Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности устройства цитохромоксидазы ba3 из термофильной бактерии Thermus thermophilus

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности устройства цитохромоксидазы ba3 из термофильной бактерии Thermus thermophilus"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

на правах рукописи

4840674

Анастасии Валерьевна Калинович

УДК 577.151.02, 577.151.042, 579.017.7

ОСОБЕННОСТИ УСТРОЙСТВА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ Ьаъ ИЗ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ Ткегтт ЛегторНИж

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 мдр 2ОЦ

Москва-2011

Работа выполнена в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Константинов Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Андреев Игорь Михайлович

кандидат биологических наук Арцатбаиов Владислав Юрьевич

Ведущая организация: Воронежский Государственный Университет

(кафедра генетики, цитологии и биоинженерии)

Защита диссертации состоится « 4 » апреля_ 2011 г. в_на заседании

диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « \ года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

— М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Цитохромоксидаза (ЦО1) - терминальный фермент дыхательной цепи митохондрий и многих бактерий. ЦО катализирует восстановление кислорода цитохромом с, сопряженное с образованием ДцНГ. Большинство терминальных оксидаз относится к так называемому гем-медному семейству, в котором на основании особенностей устройства протонных каналоз выделяют классы А, В и С. К группе А принадлежат наиболее изученные оксидазы: ЦО митохондрий и многие бактериальные оксидазы. Они содержат три протонных канала (К, D и Н), для двух из которых (К и D) участие в переносе протонов доказано экспериментально. Терминальные оксидазы класса В исследованы в гораздо меньшей степени. Наиболее древними и хуже всего изученными являются оксидазы класса С. Оксидазы класса В появились в эволюции позднее, а самыми «молодыми» являются, по-видимому, оксидазы класса А. Сравнение эволюционно далеких друг от друга оксидаз важно для нахождения общих закономерностей, сохранившихся в процессе эволюции фермента, а значит, наиболее важных. Кроме того, оно позволяет определить особенности, связанные с адаптацией организмов (к высоким температурам, кислой среде и др.). Самым изученным представителем оксидаз класса В является ЦО типа Ъа3 из термофильной эубактерии Thermus thermophilus. Это единственная оксидаза класса В, для которой расшифрована трехмерная структура. Как и оксидазы класса А, фермент содержит три потенциальные протонные канала. Для одного из них прослеживается отдаленная гомология с К-каналом ЦО фуппы А, функциональная роль двух остальных пока не выявлена. Согласно работе (Kannt, 1998), оксидаза Ьа} переносит протоны через мембрану с меньшей

1 Список принятых сокращений: ДАД - 2,3,5,6-тетраметил-гс-феиилеидиамин, Кд -константа диссоциации, КД - круговой дихроизм, МКД - магнитный круговой дихроизм, НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный; ТМФД - М,М,Ы',№-тетраметил-л-фенилендиамин, ФМС - феназинметасульфат, ЦО - цитохромоксидаза, ЭДТА -этидендиаминтетраацетат, Дц1-Г - траисмембранная разность электрохимических потенциалов иона водорода, Д>|/ - трансмембранная разность электрических потенциалов.

эффективностью (1 Г/ё = 0,5), чем оксидазы класса А (Н7ё = 1). В последнее время появляется все больше указаний на то, что механизмы перекачки протонов через мембрану у гем-медных оксидаз разных классов могут различаться. Важно установить, коррелируют ли выявленные при анализе геномов различия в структуре протонных каналов с другими свойствами оксидаз, в первую очередь - с устройством центра восстановления кислорода. Традиционный подход к изучению кислород-редуктазного центра ЦО состоит в исследовании взаимодействия фермента с такими лигандами, как СО, HCN, HiS, Н202 и др., которые могут рассматриваться, как аналоги естественного субстрата, 02 (Koutsoupakis, 2002; Maramoto, 2010).

Цели работы. Целью настоящей работы являлось исследование особенностей устройства каталитического центра ЦО Ьа3 из T. thermophiîus в сравнении с митохондриальной ЦО а<згтипа.

Основные задачи исследования заключались в том, чтобы: (1) сопоставить оптические характеристики гемовых центров оксидазы из T. thermophiîus со спектральными свойствами оксидаз ааз типа; (2) изучить связывание окисленной оксидазы Ъа~, с лигандами трехвалентного железа гема я3 (цианидом, перекисью водорода, азидом); (3) изучить взаимодействие восстановленной ЦО Ьсц с цианидом и СО; (4) выявить наличие гемосопряженных ионизируемых групп в ЦО типа bay, (5) исследовать возможную роль «кислородного канала» в проникновении лигандов в кислород-редуктазный центр оксидазы типа Ъаъ,

Научная новизна и практическая значимость. Результаты исследования каталитического центра ЦО Ъах, из T. thermophiîus, изложенные в настоящей работе, получены впервые. Обнаружено, что цитохром Ьа} образует два разных цианидных комплекса с восстановленным гемом а3, формирование которых определяется условиями восстановления фермента. При полном восстановлении в строго анаэробных условиях образуется комплекс, сходный с митохондриальным аналогом как сродством (Кд = 0,7 мМ), так и спектральными характеристиками. В присутствии слабых восстановителей гем

образует с цианидом спектрально иной и практически недиссоциирующий (Кд < 5* 10'8 М) аддукт. Обнаружены также два типа комплексов оксидазы Ьаъ с СО, один из которых, формирующийся в условиях частичного окисления, напоминает прочный цианидный комплекс. Впервые исследована кинетика взаимодействия KCN с восстановленной оксидазой Ъа3. Обнаружена pll-зависимость скорости связывания тема «32' с цианидом и показано, что связывание лиганда контролируется протонированием гемосопряженной ионизируемой группы белка с рКа около 9. Совокупность полученных данных свидетельствует о значительных различиях между ЦО классов А и В в отношении устройства кислород-редуктазного центра, что дает основания предполагать возможность различий в механизмах транслокации протонов оксидазами разных классов.

Апробация работы. Результаты докладывались на научном семинаре НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского (2010), на 14-й (Москва, 2006) и 16-й (Варшава, 2010) Европейских конференциях по биоэнергетике, XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых международных журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 3 таблицы и 38 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследовали нативный цитохром Ьсц из Т. thermophilic (Giuffre, 1999), рекомбинантный фермент с гистидиновой «ручкой» и мутантную форму А120Т, выделявшиеся по методике (Werner, 2010), а также цитохромоксидазу аау из митохондрий сердца быка, выделенную по методу (Fowler, 1962).

Спектры поглощения записывали на спектрофотометрах CaryBio-300 («Varian», США) и SLM-Aminco 2000С (США), спектры КД и МКД - на спектрофотометре «Chiroscan» (Applied Photophysics, Великобритания). Быструю кинетику связывания цианида оксидазой Ъщ изучали на спектрофотометре быстрого смешивания SX20 (Applied Photophysics, Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1, Общие характеристики оксидазы ¿а3 из Т. thermophilus.

Эяшматическая активность нативного и рекомбинантного ферментов практически не различается. С искусственными донорами электронов (аскорбат с ТМФД или ДАД, НАДН с ФМС) активность низка (1-6 с"', 22°С, ионная сила 25 мМ) и увеличивается при добавлении природного донора электронов -цитохрома с552 (~15 с"1 при 22°С). Следует помнить, что оптимум работы фермента (~ 500 с"1) достигается при ~ +60°С и нулевой ионной силе (Giuffre, 1999). Перенос электронов ферментом, встроенным в липосомы, сопряжен с образованием на мембране Дм/ и ускоряется разобщителями окислительного фосфорилирования.

Спектральные свойства. Спектры поглощения окисленной и восстановленной форм цитохрома Ьа} заметно отличаются от спектров митохондриальной ЦО (Рис. I). Это объясняется, в первую очередь, различием типов низкоспинового гема в этих ферментах (Ь и а, соответственно). В области Соре восстановленный гем Ь поглощает при 427 нм, гем а - при 444 нм. Высокоспиновый гем a32f у обеих оксидаз имеет у-максимум поглощения при 443-444 нм. В видимой области максимумы поглощения гемов Ь2' и а^ оксидазы Ьаъ еще больше отстоят друг от друга (560 и 613 нм), тогда как в митохондриальном ферменте а-полосу высокоспинового гема (согласно (Vanneste, 1966), при 602 нм) практически невозможно различить на фоне а-максимума гема cf~ (604 нм).

Рис. 1. Спектры оптического поглощении оксидаз Ьа} н яа3.

Л, Б - аэробно окисленные препараты. В, Г - препараты, восстановленные дитионитом.

Глава 2. Особенности взаимодействия цитохромоксидазы Ьа3 с лигандами.

2.1. Взаимодействие окисленной цитохромоксидазы Ьа, с лигандами

Взаимодействие оксидазы ¿а3 с лигандами существенно отличается от связывания лигандов оксидазами класса А. Прежде всего это касается окисленной формы фермента (Таблица 1). Митохондриальная оксидаза аа3 в окисленном состоянии легко взаимодействует с такими низкомолекулярными лигандами гема а33+ как цианид, сульфид, азид, перекись водорода и др. Все эги соединения взаимодействуют с ионом 1?е(Ш) гема а3 по 6-му аксиальному положению и вызывают длинноволновый сдвиг у-полосы поглощения фермента.

