Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой"

На правах рукописи

СИЛЕЦКИЙ Сергей Алексеевич

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ГЕНЕРАЦИИ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА ЦИТОХРОМ с ОКСИДАЗОЙ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 7 СЕН 2012

Москва-2012

005052418

005052418

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Официальные оппоненты:

Андреев Игорь Михайлович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Звягильская Рената Александровна - доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биологического окисления Института биохимии им. А.Н.Баха

Тихонов Александр Николаевич - доктор физико-математических наук, профессор, главный научный сотрудник каф. Биофизики Физического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук.

Защита состоится "15" октября 2012 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан " "_2012 года

РАН

Ученый секретарь диссертационного совета,

Медведева Марина Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Работа посвящена выяснению молекулярного механизма преобразования энергии, осуществляемого в мембранных ферментах электрон-транспортных цепей митохондрий, бактерий и хлоропластов. В процессе дыхания энергия окислительно-восстановительных реакций трансформируется электрон-транспортной цепью митохондрий и многих бактерий в разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране (ДцЬГ). Возникающая таким образом протон-движущая сила служит в клетке источником энергии в реакциях биохимического синтеза, мембранного транспорта, механического движения бактериальных клеток и т.д. В концевом участке дыхательных цепей аэробных организмов образование протон-движущей силы обеспечивается в результате работы терминальных оксидаз, катализирующих восстановление кислорода цитохромом с или хинолом. Основная подгруппа этих ферментов, включающая цитохромоксидазу (ЦО) из митохондрий, образует суперсемейство структурно-родственных гем-медных оксидаз. Отличительной особенностью представителей суперсемейства является каталитический центр, который образован близко расположенными ионом железа гемовой группы и ионом меди (т.н. биядерный или бинуклеарный центр, В1ЧС), и в котором непосредственно происходит восстановление молекулы кислорода с образованием двух молекул воды.

В ходе каталитического цикла, сопряженно с химической реакцией, ЦО образует ДцН в результате двух процессов. Во-первых, электроны поступают в ВИС ЦО от цитохрома с с внешней стороны мембраны (Р-сторона), в то время как участвующие в восстановлении кислорода и образовании молекул воды протоны (т.н. "субстратные" или "химические" протоны) переносятся в ВИС из внутренней водной фазы (М-сторона). Во-вторых, цитохромоксидаза является редокс-зависимым протонным насосом и дополнительно переносит с Ы-стороны на Р-сторону мембраны в среднем четыре протона (т.н. "помпируемые" протоны) на каждую восстановленную молекулу кислорода.

Таким образом, цитохромоксидаза представляет собой сложную и уникальную в своем роде молекулярную машину, осуществляющую сопряжение одноэлектронного окисления цитохрома с, 4-х электронного восстановления и протонирования молекулы кислорода с образованием воды и редокс-зависимого направленного трансмембранного переноса протонов. Сочетание этих процессов требует сложной организации и точной взаимной артикуляции перемещения зарядов (электронов и протонов) и превращения молекулы кислорода в ходе каталитического цикла. Отдельные одноэлектронные этапы восстановления кислорода в каталитическом цикле цитохромоксидазы сопряжены с набором частных реакций переноса электрона между редокс-центрами фермента и транслокации протонов в нем, происходящих в недоступном для быстрого смешивания временном диапазоне и потому практически неизученных с временным разрешением.

В последние годы для ряда цитохромоксидаз была получена трехмерная кристаллическая структура с атомным разрешением, что в сочетании с возможностями направленного мутагенеза и кинетических методов с необходимым временным разрешением предоставляет уникальную возможность для изучения механизма сопряжения энергии и внутрибелкового переноса протонов в данном ферментном комплексе. Выяснение молекулярного механизма редокс-сопряженного разделения зарядов в ЦО, динамики и траекторий внутрибелкового переноса протонов являются одними из наиболее важных и сложных задач биэнергетики, а также необходимой предпосылкой для установления общих закономерностей механизмов образования трансмембранного потенциала ферментами энерго-сопрягающих мембран.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выяснение молекулярного механизма сопряженного трансмембранного переноса зарядов (электронов и протонов) в цитохромоксидазе. Ставилась задача описать механику векторного переноса зарядов,

разрешив во времени частные стадии электрогенного переноса электронов и протонов в цитохромоксидазе, составляющие суть отдельных одноэлектронных переходов в каталитическом цикле. Выяснить точную стехиометрию переноса помпируемых протонов в отдельных одноэлектронных переходах каталитического цикла. Требовалось установить сопряженные электрон-транспортные стадии и конформационные изменения, контролирующие частные стадии транслокации протонов. Выявить внешние факторы, способные влиять на динамику проведения протонов в ЦО. Ставилась задача выяснить роль протон-проводящих путей в отдельных одноэлектронных переходах в каталитическом цикле ЦО. Локализовать траектории проведения протонов в цитохромоксидазе и выявить взаимную артикуляцию частных электрон и протон-транспортных реакций внутри отдельного одноэлектронного перехода фермента. Выяснить точную структуру каталитических интермедиатов ЦО, включая промежуточную локализацию протонов в кислород-редуктазном центре и в его окрестности. Выяснить структурно-функциональные особенности неканонических цитохромоксидаз, обусловливающие сниженную эффективность трансмембранной перекачки протонов.

Научная новизна работы. Впервые показано, что перенос на кислород 3 и 4 электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы митохондрий (переходы Р—и р—Ю, соответственно) сопряжен с суммарным электрогенным переносом равного количества зарядов через мембрану. Впервые показано, что фотоиндуцированный электрон-донорными комплексами рутения переход Р—»И цитохромоксидазы митохондрий включает две миллисекундные ("средняя" и "медленная") компоненты генерации мембранного потенциала, отражающие электрогенный перенос протонов, сопряженный с реокислением гема а биядерным центром фермента.

Впервые показано, что в фотоиндуцированных одноэлектронных переходах Р—»И и И—>0 цитохромоксидазы митохондрий, половина суммарной величины элекгрогенного перемещения протонов образуется в "средней" электрогенной фазе синхронно с редокс-реакцией переноса электрона от гема а в ВМС (с т-0.3 мс и т-1.2 мс, соответственно). Другая часть электрогенного переноса протонов в переходах Р—и Р—»О происходит в "медленной" электрогенной фазе (с т—1.3 мс и т~4.5 мс, соответственно), засчет сохранения части свободной энергии редокс-реакции в метастабильном состоянии фермента

Впервые разрешена кинетика генерации мембранного потенциала прокариотической цитохромоксидазой ааз-типа из Шос1оЪас1ег .чрИаего1с!ех. Показано сходство общей организации разрешенных стадий внутрибелкового электрогенного переноса зарядов представителями гем-медных терминальных оксидаз семейства А (митохондриальной цитохромоксидазой и цитохромоксидазой асц из 11.зр}1аего1с1ез).

Впервые показано, что электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидазы шз-типа из К^рИаего^^е.ч происходит через протон-проводящие О и К каналы, содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы. Впервые показано, что протонный Б-канал обслуживает перенос помпируемых протонов, а также перенос субстратных протонов в окислительной полуреакции каталитического цикла (стадии Р—»И, И—Ю), в то время как К-канал участвует в переносе субстратных протонов в восстановительной полуреакции (при переносе в ВИС первых двух электронов в каталитическом цикле).

Впервые показано, что Б—Ю переход ЦО с мутацией N1390, характеризующейся ингибированием протон-помпирующей функции, сопряжен с суммарной транслокацией через мембрану одного элементарного заряда. Дополнительный вклад электрогенного переноса протонов в ЦО дикого типа из Д. .уЛаегок/е^ и ЦО митохондрий соответствует трансмембранному переносу не более одного (~0.9) помпируемого протона в каждом из переходов Р—>Р и Р—>0 окислительной фазы каталитического цикла.

Впервые показано, что "средняя" электрогенная фаза в переходе Р—Ю ассоциирована с переносом помпируемого протона к внешней стороне мембраны, в то

время как "медленная" электрогенная фаза связана с переносом субстратного протона из внутренней водной фазы к BNC. Впервые показано, что ионы цинка, ингибирующее стадии переноса протонов в ряде мембранных белков, тормозят "медленную" электрогенную фазу переноса протонов при добавлении к протеолипосомам с ЦО с внешней стороны мембраны.

Предложена модель организации двухстадийного электрогенного переноса протонов в переходе F—>0 каталитического цикла цитохромоксидаз семейства А. Первая стадия включает в себя перемещение помпируемого протона из внутренней водной фазы, через консервативный остаток глутамата Е286 в верхней части D-канала, к промежуточному акцептору протона над биядерным центром. Вторая стадия включает в себя высвобождение помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны, сопряженное с электрогенным перемещением субстратного протона с внутренней стороны мембраны к биядерному центру.

Впервые разрешены интермедиаты каталитического цикла представителя семейства В гем-медных терминальных оксидаз (цитохромоксидазы Ъаъ из Thermus thermophilusj в быстрой реакции с кислородом в режиме одного оборота. Выявлено отличие оксидаз семейств А и В в локализации внутреннего акцептора протона в кинетическом интермедиате, соответствующем состоянию F. В цитохромоксидазах семейства А перенос субстратного протона происходит непосредственно в биядерный центр (к связанному с Сив гидроксил-аниону), тогда как в цитохромоксидазе bas акцептор протона локализован вне биядерного центра.

Впервые показано, что причиной сниженной усредненной эффективности протонного насоса baj ЦО из T.thermophilus является отсутствие сопряженного трансмембранного переноса протона в ряде одноэлектронных стадий каталитического цикла. В тоже время другие одноэлектронные стадии сопряжены с трансмембранным переносом 1 протона также, как в цитохромоксидазах семейства А.

Установлено, что при восстановлении низкоспинового гема b каталитический биядерный центр окисленной цитохромоксидазы Ьа} из T.thermophilus переходит в открытое состояние и приобретает способность связывать внешние лиганды.

Практическая значимость исследования. Полученные результаты значительно расширяют современные знания о свойствах и функционировании цитохромоксидазы и могут оказаться полезными при изучении других протон-транспортирующих белков. В частности, важно выяснение механизма внутрибелкового проведения протонов в ЦО для понимания работы белковых ионных насосов. Детальный анализ восстановления кислорода в ЦО и его связь с механизмом работы пероксидаз дают ценную информацию о ферментативном превращении кислорода, необходимую для расшифровки путей регуляции кислородного метаболизма в клетке и для создания кислородных биосенсоров. Материалы работы используются в учебном процессе на факультете Биоинженерии и Биоинформатики и на Биологическом факультете МГУ. Результаты исследований вошли в курс лекций по биоэнергетике.

Апуобаиия работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на 9-ой, 12-ой, 14-ой, 15-ой и 16-й Европейских Биоэнергетических конференциях - ЕВЕС (Лувен-ла-Нев, 1996; Аркашон, 2002; Москва, 2006; Дублин, 2008; Варшава, 2010), на 2-ом и 7-ом Европейских Биофизических конгрессах (Орлеан, 1997; Генуя, 2009), на 26-м съезде Федерации Европейских биохимических обществ - FEBS (Ницца, 1999), 18-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов - IUBMB (Бирмингем, 2000), Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул ECSBM (Сегед, 2003), конференции "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке" (Москва, 2005), на 8-й Европейской конференции по Биологической химии Eurobic 8 (Авиеро, Португалия, 2006), на V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), а также на ряде Гордоновских конференций по биоэнергетике. Работа была также апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-

химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ. Результаты, представленные в работе, удостоены Государственной Премии Российской Федерации за выдающиеся работы в области науки и техники для молодых ученых, премии Европейской академии для молодых ученых СНГ, премии им. А.Д.Каулена за лучшую работу молодых ученых МГУ НИИФХБ, премии Биохимического общества при Российской Академии Наук для молодых ученых России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 статей в рецензируемых журналах и 15 тезисов конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 180 страниц, 40 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 297 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изоляция митохондриальной цитохромоксидазы. Цитохромоксидазу изолировали из митохондрий бычьей сердечной мышцы по методике [Fowler et al., 1962; MacLennan & Tzagoloff, 1965].

Штаммы бактерий. Использовался штамм бактерий Rhodobacter sphaeroides (JS100), несущий делецию в гене eta D, кодирующем субьединицу I цитохромоксидазы. Клетки данного штамма содержат плазмиду (pRK-415) с геном eta D, модифицированным добавлением последовательности из шести остатков гистидина [Mitchell & Gennis, 1995]. В результате С-конец субьединицы I цитохромоксидазы несет полигистиновую последовательность, что позволяет изолировать ЦО из мембран в одну стадию с помощью аффинной хроматографии (Ni-NTA агароза).

Выращивание клеток и получение мембран. Выращивание клеток штамма R.sphaeroides (JS100) проводилось аэробно, на модифицированной среде Систрем при 30°С, как описано в [Hosler et al., 1992, Shaleigh et al., 1992]. В среде присутствовали антибиотики: стрептомицин (50 мкг/мл), спектиномицин (50 мкг/мл), а также канамицин (25 мкг/мл) или тетрациклин (1 мкг/мл). Собранные клетки ресуспендировали в 50 мМ Трис (pH 8.0) и разрушали с помощью пресса Френча (в присутствии 50 мкг/мл ДНКазы 1). Остатки клеток удаляли центрифугированием (30000 g, 30 минут).

Очистка ЦО ааз-типа из R.sphaeroides. Препарат мембран гомогенизировали в 100 мМ КН2РО4 (pH 8.0), после чего инкубировали 30 минут (при 4°С) в присутствии додецил-мальтозида (1%) и PMSF (ингибитор протеаз) при постоянном перемешивании. После центрифугирования (75000 g, 35 минут, 4 С°), к супернатанту добавляли имидазол (10 мМ) и Ni-NTA сефарозу (Quiagen). После инкубации (60 минут, 4°С), смесь наносили на хроматогрфическую колонку и промывали не менее 15 объемами буфера (50 мМ КН2РО4, рН=8.0, 10-15 мМ имидазол, 0.1% мальтозид). Цитохромоксидазу элюировали (~0.1 мл/мин) буфером с -120 мМ имидазола. Избыток имидазола удаляли гельфильтрацией по [Fry et al., 1978]. Препарат очищенного белка концентрировали до концентрации 50-100 мкМ с помощью фильтров Amicon.

Определение активности ЦО aaj-muna из R.sphaeroides. Активность ЦО из R.sphaeroides определялась спектрофотометрически по скорости окисления 30 мкМ цитохрома с в 50 мМ КН2РО4 (рН=6.5), в присутствии 0.02% лаурил мальтозида, при 25°С.

Цитохромоксидаза Ьа3 из T.thermophilus была очищена согласно [Soulimane et al., 2002]. Дрожжевой цитохром с, модифицированный по остатку cys-102 трис-бипиридил-рутениевым комплексом, был предоставлен Ф.Миллетом (Арканзасский университет, США).

Встраивание цитохромоксидазы в протеолипосомы. Для встраивания цитохромоксидазы в протеолипосомы использовались два метода: Ракера [Racker, 1972] и

Риго [Rigaud et al., 1995]. Суспензию азолектина (40-60 мг/мл) в 2% растворе холата натрия в буфере (50 мМ HEPES либо КН2Р04> рН=7.5, 2 мМ MgS04), озвученную в присутствии аргона в ледяной бане до просветления с помощью ультразвукового дезинтегратора (0.4А, 22 кГц), смешивали с ЦО до концентрации 4-6 мкМ (метод Ракера) либо 6-9 мкМ (метод Риго). Для удаления детергента согласно [Racker, 1972], суспензию диализовали два раза по 3 часа против 200 объемов и, в течение ночи, против 500 объемов буфера, не содержащего детергент. После диализа липосомы осаждали центрифугированием (Ti-50, 48000 об/мин, 4°С, 1 час). Ресуспендированный осадок протеолипосом использовали для приклеивания к плоской мембране. Для удаления детергента по методу [Rigaud et al., 1995], в суспензию протеолипосом вносили гранулы SM2 Bio-Beads ("Bio-Rad", 30 мг гранул сырого веса/мл) при постоянном перемешивании, в течении 6 часов с интервалом 0.5-1 час, согласно [Verkhovskaya et al. 1997, Jasaitis et al. 1999]. Содержащую протеолипосомы жидкую фазу отделяли от гранул Bio-Beads, разделяли на порции и замораживали в жидком азоте.

Электрометрические измерения. Быструю кинетику образования разности потенциалов цитохромоксидазой на мембране протеолипосом регистрировали методом емкостной потенциометрии с разрешением 100 не [Drachev et al., 1979, Drachev et al., 1989], адаптированным для измерений на протеолипосомах ЦО из митохондрий и бактерий [Zaslavsky et al., 1993, Siletsky et al., 1996, Verkhovsky et al., 1997, Siletsky et al., 1999]. На отверстие диаметром 4 мм, разделяющее 2 отсека тефлоновой ячейки, наносили коллодиевую пленку, смоченную в растворе фосфолипида в декане (99% лецитин, 50 мг/мл; стеариламин, 1 мг/мл). В один из отсеков ячейки, заполненной буфером (10 мМ HEPES-KOH, pH 7.4), вносили протеолипосомы с ЦО и инкубировали 3-5 часов при перемешивании в присутствии 30 мМ MgS04. Разность потенциалов между отсеками регистрировали при помощи светозащищенных Ag/AgCl электродов, после замены буфера в отсеках на среду измерений (5 мМ Трис/ацетат, pH 8.1, 10 мМ анилин). Сигнал поступал в операционный усилитель (Burr-Brown), после чего заводился в компьютер через аналого-цифровой преобразователь фирмы DATALAB (Англия) или Datascope (США).

Для одноэлектронной инъекции в субмикросекундном временном диапазоне использовалось фотовосстановление цитохромоксидазы комплексом

трис(2,2'бипиридил)рутений(И)хлорид (Rubpy) [Nillson, 1992]. Фотовозбуждение Rubpy достигалось при помощи импульсного лазера (NdYAG; 532 нм, 15 не, 40-100 мДж). В условиях низкой ионной силы, возбужденный Rubpy(II)* восстанавливает входной редокс-центр ЦО, СиА, в субмикросекундной временной шкале. Окисленный Rubpy(III) ревосстанавливался анилином. Для перевода фермента в соединение Р, через липосомный отсек электрометрической ячейки в течение 1 минуты продували окись углерода [Nicholls & Channady, 1981]. Для субмикросекундной инициации быстрой реакции окисления молекулярным кислородом восстановленной цитохромоксидазы в режиме одного оборота использовался метод "флоу-флэш" [Gibson et al., 1963]. При анаэробной инкубации в присутствии окиси углерода цитохромоксидаза образует комплекс гема а} с СО. Кислород вносится в систему с помощью быстрого смешивания, чтобы недопустить спонтанного вытеснения кислородом окиси углерода. Оксидазная реакция запускается фотолизом комплекса гем а32+-СО (NdYAG; 532 нм, 15 не, 40 мДж), в результате чего молекула кислорода связывается с гемом а3 и восстанавливается электронами, присутствующими в ферменте, в режиме одного оборота.

Разрешенные во времени спектрофотометрические измерения при одиночной длине волны. Быстрая кинетика спектральных изменений гемовых центров ЦО, в ответ на инъекцию электрона с помощью Rubpy, регистрировалась методом "флэш-фотолиза". Световой поток от галогеновой лампы (70-100 вт) попадал в термостатируемое кюветное отделение после решеточного монохроматора Jobin Yvon с шириной щели 2-8 мм. Пройдя через помещенный в микрокювету (3®3 мм либо 4®4 мм) образец, световой поток

поступал через призменный монохроматор в ФЭУ. После аналого-цифрового преобразования (DATALAB, Англия; Datascope, США) сигнал заводился на компьютер.

Фотовозбуждение Rubpy достигалось при помощи импульсного лазера (NdYAG, Quantel либо Spectraphysics; 532 нм, 15 не, 40-300 мДж). Возбуждающий свет подавался в юоветное отделение, в область прохождения через образец мониторного света, перпендикулярно последнему. Для уменьшения ионной силы, перед измерением с Rubpy препарат изолированной цитохромоксидазы переводили в деионизованный буфер с помощью гель-фильтрации [Fry et al., 1978]. В некоторых случаях, вместо Rubpy, использовалось производное двухядерного рутениевого комплекса RU2C [Siletsky et al. 2006], характеризующееся более высокой эффективностью фотовозбуждения.

Регистрация спектральных изменений ЦО с микросекундным временным разрешением. Дня регистрации кинетики переноса электронов в ходе многостадийных превращений каталитического центра ЦО использовался спектрофотометр на базе CCD (ПЗС) матрицы (DV420-UV-FK, Andor Technology, Северная Ирландия), позволяющий проводить регистрацию спектров с разрешением 1-16 мке в течение нескольких миллисекунд после начала реакции. В случае измерения быстрой кинетики окисления ЦО кислородом в режиме одного оборота, предвосстановленный и уравновешенный с окисью углерода фермент смешивался с помощью приставки стоп-флоу (Applied Photophysics, Великобритания) с буфером, насыщенным кислородом. Соотношение смешиваемых объемов составляло 1:5, соответственно. Для инициации реакции в субмикросекундном временном диапазоне, СО фотодиссоциировали из комплекса с гемом аз ЦО коротким лазерным импульсом (NdYAG; 532 нм, 15 не, -100 мДж), спустя 5 мс после начала смешивания (чтобы предотвратить спонтанное вытеснение СО кислородом).

Обработка данных. Для обработки данных использовались программы Discrete [Provencher, 1976], Origin (OriginLab Corp., США), G1M (разработана А.Л.Драчевым в НИИФХБ МГУ), MatLab (MathWorks Inc., США), Pro-Kineticist (Applied Photophysics Ltd., Великобритания). Для разрешения кинетических кривых генерации мембранного потенциала на индивидуальные экспоненты использовался алгоритм программы Discrete [Provencher, 1976]. В случае кинетической модели последовательных стадий истинные амплитуды электрогенных стадий связаны с наблюдаемыми амплитудами алгебраическими выражениями [Medvedev et al., 2005; Siletsky et al., 2006]. Истинные значения амплитуд генерации потенциала V\ и Vi могут быть вычислены из измеряемых экспериментально амплитуд, V„hs, и констант скоростей, к\, к2, с помощью системы уравнений:

V=v +V —

*! r \,obs т ' 2,obs 7 к.

