Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика влияния простагландинов на монооксигеназную систему печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика влияния простагландинов на монооксигеназную систему печени крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

РГВ Ой о 9 ФЕЭ 1993

На правах рукописи УДК 577.152.1 : 577.175.859

САДОВНИЧИЙ ВИТАЛИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЛИЯНИЯ ПРОСТЛГЛАНДИНОВ

ПЕЧЕНИ КРЫС.

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной

гепатологии Института биохимии АН Беларуси

Научные руководители:

' доктор биологических наук В. У. Буко, кандидат биологических наук А.Н. Арцукевич

Официальные ошюнетты:

доктор биологических тук, профессор М.М. Левочёв доктор медицинских наук, профессор И.Н. Морокко

Ведущая организация: ' .

НИИ наркологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_>>_ ' 1998 г. в «_» час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук при Институте питания Российской академии медицинских наук (Москва, Устьинский пр. 2/14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитания Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «_»_ 1997 г.

Ученый секретарь совета, кандидат медицинских наук

В.М. Жминченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации.

Проблема биотрансформации чужеродных веществ в живом организме занимает важное место в биологии и медицине. Система цитохро-ма Р-450 эндоплазматического ретикулума печени участвует в метаболизме как многих эндогенных субстратов, так и большого многообразия лекарств, канцерогенов и различных экзогенных веществ. Превращая гидрофобные соединения в более полярные продукты и, таким образом, способствуя удалению их из организма, эта ферментная система выполняет функцию защиты внутренней среды организма от повреждающего действия ксенобиотиков.

В настоящее время общепринятым в биохимической токсикологии является феномен метаболической активации чужеродных веществ, ко гда токсичность большинства инертных липофильных чужеродных соединений обусловлена превращением их в реакционноспособные метаболиты, ■ вступающие в реакции с макромолекулами и запускающие цепь вторичных патобиохимических процессов. Система цитохрома Р-450 также вовлечена в наработку кислородных радикалов в микросомах печени. Индукция этой системы приводит к усилению каскада свободно радикальных процессов, вызывающих гепатотоксический эффект и ведущих к окислительному поражению печени.

Исследование механизмов регуляции моиооксигеназных реакций и поиск препаратов, способных управлять активностью этой системы, открывает широкие перспективы в области предупреждения и лечения токсического и окислительного повреждения печени. В процессе проводимого поиска гепатопротекторов среди естественных метаболитов были обнаружены защитные свойства эйкозаноидов, в частности простаглан-динов (ПГ1) серии Е, обладающих также и антиоксидантными свойствами. Механизмы реализации этих эффектов ПГЕ изучены далеко недостаточно. В связи с этим нам представилось интересным исследовать влияние одного представителя этого семейства ПГЕ), а также ПГР2а, не

' Принятые сокращения в тексте автореферата: БКОД - бензилоксикумарин О-деэтилирование, ДСК - доксилстеариновая кислота, МЭОС - микросомальная . этанол-окисляющая система, ОБА - оксилтетраметилпиперидинбромацетамид, ПГ - простагландины, ПОЛ - перекисное окисление липидов, ПРОД - пентокси-резоруфин О-деэтилирование, ПХМБ - оксилтетраметилпиперединпарахлормер-курийбензонат, СОД - супероксиддисмутаза, ТЦК - оксилтетраметилпиперидин-циклогексилкарбодиимид, ЭКОД - этоксикумарин О-деэтилирование, ЭМДЕ -этилморфин Ы-деметилирование, ЭРОД - этоксирезоруфин О-деэтилирование.

обладающего гелатопротективными свойствами, на систему микросо-мального окисления в печени крыс, а также процессы, связанные с генерацией свободных кислородных радикалов в этой системе. Совокупность приведенных выше положений послужила основанием для выполнения данной работы.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнялась но проблеме 2.28.4 "Биохимия животных и человека" в рамках республиканской комплексной программы "Исследование метаболических и регуляторных факторов, общеадаптационных и иммунных реакций, нейрохимических процессов в норме и патологии" по темам "Исследование молекулярных механизмов гепатотоксичности и защиты печени при алкогольном и токсическом поражении", "Механизмы поражения печени альдегидами метаболического происхождения".

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование влияния простагландинов на функциональные и структурные изменения монооксигеназной системы микросом печени крыс в условиях ее. индуцирования или иигибирования.

Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить влияние ПГЕ) и П^а на биохимические функциональные параметры монооксигеназной системы микросом печени крыс в условиях индукции системы цитохрома Р-450 фенобарбиталом, хронической алкогольной интоксикацией и ацетоном в сочетании с голоданием.

2. Охарактеризовать воздействие ПГЕ] и ПГРча на свободноради-кальные и антиоксидантные процессы в микросомах печени крыс при индукции монооксигеназной системы фенобарбиталом, хронической алкогольной интоксикацией и ацетоном.

3. Исследовать взаимодействие ПГ с микросомальными мембранами печени интактных крыс.

4. Провести сравнительное изучение функциональных и структурных особенностей микросомальной системы под влиянием ПГЕ при острой и хронической алкогольной интоксикации.

Научная новизна полученных результатов. Впервые установлено, что ПГЕ снижает активность монооксигеназной и антиоксидантной системы, ингибирует свободнорадикальные процессы и ПОЛ при микросомальной индукции. В условиях ингибирования ПГЕ! оказывает нормализующее действие на цитохром Р-450-зависимую систему и обладает антирадикальной активностью. В экспериментах с индукцией различных

нзоформ цитохрома Р-450 показаны особенности влияния ПГЕ] на эти изоформы и связанные с ними реакции. ИГЕ, и ПГЕ2 изменяют информационное состояние белков поверхностного слоя микросомальной мембраны, а ПГР2а проникает в лишщный бислой и вызывает флюиди-зацию полярного его участка и ослабление белок-липндиых гидрофобных связей. ПГЕ] стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, уменьшая микровязкость липидного бислоя и внутримолекулярную подвижность гидрофобных областей белковых структур.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные данные расширяют представление о роли ПГ как гепатопротектора и антиоксиданта, регулирующего монооксигеназную и антирадккальную системы. ПГЕ) проявляет антиоксидантное действие в условиях индукции и ингибированип монооксигеназиок системы. Исследован характер взаимодействия ПГ с микросомальными мембранами в норме и в условиях индукции микросомальной системы. ПГЕ проникают в приповерхностный слой микросомальной мембраны, а ПГР2а - в более глубинный линидный бислой, вызывая его разжижение. В условиях хронической алкогольной интоксикации ПГЕ! эффективно стабилизирует микросо-мальную мембрану. Результаты работы носят фундаментальный характер и могут быть использованы а научно-исследовательской практике. Данные о антирадикальном действии ПГ являются принципиально новыми и имеют большое теоретическое и практическое значение. Данное соединение может применяться для предупреждения образования свободных радикалов мшсросомами печени, а также при поражении печени гепатотоксинами, поражающее действие которых связано с активацией свободнорадикальных процессов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. ПГ являются соединениями, снижающими образование свободных радикалов и гидроперекисей липидов при индукции и ингибирова-нии микросомальной системы.

2. Антирадикалыюе действие ПГ серии Е и Р связано с особенностями их взаимодействия с различными нзоформами цитохрома Р-450: ПГЕ! оказывает антиоксидантное действие, П^а может действовать как в роли антиоксиданта, так и в качестве прооксиданта.

3. ПГЕ! стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, уменьшая микровязкость гидрофобной области липидного бислоя и внутримолекулярную подвижность гидрофобных областей белковых структур.

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации обсуждены на 11-ом Гепагологпческом симпозиуме (Белосток, Польша, 1992), 6-ом симпозиуме по свободным радикалам (Турин, Италия, 1992), 27-ом конгрессе Европейской ассоциации по изучению печени (Вена, Австрия, 1992), 9-ом конгрессе по изучению болезней печени (Базель, Швейцария, 1992), международной научной конференции (Гродно, 1993), 14-ом Европейском симпозиуме по метаболизму лекарств (Париж, Франция, 1994), международном конгрессе по изучению алкоголизма (Сидней, Австралия, 1994), 6-ом симпозиуме по биохимии ли-пидов (Санкт-Петербург, 1994), 1-ом белорусском симпозиуме гепатоло-гов (Гродно, 1994), 1-ом белорусском съезде фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994), 15-ом Европейском симпозиуме по метаболизму лекарств (йена, Германия, 1996), а также на научных семинарах Института биохимии АН Беларуси (1993, 1994),

Опубликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; общей характеристики работы; основной части, содержащей обзор литературы, описание материалов и методов, результатов 2-х глав собственных исследований и их обсуждения, заключения; выводов и списка 203 использованных источников, расположенных на 24 страницах. Работа изложена па 144 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 16 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследований.

