™ каталитического цикла фермента; понять, каким образом 7 цитохром bd образует мембранный потенциал в отсутствие протонной помпы; определить устройство и механизм функционирования его активного (кислородоредуктазного) центра. Изучение механизма генерации цитохромом bd мебранного потенциала помогает понять, как именно бактерии, включая патогенные штаммы, запасают энергию при недостатке кислорода и других неблагоприятных условиях. Кроме того, выявление общих черт и различий в механизме восстановления кислорода до воды у неспособного к работе протонным насосом цитохрома bd и основных протон-транслоцирующих терминальных оксидаз помогает установить принципиальные компоненты протон-переносящей «машины», присущей гем-медным концевым дыхательным ферментам.

В качестве объекта исследования использовали оксидазы bd типа из двух бактерий - Escherichia coli и Azotobacter vinelandii. Работу выполняли с помощью различных методов спектроскопии, электрометрии и амперометрии с высоким временным разрешением.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Борисов, Виталий Борисович

ВЫВОДЫ

1. Разработан простой и быстрый метод перевода оксигенированного цитохрома bd в полностью окисленную форму с использованием липофильных акцепторов электронов. Проведено систематическое исследование взаимодействия окисленного, а также частично и полностью восстановленного фермента с лигандами - перекисью водорода, окисью углерода, цианидом, кислородом и NO с применением различных методов спектроскопии, электрометрии и амперометрии с высоким временным разрешением.

2. В окисленном ферменте, Н2О2 реагирует с гемом d с кажущейся константой диссоциации (Ка) 30-40 мкМ, но не взаимодействует с высокоспиновым гемом 6595. Реакция носит необратимый характер, приводя к образованию оксоферрильного комплекса гема d (Fe4+=02"). Константа скорости второго порядка (коп) реакции перекиси с окисленным цитохромом bd оказалась равной 600 М"1 с"1.

3. Как в мембранах, так и в выделенном цитохроме bd, СО и цианид связываются с гемом d. Кажущаяся Ка гема d с СО составляет 70-80 нМ. При высокой концентрации СО и цианида, в реакцию может вступать часть низкоспинового гема ¿55g (~ 10-20%). Связывание СО с гемом £595 не превышает 6% даже при низких температурах. Предлагается модель устройства кислородоредуктазного центра, который состоит из близко расположенных (-10 Ä) гемов 6595 и d, проявляющих антикооперативность в связывании лигандов.

4. Методом фемто/пикосекундной спектроскопии идентифицирована индивидуальная полоса Соре восстановленного гема 6595 с максимумом поглощения около 440 нм.

5. Определено сродство цитохромов bd из Е. coli и А. vinelandii к кислороду. Кажущиеся значения Ка для оксикомплекса гема d составляют 280 и 500 нМ соответственно. Измерены скорости связывания О2 с одноэлектронным (MV) и полностью восстановленным (R) цитохромом bd. В случае R формы цитохрома bd, скорость реакции возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации Ог-Напротив, для MV фермента, такая зависимость не является линейной, а носит гиперболический характер. Предполагается, что : М¥ цитохром: - в: равновесии существует в двух состояниях, но связывать Ог может только в одном из них.

6. Зарегистрированы быстрая кинетика генерации разности потенциалов цитохромом bd на мембране протеолипосом и последовательное образование спектрально различимых каталитических интермедиатов в пределах одного молекулярного оборота фермента. Идентифицирован новый каталитический интермедиат, вероятно являющийся перекисным комплексом гема с1 (Ре3+-0-0-(Н)). Связывание восстановленного цитохрома М с кислородом и дальнейшее превращение оксикомплекса в перекисный комплекс не сопряжены с генерацией потенциала, тогда как две последующие каталитические стадии - переход перекисного комплекса в оксоферрильную и затем в окисленную форму, являются электрогенными. Предлагается схема реакции полностью восстановленного цитохрома Ьс1 с кислородом.

7. Показано, что N0 взаимодействует с гемом с1 в МУ, Я и оксоферрильной формах цитохрома Ьс1. В МУ и К ферментах, связывание N0 приводит к образованию нитрозильного комплекса гема а (Ре2+-Ш). N0 реагирует с оксоферрильным интермедиатом цитохрома Ьс1 с коп - 1,2 * 105 М"1 с"1, образуя комплекс окисленного гема (1 с нитритом. Активность цитохрома Ъс1 ингибируется N0 с кажущейся константой ингибирования ~100 нМ при концентрации 02 -70 мкМ.

8. Определены константы скорости спонтанной диссоциации 02, N0 и СО от цитохрома Ъй в разных редокс-состояниях фермента. N0 и СО диссоциируют из цитохрома Ьс! гораздо быстрее, чем из гем-медных терминальных оксидаз. Диссоциация этих лигандов из МУ формы цитохрома Ьс1 замедлена в сравнении с Я ферментом. Предполагается, что редокс-состояние гема Ь595 контролирует внутрибелковый путь ухода лиганда из активного центра цитохрома М.

9. Проведена сравнительная характеристика мутантной формы фермента Е445А и цитохрома Ьс1 дикого типа. Мутация по высококонсервативному аминокислотному остатку Е445 предотвращает полное двухэлектронное восстановление дитионитом двухгемового центра фермента. Замена Е445А сильно тормозит перенос заряда поперек мембраны, связанный с окислением цитохрома Ь<Л кислородом, но не ингибирует генерацию потенциала, сопряженную с внутримолекулярным перераспределением электрона между темами и Ъъ5%. Е445 является одной из двух протонируемых групп, сопряженных с темами ¿595 и с1 в активном центре. Анализ спектров кругового дихроизма цитохрома Ьс1 указывает на экситонные взаимодействия между восстановленными темами 6595 и й.: .Предлагается модель .: внутрибелковых путей^ , переноса электронов и протонов в цитохроме Ьс1.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Борисов, Виталий Борисович, Москва

1. Rice, C.W., and Hempfling, W.P. (1978) Oxygen-limited continuous culture and respiratory energy conservation in Escherichia coli, J. Bacteriol. 134, 115-124.

2. Cotter, P.A., Chepuri, V., Gennis, R.B., and Gunsalus, R.P. (1990) Cytochrome о (cyoABCDE) and d (cydAB) oxidase gene expression in Escherichia coli is regulated by oxygen, pH, and the fnr gene product, J. Bacteriol. 172, 6333-6338.

3. Fu, H.-A., Iuchi, S., and Lin, E.C.C. (1991) The requirement of ArcA and Fnr for peak expression of the cyd operon in Escherichia coli under microaerobic conditions, Mol. Gen. Genet. 226, 209-213.

4. Zhang, J., Oettmeier, W., Gennis, R.B., and Hellwig, P. (2002) FTIR Spectroscopic Evidence for the Involvement of an Acidic Residue in Quinone Binding in Cytochrome bd from Escherichia coli, Biochemistry 41, 4612-4617.

5. Unden, G., and Bongaerts, J. (1997) Alternative respiratory pathways of Escherichia coli: energetics and transcriptional regulation in response to electron acceptors, Biochim. Biophys. Acta 1320, 217-234.

6. Miller, M.J., and Gennis, R.B. (1985) The cytochrome d complex is a coupling site in the aerobic respiratory chain of Escherichia coli, J. Biol. Chem. 260, 14003-14008.