№ ~к2)

(1)

РЕЗУЛЬТАТЫ

КИНЕТИКА ГЕНЕРАЦИИ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА, СОПРЯЖЕННАЯ С ОДНОЭЛЕКТРОННЫМИ ПЕРЕХОДАМИ В КАТАЛИТИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ

Цель - разрешить стадии электрогенного переноса электронов и протонов в ходе одноэлектронных переходов в каталитическом цикле цитохромоксидазы.

Цитохромоксидаза митохондрий содержит четыре редокс-центра. СиА располагается вблизи места взаимодействия ЦО с цитохромом с на внешней (Р) стороне мембраны. Низкоспиновый гем а и биядерный каталитический центр, состоящий из высокоспинового железа гема а3 и иона меди (Сив), располагаются в гидрофобном ядре белка на сходном расстоянии от поверхности мембраны.

В каталитическом цикле цитохромоксидазы выделяют две части. Восстановительная часть включает в себя перенос от цитохрома с в окисленный биядерный центр ЦО (состояние О) 1-го и 2-го электрона с образованием состояния R (схема 1). В окислительной фазе молекула кислорода связывается с восстановленным BNC и расщепляется, принимая одновременно 4 электрона от гема а3, Сив и входящего в состав активного каталитического центра ЦО остатка тирозина Y288, образующего ковалентную связь с одним из гистидиновых лигандов Сив. Возникшие 2 электронные вакансии заполняются в каталитическом центре ЦО переносом 3-го и 4-го электронов, переводя ЦО последовательно из состояния Р в F и из F в окисленное состояние (О).

Схема 1

О ^ R —> А —> Р % F % О «з3+ аг* a^'-Oj а34 =02Туг* аГ=О2" вз3+-ОН"

На схеме изображены состояния гема а3, в комплексе с которым происходят редокс-превращения кислорода. Туг* -радикал редокс-активного остатка тирозина.

Активируемый с помощью короткой лазерной вспышки (532 нм, ~10 не), комплекс трис(бипиридил)рутения (Rubpy) может быть использован для фотоиндуцированного переноса электрона в белки в субмикросекундной временной шкале [Sutin et al., 1978; Geren et al., 2009]. В случае природного субстрата цитохромоксидазной реакции, цитохрома с, ковалентно модифицированного Rubpy по периферическим остаткам на поверхности белка, в ответ на фотоактивацию наблюдается восстановление окисленного гема цитохрома с [Geren et al., 1991; Pan et al., 1990]. Электрогенная составляющая быстрой кинетики перераспределения электронной плотности от гема цитохрома с внутрь

встроенной в протеолипосомы ЦО и сопряженного переноса протонов может быть зарегистрирована с помощью "прямого" электрометрического метода [Drachev et al., 1978; Drachev et al., 1979].

На рисунке 1 представлена кинетика генерации трансмембранной разности потенциалов встроенной в протеолипосомы окисленной ЦО, при использовании в качестве фотовосстановителя цитохрома с из дрожжей, ковалентно модифицированного по остатку цистеина 102 трис-бипиридиловым комплексом рутения (Ru-102-Cyt с). В условиях низкой ионной силы (рН~8), Ru-102-Cyt с образует фермент-субстратный комплекс с ЦО, связываясь благодаря электростатическим взаимодействиям в специфическом сайте обращенной во внешнюю водную фазу поверхности ЦО. В присутствии избытка анилина, необходимого чтобы исключить обратный перенос электрона на окисленный Rubpy, в ответ на короткую лазерную вспышку (532 нм, 10 не, 40 мДж) ЦО генерирует трансмембранную разность потенциалов, соответствующую по знаку переносу отрицательного заряда внутрь протеолипосом (рис. 1А). Кривая нарастания регистрируемой разности потенциалов отражает кинетику образования ДТ на мембране протеолипосом [Drachev, et al.1978; Drachev et al., 1974].

Быстрая часть кинетики генерации мембранного потенциала (т~40-70 мке) отражает перенос электрона в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, от СиА к гему a [Zaslavsky et al., 1995]. Происходящий значительно быстрее (т<< 10 мке, [Pan et al., 1993 ]), перенос электрона между цитохромом с и входным редокс-центром Cua не сопровождается заметной электрогенной стадией (рис. 1А, вставка), в соответствии с периферическим расположением Сид вблизи поверхности ЦО. В медленной части кинетики доминирует электрогенная фаза, характеризующаяся субсекундным значением т-0.3 с (рис. 1А), значительно более медленным, чем стадии каталитического цикла ЦО. Эта компонента является результатом реакции второго порядка между ЦО и избытком восстановленного Ru-102-Cyt с, образовавшегося в растворе в ответ на лазерную вспышку [Zaslavsky et al., 1995].

Несвязанный с цитохромом с свободный Rubpy также способен восстанавливать ЦО в ответ на вспышку лазера (рис. 1Б, [Nilsson et al., 1992; Zaslavsky et al., 1993]). Фотоэлектрический ответ с Rubpy и Ru-102-Cyt с сходны в начальной части (рис. 1). В отличие от Ru-102-Cyt с, вызванная Rubpy светоиндуцированная генерация Д1^ завершается в течение нескольких десятков миллисекунд, вслед за чем мембрана разряжается благодаря пассивной утечке ионов.

ш 2

сГ

си ^

ГГ

I ф

н о с о н

о -&

время, мс

время, мс

■ .......... . I ■ I . ......

О 2 4 6 8 10 200 400 600 8001000

время, мс

-8- 0.0

200 400 600 800 1000

Рисунок 1. Кинетика генерации трансмембранного потенциала встроенной в протеолипосомы ЦО. (А) в присутствии восстановленного светом Яи-102-Су1 с. На вставке показана быстрая часть фотоэлектрического ответа. Условия: буфер 5 мМ трис-ацетат (рН=8.1), 10 мМ анилин, 5 мкМ Ли-102-су1: с. (Б) в присутствие ¿иЬру. Условия: буфер 5 мМ трис-ацетат (рН=8Д), 40 мкМ ЯиЬру, 10 мМ анилин.

При использовании свободного ЛиЬру, донирование электрона в ЦО происходит в одноэлектронном режиме, от образующего с ЦО электростатический комплекс предсвязанного КиЬру. Вследствие короткого времени жизни возбужденного состояния ЯиЬру (т~0.6 мкс), дополнительного диффузионного переноса электронов из объемной водной фазы от несвязанных с ЦО возбужденных молекул ЯиЬру не происходит.

Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы (Р—>0 переход).

Фиксация ЦО в гомогенном состоянии требует специфической обработки и оказывается возможной не для всех промежуточных состояний восстановленности молекулы кислорода. Инкубация с милимолярными концентрациями Н2О2 переводит ЦО в состояние Р [\\^§1е5\У0ПЬ, 1984], соответствующее промежуточной восстановленности кислорода в активном центре фермента 3-мя электронами. Инъекция электрона от ЯиЬру в ЦО в присутствии миллимолярных концентраций Н2О2 приводит к быстрому транспорту электрона через гем а в биядерный центр фермента [Швэоп, 1992], что эквивалентно переносу на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле, и, в случае встроенной в протеолипосомы ЦО, сопровождается генерацией трансмембранной разности потенциалов (рис. 2А). В кинетике набора мембранного потенциала хорошо разрешаются три компоненты, характеристические времена которых составляют -40 мкс ("быстрая"),

-1.2 мс ("средняя") и -4.5 мс ("медленная"), а относительные вклады в суммарный фотоэлектрический ответ, соответственно: 20%, 20% и 60% (в согласии с [гав^увку е1 а!., 1993]).

Для разрешенных электрогенных компонент характерно значительное различие в энергии активации, обусловленное природой транслоцируемых зарядов (электрона или протонов). Понижение температуры приводит к замедлению миллисекундных компонент генерации мембранного потенциала ("средней" и "медленной"), не сказываясь при этом заметно на скорости микросекундной фазы (рис. 2А). Константа скорости "быстрой" фазы слабо зависит от температуры в исследованном диапазоне (Еа~3.6 ккал/моль, рис. 2Б). Низкое значение энергии активации (<0.2 эВ или 4.8 ккал/моль) свидетельствует об отсутствии значительных структурных перестроек в белке, что свойственно несопряженным электрон-транспортным реакциям [Ьа1с11ег е1 а!., 1972; Рагуег е! а1., 2010].

время, МС 1 000/Т

Рисунок 2. Миллисекундные компоненты генерации мембранного потенциала, сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле ЦО из митохондрий, специфически замедляются при уменьшении температуры. (А): Кинетика генерации мембранного потенциала в переходе Б—Ю ЦО при двух значениях температуры (1 - при 24°С, 2 - при 19°С). Условия как на рисунке 1Б; в среде присутствует 4 мМ Н2О2. (Б): Зависимость компонент генерации ДО ЦО от температуры в координатах Аррениуса. Значения энергии активации для "быстрой", "средней" и "медленной" компонент составили, соответственно: -3.6 ккал/моль, -19.4 ккал/моль и -16.6 ккал/моль.

Константы скоростей "средней" и "медленной" фаз генерации потенциала, напротив, в значительной степени растут при повышении температуры и характеризуются

относительно высокими значениями энергии активации, соответственно, -19.4 ккал/моль и -16.6 ккал/моль (рис. 2Б, [Siletsky et al., 2000, 2011]). Сходные значения энергии активации характерны для протон-транслоцирующих стадий генерации мембранного потенциала в других белках-генераторах ДцН+, включая фотосинтетические реакционные центры и бактериородопсин [Mamedov et al., 2006]. Оба гемовых центра ЦО расположены на равном расстоянии от внешней поверхности мембраны [Iwata et at., 1995; Yoshikawa et al., 1998], поэтому перенос электрона между ними не вносит существенный вклад в генерацию мембранного потенциала. "Средняя" и "медленная" фазы отражают электрогенную составляющую процессов транслокации протонов в F—Ю переходе ЦО, сопряженных с переносом электрона от гема а в биядерный центр фермента.

Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 1-го и 3-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы (фотовосстановление

состояний О и Р).

Чтобы перевести цитохромоксидазу исходно в состояние Р, соответствующее уровню восстановленное™ молекулы кислорода 2-мя электронами, нами был подобран метод, основанный на обработке аэробного раствора окисленного фермента газообразным СО [Nicholls & Chanady, 1981]. Окись углерода служит в качестве 2-х электронного донора биядерного центра, и последующее взаимодействие полностью восстановленного аз/Сив центра с атмосферным кислородом приводит к образованию стабильного во времени компаунда Р. Полученный после пропускания СО разностный спектр характеризуется в видимой области а-пиком при 607 нм и Р-полосой при 566 нм с типичным для компаунда Р соотношением амплитуд -4:1 [Fabian et al., 1995; Rich et al., 1997]. Согласно величине молярной экстинкции при 607 нм (~6 мМ'см"1), около 60% цитохромоксидазы образует соединение Р, в то время как оставшаяся часть (-40%) находится в окисленном состоянии (О).

Генерация мембранного потенциала, наблюдающаяся в результате инъекции электрона в исходное окисленное состояние (О) ЦО (рис. 3, кривая 1), соответствует по знаку накоплению отрицательного заряда на протеолипосомальной мембране, обращенной во внутренний отсек. В кинетике доминирует фаза с т~45 мке, отражающая электрогенный перенос электрона с Сид на гем а. Минорная миллисекундная часть кинетики генерации ДН' вызвана наличием в препарате окисленного фермента остаточной примеси Р и F соединений (10-15%; [Siletsky et al. 1999]), в то время как инъекция электрона от Rubpy в гомогенное окисленное состояние О ЦО из митохондрий

ограничивается восстановлением гема а и не сопровождается дальнейшим переносом электрона в ВИС в миллисекундной временной шкале ([N¡185011, 1992]).

2

2.5 - ¿г + С О

ш 2 .0 -

® 1 .5 -

О " I + К С N

00.5-1/

О .0 им!

0.0 0.1

20 40

время, м с

Рисунок 3. Генерация мембранного потенциала, сопряженная с одноэлектронным фотовосстановлением встроенной в протеолипосомы ЦО. Условия: 5 мМ Трис-ацетат буфер рН=8.1, 40 мкМ ЯиЬру, 10 мМ анилин. I = 19°С. Экспериментальные кривые были зарегистрированы последовательно на одном препарате в следующем порядке: (1) после инкубации в течение 20 мин. в присутствии 200 мкМ феррицианида и 10 нМ каталазы, необходимых чтобы перевести ЦО в окисленное состояние (О) и убрать следовые количества Н2О2, способствующие образованию состояний Р и Р; (2) после пропускания в течение 1 мин. газообразного СО; (3) после добавления 0.5 мМ КСК

В ответ на обработку СО и формирование состояния Р ЦО, миллисекундная часть кинетики генерации мембранного потенциала резко возрастает (рис. 3, кривая 2), отражая стадии электрогенного переноса протонов, сопряженные с реокислением гема а каталитическим центром ЦО в переходе Р—>Р. Добавление цианида, связывающегося с окисленным гемом щ и блокирующего перенос электрона в активный центр от гема а, ингибирует фазы электрогенного переноса протонов (рис. 3, кривая 3). С учетом фракции ЦО в состоянии О (-40%), относительная амплитуда "быстрой" нечувствительной к цианиду электрогенной фазы (т~45 мкс) для обоих одноэлектронных стадий И—Ю и Р—>Р составляет -20%. Взаимное соотношение скоростей и амплитуд двух чувствительных к цианиду электрогенных протонных фаз в переходе Р—>Р (т~0.3 мс и т~1.3 мс) близко к таковому для "средней" и "медленной" фаз в переходе Р—>0. Как было сказано выше, перенос электрона от гема а в каталитический центр ЦО не вносит существенный вклад в

генерацию мембранного потенциала, поэтому чувствительные к цианиду стадии генерации потенциала обусловлены электрогенной транслокацией протонов. Относительная амплитуда "быстрой" электрогенной фазы переноса электрона от СиА на гем а может быть использована для количественной оценки суммарной величины электрогенного переноса зарядов (и, в частности, протонов) в отдельных одноэлектронных переходах каталитического цикла. Очевидно, переходы р—Ю и Р—>р сопряжены с равным суммарным числом транслоцируемых через мембрану зарядов.

КИНЕТИКА ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА ЧЕРЕЗ ГЕМОВЫЕ ЦЕНТРЫ В ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДАХ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ

Цель - установить стадии переноса электрона в ЦО, которые непосредственно сопряжены и контролируют отдельные электрогенные этапы перемещения протонов в одноэлектронных переходах фермента.

В случае исходного состояния И биядерного центра ЦО из митохондрий, разрешенная кинетика изменения экстинкции при 444 нм (максимум поглощения восстановленного гема а) содержит 3 компоненты. Микросекундная компонента нарастания поглощения А444 (т-40 мкс, неразрешаемый скачок поглощения на рисунке 4) соответствует восстановлению гема а "входной" медью СиА. Последующее снижение абсорбции А444 отражает реокисление гема а биядерным центром и содержит две компоненты, характеристические времена которых совпадают со значениями т "средней" и "медленной" электрогенных компонент (~1 мс и ~4 мс). Основной вклад (80-90%) в спад абсорбции А444 принадлежит компоненте с т~1 мс.

Регистрация поглощения при 438 нм и 412 нм позволяет избирательно следить за превращением гема а3 в И—Ю переходе. Данные длины волн близки, соответственно, к максимуму и минимуму поглощения в разностном спектре оксоферрильного комплекса гема аз относительно окисленного гема ау, вклад редокс-изменений гема а при этом минимален. Из рисунка 4 можно видеть, что изменения поглощения ЦО в ответ на фотохимическую подачу электрона от ЯиЬру, отражающие, соответственно, реокисление гема а (444 нм), исчезновение состояния И (438 нм) и появление окисленного состояния О гема аз (412 нм), происходят параллельно и характеризуются т—1-1.5 мс.

0,002

С о.ооо <1

-0,002 -0,004

время, мс

Рисунок 4. Кинетика изменения оптического поглощения в полосе восстановленного гема а при фотоиндуцированном одноэлектронном восстановлении ЦО из соединения И (444 нм), исчезновения оксоферрильного комплекса гема а3 (438 нм) и появления окисленного состояния гема аз (412 нм) в Р—Ю переходе фермента. Условия: 20 мкМ ЦО, буфер 5 мМ Трис-ацетат (рН=8.1), 0.05% додецил-мальтозид, 80 мкМ ЯиЬру, 0.2 мМ феррицианида калия, 4 мМ Н2О2. Амплитуда кинетики изменения А444 уменьшена в 2 раза.

На рисунке 5А приведено сравнение кинетики увеличения поглощения при 412 нм, отражающей появление окисленного гема аз в р—Ю переходе и параллельной кинетики электрогенного движения протонов через мембрану. Разрешаемый оптически переход р—»О биядерного центра совпадает во времени со "средней" фазой электрогенного протонного транспорта (т~1 мс). В тоже время значительная часть электрогенного протонного транспорта происходит позднее, в "медленной" электрогенной фазе (т~4 мс, рис. 5А) [БЛеГвку е1: а1., 2006].

Кинетика переноса электрона через гемовые центры ЦО из митохондрий в переходе Р—>Р регистрировалась в длинноволновой области спектра, где данные интермедиаты каталитического цикла ЦО имеют специфические и легко различимые полосы поглощения. Нарастание поглощения при 580 нм (рис. 6) отражает появление состояния Р ЦО (максимум поглощения в видимой области -583 нм) и характеризуется константой времени т~250 мкс.

412 нм

10 15 20

Рисунок 5. (А) Сравнение скорости фотоиндуцированного перехода F—Ю, измеренной по увеличению поглощения при 412 нм, с паралельной кинетикой генерации мембранного потенциала. Нарастание поглощения при 412 нм и протонная часть фотоэлектрического ответа отнормированы по амплитуде ~1 мс фазы электрогенного протонного транспорта. (Б) Сравнение скорости фотоиндуцированного перехода P-»F, измеренной по увеличению поглощения при 580 нм, с паралельной кинетикой генерации мембранного потенциала. Нарастание поглощения при 580 нм и протонная часть фотоэлектрического ответа отнормированы по амплитуде -0.3 мс фазы электрогенного протонного транспорта. Как в (А), так и в (Б) электрогенная компонента переноса электрона СиА—>гем а (т~40 мкс) вычтена из соответствующей электрометрической кривой.

Скачок поглощения, наблюдающийся в начальном участке кинетики при 605 нм (рис. 6), вызван восстановлением гема а от СиА с т~40 мкс. В кинетику уменьшения поглощения Aöos вносят вклад как реокисление гема а, так и исчезновение состояния Р. Спектральные изменения при 605 нм и 580 нм, происходящие с т~250 мкс, отражают реокисление гема а и переход P->F биядерного центра [Siletsky et al., 2006]. Как видно на рисунке 5Б, одновременно с переносом электрона в каталитический центр в переходе Р—>F, цитохромоксидаза образует разность электрических потенциалов засчет сопряженного электрогенного переноса протонов в "средней" компоненте кинетики генерации ДТ (т~0.3 мс). В тоже время, как и в случае F—Ю перехода, значительная часть мембранного потенциала образуется в ходе электрогенного протонного транспорта, происходящего позднее, в "медленной" электрогенной фазе с т~1.3 мс [Siletsky et al., 2006].

0,010-,

0,000-

0,005-

-0,005

0,000 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

время, с

Рисунок 6. Кинетика изменения поглощения при 580 нм и 605 нм, вызванная одноэлектронным фотовосстановлением состояния Р митохондриальной цитохромоксидазы в детергентом растворе. Реакционная среда содержала 10 мкМ ЦО, 30 мкМ Ru2C, 10 мМ анилин, 5 мМ Трис-HCl буфере, pH 8.0, 0.1% додецил мальтозида. Данные свидетельствуют о том, что быстрая фаза снижения поглощения при 605 нм совпадает с образованием состояния F (увеличение поглощения при 580 нм).

Таким образом, перенос электрона от гема а в биядерный центр цитохромоксидазы из митохондрий характеризуется значением т~0.3 мс (Р—>F) и т~1.2 мс (F—>0), соответственно, и сопряжен в обоих переходах с синхронной генерацией мембранного потенциала в "средней" электрогенной фазе. Электрогенный перенос протонов в "медленной" электрогенной фазе (с т~1.3 мс и т~4.5 мс, соответственно), происходит за счет сохранения части свободной энергии редокс-реакции в промежуточном метастабильном состоянии ЦО. Фазы электрогенного переноса протонов в переходах P-»F и F-Ю характеризуются сходными параметрами как по относительному соотношению соответствующих скоростей и амплитуд, так и по связи с сопряженными стадиями переноса электрона в ЦО, что указывает на универсальный характер механизма транслокации протонов на отдельных одноэлектронных стадиях окислительной полуреакции каталитического цикла.

ВНУТРИБЕЛКОВЫЕ ПУТИ ПЕРЕНОСА ПРОТОНОВ В ХОДЕ ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДОВ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦИКЛА ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ

Цель — локализовать пути проведения протонов и выяснить их функциональную роль в каталитическом цикле цитохромоксидазы.

Электрогенная активность цитохромоксидазы аа, типа из Rhodobacter sphaeroides

Исследование бактериальных цитохромоксидаз, гомологичных митохондриальной ЦО, позволяет использовать возможности направленного мутагенеза по аминокислотным остаткам, предположительно участвующим в проведении протонов внутри белка. В качестве такого модельного объекта была выбрана ЦО ал3-типа из R.sphaeroides, относящаяся к тому же подсемейству AI семейства А гем-медных оксидаз и обладающая высокой степенью гомологии (50% для первой субъединицы) с ферментом из митохондрий [Shapleigh et al., 1992].