Исследования проведены на 198 половозрелых нелинейных крысах-самцах. Объектом исследования служила ткань печени. В качестве индукторов монооксигеназной системы использовали многократное введение этанола, введение ацетона на фоне голодания, а также индукцию фенобарбиталом. В качестве ингибитора монооксигеназной системы использовалось однократное введение этанола.

Острую алкогольную интоксикацию вызывали однократным введением 25% раствора этанола в дозе 4 г/кг. ПГЕ( вводили внутрибрюшин-но в дозе 20 мг/кг одновременно с введением этанола. Хроническая алкогольная интоксикация вызывалась внутрижелудочным введением 40% раствора этанола в дозе 5 г/кг массы тела в течение 30 дней. ПГЕ и П1Т2а вводили внутрибрюшинно в течении последних 10 дней в дозе

4 мг./кг. Интоксикация ацетоном вызывалась внутрижелудочным введением 33% раствора ацетона в течении 2 дней в дозе 5 мл/кг веса тела на фоне 48 часового голодания. ПГЕ5 и ПГР2а вводили иитраперитоне-ально в течении 3 дней в дозе 10 мг/кг. Фенобарбитал вводили внутрн-бргошшшо в дозе 80 мг/кг на протяжении 2 дней. ПГЕ: в этой модели вводили интраперитонеально в дозе 4 мг/кг одновременно с фенобарбиталом. Контрольным животным внутрябрюшгагно и внутрижелудочно вводился изотонический раствор хлорида натрия. Микросомальная фракция выделялась согласно Карузиной и Арчакову С1977).

Функцию монооксигеназной системы печени оценивали но содержанию цитохромов Р-450 и bs (Omura, Sato, 1964), электротранспортной активности НАДФН- и НАДН-завишмых флавопротеидов (Dailner, 1963), скорости окисления НАДФН и НАДН (Gillette, 1957), гидроксилпрования субстратов: 7-атоксикумарииа и бензилокснкумарпна (Aitio, 1976), 7- этилрезоруфнна и пеитилрезоруфина (Burke, 1978), а также этилморфина (Klinger, Müller, 1976). Функцию антиоксидантной системы оценивали по активности СОД (Nishikimi, 1976) и наработке перекиси водорода (Hilderbrandt, 1978). Генерация свободных радикалов определялась хемилюминесцектным методом (Muiler-Peddinghaus,í977), содержание перекисей липидов и стимулируемое пе рекисное окисление липидов - тиобарбитуровым методом (Buege, Aast, 1978). Жирнокислотнын и фосфолнпидный состав мембран определялся методом газовой и тонкослойной хроматографии. Взаимодействие TT Г с микросомалыюй мембраной изучалось методом ЭПР, используя спиновые зонды: ПХМБ, ТЦК, ОБА, 5- и 16-ДСК.

Результаты исследований проанализированы методом вариацнон ной статистики с использованием критерия Стьюдента и методом достоверности разности сравниваемых величин.

Влияние ПГ на активность компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем в условиях индукции и ингибирования мшсросо-мальных систем окисления.

Длительный прием этанола приводил к увеличению содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени (в 1.4 раза), тогда как НАДФН-цитохром Р-450 редуктазная активность оставалась неизменной (табл.1). Прием алкоголя достоверно активировал микросомальное окисление НАДФН и этанола, в то время как параметры, относящиеся к цитохро-му Ь5, оставались практически неизменными. Активность СОД была увеличена в 1.3 раза. Длительный прием этанола приводил к достовер-

ному увеличению образования перекисей липидов и ПАДФН- зависимой хемилюминесценции, стимулируемой люминолом и люцигенином (Рис.2,3). Уровень восстановленного глутатиона в печени после приема алкоголя был снижен в 2 раза, тогда как содержание окисленного глутатиона оставалось неизменным (Рис.1). Интоксикация этанолом приводила к достоверному увеличению активности ЭКОД (примерно в 1.5 раза) и несущественному повышению активности БКОД и ЭРОД, тогда как активность ПРОД оставалась, неизменной и более того, активность ЭМДЕ была несколько снижена.

Таблица 1

Влияние ПГЕ( на содержание и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печени крыс после хронической алкогольной интоксикации.

