Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности функционирования дыхательной цепи Bacillus subtilis

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности функционирования дыхательной цепи Bacillus subtilis"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

на правах рукописи Наталья Вадимовна Ацаркина С^С*, Сс^^

УДК 577.151.02, 577.151.042, 579.017.7

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ BACILLUS SUBTILIS

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

lllllilllllllllllllll

Ö04613952

Москва-2010

2 5 НОЯ 2010

Работа выполнена в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Константинов Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Андреев Игорь Михайлович

кандидат биологических наук Арцатбанов Владислав Юрьевич

Ведущая организация: Воронежский Государственный Университет

(кафедра ГСНбТИКИ, ЦИТОЛОГИИ VI биоинженерии)

Защита состоится 6 декабря 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мембранная БС^К* относится к ключевым ферментам аэробного метаболизма. Во-первых, она катализирует одну из стадий цикла Кребса, во-вторых - представляет собой вход, через который в дыхательную цепь поступают электроны. Мембрана некоторых бактерий содержит особую разновидность хинона - М<3, потенциал полувосстановления которого на 100 мВ ниже, чем у пары сукцинат/фумарат. В таких организмах БСЖ катализирует энергетически невыгодный перенос электронов с более слабого восстановителя на более сильный. Согласно распространенному мнению, движущей силой процесса служит АцН*. Для МО-зависимых ферментов (тип В семейства 8(ЗЯ/<ЗРК) характерно наличие двух низкоспиновых гемов Ь, расположенных трансмембранно. По данным рентгеноструктурного анализа, место взаимодействия с Мр находится вблизи гема, дисгального по отношению к обращенной в цитоплазму дикарбоксилат-связывзющей субъединице, и граничит с наружной средой. Если, как следует из структуры, участвующие в образовании МСШ? электроны приходят по электрическому полю, а протоны по градиенту концентрации, то сукцикаг.МО-редуктазная и М<ЗН2:фумарат-редуктазная активности должны сопровождаться рассеянием и генерацией ДцЬГ, соответственно. Показано, однако, что С)Ь'К типа В из IV. хисстсщепез восстанавливает фумарат без образования АцН+. С другой стороны, известно, что рассеяние А|аН+ ингибирует Мр-редуктазную активность двугемовых из бацилл. Таким образом, данные о роли АцН+ в работе ЗСЖ. и QFR В-типа противоречивы и гипотеза о преодолении термодинамического барьера сукцинат:М(2-редуктазной реакции за счет энергии ДцН* пока не получила однозначного подтверждения.

Список принятых сокращений; БСА - бычий сывороточный альбумин, ДХФИФ - 2,6-дихлорфенолинаофенол. ДЦКД - Н,№-диииклогексилкарбод1шмид, КД - круговой дихроизм, ТМФД -Ы,Ы,К',>)'-тетраметнл-/1-фе1галендиамин, ФМС - феназинметасульфат, ХКФ - карбонилциаиид-м-хлорфенилгидразои, ЭДТА - этилендиаминтеграацетат, АрН* - разность электрохимических потенциалов протона на мембране, ДрН - разность концентраций протона на мембране, Ду - разность электрических потенциалов на мембране, МО - менахинон, (ЗРЯ - хинол:фумарат-оксидорелуктаза, - сукцинат.хинон-оксилоредуктаза, иС) - убихинон.

Цели и задачи. Основным объектом исследований являлась MQ-содержащая, преимущественно аэробная бактерия В. subtilis. В наши задачи входило: проверить, как влияет деэнергизация мембраны на скорость дыхания целых клеток В. subtilis в присутствии различных субстратов; выяснить причину падения сукцинатоксидазной активности в мембранном препарате В. subtilis-, разработать модельную систему для изучения воздействия АцТГ на работу дыхательной цепи В. subtilis; сопоставить данные о влиянии разобщителей окислительного фосфорилирования на дыхание бактерий из разных систематических групп; сравнить характеристики кофакторов SQR типа В из нескольких организмов; прояснить роль А|ЛГ в катализе SQR у В. subtilis. Научная новизна. Разработана методика получения сопряженных мембранных частиц В. subtilis с высокой сукцинатоксидазной ахтивностью. Предложена кинетическая модель, описывающая процесс окисления сукцината суспензией замкнутых мембранных частиц из бациллы. Обнаружена способность НАДН-дегидрогеназы В. subtilis в мембранных препаратах напрямую реагировать с 02. Впервые показано, что деэнергизация клеточной мембраны ингибирует дыхание В. subtilis и других бацилл от разных субстратов и что эффект не сводится к инактивации SQR. На модельной дыхательной цепи, состоящей из SQR, MQ и терминальной оксидазы bd- типа получены убедительные свидетельства сопряженности работы SQR из В. subtilis в направлении прямой реакции с расходованием Фумарат-редуктазная активность SQR, впервые

исследованная на препарате замкнутых мембранных частиц В. subtilis, найдена не сопровождающейся образованием АцН*.

Практическая значимость. Мутации митохондриальной SQR приводят к паталогиям вследствие повышенного уровня образования кислородных радикалов. Структура двугемовых SQR считается наиболее безопасной с точки зрения взаимодействия с Ог- Возможность мутагенеза позволяет исследовать данную проблему глубже. Многие SQR типа В способны переключаться в анаэробных условиях на роль QFR. Такое же переключение происходит в митохондриальной SQR из раковых клеток. Модификации белка, вызывающие

изменение его функций, удобно изучать на бактериальном аналоге. Двугемовые SQR и QFR встречаются у многих патогенных микроорганизмов (бацилл, хламидий, е-протеобактерий) и могут быть мишенью ингибиторов, имитирующих структуру MQ и безопасных для митохондриального фермента. Иигибирование дыхания бактериальных клеток разобщителями следует принять во внимание при разработке лекарств противобациллярного действия. Апробация работы. Результаты докладывались на 12"я и 16ой Европейских Биоэнергетических конференциях (ЕВЕС 2002, Франция и ЕВЕС 2010, Польша). Работа также апробирована на заседании Ученого совета НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова 22 июня 2009 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 6 полных статей в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 200 страницах машинописного текста, включает 8 схем, 10 таблиц и 39 рисунков.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Препараты SQR, выделенные из различных бактерий, были любезно предоставлены Л. Хедерштедтом (Лунд), Т. Сулиманом (Лимерик), М. Перейра (Лиссабон) и М. Янюшиным (Пущине). Цитохром bd В. subtilis получали из штамма-сверхпродуцента методами ионообменной и афинной хроматографии с гель-фильтрацией на заключительном этапе. Большая часть штаммов В. subtilis предоставлена Л. Хедерштедтом и К. фон Вашенфельдтом (Лунд). Штамм LUH-27 (trpC2 ActaCD::ble AsdhCA '::cat AqoxABCD::kan) получали на основе «дикого типа» путем трех последовательных трансформаций ДНК-материалом мутантов по цитохром с оксидазе caait SQR и хинолоксидазе аа2. Штамм LUH-17/pBSD1200 получили, трансформировав клетки LUH-17 (trpC2 ActciCD::ble AqoxABCD; :кап galT), мутантные по обеим гем-медным