На рисунке В приведена кинетика генерации мембранного потенциала встроенной в протеолипосомы ЦО дикого типа из R.sphaeroides при одноэлектронном фотовосстановлении состояния F (переход F—Ю). Разрешаемые кинетические компоненты бактериального фермента примерно в 2-3 раза быстрее соответствующих компонент кинетики митохондриальной ЦО, что согласуется с более высокой стационарной активностью бактериальной ЦО (750 с"1 против 250 с"1 при рН=8).

Рисунок 7. Кинетика генерации трансмембранной разности потенциала ЦО дикого типа из R.sphaeroides. Цианид калия ингибирует миллисекундные компоненты генерации ДЧ*. Условия: буфер 5 мМ трис-ацетат (рН=8.1), 40 мкМ ЯиЬру, 10 мМ анилин, 1 мМ Н202; где указано - добавлен 2 мМ КСК

Величина относительных вкладов в фотоэлектрический ответ чувствительных к цианиду аналогов "средней" (0.35-0.6 мс) и "медленной" (1.2-1.7 мс) электрогенных компонент и их соотношение (-1:3) близки к таковым в случае ЦО из митохондрий. Относительная амплитуда собственно электрон-транспортной стадии восстановления гема а от СиА в цитохромоксидазе из R.sphaeroides (т~10 мкс) имеет близкое значение к

таковой в митохондриальной ЦО, в соответствии со сходством трехмерной структуры обоих ферментов, и составляет ~18-20% [БПеЫсу е1 а1., 2010].

Роль входных протонных О и К каналов в каталитическом цикле ЦО.

В результате рентгено-структурного анализа кристаллов цитохромоксидазы из митохондрий сердечной мышцы быка и гомологичных бактериальных оксидаз, в мембранной гидрофобной части фермента были обнаружены структуры [1\уа1а е1 а1., 1995; Зуешзоп-Ек е1 а1., 2002], потенциально способные к проведению протонов на пути из матрикса к двухядерному железо-медному центру. Первичная гипотеза связывала два потенциальных протон-проводящих "канала", названные по остаткам лизина и аспартата в начальной части, соответственно, К и О каналами [Ког^апНпоу е1 а1., 1997], с проведением протонов разных типов (субстратных и помпируемых) [1\уа1а е1 а1., 1995; ТэикШага е( а1„ 1996].

Одиночные замены на непротонируемые аналоги ряда ключевых консервативных аминокислотных остатков в протон-проводящих путях в значительной степени либо полностью ингибируют цитохромоксидазную активность в стационарных условиях (табл.1).

ТАБЛИЦА 1. Каталитическая активность цитохромоксидазы дикого типа и мутантных форм из Ююс1оЬас1ег зрЬаего'иНез.

Фермент Дикий тип Т359А 0132И К362М Е2860

Число оборотов, с' (%) 1500 (100) 250 (17) 50 (3.3) <5 (<0.3) <5 (<0.3)

На рисунке 8А представлена кинетика генерации мембранного потенциала ЦО дикого типа при фотохимическом одноэлектронном восстановлении соединения Б с помощью ЛиЬру, в сравнении с ЦО, мутантной по остатку Е286. Можно видеть, что единичная замена расположенного в конце О-канала, вблизи двухядерного центра, остатка Е286 не влияет на быструю микросекундную часть кинетики генерации потенциала, связанную с переносом электрона с Сид на гем а. Одновременно, полностью ингибируются милисекундные фазы фотоэлектрического ответа, то есть внутрибелковый перенос протонов, сопряженный с реокислением гема а и восстановлением гема аз.

Мутация D132N в начальной части О-канала также не влияет на микросекундную часть кинетики, в то время как в миллисекундной временной шкале амплитуда фотоэлектрического ответа мутантной ЦО значительно снижена (рис. 8Б). Остаточная медленная часть кинетики генерации Д¥ ингибируется цианидом и представляет собой

электрогенное подтягивание протона в Б-канале (выше остатка 0132) в ответ на перенос электрона от гема а в двухядерный центр. Позднее, сходный эффект ингибирования электрогенного переноса протонов в результате перекрывания О-канала был обнаружен при замене на непротонируемые аналоги ряда консервативных остатков серина и аспарагина, расположенных в срединной части О-канала между остатками Э132 и Е286 [Ьее е1 а1. 2010, Б^^гвку е1 а1„ 2004, 2010].

Рисунок 8. Кинетика генерации трансмембранного потенциала цитохромоксидазами дикого типа ("\¥Т) и ЦО с сайт-специфическими мутациями в протон-проводящих каналах. Основные условия как на рисунке 7.

О-канал: (А) Кинетические кривые дикого типа (\УТ) и мутанта Е286С? нормированы по амплитуде микросекундной компоненты. В случае мутанта, для поддержания гема а в окисленном состоянии добавлен 0.2 мМ феррицианида калия. (Б) Кинетики фотоэлектрических ответов дикого типа (%Т) и ЦО с мутацией 0132Ы отнормированы по амплитуде в микросекундной временной шкале. Там, где указано - добавлен 1 мМ КСИ К-канал: (В) Фотоэлектрический ответ ЦО с одиночной заменой Т359А во входном протонном К-канале практически не отличается от ответа ЦО дикого типа. (Г) Кинетика генерации трансмембранного потенциала цитохромоксидазой с мутацией К362М в К-канале. Условия: 1) без добавок; 2) добавлено 100 мкМ феррицианида калия; 3) добавлен 1 мМ Н202; 4) добавлен 1 мМ КСК

Одиночные замены аминокислотных остатков в К-канале также приводят к заметному (Т359А) либо полному (К362М) ингибированию активности фермента (табл. 1). Однако, как можно видеть на рисунке 8, мутации в К-канале не оказывали значительного влияния на кинетику генерации ДТ, сопряженную с одноэлектронным

Ш I-

о

время, мс

время, мс

фотовосстановлением интермедиата Б, и не ингибировали электрогенный перенос протонов в ЦО, по крайней мере при однократном срабатывании.

Фотоэлектрический ответ цитохромоксидазы с заменой Т359А в присутствии 1 мМ Н2О2 не отличается от кинетики ЦО дикого типа (рис. 8В). ЦО с мутацией К362М, в присутствии ЛиЬру, образует сильно заниженный по величине фотоэлектрический ответ (рис. 8Г, кривая 1), что связано со значительной степенью восстановленности гема а в исходном состоянии. Добавление феррицианида окисляет гем а и разрешает его фотовосстановление от ЯиЬру через Сид (рис. 8Г, кривая 2). Добавление перекиси водорода, переводящее фермент в оксоферрильное состояние Р, приводит к появлению в практически неактивном К362М мутанте полностью развитой, чувствительной к цианиду миллисекундной части кинетики генерации потенциала (рис. 8Г, кривая 3,4).

0,05

400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 Длина волны, нм

0,35

417 нм

444 нм

I

О

X

Ф ?

О

Е

о с

0,250,20 0,15 0,10

ЭсО 580 600 620 «О 660 длина волнь^нм

1-Е28Ю

2-0132М

лавам

4Ш

Рисунок 9. Абсолютные спектры поглощения в полосе Соре и в видимой области спектра (на вставке) цитохромоксидазы дикого типа и мутантных форм в аэробных стационарных условиях, в присутствие аскорбата и ТМРБ в качестве доноров электронов. Условия: кювета с постоянным перемешиванием и оптическим путем 1 см. Состав среды: 0.2-0.5 мкМ фермента (ЦО дикого типа или мутантной формы), 50 мМ К-фосфат (рН 8.0), 0.1% лаурил мальтозид, 1 мМ аскорбат, 100 мкМ ТМРО.

Стационарные оптические спектры всех описанных выше мутантных форм, в присутствие избытка субстратов дыхания, свидетельствуют о значительном повышении степени восстановленности гема а (вставка к рис. 9), в соответствии с ингибированием реакции реокисления гема а двухядерным центром вследствие мутации. Однако, в отличие от мутаций по О-каналу, в случае мутанта К362М два раздельных пика с

максимумами 444 нм и 420 нм в полосе Соре свидетельствует об окисленном высокоспиновом состоянии тема а} (состояние О) на фоне восстановленного гема а (рис. 9). То есть, ингибирование стационарной активности в "мертвом" мутанте К362М в К канале вызвано замедлением переноса протонов в восстановительной части каталитического цикла, в ходе восстановления биядерного центра с образованием состояния Я, что является необходимым этапом для связывания СЬ.

Таким образом можно заключить, что электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла ЦО происходит через протон-проводящие О и К каналы, содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы, включая остатки Б132, N139, Е286 в О-канале и Т351, Т359 и К362 в К-канале [З^ку е1 а1., 1996; Коп51аШтоу е1 а1., 1997; З^ку е1 а1., 2004]. Однако, протон-проводящие Б и К каналы различаются не по типу переносимых протонов (субстратных или помпируемых), как предполагалось исходно, а задействованы на разных стадиях каталитического цикла.

АРТИКУЛЯЦИЯ ВНУТРИБЕЛКОВОГО ПЕРЕМЕЩЕНИЯ ПРОТОНОВ В ОДНОЭЛЕКТРОННОМ ПЕРЕХОДЕ И-Ю ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ

Цель - выяснить точную стехиометрию сопряженного трансмембранного переноса протонов в отдельном одноэлектронном переходе; выявить детали взаимной артикуляции проведения помпируемого и субстратного протонов в элементарном акте работы протонного насоса цитохромоксидазы.

Стехиометрия сопряженного электрогенного переноса протонов в одноэлектронном переходе Р—>0 цитохромоксидазы.

Точное число помпируемых протонов, сопряженных с отдельными одноэлектронными переходами ЦО, оставалось предметом дискуссий в течение длительного времени. Основываясь на анализе равновесных окислительно-восстановительных титрований редокс-активных групп ЦО и переходов биядерного центра, Викстремом была предложена модель, в которой каждый из переходов Р—>р и Р—>0 сопряжен с трансмембранным переносом двух помпируемых протонов [\Vikstrom, 1989], в то время как перенос 2-х первых электронов в каталитическом цикле ЦО не сопряжен с перекачкой протонов через мембрану вовсе.

Количественная оценка числа переносимых зарядов в приведенных выше предстационарных измерениях генерации мембранного потенциала в одноэлектронных Р—>Р и Р—Ю переходах ЦО существенно зависит от степени электрогенности, приписываемой "быстрой" стадии, отражающей перенос электрона от СиА к гему а и

использующейся в качестве внутреннего нормировочного параметра. Так, согласно стационарным измерениям влияния мембранного потенциала на редокс-равновесие между цитохромом с и гемом а [Hinkle & Mitchell, 1970], исходно предполагалось, что амплитуда "быстрой" электрогенной компоненты в ходе P->F и F—Ю переходов соответствует переносу электрона от СиА к гему а на 1/2 величины диэлектрического барьера мембраны. В этом случае, суммарная амплитуда миллисекундных протонных фаз (80% в F->0 или Р—>F переходе) может соответствовать трансмембранной транслокации 2 полных зарядов и включать в себя транслокацию из внутренней водной фазы в двухядерный центр субстратного протона на половину толщины мембраны и сопряженную электрогенную транслокацию двух помпируемых протонов: одного - через всю мембрану и еще одного - на половину ее толщины, то есть "полутора помпируемых протонов" на 1 одноэлектронный переход [Zaslavsky et al., 1993; Siletsky et al., 1999].

Рисунок 10. Кинетика редокс-превращений гема а в переходе Р—>0 в очищенной ЦО дикого типа из Я..чрИаего1с1е5 (\¥Т) и мутанта (N1390). Условия: 20 мкМ ЦО, 5 мМ Трис/ацетат буфер, 0.1% додецилмальтозид, 40 мкМ ЯиЬру, 10 мМ анилин, 2 мМ Н2О2. Две абсорбционные кривые отнормированы по амплитуде фотовосстановления гема а.

Чтобы достоверно оценить электрогенное расстояние между Сид и гемом а в предстационарных условиях и определить точное число зарядов, транслоцируемых в разрешенных во времени одноэлектронных переходах, нами была исследована генерация мембранного потенциала цитохромоксидазой с мутацией N1390 в начальной части О-канала [Б^эку й а1., 2004]. Данная мутация полностью сохраняет кислород-редуктазную активность ЦО, но приводит к полной утрате способности к трансмембранной перекачке протонов.

Как можно видеть на рисунке 10, реокисление тема а биядерным центром (снижение поглощения Аш) в переходе Р-Ю мутанта N1390 и ЦО дикого типа происходят с близкими скоростями. То есть, мутация N1390 не оказывает влияния на перенос электрона через гемовые центры ЦО. Фотоиндуцированная кинетика генерации мембранного потенциала непомпирующего мутанта N1390 представлена на рисунке 11 и может быть использована в качестве калибровки суммарной транслокации помпируемых протонов в И—>0 переходе протон-помпирующих оксидаз.

Генерация мембранного потенциала в мутантной ЦО обусловлена электрогенными составляющими микросекундной компоненты переноса электрона с внешней стороны мембраны к гему а и чувствительной к цианиду, миллисекундной (т~0.6 мс) компоненты переноса субстратного протона из внутренней водной фазы в ВМС, в ходе химического превращения интермедиата Р в О. С учетом выхода соединения Р в мутанте N1390 (-70%), относительная амплитуда чувствительной к цианиду -0.6 мс компоненты в фотоэлектрическом ответе составляет -1.65 от амлитуды электрогенного переноса электрона между СиА и гемом а.

Рисунок 11. Электрогенные ответы, сопряженные с Р—Ю переходом ЦО дикого типа из И.5рИаего1с1е8 (\УТ) и мутантов с единичными заменами N1390 и Е286С2. Основные условия как на рисунке 7. Эксперименты проводились с приклеенными к коллодиевой пленке протеолипосомами ЦО в среде: 5 мМ Трис-ацетат (рН 8), 40 мкМ ЯиЬру, 10 мМ анилин. Чтобы перевести фермент в исходное состояние Р, добавляли 2 мМ Н202. В случае мутанта Е286(3, был добавлен 0.2 мМ феррицианида калия, для того чтобы поддерживать гем а в окисленном состоянии.

Поскольку гем а и биядерный центр располагаются на одинаковом расстоянии от поверхности мембраны, то из полученного отношения следует, что электрогенное расстояние ВМС и гема а от внешней поверхности мембраны составляет -0.38 толщины

3,0

время, мс

мембранного диэлектрика. Эта величина близка к оценке геометрического расположения гема а в трехмерной структуре ЦО относительно внешней поверхности мембраны. Сравнение амплитуды -0.6 мс электрогенной фазы, отражающей перенос субстратного протона из внутренней водной фазы в ВЫС на расстояние -0.62 толщины мембранного диэлектрика, с ответом митохондриальной ЦО и бактериальной ЦО дикого типа позволяет оценить дополнительный электрогенный вклад, возникающий в одноэлектронном переходе помпирующего фермента в результате транслокации помпируемого протона [виейку е! а1., 2004].

Поскольку амплитуда "быстрой" электрогенной фазы, соответствующей переносу электрона от СиА к гему а, составляет -20% от полной величины фотоэлектрического ответа в одноэлекгронных Р—Ю и Р—>Р переходах [газкуэку е! а1., 1993; Б^эку е1 а1., 2010], суммарная амплитуда "средней" и "медленной" протонных электрогенных фаз соответствует транслокации -1.52 заряда через всю толщину мембранного диэлектрика. Учитывая амплитуду переноса субстратного протона в биядерный центр (-0.62), дополнительный электрогенный вклад, наблюдающийся в помпирующем ферменте, соответствует трансмембранному переносу -0.9 (то есть не более 1) помпируемого протона.

Последовательность проведения помпируемого и субстратного протонов в переходе

Р—Ю цитохромоксидазы.

В отличие от "быстрой" электрогенной фазы, для чувствительной к цианиду части фотоэлектрического ответа ЦО, отражающей стадии сопряженного переноса протонов, наблюдается заметный эффект изотопного замещения при проведении измерений в ОгО (рис. 12). Как оказалось, различие в чувствительности к ОзО/РЬО изотопному замещению может служить независимым инструментом для разделения и идентификации "средней" и "медленной" фаз генерации потенциала в Р—Ю переходе. При проведении измерения в 020, "средняя" протонная фаза в ЦО дикого типа замедлялась в 1.4-1.5 раза, в то время как характеристическое время "медленной" электрогенной фазы увеличивалось в 3.5-4 раза (табл. 2, [Э^вку й а1., 2004]).

0,10

0,05

0,00

0 5 10

время, мс

0 5 10 время, мс

Рисунок 12. Действие замены 020/Н20 на кинетику генерации мембранного потенциала ЦО дикого типа (А) и мутантной ЦО с заменой N1390 (Б). Основные условия как на рисунке 7. Где указано, буфер среды измерения был приготовлен на основе 020.

В фотоэлектрическом ответе мутанта N1390, замедление в Б20 чувствительной к цианиду -0.6 мс электрогенной фазы в 3.5-4 раза практически идентично кинетическому изотопному эффекту, наблюдаемому для "медленной" (т~1.5 мс) электрогенной фазы в диком типе и, в тоже время, значительно больше, чем кинетический изотопный эффект на "среднюю" (т~0.5 мс) фазу (табл. 2). Это означает, что -0.6 мс протонная фаза в N1390 мутанте соответствует "медленной" фазе электрогенной кинетики дикого типа, то есть электрогенное движение субстратного протона в ЦО дикого типа происходит в "медленной" электрогенной фазе [ЭИ^яку й а!., 2004].

Таблица 2. Чувствительность перехода Г—Ю к изотопному замещению ионов водорода.

Протонная электрогенная фаза Дикий тип N1390

н2о о2о н2о о2о

мс мс

"Средняя" 0.53 0.77 0.62 2.44

"Медленная" 1.46 4.9

Поскольку оксидаза с мутацией N1390 не переносит протоны через мембрану, то, следовательно, отсутствующая в мутанте "средняя" электрогенная фаза отражает в цитохромоксидазе дикого типа электрогенное перемещение помпируемого протона. Отсюда также следует, что в механизме сопряженного протонного транспорта

цитохромоксидазы, электрогенное перемещение помпируемого протона предшествует электрогенному перемещению субстратного протона.

Высвобождение протона на внешнюю сторону мембраны происходит в "медленной" электрогенной фазе. Ингибирование электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе ионами цинка.

В настоящее время принято считать, что выход помпируемого протона из ЦО на внешнюю сторону мембраны может осуществляться с помощью разветвленной сети гидрофильных остатков и молекул воды вблизи внешней поверхности ЦО [Mills et al., 2000; Sugitani et al., 2009]. Однако более точно локализовать траектории выхода протона на внешнюю сторону мембраны в трехмерной структуре фермента пока не удалось, несмотря на применение методов направленного мутагенеза. В этой связи, продуктивным оказалось использование ионов цинка, как поверхностного ингибитора протонного транспорта в ЦО [Kuznetsova et al., 2005].

Ионы цинка специфически ингибируют протонный транспорт в ряде мембранных белков [Skulachev et al., 1967; Lorusso et al., 1991; Paddock et al., 1999; Nicholls et al., 1988; Berry et al., 2000; Kuznetsova et al., 2005]. В ходе исследования влияния Zn2+ на ЦО выяснилось, что в цитохромоксидазе имеются сайты связывания цинка, располагающиеся как со стороны внутренней водной фазы, вблизи входа в D-канал, так и с внешней стороны мембраны.

Рисунок 13. Ингибирование ионами электрогеннои активности митохондриальнои ЦО, сопряженное с переходом фермента из состояния Б в состояние О. Перед опытом протеолипосомы в течение 30 мин. инкубировались в среде измерения, содержащей 5 мМ Трис-ацетат, рН 8.0, 10 мМ анилин, 40 мкМ ЯиЬру и 4 мМ Н2О2. После записи контрольной кривой 1, в кювету был добавлен 100 мкМ 7пСЬ и через 5 мин. записана кривая 2. Кривые 1 и 2 нормированы по амплитуде "быстрой" электрогенной фазы.

Взаимодействие Zn2+ с цитохромоксидазой с внутренней стороны мембраны отвечает за основные эффекты ионов цинка на солюбилизированный фермент [Kannt et al., 2001; Aagaard et al., 2002; Martino et al., 2011]. В тоже время, в некоторых условиях продемонстрировано действие ионов цинка на стационарную активность ЦО с внешней стороны цитохромоксидазных протеолипосом [Mills et al., 2002; Kuznetsova et al., 2005].

Как можно видеть на рисунке 13, при измерении с временным разрешением фотоиндуцированной генерации мембранного потенциала ЦО в переходе F—»О в присутствии 100 мкМ Zrfдобавленного с внешней стороны мембраны к цитохромоксидазным протеолипосомам, протонная составляющая кинетики образования ДЧ* значительно замедляется. Существенно, что вызванное ионами цинка замедление обусловлено специфическим торможением "медленной" электрогенной фазы, что свидетельствует о связи "медленной" компоненты кинетики генерации ДТ с процессом высвобождения помпируемого протона во внешнюю водную фазу. Кроме того, это указывает на возможное контролирование, вцелом, электрогенного переноса протонов в "медленной" электрогенной фазе стадией высвобождения помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны.

ОСОБЕННОСТИ ОДНОЭЛЕКТРОННЫХ ПЕРЕХОДОВ В КАТАЛИТИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ /шгТИПА ИЗ T. THERMOPHILUS

Цель - выяснить структурно-функциональные особенности неканонической цитохромоксидазы Ьаз из T.thermophilus, обусловливающие уменьшение усредненной стехиометрии протонного насоса; установить интермедиаты каталитического цикла; выяснить особенности взаимодействия каталитического центра с лигандами.