7. Puustinen, A., Finel, M., Haltia, Т., Gennis, R.B., and Wikstrom, M. (1991) Properties of the two terminal oxidases of Escherichia coli, Biochemistry 30, 3936-3942.10. ~ Jasaitis, A., Borisov, V.B., Belevich, N.P., Morgan, J.E., Konstantinov, A.A., and

8. Verkhovsky, M.I. (2000) Electrogenic reactions of cytochrome bd, Biochemistry 39, 13800-13809.

9. Belevich, I., Borisov, V.B., and Verkhovsky, M.I. (2007) Discoveiy of the true peroxy intermediate in the catalytic cycle of terminal oxidases by real-time measurement, J. Biol. Chem. 282, 28514-28519.

10. Mitchell, P. (1966) Chemiosmotic Coupling in Oxidative and Photosynthetic Phosphorylation, Glynn Research Ltd. Bodmin, UK.

11. Avetisyan, A.V., Bogachev, A.V., Murtasina, R.A., and Skulachev, V.P. (1992) Involvement of a af-type Oxidase in the Na+-motive Respiratory Chain of Escherichia coli Growing Under Low Ацн+ Conditions, FEBS Lett. 306, 199-202.

12. Gennis, R.B., and Stewart, V. (1996) Respiration. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2nd edn, pp. 217-261 (Neidhardt, F.C.e.a., Ed.) ASM Press, Washington, D.C.

13. Берцова, Ю.В., Демин, O.B., Богачев, А.В. (2005) Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у Azotobacter vinelandii, Успехи биологической химии 45, 205-234.

14. Bertsova, Y.V., Bogachev, A.V., and Skulachev, V.P. (1997) Generation of protonic potential by the bd-type quinol oxidase of Azotobacter vinelandii, FEBS Lett. 414, 369372.

15. Rey, L., and Maier, R.J. (1997) Cytochrome с terminal oxidase pathways of Azotobacter vinelandii: analysis of cytochrome c4 and c5 mutants and up-regulation of cytochrome c-dependent pathways with N2 fixation, J. Bacteriol. 179, 7191-7196.

16. Drozd, J., and Postgate, J.R. "(1970) Effect of oxygen on acetylene reduction, cytochrome content and respiratory activity of Azotobacter chroococcum, J. Gen. Microbiol. 63, 6373.

17. Jones, C.W., Brice, J.M., Wright, V., and Ackrell, B.A.C. (1973) Respiratory protection of nitrogenase in Azotobacter vinelandii, FEBS Lett. 29, 77-81.

18. Bjorklof, K., Zickermann, V., and Finel, M. (2000) Purification of the 45 kDa, membrane bound NADH dehydrogenase of Escherichia coli (NDH-2) and analysis of its interaction with ubiquinone analogues, FEBS Lett. 467, 105-110.

19. Junemann, S., Butterworth, P.J., and Wrigglesvvorth, J.M. (1995) A suggested mechanism for the catalytic cycle of cytochrome bd terminal oxidase based on kinetic analysis, Biochemistry 34, 14861-14867.

20. Timkovich, R., Cork, M.S., Gennis, R.B., and Johnson, P.Y. (1985) Proposed Structure of Heme d, a Prosthetic Group of Bacterial Terminal Oxidases, J. Am. Chem. Soc. 107, 6069-6075.

21. Garcia-Horsman, J.A., Barquera, B., Rumbley, J., Ma, J., and Gennis, R.B. (1994) The Superfamily of Heme-Copper Respiratory Oxidases, J. Bacteriol. 176, 5587-5600.

22. Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, T., Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1995) Structures of Metal Sites of Oxidized Bovine Heart Cytochrome c Oxidase at 2.8 A, Science 269, 1069-1074.

23. Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, R., Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1996) The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A, Science 272, 1136-1144.

24. Yoshikawa, S., Tera, T., Takahashi, Y„ Tsukihara, T., and Caughey, W.S. (1988) Crystalline Cytochrome c oxidase of bovine heart mitochondrial membrane: Composition and x-ray diffraction studies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1354-1358.

25. Iwata, S., Ostermeier, C., Ludwig, B., and Michel, H. (1995) Structure at 2.8 A resolution of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans, Nature 376, 660-669.

26. Abramsoni J., Svensson-Ek, M., Byrne, B., and Iwata, S. (2001) Structure of cytochrome c oxidase: a comparison of the bacterial and mitochondrial enzymes, Biochim. Biophys. Acta 1544, 1-9.

27. Svensson-Ek, M., Abramson, J., Larsson, G., Tornroth, S., Brzezinski, P., and Iwata, S. (2002) The X-ray Crystal Structures of Wild-type and EQ(I-286) Mutant Cytochrome с Oxidases from Rhodobacter sphaeroides, J. Mol. Biol. 321, 329-339.

28. Soulimane, Т., Buse, G., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., Huber, R., and Than, M.E. (2000) Structure and mechanism of the aberrant ¿аз-cytochrome с oxidase from Thermus thermophilus, EMBO J. 19, 1766-1776.

29. Борисов, В.Б. (1996) Цитохром bd: строение и свойства, Биохимия 61, 786-799.

30. Poole, R.K., and Cook, G.M. (2000) Redundancy of aerobic respiratory chains in bacteria? Routes, reasons and regulation, Adv. Microb. Physiol. 43, 165-224.

31. Vanlerberghe, G.C., and Mcintosh, L. (1997) ALTERNATIVE OXIDASE: From Gene to Function, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 703-734.

32. Siedow, J.N., and Umbach, A.L. (2000) The mitochondrial cyanide-resistant oxidase: structural conservation amid regulatory diversity, Biochim. Biophys. Acta 1459, 432-439.

33. Junemann, S. (1997) Cytochrome ¿¿/terminal oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1321, 107127.

34. Lubben, M. (1995) Cytochromes of Archaeal Electron Transfer Chains, Biochem. Biophys. Acta 1229, 1-22.

35. Mogi, Т., Tsubaki, M., Hori, H., Miyoshi, H., Nakamura, H., and Anraku, Y. (1998) Two terminal quinol oxidase families in Escherichia coli: variations on molecular machinery for dioxygen reduction, J. Biochem. Mol. Biol. Biophys. 2, 79-110.

36. Miller, M.J., and Gennis, R.B. (1983) The purification and characterization of the cytochrome d terminal oxidase complex of the Escherichia coli aerobic respiratory chain, J. Biol. Chem. 258, 9159-9165.

37. Junemann, S., and Wrigglesworth, J.M. (1995) Cytochrome bd oxidase from Azotobacter vinelandii. Purification and quantitation of ligand binding to the oxygen reduction site, J. Biol Chem. 270, 16213-16220. .

38. Au, D.C.-T., Lorence, R.M., and Gennis, R.B. (1985) Isolation and Characterization of an Escherichia coli Mutant Lacking the Cytochrome о Terminal Oxidase, J. Bact. 161, 123127.

39. Poole, R.K., Williams, H.D., Downie, J.A., and Gibson, F. (1989) Mutations Affecting the Cytochrome ¿/-Containing Oxidase Complex of Escherichia coli K12: Identification and Mapping of a Fourth Locus, cydD, J. Gen. Microbiol. 135, 1865-1874.

40. Poole, R.K., Kumar, C., Salmon, I., and Chance, B. (1983) The 650 nm Chromophore in Escherichia coli is an "Oxy-" or Oxygenated Compound, Not the Oxidized Form of Cytochrome Oxidase d: A Hypothesis, J. Gen. Microbiol. 129, 1335-1344.

41. Belevich, I., Borisov, V.B., Konstantinov, A.A., and Verkhovsky, M.I. (2005) Oxygenated complex of cytochrome bd from Escherichia coli: stability and photolability, FEBS Lett. 579, 4567-4570.

