Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Na+-транспортирующая дыхательная цепь алкало- и галотолерантной бациллы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Na+-транспортирующая дыхательная цепь алкало- и галотолерантной бациллы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО' ЗНАМЕНИ Г0С7ДАРСТЕЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

С ШЕЙНИНА Анна Леновна

Ыа+-ТРАНСПОРгаРУЮЩАЯ .ДЫХАТЕЛБНАЙ ЦЕПЬ АЛКАЛО- И ГАЛОТОЛЕРШНОЙ БАЦИЛЛЫ

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в сектора биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н.Белозерского ЬПУ им. И.В.Ломоносова.

Научный руководитель: академик, профессор В.П.Скулачев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Р.А.Звягильская,

кандидат биологичаских наук

В.Г.Гривенндкова

Ведущая организация: Институт проблем передачи информации РАН

на заседании специализированного совета Д.053.05.32 го адресу : Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией южно ознакомиться в библиотека Биологического факультета 'ЛГУ.

Защита состоится

1992 года в

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Ю.Н.Лейкш

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность ггооблемц. В последние голы заметно вырос интерес исследователей к роли ионов натрия в биоэнергетических процессах. Связано это прежде всего с серьезными затруднениям, возникающими при попытках приложения классического принципа протонного цикла Митчелла /N>lcnel| ,1961,1966/ к энергетике шкроорганизмов, способных существовать в условиях пониженной ь^и*, недостаточной для осуществления основных мембранных функций. Это относится как к алкалофильным бакте-. рйям, поддеркиващим рН цитоплазмы на 1,5 - 2,0 единицы кислее,-чем рН среди, так и к микроорганизмам, обладающим устой-чивочтью к действию разобщителей, т.е. способным к росту в присутствии протонофоров /Krutwie.ii ддаЗДЭБб; Скулачэв,1989/. Для объяснения данного феномена В.П.Скулачовым была ввдшнута гипотеза На+-цикла /SkutacW,1984,1385/, согласно го торой у некоторых видов бактерий роль сопрягающего иона может играть Ыа+, а не Я4". При этом предполагается, что aj^t, генерируемая первичными помпами, мояет быть использована для энергообеспечения основных типов работы, совершаемой клеткой: химической (синтез AIS), осмотической (импорт метаболитов) и механической (вращение жгутика). К настоящему времени в группах Т.Унамого и В.П.Скулачэва ужэ доказало наличие полного Ыа+-оикла у морского вибриона Vibrio olginolijVicuá /Tonuda, 11п«то'Ьэ,1982,1984;Diorov »1-,1906,1989/, отдельные элементы На+-цикла показаны у многих прокариот /обсуждение см. Сиу. лачев,1Э69/. Однако следует отметить, что если многочисленные потребители описаны для больного количества различных видов бактерий, то первичные генераторы¿рщ* изучены ху?.е. В

частности, долгов время единственным примером первичной Ыа+-помпы в состава бактериальной дыхательной цепи оставалась Ыа+-транспортирующая НАДН-хинон оксидоредуктаза из МЕг'т й1д'|поЬ|-

«И хотя в последние годы стали известны другие ещщ микроорганизмов, обладающие аналогичным Ферментным комплексом /ГоЪшЦ^о^игеДеБЭ/, во всех описанных случаях Ка+-транспор-тируювдм участком оказался .комплекс I дыхательной цепи.

Первые указания на то, что терминальная сксидаза такаа может являться первичной На^-помпой были получены в нашей группе несколько лат назад при работе со щташом гало- и алкалото-ларантной бациллы ВсюИий РТЦ/Варховская и соавт.,1938/. Таким образом, был расширен круг ферментов, способных трансшр-тировать Ка+ за счет энергии радокс-реакций.

Целью настоящей работы было дальнейшее изучение энергетики Бве'||1иЗ гти на более простой по сравнению с голыш клетками модельной система - вывернутых суббактериальных частицах: подробный анализ работы Ыа+-транспортируюцеЁ дыхательной цепи и ее взаимодействия с протонпераносящай дыхательной цепью, ' которая такхо была описана для этого вида микроорганизмов /Вагина Д 990/, а также поиск ответа на вопрос о возможном механизме регуляции Ыа+-цикла у "прокариот. В частности, нас интересовало, является ли Ыа+-транспортируюцая дыхательная цепь ВаеШиг РТ11 конститутивной, шш в некоторых условиях может происходить ее индукция. ,

Научная новизна рабой:. В ходе исследований изучена работа дыхательной цепи Вос'|11и5 ГШ. Впервые обнаружено, что при щелочных значениях рН в клетках &яс'||1и£ РП) функционирует На+-транспортирую£ая Дыхательная цепь, состояния из двух участков сопряжения: НАДН-хинон окездоре;^к.тазц и терминальной

оксздазы. Вперше получены данные, указывающие на то, что II а+-транспортирующая дыхательная цепь Beeil luí FTU является инду-цибельной, и фактором, вызывающим ее индукцию, служит снижение ¿fu* •

Теоретическое и практическое значение работы. Получэшше результаты подтверадают гипотезу В.П.Скулачева о существовании . бактериальной энергетики, основанной на циркуляции иона натрия, в разных таксономических группах прокариот. Данные о механизме ивдукции Ыа+-энергетики у Bacillus FTU облегчают понимание путей адаптации бактерий к небжгоприятным условиям, в частности, к снижению Результаты, полученные при исследовании механизма взаимодействия с Ца+-транспортирующеп дй-хательноЕ цепью Bacillus FTU могут быть использованы при разработка новых антибактериальных методов в отношении патогенных микроорганизмов, для которых показано наличие На+-цикла, -Vibrio cboleroie, Vibrio paraka«molijlicu.S, kleSsiello f>n«<-MoHioe , SalmohflU "fyphi murium.