В отличие от классических цитохромоксидаз семейства А гем-медного суперсемейства, ЦО Ьаз из Thermus thermophilus относится к эволюционно удаленному малоизученному семейству В и характеризуется вдвое меньшей усредненной стехиометрией помпирования протонов [Kannt et al., 1998], то есть переносит через мембрану в среднем ~0.5 Н+/е. Как соотносится усредненная дробная стехиометрия протонного насоса ЦО с транслокацией помпируемых протонов на отдельных одноэлектронных стадиях каталитического цикла? Может ли изменение усредненной стехиометрии помпирования свидетельствовать о принципиальном отличии механизма помпирования и сопряжения в оксидазах семейства В?

Электрогенные события, сопряженные с одноэлектронным фотовосстановлением ЦО Ьаз-типа из Т.ЛегторЫ1и%.

На рисунке 14 показана генерация ДТ встроенной в протеолипосомы окисленной (состояние О) цитохромоксидазы баз в ответ на вспышку лазера в присутствие ЯиЬру. Фотовосстановление от комплекса ЯиЬру сопровождается быстрым нарастанием мебранного потенциала, соответствующего переносу положительного заряда изнутри липосом наружу. Основной вклад в фотоэлектрический ответ вносят две компоненты с Т1~15 мкс и Тг~250 мкс и соотношением амплитуд 3:2, соответственно (рис. 14, кривая а).

В параллельной кинетике изменения оптического поглощения, компоненты с аналогичными характеристическими временами отражают, соответственно, перенос электрона от СиА на гем Ъ и последующее частичное (~30%) реокисление гема Ь биядерным центром [ЭИйэку й а1., 2009]. Учитывая распределение электронной плотности от гема Ь в биядерный центр [БИ^вку й а1. 2009], электрогенность сопряженного переноса протона в фазе с Тг~250 мкс соответствует транслокации одного субстратного протона из внутренней водной фазы к биядерному центру на расстояние около 2/3 толщины мембранного диэлектрика. Это означает, что в каталитическом цикле ЦО баз-типа, перенос первого электрона в окисленное состояние О биядерного центра несопряжен с транслокацией помпируемого протона.

время, мс

Рисунок 14. Свето-индуцированная генерация мембранного потенциала цитохромом баз. Реакционная среда содержала буфер 5 мМ Трис-ацетат (рН 8), 40 мкМ ЯиЬру, 10 мМ анилин. Фотоэлектрические кривые были зарегистрированы на одном и том же образце без добавок (а) и после добавления Н2О2 в указанных концентрациях (Ь и с).

В отличие от канонических цитохромоксидаз, биядерный центр окисленной ЦО Ьаз практически не связывает внешние лиганды и, соответственно, не образует в присутствии

Н2О2 или при обработке смесью СО/О2 детектируемого количества интермедиатов Р или/и F [Siletskiy et al., 1999]. Несмотря на это, при инъекции электрона от Rubpy в присутствии Н2О2 наблюдается дополнительная электрогенная фаза (рис. 14, кривые Ь, с). Однако, в отличие от ЦО ааз-типа, скорость данной компоненты кинетики Ьа^ оксидазы прямо пропорциональна концентрации перекиси водорода в изученном диапазоне (0.5-80 мМ) с константой скорости второго порядка ~2000 М"'с"' [Siletskiy et al., 1999]. Это означает, что данная электрогенная компонента индуцирована инъекцией электрона в ЦО и лимитируется скоростью взаимодействия Н2О2 с биядерным центром.

Неактивный в окисленном состоянии, биядерный центр ЦО баз-типа приобретает, таким образом, способность связывать лиганды (переходит в активное состояние) в ответ на восстановление гема b [Siletskiy et al., 1999]. Подобные особенности были отмечены ранее в случае ряда других гемопротеидов, включая двухгемовую пероксидазу из P.denitrificans и cd\ нитрат редуктазу [Ни et al., 1997; Williams et al., 1997].

Интермедиаты каталитического цикла, разрешаемые при окислении кислородом восстановленной ЦО Ьаз из T.thermophilus в режиме одного оборота

Поскольку окисленная цитохромоксидаза баз-типа из T.thermophilus не связывает экзогенные лиганды и не образует состояний частичного восстановления кислорода в биядерном центре, для установления интермедиатов каталитического цикла мы использовали синхронный запуск каталитической реакции во всей популяции фермента с помощью фотолиза комплекса восстановленной ЦО с окисью углерода в присутствии кислорода (т.н. метод "флоу-флэш", [Gibson et al., 1963]). Кинетика переноса электронов отслеживалась по спектральным изменениям редокс-центров, сопровождающим их редокс-превращения в ходе оксидазной реакции [Siletsky et al., 2007]. Параллельно исследовалась быстрая кинетика электрогенного переноса электронов и протонов в ферменте с помощью "прямого" электрометрического метода [Drachev et al., 1978; Drachev et al., 1979].

В результате глобальной аппроксимации двумерного массива спектрально-кинетических данных, собранных в ходе реакции окисления полностью восстановленной баз оксидазы кислородом, были выявлены 4 последовательные перехода в каталитическом цикле фермента с Ti~5.3 мкс, т2~13 мкс, Тз~30 мкс и Т4-750 мкс. Разностные спектры разрешенных кинетических компонент представлены на рисунке 15. В спектре первой кинетической компоненты (рис. 15А), уменьшение поглощения при 615 нм и увеличение поглощения при 595 нм и 560 нм отражают, соответственно, исчезновение несвязанной с

лигандом восстановленной формы тема аз и появление окси-комплекса или т.н. компаунда А (переход R-+A) [Hill et al., 1983].

В спектре второй кинетической фазы (тг~13 мкс, рис. 15Б), уменьшение поглощения при 560 нм вместе с пиком при 612 нм указывает на одновременное окисление тема b и образование состояния Р. На этой стадии, также как и в ЦО из митохондрий, молекула Ог расщепляется и принимает суммарно 4 электрона от тема аз, Сив и остатка тирозина 237 (аналог редокс-активного остатка тирозина Y288 в ааз оксидазах), образующего ковалентную связь с гистидиновым лигандом Сив ■

0.05 О

-0.05

-0.1 0.2

0.2 0.1 О -0.1

0.2

w—^ х4 А

J~ и. х4

х4 Г

400 500 600 700

Длина волны, нм

Рисунок 15. Оптические спектры кинетических компонент в реакции полностью восстановленного цитохрома баз с молекулярным кислородом. (А) Первая компонента реакции, ц~5 мкс. (Б) Вторая компонента, t2~13 мкс. (В) Третья компонента, тз~30 мкс. (Г) Четвертая компонента, т4~740 мкс. Видимая область спектра (alpha) увеличена в 4-раза.

Спектр третьей кинетической компоненты (Тз~30 мкс, рис. 15В) принципиально отличается от такового в случае ЦО из митохондрий. В оксидазах семейства А данная стадия реакции приводит к образованию из состояния Р (максимум при 607 нм) состояния F биядерного центра (максимум при 580 нм), что является результатом переноса протона из внутренней водной фазы в BNC, к связанному с Сив гидроксил-аниону, и сопровождается синхронным переносом электрона от Сид на низкоспиновый гем а. В Ьаз

оксидазе, в ходе данной кинетической фазы происходит полное ревосстановление низкоспинового гема Ъ от СиА (увеличение поглощения при 560 нм), однако спектральные изменения полосы поглощения гема аз отсутствуют (рис. 15В).

Спектр четвертой фазы в разрешенной кинетике цитохромоксидазы ¿аз указывает на образование окисленного состояния О (увеличение поглощения в полосе с переносом заряда при 660 нм), а также исчезновение интермедиата гема аз с пиком -612 нм и перенос электрона в биядерный центр от гема Ъ (уменьшение поглощения при 612 нм и 560 нм, соответственно) (рис. 15Г). Таким образом, спектральные и кинетические параметры разрешаемых состояний А, Р и О оксидазы Ьаъ-типа сходны с таковыми в митохондриальной ЦО. Однако аналог состояния Б ВИС в кинетике ЦО ¿>а3-типа не обнаруживает характерных спектральных признаков интермедиата Б аа3 оксидаз.

Стадии генерации мембранного потенциала, сопряженные с окислением восстановленной Ьаз оксидазы из Т.ЛегторЫ1иБ кислородом в режиме одного оборота

В паралельной кинетике генерации мембранного потенциала в ходе одного каталитического оборота баз оксидазы также выделяются 4 компоненты (рис. 16). Фотоэлектрический ответ начинается с микросекундной лаг-фазы (-5-6 мкс), отражающей электрометрически невидимые процессы высвобождения СО, связывания кислорода и образования состояния А. Вслед за лаг-фазой следуют три компоненты развития мембранного потенциала, соответствующие переносу положительного заряда через мембрану в направлении с Ы- к Р-стороне липосомальной мембраны (рис. 16).

время, мс

Рисунок 16. Кинетика генерации мембранного потенциала (черная линия) в ходе реакции полностью восстановленной цитохромоксидазы баз с кислородом. Через экспериментальную кривую проведена теоретическая (серая линия). Параметры теоретической кривой: к[=190 мс"1 (амплитуда=0 мв), к2=90 мс"1 (0.69 мв), к3=21.9 мс-1 (4.33 мв), к4=1.84 мс"1 (6.55 мв), к5=0.56 мс"1 (0.35 мв). Условия: 100 мМ НЕРЕЭ (рН 8), 50 мМ глюкоза, 50 мкг/мл каталаза, 120 мкг/мл глюкозоксидаза, 10% СО в смеси с аргоном. Реакция начиналась через 1.4 с после впрыска 100 мкл насыщенного кислородом буфера.

Вторая фаза электрометрического ответа (т~11 мкс) цитохрома bai соответствует константе скорости перехода А—»P в оптических измерениях и составляет -6% от полной амплитуды ответа. Основная часть кинетики генерации потенциала (около 90%) образуется в третьей (~45 мкс, -36%) и четвертой (-550 мкс, -55%) электрогенных фазах, которые относятся, соответственно, к третьему и четвертому переходу в оптических измерениях.

Чтобы определить точное число зарядов, переносимых через мембрану на каждой вычленяемой в ходе измерения одного оборота фермента стадии, мы параллельно исследовали реакцию обратного тока электронов в частично восстановленном ферменте. Данная реакция представляет собой перенос электрона из BNC во входные редокс-центры после фотолиза окиси углерода в отсуствие кислорода. На рисунке 17 показана кинетика обратного переноса электрона в ¿аз оксидазе, зарегистрированная с помощью оптической спектроскопии в полосе поглощения восстановленного гема аз при 445 нм (черная линия) и с помощью электрометрических измерений (серая линия).

время, МС

Рисунок 17. Кинетика обратного переноса электрона в оксидазе баз. Оптические изменения полосы поглощения восстановленного гема аз (445 нм, черный цвет, ось справа) и паралельные электрометрические измерения (серый цвет, ось слева). Оптические измерения проводились на детергетном растворе фермента. Условия: 7 мкМ баз цитохромоксидаза, 0.1% додецил мальтозид, 0.1 М НЕРЕБ (рН 7.4), 1 атм. СО, оптический путь 1 см. Условия электрометрических измерений как на рис. 16.

Кинетика изменения поглощения А445 начинается с неразрешаемого скачка, вызванного фотодиссоциацией СО от гема аз и образованием несвязанного с лигандом восстановленного гема аз. Последующее снижение поглощения с т—40 мкс отражает уход электрона с гема аз. Учитывая соответствующие коэффициенты экстинкции при 445 нм

для абсорбционных изменений, вызванных фотолизом СО и окислением тема аз [1лао е1 а1., 1996], величина фракции окисляющегося тема аз составляет-4.2%.

Образующийся параллельно трансмембранный потенциал (рис. 17, серая линия) отражает электрогенное перераспределение электронной плотности между гемом аз в биядерном центре и СиА. Учитывая фракцию окисляющегося гема аз, амплитуду параллельной электрогенной транслокации заряда и геометрическое расстояние между биядерным центром и СиА, оказывается возможным оценить величину генерации мембранного потенциала в ЦО, соответствующую переносу одного заряда на всю толщину мембранного диэлектрика. Это позволило нам в конечном итоге рассчитать электрогенность отдельных разрешаемых кинетических фаз в реакции полностью восстановленной ЦО с кислородом в режиме одного оборота. Число зарядов, переносимых через мембрану во второй, третьей и четвертой электрогенных компонентах, составило 0.15,1.0,1.68 заряда, соответственно [811е15ку е1 а1., 2007].

На рисунке 18 приведена схема интермедиатов каталитического цикла цитохромоксидазы баз из ТлЪегторЬИт в ходе окисления кислородом восстановленного фермента в режиме одного молекулярного оборота. Сопряженная с образованием состояния Р генерация мембранного потенциала в оксидазе Ьщ, эквивалентна по величине переносу заряда на -15% толщины мембранного диэлектрика, что составляет около 4А и отражает электрогенное перемещение в биядерный центр протона, необходимого для разрыва кислород-кислородной связи. Донором протона служит, по-видимому, остаток тирозина 237 (аналог редокс-активного остатка тирозина У288 в аа3 оксидазах), образующий ковалентную связь с гистидиновым лигандом Сив и располагающийся ниже Сив, на соответствующем расстоянии от биядерного центра (рис. 18).

Амплитуда электрогенного переноса зарядов в баз оксидазе на стадии, соответствующей во времени переходу Р—»И, эквивалентна транслокации через всю толщину мембранного диэлектрика в точности одного заряда. Образующийся мембранный потенциал обусловлен перемещением электрона от СиА к гему б на 1/3 толщины мембранного диэлектрика и сопряженным переносом протона из М-фазы в направление к ВТЧС, на расстояние 0.6-0.7 толщины мембранного диэлектрика (рис. 18, [ЭПййку е1 а1. 2007]). Следовательно, в отличие от оксидаз семейства А, трансмембранной перекачки протона на данной стадии каталитического цикла ЦО баз-типа не происходит.

Отсутствие в спектре соответствующего интермедиата цитохромоксидазы баз пика поглощения с максимумом -580 нм, типичного для интермедиата Р в оксидазах лаз-типа, означает то, что ходе данной стадии перенес протона из М-фазы происходит не в биядерный центр, а в его окрестность, не возмущая таким образом электронную структуру

тема аз и не влияя на его спектр [ЭПйзку е1 а1., 2007]. Одним из наиболее вероятных акцепторов протона является консервативный остаток редокс-активного тирозина (У237 в оксидазе баз), который был депротонирован в ходе предшествующей стадии А-»Р (рис. 18).

1.7 х 108 М'1с'1 7.5 х 104 с"' 3.5 х 104 с"1 1.3х103с'

СиА

-в- -в- г©- -С4- -О

□ I' Л « — ЧЙР— _ ^0"/

м а —— 4------' ^ : ^

_ УОН . УОН УО~ |УОН _ УОН

А Р„ / В О

Н+ и+ и*

«.и п помп п хим

Рисунок 18. Схема интермедиатов каталитического цикла цитохромоксидазы баз из Т.ЛегторИЦия, разрешаемых в кинетике окисления кислородом в режиме одного оборота. Ромб и квадрат обозначают гемы Ъ и аз соответственно; круги - СиА и Сив. В начальном состоянии (II) все редокс-центры восстановлены. Стадии переноса электрона и протонов обозначены пунктирными стрелками и указывают события, проиходящие на последующем этапе реакции.

Амплитуда электрогенного переноса зарядов в ЦО баз-типа на стадии, соответствующей во времени Б—»О переходу, в -1.7 раза выше, чем на предшествующей стадии и близка к таковому для Б—>0 перехода каталитического цикла в оксидазах семейства А [.ГаваМз й а1., 1999; БП^йку й а1., 1999; БП^эку е1 а1., 2007]. Суммарная транслокация зарядов в оксидазах обоих типов на стадии, соответствующей во времени переходу Б—»О, включает в себя перенос обоих типов протонов: субстратного (на величину -0.6-0.7 от толщины мембраны) и помпируемого (с М-стороны на внешнюю сторону мембраны).

ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности общей организации сопряженного переноса протонов на отдельных стадиях каталитического цикла цитохромоксидазы

Исходя из равновесных окислительно-восстановительных титрований редокс-активных групп ЦО считалось, что восстановительная часть каталитического цикла не сопряжена с трансмембранным переносом протонов (переходы О—>Е и Е-»11, рис. 19), и основная часть эндергонического процесса электрогенной перекачки протонов происходит в окислительной полуреакции (переходы Р->Б и Б-»0, рис. 19) [ВаЬсоск е1

al., 1992; Wikstrom et al., 1989; Ferguson-Miller et al., 1996; Gennis, 1998; Vygodina et al., 1997].

В приведенных выше предстационарных измерениях, при инъекции электрона от Rubpy в находящуюся в обычном окисленном состоянии (О) цитохромоксидазу митохондрий, электрон-транспортная реакция ограничивается переносом электрона от СиА на гем a [Nilsson, 1992; Siletsky et al., 1999; Verkhovsky et al., 2001]. Биядерный центр не восстанавливается в миллисекундной временной шкале, и чувствительные к цианиду электрогенные компоненты переноса протонов практически отсутствуют.

Рисунок 19. Схема каталитического цикла цитохромоксидазы семейства А. Переходы от состояния Я к Он образуют окислительную часть, в то время как переходы от Он к Я -восстановительную часть каталитического цикла. Протоны, переносящиеся в ходе каталитического цикла через Б- и К- протон-проводящие пути, обозначены как Ни' и Нк+, сооответственно. Для окислительной фазы реакции приведена структура промежуточных состояний гема аз каталитического центра. Радикал редокс-активного остатка тирозина обозначен как Туг-О*. В случае отслеживания реакции с кислородом в исходно полностью восстановленной (4-мя электронами) ЦО, обычное состояние Р (Рм на рисунке) не разрешается. При превращении интермедиата А, радикал редокс-активного тирозина ревосстанавливается, вследствие переноса электрона от гема а. Образующееся состояние Р биядерного центра (Ря на рисунке) обладает сходным спектром поглощения в видимой области с таковым для состояния Рм.

Данное явление можно было объяснить двояко. Либо модель, основанная на равновесных титрованиях ЦО, верна, и перенос всех помпируемых протонов сосредоточен в окислительной части каталитического цикла, либо используемое окисленное состояние ЦО функционально неактивно и не участвует в каталитическом цикле. Проведенное предстационарное исследование генерации мембранного потенциала мутантной оксидазой (N139D), полностью сохраняющей кислород-редуктазную активность и утрачивающей способность к трансмембранной перекачке протонов, позволило нам достоверно оценить электрогенность одноэлектронных переходов в окислительной фазе ЦО [Siletsky et al., 2004]. Учитывая перенос субстратного протона в BNC из внутренней водной фазы на расстояние (-0.62) толщины мембранного диэлектрика, дополнительный электрогенный вклад в одноэлектронном Р—>F и F—>0 переходе помпирующего фермента, по сравнению с несопряженным мутантом, соответствует трансмембранному переносу —0.9 (то есть всего одного) помпируемого протона.

Одновременно, в работах группы Верховского с временным разрешением было показано [Bloch et al., 2004; Belevich et al., 2007], что непосредственно после быстрого окисления восстановленной ЦО образуется коротко живущее окисленное состоянии Он, отличающееся по функциональным свойствам от обычного покоящегося окисленного состояния (О). Инъекция электрона с помощью Rubpy в метастабильное состояние Он сопровождается быстрым переносом электрона в биядерный центр и сопряженными стадиями электрогенной транслокации протонов [Bloch et al., 2004; Belevich et al., 2007; Siletsky et al., 2009; Siletsky et al., 2011]. Характеристики электрогенных фаз, разрешенных в одноэлектронном переходе Он—>Ен [Belevich et al., 2007], вцелом напоминают таковые для переходов в окислительной фазе и согласуются с трансмембранной перекачкой одного помпируемого протона, что дает основания полагать, что каждый из 4-х одноэлектронных переходов в ЦО, включая наименее изученный переход Ен—»R, сопряжены с переносом одного помпируемого протона (рис. 19).

Общая организация механизма сопряженной перекачки протонов имеет универсальные черты, проявляющиеся, по-видимому, и в случае цитохромоксидаз эволюционно удаленного семейства В. При использовании предстационарных измерений нами было установлено, что дробная стехиометрия помпирования (0.5 Н+/е вместо 1 Н+/е), наблюдающаяся в стационарных измерениях ЦО bai из T.thermophilus, является результатом того, что часть одноэлектронных переходов в каталитическом цикле цитохромоксидазы baj не сопряжена с переносом помпируемых протонов. То есть,

ограничивается электрогенной транслокацией субстратного протона, необходимого для протонирования интермедиатов восстановления кислорода.

В тоже время, разрешаемая электрогенная стадия цитохромоксидазы баз из ТлЬегторЬИиз, соответствующая во времени переходу И—»О ЦО из митохондрий, также как и в случае цитохромоксидаз семейства А, сопряжена с трансмембранным переносом в точности 1 помпируемого протона. Остается неизвестным происходит ли сопряженный перенос помпируемого протона на стадии переноса в ВИС 2-го электрона в каталитическом цикле ЦО ¿аз-типа (переход Е—а также в случае переноса 1-го электрона в окисленное состояние Он, образующееся непосредственно после окисления ЦО. Однако, в совокупности с двукратным снижением усредненной стехиометрии помпирования в цитохромоксидазе баз, имеющиеся результаты указывают на сопряженный трансмембранный перенос по одному помпируемого протону в двух из четырех одноэлектронных переходов каталитического цикла данного фермента.

Функциональная роль протон-проводящих каналов.

Электрогенная транслокация протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидаз аа3-типа семейства А происходит через протон-проводящие структуры (Б и К-каналы), содержащие критически важные консервативные протон-обменивающие группы [Б^вку е1 а1., 1996; Ког^апйпоу е! а1., 1997; 5Пе15ку е1 а1., 2004; Б^эку й а1., 2010]. При этом, участие протон-проводящих путей в проведении протонов разных типов на отдельных стадиях каталитического цикла организовано нетривиально (рис. 19).