Показатели Контроль Этанол Этанол+11ГЕ)

Цитохром Ь5 & 0.49±0.03 0.47+0.02 0.37+0.03 *#

Цитохром Р-450 & 0.62+0.05 0.83+0.03 * 0.42*0.05 *#

НАДН-цитохром Ь5 5715.4+390.96 4952.2+409.8 4711.9+306.95

редуктаза @

НАДН-цитохром Р-450 234.0+39.3 234.7+34.8 204.0+19.8

редуктаза (о)

НАДН-оксидаза @ 2.24+0.24 2.86+0.2 3.38+0.2 *

ПАДФН-оксидаза @ 1.37+0.06 1.91+0.19 * 1.57+0.14

МЭОС @ 238.4±12.7 286.5+14.6 * 134.5+7.9 *#

Продукция перекиси 0.45+0.02 0.48+0.036 0.46+0.02

водорода @

Сунсроксиддисмутаза, 32.8±0.49 40.2+1.25 * 35.7±1.65 и

% блокирования

НАДФН-зависимая 619+80 1526+178 * 521±52 #

хеми люминесценция,

с.р.т./с на мг.белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое ± Б.Е.М для 8 животных.

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к этанолу.

Глутатион БН, мкг/г печени

I

500

I

400 I

I

300 I 200 -] 100 г

I

О !-

А

160 140 120

Глутатион окисленный, мкг/г печени

100 ~

-I 80 |

й

Э Э+ПГР,а А А+ПГРг|

+ (

60

Щ\ «о

20 0

ии

в

Э :)М!(Г-,. А ~ А+ПГРг«

* - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

К - контроль, Э - этанол, Л - ацетон, ПГР2а - простагландины Р2а

Рис.1. Содержание восстановленного (Л) и окисленного (В) глутатиона в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и их комбинацией с поостагландинами Р?«,

35 ■

10" имп/мг белка в мин

зо X . . . 25|--

20 {----

I

15 10 } 5 т

0 +

К

.1.

II

!. I

А I

»—«-гз .1

25

107 имп/мг белка в мин

20 4-----

15 | -----

Ют----

Э Э+ПГЯ2а А А+ПГР2а

0

К

Л.

I

г 1

ы

Э Э+ПГР2а А А+ПГ 1-2а

В I

+ ] | ^"Т" | \

* - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

К - контроль. Э - этанол, А - ацетон, ПГР2а - простагландины Р2а

Рис.2. НАДФН-зависимая хемилюминесценция, усиленная люминолом (А) и люцигенином (В) в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и их комбинацией с простагландинами Роа.

3 2.5 2 1,5 1

0,5

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

нмоль ТБК-реакгизных продуктов/мг белка в мии

: А

!

К Э Э+ПГР2а нмоль Нг02/мг белка в .«V

Гс £

А А+Г1!Т2и

Э+ПГР,а А А+ПГР-,«-

нмоль ТБК-реактивных продуктов/мг белка

Э+ПГР2а

К - контроль, Э - этанол, А - ацетон,

Ш'г2а - простагландины

г2а.

* - р<0,05 но сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

Рис.3. НАДФН-стимудируемое перскнснос окисление лиггидов (А), образование перекисей липидов (В) и продукция перекиси водорода (С) в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и их комбинацией с простагландинами ¡^а.

I

Обработка крыс с хронической алкогольной интоксикацией ПГЕ снижала уровень цитохрома Р-450 и активность МЭОС ниже контрольного уровня (табл.О. ПГЕ] нормализовал НАДФН-зависимую хеми-люминесценцию микросом и активность СОД. ПГЕ1 повышал также НАДФН-оксидазную активность, тогда как уровень цитохрома Ь5 был снижен.

Обработка крыс, получавших этанол, ПП^а приводила к более выраженному прооксидантному эффекту, чем действие самого алкоголя на печень: наработка Н2О2, образование перекисей липидов и НАДФН-зависимая хемилюминесценция, стимулируемая люминолом и люциге-нином, были достоверно увеличены в 1.2; 1.3; 2 и 2.3 раза, соответственно, в то время как НАДФН-стимулируемое ПОЛ увеличивалось не-

существенно (Рис.2,3). Концентрации окисленного и восстановленного глутатиона снижались в 3.1 и 1.8 раза, соответственно (Рис.1). Этанол вместе с ПГ приводил к недостоверному увеличению активностей ЭРОД, ЭКОД и БКОД, тогда как активности ПРОД и ЭМДЕ снижались достоверно в 1.8 и 1.5 раза, соответственно.

Таблица 2

Влияние ИГЕ! на содержание и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печени крыс в условиях интоксикации ацетоном совместно с голоданием.