В то же время в окисленной форме оксидазы Ьаъ гем Дз3+ с лигандами практически не реагирует. В некоторых случаях свежевыделенная рекомбинантная оксидаза Ьаъ была способна связывать цианид, но тот же препарат не реагировал с Н202. Цитохром Ьа3 не реагирует с сульфидом и не

образует низкосииновый комплекс гема а33+ при добавлении высоких концентраций азида (100 мМ), как это типично для митохондриалыюго фермента. Интересно, что при этом азид вызывает небольшие спектральные изменения, которые в случае митохондриального фермента интерпретируются как взаимодействие лиганда с Сив2+ (Выгодина, 1985).

ЦО aai ЦО Ъаъ

н2о2 + -

KCN +

HN3 +

H2S + -

Таблица 1. Взаимодействие окисленных оксидаз с лигандами

* один из препаратов £>аз связывал цианид

*к наблюдаемые спектральные изменения типичны для связывания азида с Сив

2.2. Взаимодействие восстановленной цитохромоксидазы Ьа} с цианидом

Восстановление оксидазы Ьа3 приводит к появлению способности фермента связывать лиганды гема аз. В присутствии источника электронов цитохром bai, и митохондриальная оксидаза аа3 (или бактериальные оксидазы класса Л), легко реагирует с СО, NO, KCN, Н20;. При этом существенных различий между поведением нативной и рекомбинантной ЦО Ъаз нами обнаружено не было. Наиболее подробно мы исследовали взаимодействие восстановленной оксидазы Ъаз с цианидом. Было обнаружено, что в зависимости от условий восстановления, цитохром 6а3 образует с цианидом комплексы двух типов, различающиеся прочностью и спектральными свойствами.

2.2.1. Спектральные свойства комплексов восстановленной цитохромоксидазы baj с цианидом

Один тип комплекса образуется при добавлении цианида к оксидазе Ьа3 в присутствии слабых восстановителей (ферроцианида, восстановленной формы

ДЛД, аскорбата + ДЛД и др.), а также в присутствии более сильных восстановителей - ПАДИ или даже дитионита, если не принимать специальных мер для соблюдения строго анаэробных условий.

Рис. 2. Спектры поглощения цианидиых комплексов восстановленной ЦО

bay Абсолютные (Л, Б) и разностные (В, Г) спектры поглощения. Образец восстановлен дитионитом в присутствии 3 мкМ ФМС. K.CN добавлен в насыщающей концентрации 30 мМ. Сплошные линии (1) - эксперимент в открытой кювете; пунктир (2) - эксперимент в строго анаэробных условиях (плотно закрытая кювета, продувка аргоном).

В абсолютном спектре поглощения такого комплекса (Рис. 2, сплошные линии) видно исчезновение максимума 613 нм свободного гема а32' и появление пика при 591 нм, принадлежащего форме «з2+-СЫ. В области Соре наблюдается появление полосы при -439 нм. Разностный спектр характеризуется узкой интенсивной полосой при 591-592 нм (Д £592-614 = 24,0 мМ 'см"', полуширина 12,3 нм), минимумом при 614 нм и увеличением поглощения при 439-440 нм. Подобные изменения характерны для перехода гема д32+ из высокоспинового в низкоспиновое состояние. Величина вызванных цианидом изменений в области Соре и в видимой области практически одинакова. Эти спектральные характеристики согласуются с данными работы (Surerus, 1992). Комплекс гема a32+-CN, полученный в присутствии слабых восстановителей (ферроцианида или ДАД), имеет такие же спектральные

свойства, хотя в этом случае гем b и СиЛ частично или полностью окислены. Таким образом, спектральные характеристики цианидного комплекса тема д32+ существенно не зависят от степени восстановленное™ входных редокс-центров ЦО ba¡.

Добавление цианида к оксидазе Ьа3, восстановленной дитионитом в присутствии ФМС в плотно закрытой кювете, приводит к образованию комплекса, заметно отличающегося от описанного выше (Рис. 2, пунктир). В видимой области полоса при 591 нм смещается к 589 нм и уменьшается по амплитуде на -40%. В области Соре полоса цианидного комплекса гема а32+ заметно уширяется, и максимум разностного спектра смешается к 449 нм. Эти спектральные свойства анаэробного комплекса оксидазы 6а3 очень близки к характеристикам цианидного комплекса восстановленной дитионитом митохондриальной оксидазы. Различия между двумя типами цианидных комплексов ba-¡ наблюдаются также в спектрах КД и МКД (Рис. 3). Кроме того, два типа комплексов кардинально различаются сродством к лиганду (см. раздел 2.2.3).

200

Т2 100 о

Ъ

-« О £

-100

А 4А" " /IV449 кд

V \ч k/21

^v «V

Ч1

•Г 200 2 и

т£ О

е

-«.200

400

425 450 47

Длина волны,нм

Рис. 3. Спектры кругового и магнитного кругового дихроизма двух ипаниднмх комплексов оксидазы Ьа}. 550 575 600 Условия, как на Длина волны,нм рис 2

Б Т МКД

Л 594

\ 579

■563 2

2.2.2. Кинетика связывания цианида восстановленным гемом я/ цитохромоксидазы Ьа3.

В присутствии различных доноров электронов (ферроцианид, ДАД, НАДН) гем а32* цитохрома Ьаг полностью связывается с цианидом уже при микромолярных концентрациях лиганда (Рис. 4). Реакция протекает с кинетикой, близкой к моноэкспоненциальной, скорость ее пропорциональна концентрации КСЫ и характеризуется константой скорости второго порядка ~

110 М"-с'1 (панель Б), что близко к константе скорости связывания цианида с восстановленной ЦО митохондрий.

Рис. 4. Кинетика связывания цианида оксидазой ¿я; в присутствии ДАД.

Л - кинетика образования цианидного комплекса. Б - зависимость скорости образования цианидного комплекса от концентрации лнганда. Доля фермента, образовавшего цианидный комплекс, определялась слектрофо гомегрически по ЛАя2-$7<,- В качестве донора электронов использован 2 мМ восстановленный ДАД. Аэробные условия, рН 7,6.

Образование комплекса цианида с цитохромоксидазой ¿а3, восстановленной дитионитом с ФМС в анаэробных условиях, характеризуется высоким значением Кд ~ 0,7 мМ (см. ниже), поэтому кинетика процесса была исследована при высоких концентрациях лиганда с помощью метода быстрого смешивания. Развитие во времени спектральных изменений в ответ на добавление 20 мМ КСЫ показано на Рис 5А.

Рис. 5. Кинетика связывании цианида с цитохромоксидазой Ьсв анаэробных условиях. В спектрофотометре быстрого смешивания оксидазу Ьа}, восстановленную избытком дитионита натрия и 3 мкМ ФМС, смешивали с равным объемом раствора 1C.CN, содержащего дитионит. Конечные концентрации: - 3,5 мкМ; КСЫ -20 мМ.

Исчезновение полосы свободного восстановленного гема а^' при 614 нм сопровождается появлением максимума цианидного комплекса при 589-590 нм. Процесс по меньшей мере двухстадиен, как в видимой области (Рис. 5), так и в полосе Соре (не показано) и при разложении на 2 экспоненты характеризуется к1 = 3.6 с"1 и к2 = 0.05 с"1 (Рис. 5Б). Величина к1 при 20 мМ цианида соответствует константе скорости второго порядка к0„ ~ 170 М"'-с"', близкой к таковой в присутствии диаминодурола (Рис. 4).

2.2.3. Сродство восстановленного гема я3г+ цитохромоксидазы Ьа} к цианиду.

Аэробный комплекс. Цианидный комплекс гема а32+, возникающий в аэробных условиях, характеризуется чрезвычайно прочным связыванием лиганда. Как видно из Рис. 4, цитохром баз в присутствии ДАД и 50 мкМ цианида через 15-20 минут полностью переходит в связанную форму. В присутствии ферроцианида оксидаза Ьаз полностью переходит в цианидный комплекс даже без добавления цианида (Калинович, 2010), извлекая лиганд из гексацианидного комплекса Ре(Н). Прямая количественная оценка прочности связывания при таком высоком сродстве (например, путем титрования) осложняется медленностью реакции при низких концентрациях лиганда, в связи с чем были использованы другие подходы. Было найдено, что в соотношении 1:1 оксидаза Ьа3 полностью экстрагирует цианид из цианидного комплекса метмиоглобина (Кд около 1,2мкМ(УегР1ое§, 1968)). Эксперименты с использованием в качестве цианидного буфера смеси метмиоглобина с КСЫ (11:1) показали, что в присутствии 0,1 мкМ свободного цианида гем а32+, при достаточно длительной инкубации, практически полностью переходит в форму цианидного комплекса. Это позволяет оценить верхнюю границу сродства цианида к гему йз2+величиной Кд <10"8М.