Дпробздяя работы. Диссертационная работа была апробирована на теоретическом семинара отде.та биоэнергетики НИИ Ойз.-Хим. Биологии ш. А.Н.Белозерского МГУ (Москва,IS89,19S0,1991); результаты исывдоваяий бши представлены на международном

• симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва,1989), 19-й конферанции MEO (Рам,1989), 6-й Европейской биоэнергетической конференции'(Голландия,1990), 15-ом Мея-

• дународноы конгрессе го биохимии Шерусалям,Х99Х).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 13 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и-методов.исследоЕания,

изложения результатов экспериментов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литератур!. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование бактерий. Б работе использовала иташ ал- • кало- и галотолерантной бактерии Bacillui FTU , вцделенный в нашей лаборатории. Культуру Baciltui FTU выращивали при интенсивной аэрации на жидкой солевой среде следующего состава: 0,5 M ЫаС1, 10 M KCl, 5 mH !^04, 15 Ш (ЫН4)2$04, 2 ыГЛ KttgFO^, 0,01 ii«I Ре504, 0,1 мМ ЭДТА, 50 мМ тр;ю-НС1, pH 8,6. Для неко- . торых экспериментов клетки выра'чивали при pH 7,5. В этом случае в качестве буфера использовали 50мМ HepeS-ЫаОИ. Единственным источником углерода и энергни с-цуяшл сукцанат Ыа+ в концентра- ' ции 60 мГЛ. В некоторых случаях культуру клеток Bacillus FTU выращивали на синтетической соловой среде, pH 7,5, с добавлением ; 3 мкМ пентахлорфенола или 20-30 ш.М КСЫ. В последнем случае выращивание проводили в течение не более чвм 12 .часов. В сере- -дине экспоненциальной фазы роста к®тки собирали центрифугированием при 4000^ в течениз 10 минут. Полученный препарат исполь-: зовали затем для дальнейших экспериментов.

Получение истощенных клеток Bacillus FTU. Для получения истощенных по субстратад: дыхания клеток ÏW.1W F TU их в ира- . : •«авали, собирали центрифугированием, двавды промывали, суспендировали и затем оставляли при 0°с в среде следующего состава: ; 0,5 M HaCI, 5 мГЛ M<}S04, 25 мМ трицин-КОИ, pH 8,2. Через 12 часов эндогенное дыхание составляло 3-10$ от максимального. Непосредственно петед опытом клетки прошвали и суспендировала в . . той ке среде.

Регистрацию дыхания клеток и суббактзриальных частил из клеток Bacillus FTU проводили с помощью элзктрода Кларка закрытого типа. Электрод был присоединен к лолярографу LP 7в (Чо— хословакдя), а сигнал регистрировали на самописца "J{«f-'c " (^о-Sih-Jvon. Франция).

Выделение внвернутах суббактзриальных частил (СБЧ) из клеток Bcnllt<¿ PTIJ ' основано на получении сферопластов при обработка клеток лизоцимом. Сферопласты разрушали ультразвуком с помощью дезинтегратора 73ДЕ1-2Т. Субклвточные частицы осаждали центрифугированием при 40 ООО cj» 90 млн, 4°с, суспендировали в раствора, содеряащэм 100 Ш KgSO^, 10 2,5 мМ На2£04,

50 tóf трицин-КОН, pH 8,2 и зашраживали в адкон азоте.

Измерение внутреннего объема суббактериальннх частил из Bacillus FTU проводили с помощью низкомолекулярной проникающей через мембраны .спиновой мотки 2,2,6,6-тетрамотил-4-оксого!-передин-Н-оксдца/Mfhiliorr* el al., 1982/. Внутренний объем определяла' сравнением амплитуд высокопольных компонент ЭПР-спектра матки во шепнем растворе, мембранной фаза и внутри суббактериальных частиц. Сигналы от двух водных фаз в суспензии СБЧ разделяли с помощью ке проникаю.-® го через мембраны стш-уширягацэго агента - триоксалохрошта калия.

Регистрацию поглощения КСа* СБ? из Bacillus FTU проводили с помощью модифицированного'Метода Пенефски /Pen?-j"fbj,I977/. Аликвоты суспензии СБЧ, элергязовшшнх внесением НАДЯ или ас-корбата/Т!,!ЗД, через определенные интервалы времени наносили на колонку с сефалексом 9-50 coarie- и центрифугировали 1,5 ?ян в бакет-рогорз п п 7C0cj. Элгзат. содержащий' СБЧ, отмытые от nioa-H9 !í среды, разводила в 10 раз биллстплированной водой и измаря- . ли в нем концентрацию Иа+ с помощью пламенного йотокэтрп ПМ.

В этой из проба измеряли концентрацию балка к полученные результаты вира шли отношением количиства Ыа+ в ш.'.олях к нэличаству белка в мг.

Для измерения пассивной Ыа+-прошздаемости мембран СЕЧ из bacillus FTU также использовали описанный выше метод, однако б бтом случае к суббактериальным частицам, выделенным и.инкубируемым в средах баз добавленного Иа+ (начальная концентрация Ыа+ в среде при этом составляла 0,2 ыМ) в нулевой момент времени Добавляли 5 Ш Ыа^О^, создавая таким образом 50-кратный Ыа+-градиент. "

Концентрации бактериального'белка определяла по шдвйа-цированной методике Лоури /Lt>wrij -Л ol-,I95l/ä используя для разрушения мембран додецилсульфат натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выбор объекта исследований. В качество объекта исследований наш был выбран штамп алкало- и галотолерантной бациллы Bacillus FTU, ввдоленный в налей лаборатории. В более ранних работах нашей группы было показано, что этот облагатно аэробный микроорганизм обладает спонтанной устойчивость!) к разобщитэла-протонофору карбонилцианид—хлорфенилгвдрвзону (ХШ). В работах, проведенных на целых клетках Bacillus FTU. были получены данные, указывающие на наличие На+-цикла у этого шкроорганиз- . ма: первичного ьр^-геноратора в составе дыхательной цепа (терминальной оксидазы) и использования этой лр^ для синто за АИ мембранной АТО-сиятазой /Верховская,1990/.

Для более подробного исследования рвбощ лервлчннх Ыа+-поып, использупцах энергии редокс-реакций, ш выбрали модель вывернутых суббактериальных часг-.щ. Эта модель, являясь более простой по сравнению с целш.щ клетками, дает возшкность деталь-

ного исследования работа как всей дыхательной цепи, так и отдельных ев кошонентов.