42. Way, S.S., Sallustio, S., Magliozzo, R.S., and Goldberg, M.B. (1999) Impact of either elevated or decreased levels of cytochrome bd expression on Shigella flexneri virulence, J. Bacteriol. 181, 1229-1237.

43. Smith, A., Hill, S., and Anthony, C. (1990) The Purification, Characterization and Role of the d-Type Cytochrome Oxidase of Klebsiella Pneumoniae During Nitrogen Fixation, J. Gen. Microbiol. 136, 171-180. . ^ „.,.

44. Osborne, J.P., and Gennis, R.B. (1999) Sequence analysis of cytochrome bd oxidase suggests a revised topology for subunits I, Biochim. Biophys. Acta 1410, 32-50.

45. Baughn, A.D., and Malamy, M.H. (2004) The strict anaerobe Bacteroides fragilis grows in and benefits from nanomolar concentrations of oxygen, Nature 427, 441-444.

46. Endley, S., McMurray, D., and Ficht, T.A. (2001) Interruption of the cydB locus in Brucella abortus attenuates intracellular survival and virulence in the mouse model of infection, J. Bacteriol. 183, 2454-2462.

47. Kana, B.D., Weinstein, E.A., Avarbock, D., Dawes, S.S., Rubin, H., and Mizrahi, V. (2001) Characterization of the cydAB-Encoded Cytochrome bd Oxidase from Mycobacterium smegmatis, J. Bacteriol. 183, 7076-7086.

48. Bader, M., Muse, W., Ballou, D.P., Gassner, C., and Bardwell, J.C.A. (1999) Oxidative protein folding is driven by the electron transport system, Cell 98, 217-227.

49. Hill, S., Viollet, S., Smith, A.T., and Anthony, C. (1990) Roles for Enteric ¿/-Type Cytochrome Oxidase in N2 Fixation and Microaerobiosis, J. Bacteriol. 172, 2071-2078.

50. Poole, R.K., and Hill, S. (1997) Respiratory protection of nitrogenase activity in Azotobacter vinelandii roles of the terminal oxidases, Bioscience Reports 17, 307-317.

51. Wall, D., Delaney, J.M., Fayet, O., Lipinska, B., Yamamoto, T., and Georgopoulos, C. (1992) arc-Dependent Thermal Regulation and Extragenic Suppression of the Escherichia coli Cytochrome d Operon, J. Bacteriol. 174, 6554-6562.

52. Delaney, J.M., Wall, D., and Georgopoulos, C. (1993) Molecular Characterization of the Escherichia coli htrD Gene: Cloning, Sequence, Regulation, and Involvement with Cytochrome d Oxidase, J. Bacteriol. 175, 166-175.

53. Ashcroft. J.R., and Haddock, B.A. (1975) Synthesis of alternative membrane-bound redox carriers during aerobic growth of Escherichia coli in the presence of potassium cyanide, Biochem. J. 148, 349-352.

54. Bogachev, A.V., Murtazina, R.A., and Skulachev, V.P. (1993) Cytochrome d Induction in Escherichia coli Growing Under Unfavorable Conditions, FEBS Lett. 336, 75-78.

55. Bogachev, A.V., Murtazine, R.A., Shestopalov, A.I., and Skulachev, V.P. (1995) Induction of the Escherichia coli cytochrome d by low A|an+ and by sodium ions, Eur. J. Biochem. 232, 304-308.

56. Meunier, B., Madgwick, S.A., Reil, E., Oettmeier, W., and Rich, P.R. (1995) New inhibitors of the quinol oxidation sites of bacterial cytochromes bo and bd, Biochemistry 34, 1076-1083.

57. Konishi, K., Ouchi, M., Kita, K., and Horikoshi, I. (1986) Purification and Properties of a Cytochrome bs^-d Complex, a Terminal Oxidase of the Aerobic Respiratory Chain of Photobacterium phosphoreum, J. Biochem. 99, 1227-1236.

58. Junemann, S., and Wrigglesworth, J.M. (1994) Antimycin inhibition of the cytochrome bd complex from Azotobacter vinelandii indicates the presence of a branched electron transfer pathway for the oxidation of ubiquinol, FEBS Lett. 345, 198-202.

59. Miller, M.J., Hermodson, M., and Gennis, R.B. (1988) The Active Form of the Cytochrome d Terminal Oxidase Complex of Escherichia coli is a Heterodimer Containing One Copy of Each of the Two Subunits, J. Biol. Chem. 263, 5235-5240.

60. Calhoun, M.W., Newton, G., and Gennis, R.B. (1991) E. coli map. Physical Map Locations of Genes Encoding Components of the Aerobic Respiratory Chain of Escherichia coli, J. Bacteriol. 173, 1569-1570.

61. Kranz, R.G., Barassi, C.A., Miller, M.J., Green, G.N., and Gennis, R.B. (1983) Immunological Characterization of an E. coli Strain which is Lacking Cytochrome d, J. Bacteriol. 156, 115-121.

62. Bachmann, B.J. (1990) Linkage Map of Escherichia coli K-12, Edition 8, Microbiol. Rev. 54, 130-197.

63. Green, G.N., Kranz, J.E., and Gennis, R.B. (1984) Cloning the cyd Gene Locus Coding for the Cytochrome d Complex of Escherichia coli, Gene 32, 99-106.

64. Lorence, R.M., Koland, J.G., and Gennis, R.B. (1986) Coulometric and Spectroscopic Analysis of the Purified Cytochrome d Complex of Escherichia coli : Evidence for the Identification of "Cytochrome a" as Cytochrome ¿595, Biochemistry 25, 2314-2321.

65. Newton, G., and Gennis, R.B. (1991) In Vivo Assembly of the Cytochrome d Terminal Oxidase Complex of Escherichia coli from Genes Encoding the Two Subunits Expressed on Separate Plasmids, Biochim. Biophys. Acta J089, 8-12.

66. Green, G.N., Lorence, R.M., and Gennis, R.B. (1986) The Specific Overproduction and Purification of the Cytochrome b558 Component of the Cytochrome d Complex from Escherichia coli, Biochemistry 25, 2309-2314.

67. Georgiou, C.D., Fang, H., and Gennis, R.B. (1987) Identification of the cydC Locus Required for the Expression of the Functional Form of the cytochrome d Terminal Oxidase Complex in Escherichia coli, J. Bacteriol. 169, 2107-2112.

68. Bebbington, K.J., and Williams, H.D. (1993) Investigation of the Role of the cydD Gene Product in Production of a Functional Cytochrome d Oxidase in Escherichia coli, FEMS Microbiol. Lett. 112, 19-24.

69. Poole, R.K., Gibson, F., and Wu, G. (1994) The cydD Gene Product, Component of a Heterodimeric ABC Transporter, is Required for Assembly of Periplasmic Cytochrome c and of Cytochrome bd in Escherichia coli, FEBS Microb. Lett. 117, 217-224.

70. Pittman, M.S., Robinson, H.C., and Poole, R.K. (2005) A bacterial glutathione transporter (Escherichia coli CydDC) exports reductant to the periplasm, J. Biol. Chem. 280, 3225432261.

71. Cotter, P.A., and Gunsalus, R.P. (1992) Contribution of the fnr and arch. Gene Products in Coordinate Regulation of Cytochromeo and d Oxidase (cyoABCDE and cydAB) Genes in Escherichia coli, FEMS Microbiol. Lett. 91, 31-36.

72. Gunsalus, R.P. (1992) Control of Electron Flow in Escherichia coli: Coordinated Transcription of Respiratory Pathway Genes, J. Bacteriol. 174, 7069-7074.