терминальным оксидазам, плазмидой pBSD1200, несущей кодирующий SQR оперон sdhCAB. Менахинон MQ7 экстрагировали из мембран В. subtilis [Krivankova et al., 1980]. Первичную очистку глицерин-З'-фофосфат-дегидрогеназы осуществляли, обрабатывая мембраны В. subtilis ЭДТА либо KCl в высокой концентрации. Выращивание культур В. subtilis проводили при +37° с сильной аэрацией. В качестве энергетического субстрата добавляли сукцинат, малат, глицерин или глюкозу, иногда использовали минимальную среду роста. В выращивании других микроорганизмов любезно помогала Е. Стром (МГУ). Мембранную фракцию получали, разрушая клеточный материал осмотическим шоком, ультразвуком или продавливанием через Френч-пресс. Выращенные клетки осаждали центрифугированием, промывали в среде с pH 8,0 и обрабатывали лизоцимом (0,5 мг/мл, 45-60 мин, +37°). Осажденные и промытые сферопласты разрушали в присутствии ДНКазы и ингибитора протеаз. Мембраны осаждали и промывали 0,1 М фосфатом калия pH 6,6. Осадок суспендировали в среде опыта, помещали на лед и использовали в экспериментах либо суспендировали в минимальном объеме и замораживали в жидком азоте для долгосрочного хранения. Протеолипосомы с SQR или цитохромом bd из В. subtilis, либо с обоими белками одновременно приготовляли с использованием диализа, ультразвука и гранул Bio Beads. Линосомадьную мембрану получали из азолектина и насыщали MQ7 или MQ,t [Biel et al., 2002]. Спектральные исследования включали запись спектров оптического поглощения, кинетические измерения в одноволновом и двуволновом режимах, флуориметрию и запись спектров КД (при любезной помощи А. Арутюняна, МГУ). Измерения проводили в стандартных кюветах с оптическим путем 1 см. Для создания анаэробиоза применяли глюкозоксидазную систему (глкжоза+глюкозоксидаза+каталаза), которая за время смешивания снижала концентрацию растворенного 02 до нескольких мкМ. Содержание цитохромов и MQ определяли из разностных спектров оптического поглощения. ДХФИФ-редуктазную активность определяли по скорости исчезновения окисленной формы (X ~ 600 нм). К мембранному

препарату добавляли KCN и, в качестве донора, сукцинат либо глицерин-3'-фосфат. Собственно дегидрогеназную активность измеряли аналогично, но в присутствии медиатора ФМС. Слектрофотометрически измеряли также активности ТМФД-редуктазы (по исчезновению ТМФД*, А = 612 нм), НАДН-оксидазы и НАДН:фумарат-редуктазы (по исчезновению НАДН, "к = 339 нм). Генерацию супероксида регистрировали в качественной реакции с тетразолием нитросиним (X = 530 нм), в контрольном опыте источником 02" служила система ксантиноксидаза/гипоксантин. АТФ-азную активность определяли с использованием рН-чувствительного красителя крезолового пурпурного (X. = 578 нм). Образование Дц/ обратного знака определяли по спектральным изменениям оксонола VI (Х\ - 628 нм, л? = 587 нм). Флуориметрически регистрировали образование Д\)/ прямого знака с сафранином (Кю,5_ = 485 нм, Хне». — 586 нм ) и АрН обратного знака (закисление внутри мембранных частиц) с акридиновым оранжевым {Хьтб. = 493 нм, Хисп. = 530 нм). Концентрацию растворенного Ог измеряли амперометрически, с использованием электрода Кларка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Спектральные характеристики кофакторов двугемовых SQR.

Глава 1 посвящена сравнению SQR из В. subtilis, Chioroflexus aurantiacus, Thermus thermophilus и Rhodothermus marimis. Перечисленные ферменты относятся к тину В мембранных SQR/QFR [Lemos, 2002]. С помощью оптических методов были исследованы некоторые характеристики кофакторов.

На Рис. 1 приведены спектры оптического поглощения образцов SQR в видимой области. Максимумы в районе 558 нм соответствуют а-полосам двугемового цитохрома Ь. Судя по уровню восстановленное™ в присутствии сукцината, каждый из ферментов содержит высоко- и низкопотенциальный гем. Можно предположить, что дистальную позицию во всех случаях занимает второй из них, как это установлено для SQR из В. subtilis [Matsson et al., 2000].

Рис. 1. Разностные спектры оптического поглощения 8()и типа В.

Пунктир: восстановленный сукцинитом - аэробно окисленный образец. Штрих: восстановленный дитионитом -восстановленный сукцинатом образец. Сплошная линия: восстановленный дитионитом - аэробно окисленный образец.

Среда опыта с рН 7,6.

Исходя из значений Ет, известных для гемов БС?!?. В. бнЫШз (-95 мВ и +65 мВ [На§егИа11 е! а!., 1992]), при рН 7,6 сукцинат должен восстанавливать тем Ьц практически полностью, а гем менее, чем на 10%. Действительно, уровень

восстановленное™ цитохрома Ь сукцинатом в препарате из В. зиЫШя составляет около 60%. Похожего результата можно было ожидать и для образца из К. тшчпин (Е„,7,5 гемов составляет -75 мВ и +75 мВ ¡ТегпапёеБ е1 а1., 2001]), однако в наших условиях сукцинат восстанавливал цитохром Ь при рН 7,6 лишь на 20%. Дальнейшего восстановления удалось добиться, увеличив силу донора электронов путем защелачивания среды. Хотя потенциал полувосстановления Ь\. при этом также несколько снижается, относительно слабая зависимость Ет гема от рН в щелочной области (около 30 мВ/рН) позволила при рН 9,6 достичь суммарного восстановления от сукцината уже на 50%.

В препаратах из В. бнЫШб, Т. ЖегторИИиз и Я. тагтш гемы Ьн и Ьь спектрально сходны. В БрЯ из С. аигаппаст форма спектра зависит от уровня восстановлеиности цитохрома Ь: сукцинат и дитионит восстанавливают компоненты с а- (у-) полосами при 562 (430) нм и 558 (427) нм, соответственно. Это противоречит данным [Хт е1 а!., 2009], согласно которым оба гема

С. аигал&ассю

Т. ЛегтарННив

длина волны, мм

спектрально идентичны и в восстановленном состоянии имеют максимумы поглощения при 558 (424) нм. Различия касаются и окислительно-восстановительных свойств: по результатам проведенного нами с помощью пары сукцинат/фумарат редокс-титрования Е^ гемов равны +25 и -13 мВ, тогда как в [Хт е1 а1., 2009] приводятся низкие значения (-40 и -190 мВ), типичные для ОГК [Ьетоэ е1 а1., 2002]. Наблюдаемую разницу мы связываем с условиями выращивания. В нашем случае фермент был получен из клеток, выращенных в микроаэробных условиях, тогда как в [Хт ег а1., 2009] исследовался препарат из строго анаэробной культуры. Считается, что функции ОРЯ и БОЯ у С. аигап^аст выполняет один и тот же белок из семейства двугемовых БСЖ/С^Я [Хт е1 а!., 2009]. Изменение характеристик редокс-центров может объясняться модификацией фермента, переключаемого с одной роли на другую. Цитохромная субъединица в ОРЯ-форме С. аигапйасих фосфорилирована [Хт еГ а1., 2009], что могло бы быть следствием регуляции -так, показано, что фосфорилирование повышает фумарат-редуктазную и снижает сукцинатоксидззиую активность митохондриальной БОЯ [Тоткзика й

а1., 2009].

В.ьиЬЧПБ

С. аигапИасиэ Рис 2. Спектры КД SQR типа В.

Пунктир: аэробно окисленный образец. Штрих: восстановленный сукцинатом образец.

Сплошная линия: восстановленный дитионитом образец. Среда опыта с рН 7,6.

На Рис. 2 приведены спектры КД окисленных и восстановленных ЗОЯ, Во всех случаях присутствуют ответы вблизи полос

3

оптического поглощения гемов. Сигнал в присутствии сукцината по форме и амплитуде находится между полностью окисленным и

400 500 600 700 400

500

600

700

длина волны, нм

полностью восстановленным, за исключением R. marinus, где он подобен полностью окисленному - это согласуется с абсорбционными данными, демонстрирующими лишь незначительное восстановление цитохрома Ь сукцинатом при pH 7,6.

Особенности КД-спектров SQR из В. subtilis свидетельствуют о сильном экситонном взаимодействии между восстановленными темами. На это указывает форма сигнала (почти симметричная «бабочка» в у- и а-областях), большая амплитуда (150 М"'см"' для у-полосы) и резкое возрастание ответа при восстановлении второго гема. Полученные характеристики совпадают с приводимыми в работе [Palmer et al., 1994] для того же белка, экспрессированного в клетках Е. coli. Экситонное сопряжение между темами окисленного фермента гораздо слабее, что согласуется с общей закономерностью среди гем b-содержащих гемопротеидов [Palmer et al., 1994J.

Кроме ответов, связанных с гемовыми группами, в SQR из С. aurantiacus и В. subtilis присутствуют редокс-зависимые сигналы КД в области 450-550 нм. Суммарный ответ (около 25 МГ'см"1) складывается из коротковолновой положительной и длинноволновой отрицательной составляющих, синхронно исчезающих по мере восстановления (по результатам окислительно-восстанозительного титрования нарой сукцинат/фумарат, значение Ът7,б для одноэлектронного перехода равно +51 мВ). Судя по спектральным характеристикам, наиболее вероятным источником сигнала является флавиновый кофактор в полностью окисленной форме, ФАД.