Прежде чем приступить к описании полученных наш результатов, представляется целесообразны!/ остановиться на характеристике используемой модели.

Работа дыхательно!" цепи в вывернутых СБЧ приводит к трапе-порту иона гзгутрь СБЧ (Н*- в случае протонной дыхательной цепи или Ыа+ в случав натриевой), вследствие чего на мембране возникает л у ("+" - внутри частицы, - снаружи). Генерируемая при работе протонной дыхательной цепи д рН (или лрН + aiy ) го-жат затем использоваться Па+/Й*"-обменником для переноса внутрь СБЧ ионов Ыа+, Таким образом, a priori существуют два возможных механизма трансыембракного транспорта Ыа.+ за счет энергии редокс-реакцийг первичный, обуславливаемый работой Ыа+-пяш в состава дыхательной цепи, и вторичный, за счет работы Ыа+/Н*-обменника, использующего образованную протонной дыхательной цепью Для того, чтобы в условиях'эксперимента-различить

эти два механизма, сладует воспользоваться радом эффекторов. Так, например, агенты, снимающие л рН на мембране - слабне проникающие кислота (ацетат) и основание (дкзтиламин.ДЭА) - в случае первичного транспорта Ыа+ будут стго.улировать наблюдаемый процесс, а в случае вторичного - подавлять.-Аналогичным образом разобцителз-протонофоры, дисслпирующие Д/V-. будут являться сдаздулиигяцпгди в первом случае и йнгибирутаиот во втором.

Презде всего нами было показало, что при переходе к вывернутым СБЧ не утрачивается описанная для целых клеток 'Хеномено-логия первично': Ка+-пог.:лы в сх>ставз дыхательной цепи. Как шд-но из рис.1, внесение в суспензию СБЧ HAJUEî ведет к аккуглуляцни

Рио.1. Поглощение Ыа+ вывернутыми СБЧ из Вос'Л-Ки РТи цри окислении НАДИ Среда инкубации (см.Методы) была дополнена 5С Ш ДЭА/ацетатоы. В нулв вой мэыент времени в среду Н! оси ли 2 ¡¿а НАДЕ1. (о) -без добавок; (о) - 10 ыкЫ

т.

ионов Ка+, причем этот процесс не только не подавляется, но значительно стимулируется разобщителем XI©.

В ходе дальнейшей работы ш поставили перед собой задачу локализовать п охарактеризовать первичные генераторы др^ в составе дыхательной цегга Вас'|Ииг РТЫ.

Поглощение На* СБЧ из Ьос\\1и5 РТЫ при окислении НАЩ фумаштом. Для характеристики работы отдельных участков дыхательной цепи Вос^Пц^ РТи мы выбрали два комплекса: ко:дплокс I -НАДН-хинон окспчоредуктазу и комплекс 1У - терминальную окш-дазу. Такой выбор был обусловлен тем, что ранее для морского ■ вибриона Ег<о , а затем и для ряда других бак-

терий была описана На+-транспортирующая НАДН-хинон оксидоро-дуктаза /ТоЬсЬ, ип?то1й,1984;То^ис1й| Уодиге ,1989/. До самого' недавнего времени это был единственны?, прецедент наличия первичной На+-Го1лщ в составе дыхательной цепи шкроотганизшв. В то же время последние работы наией группы на целых метках показали, что в дыхательно", цепи этих бактерий,

возможно, присутствует не описанный ранее первичный генератор

~ Т0Рлнальная оксалаза /Вэрховская,1990; а Л а|,,

1989/.

За работой I комплекса дыхательной цепи й«сН1и4 РТ1( мы следили, используя НАД!1-Фумарат родуктазную реакцию. При этом терг.инальннй участок дыхательной цепи был заблокирован цианидом, и акцептором электронов, поступающих в дыхательную цепь от НАДН, слу.тал фумарат.

Было показано, что в отсутствии Фумарага СБЧ из Бас) II к 5 ГГи неспособны к энергозавпсимому накоплению Жа+; в то же время внесение в суспензию фумарата приводит к значительной аккумуляции Ка+ несмотря на наличие в среде опыта разобщителя-про-тонофора XI®. Более того, как следует из ри'сг2, .ХК6 необходим .для получения максимальной скорости транспорта На+. 7т эта данные свидетельствуют о том, что трансмембранный перекос ионов Ыа+ носит первичный характер, а не опосредован вторичным Ыа+/Я+-обменником. В пользу этого предположения говорит также

ДО (о) .ам^рид

40 сек

Рио.2. Поглощение Ыа+ вывернутыми СМ из В«с11-1м£ ПЧ) при окислении НАДЯ фумаратом. Среда инкубации была дополнена 50 Ш ДЭА/ацетагом, 10 Ш фумаратом калия и I мМ КСЦ. Реакцию начинали добавкой 2 Ш НАДН. (°) - без добавок; (•) -ЮмюМ Ж5; (л) - 10мкМ ХШ+0,2Ш ашлорвд; (х) 10мй.1 ХКЫ)ДМЙМ А^Ы03.

и тот факт, что наблюдаемый транспорт Na+ устойчив к высоким концентрациям (до 0,2 мМ) ашлорвда - ингибитора бактериальных NaVH^-oÖi,киников, но чувствителен к 2-гептпл-4-оксихиноллн-Н-оксиду (ГХО) и ионам серебра (рис.2). Ранее в работах группы Т.Унамото /Ctsanо «t at. ,19о5;Токийа1 lln«mob,IS82/ было показано,что эти дьа вещэства в очень низких концентрациях являются специфическими ингибиторами Ыа+-транспортирующей HAJJH-хи-нон оксидоредуктазы из Vibrici oljjinohj"hc.u.S . Нами было установлено, что наблюдаемый ири работе I комплекса дыхательной цепи bftcillui PTU трансмембранный перенос ионов Ыа+ также подавляется этими ингибиторами, в концентрациях, ооответствущих литературным данным. Так, в случае ГХО полу максимальный эффект наблвдаотся при 0,2 концентрации ингибитора, а в случае - при конпонтрации 1,5 х I0"®iJ.