Показатели Контроль Ацетон Ацетон+ПГЕ]

Цитохром Ь5 & 0.46+0.03 0.46+0.04 0.39±0.03

Цитохром Р-450 & 0.63+0.04 0.91 ±0.15 * 0.74±0. И

НАДН-цитохром Ь5 6020.9±662.45 3941.5±432.05 * 2623.9+202.45*#

редуктяза @

НАДН-цитохром 205.2±Н.9 278.9+33.07 * 197.2+22.48

Р-450 редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 1.91+0.27 2.59+0.28 2.49+0.48

НАДФН-оксидаза @ 2.16+0.18 4.98+0.41 * 2.94+0.43 #

МЭОС @ 299.4+17.2 343.3+24.89 294.4+46.13

Продукция перекиси 0.92+0.029 1.36±0.077 * 1.16+0.053 *#

водорода @

Супероксиддисмутаза 21.5+1.87 33.5+1.72 * 26.8+1.70 #

, % блокирования

НАДФН-зависимая 111±8 154+28 * 106±7 #

хемилюминесценция,

с.р.т./с на мг.белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое ± 8.Е.М для 8 животных. ■ -

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к ацетону.

Комбинация введения ацетона с голоданием активизировала окисление НАДФН и активность НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы (табл.2). Уровень цитохрома Р-450 в микросомах печени был достоверно увеличен в 1.8 раза. Наблюдалось достоверное увеличение активности СОД. НАДН-цитохром Ь5-редуктазная активность снижалась, тогда

как окисление НАДН и содержание цитохрома Ьз оставались неизменными в группе, получавшей ацетон. Комбинация ацетона с голоданием приводила к достоверному увеличению наработки перекиси водорода в 1.5, образования гидроперекисей липидов в 1.2 раза, НАДФН стимулированного ПОЛ в 1.52 раза и НАДФН-зависимой хемилюми-несценции, стимулируемой люминолом и люцигеюгном в 3 и 3.1 раза, соответственно (Рис.2,3). Уровни восстановленного и окисленного глу-татиона в печени резко снижались в 5.2 и 3.3 раза, соответственно (Рис.1). Интоксикация ацетоном приводила к достоверному увеличению активностей ЭРОД я 3.4 раза, ЗКОД в 5РОД, ЭКОД, ЫШД и ЭМДЕ и 3.4, 5.8; 5.9 и 1.8 раз, соответственно, тогда как активность ПРОД была увеличена несущественно.

ПГЕ( нормализовал большинство параметров, измененных сочетанием введения ацетона с голоданием. Как видно из таб.2, ПГЕ, достоверно снижал содержание цитохрома Р-450 и образование перекиси водорода, НАДФН зависимую хемилюминесценцию, окисление НАДФН и НАДФН цитохром Р-450-редуктазную активность. Снижение активности СОД после введения ИГЕ^ было несущественным. ПГЕ] также способствовал снижению и НАДН-цитохром Ь5-редуктазной активности.

ПГр2а улучшал большинство параметров, измененных комбинацией ацетона с голоданием. ПГгга достоверно повышал уровень восстановленного и окисленного глутатиона, снижал НЛДФН-стимулнруемое ПОЛ и НАДФ15 -зависимую хемилюминесценцию, стимулируемую люминолом и люцигешшом, тогда как наработка П2О2 снижалась несущественно, а образование перекисей липидов оставалось неизменным (Рис.2,3). ПГЕ^а приводил к достоверному снижению активности ЭРОД и недостоверному уменьшению активностей ПРОД, БКОД и ЭМДЕ, тогда как активность ЭКОД оставалась неизменной.

Фенобарбитал вызывал почти двухкратное увеличение НАДФН-оксидазной и НАДФН-цитохром Р-450-редуктазной активностей (табл.3). Активности МЭОС, СОД, НАДН-оксидазы и образование перекиси водорода были также повышены после введения фенобарбитала. Содержание цитохрома Р-450 увеличивалось более, чем в 2 раза. Обработка фенобарбиталом резко повысила НАДФН-зависимую хемилюминесценцию микросом.

ПГЕ! нормализовал НАДФН оксидазу, НАДФН-цитохром Р-450-редуктазу и активность МЭОС у крыс, обработанных фенобарбиталом и достоверно снижал содержание цитохрома Р-450 и активность СОД. В то же время ПГЕ практически не изменял НАДФН-зависимую хемилю-

минесценцию и образование перекиси водорода. Все показатели, относящиеся к системе цитохрома Ь5: содержание цитохрома Ь5, НАДН-оксидазная и НЛДН-цитохром Ь5-редуктазная активности были снижены после введения ПГЕ].

