Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование оксидаз caa3- и cbb3-типа у бактерий рода Bacillus
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование оксидаз caa3- и cbb3-типа у бактерий рода Bacillus"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Отдел биоэнергетики Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

На правах рукописи УДК 577.23

ПОПОВА ИРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ОКСИДАЗ саа3 и сЬЬ3 типа У БАКТЕРИЙ РОДА BACILL US

(03.00.04-Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: академик РАН,

профессор Скулачев В.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Дубинина ГА

доктор биологических наук, профессор Самуилов В.Д.

Ведущая научная организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу:

119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы, д.1, корп. 12, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан

4

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

М. В. Медведева

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Дыхательная цепь прокариот вариабельна и отражает пути адаптации каждого представителя к условиям окружающей среды. Среди бактерий обнаружены представители как с протонным типом сопряжения дыхания с окислительным фосфорилированием, так и с натриевым. У бактерий независимо от типа сопряжения дыхательная цепь на конечном участке, как правило, разветвлена и представлена несколькими редокс-зависимыми оксидазами. Гало- и алкалотолерантная бактерия Bacillus pseudofirmus FTU, согласно последним филогенетическим исследованиям, относится к кластеру 6 алкалофильных Bacillus. Ее дыхательная цепь по данным Костырко и соавт. (Kostyrko et al., 1991) характеризуется смешанным типом сопряжения: начальный сегмент содержит как Ка+-зависимую, так и протонную NADH-хиноноксидоредуктазу; пункт III - хинон-цитохром-с-редуктазу протонного типа; концевой сегмент, как было показано ранее, представлен цитохром-с-оксидазой саа3-типа. и оксидазой bb-типа. Для алкалофильных и алкалотолераптных бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, установлена инверсия по сравнению с

нейтрофилами, т.е. при щелочных значениях рН снаружи рН внутри остается более кислым, чем снаружи на 0.5-2 единицы. Расчеты показывают (Skulachev, 1994; Krulwich et al., 2001), что у таких бактерий, несмотря на более высокую Дц; по сравнению с нейтрофилами, результирующая имеет более низкое значение.

Очевидно, что на начальном сегменте дыхательной цепи, где у Bacillus pseudofirmus FTU одна из NADH-оксидаз №+-зависима, проблема с низким ДрН при щелочных рН решается за счет переключения бактерий на использование ApNa*. Что касается терминального участка, то одним из приспособлений у щелочелюбивых бактерий группы Bacillus, а также у термофильных бактерий Thermus thermophilus, можно считать наличие в их мембране цитохром-с-оксидазы саа3-типа. Для Bacillus firmus OF4 показано, что даже частичный дефицит по этой оксидазс ввиду мутации делает эту бактерию неспособной к щелочному образу жизни (Krulwich, 1996). Следует отметить, что на фоне подробного исследования молекулярно-биологических особенностей оксидаз caa3-™rn вопрос об эффективности их работы в качестве ионного насоса остается открытым. Изучение эффективности функционирования оксидазысаа,типакакпомпыпредставляетинтереснетоуьу.£''"Л)изиодс'т,.у^гл,-у"-5--

РОС. И\ЦУ011АЛ1»ЦДЯ ttVSWUWTEKA

C.lirpesijpr ОЭ 2G3 д акт

ьЯ-Ь

точки зрения, но и в теоретическом отношении, поскольку в отличие от цитохром-с-оксидазы аа3-типа высших организмов и некоторых бактерий данный генератор энергии является не четырех, а пятикомпонентным по редокс-центрам. До настоящего времени оставалась до конца не выясненной природа второй терминальной оксидазы, а также механизм трансформации энергии этим комплексом у Bacillus pseudofirmus FTU. Ранее показано, что в мембране этой бактерии содержатся гемы А, В, С, но отсутствует гем О (Muntyan et al., 1995). Поэтому на порядок менее чувствительная к цианиду дыхательная активность мембран бактерий была отнесена к оксидазе bb-типа. Более подробные характеристики этого фермента не были исследованы не только на бактериях Bacillus pseudofirmus FTU, но сведения об оксидазах этого типа у бактерий рода Bacillus в литературе отсутствовали полностью. До сих пор считалось твердо установленной принадлежность оксидаз сЬЬ-типа. только подразделению протеобактерий. Поэтому углубление исследований оксидазы bb-типа Bacillus pseudofirmus FTU представлялось весьма актуальным.

Пути адаптации бактерий к условиям изменяющейся окружающей среды не ограничиваются изменениями состава дыхательных цепей. Одним из важнейших механизмов адаптации прокариот к изменяющейся щелочности и солености среды обитания является изменение липидного состава мембран (Russell, 1989). Пути регуляции энергообеспечения в условиях адаптации бактерий (стрессовые условия) мало изучены. Концепция свободного окисления В.П. Скулачева (Скулачев, 1962; Скулачев, 1969) позволяет объяснить большое число физиологических функций дыхательных цепей клетки, в том числе и в стрессовых условиях. Перспективным подходом к выяснению путей регуляции энергообеспечения у бактерий могло бы стать исследование эффекта "мягких" разобщителей на энергосопрягающую систему факультативных экстремофилов. Основной объект, гало- и алкалотолерантная бактерия Bacillus pseudofirmus FTU, и экспериментальная база настоящей работы, представляют удобную модель для проведения такого исследования, которое могло бы существенно расширить понимание механизмов адаптации бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды.

Цель работы заключалась в исследовании механизма трансформации энергии терминальными оксидазами гало- и алкалотолерантной бактерии Bacillus pseudofirmus FTU. Для проведения такого исследования были поставлены следующие задачи:

1) реконструировать выделенную и очищенную оксидазу саа3типа из Bacillus pseudofirmus FTU в азолектиновые липосомы; 2) определить на полученных протеолипосомах природу сопрягающего иона и эффективность трансформации энергии для оксидазы саа3-типа; 3) исследовать влияние жирных кислот на энергосопрягающую систему целых клеток и протеолипосом с оксидазой саа3-типа; 4) проверить гипотезу М.С.Мунтян о наличии оксидаз сЬЬ3-типа. у бактерий рода Bacillus, дать прогноз типа энергетического сопряжения этой оксидазой и изучить условия индукции этой оксидазы.

Новизна работы. Разработана методика реконструкции терминальной оксидазы саа3-типа Bacillus pseudofirmus FTU в липосомы с получением протеолипосом, пригодных для измерения транспорта Н+. Впервые определена эффективность трансформации энергии оксидазой саа3-типа. (Н+/е") при транслокации протона через мембрану и зависимость этого показателя от рНнар.

Показано разобщающее действие жирных кислот на энергосопрягающую систему бактерии Bacillus pseudofirmus FTU. Доказано, что жирные кислоты могут служить "мягкими" разобщителями мембранного потенциала на протеолипосомах со встроенной цитохромоксидазой.

Впервые для бактерий рода Bacillus на примере Bacillus pseudofirmus FTU и Bacillus halodurans 2513 DSM показано наличие в геноме оперона ccoNOQP, кодирующего оксидазу сЬЬ3-типа.

Практическое значение. Проведенные исследования позволили выявить новые фундаментальные закономерности в организации функционирования терминального участка дыхательной цепи бактерий рода Bacillus: 1) наличие неизвестного ранее для бактерий из подразделения Firmicuta оперона оксидазы cЬЬ3 -типа; 2) эффективность работы протонных насосов пятикомпонентных по редокс-центрам (оксидазы саа3-типа) сравнима с четырехкомпонентными (оксидазы аа3-типа). Установленная нуклеотидная последовательность генов субъединиц оксидазы cЬЬ3-типа. в бактерии Bacillus pseudofirmus FTU позволяет, во-первых, определить группу родственных ферментов (подсемейство FixN), во-вторых, выявить филогенетически близкие организмы. Кроме этого, информация о структуре генов оксидазы сЪЪ3-типа бактерий рода Bacillus может быть использована для идентификации полипептидов, входящих в состав комплекса, по N-концевым

аминокислотным последовательностям. Исследование влияния жирных кислот на энергетику бактерий расширяет понимание путей адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям в экстремальных условиях обитания.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2000, 2001, 2003), на международной конференции «Митохондрии, .клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), на VIII Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2001), на 11ой Европейской биоэнергетической конференции (Брайтон, Великобритания, 2000), па III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы и изложена на страницах машинописного текста, включая € таблиц, fS рисунков, 4 фотографии. Список цитируемой литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использованы штаммы бактерий Bacillus pseudofirmus FTU, Bacillus halodurans 2513 DSM.

Ферментные дыхательные комплексы Bacillus pseudofirmus FTU экстрагировали 30 мМ октилглюкозидом при 0°С, очистку вели на конечных этапах с помощью DEAE-хроматографии (Toyo-Soda) и HPLC на колонке MonoQ (Pharmacia).

Для получения протеолипосом использовали 20 мг азолектина на 1 мл буфера следующего состава: 200 мМ Mops-NaOH (pH 7,4), и 55 мМ п-оклш-ß-D-глюкопиранозид. Получешгую суспензию обрабатывали ультразвуком, затем вносили раствор цитохром-с-оксидазы сaaз-типа из бактерии Bacillus pseudofirmus FTU (0,36 мг/мл). Удаление детергента производили поэтапным внесением сорбента "Bio-Beads" (Bio-Rad).

Выделение ДНК проводили по методу Мармура (Marmur, 1962). Полученную ДНК проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле.

Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури (Markwelletal., 1978).

Дыхательную активность измеряли закрытым электродом Кларка при помощи полярографа LP-7e.

Спектральные характеристики бактериальных мембран и выделенных цитохромов получали на двухлучевом спектрофотометре Hitachi U-3400.

Выброс протонов бактериальными клетками и протеолипосомами регистрировали по изменению рН реакционной смеси с помощью рН-метра и комбинированного микроэлектрода.

Мембранный потенциал измеряли с использованием сафранина О на спектрофотометре Aminco DW-2000 (двухволновой режим, ДЯ,=555-523) и тетрафенилфосфония (ТФФ+) с помощью ТФФ+-селективного электрода (Kamo et al., 1979).

Электрофорез в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (Laemmly, 1970).

Поиск генов и амплификацию искомых фрагментов ДНК осуществляли при помощи ПЦР (амплификатор CycloTemp («НПФ СТМ-Ц», Россия)).