73. Cotter, P.A., Melville, S.B., Albrecht, J.A., and Gunsalus, R.P. (1997) Aerobic regulation of cytochrome d oxidase (cydAB) operon expression in Escherichia coli: roles of Fnr and ArcA in repression and activation, Mol. Microbiol. 25, 605-615.

74. Govantes, F., Albrecht, J.A., and Gunsalus, R.P. (2000) Oxygen regulation of the Escherichia coli cytochrome d oxidase (cydAQ) operon: roles of multiple promoters and the Fnr-1 and Fnr-2 binding sites, Mol. Microbiol. 37, 1456-1469.

75. Shalel-Levanon, S., San, K.Y., and Bennett, G.N. (2005) Effect of oxygen, and ArcA and FNR regulators on the expression of genes related to the electron transfer chain and the TCA cycle in Escherichia coli, Metabolic Engineering 7, 364-374.

76. Lynch, A.S., and Lin, E.C.C. (1996) Responses to molecular oxygen. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2nd edn, pp. 1526-1538 (Neidhardt, F.C.e.a., Ed.) ASM Press, Washington, D.C.

77. Georgellis, D., Kwon, O., and Lin, E.C. (2001) Quinones as the redox signal for the arc two-component system of bacteria, Science 292, 2314-2316.

78. Georgellis, D., Kwon, O., and Lin, E.C. (1999) Amplification of signaling activity of the arc two-component system of Escherichia coli by anaerobic metabolites. An in vitro study with different protein modules, J. Biol. Chem. 274, 35950-35954.

79. Alexeeva, S., Hellingwerf, K.J., and Teixeira de Mattos, M.J. (2003) Requirement of ArcA for redox regulation in Escherichia coli under microaerobic but not anaerobic or aerobic conditions, J. Bacteriol. 185, 204-209.

80. Kiley, P.J., and Beinert, H. (1998) Oxygen sensing by the global regulator, FNR: the role of the iron-sulfur cluster, FEMS Microbiol. Rev. 22, 341-352.

81. Becker, S., Holighaus, G., Gabrielczyk, T., and Unden, G. (1996) O2 as the regulatory signal for FNR-dependent gene regulation in Escherichia coli, J. Bacteriol. 178, 45154521.

82. Atlung, T., and Brondsted, L. (1994) Role of the transcriptional activator AppY in regulation of the cyx appA operon of Escherichia coli by anaerobiosis, phosphate starvation, and growth phase, J. Bacteriol. 176, 5414-5422.

83. Brondsted, L., and Atlung, T. (1996) Effect of growth conditions on expression of the acid phosphatase (cyx-appA) operon and the appY gene, which encodes a transcriptional activator of Escherichia coli, J. Bacteriol. 178, 1556-1564.

84. Sturr, M.G., Krulwich, T.A., and Hicks, D.B. (1996) Purification of a Cytochrome bd Terminal Oxidase Encoded by the Escherichia coli app Locus from a Acyo Acyd Strain Complemented by Genes from Bacillusfirmus OF4, J. Bacteriol. 176, 1742-1749.

85. Collins, M.D., and Jones, D. (1981) Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implication, Microbiol. Rev. 45, 316-354.

86. Belevich, I., Bloch, D.A., Belevich, N„ Wikstrom, M., and Verkhovsky, M.I. (2007) Exploring the proton pump mechanism of cytochrome c oxidase in real time, Proc. Natl. Acad. Set USA 104, 2685-2690.

87. Rothery, R.A., Houston, A.M., and Ingledew, W.J. (1987) The Respiratory Chain of Anaerobically Grown Escherichia colv. Reactions with Nitrite and Oxygen, J. Gen. Microbiol. 133, 3247-3255.

88. Meinhardt, S.W., Gennis, R.B., and Ohnishi, T. (1989) EPR Studies of the Cytochrome-i/ Complex of Escherichia coli, Biochim. Biophys. Acta 975, 175-184.

89. Rothery, R., and Ingledew, W.J. (1989) The cytochromes of anaerobically grown Escherichia coli, Biochem. J. 262, 437-443.

90. Kahlow, M.A., Zuberi, T.M., Gennis, R.B., and Loehr, T.M. (1991) Identification of a Ferry I Intermediate of Escherichia coli Cytochrome d Terminal Oxidase by Resonance Raman Spectrosopy, Biochemistry 30, 11485-11489.

91. Hill, B.C., Hill, J.J., and Gennis, R.B. (1994) The room temperature reaction of carbon monoxide and oxygen with the cytochrome bd quinol oxidase from Escherichia coli, Biochemistry 33, 15110-15115.

92. Ingledew, W.J., Rothery, R.A., Gennis, R.B., and Salerno, J.C. (1992) The Orientation of the Three Haems of the in situ Ubiquinol Oxidase, Cytochrome bd, of Escherichia coli, Biochem. J. 282, 255-259.

93. Dueweke, T.J., and Gennis, R.B. (1990) Epitopes of Monoclonal Antibodies Which Inhibit Ubiquinol Oxidase Activity of Escherichia coli Cytochrome d Complex Localize a Functional Domain, J. Biol. Chem. 265, 4273-4277.

94. Kranz, R.G., and Gennis, R.B. (1984) Characterization of the Cytochrome d Terminal Oxidase Complex of Escherichia coli Using Polyclonal and Monoclonal Antibodies, J. Biol. Chem. 259, 7998-8003.

95. Dueweke, T.J., and Gennis, R.B. (1991) Proteolysis of the Cytochrome d Complex with Trypsin and Chymotrypsin Localizes a Quinol Oxidase Domain, Biochemistry 30, 34013406.

96. Poole, R.K. (1988) Bacterial Cytochrome Oxidases. In: Bacterial Energy Transduction, pp. 231-291 (Anthony, C., Ed.) Academic Press, London.

97. Roland, J.G., Miller, M.J., and Gennis, R.B. (1984) Potentiometric analysis of the purified cytochrome d terminal oxidase complex from Escherichia coli, Biochemistry 23, 1051-1056.

98. Borisov, V., Arutyunyan, A.M., Osborne, J.P., Gennis, R.B., and Konstantinov, A.A. (1999) Magnetic circular dichroism used to examine the interaction of Escherichia coli cytochrome bd with ligands, Biochemistry 38, 740-750.

99. Fang, H., Lin, R.-J., and Gennis, R.B. (1989) Location of Heme Axial Ligands in the Cytochrome d Terminal Oxidase Complex of Escherichia coli Determined by Site-directed Mutagenesis, J. Biol. Chem. 264, 8026-8032.

100. Kaysser, T.M., Ghaim, J.B., Georgiou, C., and Gennis, R.B. (1995) Methionine-393 is an axial ligand of the heme bus component of the cytochrome bd ubiquinol oxidase from Escherichia coli, Biochemistry 34, 13491-13501.

101. Poole, R.K. (1983) Bacterial Cytochrome Oxidases: A Structurally and Functionally Diverse Group of Electron Transfer Proteins, Biochim. Biophys. Acta 126, 205-243.

102. Hill, J.J., Alben, J.O., and Gennis, R.B. (1993) Spectroscopic evidence for a heme-heme binuclear center in the cytochrome bd ubiquinol oxidase from Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5863-5867.

103. Krasnoselskaya, I., Arutjunjan, A.M., Smirnova, I., Gennis, R., and Konstantinov, A.A. (1993) Cyanide-reactive sites in cytochrome bd complex from E. coli, FEBS Lett. 327, 279-283.

104. Tsubaki, M., Hori, H., Mogi, T., and Anraku, Y. (1995) Cyanide-binding site of bd-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli, J. Biol. Chem. 270, 28565-28569.