Несмотря на то, что И-Ю переход ЦО сопряжен с транслокацией протонов обоих типов, однако только мутации в Э —канале (но не в К-канале) приводят к подавлению чувствительных к цианиду миллисекундных компонент генерации потенциала и, соответственно, электрогенного переноса протонов на стадии Б—Ю. В тоже время, спектральные характеристики гема аз в мутантах по К-каналу (гем а3 остается в окисленном высокоспиновом состоянии в случае мутанта К362М) свидетельствуют о том, что торможение энзиматической активности в них обусловлено ингибированием восстановительной полуреакции каталитического цикла. Обнаружение несопряженной мутации N1390 в Б-канале, полностью утрачивающей способность к трансмембранной перекачке протонов, свидетельствует о том, что К-канал не участвует в проведении помпируемых протонов вовсе, в то время как Б-канал обеспечивает перенос всех помпируемых протонов в каталитическом цикле: как в окислительной полуреакции, так и в восстановительной (рис. 19).

Роль К-канала ограничивается доставкой субстратных протона(ов) в восстановительной полуреакции каталитического цикла. В подтверждении результатов функциональных исследований, в кристаллической структуре цитохромоксидазы был обнаружен механизм временного отключения К-канала [От е1 а1., 2009]. Как выяснилось, в кристаллах окисленной ЦО верхняя часть К-канала перекрыта в результате образования водородной связи между гидроксильной группой фарнезильного заместителя гема аз и редокс-активным остатком тирозина. В кристаллах восстановленной ЦО данная водородная связь отсутствует и замещается молекулами воды. Редокс-сопряженные конформационные изменения в структуре ЦО свидетельствуют, таким образом, о том, что верхняя часть К-канала закрыта в окислительной части и открывается в восстановительной части каталитического цикла ЦО, обеспечивая возможность переноса субстратных протонов в биядерный центр через него [От е1 а1., 2009].

Последовательность элементарных событий, составляющих суть "средней" и "медленной" протонных стадий в одноэлектронном переходе ЦО

Трансмембранная транслокация протона в отдельных одноэлектронных переходах окислительной фазы каталитического цикла ЦО (Р—>Р и Р—>0) происходит засчет свободной энергии переноса электрона от гема а в каталитический центр фермента. Исключительный редокс-центр в ферменте, редокс-превращения которого "прямо" сопряжены с транслокацией помпируемого протона, выделить не удается. Сопряженный электрогенный транспорт протонов в каждом из одноэлектронных переходов включает в себя две кинетически разрешаемые стадии ("среднюю" и "медленную").

Разрешаемые в переходах Р-»Р и Р—>0 протонные электрогенные компоненты, "средняя" и "медленная", характеризуются соотношением наблюдаемых амплитуд ~1:3. Использование модели двух последовательных кинетических стадий приводит к соотношению истинных амплитуд "средней" и "медленной" компонент, как —1:1.1 (Материалы и методы (1), [Мес1уе(1еу й а1., 2005; БПйБку е1 а1., 2006]). Относительная амплитуда "средней" и "медленной" электрогенных фаз для перехода Р—Ю в митохондриальном ферменте составляет, в этом случае, —1.9 и ~2.1 от величины "быстрой" электрогенной фазы. То есть, соответствует переносу в каждой из фаз одного протона (субстратного или помпируемого) из внутренней водной фазы через большую часть мембранного диэлектрика в окрестность биядерного центра, с минорным дополнительным вкладом других сопряженных внутрибелковых перемещений заряда. Вероятным промежуточным донором протона, обеспечивающим проведение помпируемого и субстратного протонов, является консервативный остаток Е286 в верхней

части О канала, расположенный на расстоянии -0.56 геометрической толщины мембраны от внутренней водной фазы (рис. 20, [\ledvedev е1 а1., 2005]). Электрогенное расстояние между остатком Е286 и биядерным каталитическим центром составляет -0.15 диэлектрической толщины мембраны ЦО [8Пе15ку е1 а1., 2010].

В несопряженной ЦО с мутацией N1390 происходит специфическое ингибирование "средней" элекгрогенной фазы, в то время как ионы цинка, добавленные снаружи протеолиопосом, тормозят "медленную" электрогенную фазу переноса протонов. Следовательно, "средняя" электрогенная компонента ассоциирована с переносом помпируемого протона, в то время как "медленная" электрогенная фаза обусловлена электрогенным переносом субстратного протона в направлении биядерного центра [БП^яку е1 а1., 2004], а также выходом помпируемого протона на внешнюю стороны мембраны. Совокупность данных свидетельствует о том, что в "средней" электрогенной фазе помпируемый протон, в результате синхронного депротонирования и репротонирования Е286 из внутренней водной фазы, переносится к внешней поверхности мембраны и локализуется на некоем промежуточном акцепторе протона - в т.н. протон-загрузочном сайте (РЬБ). РЬЭ располагается над биядерным центром, на пути выхода протона на Р-сторону мембраны (рис. 20). Точная локализация РЬЭ неизвестна. Однако, наиболее вероятными кандидатами на эту роль являются пропионатный заместитель А гема аз и один из гистидиновых лигандов (Н334) медного центра Сив.

Как показано на рисунке 20, набор частных стадий переноса зарядов, входящих в состав "средней" электрогенной фазы, включает в себя: перенос электрона вдоль плоскости мембраны от гема а к гему аз4+=02" (стадия 3), электрогенный перенос Н+ от остатка Е286 к первичному акцептору протона (РЬБ) и одно из последовательных электрогенных репротонирований остатка Е286 из внутренней водной Ы-фазы через Э-канал (стадии 2,4). Согласно данным рентгено-структурного анализа [Бусг^оп-Ек е1 а1., 2002], переносу протона от Е286 к протон-акцептороному сайту (Р1_5) предшествует стадия изомеризации Е286 (рис. 20, стадия 1). "Медленная" электрогенная протонная фаза включает в себя второе репротонирование остатка Е286 (рис. 20, стадия 6), следующее за переносом от Е286-СООН к кислород-восстанавливающему сайту протона, участвующего в химическом превращении кислорода. Кроме того, в "медленную" электрогенную фазу включено высвобождение протона из РЬБ на внешнюю сторону мембраны (рис. 20, стадия

7).

Отнесение стадии переноса субстратного протона от Е286 в биядерный центр (рис. 20, стадия 5) к "средней" либо "медленной" электрогенной фазе остается до конца невыясненным. Завершение большей части процесса переноса электрона от гема а в ВМС

в переходах Р—и Б—Ю митохондриальной ЦО синхронно со "средней" фазой паралельной кинетики генерации мембранного потенциала может свидетельствовать об одновременном попадании электрона и субстратного протона в каталитический центр в ходе данной электрогенной фазы в основной части фермента. Возможным донором субстратного протона в этом случае являются молекулы слабо связанной воды, расположенные между Е286 и биядерным центром, либо непосредственно остаток Е286 в О-канале.

Рисунок 20. На схеме приведены основные частные электрогенные стадии, разрешаемые при одноэлектронной фотоинъекции с помощью ЯиЬру в переходе Р—Ю (перенос 4-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы). Перед началом реакции гем аз находится в оксоферрильном состоянии (не показано). Узкие стрелки указывают направление переноса элетрона, в то время как широкие — стадии транслокации протонов. В ходе И—>0 перехода оба протона (субстратный и помпируемый) переносятся через О-канал. Показаны ключевые аминокислотные остатки в Э-канале (0132, N139, Е286) и промежуточный протон-акцепторный сайт (РЬБ). В соответствии с данными рентгено-структурного анализа [Зуепэвоп-Ек й а!., 2002], указаны две возможные конформации остатка Е286 (Е286[ и Е2862). Предполагается, что изомеризация Е286 предшествует переносу протона от Е286 к протон-акцептороному сайту (РЬ8).

Важнейшей задачей дальнейшего изучения механизма сопряжения является выяснение того, каким образом происходит организованное и управляемое движение субстратного и помпируемого протона между внутренним донором протонов (Е286), промежуточным акцептором помпируемого протона (РЬБ) и каталитическим центром (ВМС). Теоретически, это может быть реализовано через изменения рК соответствующих промежуточных доноров и акцепторов протонов (Е286, РЬБ и ВЫС), а также через изменения кинетических параметров переноса протонов между ними. Причиной возникновения таких изменений могут являться сопряженные конформационные изменения в белке, формирование временных цепочек молекул воды, электростатические эффекты при перемещении электрона через редокс-центры либо сочетание этих процессов.

В восстановительной полуреакции каталитического цикла ЦО кинетика генерации мембранного потенциала и переноса электрона через редокс-центры разрешена в группе Верховского в настоящее время только для Он—>Ен перехода [Вс1еу1сЬ е! а1., 2007]. Параметры разрешенных фаз электрогенного переноса протонов напоминают по скорости и амплитуде "среднюю" и "медленную" протонные фазы в переходах исследованной нами окислительной полуреакции ЦО. В отличие от окислительной, в восстановительной полуреакции одновременно работают 2 протонных канала. Донором субстратного протона является К-канал, в то время как через остаток Е286 в О-канале переносится только помпируемый протон (рис. 19). Конечным акцептором электрона в Он—>Ен переходе является Сив [Ве1еуюЬ е1 а1., 2007; Б^вку е1 а!., 2011].

Таким образом, механизм сопряжения и организации помпирования на отдельных стадиях каталитического цикла ЦО имеет как общие черты, так и некоторые отличия, вызванные различием в химии редокс-реакций в биядерном центре и участии протонных каналов в окислительной и восстановительной полуреакциях каталитического цикла ЦО. Дальнейшая детализация структурных изменений ЦО в ходе каталитического цикла, точное установление промежуточной локализации протонов и кинетических параметров их перемещения является необходимой предпосылкой для глубокого понимания и формулирования более общих закономерностей механизма сопряженной транслокации протонов в цитохромоксидазе.

выводы

1. Использование фотоактивируемых комплексов рутения в качестве донора электрона позволяет в предстационарном режиме исследовать отдельные стадии сопряженной транслокации электрона и протонов в каталитическом цикле цитохромоксидазы с микросекундным временным разрешением, недоступном при использовании методов быстрого смешивания.

2. Общая организация стадий внутрибелкового электрогенного переноса зарядов в терминальных гем-медных оксидазах семейства А (митохондриальной цитохромоксидазе и цитохромоксидазе ааз из Я.ярЛаегсн'йез) сходна. Восстановление цитохромом с входного редокс-центра, СиА, является неэлектрогенной реакцией. Перенос электрона от Сид к гему а (т~10 — 40 мкс) сопровождается генерацией мембранного потенциала, соответствующей транслокации отрицательного заряда с внешней стороны мембраны на —1/3 толщины мембранного диэлектрика.

3. Перенос от гема а в биядерный кислород-редуктазный центр 3-го и 4-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидаз семейства А (переходы Р—>Р и Б—»О, соответственно) сопряжен с трансмембранной транслокацией одного помпируемого протона и переносом из внутренней водной фазы к биядерному центру одного субстратного протона

4. Сопряженный электрогенный перенос протонов в переходах Р—»Б и Б—»О каталитического цикла цитохромоксидазы митохондрий включает две кинетически разрешаемые стадии. В первой стадии с т~0.3 мс (Р—»И) и т~1.2 мс (Б—Ю), соответственно, происходит перемещение помпируемого протона из внутренней водной фазы к промежуточному акцептору протона, располагающемуся над биядерным центром. Вторая стадия (т~1.3 мс и т~4.5 мс, соответственно) включает высвобождение помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны, сопряженное с электрогенным перемещением субстратного протона с внутренней стороны мембраны к биядерному центру.

5. В каталитическом цикле цитохромоксидазы ааз из К.sphaeroid.es, протон-проводящий О-канал служит для переноса всех помпируемых протонов, а также субстратных протонов на стадиях Р—»Б и Р—Ю переходов (перенос на кислород 3-го и 4-го электронов, соответственно). Протон-проводящий К-канал необходим для переноса субстратных протонов из внутренней водной фазы в ходе восстановления биядерного центра первыми двумя электронами в каталитическом цикле.

6. Снижение вдвое эффективности протон-транслоцирующей функции цитохромоксидазы баз из T.thermophilus семейства В гем-медных оксидаз обусловлено отсутствием сопряженного трансмембранного переноса протона в части одноэлектронных стадий каталитического цикла, тогда как другие одноэлектронные стадии сопряжены с трансмембранным переносом ~1 протона.

7. Цитохромоксидаза ¿аз из T.thermophilus семейства В гем-медных оксидаз отличается от оксидаз семейства А локализацией внутреннего акцептора протона в каталитическом интермедиате, соответствующем во времени образованию состояния F в реакции с кислородом в режиме одного молекулярного оборота. В цитохромоксидазах семейства А, перенос субстратного протона на данной каталитической стадии происходит в биядерный центр (к связанному с Сив гидроксил-аниону), тогда как в цитохромоксидазе баз акцептор протона локализован вне биядерного центра.

8. При восстановлении низкоспинового гема Ъ каталитический биядерный центр окисленной цитохромоксидазы baj из T.thermophilus переходит в открытое состояние и приобретает способность связывать внешние лиганды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах.

1. Zaslavsky D.L., Smirnova I.A., Siletsky S.A., Kaulen A.D., Millett F., Konstantinov A.A. (1995) Rapid kinetics of membrane potential generation by cytochrome с oxidase with photoactive Ru(II)-tris-bipyridyl derivative of cytochrome с as electron donor. FEBS Lett., 359, 27-30.

2. Konstantinov A.A., Siletsky S. A., Mitchell D., Kaulen A. D., Gennis R. B. (1997) The roles of the two proton input channels in cytochrome с oxidase from Rhodobacter sphaeroides probed by the effects of site-directed mutations on time resolved electrogenic Intraprotein proton transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, 9085-9090.

3. Siletsky S., Kaulen A. D., Konstantinov A.A. (1999) Resolution of electrogenic steps coupled to conversion of cytochrome с oxidase from the Peroxy to the Ferryl-Oxo state. Biochemistry, 38,4853-4861.

4. Siletskiy S.A., Soulimane Т., Azarkina N., Vygodina T.V., Buse G., Kaulen A., Konstantinov A.A. (1999) Time-resolved generation of membrane potential by 6a3 cytochrome с oxidase from Thermus thermophilus. FEBS Lett., 457, 98-102.

5. Azarkina N.A., Siletsky S.A., Borisov V.B., Wachenfeldt C., von Hederstedt L., Konstantinov A.A. (1999) A cytochrome bb -type quinol oxidase in Bacillus subtilis strain 168. J. Biol. Chem., 274,32810-32817.

6. Lee A., Kirichenko A., Vygodina Т., Siletsky S.A., Das Т.К., Rousseau D.L., Gennis R., Konstantinov A.A. (2002) Ca ^-binding site in Rhodobacter sphaeroides cytochrome с oxidase. Biochemistry, 41, 8886-8898.

7. Siletsky S.A., Pawate AS, Weiss K, Gennis RB, Konstantinov AA. (2004) Transmembrane charge separation during the ferryl-oxo -> oxidized transition in a nonpumping mutant of cytochrome с oxidase. J. Biol. Chem., 279, 52558-52565.

8. Кузнецова C.C., Ацаркина H.B., Выгодина T.B., Силецкий С.А., Константинов А.А., (2005) Ионы цинка как ингибитор цитохром с оксидазы: две точки действия на фермент. Биохимия, 70, 160-170.

9. Siletsky S.A., Han D., Brand S., Morgan J.E., Fabian M., Geren L., Millett F., Durham В., Konstantinov A.A., Gennis R.B. (2006) Single-electron photoreduction of the Рм intermediate of cytochrome с oxidase. Biochim. Biophys. Acta, 1757, 1122-1132.

10. Mamedov M.D., Tyunyatkina A.A., Siletsky S.A., Semenov A.Y. (2006) Voltage changes involving photosystem II quinone-iron complex turnover. Eur. Biophys J., 35, 647-654.

11. Siletsky S.A., Belevich I, Jasaitis A, Konstantinov A.A., Wikstrom M., Soulimane Т., Verkhovsky M.I. (2007) Time-resolved single-turnover of баз oxidase from Thermus thermophilus. Biochim. Biophys. Acta, 1767, 1383-1392.

12. Siletsky S.A., Belevich I., Wikstrom M., Soulimane Т., Verkhovsky M.I.. (2009) Time-resolved Oh->Eh transition of the aberrant баз oxidase from Thermus thermophilus. Biochim. Biophys. Acta, 1787, 201-205.

13. Siletsky S.A., Zhu J., Gennis R.B., Konstantinov A.A. (2010) Partial steps of charge translocation in the nonpumping N139L mutant of Rhodobacter sphaeroides cytochrome с oxidase with a blocked D-channel. Biochemistry, 49, 3060-3073.

14. Siletsky S.A., Belevich I., Belevich N.P., Soulimane Т., Verkhovsky M.I. (2011) Time-resolved single-turnover of caa} oxidase from Thermus thermophilus. Fifth electron of the folly reduced enzyme converts Он into EH state. Biochim. Biophys. Acta, 1807, 1162-1169.

15. Siletsky S.A., Konstantinov A.A. (2012) Cytochrome с oxidase: Charge translocation coupled to single-electron partial steps of the catalytic cycle. Biochim. Biophys. Acta, 1817, 476488.

Тезисы конференций.

1. Siletsky S.A., Kaulen A.D., Mitchell D„ Gennis R.B., Konstantinov, A.A. (1996) Resolution of two proton conduction pathways in cytochrome с oxidase. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 9,90.

2. Mitchell D., Siletsky S.A., Kaulen A.D., Konstantinov A.A., Fetter D.A., Mills D.A., Ferguson-Miller S., Gennis R.B. (1996) The use of mutants to study the putative proton-conducting channels in the heme-copper oxidases. EBEC Short Reports (List of participant and late abstract), 3.

3. Siletsky S.A., Kaulen, A.D., Konstantinov, A.A. (1997) Electrogenic events associated with peroxy-to-ferryl-oxo state transition in cytochrome с oxidase. Eur. Biophys. J., 2nd European Biophysics Congress, 26, 98.

4. Siletsky S.A., Kaulen A.D., Konstantinov A.A. (2000) F-to-O transition of cytochrome с oxidase: pH and temperature effects on kinetics of charge translocation. Abstracts of the 18th Internatl. Congress of Biochemistry and Molecular Biology, Birmingham, 457.

5. Siletsky S. Thomson F., Gennis R., Kaulen A.D., Konstantinov A. (2002) Time-resolved studies of intraprotein proton transfer in the D-channel mutants of Rhodobacter sphaeroides cytochrome с oxidase. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 12, 114.

6. Khoroshyi P., Tenger K., Borovok N., Kotlyar A., Siletsky S., Zimanyi L. (2003) Electron transfer steps in cytochrome с and cytochrome oxidase. 10th European Conference on the spectroscopy of biological molecules, 153.

7. Kuznetsova S.S., Azarkina N.V., Vygodina T.V., Siletsky S.A., Konstantinov A.A. (2005) Cytochrome с oxidase inhibition by zink ions. "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке", Москва, МГУ, 48-49.

8. Siletsky S., Pawate А., Weiss К., Gennis R., Konstantinov А. (2005) Study of electrogenic proton transfer in cytocrhome с oxidase, "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке", Москва, МГУ, 60.

9. Siletsky S.A., Weiss К., Pawate A.S., Gennis R.B., Konstantinov A.A. (2006) The intraprotein proton transfer in the D-channel mutants of Rhodobacter sphaeroides cytochrome с oxidase. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 14, 233.

10. Siletsky S.A., Zaslavsky D., Simmova I.A., Vygodina T.V., Konstantinov A.A. (2006) Rapid kinetics of charge translocation by cytochrome с oxidase: transition between the feryl-oxo and ferric states. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 14, 72.

11. Siletsky S., Konstantinov A.A. (2006) Electrogenic mechanism of cytochrome с oxidase. The 8th European Biological Chemistry Conference, EUROBIC 8, 80.

12. Tyunyatkina A.A., Siletsky S.A.j Semenov A.Yu., Mamedov M.D. (2006) Electrogenicity due to quinine-iron complex turnover. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 14, 245.

13. Belevich I., Siletsky S.A., Jasaitis A., Konstantinov A., Wikstrom M., Soulimane Т., Verkhovsky M.I. (2008) Single-turnover of баз oxidase from Thermus thermophilus. Biochim. Biophys. Acta, EBEC Short Reports, 1777, S73.

14. Siletsky S.A. Belevich I., Jasaitis A., Konstantinov A.A., Wikstrom M., Soulimane Т., Verkhovsky M. (2008) Time-resolved study of баз cytochrome oxidase form Thermus thermophilus. V съезд Российского фотобиологического общества Международная конференция "Преобразование энергии света при фотосинтезе" Пущино, 60.

15. Belevich I., Siletsky S.A., Wikstrom М., Soulimane Т., Verkhovsky M.I. (2009) Electron transfer during Он to Eh transition of the aberrant баз oxidase from Thermus thermophilus. Eur. Biophys. J., 38, S139.

Заказ № 22-П/09/2012 Подписано в печать 06.09.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.2,5

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Силецкий, Сергей Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика цитохромоксидазы

1.2. Кристаллическая структура цитохромоксидазы. 1О

1.3. Редокс-центры и субъединицы каталитического ядра цитохромоксидазы

1.4. Пути проведения протонов, переноса молекулярного кислорода и воды

1.5. Физико-химические свойства цитохромоксидазы

1.6. Подходы к изучению переноса зарядов в цитохромоксидазе с временным разрешением

1.7. Промежуточные состояния в каталитическом цикле цитохромоксидазы

1.8. Представления о сопряженном протонном транспорте в цитохромоксидазе, базирующееся на стационарных измерениях

1.9. Структурно-функциональные особенности цитохромоксидазы Ъаз из ТлЬегторкИт

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Митохондриальная цитохромоксидаза.