Определение нуклеотидной последовательности в амплифицированных фрагментах ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 на автоматическом секвснаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (4-х капиллярный) в центре коллективного пользования «Геном», созданном в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН при поддержке РФФИ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Встраивание оксидазы сaa3-типа в липосомы.

Выделенная и охарактеризованная в нашей группе цитохром-с-оксидаза саа3 типа из Bacillus pseudofirmus FTU принадлежит к суперсемейству оксидаз с гем-медным биядерным центром. По современной классификации (Castresano and Saraste, 1995) внутри суперсемейства выделяются подсемейства Sox M, Sox В и Fix N. Большинство найденных к настоящему времени оксидаз, включая хорошо изученные оксидазы aaj-тит митохондрий, относятся к Sox М-подсемейству, также как и оксидаза саа3-типа. Оксидаза саа3-типа, обнаруживается только у ограниченного числа бактерий, в основном это представители рода Bacillus, относящиеся к грамположительным бактериям. Высказывались предположения, что наличие ковалентно связанного цитохрома с с субъединицей II оксидазы предохраняет цитохром с от его вымывания из клеточных оболочек грамположительных бактерий (Ishizuka et al., 1990; Kusano et al., 1996), другие авторы связывали появление суперкомплекса цитохромов caa3 у бактерий с их термофильностью. Однако, ни одно предположение до конца не объясняет причины появления такого фермента. Ряд исследователей изучал выброс протонов дыхательной цепью на бактериях, содержащих оксидазу сaaз-типа (Sone et al., 1999; Yaginuma et al., 1997). Имеются сообщения о встраивании этого комплекса в искусственную мембрану (Elferink et al., 1993). Однако эффективность работы этого генератора энергии никем подробно не исследовалась.

Установление особенностей функционирования отдельного белка или белкового комплекса в составе целых клеток или мембранных частиц зачастую усложняет трактовку полученных результатов из-за присутствия в той же экспериментальной системе других компонентов, вклад которых в наблюдаемую картину нельзя полностью исключить. С этой точки зрения гораздо более надежным является метод встраивания очищенного белка в искусственную мембрану и получение протеолипосом. Этот метод не является универсальным и в каждом отдельном случае требует индивидуального подхода. Нами была отработана методика

получения протеолипосом для встраивания в них цитохром-с-оксидаз бактерии Bacilluspseudqfirmus FTU.

Для встраивания использовали выделенную белковую фракцию, содержащую цитохром-с-оксидазу саац-типа. Спектральные характеристики белковой фракции показаны на рис. 1.

В качестве материала для получения липосом использовали азолектин, в качестве детергента - октилглюкозид. Для удаления из среды детергента и получения замкнутых протеолипосом использовали метод с применением сорбента Bio-Beads. Качественными считались протеолипосомы со встроенной оксидазой сааутипа, дыхательный контроль которых составлял 2.5-2.8.

0,1 г

А

400 450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм

Рис. 1. Разностный спектр (восстановление дитионитом-л<икус-окисление кислородом воздуха) выделенной и очищенной оксидазы <магтипа.

В протеолипосомах со встроенной оксидазой caa¡-типа исследовали выброс протона в среду в ответ на добавку кислорода. Исследование проводили методом кислородных пульсов. В ответ на подачу кислорода протеолипосомы со встроенной

оксидазой сааз-типа, демонстрировали закисление среды с последующей релаксацией (рис. 2). Величина закисления в присутствии аскорбата составляет не менее 1.5 ^/е-, т.е. встроенная оксидаза саа3-типа выбрасывает не менее 1Н+/е-.

Протеолипосомы со встроенной оксидазой caa3-типа. чувствительны к низким концентрациям протонофора-разобщителя ХКФ. При добавке 0,5 мкМ ХКФ они полностью теряют способность к транспорту протона во внешнюю среду, а в ответ на подачу кислорода дают защелачивание среды без релаксации с коэффициентом Н+^-= -0,5. Это свидетельствует о том, что внутреннее пространство протеолипосом продолжает защелачиваться за счет поглощения протонов в ходе химической реакции восстановления О2 до Н2О оксидазой саа^-тииа, в то время как транспорт векторного протона во внешнюю среду шунтирован разобщителем.

рН

0 50 100 150 200 250 Время, с-

Ркс. 2. Закисление среды протеолипосомами со встроенной оксидазой оад-типа

в ответ на подачу кислорода. Кислород подавали инъекцией 2 мкл Н2О, содержащей 0,76 нг ат О. Изменения рН после добавки воды калибровали внесением в ячейку 1 нмоль H2SO4, насыщенной аргоном.

Ранее показано, что объект исследований способен выдерживать высокие концентрации NaCI (до 3 М) в среде роста и щелочной рН (до 10) (Muntyan et al., 2002), а начальный сегмент дыхательной цепи бактерии принадлежит к смешанному типу и содержит как протонную, так и Ка+-зависимую NADH-хинон-оксидоредуктазу (Kostyrko et al., 1990). Ввиду этого нами проанализирована возможность переключения оксидазы caoj-типа Bacillus psendofirmus FTU с протонного режима работы на натриевый. Для этого были приготовлены "натриевые" протеолипосомы, в которых буферная смесь вместо ионов К+ содержала ионы Na+. Такие протеолипосомы продолжали в ответ на подачу О2 выбрасывать Н+ во внешнее пространство в интервале рН 6,0-8,5. Специфической активации оксидазы caaj-тит ионами Na+ ни в составе мембран, ни в изолированном виде обнаружено не было. Поэтому нами сделан вывод, что оксидаза специфична к транспорту ионов Н+.

В полученных протеолипосомах также исследовали генерацию мембранного потенциала. Скорость генерации и величину мембранного потенциала на протеолипосомах оценивали по поглощению ТФФ+, которое регистрировали с помощью ТФФ+-селективного электрода (рис.3). В отсутствие цитохрома с показано, что на фоне аскорбата внесение высоких концентарций ТМФД (до 800 мкМ) в среду инкубации с протеолипосомами приводит к увеличению электрического потенциала на мембране (не показано). Этот факт косвенно свидетельствует о преимущественно "правильной" ориентации встроенного комплекса оксидазы caa-типа.

Нами исследована зависимость выброса Н+ от рН на протеолипосомах со встроенной оксидазой caaj-тит. Показано, что в интервале рН 6,0-8,8 коэффициент Н7е" не меняется, хотя дыхательная и цитохром-с-оксидазная активности мембранных фрагментов и встроенного ферментного комплекса имеют ярко-выраженную рН-зависимость. При использовании цитохрома с лошади и аскорбата в качестве субстрата во всех перечисленных выше системах оптимум активности наблюдается при рН=6,0. При введении в инкубационную смесь низких концентраций ТМФД (1020 мкМ) наблюдается увеличение активности в 4 раза с уширением пика от 5,5 до 7,0. При использовании ТМФД и аскорбата пик активности во всех исследуемых системах наблюдается в интервале рН 8,0-8,5.

5 10 15 20 25

Время, мин

Рис. 3. Измерение потенциала на липосомах со встроенной оксидазой саа^-типа

в присутствии 8 мкМ цитохрома с. Изменения мембранного потенциала регистрировали с помощью проникающего катиона. ТФФ+. Среда измерения содержала: 50 мМ Трицин-КОН, 10 мМ Ша, 100 мМ КС1, 10 мМ MgSO4, 1 мМ ЭДТА. Пл - протеолипосомы; Аск - аскорбат; цит с - цитохром с; Ниг - нигерицин; Грами - грамицидин, ХКФ - п-хлорокарбонилцианидфенилгидразон.

Можно предполагать, что в мембранах бактерии используются специфичные доноры е- для саа3-оксидазы, которые обеспечивают его эффективную работу в щелочных рН. Однако, как видно из наших экспериментов, запас активности комплекса даже на искусственно подобранном субстрате (цитохром с + аскорбат + ТМФД) очень высок для того, чтобы обеспечить эффективный выброс Н+ в широком диапазоне значений рН, охватывающих физиологические значения.

ю

2. Изучение влияния жирных кислот на эиергосопрягающую систему бактерий Bacillus pseudofirmus FTU.

Согласно концепции свободного окисления (Скулачев, 1962) в биологических мембранах кроме главного пути окисления, сопряженного с фосфорилированием, существуют параллельные пути переноса электронов в редокс-цепях, так называемое несопряженное или свободное окисление, функции которого различны: обезвреживание ядовитых веществ через Р-450 в микросомальных мембранах клеток печени и мембранах бактерий; сжигание недоокисленных продуктов в клетках бактерий, дрожжей и позвоночных, повышение теплопродукции у животных на холоде и у растений в определенные физиологические периоды и, как это ни удивительно, ускорение синтеза АТР в условиях стресса. (Скулачев, 1969).

Разобщение окислительного фосфорилирования жирными кислотами, открытое в 1956 г. (Pressman and Lardy, 1956), лучше всего исследовано на митохондриях из тканей теплокровных (Скулачев, Маслов, 1960; Левачев и др., 1965). Однако, эффект жирных кислот на энергетическое сопряжение прокариот до настоящего времени никем не изучался.

Описаны противоречивые данные о влиянии жирных кислот на проводимость бислойных фосфолипидных мембран. Одни авторы не обнаружили увеличения проводимости БЛМ под действием пальмитата в концентрации, которая оказывала разобщающее действие на митохондриях (Andreev et al., 1989). В других работах на БЛМ, приготовленных из нейтральных фосфолипидов, жирные кислоты индуцировали некоторое повышение проводимости (Gutknecht, 1988). Аналогичная ситуация описана и на протеолипосомах со встроенной цитохром-с-оксидазой сердца быка (Andreev et al., 1989; Sharpe et al., 1996).