105. Poole, R.K., and Williams, H.D. (1987) Proposal that the Function of the Membrane-bound Cytochrome «i-like Haemoprotein (Cytochrome ¿-595) in Escherichia coli is a Direct Electron Donation to Cytochrome d, FEES Lett. 217, 49-52.

106. Hata-Tanaka, A., Matsuura, K., Itoh, S., and Anraku, Y. (1987) Electron Flow and Heme-heme Interaction Between Cytochromes b-558, ¿-595 and d in a Terminal Oxidase of Escherichia coli, Biochim. Biophys. Acta 893, 289-295.

107. Jiang, F.S., Zuberi, T.M, Cornelius, J.B, Clarkson, R.B, Gennis, R.B, and Belford, R.L. (1993) Nitrogen and Proton ENDOR of Cytochrome d, Hemin, and Metmyoglobin in Frozen Solutions, J. Am. Chem. Soc. 115, 10293-10299.

108. Hirota, S, Mogi, T, Anraku, Y, Gennis, R.B, and Kitagawa, T. (1995) Resonance Raman Study on Axial Ligands of Heme Irons in Cytochrome ¿¿/-type Ubiquinol Oxidase from Escherichia coli, Biospectroscopy 1, 305-311.

109. Hori, H„ Tsubaki, M, Mogi, T, and Anraku, Y. (1996) EPR study of NO complex of bd-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli, J. Biol. Chem. 271, 9254-9258.

110. Pudek, M.R, and Bragg, P.D. (1976) Redox Potentials of the Cytochromes in the Respiratory Chain of Aerobically Grown Escherichia coli, Arch. Biochem. Biophys. 174, 546-552.

111. Mogi, T. (2006) Mass spectrometric analysis of the ubiquinol-binding site in cytochrome bd from Escherichia coli, J. Biol. Chem. 281, 1905-1912.

112. Mogi, T., Akimoto, S., Endou, S., Watanabe-Nakayama, T., Mizuochi-Asai, E., and Miyoshi, H. (2006) Probing the ubiquinol-binding site in cytochrome bd by site-directed mutagenesis, Biochemistry 45, 7924-7930.

113. Sakamoto, J., Koga, E., Mizuta, T., Sato, C., Noguchi, S., and Sone, N. (1999) Gene structure and quinol oxidase activity of a cytochrome bd-type oxidase from Bacillus stearothermophilus, Biochim. Biophys. Acta 1411, 147-158.

114. Hao, W., and Golding, G.B. (2006) Asymmetrical evolution of cytochrome bd subunits, J. Mol. Evol. 62, 132-142.

115. Oden, K.L., and Gennis, R.B. (1991) Isolation and Characterization of a New Class of Cytochrome d Terminal Oxidase Mutants of Escherichia coli, J. Bacteriol. 173, 61746183.

116. Koland, J.G., Miller, M.J., and Gennis, R.B. (1984) Reconstitution of the Membrane-Bound, Ubiquinone-Dependent Pyruvate Oxidase Respiratory Chain of Escherichia coli with the Cytochrome d Terminal Oxidase, Biochemistry 23, 445-453.

117. Wikstrom, M., Bogachev, A., Finel, M., Morgan, J.E., Puustinen, A., Raitio, M., Verkhovskaya, M., and Verkhovsky, M.I. (1994) Mechanism of Proton Translocation by the Respiratory Oxidases. The Histidine Cycle, Biochim. Biophys. Acta 1187, 106-111.

118. Dervartanian, D.V., Iburg, L.K., and Morgan, T.V. (1973) EPR studies on phosphorylating particles from Azotobacter vinelandii, Biochim. Biophys. Acta 305, 173178.

119. Kauffman, H.F., DerVartanian, D.V., van Gelder, B.F., and Wampler, J. (1975) EPR studies on cytochrome components in phosphorylating particles of Azotobacter vinelandii, J. Bioenerg. 7, 215-222.

120. Hata, A., Kirino, Y., Matsuura, K., Itoh, S., Hiyama, T., Konishi, K., Kita, K., and Anraku, Y. (1985) Assignment of ESR Signals of Escherichia coli Terminal Oxidase Complexes, Biochim. Biophys. Acta 810, 62-72.

121. Kumar, C., Poole, R.K., Salmon, I., and Chance, B. (1985) The Oxygen Reaction of the Cytochrome ¿/-terminated Respiratory Chain of Escherichia coli at Sub-zero Temperatures, FEBS Lett. 190, 227-231.

122. Gibson, Q., and Greenwood, C. (1963) Reactions of cytochrome oxidase with oxygen and carbon monoxide, Biochem. J. 86, 541-555.

123. Junemann, S., Wrigglesworth, J.M., and Rich, P.R. (1997) Effects of decyl-aurachin D and reversed electron transfer in cytochrome bd, Biochemistry 36, 9323-9331.

124. Hubbard, J.A.M., Hughes, M.N, and Poole, R.K. (1983) Nitrite, but not silver, ions induce spectral changes in Escherichia coli cytochrome d, FEBS Lett. 164, 241-243.

125. Hubbard, J.A.M., Hughes, M.N, and Poole, R.K. (1985) Microbial Gas Metabolism: Mechanistic, Metabolic and Biotechnological Aspects, pp. 231-236 (Poole, R.K. and Dow, C.S, Eds.) Academic Press, London.

126. Bonner, F.T, Hughes, M.N, Poole, R.K, and Scott, R.I. (1991) Kinetics of the Reactions of Trioxodinitrate and Nitrite Ions With Cytochrome d in Escherichia coli, Biochim. Biophys. Acta 1056, 133-138.

127. Kauffmann, H.F, and Van Gelder, B.F. (1973) The respiratory chain of Azotobacter vinelandii. II. The effect of cyanide on cytochrome d, Biochim. Biophys. Acta 314, 276283.

128. Kauffmann, H.F, and Van Gelder, B.F. (1974) The respiratory chain of Azotobacter vinelandii. III. The effect of cyanide in the presence of substrates, Biochim. Biophys. Acta 333, 218-227.

129. Pudek, M.R, and Bragg, P.D. (1974) Inhibition by cyanide of the respiratory chain oxidases of Escherichia coli, Arch. Biochem. Biophys. 164, 682-693.

130. Poole, R.K, and Williams, H.D. (1988) Formation of the680-nm-absorbing Form of the Cytochrome bd Oxidase Complex of Escherichia coli by Reaction of Hydrogen Peroxide with the Ferric Form, FEBS. Lett. 231, 243-246.

131. Lorence, R.M., and Gennis, R.B. (1989) Spectroscopic and quantitative analysis of the oxygenated and peroxy states of the purified cytochrome d complex of Escherichia coli, J. Biol. Chem. 264, 7135-7140.

132. Bergmayer., H.U., Gawehn, K., and Grassl, M. (1970) In: Methoden der Enzymatischen Analyze, Vol. 1, pp. 440 (Bergmayer, H.U., Ed.) Verlag Chemie, Weinheim.

133. Борисов, В.Б. (1995) Взаимодействие комплекса цитохромов bd из Е. coli с лигандами. Дисс. канд. биол. наук, МГУ, Москва.

134. Miller, M.J., and Gennis, R.B. (1986) Purification and reconstitution of the cytochrome d terminal oxidase complex from Escherichia coli, Methods Enzymol. 126, 87-94.

135. Belevich, I., Borisov, V.B., Bloch, D.A., Konstantinov, A.A., and Verkhovsky, M.I. (2007) Cytochrome bd from Azotobacter vinelandii: evidence for high-affinity oxygen binding, Biochemistry 46, 11177-11184.

136. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193, 265-275.