Таким образом, совокупность получанных наш данных позволяет предполо;хить наличие в составе дыхательной цапк клеток BacUW FTU первичного -генератора, аналогичного описанной ранее Ыа+-транспоргируюцо;: НАДН-хкнон окездорадуктаза из

Vitrio ot^inoli^icus.

Поглощение На'*" СБЧ из Beul Hui FTU при окислении аскор-бцтд. Слздующей вставшей перед нами задача Г: была характеристика терминального участка дыхательной цепи Bacillus FTIL Проадо всего наш было показано, что энергизация СБЧ Т.КД/аскорбатом ведет к аккумуляции Ыа+ везикулами, причэм этот .процесс стимулируется дассипирумщим лу вялмгомкданом (рис.3). Следует отме-тсть, что наблэдаешй транспорт Ка+ внутрь ьезикул происходит против градиента концентрации этого катиона. Как гюказали ЭПР-.измарания, внутренний объем СБЧ лз Вас'Л!ue FTU раван 0,08 мклДц бактериального белка. В то эв ■■ .время средние значения наблвдае-

валяномицил, ДЭА/ацвтат

90 сек

Рис.3. Поглощение Ыа+ вывернутыми СБЧ из Вяс'Л-1и$ РТи при окислении ас-корбата. В нужвой момент времени в сроду зносили 0,5:М ТШД. В среде инкубации дополнительно присутствовали: (о) - 50?.М ДЭА/ацетат; (*) - ЮмкМ валиномгашн; (•) - 50ыМ ДЭА/ацетат + ГОмкМ валиномицин.

ХК5.ДЭА/. 40 ацетат

I

3 мин О

2 мин

Рис.4. Поглощение Ыа+ швер:{уп;;-!1 СБЧ из ВайПиЗ РТ1! при окислении аскорбата. В' нулевой модояг времени в среду вносили 0,25 1.Ы ТГ,??Д. В среде янкубашш дополнительно присутствовали: А. (о) - 50м2.1. ДЗА/ацетат; (О-ГОмкМ Х23; {в)-10:.з£4 вахтомэдгон-501'.I ДЭА/ацвтат; (4)-10:1-;,'.! Ш, + ' 5СМ1 ДЭА/ацетат. Б. (о)-боз добавок; (<>)-10гас.: Г«?;. (А)-10ккй V 5»Я (*)-ХСюЯ ХК* + 1СхкМ '«женой.

мого в экспериментах накопления Ыа+ везикулами составляют 20 ♦ 40 н.'.юль/мг бвлиа. Таким образом, концентрацию Ка+ внутри СБЧ при максимальном транспорте южно оценить как 250+500Ш, что в 25+50 раз превышает концентрацию этого иона в среде опыта.

Тиак, наш был продемонстрирован стимулируешй валинокщци-ном транспорт Ыа+ против градиента концентрации внутрь вывернутых СБЧ из BacilluS FTU, энергизуешх Т.БД/аскорбатом. Однако сам но сабе этот факт еще не говорит о первичном характере наблюдаемого процесса. Валиномицин, диссидируя генерируемую дыхательной цепью ьи) , активирует работу Дыхательной цепи вне за-

<

висимости от того, какой ион переносится через мембрану. То есть представленные на рис.3 данные полно объяснить либо функционированием первичной Ыа+-поыгш, либо работой обычной протонной ' тершналглой оксидазы и вторичного Ыа+/Н*'-обмешщка. Чтобы различить эта две возможности, необходимо воспользоваться эффекторами , снимающими или одну из ее кошонант — ajSI. Результаты такого опыта представлены на рис.3 и рис.4. Мы видим, что диссипация a pli (при внесении в суспензии слабых проникающих кислоты и основания) ведет к стш.гуляциа наблюдаемого процесса. \ ' Более того, в отсутствии на мембране дрн+такжо наблюдается :.ак-' сишльный транспорт Ка+, такшГ по скорости накоплению Па+, вызванное, добавкой валиномицина (рис.4). Таким образом, оптимальными условия.ai для аккумуляции На+ вывернутыми СБЧ из 6ос\|-lus FTU, эиергизуемы1Л1 "П.ЕД/аскорбато.м, является отсутствие на мембране Такла нами бпло погазано, что наблвдаеиый в при-

сутствии протоноТора Ш5 транспорт Ка+ подаатается искусственны;.'. электронейтпальнш.! Ыа+/Н+~оог,:еннико.л шнеисикоц а ингибитором дыхания илшшчом (fiic.dE). На рис.5 приведены кривые ин-гибирования цианидом дыхания к поглощения Ка+ СБЧ пз Batillug

Рис.5. йнгибирование цианидом дыхания (о) и поглощения На+ (») вывернутнш! СБЧ из Вас;I-

РТИ при окислении аснорба-та. Среда инкубации была дополнена БОг.М ДЭА/ацетатом, 15 мМ аснорбатом калия'и ЮтжМ X®. Реакцию начинали добавкой 0,5мМ ТГЛЬД. (в) - начальная

__ скорость поглощения Ыа+;

ИР^КСЫ] ,М (о) - скорость диха- ' ния сразу посла добавки КСМ,

рти, энергизуекыми ТЖД/аскорбатом. Мы видим, что внесение в суспензию СБЧ цианида ведет к подавлению гак дыхательной активности СБЧ, так и транспорта Ыа+; полное шгг.1ирование обоих процессов происходит прп концентрации цианида, равной I мМ. Эта данные подтверждают зависимость наблюдаемого накопления Па+ от работы'терминальной оксидазы. Результаты проведенного нами вдгибиторного анализа суммированы в таблице I:

Таблица I. Влияние различных эффекторов на накопление Ыа+ вывернутыми СБЧ из БасШис РТи > энергизуег.зг.л ЕВД/ас-корбатом.