В наших экспериментах, как следует из рис.4, (показано действие только миристиновой кислоты), эффект снижения мембранного потенциала низкими концентрациями жирных кислот можно увидеть на бактериях только после истощения клеток по эндогенным субстратам. Этот эффект падает в ряду жирных кислот: миристиновая, пальмитиновая и лауриновая. Полученное ускорение дыхания на целых клетках под действием жирных кислот (Таблица 1) могло бы означать, что

10 мип

Рис.4. Влияние миристиновой кислоты на мембранный потенциал клеток

Bacillus pseudofirmus FTU. Использовали клетки из логарифмической фазы роста, истощенные по эндогенным субстратам в течение 2 суток при 4°С. Изменения мембранного потенциала регистрировали с помощью проникающего катиона ТФФ+. Перед опытом прединкубация с ДЦКД не использовалась (А), использовалась в течение 2 ч при 4°С с 200 мкМ ДЦКД (Б), с 400 мкМ ДЦКД (В). Среда измерения содержала: 150 мМ КС1,450 мМ NaCl, 5 мМ Трис-HCl (рН 8,2). Аск - аскорбат, Мк -миристиновая кислота, Грами - грамицидин.

это вызвано: а) разобщением, б) усилением активности дегидрогсназ, в) усилением АТРазной активности. Вариант б) можно исключить, т.к. потенциал на целых клетках уменьшается (рис.4 Б, В), а при увеличении активности дегидрогеназ он должен был бы увеличиваться. Этот эффект нельзя объяснить и активацией АТРазы, так как он наблюдается и на протеолипосомах с цитохром-с-оксидазой в отсутствие АТРазы (рис.5), а в опытах с целыми клетками все эффекты наблюдали только в присутствии ингибитора АТРаз, ДЦКД. Остается принять вариант а).

Таблица 1. Влияние жирных кислот и протонофора-разобщителя ХКФ на дыхание клеток и очищенной цитохромоксидазы Bacillus pseudoßrmus FTU.

Соединение Концентрация Дыхательная

активность, %

Клетки

- 100

ХКФ 1 мкМ 190

Миристиновая кислота 5 мкМ 115

20 мкМ 133

Пальмитиновая кислота 8 мкМ 120

Лауриновая кислота 20 мкМ 125

Цитохромоксидаза еадгтипа

1 100

Миристиновая кислота 20 мкМ 100

40 мкМ 100

80 мкМ 100

Дыхание измеряли при 22° С на истощенных клетках. Перед опытом клетки прединкубировали с 200 мкМ ДЦКД в течение 2 ч, а затем с 80 мкМ ТМФД в течение 20 мин. Дыхание начинали добавкой 5 мМ аскорбата в полярографическую ячейку.

Эксперименты на целых клетках позволили предположить, что разобщающее действие жирных кислот можно увидеть лишь при низкой скорости генерации потенциала, т.к. в этом случае дыхательная цепь не успевает восстановить мембранный потенциал при данном шунтировании до исходного уровня. Рис.4 (А-В) подтверждает это предположение: при снижении активности генераторов потенциала увеличивающимися концентрациями ДЦКД действующая концентрация миристиновой кислоты снижается от 30 до 5-10 мкМ. Как видно из рис.5 (А-В),

скорость генерации потенциала в случае работы одной цитохром-с-оксидазы в искусственной системе можно оценить по начальной скорости нарастания потенциала, индуцированного добавкой ТМФД на фоне аскорбата. Видно, что эффект миристиновой кислоты при концентрации 20 мкМ в снижении мембранного потенциала отчетливо проявляется только, когда скорость генерации потенциала низка (рис.5 А, Б), и не выявляется вовсе при высокой скорости генерации потенциала (рис.5 В).

Кроме ускорения • дыхания и снижения мембранного потенциала, жирная кислота в тех же концентрациях вызывает снижение Н+/е- на целых клетках, подобно протонофору-разобщителю ДНФ (рис. 6). Поскольку измерения ЬГ7е" проводили на терминальном участке цыхательной цепи клеток, а жирная кислота не оказывает влияния на активность цитохромоксидазы (Табл. 1), можно предполагать увеличение Непроводимости, индуцированной жирной кислотой, подобно тому, как это наблюдается на митохондриях печени (Brustovetsky et al., 1990).

Мы полагаем, что совокупность полученных данных показывает, что миристиновая кислота оказывает разобщающее действие на энергосопрягающую систему бактерии Bacillus pseudofirmns FTU.

Не исключено, что разобщающее действие жирных кислот помогает бактериям адаптироваться в условиях стрессовых воздействий. Известно, что гало- и алкалотолерантные бактерии, к которым относится объект настоящего исследования, располагают специфическим механизмом адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. Заключается он в перестройке липидного состава мембран в ответ на изменение как щелочности, так и солености среды. Адаптация к изменившимся условиям через несколько минут после воздействия сопровождается резким подъемом в несколько раз скорости синтеза замещающего липида, который продолжается в последующие 1-2 часа одновременно с полной остановкой роста бактерий (Russell et al., 1986), после чего происходит возврат к исходным скоростям синтеза липидов и восстановление роста. Возможно, что в бактериях при перестройке липидного состава мембран за счет активации биосинтеза жирных кислот концентрация последних в клетках повышается, и таким образом они оказывают влияние на протонную проводимость мембран.

£ ■J

Разобщитель, мкМ

Рис.6. Эффект миристиновой кислоты (1) и разобщителя ДНФ (2) на выброс Н* из клеток Bacillus pseudofirmus FTU в ответ на кислородный пульс в анаэробных условиях. Клетки, подготовленные как указано в подписи к рис.4а, перед экспериментом инкубировали 20 мин в среде измерения, которая содержала 150 мМ KCl, 450 мМ NaCl, 1 мкМ валиномицин, 5 мкМ HQNO, 80 мкМ ТМФД, 5 мМ аскорбат калия и 0,5 мМ Трицин-КОН (pH 8.1). Выброс Н* из клеток индуцировали добавкой 10 мкл воды при 25°С. Изменения pH после каждой добавки воды калибровали внесением в ячейку 10 нмоль HCl, насыщенной аргоном.

Известно, что для биосинтеза 1 моль пальмитоил-АПБ бактерии требуется 7 моль АТФ и 14 моль НАДФН. Потребность в НАДФН для биосинтеза можно удовлетворить за счет трансгидрогеназной реакции. Увеличить скорость продукции АТФ в условиях возросшей потребности в этом энергопродукте при адаптации к стрессу могло бы частичное разобщение окислительного фосфорилирования продуктом биосинтеза, жирными кислотами, в целях ослабления сопряжения (Скулачев, 1962).

Значение обнаруженного в настоящей работе "мягкого" разобщающего действия природного разобщителя, жирных кислот, на энергетическую систему бактерии Bacillus pseudofirmus FTU могло бы заключаться в индукции свободного окисления, приводящего к сдвигу динамического равновесия реакций окисления и потребления образовавшегося ДрН* . Таким образом, свободное окисление могло бы служить механизмом в адаптации бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды.

3. Обнаружение и идентификация оперона оксидазы cbb-типау бактерий рода Bacillus.

К настоящему времени цитохром-с-оксидаза сЬЬуТпт достаточно полно описана как отдельная группа суперсемейства гем-медных оксидаз. Она обнаружена у ряда представителей прокариот, однако ее присутствие отмечалось исключительно внутри группы протеобактерий (Myllykallio, 2000; Cosseau, Batut, 2004). У бактерий рода Bacillus присутствие оксидазы ebb-типа. и/или ЪЪ3-типа в доступной для нас литературе до сих пор никем не отмечалось.

Ранее в нашей группе было показано наличие альтернативной оксидазы у Bacillus pseudofirmus FTU, отличающейся от известной оксидазы сложила по ряду признаков. Были исследованы условия, благоприятные для ее индукции и биосинтеза (Мунтян, Скрипникова, 1993). Позже эта оксидаза была охарактеризована как оксидаза ЪЪ-типа (Muntyan et al., 1995). Эта оксидаза индуцируется у Bacillus pseudofirmus FTU в стационарной фазе роста и в условиях дефицита кислорода. В этих же работах для нее показана низкая дыхательная активность в ТМФД/аскорбатной системе в качестве субстрата по сравнению с оксидазой сааз-типа из той же бактерии и на порядок большая устойчивость к цианиду (К= =20мкМ).

В нашей группе М.С.Мунтян была высказана гипотеза о наличии оксидазы у Bacillus pseudofirmus FTU. Для проверки этой гипотезы нами была предпринята попытка обнаружения предполагаемых генов, а возможно оперона оксидазы сЬЬз-ТШШ при помощи специально синтезированных вырожденных праймеров. Кроме того, в экспериментах в качестве контрольного объекта исследования использовали близкородственный вид Bacillus halodurans 2513 DSM. Исследования начали с использованием двух пар праймеров, комплементарных

нуклеотидным последовательностям в двух первых генах оперона ccoNOQP: ccoN и ссоО.

Результаты этой поисковой работы показали, что в ДНК Bacillus pseudofirmus FTU и Bacillus halodurans 2513 DSM содержатся полинуклеотидные последовательности, соответствующие по размерам фрагментам генов, кодирующих субъединицы CcoN и СсоО в опероне ccoNOQP. На электрофорезном геле полученные полинуклеотиды обнаруживаются, как зоны с длиной полинуклеотидной цепи около 800 п.о. Для окончательного вывода был проведен сиквенс полученных полинуклеотидных фрагментов. Амплификацию и сиквенс фрагментов предполагаемых генов оперона CcoNOQP исследуемых бацилл проводили с применением уже использовавшихся в аналитических целях праймеров.

Результаты, полученные благодаря проведенному сиквенсу, успешно подтвердили наше предположение о присутствии в ДНК исследуемых объектов последовательностей, кодирующих оксидазу Было получено два

полинуклеотидных продукта ПНР (рис. 7), первый из которых содержал срединную часть субъединицы CcoN (А), второй - 3'-концевую часть субъединицы CcoN (Б) и 5'- концевую часть субъединицы СсоО (В).

Как и у других известных представителей ген ccoN заканчивается стоп-кодоном. Кроме того, этот же фрагмент несет последовательность Шайне-Дальгарно, служащую инициаторным доменом для посадки рибосом при считывании следующего гена ссоО.

Субъединица CcoN, кодируемая геном ccoN, заслуживает особого внимания (рис. 7). Это основная каталитическая субъединица комплекса цитохром-с-оксидазы cbbj-типа, несущая все простетические группы гем-медного каталитического центра: низкоспиновый гем b, высокоспиновый гем b3 и медь CuB. В высоко гомологичных районах по отношению к известным последовательностям можно увидеть присутствие двух гистидипов. Помимо них в аминокислотной последовательности субъединицы CcoN Bacillus pseudofirmus FTU и Bacillus halodurans 2513 DSM обнаруживаются еще шесть гистидинов, четыре из которых консервативны. Можно предположить, что именно они участвуют в связывании низкоспинового гема и биядерного металлического центра (рис. 8).