137. Brunori, M., Falcioni, G., and Rotilio, G. (1974) Kinetic properties and electron paramagnetic resonance spectra of the nitric oxide derivative of hemoglobin components of trout (Salmo irideus), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 2470-2472.

138. Brunori, M., Giuffre, A., D'Itri, E., and Sarti, P. (1997) Internal electron transfer in Cu-heme oxidases. Thermodynamic or kinetic control?, J. Biol. Chem. 272, 19870-19874.

139. Montgomery, H.A.C., Thom, N.S., and Cockburn, A. (1964) Determination of dissolved oxygen by Winkler method and solubility of oxygen in pure water and sea water, J. Appl. Chem. 14, 280-296.

140. Racker, E. (1972) Reconstitution of cytochrome oxidase vesicles and conferral of sensitivity to energy transfer inhibitors, J.Memb.Biol. 10, 221-235.

141. Rigaud, J.L., Pitard, B., and Levy, D. (1995) Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins, Biochim. Biophys. Acta 1231, 223-246.

142. Borisov, V.B., Forte, E., Konstantinov, A.A., Poole, R.K., Sarti, P., and Giuffre, A. (2004) Interaction of the bacterial terminal oxidase cytochrome bd with nitric oxide, FEBS Lett. 576, 201-204.

143. Drachev, L.A., Kaulen, A.D., Semenov, A.Y., Severina, 1.1., and Skulachev, V.P. (1979) Lipid-Impregnated Filters as a Tool for Studying the Electric Current-Generating Proteins, Anal. Biochem. 96, 250-262.

144. Verkhovsky, M.I., Morgan, J.E., Verkhovskaya, M., and Wikstrom, M. (1997) Translocation of electrical charge during a single turnover of cytochromes oxidase, Biochim.Biophys.Acta 1318, 6-10.

145. Azarkina, N., Siletsky, S., Borisov, V., von Wachenfeldt, C., Hederstedt, L., and Konstantinov, A.A. (1999) A cytochrome ¿¿'-type quinol oxidase in Bacillus subtilis strain 168, J. Biol. Chem. 274, 32810-32817.

146. Martin, J.L., and Vos, M.H. (1994) Femtosecond measurements of geminate recombination in heme proteins, Methods Enzymol. 232, 416-430.

147. Vos, M.H., Borisov, V.B., Liebl, U., Martin, J.-L., and Konstantinov, A.A. (2000) Femtosecond resolution of ligand-heme interactions in the high-affinity quinol oxidase bd: A di-heme active site?, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1554-1559.

148. Beal, D., Rappaport, F., and Joliot, P. (1999) A new high-sensitivity 10-ns time-resolution spectrophotometric technique adapted to in vivo analysis of the photosynthetic apparatus, Rev. Sci. Instrum. 70, 202-207.

149. Chance, B., Graham, N., and Legallais, V. (1975) Low temperature trapping method for cytochrome oxidase oxygen intermediates, Anal. Biochem. 67, 552-579.

150. Kalnenieks, U., Galinina, N., Bringer-Meyer, S., and Poole, R.K. (1998) Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis: evidence for a branched respiratory chain, FEMS Microbiol. Lett. 168, 91-97.

151. Dawson, R.M.C., Elliott, D.C., Elliott, W.H., and Jones, K.M. (1986) Data for Biochemical Research, Clarendon Press. Oxford.

152. Clark, W.M. (1960) Oxidation-Reduction Potentials of Organic Systems, Williams and Wilkins. Baltimore, MD.

153. Provencher, S.W. (1976) A Fourier method for the analysis of exponential decay curves, Biophys. J. 16, 27-50.

154. Wood, P.M. (1984) Bacterial Proteins with СО-binding b- or c-type Haem Functions and Absorption Spectroscopy, Biochem. Biophys. Acta 768, 293-317.

155. Костырко, B.A., Ягужинский, JI.C. (1974) Два центра связывания убисемихинона в сукцинатоксидазе митохондрий, Биохимия 44, 1884-1889.

156. Vygodina, T.V., and Konstantinov, A.A. (1987) Evidence for Two FhCVbinding Sites in Ferric Cytochrome с Oxidase. Indication to the O-cycle?, FEBS Lett. 219, 387-392.

157. Vygodina, Т., and Konstantinov, A. (1989) Effect of pH on the Spectrum of Cytochrome с Oxidase Hydrogen Peroxide Complex, Biochim. Biophys. Acta 973, 390-398.

158. Watmough, N.J., Cheesman, M.R., Greenwood, C., and Thomson, A.J. (1994) Cytochrome bo from Escherichia coli: Reaction of the Oxidized Enzyme with Hydrogen Peroxide, Biochem. J. 300, 469-475.

159. Moody, A.J., and Rich, P.R. (1994) The Reaction of Hydrogen Peroxide with Pulsed Cytochrome bo from Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 226, 731-737.

160. Выгодина, T.B., Шмидмайер, К., Константинов, A.A. (1992) Взаимодействие окисленной цитохромоксидазы с гидроперекисями, Биол. мембраны 9, 677-692.

161. Gorren, A.C.F., Dekker, Н., and Wever, R. (1986) Kinetic investigations of cytochrome с oxidase with hydrogen peroxide, Biochim. Biophys. Acta 852, 81-92.

162. Weng, L., and Baker, G.M. (1991) Reaction of Hydrogen Peroxide with the Rapid Form of Resting Cytochrome Oxidase, Biochem. 30, 5727-5733.

163. Erman, J.E., Vitello, L.B., Miller, M.A., Shaw, A., Brown, K.A., and Kraut, J. (1993) Histidine 52 is a critical residue for rapid formation of cytochrome с peroxidse Compound I, Biochemistry 32, 9788-9806.

164. Petrich, J.W., Poyart, C., and Martin, J.L. (1988) Photophysics and reactivity of heme proteins: a femtosecond absorption study of hemoglobin, myoglobin, and protoheme, Biochemistry 27, 4049-4060.

165. Yonetani, Т., and Ray, G.S. (1965) Studies on cytochrome с peroxidase. I. Purification and some properties, J. Biol. Chem. 240, 4503-4508.

166. Li, T, Quiilin, M.L, Phillips, G.N, and Olson, J.S. (1994) Structural Determinants of the Stretching Frequensy of CO Bound to Myoglobin, Biochemistry 33, 1433-1446.

167. Mims, M.P, Porras, A.G, Olson, J.S, Noble, R.W, and Peterson, J.A. (1983) Ligand binding to heme proteins, J. Biol. Chem. 258, 14219-14232.

168. Coletta, M, Ascoli, F, Brunori, M, and Tray lor, T.G. (1986) pH Dependence of Carbon Monoxide Binding to Ferrous Horseradish Peroxidase, J. Biol Chem. 261, 9811-9814.

169. Poole, R.K, Scott, R.I, and Chance, B.R. (1981) The Light-reversible Binding of Carbon Monoxide to Cytochrome a\ in Escherichia coli K12, J. Gen. Microbiol. 125, 431-438.

170. Poole, R.K, Sivaram, A, Salmon, I, and Chance, B. (1982) Photolysis at Very Low Temperatures of CO-Liganded Cytochrome Oxidase (Cytochrome d) in Oxygen-limited Escherichia coli, FEBS. Lett. 141, 237-241.

171. Wilson, D.F. (1967) Effect of temperature on the spectral properties of some ferrocytochromes, Arch. Biochem. Biophys. 121, 757-768.

172. Vincent, J.C, Kumar, C, and Chance, B. (1982) Quantitative visible spectroscopy at low temperatures: a systematic examination,^««/. Biochem. 126, 86-93.