Эффектэр

Оказываемое действие

Влияние на транспорт Ыа

валиношадн. протонофоры ДЭА/ацэтат амилорнд

моненсия + ХКЗ КСЫ

Ыа+-поно?ор ЕШ 157

в о стимуляция

а^и» = 0 стимуляция ■

дрН = 0 .стагфляция

ингибитор бактериальных отсутствие эффекта Ыа*" /Н* -обмешшко в

др^ = 0 подавление

ингибитор переноса электронов подавление в терминальной оксвдазе

= 0 подавление

Именно совокупность полученных данных позволила нагл утверждать, что. терминальная окслдаза дыхательной цепи ВайИм ^Ти фушсвд-

онирует как первичная Ка+-помпа.

Влияние субмакромоляшых ьужцентрацкИ Ag4" на активный транспорт Ыа+ и пассивную Ыа~*"-проницаемость в СБЧ из Bacillus FTU. Как уже отмечалось ранее, наш было показано, что очень низкие концентрации (Cj^I^O^Ll) полностью подавляют накопление Ыа+ вывернутш,ш СБЧ из boc'illuá FTU в том случае, когда этот процесс обеспечивается работой I комплекса ды-. хательной цепи. Такой специфический эффект можно объяснить ин-гибарованием Ыа+-транспортирующей НАДН-хинои оксидорэдуктазы, как это было описано ранео для V'tfef»о algirioly"licuá М.Асано и коллегами / Oí с к о el al.,1985/. Однако последующие опыты показали, что влияет также и на поддерживаемый работой терминальной оксидазы активный транспорт Na+ внутрь СБЧ из Bacilluí ■ FTU. На рис.6 приведены данные, показывающие ингибкрование ионами Ас|+ активного накопления Tía+, поддерживаемого работой I комплвкса дыхательной цепи (НАДН окисляется Лумаратом) и терминальной оксидазы (аскорбат чэрез Т!.КД окисляется кислородом). Оказалось, что во втором случае процесс дата несколько более

чувствителен к Ai

3

100

И

я w

m Е' о

В

50

4t-

НАДЙ

Рис.6. Влияние Aq+ на гогло-*

щение На вывернутыми СБЧ из Bacillus FTU при окислении НАД!! йумаРатом {&) и аскорба-та/ТШД кислородом (®). 10Щ5 соответствует начальной

аскорбат, скорости поглощения Ыат.

I0~J I0"6 10~"\АоЫ03*] ,!1

>+ та. Среда инкубации была

Рис.7. Поглощение Ыа+ ш-вернутыми СБЧ из ВоаПис

дополнена 50Ш ДЭА/апетя-том, ЮикМ Хгй и 15м!.! ас-корбатом.Роакцию начинали добавкой 0,5 Ш Т№Д. (•)-без добавок: и)-Э,1шМ

РШгфЦ окислении ас''.01<5а-

(а)-4мкМ ГХО + 0,1 икМ А^Н03.

20 " 40* сок

Наблюдаемый э.^оект .можно было бы объяснить тем, что ингпбирует Ыа+ транспортирующую терглшальную оксиддзу так

га, как и НАДЯ-хинон оксидорадуктазу. Однако некоторые данные свидетельствуют против такого предполояиния; (I) низкие когашн-трацки вызысаеде полное подавление транспорта Ыа+ торм.-нальной оксидазо!!, но о;шзывают влияния па скорость окислэнпя аскорбата; (2) ГЖ) (который является ингибитором На+-транспор-тируюс;ой НАДН-хпнон оксидоредуктази, но не влияет на терминальную океццазу) предотвращает подавление ионами Ао+ накопления На*,

сопряженного с окислением аскорбата (рис.7). Последней наблюдение позволило нам предположить, что эффект на транспорт На4" твр.шкаяьной оксидаэой опосредован взаимодействием Ао* с па«яль-

Дет азмвренвя ивибраиной ца*-лроннцаекости, СБЧ из Вйс'Л-

ДУ аднубашш, солзрзашу» 5 я.! Ыа^О^ (с«. Методы). Ъи-.о пана' зйяо, '¡то равновесие гаиу жутрл&озяфлдошы прост ранет го:: а

1иг РТМ выделяли в бэзнатрнеюЯ среда, я заток вносили .гх в сре-

Рис.6. Влияние ..Oj на пассивную Ыа+-проницаешсть СБЧ из Bacillus PTU • Среда инку бацая содержала ОД "Л TpHc-HgiO^j pH 8,2, I0i.i<I М^04, 50м\1 ДЭА/ацетат, 1С мкМ Ш>, 0,2 АйГЫа*. В нулевой момент времени в среду вносила 5,11 Ыа^04. (о)-без добавок; (в)-1мкМ AgKOg.

60 сек

.внешней средой в этих условиях устанавливается за 1+3 минуты, а добавка Ад+ приблизительно г/г рое увеличивает скорость пассивного входа На+ в СБЧ (рис.8). Этот эффект Ао+ оказался чувствителен к ГХО (не показано), что позволило нам предположить, что под действием не только подавляется перенос электронов в-I комплексе дыхательной цепи, но модифицируется и Ыа+-трансгор-. тирующая часть этого ферментного комплекса, вследствие чего становится возможным трансмембранный перенос ионов На+, не оопря-яэшхый с отслительно-восстановиге льтя.га реакциями. В то яв время другой ингибитор НАДН-хинон оксидоредуктазы, ГХО, по всей вероятности, предотвращает такую модификации фермента ионами "г,онно поэтому ГХО снга.ает вызванное Ао^ ингкбировшке активного транспорта Ыа+, сопряженного с работой терминальной оксидазы (рис.7).

Икания иа^-тшнспоитиотюшей дыхательной цепи ВаоПы* рТЦв условиях покаченной а^н». Как следует из результатов, предсташгоиных в предцду^х разделах, если культуру Вас\Пи£ ГШ шгрги-пвагь в опти'.-лльних условиях (рП роста 8,6), то получаемое ¡'.э таких клеток пгепарати СБЧ обладают Ыа+-вэренося:1рй ды-

ха тельной цепью. Но тогда перед нами встает вопрос, является ли эта цепь конститутивной, или появление первичных -генераторов отражает адаптацию данной бактериальной культуры к условиям, в которых функционирование протонного цикла затруднено. В салу вышесказанного, нам представлялось интересным проверить, будет ли функционировать Ыа+-транспортирующая дыхательная цепь, если клетки ВсюПш? РТ1| вырастить при нейтральном рН. В случав получения положительных результато.:, они стали бы еще одним свидетельством в пользу адаптивного значения На+-энергетики у бактерий.