В исследованном диапазоне условий связывание цианида с гемом яз2+ является практически необратимым. Наблюдать сколь-либо заметную диссоциацию комплекса не удается. На Рис. 6 показаны результаты

эксперимента, в котором к полностью сформированному комплексу добавили избыток кобаламина (III), являющегося эффективной ловушкой для цианида

(Кд ~ 10-12 М (Brodcrick, 2006)). Распада цианидного комплекса цитохрома Ьа3 не происходит даже за 6 суток, за исключением примерно 10% комплекса, диссоциирующего с k^ ~ 5,6» 10"6 с'1. Для небольшой части комплекса, подвергающейся диссоциации, соотношение koff/kon дает верхний предел Кд < 5*10"8 М, что согласуется с данными равновесных экспериментов с использованием цианидного комплекса метмиоглобина. В контрольном эксперименте добавление в тех же условиях кобаламина к цианидному комплексу метмиоглобина вызывает распад комплекса с k^- ~ 1,3*10"4 с"' (Рис. 6Б), что хорошо соответствует литера17рным данным (Brancaccio, 1994).

оЮО

с

2

о

х

150

х

4 s

X

га

5 о

^ . А

оксидаза

Ьа Г

з ;

50 100 150 Время, ч

200

100 200 Время, мин

300

Рис. 6. Диссоциация аэробного цианидного комплекса восстановленной оксидазы Ьа}.

А - распад цианидного комплекса оксидазы bai (4,7 micM) в присутствии кобаламина (60 мкМ). 15 мкМ KCN, рН 7,6, в качестве восстановителя использован 50 мкМ НАДИ. Б - контрольный эксперимент: диссоциация цианидного комплекса метмиоглобина (8,6 мкМ). рН 7,0, остальные условия, как на панели А.

Анаэробный комплекс. Комплекс, образующийся при добавлении KCN к оксидазе Ьаъ восстановленной дитионитом с ФМС в анаэробных условиях (плотно закрытая кювета, в раствор KCN добавлен дитионит), характеризуется низким сродством к цианиду. Связывание лиганда в этом случае легко обратимо и титруется с Кд = 0,7 мМ. (Рис. 7). Эта величина близка к Кд цианидного комплекса восстановленной митохондриальной ЦО, определенной нами в тех же условиях (Кд около 0,4 мМ).

25

Титрование цианидом цитохромов ba¡ и «а, в присутствии 25 мМ дитнонита натрия и 3 мкМ ФМС, рН 7,6. Продувка аргоном, плотно закрытая кювета, K.CN добавлялся из анаэробного исходного раствора. По оси ординат отложена ДА589.614 (ba-¡) и ДЛ589.610 {aa-i).

восстановленными

цитохромоксидаз Ьа3 и аа3 типа.

Рис. 7. Связывание цианида с полностью

формами

о

5 10

[К С N J, мМ

15

Таким образом, цианидные комплексы, образующиеся при различном способе восстановления биядерного центра океидазы Ьа}, по меньшей мере на 5 порядков различаются между собой по прочности. Было найдено, что анаэробный комплекс при открывании кюветы и перемешивании легко переходит в форму с высоким сродством, несмотря на избыток в среде дитионита. Обратного превращения предобразованного прочного комплекса в форму с низким сродством и максимумом при 589 нм не удается добиться даже при длительной инкубации с избытком дитионита и ФМС в плотно закрытой кювете. Из Рис. 7 видно, что коэффициент экстинкции анаэробного цианидного комплекса океидазы 6я3 вдвое ниже, чем у океидазы аа3, а также у аэробного цианидного комплекса (см. Рис. 2).

2.3. Два типа комплексов восстановленной цитохромоксидазы Ьа$ с окисью углерода.

Рис. 8. Абсолютные спектры поглощения комплекса восстановленной океидазы Ьаъ с окисью углерода, полученные через 1 мин после продувки СО (1) и через 24 для инкубации на воздухе (2). 1,4 мкМ ЦО Ааз восстановлена 20 мМ дитионитом натрия с 3 мкМ ФМС.

400 425 450 475 Длина волны, нм

525 550 575 600 625 Длина волны, нм

Нами было обнаружено также два разных комплекса оксидазы 6а3 с СО (Рис. 8). Один из них образуется при взаимодействии полностью восстановленного фермента с избытком СО и аналогичен описанному в литературе (Рис. 8, кривые 1). При длительной инкубации комплекса на воздухе его спектр претерпевает значительные изменения и через несколько дней становится практически не отличим от спектра «прочного» цианидного комплекса (Рис. 8, кривые 2). Далее комплекс остается стабильным в течение всего срока наблюдения (до двух месяцев), не считая постепенного окисления гема Ь. Спектры КД и МКД подтверждают сходство аэробных комплексов а32+-СО и a3:'-CN в оксидазе ba¡. Низкотемпературные спектры ЭПР показали, что в аэробном СО-комплексе «невидимая медь» Сив находится в окисленном состоянии.

Глава 3. Гемосопряжеиные ионизируемые группы цитохромоксидазы ba¡.

В главе описаны результаты исследования рН-зависимости свойств гемовых центров фермента.

3.1. рН~зависимость спектров поглощения.

рН-зависимость спектральных свойств гемопротеидов обычно отражает кислотно-основную ионизацию групп в ближайшем окружении гемов, ионизация тех же групп влияет, как правило, на способность гемов к редокс-зависимому протонированию. Найдено, что влияние рН на спектральные свойства оксидаз аа} и резко различается. В случае оксидазы аа3 при защелачивании возникает асимметричный разностный спектр, свидетельствующий о длинноволновом сдвиге полосы Соре, и увеличивается поглощение при 606 нм (не показано), что согласуется с данными литературы и связано с изменением спектральных характеристик высокоспинового гема а3 (Paru!, 2005) - возможно, с образованием перекисного комплекса. Совершенно другой характер имеют спектральные изменения окисленной ЦО ba¡ -типа. Защелачивание вызывает симметричный разностный спектр примерно той же

амплитуды, что в случае оксидазы аа}, но указывающий на сдвиг полосы Соре в коротковолновую область.

3.2. рН-зависимость скорости связывания цианида.

Было найдено, что в оксидазе ¿>«3 скорость связывания восстановленного тема а3 с цианидом замедляется при защелачивании. Типичные результаты представлены ка Рис. 9.

Рис. 9. рН-зависимость скорости связывания цианида с цитохромом Ляз в присутствии ДАД. (А) - кинетика связывания 50 мкМ цианида с цитохромом ¿03 при различных значениях рН. (Б) - рН-зависимость скорости образования комплекса. Через экспериментальные точки проведены теоретические кривые, соответствующие следующим случаям: 1 - протонированный фермент (рКа = 9,3) связывает НСК; 2 - протонированный фермент (рКа = 8,75) связывает как НСЫ, так и С>Г; 3 - протонированный фермент (рКа <7) связывает СЬГ; 4- с баз, независимо от ионизации фермента, связывается НСЫ.

При постоянной концентрации лиганда скорость реакции замедляется в шесть раз при защелачивании среды от рН 7,4 до рН 9,5. Наблюдаемое замедление нельзя объяснить ионизацией НСЫ (рК=9,2) и избирательным взаимодействием фермента с анионом СЬГ (кривая 3 на Рис. 9Б); таким образом, эффект связан с ионизацией 1-рупп(ы) фермента. Хорошее соответствие экспериментальным данным дают две простейшие модели: взаимодействие протонированной формы фермента (рКа = 9.3) с НСИ (кривая 1), либо реакция протонированной формы фермента (рКа = 8.75) как с НСИ, так и с С1\Г (кривая 2). Как можно видеть из Рис. 9Б, чтобы достоверно различить эти два варианта, необходимы эксперименты в области рН > 10.

Глава 4. Свойства мутаитной формы оксидазы Ьа3 с заменой А120Т в кислородном канале.

Вопрос о том, как лиганды попадают в активный центр оксидаз, практически не исследован. Затруднения в связывании лигандов с окисленной формой оксидазы Ьа}, описанные в Главе 2, могли бы объясняться проникновением лигандов в кислород-редуктазный центр фермента через кислородный канал, который открывается только при восстановлении биядерного центра. В связи с этим представлялось интересным исследовать влияние аминокислотных замен в кислородном канале на свойства фермента, включая взаимодействие оксидазы Ьа3 с лигандами. Подобные работы в литературе отсутствуют. В качестве первого этапа исследований нами в совместной работе с лабораторией Б.Людвига в Биоцентре Университета им. Гете (Франкфурт) был получен и исследован мутант AI20T с заменой одной из гидрофобных аминокислот в кислородном канале на более гидрофильный аналог с близкими размерами бокового заместителя.

Между свойствами мутантой формы и ферментом дикого типа были найдены некоторые различия. Активность солюбшшзированной мугантной ЦО Ьа3 составляет 50-60 % от активности фермента из штамма дикого типа. Кроме того, имеются различия в спектрах поглощения: в окисленной оксидазе А120Т наблюдается небольшой максимум при 582 нм, который растет при восстановлении. При этом поглощение свободного восстановленного гема а3 уменьшается как в области Соре (443 нм), так и в видимой области (613 нм) на 30-50 %, что коррелирует со сниженной активностью мутанта.