2. Торможение MQHí-зависимого переноса электронов в деэнергизованиой мембране бацилл.

Глава 2 посвящена исследованию феномена, первоначально обнаруженного нами на целых клетках В. subtilis [Azarkina & Konstantinov, 2002]. Суть явления заключается в том, что, в отличие от митохондрий и большинства аэробных бактерий, рассеяние ДцЬГ не стимулирует, а, напротив, резко подавляет дыхательную активность В. subtilis.

ю

залиномицин

клетки

4-i, ХКФ,

валиномицин

ТМФД

5 мин

Рнс. 3. Ингибирование дыхания клеток В. яиЫИк разобщителями.

Клетки выращены на малате.

1 - 4 - «дикий тип»,

3 - ШН-16 (не содержит 8(211).

Добавки: 10 мкМ ХКФ, 5 мкМ валиномицин,

1 мг/мл БСА, 0,5 мМ ТМФД (восстановленная

форма).

Рис. 3 иллюстрирует действие разобщителей окислительного

фосфорилирования на дыхание клеток В. зиЬИШ от эндогенных субстратов. Сочетание протонофора ХКФ и калиевого переносчика валиномицина

^ азпиноичцт вызывает прекращение потреоления

Добавленные

по

^ — кислорода,

отдельности, ХКФ и валиномицин ингибируют дыхание в меньшей степени. Значение для ХКФ на фоне валиномицина ниже 100 нМ. Действие ХКФ имеет обратимый характер: БСА, эффективно адсорбирующий гидрофобные соединения, снимает ингибирование. Окисление ТМФД и ДХФИФ, передающих электроны на терминальный участок дыхательной цепн, разобщением не тормозится. В другой серии экспериментов (Рис. 4) исследовался эффект разобщителей на реакцию восстановления клетками В. subtilis ДХФИФ и ТМФД4. Оба акцептора получают электроны от мембранного MQIL. Как и дыхание, редуктазная активность клеток оказалась чувствительна к рассеивающим АцН+ ионофорам.

Подавление дыхания В. subtilis при деэнергизации клеточной мембраны отмечали и раньше [Lemma et al., 1990], но только для случая окисления сукцината. Ингибирование, как считалось, затрагивало исключительно сукцинат:М0-редуктазную реакцию. Представленные на Рис. 3 и 4 данные получены в условиях, когда электроны поступают в дыхательную цепь преимущественно от НАДН. Аналогичная картина наблюдалась и при

п

использовании нами в качестве основного субстрата глицерина, когда непосредственным донором для дыхательной цепи служит глицерин-3 '-фосфат. Более того, все результаты по ингибированию эндогенной дыхательной активности клеток разобщителями воспроизводятся на штамме ШН-16, мутантном по БС>11.

ü

Рис. 4. Ингибироваиис разобщителями ДХФИФ-редуктязной активности клеток В. subtilis.

Клетки выращены на малате. Анаэробные условия.

/ - «дикий тип», 2 - LÜH-1 б (не содержит SQR). Пунктир - ход реакции я отсутствие дальнейших добавок.

5 мин

залиномицин

С деэнергизанией мембраны связан, очевидно, еще один феномен: потеря дыхательной активности В. зиЬНШ в процессе выделения из клеток мембранной фракции. Эффект наиболее выражен в сукцинат-зависимых реакциях (ингибирование на два порядка), однако имеет место и при переносе электронов от НАДН и глицерин-3'-фосфата (падение скорости в 10-15 раз). В присутствии медиатора ФМС, передающего электроны с соответствующей делвдрогеназы на искусственный конечный акцептор, удельные скорости окисления НАДН, сукцината и глицерин-3'-фосфата клетками и субклеточными мембранами практически не различаются.

Чтобы выяснить, на какой стадии выделения мембран развивается ингибирование, мы получили из свежевыращенных клеток лишенные клеточной стенки сферопласты. Препарат обладал такой же эндогенной дыхательной активностью, как и необработанные клетки, которая была столь же, как у клеток, чувствительна к действию пары ХКФ/валиномицин. После разрыва мембраны в результате осмотического шока потребление кислорода

полностью прекратилось. Чтобы исключить эффект разведения, к образцу был добавлен 1 мМ НАДН. Дыхание возобновилось, однако с удельной скоростью, не превышающей 15% от исходной, причем дальнейшего ингибирования разобщителями не наблюдалось. Очевидно, торможение переноса электронов по дыхательной цепи В. зиЫШз происходит в момент, когда мембрана теряет целостность. Главной причиной причиной ингибирования электронного транспорта следует считать рассеяние АцГГ.

Судя по тому, что деэнергизация не затрагивает работу дыхательной цепи В, тЬпИз на начальном (активности дегидрогеназ в присутствии ФМС) и терминальном (окисление восстановленных ДХФИФ и ТМФД) участках, можно предположить, что активирующее действие Ац1-Г направлено либо на восстановление МО до МОН2> либо на последующее окисление Чтобы

выяснить, какой из вариантов реализуется, был проведен эксперимент на истощенных по эндогенным субстратам сферопластах. В качестве донора электронов для дыхательной цепи использовали глицерин-3'-фосфат, поскольку транспорт в клетку глицерина с последующим фосфорилированием не требует затраты ДцГГ.

Рис. 5. Влияние разобщителей на рсдокс-состояннс М(?7 в сферопластах В. зиЫШз.

1 - сферопласты, истощенные по эндогенным субстратам, анаэробно инкубировались с 0,25% глицерином. Разность между спектрами образца после и до восстановления дыхательной цепи.

2 - к сферопластам, аэробно окисляющим глицерин, была добавлена пара 10 мкМ ХКФ/2 мкМ валиномицин. Разность между спектром, записанным сразу после прекращения дыхания и спектром образца в стационарных условиях дыхания.

3 - контроль: спектральные изменения, нызванные восстановлением МСЬ в мембранном препарате (нормировано по амплитуде).

На Рис. 5 приведены спектры оптического поглощения препарата. При дыхании в присутствии глицерина

I

-К

I ^

I .....-.....3

273

250 300

уровень восстановленности MQ в сферопласгах составлял около 10%. Добавление пары ХКФ/валиномицин вызвало немедленное и полное прекращение дыхания, при этом восстановления мембранного MQ не произошло (разностный спектр 2). Таким образом, деэнергизация мембраны тормозит, очевидно, не окисление MQ7H2, а восстановление MQ7 дегидрогеназами.

Чтобы проверить, является ли зависимость дыхательной активности от ДцН+ уникальным свойством В. subtilis, мы протестировали значительное число аэробных бактерий из разных систематических групп. Из 14-ти грам-положительных MQ-содержащих организмов эффект ингибировання эндогенного дыхания разобщителями не был обнаружен лишь у 2-х, тогда как у 7-ми (все из рода Bacilli) он проявлялся столь же сильно, что и у В. subiilis. Среди грам-отрицательных UQ-содержащих бактерий наблюдалась обратная ситуация: только в 4-х случаях из 13-ти высокие концентрации протонофора вызвали ингибирование дыхания, причем незначительное и скорее всего неспецифичное. Можно думать, что участие ДиН* в поддержании дыхательной активности характерно для MQ-содержащих грам-положительных бактерий, в первую очередь, для бацилл.

3. Работа дыхательной цепи В. subtilis в субклетчных мембранных препаратах.

В Главе 3 рассматриваются особенности дыхания мембранных частиц В. subtilis. Объектом служил штамм 3G18/pBSD1200 с повышенной экспрессией SQR [Hagerhall et al., 1992].