173. Junemann, S„ Rich, P.R, and Wrigglesworth, J.M. (1995) CO Flash Photolysis of Cytochrome bd from Azotobacter vinelandii, Biochem. Soc. Trans. 23, 157S.

174. Chang, Y„ More 11, D.B., Nichol, A.W, and Clezy, P.S. (1970) Substituted iron-chlorins and their complexes with globin. Spectral comparisons with myeloperoxidase, Biochim. Biophys. Acta 215, 88-96.

175. Martinis, S.A, Sotiriou, C, Chang, C.K., and Sligar, S.G. (1989) Characterization of cytochrome b$ reconstituted with a ferric chlorin and a ferric oxochlorin, Biochemistry 28, 879-884.

176. D'mello, R, Purchase, D, Poole, R.K, and Hill, S. (1997) Expression and content of terminal oxidases in Azotobacter vinelandii grown with excess NH4+ are modulated by O2 supply, Microbiology 143, 231-237.

177. Lehninger, A.L, Nelson, D.L, and Cox, M.M. (1993) Principles of Biochemistry, Worth Publishers. New York.

178. Verkhovsky, M.I, Morgan, J.E, Puustinen, A, and Wikstrom, M. (1996) Kinetic trapping of oxygen in cell respiration, Nature 380, 268-270.

179. Antonini, E, and Brunori, M. (1971) Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands, North-Holland Publishing Co. Amsterdam.

180. Martin, J.-L, and Vos, M.H. (1992) Femtosecond biology, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21, 199-222.

181. Ye, X., Demidov, A., and Champion, P.M. (2002) Measurements of the photodissociation quantum yields of MbNO and Mb02 and the vibrational relaxation of the six-coordinate heme species, J. Am. Chem. Soc. 124, 5914-5924.

182. Fry, H.C, Hoertz, P.O., Wasser, I.M., Karlin, K.D., and Meyer, G.J. (2004) Efficient photodissociation of O2 from synthetic heme and heme/M (M = Fe, Cu) complexes, J. Am. Chem. Soc. 126, 16712-16713.

183. Brudvig, G.W., Stevens, T.H., and Chan, S.I. (1980) Reactions of Nitric Oxide with Cytochrome c Oxidase, Biochemistry 19, 5275-5285.

184. Henry, E.R., and Hofrichter, J. (1992) Singular value decomposition: Application to analysis of experimental data, Methods Enzymol. 210, 129-192.

185. Myer, Y.P. (1985) Circular Dichroism Studies of Electron Transfer Components. Vol. 14, pp. 149-188, Academic Press, New York.

186. Palmer, G., and Esposti, M.D. (1994) Application of Exciton Coupling Theory to the Structure of Mitochondrial Cytochrome b, Biochemistry 33, 176-185.

187. Hsu, M.C., and Woody, R.W. (1971) The origin of the heme Cotton effects in myoglobin and hemoglobin, J. Am. Chem. Soc. 93, 3515-3525.

188. Arutiunian, A.M., and Denisenko, A.N. (1986) Heme-heme interactions in circular dichroism spectra, Mol. Biol. (Mosk.) 20, 514-518.

189. Blauer, G., Sreerama, N., and Woody, R.W. (1993) Optical activity of hemoproteins in the Soret region. Circular dichroism of the heme undecapeptide of cytochrome c in aqueous solution, Biochemistry 32, 6674-6679.

190. Goldbeck, R.A., Sagle, L., Kim-Shapiro, D.B., Flores, V., and Kliger, D.S. (1997) Evidence for heme-heme excitonic coupling in the Soret circular dichroism of hemoglobin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 235, 610-614.

191. Nicola, N.A., Minasian, E., Appleby, C.A., and Leach, S.J. (1975) Circular dichroism studies of myoglobin and leghemoglobin, Biochemistry 14, 5141-5149.

192. Degli Esposti, M., Kamensky, Y.A., Arutjunjan, A.M., and Konstantinov, A.A. (1989) A Model for Molecular Organization of Cytochrome 6-561 in Chromaffin Granule Membranes, FEBS Lett. 254, 74-78.

193. Esposti, M.D., Crimi, M„ Kurtner, C., Kruger, A., and Link, T. (1991) The Structure of the Dihaem Cytochrome b of Fumarate Reductase in Wolinella Succinogenes: Circular Dichroism and Sequence Analysis Studies, Biochim. Biophys. Acta 1056, 243-249.

194. Schoepp, B., Chabaud, E., Breyton, C., Vermeglio, A., and Popot, J.L. (2000) On the spatial organization of hemes and chlorophyll in cytochrome b(f. A linear and circular dichroism study, J. Biol. Chem. 275, 5275-5283.

195. Riistama, S., Puustinen, A., Garcia-Horsman, A., Iwata, S., Michel, H., and Wikstrom, M. (1996) Channelling of dioxygen into the respiratory enzyme, Biochim. Biophys. Acta 1275, 1-4.

196. Hill, B.C. (1994) Modeling the sequence of electron transfer reactions in the single turnover of reduced, mammalian cytochrome c oxidase with oxygen, J. Biol. Chem. 269, 2419-2425.

197. Verkhovsky, M.I., Morgan, J.E., and Wikstrom, M. (1994) Oxygen binding and activation: early steps in the reaction of oxygen with cytochrome c oxidase, Biochemistry 33, 3079-3086.

198. Battino, R., Rettich, T.R., and Tominaga, T. (1983) The solubility of oxygen and ozone in liquids, J. Phys. Chem. Ref. Data 12, 163-178.

199. Hofacker, I., and Schulten, K. (1998) Oxygen and proton pathways in cytochrome c oxidase, Proteins 30, 100-107.

200. Salomonsson, L., Lee, A., Gennis, R.B., and Brzezinski, P. (2004) A single-amino-acid lid renders a gas-tight compartment within a membrane-bound transporter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11617-11621.

201. Jones, P., and Dunford, H.B. (2005) The mechanism of Compound I formation revisited, J. Inorg. Biochem. 99,2292-229%.

202. Baek, H.K., and Van Wart, H.E. (1989) Elementary steps in the formation of horseradish peroxidase compound I: direct observation of compound 0, a new intermediate with a hyperporphyrin spectrum, Biochemistry 28, 5714-5719.

203. Shintaku, M., Matsuura, K., Yoshioka, S., Takahashi, S., Ishimori, K., and Morishima, I. (2005) Absence of a detectable intermediate in the compound I formation of horseradish peroxidase at ambient temperature, J. Biol. Chem. 280, 40934^0938.

204. Han, S., Ching, Y.-c., and Rousseau, D.L. (1990) Ferryl and Hydroxy Intermediates in the Reaction of Oxygen with Reduced Cytochrome c Oxidase, Nature 348, 89-90.

205. Hill, B.C. (1991) The Reaction of the Electrostatic Cytochrome c-Cytochrome Oxidase Complex with Oxygen, J. Biol. Chem. 266, 2219-2226.

206. Morgan, J.E., Verkhovsky, M.I., and Wikstrom, M. (1996) Observation and Assignment of Peroxy and Ferryl Intermediates in the Reduction of Dioxygen to Water by Cytochrome c Oxidase, Biochemistry 35, 12235-12240.

207. Kitagawa, T., and Ogura, T. (1997) Oxygen Activation Mechanism at the Binuclear Site of Heme-Copper Oxidase Superfamily as Revealed by Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy, Prog. Inorg. Chem. 45, 431-479.

208. Proshlyakov, D.A., Pressler, M.A., and Babcock, G.T. (1998) Dioxygen activation and bond cleavage by mixed-valence cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8020-8025.