Субъсдииица CcoN (А)

B.FTU GCTSSKEYAELEWPISILIAIVWMAYAIVFFGTV I KR KI KIIIYVCN WFFGAFIMAV AI LH---G 237

¡3.2513 PKEIRPE - -MAQWPI--A - -VGW - - - A-VF F G T M VK R NT К HIY V GN W FF G A FI VVMAILII IVNII 237

B.FTU ADMPVSL--TKSYSAYRAVRTDAM I Q W W Y GIIN А V G FI LT A G F L G M M Y Y F I PKQ А E RP V Y S Y RL 299 B.2513 AYMPVSF--FKSYSAYC GRPDAMM QWWYGHNАVGFFLTAGFLGMMYYFV PКAF.RRPMYSYRL 299

B.FTU SIVIIFWALIFTYMWAGPIIIILIIYTALPDWAQSMGMVMSMVLLAPSWGGMING I MTLSGAWIIK 360 B.2513 SIVIIFWALITLY I WAGPIIIILHYTALPDWAQS LGMAMS I I LL AP S WG G M IN G M MT L S G A W II К 360

B.FTU LRTDPIMKF 369

B.2S13 LRTDPI LRF 369

Субъслипица CcoN (15)

B.FTU RMVNWIIFWWATVGIVLYAWSMWVAGI SQGKE WGEYGSDRYLVYSLАEVVQSMIIPYYLIRT 498

B.2513 GMVNWIIFWC ATLGIVLYA С S M W V A G IM Q G LM W RE Y G S D G Y L V Y SFAE V V Q AMIIP Y YLIRT 498

B.FTU TGGLLYLTGAWIMAWNIWMTIAGKLRDEAPMSSPAFDPARDRPLQHVPAE 535

B.2513 TGGLLYLTGA LIM A W NIW MTIA G К LRD E АРМ S S P A F D P ARD RP L Q II VP А E 535

Субъединица CcoO (B)

B.FTU MANLLNRHKVIERNVTLLAVFAF LT V АI G G I VE IА P LF WID ST VD К V E G VRP YTP LE L A G RD 61

B.2513 MANLLNRHKVIERNVTLLAVFAF LT V АIG GIV EI AP LF WID S T VD К V E G VR P YT P LE L A G RD 61

B.FTU IYIREGCYGCIISOMIRPFRDETERYGHYSLAG 93

B.2513 IYIREGCYGCIISOMIRPFRDETERYGIIYSLAG 93

Рис. 7. Предсказанные из последовательностей нуклеогидов аминокислотные последовательности фрагментов субъединиц CcoN и CcoO Bacillus halodurans 2513 и Bacillus pseudoßrmus FTU. Использована нумерация аналогичных последовательностей в опероне ccoNOQP Rhodobacter sphaeroides.

Фрагмент, соответствующий второму гену, ссоО (рис. 7, фрагмент В), у известных представителей несет ковалентно связанный гем С. Сайтом связывания для гема, вероятнее всего, является участок -СУОСЫ- , отмеченный на рисунке подчеркиванием (рис. 7, фрагмент В). Полученные полинуклеотиды обладают между собой высоким процентом гомологии (табл. 2).

2 « 2

¡3 «

¡4 ¡4 й

I I

цптохрои с расположение предполагаемых сайтов

I — cejtibieat&ui опюехых простешпесхих еругт

охеидазысЬЬЗ-типа

ccoN ссоО Q ССОР

[ — участки оперою, расшифрованная для Bacillus pseudofirma FTU и Bacillus halodurans 25t 3

расположат* предполагаемых сайтов свлтыванил основных Тфостетичесхих ¡г) групп оксидапл сЪЬЗ-типа

О

Рис. 8. Схема оперона ccoNOQP с указанием расположения расшифрованных для Bacillus pseudofirmus FTU и Bacillus halodurans 2513 полипуклеотидных фрагментов и расположения предполагаемых сайтов связывания основных простетических групп оксидазы сб^-типа. Нумерация остатков гистидина соответствует их расположению в опероне ccoNOQP Rhodobacter sphaeroides. His118 и 407 - лиганды дня гема b; His405 -лиганд для гема by, His267'317,318 - лиганды для CuB; -CYGCH- - сайт связывания для цитохрома с.

Таблица 2. Гомология по полинуклеотидным последовательностям генов оксидазы сЬ^гТИпа Bacillus pseudofirmus FTU, Bacillus halodurans 2513 и Rhodobacter sphaeroides.

Гомология ДНК, %

Объект Bacillus pseudofirmus FTU

CcoN (A) CcoN (Б) CcoO

Bacillus pseudofirmus FTU 100 100 100

Bacillus halodurans 2513 58 79 99.9

Rhodobacter sphaeroides 46 21 50

Полученные последовательности сравнивали с уже известными структурами генов оперона ссоЫО()Р других представителей. Оказалось, что и с другими филогенетически отдаленными организмами наблюдается достаточно высокая

гомология и совпадение в структуре высококонсервативных участков генов (табл.3).

Очевидно также, что гомология по анализируемым участкам между двумя исследованными представителями Bacillus значительно выше, чем между Bacillus pseudofirmus FTU и любым другим представителем из списка опубликованных в литературе данных. Данные этой таблицы показывают, что степень гомологии главной субъединицы оксидаз сЬЬз-ТШП различных представителей отражает родственные связи бактерий подобно тому, как это наблюдается для субъединиц I и II оксидаз саа3-типа. (Muntyan et al., 2002). Видно, что степень гомологии в менее консервативной области субъединицы N (CcoN, Б), составляет около 90% для двух филогенетически близких алкалофильных видов Bacillus против 31-45% для Bacillus pseudofirmus FTU и протеобактерий.

Однако, известно, что не все гены, имеющиеся в геноме организма, экспрессируются конститутивно. В этом случае их экспрессия зависит от каких-либо условий. Нами была исследована возможность индукции полипептида с молекулярной массой в районе 30 кДа и несущего цитохром с в мембранах бактерии.

Таблица 3. Гомология по аминокислотным последовательностям генов оксидазы cbbr типа Bacillus pseudofirmus FTU и других бактерий.

№ Объект Гомология по аминокислотным остаткам,%

Bacillus i CcoN (Л) iseudofirmus'. CcoN (Б) TU CcoO

1 Bacillus pseudofirmus FTU 100 100 100

2 Bacillus halodurans 2513 76 89 100

3 Paracoccus denitrificans 70 33 72

4 Rhodobacter capsulatus 66 36.5 66.6

5 Rhizobium leguminosarum 65.5 39.1 73.12

6 Rhizobium elli 65 45.2 -

7 Agrobacterium tumefaciens 64 42.6 72

8 Rhizobium melitoli 63.5 40.8 71

9 Bradirhizobium japonicum 63.5 39.1 63.44

10 Rhodobacter sphaeroides 63.5 36.5 71

11 Azorhizobium caulinodans 62 37.4 61.3

12 Helicobacter pylori 41 31.3 44.1

Как уже указывалось выше, ранее обнаруженная оксидаза bb-типа индуцируется у Bacillus pseudofirmus FTU в стационарной фазе роста и в условиях дефицита кислорода. Данные литературы об оксидазах cbbj-THia свидетельствуют о сходных условиях индукции этой оксидазы у других представителей бактерий. Поэтому нами был предпринят поиск полипептидов, являющихся одновременно и цитохромами с и субъединицами оксидазы c66j-THna в предполагаемых условиях роста.

Исследования неочищенной мембранной фракции с помощью электрофореза показали, что на эту роль могли бы претендовать полипептиды в области 30 кДа. Нами было обнаружено, что в экспоненциальной фазе роста имеются цитохромы с с массой 37, 25 и 17 кДа. Полипептид с массой 37 кДа является субъединицей II комплекса оксидазы саaз-типа. В стационарной фазе роста замечено появление двух цитохромов с в области 30 кДа, и исчезновение полипептида с массой 37 кДа. Наблюдаемая картина хорошо согласуется с ожидаемой в случае индукции синтеза цитохрома cbb3. Поскольку оксидаза сааз-типа доминирует в экспоненциальной фазе. роста и редуцируется при достижении стационарной фазы в условиях batch-культуры, то субъединица II с массой 37 кДа, как и весь комплекс, должна исчезать в стационарной фазе, а комплекс оксидазы наоборот должен синтезироваться.

Нами показано, что в геноме представителей Bacillus имеются, по крайней мере, гены двух субъединиц CcoN и СсоО, кроме того получена положительная ПЦР-реакция на две следующие субъединицы CcoQ и СсоР.

Таким образом, результаты наших исследований - это первые данные, показывающие, что оксидазы сЬЬуТШ1& присущи не только протеобактериям, но и бактериям из других подразделений царства.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что очищенная оксидаза сааз-типа Bacilluspseudofirmus FTU генерирует трансмембранную разность потенциалов ионов Н+. Эффективность трансформации энергии оксидазой CßOj-THna при транслокации протона через мембрану составляет не менее 1Н+/е-. Стехиометрия Н+/е- для данной оксидазы не зависит от рН в интервале 6,0-8,8.

2. Жирные кислоты могут оказывать "мягкое" разобщающее действие на энергосопрягающую систему бактерий, что доказано на примере бактерии Bacillus pseudofirmus FTU и на протеолипосомах со встроенной цитохромоксидазой caaj-тит из этой же бактерии.

3. Геном бактерий Bacillus pseudofirmus FTU и Bacillus halodurans 2513 содержит оперон ccoNOQP, кодирующий оксидазу сbb3-типа. Оксидаза сbb3-типа. у Bacillus pseudofirmus FTU индуцируется в стационарной фазе роста.

4. Высокая гомология нуклеотидных последовательностей оперона ccoNOQP этих бактерий отражает их близкородственное таксономическое положение.

Список опубликованных работ:

1. Беляев М.А., Мунтян М.С., Попова И.В., Мохова Е.Н. (2000) Обнаружение разобщающего действия жирных кислот на бактерии Bacillus halodurans FTU. Междунар. конф. студ. и асп. "Ломоносов-2000", Москва, МГУ, С. 201.