2.2. Штамм КкойоЬа^ег яр}1аего1с1е8.

2.3. Выращивание клеток и получение мембран из клеток Я. яркаегогсЗея.

2.4. Изоляция цитохромоксидазы ааз из Кхркаег oid.es.

2.5. Определение активности цитохромоксидазы ааз из К.5ркаего1йе8.

2.6. Цитохромоксидаза Ъаъ из ТЪегтш 1кегторЫ1ш\

2.7. Встраивание цитохромоксидазы в протеолипосомы.

2.8. Электрометрические измерения с использованием трис(бипиридил)рутения.

2.9. Электрометрические измерения с ипользованием метода "флоу-флэш".

2.10. Спектрофотометрические кинетические измерения на одиночной длине волны.

2.11. Разрешенная во времени регистрация спектров ЦО в оптическом диапазоне в сочетании с методом "флоу-флэш".

2.12. Обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Генерация мембранного потенциала, сопряженная с одноэлектронными переходами в каталитическом цикле цитохромоксидазы

3.1.1. Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы (Р—>0 переход).

3.1.2. Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 1-го и 3-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы (фотовосстановление состояний О и Р).

3.2. Кинетика переноса электрона через гемовые центры в одноэлектронных переходах каталитического цикла цитохромоксидазы.

3.3. Внутрибелковые пути переноса протонов в ходе одноэлектронных переходов каталитического цикла цитохромоксидазы.

3.3.1. Электрогенная активность цитохромоксидазы Шз из ШюйоЪаМег яр}гаего1с1е$ дикого типа.

3.3.2. Роль входных протонных Б и К каналов в каталитическом цикле цитохромоксидазы.

3.4. Артикуляция внутрибелкового перемещения протонов в одноэлектронном переходе Р—>0 цитохромоксидазы.

3.4.1. Стехиометрия сопряженного электрогенного переноса протонов в одноэлектронном переходе Р—>0.

3.4.2. Последовательность проведения помпируемого и субстратного протонов в переходе Р—»0 цитохромоксидазы.

3.4.3. Высвобождение протона на внешнюю сторону мембраны. Ионы цинка - как ингибитор электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе.

3.5. Особенности одноэлектронных переходов в каталитическом цикле цитохромоксидазы Ъаз из ТлЬ.егторЫ1т

3.5.1. Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 1-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы Ъаз (фотовосстановление состояний О).

3.5.2. Интермедиаты каталитического цикла, разрешаемые при окислении кислородом восстановленной цитохромоксидазы Ъат, из ТЛкегторкИт в режиме одного оборота.

3.5.3. Стадии генерации мембранного потенциала, сопряженные с окислением восстановленной Ъаз оксидазы из ТлкегторЫ\liis кислородом в режиме одного оборота

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой"

Благодаря фотосинтезу, растения и фотосинтезирующие бактерии улавливают солнечную энергию. В результате их жизнедеятельности ежегодно в атмосферу Земли выделяются миллиарды тонн молекулярного кислорода и образуются сложные органические соединения. Аэробные организмы получают необходимую для жизнедеятельности энергию из внешней среды в процессе дыхания, то есть в ходе окисления органических соединений кислородом воздуха. Важнейшую роль в дыхательных и фотосинтетических процессах преобразования энергии играют электронтранспортные цепи митохондрий, бактерий и хлоропластов. Ключевым звеном цепей переноса электронов являются энерго-преобразующие мембранные ферменты.

В митохондриях и аэробных бактериях трансформация энергии происходит в дыхательной цепи - совокупности сложно организованных ферментных комплексов, локализованных во внутренней мембране митохондрий эукариотических клеток или в цитоплазматической мембране прокариот. В процессе клеточного дыхания энергия окислительно-восстановительных реакций трансформируется электронтранспортной дыхательной цепью в разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране (АцН+). Возникающая таким образом протон-движущая сила служит в клетке источником энергии в реакциях биохимического синтеза, мембранного транспорта, механического движения бактериальных клеток и тд.

В концевом участке дыхательных цепей аэробных организмов образование протон-движущей силы обеспечивается в результате работы терминальных оксидаз, катализирующих восстановление кислорода цитохромом с или хинолом. Основная подгруппа этих ферментов, включающая цитохромоксидазу (ЦО) из митохондрий, образует суперсемейство структурно-родственных гем-медных оксидаз. Отличительной особенностью представителей суперсемейства является каталитический центр, который образован близко расположенными ионом железа гемовой группы и ионом меди (т.н. биядерный или бинуклеарный центр, ВЫС). В биядерном центре, непосредственно, происходит восстановление молекулы кислорода с образованием двух молекул воды.

В ходе каталитического цикла, цитохромоксидаза образует ДцН+ в результате двух процессов. Во-первых, электроны поступают в ВИС от цитохрома с с периплазматической стороны мембраны (Р-сторона), в то время как участвующие в восстановлении кислорода и образовании молекул воды протоны (т.н. "субстратные" или "химические" протоны) переносятся электрогенно в ВИС из матриксной водной фазы (И-сторон а). Во-вторых, цитохромоксидаза является редокс-зависимым протонным насосом и дополнительно переносит с Ы-стороны на Р-сторону мембраны в среднем четыре протона (т.н. "помпируемые" протоны) на каждую восстановленную молекулу кислорода.

Таким образом, цитохромоксидаза представляет собой сложную и уникальную в своем роде молекулярную машину, осуществляющую сопряжение одноэлектронного окисления цитохрома с, 4-х электронного восстановления и протонирования молекулы кислорода с образованием воды и редокс-зависимого направленного трансмембранного переноса протонов. Сочетание этих процессов требует сложной организации и точной взаимной артикуляции перемещения зарядов (электронов и протонов) и превращения молекулы кислорода в ходе каталитического цикла. Выяснение молекулярного механизма редокс-сопряженного разделения зарядов в цитохромоксидазе, описание динамики и траекторий внутрибелкового переноса протонов относятся к ряду наиболее важных и сложных задач биэнергетики, решение которых является необходимой предпосылкой для установления общих закономерностей механизмов образования трансмембранного потенциала ферментами энерго-сопрягающих мембран.

В каталитическом цикле цитохромоксидазы можно выделить две части: восстановительную и окислительную. Восстановительная часть включает в себя перенос от цитохрома с в окисленный биядерный центр 1-го и 2-го электронов. В результате оба редокс-центра ВИС (гемовое железо и атом меди) переходят в восстановленное состояние. В окислительной фазе молекула кислорода связывается с восстановленным атомом железа гема, входящего в состав В1ЧС. Далее происходит разрыв 0-0 связи, одновременно с которым 4 электрона переносятся из молекулы белка на атомы кислорода с образованием состояния Р фермента, в котором атом железа гема образует оксоферрильный комплекс. Каталитический цикл завершается переносом в ВЫС от цитохрома с последовательно 3-го и 4-го электронов, в результате которых происходит, соответственно, переход цитохромоксидазы из состояния Р в состояние Р и восстановление Р с образованием исходного, полностью окисленного состояния (О).

Каждая из отдельных одноэлектронных стадий каталитического цикла цитохромоксидазы включает в себя набор частных реакций переноса электронов и протонов, без детального исследования которых невозможно установить молекулярный механизм сопряженного трансмембранного переноса зарядов. Все эти реакции происходят во временном диапазоне, недоступном для методов быстрого смешивания. Первоначальные сведения о механизме сопряженного переноса протонов в цитохромоксидазе базировались на результатах различного рода стационарных измерений. В связи с этим, в наши задачи входило изучение механизма электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе с помощью предстационарных подходов.

Цель заключалась в том, чтобы максимально полно описать механику векторного переноса зарядов в цитохромоксидазе, разрешив во времени частные стадии электрогенного переноса электронов и протонов, составляющие суть отдельных одноэлектронных переходов в каталитическом цикле фермента. В задачи исследования входило выяснить точную стехиометрию переноса помпируемых протонов в отдельных одноэлектронных переходах каталитического цикла цитохромоксидазы. Установить сопряженные электрон-транспортные стадии и конформационные изменения, контролирующие частные стадии транслокации протонов. Выяснить точную структуру каталитических интермедиатов ЦО, включая промежуточную локализацию протонов в кислород-редуктазном центре и в его окрестности.

Возможности изучения промежуточных стадий в каталитическом цикле цитохромоксидазы в предстационарном режиме с адекватным временным разрешением появились сравнительно недавно, благодаря развитию импульсной лазерной техники и фотохимии. Фотоинициированная синхронизация электронтранспортных реакций в ЦО позволяет производить одновременный запуск реакции переноса электрона внутри всей популяции фермента, используя наносекундный импульс лазерного света, и исследовать фотоиндуцированные частные стадии транслокации зарядов и превращений каталитического центра с микросекундным временным разрешением.

Первый метод, использующийся в предстационарных измерениях ЦО, был разработан в 60-х годах Гиббсоном и Гринвудом и представляет собой фотолиз окиси углерода от восстановленного биядерного центра ЦО в присутствии молекулярного кислорода. Этот метод позволяет исследовать окисление изначально восстановленного фермента в режиме одного оборота каталитического цикла. Другой вариант представляет собой восстановительные одноэлектронные пульсы в цитохромоксидазу с помощью фотоактивных комплексов рутения. Этот подход был разработан первоначально Греем и соавторами в 80-х годах и адаптирован применительно к ЦО в начале 90-х Нильсоном.

Наиболее продуктивными подходами к мониторингу и изучению быстрых стадий переноса протонов и электронов в цитохромоксидазе оказались метод "прямой" электрометрической регистрации трансмембранной разности электрических потенциалов (емкостная потенциометрия) и разрешенная во времени спектрофотометрия. "Прямой" электрометрический метод был разработан изначально в лаборатории Л.А.Драчева в НИИ им. А.Н. Белозерского МГУ для исследования бактериородопсина и фотосинтетических реакционных центров и позволяет отслеживать в реальном времени электрогенную составляющую переноса зарядов в мембранных белках.

В последние годы для цитохромоксидазы из митохондрий и ряда бактерий была получена трехмерная кристаллическая структура с атомным разрешением. Это позволило локализовать гипотетические внутрибелковые структуры, содержащие консервативные аминокислотные остатки и потенциально способные к проведению протонов из внутренней водной фазы в гидрофобную область цитохромоксидазы к каталитическому двухядерному центру. В сочетании с возможностями направленного мутагенеза и кинетических методов с необходимым временным разрешением, это предоставляет уникальную возможность выяснения деталей механизма сопряжения энергии и внутрибелкового переноса протонов в данном ферментном комплексе. В связи с этим, в наши задачи входило сравнительное изучение механизма электрогенного переноса протонов в гомологичных бактериальных цитохромоксидазах с использованием возможностей направленных генетических манипуляций по замене и тестированию функциональной роли консервативных аминокислотных остатков в проведении протонов.

Цель заключалась в том, чтобы локализовать траектории проведения протонов в цитохромоксидазе и выявить взаимную артикуляции частных электрон и протон-транспортных реакций внутри отдельного одноэлектронного перехода фермента. Выяснить роль протон-проводящих путей в отдельных одноэлектронных переходах в каталитическом цикле ЦО. Выяснить структурно-функциональные особенности неканонических цитохромоксидаз, обусловливающие сниженную эффективность трансмембранной перекачки протонов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Силецкий, Сергей Алексеевич

выводы

1. Использование фотоактивируемых комплексов рутения в качестве донора электрона позволяет в предстационарном режиме исследовать отдельные стадии сопряженной транслокации электрона и протонов в каталитическом цикле цитохромоксидазы с микросекундным временным разрешением, недоступном при использовании методов быстрого смешивания.

2. Общая организация стадий внутрибелкового электрогенного переноса зарядов в терминальных гем-медных оксидазах семейства А (митохондриальной цитохромоксидазе и цитохромоксидазе ааз из К sphaeroid.es) сходна. Восстановление цитохромом с входного редокс-центра, Сид, является неэлектрогенной реакцией. Перенос электрона от Сид к гему а (т~ 10-40 мкс) сопровождается генерацией мембранного потенциала, соответствующей транслокации отрицательного заряда с внешней стороны мембраны на -1/3 толщины мембранного диэлектрика.

3. Перенос от гема а в биядерный кислород-редуктазный центр 3-го и 4-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидаз семейства А (переходы Р—»Б и Р—>0, соответственно) сопряжен с трансмембранной транслокацией одного помпируемого протона и переносом из внутренней водной фазы к биядерному центру одного субстратного протона

4. Сопряженный электрогенный перенос протонов в переходах Р—>Р и Р—Ю каталитического цикла цитохромоксидазы митохондрий включает две кинетически разрешаемые стадии. В первой стадии с т~0.3 мс (Р—>Р) и г~\2 мс (Б—Ю), соответственно, происходит перемещение помпируемого протона из внутренней водной фазы к промежуточному акцептору протона, располагающемуся над биядерным центром. Вторая стадия (т~1.3 мс и т~4.5 мс, соответственно) включает высвобождение помпируемого протона на внешнюю сторону мембраны, сопряженное с электрогенным перемещением субстратного протона с внутренней стороны мембраны к биядерному центру.

5. В каталитическом цикле цитохромоксидазы ааз из R.sphaeroides, протон-проводящий Б-канал служит для переноса всех помпируемых протонов, а также субстратных протонов на стадиях Р—»Е и Р—>0 переходов (перенос на кислород 3-го и 4-го электронов, соответственно). Протон-проводящий К-канал необходим для переноса субстратных протонов из внутренней водной фазы в ходе восстановления биядерного центра первыми двумя электронами в каталитическом цикле.

6. Снижение вдвое эффективности протон-транслоцирующей функции цитохромоксидазы баз из ТлкегторЫ'1ш семейства В гем-медных оксидаз обусловлено отсутствием сопряженного трансмембранного переноса протона в части одноэлектронных стадий каталитического цикла, тогда как другие одноэлектронные стадии сопряжены с трансмембранным переносом ~1 протона.

7. Цитохромоксидаза баз из ТлкегторкИш семейства В гем-медных оксидаз отличается от оксидаз семейства А локализацией внутреннего акцептора протона в каталитическом интермедиате, соответствующем во времени образованию состояния Б в реакции с кислородом в режиме одного молекулярного оборота. В цитохромоксидазах семейства А, перенос субстратного протона на данной каталитической стадии происходит в биядерный центр (к связанному с Сив гидроксил-аниону), тогда как в цитохромоксидазе баз акцептор протона локализован вне биядерного центра.

8. При восстановлении низкоспинового гема б каталитический биядерный центр окисленной цитохромоксидазы баз из ТлИегторкИш переходит в открытое состояние и приобретает способность связывать внешние лиганды.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Силецкий, Сергей Алексеевич, Москва

1. Anraku, Y. (1988) Bacterial electron transport chains, Ann. Rev. Biochem. 57, 101-132.

2. Garcia-Horsman, J. A., Barquera, B., Rumbley, J., Ma, J., and Gennis, R. B. (1994) The superfamily of heme-copper respiratory oxidases, J. Bacteriol. 176, 5587-5600.

3. Babcock, G. T., and Wikstriim, M. (1992) Oxygen Activation and the conservation of energy in cell respiration, Nature 356, 301-309.

4. Ferguson-Miller, S., and Babcock, G. T. (1996) Heme/copper terminal oxidases, Chem. Rev. 7, 2889-2907.

5. Hemp, J., and Gennis, R. B. (2008) Diversity of the heme-copper superfamily in archaea: insights from genomics and structural modeling, Results Probl. Cell Differ. 45, 1-31.

6. Belevich, I., and Verkhovsky, M. I. (2008) Molecular mechanism of proton translocation by cytochrome c oxidase, Antioxidants and Redox Signaling 10,1-29.

7. Pereira, M. M., Santana, M., and Teixeira, M. (2001) A novel scenario for the evolution of haem-copper oxygen reductases., Biochim. Biophys. Acta 1505, 185-208.

8. Yoshikawa, S. (2005) Structural chemical studies on the reaction mechanism of cytochrome c oxidase, In Biophysical and structural aspects of bioenergetics (M., W., Ed.), pp 55-71, RSC Publishing, Norfolk.

9. Kaila, V. R., Verkhovsky, M. I., Hummer, G., and Wikstrom, M. (2008) Glutamic acid 242 is a valve in the proton pump of cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 6255-6259.

10. Namslauer, A., Lepp, H., Branden, M., Jasaitis, A., Verkhovsky, M. I., and Brzezinski, P. (2007) Plasticity of proton pathway structure and water coordination in cytochrome c oxidase, J. Biol. Chem. 282, 15148-15158.

11. Siletsky, S. A., Pawate, A. S., Weiss, K., Gennis, R. B., and Konstantinov, A. A. (2004) Transmembrane charge separation during the ferryl-oxo-> oxidized transition in a non-pumping mutant of cytochrome c oxidase., J. Biol. Chem. 279, 52558-52565.

12. Belevich, I., Bloch, D. A., Wikstrom, M., and Verkhovsky, M. I. (2007) Exploring the proton pump mechanism of cytochrome c oxidase in real time, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 2685-2690.

13. Ruitenberg, M., Kannt, A., Bamberg, E., Fendler, K., and Michel, H. (2002) Reduction of cytochrome c oxidase by a second electron leads to proton translocation., Nature 417, 99102.

14. Brzezinski, P., and Gennis, R. B. (2008) Cytochrome c oxidase: exciting progress and remaining mysteries, J. Bioenerg. Biomembr. 40, 521-531.

15. Brzezinski, P., and Johansson, A. L. (2010) Variable proton-pumping stoichiometry in structural variants of cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1797, 710-723.

16. Hosier, J. P., Ferguson-Miller, S., and Mills, D. A. (2006) Energy transduction: proton transfer through the respiratory complexes, Annu. Rev. Biochem. 75, 165-187.

17. Yoshikawa, S., Muramoto, K., and Shinzawa-Itoh, K. (2011) Proton-pumping mechanism of cytochrome c oxidase, Annu. Rev. Biophys. 40, 205-223.

18. Rich, P. R., and Marechal, A. (2010) The mitochondrial respiratory chain, Essays Biochem 47, \-23.

19. Wikstrom, M., and Verkhovsky, M. I. (2007) Mechanism and energetics of proton translocation by the respiratory heme-copper oxidases, Biochim. Biophys .Acta 1767, 1200-1214.

20. Fee, J. A., Sanders, D., Slutter, C. E., Doan, P. E., Aasa, R., Karpefors, M., and Vflnngerd, T. (1995) Multi-frequency EPR Evidence for a Binuclear Cua Center in Cytochrome c Oxidase: Studies with a 63Cu- and 65Cu-enriched, Soluble Domain of the

21. Cytochrome ba^, Subunit II from Thermus Thermophilics, Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 77-83.

22. Soulimane, T., von Walter, M., Hof, P., Than, M. E., Huber, R., and Buse, G. (1997) Cytochrome c-552 from Thermus thermophilus: a functional and crystallographic investigation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237, 572-576.

23. Soulimane, T., Buse, G., Bourenkov, G. B., Bartunik, H. D., Huber, R., and Than, M. E. (2000) Structure and mechanism of the aberrant ¿¿^-cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus, EMBO J. 19, 1766-1776.

24. Pitcher, R. S., and Watmough, N. J. (2004) The bacterial cytochrome cbbi oxidases, Biochim. Biophys. Acta 1655, 388-399.

25. Rauhamaki, V., Bloch, D. A., Verkhovsky, M. I., and Wikstrom, M. (2009) Active site of cytochrome cbbj, J. Biol. Chem. 284, 11301-11308.

26. Buschmann, S., Warkentin, E., Xie, H., Langer, J. D., Ermler, U., and Michel, H. (2010) The structure of cbbi, cytochrome oxidase provides insights into proton pumping, Science 329, 327-330.

27. Mitchell, P. (1968) Chemiosmotic coupling and energy transduction, Glynn Research Ltd., Bodmin.

28. Wikstrom, M. (1977) Proton pump coupled to cytochrome c oxidase in mitochondria, Nature 266, 271-273.

29. Wikstrom, M. (2004) Cytochrome c oxidase: 25 years of the elusive proton pump, Biochim. Biophys .Acta 1655, 241-247.

30. Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Takashi, T., Yamaguichi, H., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, R., Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1996) The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A, Science 272, 1136-1144.

31. Iwata, S., Ostermeier, C., Ludwig, B., and Michel, H. (1995) Structure at 2.8 A resolution of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans, Nature 376, 660-669.

32. Ostermeier, C., Iwata, S., Ludwig, B., and Michel, H. (1995) Fy fragment-mediated crystallization of the membrane protein bacterial cytochrome c oxidase, Nat. Struct. Biol. 2, 842.

33. Svensson-Ek, M., Abramson, J., Larsson, G., Tornroth, S., Brzezinski, P., and Iwata, S. (2002) The X-ray crystal structures of wild-type and EQ(I-286) mutant cytochrome c oxidases from Rhodobacter sphaeroides., J. Mol. Biol. 321, 329-339.

34. Qin, L., Liu, J., Mills, D. A., Proshlyakov, D. A., Hiser, C., and Ferguson-Miller, S. (2009) Redox dependent conformational changes in cytochrome c oxidase suggest a gating mechanism for proton uptake, Biochemistry 48, 5121-5130.

35. Capaldi, R. A. (1990) Structure and Function of Cytochrome c Oxidase, Ann. Rev. Biochem. 59, 569-596.

36. Fontanesi, F., Soto, H. C., and Barrientos, A. (2008) Cytochrome c oxidase biogenesis: New levels of regulation, IUBMB Life 60, 557-568.

37. Fontanesi, F., Soto, I. C., Horn, D., and Barrientos, A. (2006) Assembly of mitochondrial cytochrome c-oxidase, a complicated and highly regulated cellular process, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, CI 129-1147.

38. Shapleigh, J. P., and Gennis, R. B. (1992) Cloning, Sequencing and Deletion from the Chromosome of the Gene Encoding Subunit I of the -type Cytochrome c Oxidase of Rhodobacter sphaeroides, Mol. Microbiol. 6, 635-642.