209. Gennis, R.B. (1998) Multiple proton-conducting pathways in cytochrome oxidase and a proposed role for the active-site tyrosine, Biochim. Biophys. Acta 1365, 241-248.

210. Fabian, M., Wong, W.W., Gennis, R.B., and Palmer, G. (1999) Mass spectrometric determination of dioxygen bond splitting in the "peroxy"' intermediate of cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13114-13117.

211. Proshlyakov, D.A., Pressler, M.A., DeMaso, C., Leykam, J.F., DeWitt, D.L., and Babcock, G.T. (2000) Oxygen activation and reduction in respiration: Involvement of redox-active tyrosine 244, Science 290, 1588-1591.

212. Takahashi, S., Ching, Y.-c., Wang, J., and Rousseau, D.L. (1995) Microsecond generation of oxygen-bound cytochrome c oxidase by rapid solution mixing, J. Biol. Chem. 270, 8405-8407.

213. Greenwood, C., Wilson, M.T., and Brunori, M. (1974) Studies on Partially Reduced Mammalian Cytochrome Oxidase, Biochem. J. 137, 205-215.

214. Morgan, J.E., Verkhovsky, M.I., Palmer, G., and Wikstrom, M. (2001) Role of the PR intermediate in the reaction of cytochrome c oxidase with O2, Biochemistry 40, 68826892.

215. Karpefors, M., Adelroth, P., Namslauer, A., Zhen, Y., and Brzezinski, P. (2000) Formation of the "peroxy" intermediate in cytochrome c oxidase is associated with internal proton/hydrogen transfer, Biochemistry 39, 14664-14669.

216. Sucheta, A., Szundi, I., and Einarsdottir, O. (1998) Intermediates in the reaction of fully reduced cytochrome c oxidase with dioxygen, Biochemistry 37, 17905-17914.

217. Brzezinski, P. (2004) Redox-driven membrane-bound proton pumps, Trends Biochem. Sci. 29, 380-387.

218. Brunori, M., Giuffre, A., and Sarti, P. (2005) Cytochrome c oxidase, ligands and electrons, J. Inorg. Biochem. 99, 324-336.

219. Hosier, J.P., Ferguson-Miller, S., and Mills, D.A. (2006) Energy transduction: proton transfer through the respiratory complexes, Annu. Rev Biochem. 75, 165-187.

220. Yoshikawa, S., Muramoto, K., Shinzawa-Itoh, K., Aoyama, H., Tsukihara, T., Ogura, T., Shimokata, K., Katayama, Y., and Shimada, H. (2006) Reaction mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1757, 395-400.

221. Stubbe, J., and van Der Donk, W.A. (1998) Protein radicals in enzyme catalysis, Chem. Rev. 98, 705-762.

222. Brown, G.C., and Cooper, C.E. (1994) Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase, FEBS Lett. 356, 295-298.

223. Torres, J., Darley-Usmar, V., and Wilson, M.T. (1995) Inhibition of cytochrome c oxidase in turnover by nitric oxide: mechanism and implications for control of respiration, Biochem. J. 312, 169-173.

224. Giuffre, A., Sarti, P., D'ltri, E., Buse, G„ Soulimane, T., and Brunori, M. (1996) On the mechanism of inhibition of cytochrome c oxidase by nitric oxide, J. Biol. Chem. 271, 33404-33408.

225. Sarti, P., Giuffre, A., Forte, E„ Mastronicola, D„ Barone, M.C., and Brunori, M. (2000) Nitric oxide and cytochrome c oxidase: mechanisms of inhibition and NO degradation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 183-187.

226. Forte, E, Urbani, A, Saraste, M, Sarti, P, Brunori, M, and Giuffre, A. (2001) The cytochrome cbb^ from Pseudomonas stutzeri displays nitric oxide reductase activity, Eur. J. Biochem. 268, 6486-6491.

227. Butler, C, Forte, E, Maria Scandurra, F, Arese, M, Giuffre, A, Greenwood, C, and Sarti, P. (2002) Cytochrome bo(3) from Escherichia coli: the binding and turnover of nitric oxide, Biochem. Biophys. Res. Commun. 296, 1272-1278.

228. Hendriks, J, Warne, A, Gohlke, U, Haltia, T, Ludovici, C, Lubben, M, and Saraste, M. (1998) The active site of the bacterial nitric oxide reductase is a dinuclear iron center, Biochemistry 37, 13102-13109.

229. Cheesman, M.R, Zumft, W.G, and Thomson, A.J. (1998) The MCD and EPR of the heme centers of nitric oxide reductase from Pseudomonas stutzeri: evidence that the enzyme is structurally related to the heme-copper oxidases, Biochemistry 37, 3994-4000.

230. Stubauer, G, Giuffra, A, Brunori, M, and Sarti, P. (1998) Cytochrome c oxidase does not catalyze the anaerobic reduction of NO, Biochem. Biophys. Res. Commun. 245, 459465.

231. Torres, J, Cooper, C.E, and Wilson, M.T. (1998) A Common Mechanism for the Interaction of Nitric Oxide with the Oxidized Binuclear Centre and Oxygen Intermediates of Cytochrome c Oxidase, J. Biol. Chem. 273, 8756-8766.

232. Giuffre, A, Barone, M.C, Mastronicola, D, DTtri, E„ Sarti, P, and Brunori, M. (2000) Reaction of Nitric Oxide with the Turnover Intermediates of Cytochrome c Oxidase: Reaction Pathway and Functional Effects, Biochemistry 39, 15446-15453.

233. Herold, S, and Rehmann, F.-J.K. (2001) Kinetic and mechanistic studies of the reactions of nitrogen monoxide and nitrite with ferryl myoglobin, J. Biol. Inorg. Chem. 6, 543-555.

234. Herold, S, and Rehmann, F.-J.K. (2003) Kinetic of the reactions of nitrogen monoxide and nitrite with ferryl hemoglobin, Free Radic. Biol. Med. 34, 531-545.

235. Lemon, D.D, Calhoun, M.W, Gennis, R.B, and Woodruff, W.H. (1993) The Gateway to the Active Site of Heme-Copper Oxidases, Biochemistry 32, 11953-11956.

236. MacMicking, J, Xie, Q.W, and Nathan, C. (1997) Nitric oxide and macrophage function, Annu. Rev. Immunol. 15, 323-350.

237. Richardson, A.R, Dunman, P.M., and Fang, F.C. (2006) The nitrosative stress response of Staphylococcus aureus is required for resistance to innate immunity, Mol. Microbiol. 61, 927-939.

238. Pettigrew, G.W, and Moore, G.R. (1987) Cytochromes c. Biological Aspects, SpringerVerlag. Cambridge, Masschusetts.

239. Выражаю глубочайшую благодарность Александру Александровичу Константинову за постоянное внимание, поддержку, доброжелательность, помощь в планировании экспериментов и при обсуждении полученных результатов.

240. Искренне благодарю Владимира Петровича Скулачева и Андрея Дмитриевича Виноградова за интерес к работе, полезное обсуждение и критические замечания.

241. Я чрезвычайно признателен Александру Миграновичу Арутюняну за совместные измерения КД и МКД, постоянную помощь и участие.

242. Благодарю Сергея Силецкого, Ирину Анатольевну Смирнову, Татьяну Владимировну Выгодину, Наташу Ацаркину, Ирину Новикову за доброе отношение, помощь в работе и поддержку.

243. Наконец, я благодарен всем сотрудникам отделов биоэнергетики и молекулярной энергетики микроорганизмов за всестороннюю помощь и поддержку.