2. M.S.Muntyan, I.V.Popova (2000) Reconstituted cytochromes caa3 and bb of Bacillus halodurans FTU. Which ofthem translocates H+? 11th EBEC Short Reports (Brighton, UK),p.244.

3. Попова И.В., Мунтян М.С. (2000) Изучение функционирования терминальных оксидаз сааг и bb-тнпа. бактерии Bacillus halodurans FTU, реконструированных в искусственную систему. Междунар. конф. "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода", Пущино, С. 122.

4. Попова И.В., Мунтян М.С. (2001) Изучение рН-зависимости функционирования оксидазы caaj-тит. Междунар. конф. студ. и асп. «Ломоносов-2001», Москва, МГУ, вып. 6, с.35.

5. Попова И.В., Мунтян М.С. (2002) Влияние жирных кислот на цитохром-с-оксидазу из бактерий Bacillus pseudofirmus FTU. Ш-ий Всероссийский биохимический съезд, Санкт-Петербург, с. 259.

6. Грищук Ю.В., Мунтян М.С, Попова И.В., Сорокин Д.Ю. (2003) Транспорт ионов, сопряженный с работой терминальной оксидазы экстремально щелочелюбивой солеустойчивой бактерии рода Thioalkalivibrio. Биохимия, 68, № 4,477-483.

7. Попова И.В., Бодрова М.Э., Мохова Е.Н., Мунтян М.С. (2004) Разобщающее действие жирных кислот в гало- и алкалотолерантной бактерии Bacillus pseudofirmus FTU. Биохимия, 69, № 10 (в печати).

Работа поддержана РФФИ (гранты № 02-04-49107, 01-04-06 4™ л ^

Подписано в печать 26.08.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 122 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

HI 1 68 0t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попова, Ирина Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. АЛКАЛОФИЛЬНЫЕ ВИДЫ BACILLUS.

1. Таксономия рода Bacillus.

2. Актуальные проблемы классификации Bacillus.

3. Идентификация штамма Bacillus sp. FTU.

4. Промышленное значение Bacillus spp.

ГЛАВА II. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АЛКАЛОФИЛОВ

1. Мембранные липиды.

2. Компоненты дыхательной цепи

2.1. Цитохром

2.2. Сукцинат-хинон оксидоредуктаза.

2.3. Небелковые компоненты.

ГЛАВА III. ГЕМ-СОДЕРЖАЩИЕ ТЕРМИНАЛЬНЫЕ ОКСИДАЗЫ.

1. Оксидаза сааз-типа.

2. Цитохром-с-оксидаза сййз-типа.

3. Другие цитохром-ооксидазы.

ГЛАВА IV. ГИПОТЕЗА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ АЛКАЛОФИЛОВ.

1. Высокий трансмембранный потенциал (AT) и его локализация.

2. Низкий внутриклеточный рН и рН вблизи наружной поверхности мембраны.

ГЛАВА V. ГЕНОМИКА.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. Культивирование бактерий

1. Хранение культуры бактерий Bacillus pseudofirmus FTU.

2. Культивирование Bacillus pseudofirmus FTU в жидкой питательной среде в небольших объемах.

3. Культивирование Bacillus halodurans 2513.

Глава II. Препаративные методы.

1. Подготовка клеточной суспензии к экспериментам.

2. Выделение мембранных частиц Bacillus pseudofirmus FTU.

3. Выделение и очистка терминальных оксидаз сааз - и сЬЬз-типов Bacillus pseudofirmus FTU.

4. Приготовление протеолипосом.

5. Выделение ДНК из бактерий.

Глава III. Аналитические методы.

1. Измерение концентрации белка.

2. Измерение дыхательной активности.

3. Спектральный анализ гемсодержащих препаратов суббактериальных мембранных частиц Bacillus pseudofirmus FTU.

4. Изучение ионтранспортных свойств оксидаз Bacillus pseudofirmus FTU на целых клетках методом малых добавок кислорода.

5. Измерение мембранного потенциала

5.1. Измерение мембранного потенциала с использованием сафранина.,.

5.2. Измерение мембранного потенциала с использованием ТФФ+.

6. Электрофорез в денатурирующих условиях.

7. Электрофорез в неденатурирующих условиях.

8. Окрашивание гелей на белок.

9. Окрашивание гелей на гем.

10. Окрашивание гелей на оксидазную активность.

11. Определение содержания ДНК в материале.

12. Горизонтальный электрофорез ДНК в 1% агарозном геле.

13. Амплификация фрагментов бактериальной ДНК.

14. Выделение амплифицированных фрагментов ДНК.

15. Определение нуклеотидной последовательности в амплифицированных фрагментах ДНК.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ РЕАКТИВОВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Встраивание оксидазы сааз-типа в липосомы.

ГЛАВА II. Изучение влияния жирных кислот на энергосопрягающую систему бактерий Bacillus pseudofirmus FTU.

ГЛАВА III. Обнаружение и идентификация оперона оксидазы сййз-типа у бактерий рода Bacillus.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование оксидаз caa3- и cbb3-типа у бактерий рода Bacillus"

Дыхательная цепь прокариот вариабельна и отражает пути адаптации каждого представителя к условиям окружающей среды. Среди бактерий обнаружены представители как с протонным типом сопряжения дыхания с окислительным фосфорилированием, так и с натриевым. У бактерий независимо от типа сопряжения дыхательная цепь на конечном участке, как правило, разветвлена и представлена несколькими редокс-зависимыми оксидазами. Гало- и алкалотолерантная бактерия Bacillus pseudofirmus FTU, согласно последним филогенетическим исследованиям, относится к кластеру 6 алкалофильных Bacillus. Ее дыхательная цепь по данным Костырко и соавт. (Kostyrko et al., 1991) характеризуется смешанным типом сопряжения: начальный сегмент содержит как На+-зависимую, так и протонную NADH-хиноноксидоредуктазу; пункт III - хинон-цитохром-с-редуктазу протонного типа; концевой сегмент, как было показано ранее, представлен цитохром-ооксидазой сааз-типа и оксидазой ЪЪ-типа. Для алкалофильных и алкалотолерантных бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, установлена инверсия ДрН по сравнению с нейтрофилами, т.е. при щелочных значениях рН снаружи рН внутри остается более кислым, чем снаружи на 0.5-2 единицы. Расчеты показывают (Skulachev, 1994; Krulwich et al., 2001), что у таких бактерий, несмотря на более высокую А1?, по сравнению с нейтрофилами, результирующая Д(Ш+ имеет более низкое значение. Очевидно, что на начальном сегменте дыхательной цепи, где у Bacillus pseudofirmus FTU одна из NADH-оксидаз Ка+-зависима, проблема с низким ДрН при щелочных рН решается за счет переключения бактерий на использование AjINa+. Что касается терминального участка, то одним из приспособлений у щелочелюбивых бактерий группы Bacillus, а также у термофильных бактерий Thermus thermophilus, можно считать наличие в их мембране цитохром-с-оксидазы сааз-типа. Для Bacillus firmus OF4 показано, что даже частичный дефицит по этой оксидазе ввиду мутации делает эту бактерию неспособной к щелочному образу жизни (Krulwich, 1996). Следует отметить, что на фоне подробного исследования молекулярно-биологических особенностей оксидаз сааз-типа вопрос об эффективности их работы в качестве ионного насоса остается открытым. Изучение эффективности функционирования оксидазы сяяз-типа как помпы представляет интерес не только с физиологической точки зрения, но и в теоретическом отношении, поскольку в отличие от цитохром-с-оксидазы сшз-типа высших организмов и некоторых бактерий данный генератор энергии является не четырех, а пятикомпонентным по редокс-центрам. До настоящего времени оставалась до конца не выясненной природа второй терминальной оксидазы, а также механизм трансформации энергии этим комплексом у Bacillus pseudofirmus FTU. Ранее показано, что в мембране этой бактерии содержатся гемы А, В, С, но отсутствует гем О (Muntyan et al., 1995). Поэтому на порядок менее чувствительная к цианиду дыхательная активность мембран бактерий была отнесена к оксидазе ЬЪ-типа. Более подробные характеристики этого фермента не были исследованы не только на бактериях Bacillus pseudofirmus FTU, но сведения об оксидазах этого типа у бактерий рода Bacillus в литературе отсутствовали полностью. До сих пор считалось твердо установленной принадлежность оксидаз сЬЪз-типа только подразделению протеобактерий. Поэтому углубление исследований оксидазы ЬЬ-типа Bacillus pseudofirmus FTU представилось весьма актуальным.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Попова, Ирина Вячеславовна

выводы

1. Показано, что очищенная оксидаза caaj-типа Bacillus pseudofirmus FTU генерирует трансмембранную разность потенциалов ионов Н+. Эффективность трансформации энергии оксидазой сад-типа при транслокации протона через мембрану составляет не менее 1Н+/е\ Стехиометрия Н+/е" для данной оксидазы не зависит от рН в интервале 6,0-8,8.

2. Жирные кислоты могут оказывать "мягкое" разобщающее действие на энергосопрягающую систему бактерий, что доказано на примере бактерии Bacillus pseudofirmus FTU и на протеолипосомах со встроенной цитохромоксидазой сааз-типа из этой же бактерии.

3. Геном бактерий Bacillus pseudofirmus FTU и Bacillus halodurans 2513 содержит оперон ccoNOQP, кодирующий оксидазу сЪЪз-типа. Оксидаза сЪЪз-типа у Bacillus pseudofirmus FTU индуцируется в стационарной фазе роста.

4. Высокая гомология нуклеотидных последовательностей оперона ccoNOQP этих t бактерий отражает их близкородственное таксономическое положение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Ирина Вячеславовна, Москва

1. Лкиыемко с^т9ериа.ту&Ш1е ozeu^agpt . Д/,

2. Амбулос, Н., Арчибальд, Р., Аткинсон Т. и др. (1992) Бациллы. Генетика и биотехнология. М.:Мир.

3. Верховская M.JI., Семейкина A.JL, Скулачев В.П. (1988) Конечная оксидаза, действующая как первичный насос Na+. Доклад АН СССР, 303, 1501-1503.