39. Pilet, E., Jasaitis, A., Liebl, U., and Vos, M. H. (2004) Electron transfer between hemes in mammalian cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 16196-16203.

40. Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, T., Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1995) Structures of metal sites of oxidized bovine heart cytochrome c oxidase at 2.8 A, Science 269, 1069-1074.

41. Saiki, K., Mogi, T., Ogura, K., and Anraku, Y. (1993) In Vitro Heme O Synthesis by the cyoE Gene Product from Escherichia coli, J. Biol. Chem. 268, 26041-26045.

42. Caughey, W. S., Smythe, G. A., O'Keeffe, D. H., Maskasky, J. E., and Smith, M. I. (1975) Heme A of cytochrome c oxicase. Structure and properties: comparisons with hemes B, C, and S and derivatives, J. Biol. Chem. 250, 7602-7622.

43. Lubben, M., and Morand, K. (1994) Novel prenylated hemes as cofactors of cytochrome oxidases. Archaea have modified hemes A and O, J. Biol. Chem. 269, 21473-21479.

44. Buse, G., Soulimane, T., Dewor, M., Meyer, H. E., and Bloggel, M. (1999) Evidence for a copper coordinated histidine-tyrosine crosslink in the active site of cytochrome oxidase., Protein Sci. 8, 985-990.

45. Babcock, G. T. (1999) How oxygen is activated and reduced in respiration, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 12971-12973.

46. Proshlyakov, D. A., Pressler, M. A., DeMaso, C., Leykam, J. F., DeWitt, D. L., and Babcock, G. L. (2000) Oxygen activation and reduction in respiration: involvement of redox-active tyrosine 244, Science 290, 1588-1591.

47. Gennis, R. B. (2004) Coupled proton and electron transfer reactions in cytochrome oxidase, Front. Biosci. 9, 581-591.

48. Wikstrom, M. (2000) Mechanism of proton translocation by cytochrome c oxidase: a new four-stroke histidine cycle, Biochim. Biophys. Acta 1458, 188-198.

49. Malmstrom, B. G., and Aasa, R. (1993) The Nature of the CuA Center in Cytochrome c Oxidase, FEBS Lett. 325, 49-52.

50. Kobayashi, K., Une, H., and Hayashi, K. (1989) Electron transfer process in cytochrome oxidase after pulse radiolysis, J. Biol. Chem. 246, 7976-7980.

51. Nilsson, Т. (1992) Photoinduced electron transfer from tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium to cytochrome с oxidase, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 89, 6497-6501.

52. Mills, D. A., and Hosier, J. P. (2005) Slow proton transfer through the pathways for pumped protons in cytochrome с oxidase induces suicide inactivation of the enzyme, Biochemistry 44, 4556-4666.

53. Branden, G., Gennis, R. В., and Brzezinski, P. (2006) Transmembrane proton translocation by cytochrome с oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1757, 1052-1063.

54. Gennis, R. B. (1998) Multiple proton-conducting pathways in cytochrome oxidase and a proposed role for the active-site tyrosine, Biochim. Biophys. Acta 1365, 241-248.

55. Branden, M., Tomson, F., Gennis, R. В., and Brzezinski, P. (2002) The entry point of the K-proton-transfer pathway in cytochrome с oxidase, Biochemistry 41, 10794-10798.

56. Hofacker, I. a. S., K. (1998) Proteins: structure, function, and genetics 30, 100-107.

57. Popovic, D. M., and Stuchebrukhov, A. A. (2005) Proton exit channels in bovine cytochrome с oxidase, J. Phys. Chem. В 109,1999-2006.

58. Shimokata, K., Katayama, Y., Murayama, H., Suematsu, M., Tsukihara, Т., Muramoto, K., Aoyama, H., Yoshikawa, S., and Shimada, H. (2007) The proton pumping pathway of bovine heart cytochrome с oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 4200-4205.

59. Pfitzner, U., Odenwald, А., Т., O., Weingard, L., Ludwig, В., and Richter, О. M. (1998) Cytochrome с oxidase (heme ааз) from Paracoccus denitrificans: analysis of mutations in putative proton channels of subunit I., J. Bioenerg. Biomembr. 30, 89-97.

60. Salomonsson, L., Lee, A., Gennis, R. B., and Brzezinski, P. (2004) A single-amino-acid lid renders a gas-tight compartment within a membrane-bound transporter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11617-11621.

61. Schmidt, B., McCracken, J., and Ferguson-Miller, S. (2003) A discrete water exit pathway in the membrane protein cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 15539-15542.

62. Sugitani, R., and Stuchebrukhov, A. A. (2009) Molecular dynamics simulation of water in cytochrome c oxidase reveals two water exit pathways and the mechanism of transport, Biochim. Biophys. Acta 1787, 1140-1150.

63. Beinert, H., Shaw, R. W., Hansen, R. E., and Hartzell, C. R. (1980) Studies on the Origin of the Near Infrared (800 nm 900 nm) Absorption of Cytochrome c Oxidase, Biochim. Biophys. Acta 591, 458-470.

64. Palmer, G. (1993) Current Issues in the Chemistry of Cytochrome c Oxidase, J. Bioenerg. Biomembr. 25, 145-151.

65. Vanneste, W. H. (1966) The Stoichiometry and Absorption Spectra of Components a and «3 in Cytochrome c Oxidase, Biochemistry 65, 838-848.

66. Riistama, S., Verkhovsky, M. I., Laakkonen, L., Wikstrom, M., and Puustinen, A. (2000) Interaction between the formyl group of heme a and arginine 54 in cytochrome aa^ from Paracoccus denitrificans, Biochim. Biophys. Acta 1456, 1-4.

67. Mitchell, R., Mitchell, P., and Rich, P. R. (1991) The Assignment of the 655 nm Spectral Band of Cytochrome Oxidase, FEBS Lett. 280, 321-324.

68. Shaw, R. W., Hansen, R. E., and Beinert, H. (1978) A Novel Electron Paramagnetic Resonance Signal of "Oxygenated" Cytochrome c Oxidase, J. Biol. Chem. 253, 66376640.

69. Leigh, J. S., Wilson, D. F., and Owen, C. S. (1974) Heme-Heme Interaction in Cytochrome c Oxidase: The Cooperativity of the Hemes of Cytochrome c Oxidase as Evidenced in the Reaction with CO, Arch. Biochem. Biophys. 160, 476-486.

70. Moody, A. J., and Rich, P. R. (1990) The Effect of pH on Redox Titrations of Haem a in Cyanide-Liganded Cytochrome c Oxidase: Experimental and Modelling Studies, Biochim. Biophys. Acta 1015, 205-215.

71. Carithers, R. P., and Palmer, G. (1981) Characterization of the Potentiometric Behavior of Soluble Cytochrome Oxidase by Magnetic Circular Dichroism, J. Biol. Chem. 256, 7967-7976.

72. Goodman, G. (1984) Metal Site Cooperativity within Cytochrome Oxidase, J. Biol. Chem. 259, 15094-15099.

73. Blair, D. F., Ellis, J., Walther R. , Wang, H., Gray, H. B., and Chan, S. I. (1986) Spectroelectrochemical Study of Cytochrome c Oxidase: pH and Temperature Dependences of the Cytochrome Potentials, J. Biol. Chem. 261, 11524-11537.

74. Wikstrom, M., Krab, K., and Saraste, M. (1981) Cytochrome oxidase a synthesis, Academic Press, New York.

75. Moody, A. J., Cooper, C. E., and Rich, P. R. (1991) Characterisation of 'Fast" and 'Slow Forms of Bovine Heart Cytochrome-c Oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1059, 189-207.

76. Van Gelder, B. F., and Beinert, H. (1969) Studies of the Heme Components of Cytochrome c Oxidase by EPR Spectroscopy, Biochim. Biophys. Acta 189, 1-24.

77. Aasa, R„ Albracht, S. P. J., Falk, K.-E., Lanne, B., and Vanngard, T. (1976) EPR Signals From Cytochrome c Oxidase, Biochim. Biophys. Acta 422, 260-272.

78. Baker, G. M., Noguchi, M., and Palmer, G. (1987) The Reaction of Cytochrome Oxidase with Cyanide, J. Biol. Chem. 262, 595-604.

79. Bloch, D., Belevich, I., Jasaitis, A., Ribacka, C., Puustinen, A., Verkhovsky, M. I., and Wikstrom, M. (2004) The catalytic cycle of cytochrome c oxidase is not the sum of its two halves, Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 529-533.

80. Jancura, D., Berka, V., Antalik, M., Bagelova, J., Gennis, R. B., Palmer, G., and Fabian, M. (2006) Spectral and kinetic equivalence of oxidized cytochrome c oxidase as isolated and "activated" by reoxidation, J. Biol. Chem. 281, 30319-30325.

81. Siletsky, S. A., Belevich, I., Wikstrom, M., Soulimane, T., and Verkhovsky, M. I. (2009) Time-resolved Oh->Eh transition of the aberrant ba3 oxidase from Thermus thermophilus, Biochim. Biophys. Acta 1787, 201-205.

82. Siletsky, S., Kaulen, A. D., and Konstantinov, A. A. (1999) Resolution of electrogenic steps coupled to conversion of cytochrome c oxidase from the peroxy to the ferryl-oxo state, Biochemistry 38, 4853-4861.

83. Verkhovsky, M. I., Tuukkanen, A., Backgren, C., Puustinen, A., and Wikstrom, M. (2001) Charge translocation coupled to electron injection into oxidized cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans, Biochemistry 40, 7077-7083.

84. Gibson, Q. H., and Greenwood, C. (1963) Reactions of cytochrome oxidase with oxygen and carbon monoxide, Biochem. J. 86, 541-554.

85. Oliveberg, M., Brzezinski, P., and Malmstrom, B. G. (1989) The effect of pH and temperature on the reaction of fully reduced and mixed-valence cytochrome c oxidase with dioxygen, Biochim. Biophys. Acta 977, 322-328.

86. Blackmore, R. S., Greenwood, C., and Gibson, Q. H. (1991) Studies of the primary oxygen intermediate in the reaction of fully reduced cytochrome oxidase, J. Biol. Chem. 266, 19245-19249.

87. Verkhovsky, M. I., Morgan, J. E., and Wikstrom, M. (1994) Oxygen binding and activation: early steps in the reaction of oxygen with cytochrome c oxidase, Biochemistry 33, 3079-3086.

88. Pan, L. P., Frame, M., Durham, B., Davis, D., and Millett, F. (1990) Photoinduced electron transfer within complexes between plastocyanin and ruthenium bisbipyridine dicarboxybipyridine cytochrome c derivatives, Biochemistry 29, 3231-3236.

89. Pan, L. P., Hibdon, S., Liu, R.-Q., Durham, B., and Millett, F. (1993) Intracomplex Electron Transfer Between Ruthenium-Cytochrome c Derivatives and Cytochrome c Oxidase, Biochemistry 32, 8492-8498.

90. Geren, L., Durham, B., and Millett, F. (2009) Use of ruthenium photoreduction techniques to study electron transfer in cytochrome oxidase, Methods Enzymol. 456, 507520.

91. Farver, O., Chen, Y., Fee, J. A., and Pecht, I. (2006) Electron transfer among the CuA-, heme b- and ¿^-centers of Thermus thermophilus cytochrome ba3, FEBS Lett. 580, 3417— 3421.

92. Drachev, L. A., Kaulen, A. D., Semenov, A. Y., Severina, I. I., and Skulachev, V. P. (1979) Lipid-impregnated filters as a tool for studying the electric current-generating proteins, Anal. Biochem. 96, 250-262.

93. Zaslavsky, D., Kaulen, A., Smirnova, I. A., Vygodina, T. V., and Konstantinov, A. A. (1993) Flash-induced membrane potential generation by cytochrome c oxidase, FEBS Lett. 336, 389-393.

94. Verkhovsky, M. I., Morgan, J. E., Verkhovskaya, M., and Wikstrom, M. (1997) Translocation of electrical charge during a single turnover of cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys Acta 1318, 6-10.

95. Siletsky, S. A., Kaulen, A. D., and Konstantinov, A. A. (1997) Electrogenic events associated with peroxy- to ferryl-oxo state transition in cytochrome c oxidase, Eur. J. Biophys. 26, 98.

96. Siletsky, S. A., Kaulen, A. D., Mitchell, D., Gennis, R. B., and Konstantinov, A. A. (1996) Resolution of two proton conduction pathways in cytochrome c oxidase, EBEC Short Reports 9, 90.

97. Siletsky, S. A., Zhu, J., Gennis, R. B., and Konstantinov, A. A. (2010) Partial steps of charge translocation in the nonpumping N139L mutant of Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase with a blocked D-channel, Biochemistry 49, 3060-3073.

98. Jasaitis, A., Verkhovsky, M. I., Morgan, J. E., Verkhovskaya, M. L., and Wikstrom, M. (1999) Assignment and charge translocation stoichiometries of the electrogenic phases in the reaction of cytochrome c with dioxygen, Biochemistry 38, 2697-2706.

99. Lepp, H., and Brzezinski, P. (2009) Internal charge transfer in cytochrome c oxidase at a limited proton supply: Proton pumping ceases at high pH, Biochim. Biophys. Acta 1790, 552-557.

100. Verkhovsky, M. I., Jasaitis, A., Verkhovskaya, M. L., Morgan, L., and Wikstrom, M. (1999) Proton translocation by cytochrome c oxidase, Nature 400, 480-483.

101. Chance, B., Saronio, C., and Leigh, J. S., Jr. (1975) Functional intermediates in the reaction of membrane-bound cytochrome oxidase with oxygen, J. Biol. Chem. 250, 92269237.

102. Hill, B. C., and Greenwood, C. (1983) Spectroscopic evidence for the participation of compound A (Fe«3 -O2) in the reaction of mixed-valence cytochrome c oxidase with oxygen at room temperature, Biochem. J. 215, 659-667.

103. Oliveberg, M., and Malmstrijm, B. G. (1992) Reaction of Dioxygen with Cytochrome c Oxidase Reduced to Different Degrees: Indications of a Transient Dioxygen Complex with Copper-B, Biochemistry 31, 3560-3563.

104. Morgan, J. E., Verkhovsky, M. I., and Wikstrom, M. (1996) Observation and assignment of Peroxy and Ferryl Intermediates in the reduction of dioxygen to water by cytochrome c oxidase, Biochemistry 35, 12235-12240.

105. Hill, B. C., and Greenwood, C. (1984) The reaction of fully reduced cytochrome c oxidase with oxygen studied by flow-flash spectrophotometry at room temperature, Biochem. J. 218, 913-921.

106. Han, S., Ching, Y.-C., and Rousseau, D. L. (1990) Primary intermediate in the reaction of oxygen with fully reduced cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 24912495.

107. Proshlyakov, D. A., Pressler, M. A., and Babcock, G. T. (1998) Dioxygen activation and bond cleavage by mixed-valence cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8020-8025.

108. Ogura, T., Takahashi, S., Shinzawa-Itoh, K., Yoshikawa, S., and Kitagawa, T. (1990) Observation of the Fe4+=0 stretching Raman band for cytochrome oxidase compound B at ambient temperature, J. Biol. Chem. 265, 14721-14723.

109. Proshlyakov, D. A., Pressler, M. A., DeMaso, C., Leykam, J. F., DeWitt, D. L., and Babcock, G. T. (2000) Oxygen activation and reduction in respiration: involvement of redox-active tyrosine 244, Science 290, 1588-1591.

110. Siegbahn, P., and Blomberg, M. R. A. (2004) Important roles of tyrosines in Photosystem II and cytochrome oxidase, Biochim Biophys Acta 1655, 45-50.

111. MacMillan, F., Budiman, K., Angerer, H., and Michel, H. (2006) The role of triptophan 272 in the Paracoccus denitrificans cytochrome c oxidase, FEBS Lett 580, 1345-1349.

112. Wiertz, F. G. M., Richter, O.-M. H., Ludwig, B., and de Vries, S. (2007) Kinetic resolution of a tryptophan-radical intermediate in the reaction cycle of Paracoccus denitrificans cytochrome c oxidase,/. Biol. Chem. 282, 31580-31591.

113. Sucheta, A., Szundi, I., and Einarsdottir, O. (1998) Intermediates in the Reaction of Fully reduced Cytochrome с Oxidase with Dioxygen, Biochemistry 37, 17905-17914.

114. Einarsdottir, O., Szundi, I., Van Eps, N., and Sucheta, A. (2002) Рм and Pr forms of cytochrome с oxidase have different spectral properties, J. Inorg. Biochem. 91, 87-93.

115. Karpefors, M., Adelroth, P., Namslauer, A., Zhen, Y., and Brzezinski, P. (2000) Formation of the "peroxy" intermediate in cytochrome с oxidase is associated with internal proton/hydrogen transfer, Biochemistry 39, 14664-14669.

116. Hill, В. C. (1991) The Reaction of the Electrostatic Cytochrome c-Cytochrome Oxidase Complex with Oxygen, J. Biol. Chem. 266, 2219-2226.

117. Wikstrom, M. (1987) Insight into the Mechanism of Cellular Respiration from its Partial Reversal in Mitochondria, Chemica Scripta 27В, 53-58.

118. Wikstrom, M., and Morgan, J. E. (1992) The Dioxygen Cycle, J. Biol. Chem. 267, 10266-10273.

119. Orii, Y., and Okunuki, K. (1963) Studies on Cyochrome a. X. Effect of Hydrogen Peroxide on Absorption spectra of Cytochrome a, J. Biochem. 54, 207-213.

120. Fabian, M., and Palmer, G. (1995) The Reaction of Cyanide with Peroxidatic Forms of Cytochrome Oxidase, Biochemistry 34, 1534-1540.

121. Bickar, D., Bonaventura, C., and Bonaventura, J. (1984) Carbon Monoxide-driven Reduction of Ferric Heme and Heme Proteins, J. Biol. Chem. 259, 10777-10783.

122. Nicholls, P., and Chanady, G. A. (1981) Interactions of Cytochrome aa3 with Oxygen and Carbon Monoxide, Biochim. Biophys. Acta 634, 256-265.

123. Witt, S. N., Blair, D. F., and Chan, S. I. (1986) Chemical and Spectroscopic Evidence for the Formation of a Ferryl Fea3 Intermediate during Turnover of Cytochrome с Oxidase, J. Biol. Chem. 261.

124. Mitchell, R., Mitchell, P., and Rich, P. R. (1992) Protonation States of the Catalytic Intermediates of Cytochrome с Oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1101, 188-191.

125. Mitchell, R., and Rich, P. R. (1994) Proton Uptake by Cytochrome с Oxidase on Reduction and on Ligand Binding, Biochim. Biophys. Acta 1186, 19-26.

126. Kaila, V. R., Verkhovsky, M. I., and Wikstrom, M. (2010) Proton-coupled electron transfer in cytochrome oxidase, Chem. Rev. 110, 7062-7081.

127. Babcock, G. T., Varotsis, C., and Zhang, Y. (1992) O2 Activation in Cytochrome Oxidase and in Other Heme Proteins, Biochim. Biophys. Acta 1101, 192-194.

128. Wikstrom, M. (1989) Identification of the Electron Transfers in Cytochrome Oxidase that are Coupled to Proton-Pumping, Nature 338, 776-778.

129. Wikstrom, M. (1981) Energy-Dependent Reversal of the Cytochrome Oxidase Reaction, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4051-4054.

130. Hinkle, P., and Mitchell, P. (1970) Effect of membrane potential on the redox poise between cytochrome a and cytochrome c in rat liver mitochondria, J Bioenerg 1,45-60.

131. Michel, H. (1998) The mechanism of proton pumping by cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci USA 95, 12819-12824.

132. Vygodina, T. V., Capitanio, N., Papa, S., and Konstantinov, A. A. (1997) Proton pumping by cytochrome c oxidase is coupled to peroxidase half of its catalytic cycle., FEBSLett. 412, 405-409.

133. Liberman, E. A. (1977) Potential difference across the membrane of subcellular vesicles. III. Proton channels in oxidative phosphorylation, Biophysics (Moscow) 22, 1115-1128.

134. Mitchell, P. (1966) Chemiosmotic Coupling in Oxidative and Photosynthetic Phosphorylation, Glynn Research Ltd., Bodmin, UK.

135. Rich, P. R. (1991) The Osmochemistry of Electron-transfer Complexes, Bioscience Reports 77,539-571.

136. Hunsicker-Wang, L. M., Pacoma, R. L., Chen, Y., Fee, J. A., and Stout, C. D. (2005) A novel cryoprotection scheme for enhancing the diffraction of crystals of recombinant cytochrome ba^ oxidase from Thermus thermophilus, Acta Cryst D61, 340-343.

137. Oertling, W. A., Surerus, K. K., Einarsdyttir, O., Fee, J. A., Dyer, R. B., and Woodruff, W. H. (1994) Spectroscopic Characterization of Cytochrome ba3, a Terminal Oxidase

138. From Thermus thermophilus: Comparison of the ¿Z3/CUB Site to That of Bovine Cytochrome aa^, Biochemistry 33, 3128-3141.

139. Giuffre, A., Forte, E., Antonini, G., D'ltri, E., Brunori, M., Soulimane, T., and Buse, G. (1999) Kinetic properties of ba^ oxidase from Thermus thermophilus: Effect of temperature, Biochemistry 38,1057-1065.

140. Das, T. K., Gomes, C. M., Bandeiras, T. M., Pereira, M. P., Teixeira, M., and Rousseau, D. L. (2004) Active site structure of the aa.3 quinol oxidase of Acidianus ambivalens, Biochim. Biophys .Acta 1655.

141. Pereira, M. M., and Teixeira, M. (2004) Proton pathways, ligand binding and dynamics of the catalytic site in haem-copper oxygen reductases: a comparison between the three families, Biochim. Biophys. Acta 1655, 340-346.