В более ранних исследованиях падение удельной скорости дыхания В. subtilis от сукцината в результате деэнергизации мембраны препятствовало изучению феномена ингибирования SQR на субклеточном уровне. Нам удалось научиться получать из клеток В. subtilis препараты замкнутых мембранных частиц, в которых можно было наблюдать Г-зависимую

сукцинатоксидазную активность [Azarkina & Konstantinov, 2010]. При

выделении мембран клетки разрушали Френч-прессом, а з среды добавляли избыток ионов М§2+ и, в ряде экспериментов, 1 мМ ДЦКД - это повышало сопряженность частиц благодаря предотвращению протонной утечки через фактор Р0 в поврежденных молекулах мембранной АТФазы [Бгштоуа ег а1., 1990]. Тесты показали, что используемый нами мембранный препарат состоит в основном из вывернутых замкнутых частиц с низкой ионной проницаемостью. Об этом свидетельствовала высокая удельная скорость окисления непроникающих субстратов и способность образовывать А\(/ и АрН в процессе дыхания. Судя по уровню восстановленное™ цитохромов непроникающими субстратами, доля замкнутых частиц с клеточной ориентацией мембраны составляла 10 - 25%. Оказалось, что в условиях, максимально повышающих сопряженность, сукцинатоксидазная активность частиц возрастает до значений, соизмеримых со скоростью дыхания интактных клеток (около 60 молекул 02 на молекулу терминальной оксидазы за 1 сек). Отсюда можно заключить, что доля незамкнутых фрагментов мембраны в препарате невелика.

сукцинат сукцинат Рис. 6. Влияние сопряженности

мембранного препарата В. ¡иЫИй на сукцинатоксидазную активность.

Мембраны выделены при помощи Френч-пресса. Среда опыта содержит: ! валиномицин 1 ~ 0,5 шМ ЭДТА и 1 мМ М£804;

2 - 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ К^БО, и 1 мМ ДЦКД; добавки: 6 мМ сукцинат, 7,5 мкМ ХКФ, 5 мкМ валшюмицин;

3 - 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ Ми804и 1 мМ ДЦКД; сукцинат добавлен до 26 мМ.

На Рис. 6 показано активирующее действие сопрягающих агентов на сукцинатоксидазную активность мембран, а также ингибирование разобщителями

дыхания сопряженных мембран от сукцината. Кроме того, в начале

I

опыта 3 хорошо заметно ускорение дыхания, связанное с активацией 8(211 по мере набора ЛиН\ Последний эффект проявляется только при концентрациях сукцината свыше 10 мМ, что указывает на рост Км в условиях энергизации.

Таблица 1.

Каталитические параметры 8(}11 в сопряженных мембранных частицах В.

1 сукцинат-Км, мМ ->ДХФИФ Б сукцинат-»ФМС->ДХФИФ Км, мМ 1 УтаХ) с'1 сукцинат-Км, мМ В ->МС>7->От V с1 у тах»

0,3 12 1,2 | 131 2,2 62

Км/Утщ = 0,025 Км/Утах = 0,009 Км/Утах = 0,035

Приведенные в Таблице 1 данные подтверждают, что дыхание сопряженных частиц характеризуется намного более высокими значениями Км но сукцинату и Утах , чем дегидрогеназная и ДХФИФ-редуктазная активности того же препарата, не сопровождающиеся образованием ЛцН*. Можно заметить, что рост Км, связанный с активацией сукцинатоксидазного процесса в энергизованной мембране, непропорционально велик - эта особенность находит объяснение в рамках кинетической модели, учитывающей положительную обратную связь между уровнем Лц! Г и скоростью окисления сукцината мембранной частицей [Агагкта & А1загкт, 2010].

На сопряженных мембранных частицах в присутствии сукцината полностью воспроизводится картина ингибирования дыхания разобщителями, характерная для целых клеток. Важное отличие состоит в том, что в случае клеток электроны поступали в дыхательную цепь главным образом от НАДН через единственную у В. хиЬИШ НАДН-дегидрогеназу (фермент типа II, не обладающий ЬГ-траислоциругощей активностью [Ве^та е1 а1., 1982]). На окисляющих НАДН мембранных частицах эффекта энергозависимости наблюдать, к сожалению, не удается. По-видимому, это связано с нарушением свойств фермента при выделении мембран. Об этом свидетельствует ряд наблюдений. Так, НАДН-оксидазная активность мембран в наших условиях была по крайней мере на порядок ниже скорости эндогенного клеточного

дыхания, проявляла устойчивость к цианиду, уменьшалась по ходу реакции и не сопровождалась образованием ЛцН\ Вероятное объяснение состоит в том, что в мембранном препарате электроны от НАДН попадают, в обход дыхательной цепи, непосредственно на 02. Образование 02" при реакции НАДН с кислородом в присутствии мембранных частиц удалось зарегистрировать в опытах с тетразолием нитросиним. По-видимому, структура НАДН-дегидрогеназы В. subtilis отличается лабильностью и под действием факторов, влияющих на расположение фермента в мембране, его активный центр утрачивает способность реагировать с естественным акцептором MQ7 и становится доступен для прямого контакта с 02.

Вместе с тем, энергозависимый характер работы дыхательной цепи В. subtilis удалось подтвердить на мембранных частицах, окисляющих глицерин-3 '-фосфат, хотя все эффекты в этом случае были выражены менее ярко, чем при окислении сукцината. Дыхание частиц от глицерин-3'-фосфата воспроизводимо (на 20 - 30%) ускорялось в присутствии 1 мМ ДЦКД. Деэнергизация мембраны при добавлении протонофора в сочетании с валиномицином вызывала примерно двукратное подавление оксидазной активности.

4. Два режима функционирования SQR из В. subtilis

В Главе 4 на примере SQR из В. subtilis рассматривается вопрос об участии ДцН* в механизме работы SQR и QFR В-типа.

В двугемовых SQR энергетический барьер при переносе электронов с сукцината (Ет = +24 мВ) на MQ7 (Ега = -74 мВ) мог бы преодолеваться за счет расходования ДцН+ [Schirawski et al., 1998]. Устройство мембранной части SQR/QFR типа В, подтвержденное данными трехмерной структуры фермента из W. succinogenes [Lancaster et al., 1999], согласуется с такой возможностью. Как видно из Схемы 1, восстановление MQ должно сопровождаться переносом электронов по полю и захватом протонов из периплазмы, т.е. потреблением ДцЬГ, а обратная реакция - переносом электронов против поля и выбросом протонов в периплазму, т.е. образованием ДцЬГ.

17

Схема 1. SQR из В. subtilis. ®

периплазма

Экспериментально^ доказано, что

0 0 0 0 0 0

сукцинат

фумарат

МО'7Н2° 0 0 0 0 QFR из W. succinogenes осуществляет М(ЗН2:фумарат-редуктазную реакцию I II | электронейтрально [Kroger et al., 2002].

Это связано с тем, что в ферменте есть

5 0 0 0 0 0

цитоплазма протон-проводящий «глутаматный» путь, по которому протоны переносятся обратно в цитоплазму, компенсируя трансмембранное

разделение зарядов в ходе катализа [Lancaster et al., 2005; Madej et al, 2006]. Поскольку в SQR из бацилл ключевой остаток «глутаматного» пути отсутствует [Zaunmuller et al., 2006], считается, что эти ферменты должны работать электрогенно, т.е. с затратой и образованием ДцН+ при катализе в прямом и обратном направлении, соответственно [Madej et al., 2006].

Тот факт, что сукцинат:М(2-редуктазная активность SQR из В. subtilis требует энергизации мембраны, можно объяснить двояко: либо ДцН+ выполняет роль одного из «субстратов» MQ-редуктазной реакции, либо энергизация мембраны поддерживает SQR в активной конформации. В паши задачи входило проверить обе эти возможности.

Первая серия экспериментов была проведена на штамме LUH-17 с единственной терминальной оксидазой bd-типа, которая образует ДцН+ с эффективностью 1 Н+/с" [Lauraeus et al, 1993]. Клетки LUH-17 росли на сукцинате крайне слабо и вскоре лизировались вследствие недостаточного уровня ДцН* [Jolliffe et al, 1981]. Введение в LUH-17 содержащей гены SQR плазмиды pBSD1200 заметно улучшило рост культуры на сукцинате и предотвратило лизис. Защитный эффект плазмиды проявлялся только в средах, содержащих сукцинат, хотя в минимальной среде с сукцинатом клетки LUH-

17/рВ8Б1200 не были способны делиться. Влияние, оказываемое работающей БСЖ на рост мутанта с пониженным уровнем ДцН+, мы объясняем ускорением реакций цикла Кребса.