4. Гринкевич В.А., Арзамазова Н.М., Потапенко Н.А, Гринкевич Х.А., Кравченко З.Б., Фейгина М.Ю., Алданова Н.А. (1979) Первичная структура LTV-связывающего белка из E.coli. Биоорган химия, 5, 1757-1774.

5. Йошикава, Ш., Цукихара, Т., Шинзава-Ито, К. (1996) Кристаллическая структура полностью окисленной формы цитохром-с-оксидазы из сердца быка с разрешением 2,8А. Биохимия, 61(11), 1931-1940.

6. Левачев М.М., Мишукова Е.А., Сивкова В.Г., Скулачев В.П. (1965) Энергетический метаболизм голубей после гипотермии. Биохимия, 30, 864.

7. Мунтян М.С., Скрипникова Е.В. (1993) Изучение свойств терминального участка дыхательной цепи алкалотолерантной бактерии Bacillus FTU в различных фазах роста. Биохимия, 58(8), 1290-1295.

8. Самарцев В.Н. (2000) Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования. Биохимия, 65 (9), 1173-11&9.

9. Скулачев В.П. (1962) Соотношение окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи. М, Изд-во АН СССР.

10. Скулачев В.П. (1969) Аккумуляция энергии в клетке. М., Изд-во "Наука".

11. Скулачев В.П., Маслов С.П. (1960) Биохимия, 25,1058-1065.

12. П.Устиян B.C. (1997) Изучение структурных и ионтранспортных свойств терминальных оксидаз щелочеустойчивой бактерии Bacillus sp. FTU. Канд. дисс., Москва, МГУ.

13. Agnew, M. D., Koval, S. F., and Jarrell, K. F. (1995) Isolation and characterization of novel alkaliphiles from bauxite-processing waste and description of Bacillus vedderi sp. nov., a new obligate alkaliphile. Syst Appl Microbiol, 18, 221-230.

14. Albers, S.-V., Van de Vossenberg, Jack L.S.M., Driessen, A.J.M. and Konings, W.N. (2001) Bioenergetics and solute uptake under extreme conditions. Extremophiles, 5, 285-294.

15. Aono, R. (1995) Assignment of facultative alkaliphilic Bacillus sp. strain C-125 to Bacillus lentus group 3. IntJSyst Bacteriol, 45, 582-585.

16. Aono, R., Ito, M., and Horikoshi, K. (1993) Occurrence of teichurono peptide in cell walls of group 2 alkaliphilic Bacillus sp. J Gen Microbiol, 139,2738-2744

17. Aono, R., Ito, M., and Machida, T. (1999) Contribution of the cell wall component teichuronopeptide to pH homeostasis and alkaliphily in the alkaliphile Bacillus lentus C-125. J Bacteriol, 181, 6600-6606.

18. Aono, R., Ito, M.5 Joblin, K. N., and Horikoshi, K. (1995) A high cell wall negative charge is necessary for the growth of the alkaliphile Bacillus lentus C-125 at elevated pH. Microbiology, 141,2955-2964.

19. Aono, S., Bentrop, D., Bertini, I., Luchinat, C. and Macinai, R. (1997) The D13C variant of Bacillus schlegelii 7Fe ferredoxin is an 8Fe ferredoxin as revealed by 1H-NMR spectroscopy. FEBSLett, 412(3), 501-5.

20. Apweiler, R., Biswas, M., Fleischmann, W. and Kanapin, A. (2001) Proteome analysis database: online application of InterPro and CluSTr for the functional classification of proteins in whole genomes. Nucleic Acids Research, 29(1), 44-48.

21. Brzezinski, P. and Malmstrom, B.G. (1987) The mechanism of electron gating in proton pumping cytochrome с oxidase: the effect of pH and temperature on internal electron transfer. Biochim Biophys Acta, 894, 29-38.

22. Calhoun, M., Thomas, J. and Gennis, R. (1994) The cytochrome oxidase superfamily of redox-driven proton pumps. Trends in Biochem Sci, 19, 325-330.

23. Castresana, J. and Saraste, M. (1995) Evolution of energetic metabolism: the respiration-early hypothesis. Trends Biochem Sci, 20(11), 443-448.

24. Castresana, J., Lubben, M., Saraste, M. and Higgins D.G. (1994) Evolution of cytochrome oxidase, an enzyme older than atmospheric oxygen. EMBO J, 13, 25162525.

25. Clejan, S., Krulwich, T.A., Mondrus, K.R. and Seto-Young, D. (1986) Membrane lipid composition of obligately and facultatively allcalophilic strains of Bacillus spp. J Bacteriol, 168(1), 334-340.

26. Copeland, R.A., Smith, P.A. and Chan, S.I. (1987) Cytochrome coxidase exhibits a rapid conformational change upon reduction of Сид: a tryptophan fluorescence study. Biochemistry, 26,7311-7316.

27. Copeland, R.A., Smith, P.A. and Chan, S.I. (1988) pH dependence of the tryptophan fluorescence in cytochrome с oxidase: further evidence for a redox-linked conformational change associated with CuA. Biochemistry, 27,3552-3555.

28. Cosseau, C. and Batut, J. (2004) Genomics of the ccoNOQP-encoded cbb3 oxidase complex in bacteria. Arch Microbiol, 181, 89-96.

29. Davidson, M.W., Gray, K.A., Knaff, D.B., and Krulwich, T.A. (1988) Purification and characterization of two soluble cytochromes from the alkalophilic Bacillus firmus RAB. Biochim Biophys Acta, 933,470-477.

30. Davis, B.J. (1964) Disc electrophoresis II. Method and application to human serum proteins. Annu N.Y. Acad Sci, 121, 404-427.

31. De Vrij, W., Heyne, R. I., Konings, W. N. (1989) Characterization and application of a thermostable primary transport system: cytochrome-c-oxiase from Bacillus stearothermophilus. Eur J Biochem, 178, 763-770.

32. Devine, K. (1995) The Bacillus subtilis genome project: aims and progress. Elsevier Science, 13, 210-216.

33. Elferink, M.G., De Wit, J.G., Driessen, A.J. and Konings, W.N. (1993) Energy-transducing properties of primary proton pumps reconstituted into archaeal bipolar lipid vesicles. Eur J Biochem, 216(3), 880.

34. Farrar, J.A., Lappalainen, P., Zumft, W.G., Saraste, M. and Thomson, A.J. (1995) Spectroscopic and mutagenesis studies on the Сид centre from the cytochrome-c-oxidase complex of Paracoccus denitrificans. Eur J Biochem, 232, 294-303.

35. Farrar, J.A., Thomson, A.J., Cheesman, M.R., Dooley, DM. and Zumft, W.G. (1992) A model of the copper centres of nitrous oxide reductase (Pseudomonas stutzeri). Evidence from optical, EPR and MCD spectroscopy. FEBS Lett, 294,11-15.

36. Fritze, D. (1996) Bacillus haloalkaliphilus sp. nov. IntJSyst Bacteriol, 46, 98-101.

37. Fritze, D., Flossdorf, J., and Clans, D. (1990) Taxonomy of alkaliphilic Bacillus strains. Int JSyst Bacteriol, 40, 92-97.

38. Garcia-Horsman, J., Barquera, В., Rambley, J., Ma, J. and Gennis, R. (1994) The superfamily of heme-copper respiratory oxidases. J Bacteriol, 176, 5587-5600.

39. Gilmour, R. and Krulwich, T. (1996) Purification and characterization of the succinate dehidrogenase complex and СО-reactive 6-type cytochromes from the facultative alkaliphile Bacillus firmus OF4. Biochim et Biophys Acta, 1276, 57-63.

40. Gilmour, R. and Krulwich, T. A. (1997) Construction and characterization of a mutant of alkaliphilic Bacillus firmus OF4 with a disrupted eta operon and purification of a novel cytochrome bd. J Bacteriol, 179, 863-870.

41. Gray, K., Grooms, M., Myllykallio, H., Moomav, C., Slaughter, C. and Daldal, F. (1994) Rhodobacter capsulatus contains a novel cb-type cytochrome-c-oxidase without а Сид center. Biochemistry, 33, 3120-3127.

42. Guffanti, A. A., Finkelthal, O., Hick, D.B., Falk, L., Sidhu, A., Garro, A., and Krulwich, T. A. (1986) Isolation and characterization of new facultatively alkalophilic strains of Bacillus species. J Bacteriol, 167, 766-773.

43. Gutknecht, J. (1988) Proton conductance caused by long-chain fatty acids in phospholipid bilayer membranes. JMembr Biol, 106, 83-93.

44. Hansen, A.P., Britt, R.D., Klein, M.P., Bender, C.J. and Babcock, G.T. (1993) ENDOR and ESEEM studies of cytochrome-c-oxidase: evidence for exchangeable protons at the Cu site. Biochemistry, 32,13718-13724.

45. Harwood C. (1992) Bacillus subtilis and its relatives-molecular biological and industrial workhorses. Trends Biotechnol, 10, 247-256.

46. Hase, C.C., Fedorova, N.D., Galperin, M.D. and Dibrov, P.A. (2001) Sodium ion cycle in bacterial pathogens: evidence from Cross-genome comparisons. Microbiol andMol Biol Rev, 65, 353-370.

47. Heberle, J., Riesle, J., Thiedemann, G., Oesterhelt, D., and Dencher, N. A. (1994) Proton migration along the membrane surface and retarded surface to bulk transfer. Nature, 370, 379-382.

48. Hicks, D. B. and Krulwich, T. A. (1990) Purification and reconstitution of the FiFo -ATP sinthase from alkaliphilic Bacillus firmus OF4: evidence that the enzyme translocates H+ but not Na+. J Biol Chem, 265, 20547-20554.

49. Higashibata, A., Fujiwara, Т., and Fukumori, Y. (1998) Studies on the respiratory system in alkaliphilic Bacillus: a proposed new respiratory mechanism. Extremophiles, 2, 83-92.

50. Hill, B.C. (1991) The reaction of the electrostatic cytochrome-c-oxidase complex with "oxygen. J Biol Chem, 266, 2219-2226.

51. Hill, B.C. (1994) Modeling the sequence of electron transfer reactions in the single turnover of reduced, mammalian cytochrome-c-oxidase with oxygen. J Biol Chem, 269,2419-2425.