Было исследовано взаимодействие мутантной ЦО Ьаз А120Т с цианидом и СО, но больших отличий от «дикого типа» обнаружено не было. В частности, мутация не влияет на степень фотодиссоциации СО после вспышки лазера и кинетику последующей темновой рекомбинации СО. Для формы А120Т не удалось получить анаэробный цианидный комплекс с низким сродством, однако сколь существенно это обстоятельство, пока сказать трудно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты работы свидетельствуют, что между свойствами центра восстановления кислорода в оксидазе Ьа3 (оксидаза класса В) и в митохондриальной оксидазе асц (оксидаза класса А) имеются существенные различия. Эти различия ярко проявляются в реакционной способности кислород-редуктазного центра по отношению к лигандам гема а}. Оксидазы класса А в окисленном состоянии легко взаимодействуют с низкомолекулярными лигандами гема 03 - цианидом, перекисью водорода, азидом, сульфидом, тогда как окисленная оксидаза Ъаъ либо вообще не реагирует с этими лигандами, либо взаимодействует необычно. Восстановление оксидазы Ьа3 сопровождается появлением способности

2г д

связывать лиганды гема а3 так же легко, как и в оксидазах класса А. Возникает предположение, что окисление оксидазы Ьа3 сопровождается изменениями в активном центре, закрывающими доступ лигандов к гему «3.

В одном из препаратов оксидазы 6я3 нам удалось наблюдать способность к связыванию цианида с окисленной формой фермента с образованием обычного комплекса аз^'-СМ. Но тот же препарат по-прежнему не взаимодействовал с Н2О2, сульфидом и не давал низкосяинового комплекса с азидом. Интересно отметить, что из перечисленных соединений НОМ имеет минимальный размер. Представляется вероятным, что проникновение низкомолекулярных лигандов в активный центр, как и проникновение естественного субстрата — кислорода, осуществляется через «кислородный канал», хорошо различимый в трехмерной структуре оксидазы Ъа3. Можно предположить, что этот канал при окислении ЦО закрывается или сужается, так что лишь имеющий минимальные размеры цианид в некоторых препаратах способен проникать через возникающий барьер. При восстановлении фермента канал открывается, и биядерный центр становится доступен для 02, СО и других лигандов.

Редокс-зависимое стерическое перекрывание кислородного канала могло бы оптимизировать работу фермента в условиях низких концентраций

кислорода, например, предотвращая заполнение канала в бездействующем окисленном ферменте водой, которая будет препятствовать быстрой диффузии кислорода к восстановленному тему ¿13 после прихода в биядерный центр электронов.

С целью проверки такой возможности была начата работа по мутагенезу остатков в кислородном канале цитохромоксидазы ¿д3. На сегодня нами получен только один мутант такого рода с заменой А120Т во входе в кислородный канал, и эта замена не повлияла существенно на скорость связывания яигандов с биядерным центром. Следует отметить, что кислородный канал в оксидазс Ьа3 имеет У-образную разветвленную форму с двумя выходами вглубь мембраны. Возможно, для выявления заметных эффектов необходимо произвести замены в обоих выходах канала.

Взаимодействие с лигандами восстановленного гема я3. Восстановленная оксидаза Ъа} легко взаимодействует с лигандами гема а32+: СО, N0, цианидом. Однако и тут наблюдаются существенные отличия от оксидаз класса А. В частности, гем оксидазы Ъаъ образует с КСН и с СО два типа комплексов. Сопоставление с литературными данными позволяет предложить следующую интерпретацию наших результатов.

В присутствии сильного восстановителя (дитионита) в анаэробных условиях образуется цианидный комплекс фермента, в котором все 4 редокс-центра восстановлены: СиА1+, сц'\ Сив'+- Этот комплекс с максимумом поглощения при 589 нм и с низким сродством к цианиду (Кд=0.7 мМ) похож на цианидный аддукт восстановленной митохондриальной оксидазы. Важно отметить, что при близкой форме слектра его молярная интенсивность в оксидазе 6а3 всегда на 30-40% ниже, чем в случае митохондриального фермента. По-видимому, в оксидазе типа Ьа3 связанный в кислород-редуктазном центре цианид способен присоединяться как к гему аз2+, так и к Сив+, подобно тому, как это было ранее показано в отношении СО методом ИК-спектроскопии (КоШзоираЫэ, 2002): [<з32+-СЫ Сив+ «-» а32' ЫС-Сив+]. Между этими двумя формами устанавливается равновесие -2:1, что близко к константе

равновесия, наблюдаемой для комплекса Ъаъ с СО. В восстановленной же митохондриалыюй оксидазе и других оксидазах класса А весь связанный в активном центре HCN находится на теме и, соответственно, молярная интенсивность полосы поглощения комплекса выше, чем у оксидазы Ъаъ.

Цианидный комплекс, образующийся в аэробных условиях, характеризуется максимумом поглощения при 592 нм и почти в два раза более высоким коэффициентом молярной экстинкции, а также очень высоким сродством лиганда к гему а32+. Сопоставление с литературными данными позволяет заключить, что в этом комплексе Сив окислена, что и объясняет как прочность связывания лиганда, так и отсутствие спектрально невидимой формы (я327Сив+-СМ). Представляются вероятными две структуры цианидного комплекса частично восстановленной оксидазы типа Ьа2.

В работе (Surerus, 1992) предполагалось, на основании данных ENDOR-спектроскопии, что в аэробном комплексе оксидазы èaj с ферментом связываются 2 молекулы цианида, образуя продукт а3 '-CN/Cub2"-CN. Прочное связывание лиганда с окисленной медью могло бы «запирать» в активном центре лиганд, сидящий на геме аз2+. Альтернативная возможность заключается в связывании одной молекулы лиганда, которая образует мостик между восстановленным гемом а3 и окисленной Сив: a32<-CN-CuB2+. Подобный тип связи аналогичен прочному связыванию цианида в активном центре оксидаз класса A: a33+-CN-CuB2+ (либо a33'-CN-CuB+).

В полностью восстановленном цианидном комплексе Ъаъ Сив, по всей видимости, сохраняет аутооксидабельность, поэтому даже кратковременный контакт комплекса со следами кислорода приводит к окислению Сив и образованию стабильного цианидного комплекса с участием Сив2+; в таком комплексе даже столь сильный восстановитель как дитионит не всегда может обеспечить переход Сив2+ в восстановленное состояние. Аналогичная ситуация наблюдается в отношении цианидного комплекса полностью восстановленной митохондриальной ЦО. Этот комплекс также неустойчив, но в этом случае ключевую роль играет аутооксидабельность не только Сив, но и гема а3\ при

малейшем контакте с кислородом, даже в присутствии избытка дитионита, фермент практически необратимо переходит в прочный цианидный мостиковый комплекс а^ - CN Сип2^ (либо а^ - CN -Сиа ').

Возможно, что образование прочного аэробного комплекса оксидазы Ьа3 с СО также обусловлено окислением CuB+—» Cuu2+, которое «запирает» СО, связанный с гемом д32+ в активном центре. Такой эффект может объясняться потребностью в восстановленной форме Сив, как в промежуточном центре посадки СО на пути его выхода из фермента, либо тем, что окисление Сиц+ и является фактором, который индуцирует обсуждавшиеся выше конформационные изменения, ведущие к стерическому перекрыванию доступа лигандов в кислород-редуктазный центр окисленного фермента.

Гемосопряженные группы. Выявление гемосопряженных групп в дыхательных оксидазах важно, поскольку такие группы являются наиболее вероятными участниками редокс-зависимой транслокации протонов. Наши опыты показывают, что в окружении кислород-редуктазного центра оксидазы Ьа^ имеются гемосопряженные ионизируемые группы, влияющие на спектральные свойства фермента и на его реакционную способность по отношению к лигандам. Эти группы проявляют себя существенно иным образом, чем в оксидазах класса А, что является еще одним аргументом в пользу возможности разных протондвижущих механизмов в оксидазах разных классов.

В частности, обнаружен противоположный характер рН-зависимых изменений в спектре поглощения окисленных ферментов из митохондрий и из T. thermophilus. Возможной причиной может быть присутствие разных эндогенных лигандов в биядерных центрах окисленных ферментов разных классов. На рентгеновских структурах видно, что в каталитическом центре окисленной оксидазы ааъ присутствуют два атома кислорода, тогда как у оксидазы bai - только один.

К сожалению, в этой работе мы не успели снять подробную рН-зависимость и определить рКа группы, ответственной за спектральный сдвиг

окисленного фермента. В случае восстановленного фермента был определен рКа ~ 9.0 группы, контролирующей скорость присоединения цианида к тему

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы свойства нативной и рекомбинантной форм цитохромоксидазы ¿«3 из бактерии Пегти.ч ¡ЬегторкИич с помощью спектроскопии поглощения, кругового дихроизма и магнитного кругового дихроизма.

2. Связывание лигандов с кислород-редуктазным центром цитохромоксидазы баз из Т. ЛегторЫш (ЦО класса В) существенно отличается от реакции с цитохромоксидазой ааъ митохондрий (ЦО класса А).