В Таблице 2 приводятся характеристики мембранных частиц из ШН-17/рВ8В1200. Наиболее примечательной их особенностью является полная неспособность окислять сукцинат. В процессе выращивания клетки мутанта используют сукцинат в качестве дыхательного субстрата, а выделенные мембраны содержат значительное количество $(¿11 и проявляют высокую сукцинат-дегидрогеназную активность. Тем не менее, сукцинатоксидазная активность мембран ШН-17/рВБ01200 практически отсутствует даже в максимально сопрягающих условиях, когда на препарате «дикого типа» удается достичь скорости окисления сукцинага, сравнимой с клеточным дыханием. Очевидно, генерация ЛцН+ со стехиометрией 1 Н+/е" не обеспечивает необходимого для работы 8СЩ уровня Лц1Г. Следует предположить, что катализ БОЯ сопровождается затратой АиН+ со стехиометрией 1 НГ/е".

Таблица 2.

Типичные характеристики мембранных препаратов с повышенной экспрессией 8 О К.

Штамм Бдк пмоль /мг беп к а сукцинат-дегидрогеназа нмольДХФИФ /(мин-мг белка) сукцинат-Юг lt.UO.ib О2 /(мин-мг бмка) НАДН-Ю: Н.иОЛЬ О; /('мин-мг бедка) НАДН—>фумарат яи» НАДН /(мин -мг белка)

3018 /рВ801200 1,9 5604 1500 120 126

ШН-17 /рВЯОШО 1,5 4065 <10 150 131

Во второй серии экспериментов изучалась МОН2:фумарат-редуктазная активность мембранных частиц, которую измеряли в анаэробных условиях, восстанавливая мембранный МСЬ от НАДН. Как выяснилось, в отсутствие 02 активность НАДН-дегидрогеназы В. ¡иЬНИ:; достаточно стабильна.

Рис. 7. Фумарат-редуктазная активность мембран В. ¡иЬйШ.

Анаэробные условия. Добавки: 0,35 мМ НАДН, 46 мМ фумарат, 10 мкМ ХКХ, 5 мкМ валиномицин, 91 мМ малонат.

Типичная кинетика процесса приведена на Рис. 7.

Существенно, что, в отличие

0 20 80 100 120

время, шн от катализа в направлении

окисления сукцината, фумарат-редуктазная активность БСЖ. не чувствительна к

разобщителям. При наличии НАДН и фумарата реакция идет с постоянной

скоростью в течение 2 часов и более. Таким образом, предположение о чисто

регуляшрной роли Д|лНь не подтверждается: если бы ДцН4 стабилизировала

активную конформацию 8(}К, энергизация мембраны была бы необходима для

протекания как прямой, так и обратной реакции.

Возможность образования АиН* в ходе НАДН:фумарат-редуктазной реакции была проверена в опытах с акридиновым оранжевым, реагирующим на закисление внутри частиц. Добавляя к мембранному образцу в аэробных условиях низкие концентрации сукцината, мы определили минимальную скорость электронного транспорта, достаточную для наблюдения ответа. С учетом того, что терминальные оксидазы работают с эффективностью 2 Н~7е, а стехиометрия образования АцН1" при окислении М()Н2 может составлять лишь 1 Н+/е", достоверный ответ должен обеспечиваться НАДН:фумарат-редуктазной активностью, равной 120 нмолей НАДН/(мин-мг белка).

Регистрация ДрН на частицах с высокой НАДН:фумарат-редуктазной активностью показана на Рис. 8А. Внесение обладающего собственной флуоресценцией НАДН вызывает сдвиг уровня сигнала, не связанный с изменением рН внутри частиц. Добавка фумарата дает кратковременный отброс, после чего флуоресценция принимает прежнее значение, не меняющееся под действием Ыа+/Н+-обменника моненсина. Таким образом,

НАДН фумарат

2,0

НАДН

ХКФ, валиномицин

малонат

I.. I

генерации ЛрН не наблюдается, хотя реакция идет с постоянной скоростью в

течение всего эксперимента.

Рис. 8. Сравнение способности мембран В. хиЫИЫ образовывать ДрН при восстановлении фумарата и при окислсннн сукцпната. (Л) НАДН:фумарат-редуктазная реакция.

1 - регистрация АрН. Добавки: 0,4 мМ НАДН, 65 мМ фумарат,

6,7 мкМ моненсин.

2 - кинетика окисления НАДН фум аратом.

(Б) Сукцииатоксидазная реакция.

7-40 мкМ сукцинат,

2-60 мкМ сукцииаг; регистрация ДрН.

3-60 мкМ сукцинат; кинетика потребления кислорода.

Положительный контроль представлен на панели Б, где сукцииатоксидазная активность, соответствующая условиям эксперимента А, сопровождается снижением рН внутри частиц, регистрируемым до тех пор, пока система не истощается по сукцинату.

выводы

1. Дыхание целых клеток В. тЫИи ускоряется под действием АцН+ и практически полностью подавляется при деэнергизации мембраны. Энергозависимая стимуляция переноса электронов по дыхательной цепи направлена на стадию восстановления дегидрогеназами мембранного менахинона.

2. Эффект ингибирования эндогенного клеточного дыхания в условиях разобщения характерен для менахинон-содержащих организмов: бацилл и, возможно, других грам-положительных аэробов. Электрон-транспортная активность убихинон-содержащих дыхательных цепей грам-отрицательных бактерий при деэнергизации мембраны не тормозится.

3. Получение из клеток В. хиЫШа мембранной фракции сопровождается резким падением удельной сукцинатоксидазной активности, причиной которого является низкая сопряженность препарата. Создание Дц.Нт на мембране замкнутых частиц полностью восстанавливает работу дыхательной цепи В. хиЬШй от сукцината.

4. Окисление сукцината сопряженными мембранными частицами из В. зиЫШя сопровождается потреблением ЛцН4. Активность хинолоксидазы Ьс1-тииа не обеспечивает энергизации мембраны, необходимой для заметного протекания сукцинатоксидазной реакции.

5. Восстановление фумарата сопряженными мембранными частицами из В. 5чЬпИя не сопровождается образованием ДцН\ Денергизация мембраны не влияет на скорость менахинол.'фумарат-редуктазной реакции.

6. Суцинат:менахинон-оксидоредуктаза В. хиЫШя способна функционировать в двух режимах: катализ в прямом направлении сопровождается расходованием ДцН\ катализ в обратном направлении протекает по электронейтральному механизму. Представляется вероятным, что данная особенность характерна для группы двугемовых сукцинат:менахинон- и менахинол:фумарат-оксидоредуктаз.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Azarkina N.V. Induction of Na"-motive terminal oxidase in facultatively alkalophilic bacterium Bacillus halodurans grown under alkaline conditions. (1995) Biochemistry (Moscow) 60, 2, 211-216.

2. Azarkina N., Borisov V.B. and Konstantinov A.A. Spontaneous spectral changes of the reduced cytochrome bd. (1997) FEBS Lett. 416, 171-174.

3. Azarkina N., Siletsky S., Borisov V., von Wachenfeldt C., Hederstedt L.

and Konstantinov, A.A. A cytochrome W-type quinol oxidase in Bacillus subtilis strain 168. (1999) J. Biol. Chem. 274, 32810-32817.

4. Azarkina N. and Konstantinov A.A. Stimulation of menaquinone-dependent electron transfer in the respiratory chain of Bacillus subtilis by membrane energization. (2002) 12th European Bioenergetics Conference. In: Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports 12, 148.

5. Azarkina N. and Konstantinov A.A. Stimulation of menaquinone-dependent electron transfer in the respiratory chain of Bacillus subtilis by membrane energization. (2002)7. Bacterial. 184, 19, 5339-5347.

6. Azarkina N.V. and Konstantinov A.A. Energization of Bacillus subtilis membrane vesicles increases catalytic activity of succinate:menaquinone oxidoreductase. (2010) Biochemistry (Moscow) 75, 1, 50-62.

7. Azarkina N.V. and Atsarkin V.A. Energy-dependent respiration of Bacillus subtilis coupled membranes. A kinetic model. (2010) Doklady Rus. Acad. Sci. 435, 5 (в печати).