Рост клеток Вас\\1и> РТЫ при Ш 7.5. На рис.9 показан сопряиэн-ный с работой начального участка дыхательной цепи транспорт Ыа+ внутрь вывернутых СБ! из ГГЦ, выращенных при рН 7,5.

Видно, что работа НЩ1-4ушрат редуктазы вызывает транспорт Ыа+ внутрь везикул. Этот процесс значительно стимулируется валиноми-цаном, устойчив к действию и ингибируегся аротонофором ХЮ и ингибитором бактериалышх На+/И+-об.»,'.ашшков ашлорздом (рис.9). Таким образом, проведенный ингибнторндй анализ сгадетельствует о том, что наблюдаемый транспорт На* является гаоричнкм, обус.*о&-лан работой ¡Г^-транспортирувщо;! дыхательной целя (супэ ствованиа которой в клетках' Ва'сШде РТ11 было ранее показано ¿¿.Вагиной ц В.Костырко - Вагина,1950) и Ма+/^"-обмзнника.

Сходные результаты были далучэны и в том случае, когда накопление Яа+ везикула?,ш было оопряяено с работой тар.зшально-гэ участка дыхательной цепи. При этом наблюдаются стимуляц/.л транспорта Ыа+ валшюмлцино:.: а подавление его тьзобциталсм £-3, шалорэдом н искусственным Ыа+-ионэ[.оро;/. ¿1ТН 157 (рас.10). Хромо того, набладазгай процесс шггиблруотся ыа;:роыолярни:.щ коццен-треииямя цганада (рис.II). В то ,та врош ара 'рвСзте- с <-"БЧ из

валиномицин

оммцин, Acj

40 сек

Рис.С. Поглощение Na+ вывернутыми си из 8ac¡l¡u< FTU при окислении НАД! фумаратом. Клетки выращивали при рй 7,5.Среда инкубации была дополнена 5>.í.l фуш-

•-КЛГ'р8™ и м

Реакцию начинали • добавкой 2ьй НАДН. (А)-без добавок; (А)-10мкМ ХШ;

Ш

(•)-10мкМ валиномицин; (х)-10»з<М валиномицин + ОДмкМ А^ЫОд; (ш)-10шй1 ваяинотщт + 0,2ыМ амилорад.

валиЕомацин

валиномицин, КГН валииомицин, амилорвд

20 40 сек

Рис, 1С. Поглощение Ыа+ внверлутцми СБЧ из Bacilluí FTU при огаслонйи аскорбата. Клег:а в.чралдавали при tH 7,5. Среда инкубации била дополнена I&SÍ асаэрбатоы калия. Реакция начинали добавкой 0, С-М Т*|>Д. (о)-без добавок; (•}-10мкК ишшоюшан; U)-I0:.tíI Ж; (*)-ICtoí¿ валикоыя-цкн ■•»• 0.5>2Л шало рад; (г)-10икМ «а.адно?.згаия + ВЭ-íkM БТН.

Среда инкубации была рост пра рй 7,5 дополнена I5m¿ аскор-

Pac.II. Ингибированне цианидом оопряршнного о окислением аскорбата поглощения Ыа+ выгар-нутыня СБЧ кз Вас tifus FTU, выращенных при ¡Л

ацетатом (*)Реакцию на чу-

батом, а таювэ I0j.sU валиношцином (о), или ЮмкМ йО и 50м!Д ДЭА/

7,5 (в) H pH 8,6 14)

0

5 10

■'. клеток, выращенных в щелочных условиях, мы регистрировала первичный, стшулируеши разобщителем транспорт Ка+, сопряженный с работой тер;динальыой оксидези, и для ьго гадавлашш были на обходам гораздо более высокие концентрации цианида (см. рио.4 а ряс.II). Вышеприведенные данные позволили нам сделать вывод о том, что рост клеток пра нейтральном р; приводит к подавлони» активности Ыа+-трансгор?иру»зэй-дыхательной цени .и к активаций альтернативного ызханазма генерации íj*цй* - вторичного KaVlí1 обмешшш, иепользувдэго создаваацуп протонной дыхательной цепьэ Дрн». Даняко, тдтвэрздаюоше этот вывод, были получены и с использованием другого метода. Измерения скорости дашшя С5Ч из клеток Bqc'iHus fTU, охасдявдих ЕйД/аскорбат, показали, что краше шггабкрования скорости дыхания СШ цианвдои значительно отлнчаотет у клеток, рос лх в раз них условия. ¡i слупа роста пра рН 8,6 кривая носят яепо двухфазный характор, что соответствует двум константак цягябнрованая по цианиду (ряс.12). Как mí полагаем, эта двух$азность отразаот впжще двух гврикюль-

Рис.12. Влияние pH среды роста на чувствительность к цаани- , ду терминальных оксидаз Bacillus FTU. 1T0i соответствует начальной скорости дыхания СБЧ, энергизуетх £.&Д/аскорбатом, из клеток, росших при pH 8,6 (в) при pH 7,5 (о).

ных оксидаз, йушсционируицих в данных услошях - Я*"- и Ыа+-транспортирую:щх.

В то же время аналогичные опыты, проведенные на СБЧ из клеток, росших при нейтральном pH, показала, что в этом случае кривая является однофазной; у таких СБЧ отсутствует дыхание, устойчивое к низким концентрациям цианида (рис.12). Эти данные соответствуют' результа-чм по транспорту Na+, представленным на рис.II (трансшрт Ыа+, регистрируемый на "нейтральных" СБЧ, чувствителен к низкому цианиду, неэффективно^ в случае "щелочных" СБЧ).