142. Kannt, A., Soulimane, T., Buse, G., Becker, A., Bamberg, E., and Michel, H. (1998) Electrical current generation and proton pumping catalyzed by the 6a3-type cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus, FEBS Lett 434, 17-22.

143. Fowler, L. R., Richardson, S. H., and Hatefi, Y. (1962) A rapid method for the preparation of highly purified cytochrome oxidase, Biochim. Biophys. Acta 64, 170-173.

144. MacLennan, D. H., and Tzagoloff, A. (1965) The isolation of a copper protein from cytochrome oxidase, Biochim. Biophys.Acta 96, 166-168.

145. Soulimane, T., and Buse, G. (1995) Integral cytochrome-c oxidase. Preparation and progress towards a three-dimensional crystallization, Eur. J. Biochem. 227, 588-595.

146. Crane, F. L., Glenn, J. L., and Green, D. E. (1956) Studies on the electron transfer system. IV. The electron transfer particle, Biochim. Biophys. Acta 22, 475-487.

147. Mitchell, D. M., and Gennis, R. B. (1995) Rapid Purification of Wildtype and Mutant Cytochrome c Oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni -NTA Affinity Chromatography, FEBS Lett. 368, 148-150.

148. Racker, E. (1972) Reconstitution of cytochrome oxidase vesicles and conferral of sensitivity to energy transfer inhibitors, J. Membr. Biol. 10, 221-235.

149. Rigaud, J.-L., Pitard, B., and Levy, D. (1995) Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins, Biochim. Biophys.Acta 1231, 223-246.

150. Drachev, L. A.,' Kaulen, A. D., and Skulachev, V. P. (1978) Time Resolution of the Intermediate Steps in the Bacteriorhodopsin-Linked Electrogenesis, FEBS Lett. 87, 161167.

151. Fry, D. W., White, J. C., and Goldman, I. D. (1978) Rapid separation of low molecular weight solutes from liposomes without dilution, Anal Biochem 90, 809-815.

152. Provencher, S. W. (1976) A Fourier method for the analysis of exponential decay curves, Biophys. J. 16, 27-41.

153. Medvedev, D. M., Medvedev, E. S., Kotelnikov, A. I., and Stuchebrukhov, A. A. (2005) Analysis of the kinetics of the membrane potential generated by cytochrome c oxidase upon single electron injection., Biochim. Biophys. Acta 1710, 47-56.

154. Sutin, N. C., C. (1978) Adv. Chem. Ser. 168, 1-27.

155. Mayo, S. L., Ellis, W. R., Jr., Crutchley, R. J., and Gray, H. B. (1986) Long-range electron transfer in heme proteins, Science 233, 948-952.

156. Vygodina, T. V., and Konstantinov, A. A. (1988) HhCb-Induced Conversion of Cytochrome c Oxidase Peroxy Complex to Oxoferryl State, Ann. NY Acad. Sci. 550, 124138.

157. Siletsky, S., Zaslavsky, D., Smirnova, I., Kaulen, A., and Konstantinov, A. (2000) F-to-0 transition of cytochrome c oxidase: pH and temperature effects on kinetics of charge translocation Biochem Soc Trans 28, A457.

158. Brzezinski, P. (1996) Internal Electron-Transfer Reactions in Cytochrome c Oxidase, Biochemistry 35, 5611-5615.

159. Laidler, K. J. (1972) Unconvenitonal applications of the Arrhenius Law J Chem Educ 49, 343-344.

160. Mamedov, M. D., Tyunyatkina, A. A., Siletsky, S. A., and Semenov, A. Y. (2006) Voltage changes involving photosystem II quinone-iron complex turnover, Eur Biophys J 35, 647-654.

161. Maroti, P., and Wraight, C. A. (1997) Kinetics of H+ ion binding by the P+QA"state of bacterial photosynthetic reaction centers: rate limitation within the protein, Biophys J 73, 367-381.

162. Vygodina, T., and Konstantinov, A. (1989) Effect of pH on the Spectrum of Cytochrome c Oxidase Hydrogen Peroxide Complex, Biochim. Biophys. Acta 973, 390-398.

163. Fabian, M., and Palmer, G. (1995) The Interaction of Cytochrome Oxidase with Hydrogen Peroxide: The Relationship of Compounds P and F, Biochemistry 34, 1380213810.

164. Rich, P., and Moody, A. J. (1997) Cytochrome c Oxidase, In Bioenergetics (Graber, P., and Milazzo, G., Eds.), pp 419-456, Birkhauser.

165. Siletsky, S. A., Kaulen, A. D., and Konstantinov, A. A. (1997) Electrogenic events associated with peroxy-to-ferryl-oxo state transition in cytochrome c oxidase, Eur J Biophys 26, 98.

166. Fabian, M., and Palmer, G. (2001) Proton Involvement in the Transition from the "Peroxy" to the Ferryl Intermediate of Cytochrome c Oxidase, Biochemistry 40, 18671874.

167. Gorbikova, E. A., Belevich, N. P., Wikstrom, M., and Verkhovsky, M. I. (2007) Time-resolved ATR-FTIR spectroscopy of the oxygen reaction in the D124N mutant of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans, Biochemistry 46, 13141-13148.

168. Liao, G.-L., and Palmer, G. (1996) The reduced minus oxidized spectra of cytochromes a and <33, Biochim. Biophys. Acta 1274, 109-111.

169. Zaslavsky, D., Sadoski, R. C., Wang, K., Durham, B., Gennis, R. B., and Millett, F. (1998) Single electron reduction of cytochrome c oxidase compound F: resolution of partial steps by transient spectroscopy, Biochemistry 37, 14910-14916.

170. Sharpe, M. A., and Ferguson-Miller, S. (2008) A chemically explicit model for the mechanism of proton pumping in heme-copper oxidases., J. Bioenerg. Biomembr. 40, 541-549.

171. Lee, H. J., Svahn, E., Swanson, J. M., Lepp, H., Voth, G. A., Brzezinski, P., and Gennis, R. B. (2010) Intricate role of water in proton transport through cytochrome c oxidase, J Am Chem Soc 132, 16225-16239.

172. Verkhovsky, M. I., Morgan, J. E., and Wikstrijm, M. (1995) Control of Electron Delivery to the Oxygen Reduction Site of Cytochrome c Oxidase: A Role for Protons, Biochemistry 34, 7483-7491.

173. Siletsky, S. A., and Konstantinov, A. A. (2012) Cytochrome c oxidase: Charge translocation coupled to single-electron partial steps of the catalytic cycle, Biochim BiophysActa 1817, 476-488.

174. Morgan, J. E., Verkhovsky, M. I., and Wikstrum, M. (1994) The Histidine Cycle: A New Model for Proton Translocation in the Respiratory Heme-copper Oxidases, J. Bioenerg. Biomembr. 26, 599-608.

175. Rich, P. R. (1995) Towards an Understanding of the Chemistry of Oxygen Reduction and Proton Translocation in the Iron-Copper Respiratory Oxidases, Aust. J. Plant Physiol. 22, 479-486.

176. Konstantinov, A. (1998) Cytochrome c oxidase as a proton-pumping peroxidase: reaction cycle and electro genie mechanism., J. Bioenerg. Biomembr. 30, 121-130.

177. Decoursey, T. E. (2003) Voltage-gated proton channels and other proton transfer pathways, Physiol Rev 83, 475-579.

178. Salomonsson, L., Branden, G., and Brzezinski, P. (2008) Deuterium isotope effect of proton pumping in cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1777, 343-350.

179. Agmon, N. (1995) The Grotthus Mechanism, Chem. Phys. Lett. 244,456-462.

180. Wikstrom, M. K. F. (1998) Proton translocation by the respiratory haem-copper oxidases, Biochim. Biophys. Acta 1365, 185-192.

181. Wikstrom, M., Verkhovsky, M. I., and Hummer, G. (2003) Water-gated mechanism of proton translocation by cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 45238, 1-5.

182. Mills, D. A., Florens, L., Hiser, C., Qian, J., and Ferguson-Miller, S. (2000) Where is 'outside' in cytochrome c oxidase and how and when do protons get there?, Biochim. Biophys. Acta 1458, 180-187.

183. Kuznetsova, S. S., Azarkina, N. V., Vygodina, T. V., Siletsky, S. A., and Konstantinov, A. A. (2005) Zinc ions as cytochrome c oxidase inhibitors: two sites of action, Biochemistry (Mosc) 70, 128-136.

184. Skulachev, V. P., Chistyakov, V. V., Jasaitis, A. A., and Smirnova, E. G. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 26, 1-6.

185. Lorusso, M., Cocco, T., Sardanelli, A. M., Minuto, M., Bonomi, F., and Papa, S. (1991) Interaction of Zn2+ with the bovine-heart mitochondrial bcl complex, Eur J Biochem 197, 555-561.

186. Paddock, M. L., Graige, M. S., Feher, G., and Okamura, M. Y. (1999) Identification of the proton pathway in bacterial reaction centers: inhibition of proton transfer by binding of Zn2+ or Cd2+, Proc Natl Acad Sci USA 96, 6183-6188.

187. Nicholls, P., and Singh, A. P. (1988) Life Sci. Adv. (Biochemistry, Delhi) 7, 321-326.

188. Berry, E. A., Zhang, Z., Bellamy, H. D., and Huang, L. (2000) Crystallographic location of two Zn(2+)-binding sites in the avian cytochrome bc(l) complex, Biochim. Biophys. Acta 1459, 440-448.

189. Kannt, A., Ostermann, T., Muller, H., and Ruitenberg, M. (2001) Zn2+ binding to the cytoplasmic side of Paracoccus denitrificans cytochrome c oxidase selectively uncouples electron transfer and proton translocation, FEBS Lett 503, 142-146.

190. Aagaard, A., Namslauer, A., and Brzezinski, P. (2002) Inhibition of proton transfer in cytochrome c oxidase by zinc ions: delayed proton uptake during oxygen reduction, Biochim. Biophys. Acta 1555, 133-139.

191. Martino, P. L., Capitanio, G., Capitanio, N., and Papa, S. (2011) Inhibition of proton pumping in membrane reconstituted bovine heart cytochrome c oxidase by zinc binding at the inner matrix side, Biochim. Biophys. Acta 1807, 1075-1082.

192. Mills, D. A., Schmidt, В., Hiser, C., Westley, E., and Ferguson-Miller, S. (2002) Membrane Potential-controlled Inhibition of Cytochrome с Oxidase by Zinc, J Biol С hem 277, 14894-14901.

193. Kuznetsova, S. S., Azarkina, N. V., Vygodina, Т. V., Siletsky, S. A., and Konstantinov, A. A. (2005) Zink ions as cytochrome с oxidase inhibitors: two sites of action, Biochemistry (Moscow) 70, 128-136.

194. Popovic, D. M., and Stuchebryukhov, A. A. (2004) Proton pumping mechanism and catalytic cycle of cytochrome с oxidase: Coulomb pump model with kinetic gating, FEBS Lett. 566, 126-130.

195. Zimmermann, В. H., Nitsche, С. I., Fee, J. A., Rusnak, F., and Munck, E. (1988) Properties of a copper-containing cytochrome bai: a second terminal oxidase from the extreme thermophile Thermus Thermophilus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5779-5783.

196. Siletsky, S. A., Belevich, I., Jasaitis, A., Konstantinov, A. A., Wikstrom, M., Soulimane, Т., and Verkhovsky, M. I. (2007) Time-resolved single-turnover of ba3 oxidase from Thermus thermophilus, Biochim. Biophys. Acta 1767, 1383-1392.

197. Williams, P. A., Fulop, V., Garman, E. F., Saunders, N. F. W., Ferguson, S. J., and Hajdu, J. (1997) Haem-ligand switching during catalysis in crystals of a nitrogen-cycle enzyme, Nature (London) 389, 406-412.

198. Sucheta, A., Georgiadis, К. E., and Einarsdyttir, O. (1997) Mechanisms of Cytochrome с Oxidase-catalyzed Reduction of Dioxygen to Water: Evidence for Peroxy and Ferryl Intermediates at Room Temperature, Biochemistry 36, 554-565.

199. Adelroth, P., Ek, M., and Brzezinski, P. (1998) Factors determining electron-transfer rates in cytochrome с oxidase: investigation of the oxygen reaction in the R.sphaeroides enzyme, Biochim. Biophys. Acta 1367, 107-117.

200. Faxen, K., Gilderson, G., Adelroth, P., and Brzezinski, P. (2005) A mechanistic principle for proton pumping by cytochrome с oxidase, Nature 437, 286-289.

201. Verkhovsky, M. I., Morgan, J. E., Puustinen, A., and Wikstrom, M. (1996) The "ferrous-oxy" intermediate in the reaction of dioxygen with fully reduced cytochromes aa3 and bo3, Biochemistry 35, 16241-16246.

202. Smirnova, I., Adelroth, P., Gennis, R. B., and Brzezinski, P. (1999) Aspartate-132 in cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides is involved in a two-step proton transfer during oxo-ferryl formation, Biochemistry 38, 6826-6833.

203. Lee, A., Kirichenko, A., Vygodina, T., Siletsky, S. A., Das, T. K., Rousseau, D. L., Gennis, R. A., and Konstantinov, A. A. (2002) Ca2+ -binding site in Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase., Biochemistry 41, 8886-8898.

204. Gennis, R. (1998) How does cytochrome oxidase pump protons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12747-12749.

205. Artzatbanov, V. Y., Konstantinov, A. A., and Skulachev, V. P. (1978) Involvement of Intramitochondrial Protons in Redox Reactions of Cytochrome a, FEBS Lett. 87, 180185.

206. Michel, H. (1999) Cytochrome c oxidase: Catalytic Cycle and Mechanism of Proton Pumping A Discussion, Biochemistry 38, 15129-15140.

207. Verkhovsky, M. I., Belevich, N., Morgan, J. E., and Wikstrom, M. (1999) Proton linkage of cytochrome a oxidoreduction in carbon monoxide-treated cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 141, 184-189.

208. Ellis, W. R., Jr., Wang, H., Blair, D. F., Gray, H. B., and Chan, S. I. (1986) Spectroelectrochemical Study of the Cytochrome a Site in Carbon Monoxide Inhibited Cytochrome c Oxidase, Biochemistry 25, 161-167.

209. Moser, C. C., Page, C. C., and Dutton, P. L. (2006) Darwin at the molecular scale: selection and variance in electron tunnelling proteins including cytochrome c oxidase, Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 361, 1295-1305.

210. Malmstrom, B. G. (1994) Rack-induced Bonding in Blue-Copper Proteins, Eur. J. Biochem 223, 711-718.

211. Kozlova, M. A., Juhnke, H. D., Cherepanov, D. A., Lancaster, C. R., and Mulkidjanian, A. Y. (2008) Proton transfer in the photo synthetic reaction center of Blastochloris viridis, FEBS Lett 582, 238-242.

212. Gorbikova, E. A., Belevich, I., Wikstrom, M., and Verkhovsky, M. I. (2008) The proton donor for 0-0 bond scission by cytochrome c oxidase, Proc Natl Acad Sci USA 105, 10733-10737.

213. Gomes, C. M., Backgren, C., Teixeira, M., Puustinen, A., Verkhovskaya, M. L., Wikstrom, M., and Verkhovsky, M. I. (2001) Heme-copper oxidases with modified D-and K-pathways are yet efficient proton pumps, FEBS Lett 497, 159-164.

214. Morgan, J. E., Verhovsky, M. I., Palmer, G., and Wikstrom, M. (2001) Role of the PR intermediate in the reaction of cytochrome c oxidase with O2, Biochemistry 40, 68826892.

215. Namslauer, A., and Brzezinski, P. (2004) Structural elements involved in electron-coupled proton transfer in cytochrome c oxidase, FEBS Lett 567, 103-110.

216. Gorbikova, E. A., Wikstrom, M., and Verkhovsky, M. I. (2008) The protonation state of the cross-linked tyrosine during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase, J.Biol. Chem. 283, 34907-34912.

217. Lepp, H., Svahn, E., Faxen, K., and Brzezinski, P. (2008) Charge transfer in the K proton pathway linked to electron transfer to the catalytic site in cytochrome c oxidase, Biochemistry 47, 4929-4935.

218. Sharpe, M. A., Krzyaniak, M. D., Xu, S., McCracken, J., and Ferguson-Miller, S. (2009) EPR Evidence of Cyanide Binding to the Mn(Mg) Center of Cytochrome c Oxidase: Support for CuA-Mg Involvement in Proton Pumping (dagger). Biochemistry 48, 328335.

219. Lepp, H., Salomonsson, L., Zhu, J.-P., Gennis, R. B., and Brzezinski, P. (2008) Impaired proton pumping in cytochrome c oxidase upon structural alteration of the D pathway, Biochim. Biophys. Acta 1777, 897-903.

220. Papa, S. (2005) Role of cooperative H(+)/e(-) linkage (redox bohr effect) at heme a/Cu(A) and heme a(3)/Cu(B) in the proton pump of cytochrome c oxidase, Biochemistry (Mosc) 70, 178-186.

221. Papa, S., Capitanio, N., and Capitanio, G. (2004) A cooperative model for proton pumping in cytochrome c oxidase., Biochim. Biophys. Acta 1655, 353-364.

222. Papa, S., Capitanio, N., Capitanio, G., and Palese, L. (2004) Protonmotive cooperativity in cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1658, 95-105.

223. Yoshikawa, S. (2003) A cytochrome c oxidase proton pumping mechanism that excludes the 02 reduction site, FEBS Lett. 555, 8-12.

224. Yoshikawa, S., Muramoto, K., Shinzawa-Itoh, K., Aoyama, H., Tsukihara, T., Ogura, T., Shimokata, K., Katayama, Y., and Shimada, H. (2006) Reaction mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1757, 395-400.

225. Salje, J., Ludwig, B., and Richter, O.-M. H. (2005) Is a third proton-conducting pathway operative in bacterial cytochrome c oxidase?, Biochem. Soc. Transactions:, 829-831.

226. Mills, D. A., Tan, Z., Ferguson-Miller, S., and Hosier, J. (2003) A role for subunit III in proton update into the D pathway and possible proton exit pathway in Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase, Biochemistry 42, 7410-7417.

227. Gelles, J., Blair, D. F., and Chan, S. I. (1986) The Proton-Pumping Site of Cytochrome c Oxidase: A Model of its Structure and Mechanism, Biochim. Biophys. Acta 853, 205-236.

228. Mitchell, P. (1988) Possible Proton Motive Osmochemistry in Cytochrome Oxidase, Ann. N.Y. Acad. Sci. 550, 185-198.

229. Babcock, G. T., and Callahan, P. M. (1983) Redox-Linked Hydrogen Bond Strength Changes in Cytochrome a: Implications for a Cytochrome Oxidase Proton Pump, Biochemistry 22, 2314-2319.

230. Puustinen, A., Finel, M., Virkki, M., and Wikstriim, M. (1989) Cytochrome o(bo) is a Proton Pump in Paracoccus denitrificans and Escherichia coli, FEBS Lett. 249, 163-167.

231. Namslauer, A., Aagaard, A., Katsonouri, A., and Brzezinski, P. (2003) Intramolecular proton-transfer reactions in a membrane-bound proton pump: the effect of pH on the peroxy to ferryl transition in cytochrome c oxidase, Biochemistry 42, 1488-1498.

232. Siletsky, S., and Konstantinov, A. A. (2006) Electrogenic mechanism of cytochrome c oxidase, The 8th European Biological Chemistry Conference, 80.

233. Wikstrom, M., and Verkhovsky, M. I. (2006) Towards the mechanism of proton pumping by the haem-copper oxidases, Biochim. Biophys. Acta 1757, 1047-1051.

234. Sugitani, R., Medvedev, E. S., and Stuchebrukhov, A. A. (2008) Theoretical and computational analysis of the membrane potential generated by cytochrome c oxidase upon single electron injection into the enzyme, Biochim. Biophys. Acta 1777, 1129-1139.

235. Wikstrom, M., Ribacka, C., Molin, M., Laakkonen, L., Verkhovsky, M. I., and Puustinen, A. (2005) Gating of proton and water transfer in the respiratory enzyme cytochrome c oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 10478-10481.

236. Zheng, X., Medvedev, D. M., Swanson, J., and Stuchebrukhov, A. A. (2003) Computer simulation of water in cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1557, 99-107.

237. Tashiro, M., and Stuchebrukhov, A. A. (2005) Thermodynamic properties of internal water molecules in the hydrophobic cavity around the catalytic center of cytochrome c oxidase, JPhys Chem B 109, 1015-1022.

238. Olsson, M. H. M., Sharma, P. K., and Warshel, A. (2005) Simulating redox coupled proton transfer in cytochrome c oxidase: looking for the proton bottleneck, FEBS Lett. 579, 2026-2034.

239. Pereira, M. M., Sousa, F. L., Teixeira, M., Nyquist, R. M., and Heberle, J. (2006) A tyrosine residue deprotonates during oxygen reduction by the caa3 reductase from Rhodothermus marinus, FEBS Lett. 580, 1350-1354.

240. Siletsky, S. A., and Konstantinov, A. A. (2012) Cytochrome c oxidase: charge translocation coupled to single-electron partial steps of the catalytic cycle, Biochim. Biophys. Acta 1817, 476-488.

241. Brzezinski, P., and Larsson, G. (2003) Redox-driven proton pumping by heme-copper oxidases, Biochim. Biophys. Acta 1605,1-13.

242. Popovic, D. M., and Stuchebryukhov, A. A. (2004) Electrostatic Study of the Proton Pumping Mechanism in Bovine Heart Cytochrome c Oxidase, J. Am. Chem. Soc. 126, 1858-1871.

243. Kaila, V. R., Sharma, V., and Wikstrom, M. (2011) The identity of the transient proton loading site of the proton-pumping mechanism of cytochrome c oxidase, Biochim. Biophys. Acta 1807, 80-84.

244. Siegbahn, P. E. M., and Blomberg, M. R. A. (2008) Proton pumping mechanism in cytochrome c oxidase, J. Phys. Chem. 112, 12772-12780.