8. Azarkina N. and Konstantinov A.A. Electrogenicity of succinate:menaquinone oxidoreductase from Bacillus subtilis depends on ihe direction of electron transfer. (2010) 16th European Bioenergetics Conference. In: Biochim. Biophys. Acta 1797, 112.

Отпечатано в коницентре « CT ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 01.11.2010 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ацаркина, Наталья Вадимовна

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы

1. Bacillus subtilis

1.1 Общая характеристика.

1.2 Дыхательная цепь.

2. Сукцинат:хинон- и хинол:фумарат-оксидоредуктазы

2.1 Классификация.

2.2 Двугемовые сукцинат:МС>- и МС>Н2:фумарат-оксидоредуктазы.

II. Материалы и методы

1. Препаративные методы.

2. Аналитические методы.

3. Математическая и компьютерная обработка.

III. Результаты и их обсуждение

Глава 1. Спектральные характеристики двугемовых сукцинат:менахиноноксидоредуктаз.

1.1 Спектры оптического поглощения.

1.2 Окислительно-восстановительное титрование цитохрома b в ферменте из Chloroflexus aurantiacus.

1.3 Спектры кругового дихроизма.

1.4 Исследование сигнала КД флавина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности функционирования дыхательной цепи Bacillus subtilis"

Актуальность темы.

Все организмы получают необходимую для жизнедеятельности энергию благодаря окислительно-восстановительным реакциям. Энергия, заключенная в химических связях, переводится в другую форму, после чего клетка способна использовать ее для совершения необходимых работ: химической (синтез новых молекул), механической (движение), осмотической (транспорт метаболитов) и проч.

Наиболее универсальные формы «энергетической валюты» это АТФ и разность электрохимических потенциалов протона на мембране, ДцН+. Иногда гидролиз АТФ сопряжен с совершением работы напрямую, однако чаще энергия сначала переводится в форму ЛрН+. Взаимопревращение ДиН+ и АТФ возможно благодаря работе мембранной ЛТФ-синтетазы, сопрягающей синтез АТФ с расходованием ДрН+ и, наоборот, гидролиз АТФ с образованием ЛцН' . Главным генератором ДрН+ у аэробных организмов служит дыхательная цепь.

Последняя локализована в мембране (у бактерий в плазматической, у эукариотов во внутренней митохондриальной) и состоит из ферментов, окислительно-восстановительная активность которых сопровождается переносом протонов из внутренней водной фазы во внешнюю. В целом устройство митохондриальной и прокариогических дыхательных цепей сходно, однако у бактерий часто присутствуют разные варианты одного и того же фермента - это играет важную адаптационную роль для одноклеточного организма, находящегося в постоянно меняющихся условиях.

Мембранная сукцинат:хинон-оксидоредуктаза — ключевой фермент аэробного метаболизма. Роль ее двоякая. С одной стороны, это катализ реакции из цикла Кребса -замкнутой цепочки превращений органических молекул, в результате которых клетка получает сырье для синтеза необходимых структур, энергию в форме АТФ и восстановительные эквиваленты, далее окисляемые дыхательной цепью. С другой стороны, сукцинат:хинон-оксидоредуктаза представляет собой вход, через который в дыхательную цепь поступают электроны.

Мембрана бацилл и некоторых других аэробных бактерий содержит особую разновидность хинона - менахинон, потенциал полувосстановления которого на 100 мВ ниже, чем у пары сукцинат/фумарат. Сукцинат:менахинон-оксидоредуктаза таких организмов катализирует энергетически невыгодный перенос электронов с более слабого восстановителя на более сильный. Недавно полученные рентгеноструктурные данные подтвердили, что в катализе может принимать участие ДцН+, однако устройство механизма, связывающего внутримолекулярный перенос электронов с мембранным потенциалом, продолжает оставаться неясным.

Имеющиеся на сегодня экспериментальные сведения, касающиеся взаимовляния Д|лНь и дыхательной активности у менахинон-содержащих бактерий, неполны и противоречивы. С одной стороны, классическое явление «дыхательного контроля» состой г в том, что по мере роста мембранного потенциала работа генерирующих его ферментов должна тормозиться. С другой стороны, достоверно показано, что рассеяние Aju.H+ резко ингибирует дыхание клеток Bacillus subtilis в присутствии сукцината. Предположительно, именно это является причиной того, что субклеточный мембранный препарат Bacillus subtilis практически не обладает сукцинатоксидазной активностью. Наконец, сукцинат:менахинон-оксидоредуктаза из Bacillus subtilis структурно чрезвычайно близка к менахинол:фумарат-оксидоредуктазе из Wolinella succinogenes, однако для последнего фермента был строго доказан электронейтральный механизм катализа.

Цель исследования.

Основным объектом настоящей работы был менахинон-содержащий, преимущественно аэробный организм - Bacillus subtilis. Исследования были направлены на прояснение взаимодействия двух связанных параметров: электрон-переносящей активности дыхательной цепи и уровня ДцН+ на мембране.

Прежде всего, необходимо было понять, как соотносятся между собой дыхательный контроль и явление ингибирования клеточного дыхания от сукцината при разобщении.

Для более подробных исследований зависимости активности дыхательных ферментов от мембранного потенциала желательно было разработать более простую и удобную, чем целые клетки, систему.

Данные об ингибировании дыхания клеток Bacillus subtilis предполагалось проверить на других микроорганизмах. Также предполагалось сравнить, хотя бы предварительно, характеристики выделенной сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы из Bacillus subtilis с несколькими другими ферментами того же типа.

Хотя ингибирование сукцинат:менахинон-редуктазной реакции при деэнергизации клеточной мембраны Bacillus subtilis является твердо установленным фактом, он может иметь различные объяснения. Мембранный потенциал либо служит «субстратом» реакции и расходуется по мере ее протекания, либо выполняет чисто регуляторную роль, стабилизируя активное состояние сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы. В цели исследования входило выяснить, какой из вариантов реализуется в действительности.

Перспективным подходом представлялось создание модельной дыхательной цепи, состоящей из сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы, менахинона и терминальной оксидазы ¿¿/-типа, стехиометрия которой как генератора Д)Ш+ известна и составляет 1 Н+/е\ Окисление такой дыхательной цепью сукцината сопровождалось бы генерацией мембранного потенциала только при условии, что восстановление менахинона происходит без расходования Д|Ш+. В случае электрогенной работы сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы суммарный результат оказался бы электронейтральным. В наши планы входило сконструировать дыхательную цепь требуемого состава и проверить, сопряжена ли ее работа с энергизацией мембраны.

В том случае, если мембранный потенциал расходуется при окислении сукцината, следует ожидать, что в обратном, фумарат-редуктазном процессе он будет генерироваться. Предполагалось проверить, сопряжена ли с образованием Д|Ш+ активность сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы в направлении обратной реакции.

Основные задачи исследования.

В наши задачи входило:

- проверить, наблюдается ли явление дыхательного контроля на клетках Bacillus subtilis в присутствии различных субстратов дыхания;

- выяснить причину падения сукцинатоксидазной активности в мембранном препарате Bacillus subtilis;

- разработать более простую, чем целые клетки, модель для изучения воздействия мембранного потенциала на работу дыхательной цепи Bacillus subtilis',

- сопоставить данные о влиянии мембранного потенциала на дыхательную активность бактерий из разных систематических групп, содержащих мембранный хинон разных типов;

- сравнить характеристики мембранных сукцинат:менахинон-оксидоредуктаз из нескольких менахинон-содержащих организмов;

- прояснить роль Др.Н+ в катализе сукцинат:менахиноп-редуктазного процесса у Bacillus subtilis: расходуется ли мембранный потенциал в ходе реакции, или же энергизация мембраны лишь поддерживает фермент в активной конформации;

- выяснить, связана ли с уровнем мембранного потенциала активность сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы из Bacillus subtilis в направлении восстановления фумарата.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В предыдущих исследованиях явление энергозависимости сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы Bacillus subtilis удавалось наблюдалсь только на уровне интактных клеток. При выделении мембранных частиц сукцинатоксидазная активность препарата падала настолько, что изучать ее характеристики было невозможно. Вместе с тем, целые клетки представляют собой столь сложный объект, что однозначно интерпретировать полученные на нем результаты, касающиеся регуляции активности фермента, очень • трудно. В представленной работе впервые разработана методика, позволяющая наблюдать на сопряженном препарате замкнутых мембран из Bacillus subtilis сукцинатоксидазную активность, сравнимую по величине с эндогенным дыханием клеток. Сопряженные мембранные частицы Bacillus subtilis оказались чрезвычайно удобным объектом для исследования явлений, связанных с энергизацией мембраны.