Таким образом, сумма приведенных вето данных сшдетедьст-вуст о том, что при нейтральном pH в ¡метках Boc'iUus FTU функционирует протонная дыхательная цепь, а рост клеток в зрлочных условиях шзытает индукцию дополнительной Ыа+-транспортирущей дыхательной цепи. Но тогда возникает вопрос, -сто же является фактором, вклвчй.тиг.! натриевую энергетику у этих бактерий. Q priori

таким фактором мо:шт являться либо повышение рН среды рста ft г se, либо возникающее при этом снижение . Чтобы различить эти

две возможности, мы проводили выращивание клеток Вас»llus FTU при нейтральном рН, но в условиях пониженной Арнг Рост клеток BotUlut FTU той неЕ.т)&льноц рИ. но пониженной *fn*. В описыгаомой низе серил экспериментов мы использовали клетки bot\l|ui PTU, росше при р±1 7,5 в присутствии протонофора пон-тахлорофянола (ЗмкУ), или 20 мкУ КСК. Нами было показано, что ври тагаЛ концентрации эффектора в среда скорость роста ¡тоток замедляется в 2-3 раза по сравнению с контрольной. Оказалось, что няличие как 1Ш, так и КСЫ в среде роста в данных услошях сходнал образом алияэт на энергетику клеток. СБЧ, выделенные из таких клеток, обладают 'способностью к энергозавислмо!*/ накошш-нию Ыа+, стимулнруэмог.у разобщителем-протонофором (рисЛЗА; транспорт Na+ сопряжен с работой терминального участка дыхательной цепи). Проведенные параллельно измерения скорости дыхания на интактных клетках, истощенных по эндогенным субстратам, показали, что рост клвток при пониженной ij*^-» приводит к появлению активности второй терминальной оксидазы, чувстштельной к более высоки!.; концентрациям цаанада. Как видно из рис.13В, в этих условиях кривой зависимости скоростл поглощения кислорода клетками, окислявдими ТХД/аскорбат, от цианида соответствует две константа ияк1бирования по цианиду. Одна из этих консгант совпадает с величиной, характерной для клеток, рослих при нз!'т-ральнок рН, и соответствует Е+-транспортируюцо.1 термииигьноИ оксндазо. Вторая константа отражает появление в уелошях роста при понтаелной йрц» На+-транспортпрувд;1 тершнатьноЬ оксадазн.

Таким образом, выпеправеданныа данные срцдвтэльствупт в пользу того, что замена Н*" на На* в ¡счастье сопрягашьго ко:я

10 20 30 40 сек

^[KCKI.mbM

Pile. 13. Появление активности Ыа+-транспортирующей терминальной ог'.сицаэн в глэтках bacillui FTll, выращенных при рН 7,5 в присутствии ¡гротоноТора. А. Поглощение Ыа+ СБЧ из Baciltui FTU при окислении аскорбата. Среда инкубации была дополнена 5Сг;.1 ДЭА/ацетатом и 15 аскорбатом. Реакции яатаклг добавгой 0,5 мМ Т..&Д. (о)-без добавок; (•)-IOr.ric.; Б. Чувствительность к цианиду Термшальных оксида з клеток Bocillui FTU. ллетки были истощены по эндоген-' нж су Остра?:»: дыхания. ^ соответствует начальной скорос-ii; днханкя jyieroi; рос^кх при рН 7,5(о) и при рН 7,5 в при-сугст;.ши 3-ji.l пентахлороТенола (•).

Рост при pH 7,5

Na

ВД цятсплазга

Роет при понггенпоЗ

париплааш

Рис.14. Два механизма транспорта На+ из клеток Üacilluí FTU : взаимодейст-вив -транспортируще й дыхательной цепи и Ыа+/Н^-обмоцншса в клетках, растущих при нейтральной pH (верхняя схема); индукция На^-транспортирующой дыхательной цепи в клетках, растущих в условиях пониженной Ошяняя схема).

НДДЙ Na*

являетсп не только биоэнергетикаскям механизмом адаптации микроорганизмов к щелочной среде,, но такяэ я способом Eira валил при нейтральном pil в условиях пониженной В рамках этой концеп-

ции высокий р!1 является лишь частным случаем адаптивного механизма гораздо более общего значения. Реализация этого механизма в клетках Bacillus FTU прадетавлвла на схемах рнс.14. В условиях достаточно высокой Арк*(например, рост при pH 7,5) эта клетки обладает протонлерэносяцей дыхательной цепью, ц единственным способом генерации является работа торичного Ka*Aí* обметшка. Снижение йрц+в ходе роста культуры приводит к индукции альтернативного механизма - первичного трансаорта натрия Ыа+-тра!1сшртиру}хэй дыхательной цепью. При этом по ьа-дю, каким образом происходи? сшконав Ар: вследствие повышения pH ЙЛЛ Е силу других ПРИЧИН.

- 24 -ШВОДЫ

1. Показано, что вывернутые суббактериальнае тастицы из клеток Вос\\|их РТи, выращенных при рН 8,6, способны к энергозавися-моьу накоплен® На+, сопряяешюг.у с работой как I, так и 1У юмплексов дыхательной цепи.

2. Транспорт Ыа+ шутрь мембранных пузырьизв, обеспечиваемый Функционированием ПАДН-фумарат редуктазы, стимулируется разобщи телаы-прогонофором и ацетатом диэтиламмония, ко подавляэтся низкими концентрациями и ГХО.

3. Накопление Ыа+ вывернутыми СБЧ, энергизуемнми КЛД/аскорба-то,.1, то юта значительно стимулируется разобщителями, ацетатом дкэнишшония и валиномнцином.ео ингибируется монвнсином, цианидом, Ып+-иопофором ЕТН 157.

4. Обусловленный функционированием таргдшальной оксадазн транспорт Ыа+ шутрь СБЧ устойчив к действию ГХО и ингибитора На+/ЕУ обманников амилорада.

5. Субшкро?!олярны9 концентрации вызывают юдавлэпие актсв-ного транспорта Ыа+, сопряямнного о работой как КАДН-фу марат редуктазы, так и тер>янальной оксидазы ВооИи^ ?Т1|. Показано, что этот эф)опосредован ювышлием шссиеюй Ка+-про-ннцаомости мембран &ао|1и5 ГТи вследствие взаимодействия Ас|+

с Ыа+-транспортирунздм гошлакоом I.