3. Восстановленная форма цитохромоксидазы Ьа} легко сзязывает типичные лиганды гемового железа, но в окисленной форме взаимодействие фермента с лигандами затруднено, тогда как оксидазы класса А взаимодействуют с лигандами как в восстановленной, так и окисленной формах.

4. В отличие от митохондриальной оксидазы, оксидаза Ьа3 образует два цианидных комплекса гема а32+, различающиеся сродством к лиганду и спектральными свойствами:

в присутствии дитионита в строго анаэробных условиях формируется комплекс гема + с низким сродством к цианиду (Кд ~ 0,7 мМ), похожий на цианидный комплекс восстановленного гема а3 цитохромоксидазы митохондрий (Кд ~ 0,4 мМ);

в присутствии слабых восстановителей образуется цианидный комплекс гема а32+ с необычно высоким сродством (Кд ^ 5»10"8 М), не имеющий аналогов среди известных оксидаз.

5. Сопоставление результатов с литературными данными показывает, что в строго анаэробных условиях образуется непрочный комплекс полностью восстановленного фермента: [а32+-СН Сив+ <-> СЫ-Сив'], тогда как при

неполном восстановлении возникает прочный аддукт, имеющий структуру [а/+-СЫ-Сив2+] либо [a32+-CN CuB2+-CN].

6. Кинетика связывания цианида с восстановленным гемом а3 в оксидазе Ъаъ характеризуется константой скорости второго порядка ~102 М"'с"', независимо от типа комплекса.

7. Скорость связывания цианида с восстановленным гемом а} контролируется ионизируемой группой фермента с рКа ~ 9.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А. Калинович. Н. Ацаркина, Т.В. Выгодина, Т. Сулиман, А.А. Константинов. Особенности связывания цианида с цитохромоксидазой типа Ьа3 из термофильной бактерии Thermus thermophilus. Биохимия, 2010. 75(3): С. 419-

2. A. Dyuba, A.Arutyunyan, Т. Vygodina, N. Azarkina, А. Kalinovich, Y. Sharonov, A. Konstantinov. Circular dichroism spectra of cytochrome с oxidase. Metallomics, 2011.2(1): C. 1-16.

3. A. Kalinovich, N. Azarkina, A.A. Konstantinov. Cyanide binding to cytochrome bay is controlled by intraprotein protonation. Abstr. 14-th European bioenergetics conference (Moscow), Biochim. et Biophys. Acta, 2006, V. 14, P. 183-4.

4. A.B. Калинович. Взаимодействие гем-медпых терминальных оксидаз группы В с цианидом. XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 2007, с. 10.

5. A.B. Калинович, Н.В. Ацаркина, A.A. Константинов. Особенности взаимодействия с цианидом терминальных оксидаз типа В. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, с. 320.

6. A.V. Kalinovich, N.V. Azarkina, T.V. Vygodina, Т. Soulimane and A.A. Konstantinov. Pecularities of cyanide binding to баз-type cytochrome oxidase from a thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Abstr. 16-th European bioenergetics conference (Warsaw, Poland), 2010, Biochim. Biophys. Acta, V.1797, S.l, P.96.

430.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 01.03.2011 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калинович, Анастасия Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика цитохромоксидазы. Митохондриальная 8 цитохромоксидаза типа ааз.

1.1. Общий план строения

1.2. Механизм функционирования цитохромоксидазы

1.3. Взаимодействие с лигандами

1.3.1. Взаимодействие окисленной митохондриальной оксидазы с 17 лигандами

1.3.2. Взаимодействие восстановленной митохондриальной оксидазы с лигандами.

1.4. Классификация семейства гем-медных оксидаз

Глава 2. Цитохромоксидаза Ьаз из T. thermophilus.

2.1. Общие свойства и особенности структуры оксидазы bai

2.2. Особенности функционирования оксидазы Ъа3.

2.3. Особенности взаимодействия с лигандами оксидазы Ьаъ. 32 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы

1.1. Реактивы и растворы.

1.2. Препараты ферментов

2. Методы исследования

2.1. Получение препарата рекомбинантной ЦО Ьаъ из T. thermophilus

2.2. Создание мутантной ЦО bas из T. thermophilus

2.3. Получение протеолипосом

2.4. Оптические измерения

2.5. Калориметрические измерения

2.6. Измерение активности фермента

2.7. Измерение генерации потенциала цитохромоксидазой Ьаз на 42 протеолипосомах

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. Общие характеристики цитохромоксидазы Ъа^ из T. thermophilus

Глава 2. Особенности взаимодействия цитохромоксидазы Ьаз с лигандами

2.1. Взаимодействие окисленного гема аз + цитохромоксидазы Ьаз с 50 лигандами

2.2. Взаимодействие восстановленного гема аз цитохромоксидазы Ъа$ с 53 цианидом.

2.2.1. Спектральные свойства комплексов восстановленной 54 цитохромоксидазы Ьаз с цианидом

2.2.2. Кинетика связывания цианида восстановленным гемом 58 цитохромоксидазы Ьа3.

2.2.3. Сродство восстановленного гема а32+ цитохромоксидазы Аа3 к 60 цианиду.

2.3. Два типа комплекса восстановленной цитохромоксидазы Ьаз с окисью 76 углерода

Глава 3. Гемосопряженные ионизируемые группы цитохромоксидазы Ьаз

3.1. рН —зависимость спектров поглощения.

3.2. рН-зависимость скорости связывания цианида восстановленной 84 цитохромоксидазой Ьаз

Глава 4. Особенности мутантной формы оксидазы Ьаз по кислородному каналу

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности устройства цитохромоксидазы ba3 из термофильной бактерии Thermus thermophilus"

Актуальность темы

Цитохромоксидаза (ЦО) — терминальный фермент дыхательной цепи митохондрий и многих бактерий, катализирующий восстановление кислорода цитохромом с, сопряженное с образованием трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода.

Большинство терминальных оксидаз относят к так называемому гем-медному семейству, в котором по современной классификации выделяют группы А, В и С, главным образом, на основании особенностей устройства протонных каналов [1], что коррелирует также со многими функциональными свойствами ферментов. К группе А принадлежат наиболее изученные оксидазы: ЦО митохондрий и многие бактериальные оксидазы. Они содержат по крайней мере два протонных канала - К- и О-каналы.

Терминальные оксидазы группы В исследованы в гораздо меньшей степени. Главным образом их находят у экстремофильных микроорганизмов. Самым изученным представителем группы является ЦО типа ¿аз из термофильной эубактерии ТЬегтт ^егторИИиз, единственный фермент группы, для которого расшифрована трехмерная структура. Он содержит только один канал, гомологичный К-каналу оксидаз класса А, однако, не имеющий практически ни одного общего с ними аминокислотного остатка. Оксидаза Ьа3 помпирует протоны с меньшей стехиометрией, по сравнению с оксидазами класса А (0,5 Н7ё и 1 Н+/ё, соответственно) [2].

До сих пор не раскрыт механизм сопряжения переноса электронов с переносом протонов у цитохромоксидазы. Вероятно, механизм помпирования протонов у оксидаз различных групп различный. Представляет интерес вопрос, коррелирует ли различное устройство протонных каналов с другими свойствами оксидаз, в частности с устройством каталитического центра.

Наиболее древними оксидазами являются оксидазы класса С, оксидазы класса В появились в эволюции позднее, и самыми «молодыми» считаются оксидазы класса А [1]. Сравнение различных оксидаз, эволюционно отстоящих далеко друг от друга, важно, с одной стороны, для выявления общих закономерностей, сохранившихся в процессе эволюции, а значит наиболее важных, а с другой стороны, для выявления отличий, связанных с адаптацией организмов к тем или иным условиям (высоким температурам, низким значениям рН и др.).

Большой вклад в изучение устройства каталитического центра и функционирования фермента вносит исследование взаимодействия фермента с различными лигандами, 5 выполняющими роль модельных экспериментов для связывания естественного субстрата — кислорода [3, 4].

Уже в первоначальных исследованиях ЦО были обнаружены существенные отличия ее поведения от ферментов группы А по отношению к типичным экзогенным лигандам терминальных оксидаз, что, несомненно, имеет прямое отношение к механизму реакции с естественным лигандом — кислородом.

Считается, что ключевым элементом в механизме сопряжения электронов и протонов являются гемосопряженные ионизируемые группы. Восстановление редокс-центров приводит к изменению рК этих групп, в результате чего запускается протонный транспорт. Связывание лигандов, как правило, является рН-зависимым процессом, контролируемым протонированием неких групп фермента. Вполне вероятно, что одни и те же белковые группы контролируют и связывание лигандов в каталитическом центре, и протонный транспорт. Изучение рН-зависимости связывания лигандов позволяет обнаружить такие группы. I

Изучение взаимодействия лигандов с цитохром с оксидазой интересно также с точки зрения токсикологии. Отравления такими лигандами, как цианид, СО, азид, вызваны образованием прочных комплексов с гемопротеидами, главным образом с цитохромоксидазой.

Повышенный интерес к данной теме в последнее время связан с обнаружением большого физиологического значения некоторых лигандов цитохромоксидазы (например, NO), а также важной роли цитохромоксидазы в их депонировании и регуляции концентрации

5, 6].