52. Hockings, P.D. and Rogers, P.J. (1996) The measurement of transmembrane electric potential with lipophilic cations. Biochem Biophys Acta, 1282,101-106.

53. Hoffmann, A. and Dimroth, P. (1991) The ATPase of Bacillus alcalophilus. Reconstitution of energy-transducing function. Eur J Biochem, 196,493-497.

54. Horikoshi, К. (1991) Microorganisms in alkaline environments. Kodansha, Tokio, VCH, Weinheim, New York.

55. Horikoshi, K. (1999) Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology. Microbiol and Mol Biol Rev, 63, 735-750.

56. Iwata, S., Ostermeier, C., Ludwig, B. and Michel, H. (1995) Structure at 2.8 A resolution of cytochrome-c-oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature, 376, 660669.

57. Keefe, R.G. and Maier, R.J. (1993) Purification and characterization of an O-utilizing cytochrome-c-oxidase complex from Bradyrhizobium japonicum bacteroid membranes. Biochim Biophys Acta, 1183, 91-104.

58. Kitada, M. and Krulwich, T.A. (1984) Purification and characterization of the cytochrome oxidase from alkalophilic Bacillus firmus RAB. J Bacteriol, 158, 963966.

59. Kitada, M., Hashimoto, M., Kudo, Т., and Horikoshi, К. (1994) Properties of two different Na+/H+ antiport systems in alkaliphilic Bacillus sp. strain C-125. J Вас ten ol, 176, 6464-6469.

60. Koyama, N. and Nosoh, Y. (1985) Effect of potassium and sodium ions on the cytoplasmic pH of an alkalophilic Bacillus. Biochim Biophys Acta, 812, 206-212.

61. Koyama, N., Wakabayashi, K., and Nosoh, Y. (1987) Effect of K+ on the membrane function of an alkalophilic Bacillus. Biochim Biophys Acta, 898, 293-298.

62. Krulwich, T.A., Ito, M., Gilmour, R., Sturr, M.G., Guffanti, A. A., and Hicks, D. B. (1996) Energetic problems of extremely alkaliphilic aerobes. Biochim Biophys Acta, 1275,21-26.

63. Krulwich, T.A. and Guffanti, A.A. (1989) Alkalophilic Bacteria. Annu Rev Microbiol, 43,435-463.

64. Krulwich, T.A., Ito, M., Gil mom, R., and Guffanti, A. A. (1997) Mechanisms of cytoplasmic pH regulation in alkaliphilic strains of Bacillus. Extremophiles, 1, 163169.

65. Krulwich, T.A., Ito, M., Gilmour, R., Hicks, D. and Guffanti, A.A. (1998) Energetics of alkaliphilic Bacillus species: phisiology and molecules. Adv Microb Physiol, 40, 401-438.

66. Kunst, F., Ogasawara, N., Moszer, I., Albertini, A.M., Alloni, G., Azevedo, V., Bertero, M.G., Bessieres, P., Bolotin, A., Borchert, S., Borriss, R., Boursier, L., Brans,

67. Laemmli, U. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage. Nature, 227(5259), 680-685.

68. Lappalainen, P., Aasa, R., Malmstrom, B.G. and Saraste, M. (1993) Soluble Сил-binding domain from the Paracoccus cytochrome-c-oxidase. J Biol Chem, 268, 26416-26421.

69. Lauraeus, M., Haltia, Т., Saraste, M. and Wikstrom, M. (1991) Bacillus subtilis expresses two kinds of haem-A-containing terminal oxidases. Eur J Biochem, 197, 699-705.

70. Lewis, R. J., Belkina, S., and Krulwich, T. A. (1980) Alkalophiles have much higher cytochrome contents than conventional bacteria and than their own non-alkaliphilic mutant derivatives. Biochem Biophys Res Commitn, 95, 857-863.

71. Li, P.M., Morgan, J.E., Nilsson, Т., Ma, M. and Chan, S.I. (1988) Heat treatment of cytochrome-o-oxidase perturbs the Сид site and affects proton pumping behavior. Biochemistry, 27, 7538-7546.

72. Li, Z.Y., Larsen, R.W., Pan, L.P. and Chan, S.I. (1991) The effects of p-hydroxymercuribenzoic acid modification and heat treatment on the CuA reduction potential of cytochrome-c-oxidase. J Biol Chem, 266, 22858-22865.

73. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.Y. (1951) Protein measurment with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 193,265-275.

74. Malmstrom, B.G. and Aasa, R. (1993) The nature of the Сид center in cytochrome-c-oxidase. FEBS Lett, 325,49-52.

75. Mandon, K., Kaminski, P. and Elmerich, C. (1994) Functional analysis of the fixNOQP region of Azorhizobium caulinodans. J Bacteriol, 176, 2560-2568.

76. Markwell, M.A., Haas, S.M., Bieber, L.L. and Tolbert, N.E. (1978) A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. Anal Biochem, 87, 206-210.

77. Matsushita, K., Patel, L., and Kaback, R. (1984) Cytochrome о type oxidase from Escherichia coll Characterization of the enzyme and mechanism of electrochemical protone gradient generation. Biochemistry, 23,4703-4714.

78. Meunier, В., Colson, A.M. and Rich, P.R. (1995) The topology of CuA in relation to the other metal centres in cytochrome-c-oxidase of Saccharomyces cerevisiae as determined by analysis of second-site reversions. Biochim Biophys Acta, 1253, 13-15.

79. Miki, K. and Okunuki, K. (1969) Cytochrome of Bacillus subtilis III. Physicochemical and enzymatic properties of cytochrome c-550 and c-554. J Biochem, 66, 845-854.

80. Miki, K. and Okunuki, K. (1969) Cytochrome of Bacillus subtilis II. Purification and spectral properties of cytochrome c-550 and c-554. J Biochem, 66, 831-843.

81. Mitchell, P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type mechanism. Nature, 191,14*4-148.

82. Mogi, Т., Nakamura, H. and Anraku, Y. (1994) Molecular structure of a heme-copper redox center of the Escherichia coli ubiquinol oxidase: evidence and model. J Biochem (Tokyo), 116,471-477.

83. Muntyan, M., Ustiyan, V., Viryasov, M. and Skulachev, V.P. (1995) Terminal oxidases of the bb- and сааз-types in Bacillus sp. FTU. Biochem and Biophys Research Comm, 207(1), 55-61.

84. Muntyan, M.S., Tourova, T.P., Lysenko, A.M., Kolganova, T.V., Fritze, D. and Skulachev, V.P. (2002) Molecular identification of alkaliphilic and halotolerant strain Bacillus sp. FTU as Bacillus pseudofirmus FTU. Extremophiles, 6, 195-199.

85. Myllikallio, H. and Liebl, U. (2000) Dual role for cytochrome сЬЬз oxidase in clinically relevant proteobacteria? Trends Microbiol, 8(12), 542-543.

86. Nielsen, P., Fritze, D., and Priest, F. G. (1995) Genetic diversity of alkaliphilic Bacillus strains: proposal for nine new species. Microbiology, 141, 1745-1761.

87. Nielsen, P., Rainey, F. A., Outtrup, H., Priest, F. G., and Fritze, D. (1994) Comparative 16S rDNA sequence analysis of some alkaliphilic bacilli and the establishment of sixth rRNA group within the genus Bacillus. FEMS Microbiol Lett, 111, 61-66.

88. Nilsson, Т., Copeland, R.A., Smith, P.A. and Chan, S.I. (1988) Conversion of CuA to a type II copper in cytochrome-c-oxidase. Biochemistry, 27, 8254-8260.

89. Nilsson, Т., Gelles, J., Li, P.M. and Chan, S.I. (1988) Chemical modification of the CuA site affects the proton pumping activity of cytochrome-c-oxidase. Biochemistry, 27,296-301.

90. Oh, J. and Kaplan, S. (2000) Redox signaling: globalization of gene expression. EMBOJ, 19(16), 4237-4247.

91. Orii, Y., Yumoto, I., Fukumori, Y., and Yamanaka, T. (1991) Stopped-flow and rapid-scan studies of the redox behavior of cytochrome aco from facultative alkalophilic Bacillus. J Biol Chem, 266, 14310-14316.

92. Park, C., Moon, Ja., Cokic, P., Webster, D. (1996) Na+-translocating cytochrome bo terminal oxidase from Vitreoscilla: some parameters of its Na+ pumping and orientation in synthetic vesicles. Biochemistry, 35,11895-11900.

93. Parkhill, J., Wren, B.W., Mungall, K., Ketley, J.M., Churcher, C., Basham, D., Chillingworth, Т., Davies, R.M., Feltwell, Т., Holroyd, S., Jagels, K., Karlyshev, A.V., Moule, S., Pallen, M.J., Penn, C.W., Quail, M.A., Rajandream, M.A., Rutherford,

94. К.М., van Vliet, A.H., Whitehead, S. and Barrell, B.G. (2000) The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature, 403(6770), 665-668.

95. Pitcher, R., Brittain, T. and Watmough, N. (2002) Cytochrome сЬЪз oxidase and bacterial microaerobic metabolism. Biochem Soc Trans, 30(4), 653-658.

96. Preisig, O., Anthamatten, D. and Hennecke, H. (1993) Genes for a microaerobically induced oxidase complex in Bradyrhizobium japonicum are essential for a nitrogen-fixing endosymbiosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 90, 3309-3313.

97. Preisig, O., Zufferey, R., Thony-Meyer, L., Appleby, C. and Hennecke, H. (1996) A high-affinity ebbз-type cytochrome oxidase terminates the simbiosis-specific respiratory chain of Bradyrhizobium japonicum. J Bacteriol, 178(6), 1532-1538.

98. Pressman, B.C., and Lardy, H.A. (1956) Effect of surface active agents on the latent ATPase of mitochondria. Biochim Biophys Acta, 21,458-466.

99. Quirk, P.G., Hicks, D.B. and Krulwich, T.A. (1993) Cloning of the eta operon from alkaliphilic Bacillus firmus OF4 and characterization of the pH-regulated cytochrome сааз -oxidase it encodes. J Biol Chem, 268, 678-685.

100. Qureshi, M. H., Yumoto, I., Fujiwara, Т., Fukumori, Y., and Yamanaka, T. (1990) A novel aco-type cytochrome-c-oxidase from a facultative alkalophilic Bacillus:purification, and some molecular and enzymatic features. J Biochem, 107, 480-485.