В работе впервые предложена кинетическая модель, описывающая процесс окисления сукцината суспензией замкнутых мембранных частиц из бациллы. Модель учитывает обратную положительную связь, возникающую в системе благодаря тому, что мембранный потенциал, образуемый при окислении менахинола терминальным участком дыхательной цепи, в свою очередь стимулирует активность сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы. Модель объясняет детали концентрационной зависимости сукцинатоксидазной реакции, наблюдаемые в эксперименте и непонятные в рамках простейшей схемы.

Полезен с методической точки зрения результат, касающийся поведения несопряженной НАДН-дегидрогеназы Bacillus subtilis в мембранных препаратах. Легкость, с которой фермент переходит в доступную для взаимодействия с молеклярным кислородом конформацию, необходимо принимать во внимание при работе с НАДП в аэробных условиях.

То, что дыхание клеток Bacillus subtilis от сукцината требует энергизации, мембраны, объясняли до сих пор энергозависимым характером.работы сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы. В работе впервые представлены данные о том, что деэнергизация клеточной мембраны ингибирует дыхание Bacillus subtilis от нескольких различных субстратов и что данный эффект не сводится к инактивации сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы.

Впервые проведено тестирование микроорганизмов из разных систематических групп на предмет зависимости дыхательной активности клеток от мембранного потенциала. До сих пор считалось, что явление дыхательного контроля, впервые обнаруженное на митохондриях и воспроизведенное на ряде бактерий, одинаково 8 распространено среди всех аэробных организмов. Мы убедились, что ингибирование дыхания в условиях деэнергизации клеточной мембраны проявляется не только у Bacillus subtilis, но и у других грам-положительных менахинон-содержащих бактерий, в особенности ярко - у бацилл.

Для решения вопроса об электрогенности работы сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы Bacillus subtilis применен новый оригинальный подход, состоящий в том, что предполагаемая электрогенная активность фермента сопоставляется с протон-транслоцирующей способностью терминальной оксидазы ¿¿/-типа, характеристики которой хорошо известны. Впервые искусственно создана дыхательная цепь, состоящая из сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы, мембранного менахинона и цитохрома bd. Полученные на модельном объекте результаты важны для понимания механизма катализа сукцинат:менахинон-оксидоредуктазы в направлении прямой реакции.

Впервые исследована фумарат-редуктазная активность сукцинат:менахинон-оксидорсдуктазы в замкнутых мембранных частицах Bacillus subtilis. Данные других авторов об электрогенности процесса были получены на целых клетках и не поддавались однозначной интерпретации. Гипотеза о возможной генерации мембранного потенциала в ходе менахинол:фумарат-редуктазной реакции проверена на качественном и на количественном уровне, с учетом зависимости величины ожидаемого ответа от скорости переноса электронов. Полученные данные проясняют механизм работы фермента в направлении обратной реакции.

Практическая значимость информации о мехнизме работы важнейшего фермента аэробного метаболизма, сукцинат:хинон-оксидоредуктазы, состоит, прежде всего, в том, что установленные принципы функционирования могут быть частично перенесены с бактериального белка на его эукариотический аналог.

Известно, что мутации в гене митохондриальной сукцинат:хинон-оксидоредуктазы человека приводят к серьезным нарушениям вследствие повышенного уровня образования кислородных радикалов. Структура двугемовых сукцинат-менахинон-оксидоредуктаз, включая фермент из Bacillus subtilis, рассматривается некоторыми исследователями как вариант, наиболее безопасный с точки зрения взаимодействия с кислородом. Возможность мутагенеза позволяет исследовать данную проблему более подробно.

Перспективная линия исследований касается свойственной сукцинат:менахинон-редуктазам способности переключаться в анаэробных условиях на роль фумарат-редуктазы. Известно, что такое же переключение происходит в митохондриальном ферменте из раковых клеток при переходе на анаэробный метаболизм. Бактериальный аналог, безусловно, более удобен для исследования модификаций белка, вызывающих изменение его функций.

Очевидным является приложение знаний об устройстве сукцинат:менахинон-оксидордуктазы для разработки антибактериальных препаратов. Двугемовые сукцинат:менахинон-оксидоредуктаза и менахинол:фумарат-оксидоредуктаза встречаются у многих патогенных микроорганизмов (бацилл, хламидий, Б-протеобактерий) и могут быть мишенью характерных ингибиторов, имитирующих структуру менахинона и безопасных для митохондриального фермента.

Наконец, впервые описанное в работе ингибирование эндогенного дыхания клеток разобщающими агентами должно быть принято во внимание при разработке лекарств антибациллярного спектра действия. Можно предположить, что чрезвычайно низкие дозы разобщителя, достаточные для подавления дыхания бацилл, никак не повлияли бы на устойчивую к деэнергизации дыхательную активность митохондрий.

I. Обзор литературы.

1. Bacillus subtilis

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ацаркина, Наталья Вадимовна

Выводы

1. Дыхание целых клеток В. subtilis ускоряется под действием Др.Н+ и практически полностью подавляется при деэнергизации мембраны. Энергозависимая стимуляция переноса электронов по дыхательной цепи направлена на стадию восстановления дегидрогеназами мембранного менахинона.

2. Эффект ингибирования эндогенного клеточного дыхания в условиях разобщения характерен для менахинон-содержащих организмов: бацилл и, возможно, других грам-положительных аэробов. Электроп-транспортная активность убихиноп-содержащих дыхательных цепей грам-отрицательных бактерий при деэнергизации мембраны не тормозится.

3. Получение из клеток В. subtilis мембранной фракции сопровождается резким падением удельной сукцинатоксидазпой активности, причиной которого является низкам сопряженность препарата. Создание ДцКГ на мембране замкнутых частиц полностью восстанавливает работу дыхательной цепи В. subtilis от сукцината.

4. Окисление сукцината сопряженными мембранными частицами из В. subtilis сопровождается потреблением ДцН+. Активность хинолоксидазы bd-типа не обеспечивает энергизации мембраны, необходимой для заметного протекания сукцинатоксидазной реакции.

5. Восстановление фумарата сопряженными мембранными частицами из В. subtilis не сопровождается образованием ДрН+. Деэнергизация мембраны не влияет на скорость менахинол:фумарат-редуктазной реакции.

6. Суцинат:менахинон-оксидоредуктаза В. subtilis способна функционировать в двух режимах: катализ в прямом направлении сопровождается расходованием Д[Ш+, катализ в обратном направлении протекает по электронейтральному механизму. Представляется вероятным, что данная особенность характерна для группы двугемовых сукцинат:менахинон- и менахинол:фумарат-оксидоредуктаз.

Заключение

На примере В. яиЫШз мы рассмотрели некоторые особенности функционирования дыхательной цепи, характерные для аэробных бактерий, мембранный пул хинона которых представлен менахиноном.

В биоэнергетике хорошо известно явление дыхательного контроля. Оно состоит в том, что по мере повышения на мембране уровня ДрН+ перенос электронов по дыхательной цепи тормозится; при добавлении в такой ситуации разобщителей окислительного фосфорилирования можно наблюдать ускорение дыхания. Как показывают результаты, изложенные в Главе 2, у менахинон-содержащих организмов дело обстоит прямо противоположным образом: мембранный потенциал не подавляет, а активирует электрон-транспортную активность дыхательной цепи. Соответственно, любые воздействия, приводящие к деэнергизации мембраны (ионофоры, каналообразователи, механическое нарушение целостности мембраны, факторы, увеличивающие неспецифическую протонную проводимость и т.п.) вызывают не ускорение, а резкое ингибирование дыхательной активности.