Цель работы

Целью настоящей диссертационной работы являлось исследование особенностей устройства каталитического центра цитохромоксидазы Ъаз из Thermus thermophilus в сравнении с митохондриальной оксидазой аа3.

Основные задачи исследования:

1. сопоставить оптические характеристики гемовых центров оксидазы èa3 Т. thermophilus со спектральными свойствами оксидаз аа3 типа;

2. изучить связывание окисленной ЦО ba3 с лигандами трехвалентного железа гема а3 (цианидом, перекисью водорода, азидом);

3. изучить взаимодействие восстановленной ЦО Ьаз с цианидом и СО;

4. выявить наличие гемосопряженных ионизируемых групп в ЦО типа баз;

5. выявить возможную роль «кислородного канала» в проникновении лигандов в кислород-редуктазный центр оксидазы типа Ьа3.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Результаты исследования каталитического центра ЦО баз из Т. ЖегторкПиз, изложенные в настоящей работе, получены впервые.

Обнаружено, что цитохром Ьаз образует два разных цианидных комплекса с восстановленным гемом аз, формирование которых определяется условиями восстановления фермента.

При полном восстановлении в строго анаэробных условиях образуется комплекс, сходный с митохондриальным аналогом как сродством (Кд = 0,7 мМ), так и спектральными характеристиками.

В присутствии слабых восстановителей гем а32+ образует с цианидом спектрально иной и практически недиссоциирующий (Кд < 5* 10"8 М) аддукт.

Обнаружены также два типа комплексов оксидазы Ьаз с СО, один из которых, формирующийся в условиях частичного окисления, напоминает прочный цианидный комплекс.

Впервые исследована кинетика взаимодействия КСЫ с восстановленной оксидазой Ьаз. Обнаружена рН-зависимость скорости связывания гема + с цианидом и показано, что связывание лиганда контролируется протонированием гемосопряженной ионизируемой группы белка с рКа около 9.

Совокупность полученных данных свидетельствует о значительных различиях между ЦО классов А и В в отношении устройства кислород-редуктазного центра, что даст основания предполагать возможность различий в механизмах транслокации протонов оксидазами разных классов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Калинович, Анастасия Валерьевна

выводы

1. Охарактеризованы свойства нативной и рекомбинантной форм цитохромоксидазы ба3 из бактерии Thermus thermophilus с помощью спектроскопии поглощения, кругового дихроизма и магнитного кругового дихроизма.

2. Связывание лигандов с кислородредуктазным центром цитохромоксидазы баз из Т. thermophilus (ЦО класса В) существенно отличается от реакции с цитохромоксидазой аа3 митохондрий (ЦО класса А).

3. Восстановленная форма цитохромоксидазы ба3 легко связывает типичные лиганды гемового железа, но в окисленной форме взаимодействие фермента с лигандами гема аз3+ затруднено, тогда как оксидазы класса А взаимодействуют с лигандами как в восстановленной, так и окисленной формах.

4. В отличие от митохондриальной оксидазы, оксидаза ба3 образует два цианидных комплекса гема аз2+, различающиеся сродством к лиганду и спектральными свойствами: в присутствии дитионита в строго анаэробных условиях формируется комплекс гема ji а3 с низким сродством к цианиду (Кд ~ 0,7 мМ), похожий на цианидный комплекс восстановленного гема a-¡ цитохромоксидазы митохондрий (Кд ~ 0,4 мМ); в присутствии слабых восстановителей в аэробных условиях образуется цианидный комплекс гема а32+ с необычно высоким сродством (Кд < 5-10"8 М), не имеющий аналогов среди известных гем-медных оксидаз.

5. Сопоставление результатов с литературными данными показывает, что в строго анаэробных условиях образуется непрочный комплекс полностью восстановленного фермента: [a32+-CN" Сив+ <-> аз2+ CN"-CuB+], тогда как при неполном восстановлении возникает прочный аддукт, имеющий структуру [a32+-CN"-CuB2+] либо [a32+-CNV CuB2+-CN"].

6. Кинетика связывания цианида с восстановленным гемом а3 в оксидазе баз

2 11 характеризуется константой скорости второго порядка ~10 М" -с" , независимо от типа комплекса. . ,.,„, ^ ,. ,

7. Скорость связывания цианида с восстановленным гемом а3 контролируется ионизируемой группой фермента с рКа ~ 9.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калинович, Анастасия Валерьевна, Москва

1. Pereira, М.М., М. Santana, and М. Teixeira, A novel scenario for the evolution of haem-copper oxygen reductases. Biochim. Biophys. Acta, 2001. 1505(2-3): p. 185-208.

2. Kannt, A., et al., Electrical current generation and proton pumping catalyzed by the Ьаз-type cytochrome с oxidase from Thermus thermophilus. FEBS Lett., 1998. 434: p. 17-22.

3. Muramoro, K., et al., Bovine cytochrome с oxidase structures enable O2 reduction with minimization of reactive oxygens and provide a proton-pumping gate. PNAS, 2010. 107(17): p. 7740-5.

4. Koutsoupakis, C., et al., Observation of the equilibrium Сив-СО complex and functional implications of the transient heme аз propionates in cytochrome bayCO from Thermus thermophilus. J. Biol. Chem., 2002. 277(36): p. 32860-6.

5. Осипов, A.H., Г.Г. Борисенко, and А. Владимиров, Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов. Успехи биологической химии, 2007. 47: С. 259-292.

6. Unitt, D.C., et al., lnactivation of nitric oxide by cytochrome с oxidase under steady-state oxygen conditions. Biochim Biophys Acta, 2010. 1797: p. 371-7.

7. Mitchell, P., Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature, 1961.191: p. 144-148.

8. Tsukihara, Т., et al., The low-spin heme of cytochrome с oxidase as the driving element of the proton-pumping process. PNAS, 2003.100(26): p. 15304-9.

9. Tsukihara, Т., et al., The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome с oxidase at 2.8 A. Science, 1996. 272: p. 1136-1144.

10. Yoshikawa, S., et al., Redox-coupled crystal structural changes in bovine heart cytochrome с oxidase. Science, 1998. 280: p. 1723-9.

11. Ohta, K., et al., X-ray structure of the NO-bound Cub in bovine cytochrome с oxidase. Acta Crystallogr., 2010. 66(Pt. 3): p. 251-3.

12. Iwata, S., et al., Structure at 2.8 A resolution of cytochrome с oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature, 1995. 376: p. 660-9.

13. Harrenga, A. and H. Michel, The cytochrome с oxidase from Paracoccus denitrificans does not change the metal center ligation upon reduction. J. Biol. Chem., 1999. 274(47): p. 33296-9.

14. Qin, L., et al., Identification of conserved lipid detergent-binding sites in a high-resolution structure of the membrane protein cytochrome c oxidase. PNAS, 2006. 103(44): p. 1611722.

15. Svensson-Ek, M., et al., The X-ray crystal structures of wild-type and EQ(I-286) mutant cytochrome c oxidases from Rhodobacter sphaeroides. J. Mol. Biol., 2002. 321(2): p. 32939.

16. Qin, L., et al., Redox dependent conformational changes in cytochrome c oxidase suggest a gating mechanism for proton uptake. Biochem., 2009. 48: p. 5121-5130.

17. Abramson, J., et al., The structure of the ubiquinol oxidase from Escherichia coli and its ubiquinone binding site. Nat. Struct. Biol., 2000. 7: p. 910-7.

18. Soulimane, T., et al., Structure and mechanism of the aberrant b a ¡-cytochrome c oxidase from Thermus thermophilic. EMBO J., 2000. 19(8): p. 1766-1776.

19. Hunsicker-Wang, L.M., et al., A novel cryoprtection scheme for enhancing the diffraction of crystals of recombinant cytochrome ba$ oxidase from Thermus thermophilus. Biol. Crystallogr., 2005. 61(Pt. 3): p. 340-3.

20. Buschmann, S., et al., The structure of cbb$ cytochrome oxidase provides Insights into proton pumping. Science, 2010. 329: p. 327-30.

21. Wikstrom, M., Protn pump coupled to cytchrome c oxidase in mitochondria. Nature, 1977. 266: p. 271-273.

22. Verkhovsky, M.I., J.E. Morgan, and M. Wikstroem, Oxygen binding and activation: early steps in the reaction of oxygen with cytochrome c oxidase. Biochem., 1994. 33(10): p. 307986.

23. Siletsky, S., A. Kaulen, and A. Konstantinov, Resolution of electrogenic steps coupled to conversion of cytochrome c oxidase from the peroxy to the ferryl-oxo state. Biochem., 1999. 38: p. 4853-61.

24. Faxen, K., et al., A mechanistic principle for proton pumping by cytochrome c oxidase. Nature, 2005. 437: p. 286-9.

25. Nilsson, T., Photoinduced electron transfer from Tris(2,2 "-bipyridyl)ruthenium to cytochrome c oxidase. PNAS, 1992. 89: p. 6497-6501.

26. Drachev, L.A., et al., Lipid-impregnated filters as a tool for studying the electric current-generating proteins. Anal. Biochem., 1979. 96: p. 250-262.