6. Вывернутые СБЧ из клеток ЬсиШи^ Р*П1, выращенных при рН 7,5, способны к энергозашсамоьу накоплению Ыа"1", сопряженному с Функционированием НАДН-^умарат редуктазы или те ¡шкальной оксздазн. Процесс сттгуллруется валиномнцином в присутствии калия, но полностью , пода п^яо гея ЖЭ, сцетг.том диэталамюния и амилорздом,

что екпя?тзльстьует о функщоакровакнц На^'/И^-штигортера у глоток, здрсцаг^их в среда с нейтральным рН.

7. Показано, что для клеток, выращенных при рН 8,6, характера наличие активности двух тарьиыалышх оксидаз, отличающихся по чувствительности к цианиду. Б то за время рост при нейтральном jfi ведет к подавлению активности терминальной оксидази, более устойчивой к цианиду.

8. Выращивание клеток Bacillui FTU при нейтральном pli, но в присутствии эффекторов, сншсашцих тзобщителя 1Ш или цианида - ведет к восстановлению активности второй терминальной оксидази и появлению стимулируемого разобщителем транспорта Na+, энергазуемого йЦД/аскорбатом.

9. Полученные данныэ указывают на то, что в кленах Bacillus Пи, выращенных в щелочных условиях, санкционирует На+-транс-тартирутсря дыхательная цепь, состоящая по меньшей мере из двух участков сопряжения: НАДН-хинон оксидоредуктазы и терминальной оксидазы. Данная дыхательная цепь является икдуидбелькой: рост клеток при нейтральном рН ведет к подавлению активности первичных На+-юмн и индукции альтернативного миханизма генерации

вторичного Ыа+/Н*"-обмекника, использующего создаваемою протонной дыхательной цепью Получены дашша, указывающие

на то, что фактором, включахвдш Ыа+-энергетику у BotîUuv FTU , является не повышение рH среды роста-pfr sr , а снижение Арн*.

СПИСОК ШЗОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ЖЭЗСЕРВДШ

1.Верховская М.Л. .Семейкша A.JI. .Скужчев В.П. Конечная оксвда-за, действующая как первичный Ыа+-4;сос.// ДАК СССР,1988,

т.303,o.1501-1503.

2.Верховская М.Д..Семсйшяа А.Л.,Слулачев В.П..Булыгина ¿¡.С., Чумаков К.М. Обнаружение натриевого насоса в терминальном участке бактериальной дыхательной цеод.// Биохимия,1289,т.54,

. с.1457-1466.

3.Верховская ¡.{.Л.,Семэйхша А-Л^Скулсчев В.П. Необходимость \ ионов натрия для генераггал r/.е;,-.бранного штенциала кмтками

олкалотолзрантной бациллы в присутствии протонофоров.// Био- ; химия,1S90, т. 55, с .1043-1051. 4.Вагина М.Л..Берховская М.Л.,Костыряо В.А.,Семейкина А.Л.,Ску- г лмев В.П. »Смирнова И.А. Натриевый и протонный насосы в диха-тельной цепи ирлочаустойчивой бациллы.// Биохимия,1991,т.56, 0.733-746.

5.Seneykine A.L.,Sknlachev V.P.,Verkhov8kaya M.L.,Bulygina E.S., Chumakov K.M. The Na^-motive terminal oxidase activity in an alkalo- and halotolerant Bacillus.// Eux.J.Biochem.,1989.V.183, p.t 71-678.

6.Pemeykina A.L.,Skulachev V.P.,Verkhovskaya M.t. Terminal oxidase of the alkalobolerant Bacillus ITU operates as a primary sodium pump.// In:"Molecular organization of biological structures", Int.Symp., June 19-24,1989,lloacon, p. 28.

7.Skulachev V.P.,Seaeykina A.L.,Verkhovskaya M.Ii.,Kostyrko V.A., Vaphina M.L. Na+-motive terminal oxidase In subcellular vesic-1ея from halo- and alkalotolerant Bacillus FTP.// Abstract book of the 19th FEBS Meeting,July 2-7,1989,Rome,p.33. .

P.fCostyrico V.A.iSemeylcina A.L.,Skulachev V.P.,Smirnova I.A.,Vaghi~ na M.L.,Verkhovskaya M.L. The H+-motive and Na+-motive respiratory chains in Bacillus JfTU subcellular vesicles.// Reports of the 6th ЕЬьС, August 25-30.1990,the Nithorlands,v.6,p.19.

9.Semeykina A.L.,Skulachev V.P. Submicromolar Ag+ increases pae-oive Ka+ perneability and inhibits the respiration-supported foimation of Na+ gradient in Bacillus FTU vesicles.// FEBS Lett.,1990,v.269,p.69-72.• IQ.Kostyrko V.A.,Cemey)cina A.L.,Skulachev V.P.,Smirnova I.A.,Vag- • hine. Г.Ь.,'vVrkhovakaya I'.L. The H+- and Na+-notive respiratory chains In Bacillus TTU subcellular vesicles.// Eur.J.Bio-chem.,1991,v.1^8,p.527-53^« .

11-Avetlsyan A.V.,Dibrov P.A.,Semeykina A.Ii.,Siulachev V.P.,Soko-lov M.V, :;a+-notive respiration, substitutes for Na+/H+ antiporter as tho ;ia+-transportivg mechanism iix E.coli and Bacillus FTU growing at alkaline pH.// Abstracts of the 15th Int. Congress of Biochemistry,August 4-8,1991,Jerusalem,Israel,p.293 12.Avetlsyan A.7.,Eibrov P.A..Seneykina. A.L.,Skulachev V.P.,Soko-lov V.V..Adaptation of Bacillus FTU and E.coli to alkaline conditions: the N'ci+-cotive respiration.//Biochin.Biophys.Acta, 1991,v.',C;98,p.9S-e (J

13.Senejitlna A.I*..Sfculackev V,P. Appearance of tiis fJa+-aotlwa temlnal oxidase in Bacillus FTU grown under three different conditions lowering the Aphf- level.// PEBS hstb., v. 296,1992, p.77-81.