101. Raitio, M. and Wikstrom, M. (1994) An alternative cytochrome oxidase of Paracoccus denitrificans functions as a proton pump. Biochim Biophys Acta, 1186, 100-106.

102. Rich, P.R., West, I.C. and Mitchell, P. (1988) The location of CuA in mammalian cytochrome-c-oxidase. FEBS Lett, 233, 25-30.

103. Russell, NJ. (1989) Adaptive modifications in membranes of halotolerant and halophilic microorganisms. JBioenj Biomem, 21, 93-113.

104. Saiki, K., Mogi, T. and Anraku, Y. (1992) Heme О biosynthesis in Escherichia coli: the cyoE gene in the cytochrome bo operon encodes a protoheme IX farnesyltransferase. Biochem Biophys Res Commun, 189, 1491-1497.

105. Salerno, J.C., Bolgiano, B. and Ingledew, W.J. (1989) Potentiometric titration of cytochrome-6o type quinol oxidase of Escherichia coli: evidence for heme-heme and copper-heme interaction. FEBS Lett, 247,101-105.

106. Salerno, J.C., Bolgiano, В., Poole, R.K., Gennis, R.B. and Ingledew, W.J. (1990) Heme-copper and heme-heme interactions in the cytochrome 60-containing quinol oxidase of Escherichia coli. J Biol Chem, 265, 4364-4368.

107. Samartsev V.N., Mokhova, E.N., and Skulachev, V.P. (1997) The pH-dependent reciprocal changes in contributions of ADP/ATP antiporter and aspartate/glutamate antiporter to the fatty acid-induced uncoupling. FEBS Lett, 412,179-182.

108. Saraste, M., Holm, L., Lemieux, L., Lubben, M. and van der Oost, J. (1991) The happy family of cytochrome oxidases. Biochem Soc Trans, 19, 608-612.

109. Scholes, C.P. and Malmstrom, B.G. (1986) Two-electron reduction of cytochrome-c-oxidase triggers a conformational transition. FEBS Lett, 198, 125-129.

110. Semeykina, А.1., Skulachev, V.P., Verkhovskaya, M.L., Bulygina, E.S. and Chumakov, K.M. (1989) The Na+-motive terminal oxidase activity in an alkalo- and halo-tolerant Bacillus. Eur JBiochem, 183, 671-678.

111. Shapleigh, J.P., Hill, J.J., Alben, J.O. and Gennis, R.B. (1992) Spectroscopic and genetic evidence for two heme-Cu-containing oxidases in Rhodobacter sphaeroides. J Bacteriol, 174, 2338-2343.

112. Sharpe, M., Perin, I. and Nichols, P. (1996) Action of bovine serum albumin on cytochrome-c-oxidase activity and proton pumping: a role of fatty acids in enzyme function. FEBS Lett, 391,134-138.

113. Sone, N. and Nicholls, P. (1984) Effect of heat treatment on oxidase activity and proton-pumping capability of proteoliposome-incorporated beef heart cytochrome aaj. Biochemistry, 23, 6550-6554.

114. Sone, N. and Yanagita, Y. (1982) A cytochrome ааз-type terminal oxidase of a thermophilic bacterium. Purification, properties and proton pumping. Biochim Biophys Acta, 682,216-226.

115. Sone, N, Sekimachi, M, and Kutoh, E. (1987) Identification and properties of a quinol oxidase super-complex composed of a bcj complex and cytochrome oxidase in the thermophilic bacterium PS3. J Biol Chem, 262(32), 15386-91.

116. Sone, N., Ogura, Т., Noguchi, S., and Kitagawa, T. (1994) Proton pumping activity and visible absorption and resonance Raman spectra of a cao-type cytochrome с oxidase isolated from the thermophilic bacterium Bacillus PS3. Biochemistry, 33, 849855.

117. Spanka, R. and Fritze, D. (1993) Bacillus cohnii sp. nov., new, obligately alkaliphilic, oval-spore-forming Bacillus species with ornithine and aspartic acid instead of diaminopimeric acid in the cell wall. JntJSyst Bacteriol, 43, 150-156.

118. Stover, C.K., Pham, X.Q., Erwin, A.L., Mizoguchi, S.D., Warrener, P., Hickey, M.J., Brinkman, F.S., Hufnagle, W.O., Kowalik, D.J., Lagrou, M., Garber, R.L.,

119. Sturr, M.G., Guffanti, A. A., and Krulwich, T.A. (1994) Growth and bioenergetics of alkaliphilic Bacillus flrmus OF4 in continuous culture at high pH. J Bacteriol, 176, 3111-3116.

120. Sugiyama, S., Matsukura, H., and Imae, Y. (1986) Relationship between Independent cytoplasmic pH homeostasis and Na+-dependent flagellar rotation and amino acid transport in alkalophilic Bacillus. Biochim Biophys Acta, 852, 38-45.

121. Takami, H., Nakasome, K., Takai, Y., Maeno, G., Sasaki, R., Masui, N., Fujii, F., Hirama, C., Nakamura, Y, Ogasawara, N., Kuhara, S., and Horikoshi, K. (2000)

122. Complete genome squence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans andgenomic sequence comparison with Bacillus subtilis. Nucleic Acid Res, 28, 43174331.

123. Takami, H., and Krulwich, T.A. (2000) Reidentification of facultatively alkaliphilic Bacillus firmus OF4 as Bacillus pseudofirmus OF4. Extremophiles, 4, 19-22.

124. Thomas, P.E., Ryan, D. and Levin, W. (1976) An improved staining procedure for the detection of the peroxidase activity of cytochrome P-450 on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Anal Biochem, 75(1), 168-176.

125. Toledo-Cuevas, M., Barquera, В., Gennis, R.B., Wikstrom, M. and Garcia-Horsman, J.A. (1998) The сЬЬз-type cytochrome-c-oxidase from Rhodobacter sphaeroides, a proton-pumping heme-copper oxidase. Biochim Biophys Acta, 1365(3), 421-434.

126. Tsukihara, Т., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, Т., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, R., Yaono, R. and Yoshikawa, S. (1995) Structures of metal sites of oxidized bovine heart cytochrome-c-oxidase at 2.8 A. Science, 269, 10691074.

127. Tsukihara, Т., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, Т., Yamaguchi, H., Shinzawa1.oh, K., Nakashima, R., Yaono, R. and Yoshikawa, S. (1996) The whole structure ofthe 13-subunit oxidized cytochrome-c-oxidase at 2.8 A. Science, 272,1136-1144.

128. Tsukita, S., Koyanagi, S., Nagata, K., Koizuka, H., Akashi, H., Shimoyama, Т., Tamura, T. and Sone, N. (1999) Characterization of a cb-type cytochrome-c-oxidase from Helicobacter pylori. J Biochem (Tokyo), 125(1), 194-201.

129. Urbani, A., Gemeinhardt, S., Warne, A. and Saraste, N. (2001) Properties of the detergent solubilised cytochrome-c-oxidase (cytochrome сЬЬз) purified from Pseudomonas stutzeri. FEBS Lett, 508(1), 29-35.

130. Van de Vossenberg, Jack L.S.M., Driessen, A.J.M. and Konings, W.N. (2000) Adaptations of the cell membrane for life in extreme environments. Elsevier Sci, 6, 71-88.

131. Von Wachenfeldt, C., de Vries, S. and van der Oost, J. (1994) The CuA site of the сааз -type oxidase of Bacillus subtilis is a mixed valence binuclear copper centre. FEBSLett, 340, 109-113.

132. Wachenfeldt, C. and Hederstedt, L. (1993) Physico-chemical characterization of membrane-bound and water-soluble forms of Bacillus subtilis cytochrome c-550. FEBS Lett, 212,499-509.

133. Woolley, K. J. (1987) The c-type cytochromes of the Gram-positive bacterium Bacillus licheniformis. Arch Biochem Biophys, 254, 376-370.

134. Yoshikawa, S., Shinzawa-Itoh, K. and Tsukihara, T. (1998) Crystal structure of bovine heart cytochrome-c-oxidase at 2.8A resolution. J Bioenerg Biomem, 30(1), 714.

135. Yumoto, I., Yamazaki, K., Sawabe, Т., Nakano, K., Kawasaki, K., Ezura, Y., and Shinano, H. (1998) Bacillus horti sp. nov., a new Gram-negative alkaliphilic bacillus. IntJSyst Bacteriol, 48, 565-571.

136. Yumoto, I. (2002) Bioenergetics of alkaliphilic Bacillus spp. J Biosci Bioeng, 93(4), 342-353.

137. Yumoto, I., Fukumori, Y., and Yamanaka, T. (1991) Purification and characterization of two membrane-bound c-type cytochromes from a facultative alkalophilic Bacillus. J Biochem, 110,267-273.

138. Yumoto, I., Nakajima, K., and Ikeda, K. (1997) Comparative study on cytochrome content of alkaliphilic Bacillus strains. J Ferment Bioeng, 83, 466-467.

139. Yumoto, I., Takahashi, S., Kitagawa, Т., Fukumori, Y, and Yamanaka, T. (1993) The molecular features and catalytic activity of Сид-containing асоз-type cytochrome с oxidase from facultative alkalophilic Bacillus. JBiochem, 114, 88-95.

140. Zickermann, I., Tautu, O.S., Link, T.A., Korn, M., Ludwig, B. and Richter, O.M. (1997) Expression studies on the Ьаз quinol oxidase from Paracoccus denitrificans. A ЪЪз variant is enzymatically inactive. Eur JBiochem, 246(3), 618-624.

141. Zufferey, R., Preisig, O., Hennecke, H. and Thony-Meyer, L. (1996) Assembly and function of the cytochrome сЪЪз-oxidase subunits in Bradyrhizobium japonicum. J Biol Chem, 271(15), 9114-9119.

142. Автор приносит глубокую благодарность своему научному руководителю, академику (PJ&f, профессору <В.9Т. Скулачеву за постоянное внимание к^ работе, помощь в планировании экспериментов и обсуждении полученнъи^резулътатов.

143. Благодарю всех, сотрудников и аспирантов отдела биоэнергетики за помощь в работе.