27. Zaslavsky, D., A. Kaulen, and I.A. Smirnova, Flash-induced membrane potential generation by cytochrome с oxidase. FEBS Lett., 1993. 336: p. 389-393.

28. Siletsky, S., et al., Partial steps of charge translocation in the nonpumping N139L mutant of Rhodobacter sphaeroides cytochrome с oxidase with a blocked D-channel. Biochem., 2010. 49(14): p. 3060-73.

29. Farver, O., et al., Pulse radio lysis studies of temperature dependent electron transfers among redox centers in Ьаз-cytochrome с oxidase from Thermus thermophilus: comparison of A-andB-type enzyme. Biochem., 2010.

30. Константинов, A.A. Роль протонов в механизме работы пункта сопряжения III дыхательной цепи митохондрий: цитохромоксидаза как электронно-протонный генератор мембранного потенциала. Докл. Акад. наук СССР, 1977. 237(3): С. 713-6.

31. Арцатбанов, В. and A.A. Константинов, Исследования локализации цитохромоксидазы в сопрягаюей мембране: взаимодействие цитохрома а с ионами if митохондриалъного матрикса. Докл. Акад. наук СССР, 1977.1977(237): С. 2.

32. Artzatbanov, V.Y., A. Konstantinov, and V.P. Skulachev, Involvement of intramitchondrial protons in redox reactions of cytochrome a. FEBS Lett., 1978. 87(2): p. 180-5.

33. Thomas, J.W., et al., Substitution of asparagine for aspartate-135 in submit I of the cytochrome bo ubiquinol oxidase of Escherichia coli eliminates proton-pumping activity. Biochem., 1993. 32(40): p. 10923-8.

34. Pfitzner, U., et al., Cytochrome с oxidase (heme aa$■) from Paracoccus denitrificans: analysis of mutations in putative proton channels of submit I. J. Bioenerg. Biomembr., 1998. 30(1): p. 89-97.

35. Koutsoupakis, C., et al., Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for О2 inputand H20/It output channels. Biochim

36. Biophys Acta, 2004.1655: p. 347-52.

37. Vygodina, T.V., et al., Proton pumping by cytochrome с oxidase is coupled to peroxidase half of its catalytic cycle. FEBS Lett.,, 1997. 412(3): p. 405-9.

38. Namslauer, A., et al., Redox-coupled proton translocation in biological systems: proton shuttling in cytochrome с oxidase. PNAS, 2003.100(26): p. 15543-7.

39. Durr, K., et al., A D-pathway mutation decouples the Paracoccus denitrificans cytochrome с oxidase by altering the side-chain orientation of a diastant conserved glutamate. J. Mol. Biol., 2008. 384: p. 865-77.

40. Brzezinski, P. and A.L. Johansson, Variable proton-pumping stoichiometry in structural variants of cytochrome с oxidase. Biochim Biophys Acta, 2010. 1797(6-7): p. 710-23.

41. Jones, M.G., et al., A re-examination of the reactions of cyanide with cytochrome с oxidase. Biochem. J., 1984. 220: p. 57-66.

42. Hill, B.C. and S. Marmor, Photochemical and ligand-exchange properties of the cyanide complex of fully reduced cytochrome с oxidase. Biochem. J., 1991. 279: p. 355-60.

43. Antonini, E., et al., Oxygen "pulsed" cytochrome с oxidase: Functional properties and catalytic relevance. PNAS, 1977. 74(8): p. 3128-3132.

44. Brittain, T. and C. Greenwood, Kinetic studies on the binding of cyanide to oxygenated cytochrome с oxidase. Biochem., 1976. 155: p. 453-5.

45. Jensen, P., et al., Cyanide inhibition of cytochrome с oxidase. Biochem., 1984. 224: p. 82937.

46. Li, W. and G. Palmer, Spectroscopic characterization of the interaction of azide and thiocyanate with the binuclear center of cytochrome oxidase: evidence for multiple ligand sites. Biochem., 1993. 32: p. 1833-1843.

47. Выгодина, T.B. and A.A. Константинов, Взаимодействие мембранной цитохромоксидазы с низкими концентрациями азида. Влияние рН на прочность связывания лиганда. Биол.мембр. 1985.2(9): С. 861-869.

48. Parul, D., G. Palmer, and М. Fabian, Ligand trapping by cytochrome с oxidase. Implications for gating at the catalytic center. J. Biol. Chem., 2010. 285(7): p. 4536-4543.

49. Fei, M.J., et al., X-ray structure of azide-bound fully oxidized cytochrome с oxidase from bovine heart at 2.9 A resolution. Acta Crystallogr., 2000. 56(Part 5): p. 529-35.

50. Fabian, M., et al., Cyanide stimulated dissociation of chloride from the catalytic center of oxidized cytochrome с oxidase. Biochem., 2001. 40: p. 6061-9.

51. Hill, B.C., The pathway of CO binding to cytochrome с oxidase. Can the gateway be closed? FEBS Lett., 1994. 354: p. 284-288.

52. Rich, P.R. and J. Breton, FTIR studies of the CO and cyanide adducts offully reduced bovine cytochrome с oxidase. Biochem., 2001. 40(21): p. 6441-9.

53. Kalinovich, A.V., et al., Peculiarities of cyanide binding to the ba3-type cytochrome oxidase from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Biochemistry (Mosc), 2010. 75(3): p. 342-52.

54. Muntyan, M.S., et al., Role of copper during carbon monoxide binding to terminal oxidases. FEBS Lett., 1998. 429: p. 216-220.

55. Chang, H.-Y., et al., The cytochrome ba3 oxygen reductase from Thermus thermophilus uses a single input channel for proton delivery to the active site and for proton pumping. PNAS, 2009.106(38): p. 16169-73.

56. Castresana, J., et al., Evolution of cytochrome oxidase, an enzyme older than atmospheric oxygen. EMBO J., 1994. 13(11): p. 2516-25.

57. Preisig, O., et al., A high-affinity cbb3 -type cytochrome oxidase terminates the symbiosis-specific respiratory chain of Bradyrhizobium japonicum. J. Bacteriol., 1996. 178(6): p. 15328.

58. Henne, A., et al., The genotne sequence of the extreme thermophile Thermus thermophilus. Nat. Biotechnol., 2004. 22(5): p. 547-53.64.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome?Db-genome&Cmd=ShowDetailView&Termr.,oSearc h=530.

59. Meinhardt, S.W., et al., Studies on the NADH-menaquinone oxidoreductase segment of the respiratry chain in Thermus thermophilus HB-8. J. Biol. Chem., 1990. 265(3): p. 1360-8.67. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3169664.

60. Mooser, D., et al., A four-subunit cytochrome bc(l) complex complements the respiratory chain ofThermus thermophilus. Biochim Biophys Acta, 2005.1708(2): p. 262-74.

61. Mooser, D., et al., The menaquinol-oxidizing cytochrome be complex from Thermus thermophilus: protein domains and subunits. Biochim Biophys Acta, 2006. 1757: p. 108495.

62. Fee, J.A., et al., Cytochrome caa¡ from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus: a member of the heme-copper oxidase superfamily. J. Bioenerg. Biomembr., 1993. 25(2): p. 103-14.

63. Hellwig, P., T. Soulimane, and W. Maentele, Electrochemical, FT-IR and UV/VIS spectroscopic properties of the caa3 oxidase from T. thermophilus. Eur. J. Biochem., 2002. 269(19): p. 4830-8.

64. Zimmermann, B.H., et al., Properties of a copper-containing cytochrome ba¡: a second terminal oxidase from the extreme thermophile Thermus thermophilus. PNAS, 1988. 85(16): p. 5779-83.

65. Giuffre, A., et al., The heme-copper oxidases of Thermus thermophilus catalyze the reduction of nitric oxide: evolutionary implications. PNAS, 1999. 96(26): p. 14718-14723.

66. Hayashi, T., et al., Fourier transform infrared characterization of a Cus-nitrosyl complex in cytochrome ba¡ from Thermus thermophilus:Relevance to NO reductase activity in heme-copper terminal oxidases. J. Am. Chem. Soc., 2007.129(48): p. 14952-8.

67. Di Salle, A., et al., A novel thermostable sulfite oxidase from Thermus thermophilus: characterization of the enzyme, gene cloning and expression in Escherichia coli Extremophiles, 2006.10(6): p. 587-98.

68. Rami'rez-Arcos, S., L.A. Fernandez-Herrero, and J. Berenguer, A thermophilic nitrate reductase is responsible for the strain specific anaerobic growth ofThermus thermophilus HB8 Biochim Biophys Acta, 1998.1396(2): p. 215-27.

69. Cava, F., et al., A New Type of NADH Dehydrogenase Specific for Nitrate Respiration in the Extreme Thermophile Thermus thermophilus. J. Biol. Chem., 2004. 279: p. 45369-78.

70. Cava, F., et al., Control of the respiratory metabolism of Thermus thermophilus by the nitrate respiration conjugative element NCE. Mol. Microbiol., 2007. 64(3): p. 630-46.