В Главе 2 явление стимуляции дыхательной цепи мембранным потенциалом рассмотрено на уровне целых клеток В. БиЫШз. Активирующее действие ДцН+ направлено на реакцию восстановления мембранного менахинона. Характерно, что эффект не зависит от природы восстановителя: разобщение ингибирует дыхание не только от сукцината (что было известно и раньше), но, в той же степени, от эндогенного НАДН или глицерина, в том числе, в мутантных клетках, лишенных БОЯ. Работа дыхательной цепи требует энергизации мембраны не только в случае В. зиЬНШ, но и у других бацилл, а также у некоторых представителей других таксоном ическох групп, в аэробном метаболизме которых используется менахинон.

В Главе 3 энергозависимый характер дыхания от сукцината и глицерофосфата продемонстрирован на мембранных частицах из В. шЬМИя. В случае глицерофосфата активация мембранным потенциалом выражена слабее, что связано с большей силой этого восстановителя. В случае НАДН эффект не наблюдается из-за обнаруженной нами особенности несопряженной НАДН-дегидрогеназы: в мембранных препаратах В. яиЫШя фермент легко переходит в форму, катализирующую передачу электронов не в дыхательную цепь, а на молекулярный кислород.

Помимо общего механизма, способствующего восстановлению менахинона в энергизованной мембране и сказывающегося на всех менахинол-зависимых процессах, существуют отдельное явление активации мембранным потенциалом работы 8<311. Если в первом случае связь между редокс-состоянием М(2 и уровнем А|л.Н+ осуществляется, как мы предполагаем, при участии вспомогательных мембранных белков, то во втором необходимые трансмембранные элементы структуры содержит сама молекула фермента.

До сих пор проявления энергозависимости 8(311 удавалось наблюдать только на целых клетках В. яиЫШя. В Главе 3 описаны эксперименты, впервые воспроизводящие их на гораздо более простом объекте - замкнутых мембранных частицах. В условиях сопряжения частицы способны окислять сукцинат практически с той же скоростью, что и растущие клетки, при этом наблюдается весь комплекс явлений, связанный с ингибированием дыхания о г сукцината при деэнергизации. Характерная особенность сукцинатоксидазной реакции, катализируемой суспензией сопряженных частиц -значительный рост, по мере энергизации, параметра С5о% по сукцинату относительно истинной константы Михаэлиса. Данный эффект не имеет объяснения в рамках простейшей кинетической схемы. В Главе 3 предложена модель, учитывающая положительную обратную связь между активностью 8(311 и величиной АрН+ на мембране и объясняющая наблюдаемую закономерность.

БС^Я из В. яиЫШх относится к В-типу ферментов, катализирующих окисление сукцината мембранным хиноном либо обратную, хинол:фумарат-редуктазную реакцию. Характерным структурным признаком представителей этой группы являются два низкоспиновых гема Ь, расположенные трансмембранно. В Главе 1 четыре фермента типа В рассматриваются с точки зрения спектральных и окислительно-восстановительных характеристик редокс-групп. Два из них (из В. зиЫШх и Л. тагтт) выполняют в клетке прежде всего функции БСЗЛ, а два (из С. аигапНасш и Т. (ЬегторкНш) по-видимому могут играть роль как 8(211, так и С>Р11, в зависимости от условий. Обнаруженные нами изменения в оптических спектрах и потенциалах полувосстановления гемов могут быть связаны с переключением фермента с одной функции на другую.

Все 8(311 и (ЗР11 типа В работают с менахиноном. Существует гипотеза о том, что движущей силой энергетически невыгодного восстановления М(2 сукцинатом является АрН+. Это предположение подкрепляется анализом трехмерной структуры (2Р11 из IV. succinogenes, хотя, в то же время, известно, что активность данного фермента в направлении восстановления фумарата не связана с образованием мембранного потенцала. Термодинамический барьер М(3-редуктазной реакции мог бы преодолеваться не за счет расходования ДцН+, а благодаря стабилизации восстановленной формы М(3, прочно связывающейся с Б (311 либо с другим белком. В этом случае энергозависимость 8(311 объяснялась бы чисто регуляторной ролью мембранного потенциала, поддерживающего фермент в активном состоянии.

В Главе 4 выясняется вопрос о значении Д|лН+ в катализе БСЗЯ из В. хиЬИНя. Во-первых, исследовалась дыхательная цепь, состоящая из БС^Я, и цитохрома Ьс1. Во-вторых, была предпринята попытка установить, электрогенна ли фумарат-редуктазная активность фермента.

Увеличение содержания ЭС^Л в клетках штамма с единственной терминальной оксидазой типа Ьс1 улучшает рост культуры в присутствии сукцината — по-видимому, за счет ускорения оборота цикла Кребса. При этом замкнутые мембранные частицы из клеток мутанта полностью лишены способности окислять сукцинат - очевидно, из-за принципиальной невозможности энергизовать мембрану при помощи Д|Ш+-генератора со стехиометрией 1 Н+/е\ Это указывает на суммарную электронейтральность работы дыхательной цепи БСШ. —> —» цитохром Ъй и, тем самым, на электрогенность катализа 8<311 в направлении прямой реакции (Схема 4-0-2, вариант Б).

В экспериментах по регистрации закисления внутри вывернутых мембранных частиц было показано, что обратная, фумарат-редуктазная реакция не сопровождается образованием Д|Ш+. Кроме того, фумарат-редуктазная активность 8(^11 не ингибируется при разобщении. Следовательно, роль ДцН+ заключается не в поддержании активной конформации фермента при катализе в том или ином направлении.

Из полученных нами результатов и их сопоставления с данными других авторов следует, что 8(^11 из В. яиЬНИх, а также другие двугемовые сукцинат:менахинон-редуктазы и менахинол:фумарат-редуктазы могут работать, в зависимости от обстоятельств, по двум механизмам: электрогенному и электронейтральному.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ацаркина, Наталья Вадимовна, Москва

1. Moszer I., Jones L. M., Moreira S., Fabry C., Danchin A. (2002) SubtiList: the reference database for the Bacillus subtilis genome. // Nucleic Acids Research Vol. 30, pp 62-65

2. Hoch J. A. (1991) Genetic analysis in Bacillus subtilis. II Methods Enzymol. Vol. 204, pp 305-320

3. Kunst F., Ogasawara, N., Moszer, I. et al. (1997) The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. //Nature Vol. 390, pp 249-256

4. Lemma E., Unden G., Kroger A. (1990) Menaquinone is an obligatory component of the chain catalyzing succinate respiration in Bacillus subtilis. II Arch. Microbiol. Vol. 155, pp 62-67

5. Poole R. K. (1993) The isolation of membranes from bacteria. // Methods Mol. Biol. Vol. 19, pp 109-122

6. Sone N., Hinklc P. C. (1982) Proton Transport by Cytochrome c Oxidase from the Thermophilic Bacterium PS3 Reconstituted in Liposomes // J. Biol. Chem. Vol. 257, pp 12600-12604

7. Grinkevich V. A., Lysenko A. M., Muntyan M. S., Skripnikova E. V., Afrikyan E. K. (1997) Identification of Bacillus sp. FTU strain and the study of the caoj. type oxidase homology // Biochemistry Vol. 62, pp 718-724

8. Skulachev V. P. (1988) Membrane Bioenergetics. Springer, Berlin

9. Cheng J., Hicks D. B., Krulwich T. A. (1996) The purified Bacillus subtilis tetracycline efflux protein TetA(L) reconstitutes both tetracycline-cobalt/H+ and Na+(K+)/H+ exchange. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 93, pp 14446-144451

10. Guffanti A. A., Cheng J. B., Krulwich T. A. (1998) Electrogenic antiport activities of the gram-positive tet proteins include a Na+(K+)/K+ mode that mediates net K+ uptake. // J. Biol. Chem. Vol. 273, pp 26447-26454

11. Fujisawa M., Kusumoto A., Wada Y., Tsuchiya T., Ito M. (2005) NhaK, a novel monovalent cation/H+ antiporter of Bacillus subtilis. II Arch Microbiol. Vol. 183, pp 411420

12. Ito M. G. A. A., Oudega B.,.Krulwich T.A. (1999) Mrp, a multigene, multifunctionallocus in Bacillus subtilis with roles in resistance to cholate and to Na(+) and in pHhomeostasis. // J. Bacteriol. Vol. 181, pp 2394-240217914.