71. Lubben, M. and K. Morand, Novel prenylated hemes as cofactors of cytochrome oxidases. Archaea have modified hemes A and O. J. Biol. Chem., 1994. 269(34): p. 21473-21479.i i

72. Fee, J.A., D.A. Case, and L. Noodleman, Toward a chemical mechanism of proton pumping by the B-type cytochrome с oxidases: application of density functional theoiy to cytochrome ba3 of Thermus thermophilic. J. Am. Chem. Soc., 2008.130: p. 15002-21.

73. Maneg, О., B. Ludwig, and F. Malatesta, Different interaction modes of two cytochrome-c oxidase Soluble Сил fragments with their substrates. J. Biol. Chem., 2003. 278(47): p. 46734-40.

74. Soulimane, Т., et al., Cytochrome-c552 from Thermus thermophilus: a functional and crystallographic investigation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997. 237(3): p. 572-6.

75. Giuffre, A., et al., Kinetic properties of ba3 oxidase from Thermus thermophilus: effect of temperature. Biochemistry, 1999.38(3): p. 1057-1065.

76. Sakaguchi, M., et al., A resonance raman band assignable to the 0--0 stretching mode in the resting oxidized state of bovine heart cytochrome с oxidase. J. Bioenerg. Biomembr., 2010. 42(3): p. 241-3.

77. Gerscher, S., et al., The active site structure of ba3 oxidase from Thermus thermophilus studied by resonance raman spectroscopy. Biospectroscopy, 1999. 5(S5): p. S53-S63.

78. Oertling, W.A., et al., Spectroscopic characterization of cytochrome ba3, a terminal oxidase from Thermus thermophilus: comparison of the a3/CuB site to that of bovine cytochrome aa3. Biochemistry, 1994. 33: p. 3128-3141.

79. Sousa, F.L., et al., Redox properties of Thermus thermophilus ba3: different electron-proton coupling in oxygen reductases? Biophysical J., 2008. 94: p. 2434-2441.

80. Todorovic, S., et al., Midpoint potentials of hemes a and a3 in the quinol oxidase from Acidianus ambivalens are inverted. J. Am. Chem. Soc., 2005.127: p. 13561-6.

81. Harmon, P.A., R.W. Hendler, and I.W. Levin, Resonance Raman and optical spectroscopic monitoring of heme a redox states in cytochrome с oxidase during potentiometric titrations. Biochem., 1994. 33(3): p. 699-707.

82. Farver, O., et al., Electrn transfer among the Сил-, heme b- and a3-centers of Thermus thermophilus cytochrome ba3. FEBS Lett., 2006. 580: p. 3417-21.

83. Siletsky, S., et al., Time-resolved single-turnover ofba3 oxidase from Thermus thermophilus. Biochim. Biophys. Acta, 2007. 1767(12): p. 1383-92.

84. Siletsky, S., et al., Time-resolved generation of membrane potential by ba3 cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus. Evidence for reduction-induced opening of the binuclear centre. FEBS Lett., 1999. 457: p. 98-102.

85. Goldbeck, R.A., et al., Magnetic circular dichroism study of cytochrome has from Thermus thermophilus: spectral contribution from cytochromes b and as and nanosecond spectroscopy of CO photodissociation intermediates. Biochem., 1992. 31(9376-87).

86. Koutsoupakis, C., T. Soulimane, and C. Varotsis, Docking site dynamics of ba^-cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus. J. Biol. Chem., 2003. 278(38): p. 36806-9.

87. Porrini, M., et al., Heme cavity dynamics of photodssociated CO from baycytochrome c oxidase: the role ofring-Dpropionate. J. Phys. Chem. B, 2009. 113: p. 12129-35.

88. Kim, Y., et al., Cyanide binding and active site structure in heme-copper oxidases: normal coordinate analysis of iron-cyanide vibrations of CtV complexes of cytochromes ba3 and aa3. Biospectroscopy, 1998. 4: p. 1-15.

89. Fowler, L.R., S.H. Richardson, and Y. Hatefi, A rapid method for the preparation of highly purified cytochrome oxidase. Biochim. Biophys. Acta, 1962. 64: p. 170-3.

90. Nicholls, P., et al., Biochim Biophys Acta, 1976. 449: p. 188-196.

91. Werner, C., O.M. Richter, and B. Ludwig, A novel heme a insertion factor gene cotranscribes with the Thermus thermophilus cytochrome ba3 oxidase locus. J. Bacteriol., 2010.192(18): p. 4712-9.

92. Lowry, O.H., et al., Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951.193: p. 265-75.

93. Markwell, M.A., et al., A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. Anal. Biochem., 1978. 87: p. 206-10.

94. Vik, S.B. and R.A. Capaldi, Conditions for optimal electron transfer activity of cytochrome c oxidase isolated from beef heart mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980. 94(1): p. 348-354.

95. Casey, R.P., B.H. Ariano, and A. Azzi, Studies on the transmembrane orientation of cytochrome c oxidase in phospholipid vesicles. Eur. J. Biochem., 1982.122: p. 313-318.

96. Vanneste, W.H., The stoichiometry and absorption spectra of components a and flj in cytochrome c oxidase. Biochem., 1966. 65: p. 838-848.

97. Dyuba, A., et al., Circular dichroism spectra of cytochrome с oxidase. Metallomics, 2011. 2(1): p. 1-16.

98. Калинович A., A.H., Выгодина T.B., Сулиман Т., Константинов А.А. Особенности связывания цианида с цитохромоксидазой типа Ъаз из термофильной бактерии Thermus thermophilus. Биохимия, 2010. 75(3): С. 419-430.

99. Mason, M.G., P. Nicholls, and C.E. Cooper, The steady-state mechanism of cytochrome с oxidase: redox interactions between metal centres. Biochem. J., 2009. 422: p. 237-246.

100. Goldbeck, R.A., et al., Time-resolved magnetic circular dichroism spectroscopy of photolyzed carbonmonoxy cytochrome с oxidase (cytochrome ааз). Biophys. J., 1991. 60: p. 125-134.

101. Clark, W.M., Oxidation-Reduction Potentials of Organic Systems. 1960, Baltimore, MD: Williams and Wilkins.

102. Никольский, Б.П. ed. Справочник химика. Т. 3. 1964, "Химия": Москва.

103. Andreev, I.M., et al., Acceleration by cytochrome с of cyanide binding to oxidized cytochrome с oxidase. Biokhimia (Russia), 1983. 48: p. 219-223.

104. Ver Ploeg, D.A. and R.A. Alberty, Kinetics of binding of cyanide to sperm whale metmyoglobin. J. Biol. Chem., 1968. 243(2): p. 435-440.t I I > l 1 I tlx. I It t i К 4

105. Shiro, Y., et al., Specific modification of structure and property of myoglobin by the formation of tetrazolylhistidine 64(E7). Reaction of the modified myoglobin with molecular oxygen. J. Biol. Chem., 1993. 268(27): p. 19983-19990.

106. Broderick, K.E., et al., Cyanide detoxification by the cobalamin precursor cobinamide. 2006: p. 641-649.

107. Banerjee, R.V., et al., Mechanism of reductive activation of cobalamin-dependent methionine synthase: an electron paramagnetic resonance spectroelectrochemical study. Biochemistry, 1990. 29(5): p. 1129-35.

108. Brancaccio, A., et al., Structural factors governing azide and cyanide binding to mammalian metmyoglobins. JBC, 1994. 269(19): p. 13843-13853.

109. Parul, D., G. Palmer, and M. Fabian, Proton interactions with hemes a and oj in bovine heart cytochrome c oxidase. Biochemistry, 2005. 44(11): p. 4562-71.

110. Einarsdottir, O., et al., An Infrared study of the binding and photodissociation of carbon monoxide in cytochrome bas from Thermus thermophilus. J. Biol. Chem., 1989. 264(5): p. 2405-8.

111. Bolli, A., et al., Ferrous Campylobacter jejuni truncated hemoglobin P displays an extremely high reactivity for cyanide a comparative study. FEBS J., 2008. 275(4): p. 633645.

112. Fiamingo, F.G., et al., Dynamic interactions of CO with a ¿Fe and Cub in cytochrome c oxidase in beef heart mitochondria studied by Fourier transform infrared spectroscopy at low temperatures. J. Biol. Chem., 1982. 257(4): p. 1639-50.

113. Wilson, D.F., M. Erecinska, and E.S. Brocklehurst, The chemical properties of cytochrome c oxidase in intact mitochondria. Arch. Biochem. Biophys., 1972. 151: p. 180-187.

114. Andreev, I.M., et al., Binding of cyanide with ferricytochrome a^ in rat liver mitochondria. Dokl. Acad. Nauk SSSR, 1979. 244(4): p. 1013-1017.

115. Andreev, I.M. and A.A. Konstantinov, Reaction of the oxidized cytochrome oxidase with cyanide. Effects of pH, cytochrome c and membrane environment. Bioorg. Chem. (Moscow), 1983. 9: p. 216-227.

116. Konstantinov, A.A., T.V. Vygodina, and I.M. Andreev, Electrogenic Proton Exchange between Cytochrome a^ Active Centre and M-aqueous Phase. Evidence for Cytochrome a3 Associated Input Proton Well. FEBS Lett., 1986. 202: p. 229-234.H