Таблица 3

Влияние ИГЕ) па содержание и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печени крыс после индукции микросом

фенобарбиталом.

Показатели Контроль Фенобарбитал Фенобарбитал +ПГЕ,

Цитохром Ь5 & 0.46+0.02 0.47±0.01 0.32+0.02 *#

Ццтохром Р-450 & 0.49+0.01 0.87+0.07 * 0.54+0.05 *#

НАДН-цитохром Ь5 2385.2+145.65 2844.2+262.1 1561.7±99.41 *#

редуктаза @

НАДН-цитохром Р-450 136.8-2.56 256.6+23.17 * 165.2+13.7 #

редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 3.27+0.19 4.82+0.3 * 3.86+0.15

НАДФН-оксидаза (о) 2.90+0.09 6.51+0.46 * 2.98+0.25 #

МЭОС @ 214.4+23.7 339.2+46.5 * 223.3+22.2 #

Продукция перекиси 0.69+0.049 0.96+0.132 * 0.89+0.065 *

Еодорода @

Супероксиддисмутаза, 31.2+2.96 5.5.1+2.65 * 47.4+2.61 *#

% блокирования

НАДФН-зависимая 237+32 343+39 * 379+26 *

хемп люминесценция,

с.р.т./с на мг. белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое + Б.Е.М для 8 животных.

@ - активность выражена в нмолъ/мин./мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к фенобарбиталу.

При острой алкогольной интоксикации содержанке цитохромов Ь5 и Р-450 достоверно снижалось в 1.4 и 1.44 раза соответственно (табл.4). Наблюдалось достоверное снижение НАДН-цитохром Ь5-редуктазной активности в 1.4 раза, в то время как НАДФН-цитохром Р-450 редуктазная активность и окисление НАДН и НАДФН остава-

лись практически неизменными, а НАДФН-зависимая хемилюминес-ценция была несущественно увеличена. Активность МЭОС резко снижалась (в 2 раза), а активность СОД и продукция перекиси водорода достоверно повышалась в 1.2 и 1.5 раза соответственно.

Таблица 4

Влияние ШТц на содержание и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печени крыс при острой алкогольной интоксикации.

Показатели Контроль Этанол Этанол+ПГ

Цитохром Ь5 & 0.42+0.02 0.30+0.01 * 0.42+0.01 #

Цитохром Р-450 & 0.46+0.01 0.32+0.02 * 0.47+0.02 #

НАДН-цптохром Ь5 4774.3+144.91 3346.5+203.7 * 4003.3+335.9

редуктаза @

НАДП-цитохром Р-450 187.8+8.37 205.8+4.86 260.4+13.54 *#

редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 3.55+0.12 3.55+0.11 3.98+0.08 4#

НАДФН-оксидаза (д) 3.48x0.11 3.58+0.17 3.93+0.07 *

МЭОС @ 311.5+36.9 191.75+9.1 * 222.25.il5.86 *

Продукция перекиси 1.16+0.116 1.63±0.094 * 1.55+0.124 *

водорода @

Супероксиддисмутаза, 30.4+0.53 36.1 + 1.65 * 32.9+1.03 *#

% блокирования

НАДФН-зависимая 524±114 649±93 489+83

хемилюминесцешщя,

с.р.ш./'с на мг.белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое ± Б.Е.М для 8 животных.

(ей - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/'мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к этанолу.

ПЩ оказывал положительный эффект практически на все параметры, измененные при острой алкогольной интоксикации. Он полностью нормализовал содержание цитохромов и Р-450, НАДН-цитохром Ь5- и НАДФН-цитохром Р-450-редуктазные активности и активность МЭОС. Кроме того, ПГЕ! снижал активность СОД и досто-

верно не влиял на образование перекиси водорода и НАДФН-зависимую хемилюминесценцию.

Суммируя приведенные выше результаты, можно сделать следующее заключение: ИГ, в большей степени серии Е, обладают антиокси-дантной и аитирэдикальной активностью, снижая генерацию свободных радикалов микросомами печени и ингнбируя ПОЛ при воздействии различных гепатотоксинов. Этот эффект обусловлен нормализующим действием ПГ на монооксигеназную систему и, в особенности, на цитохром Р-450-зависимую цепь переноса электронов.

Взаимодействие ПГ с мембранами микросом печени крыс.

ПГ уменьшают время вращательной корреляции (т) спиновой метки ПХМБ, которая взаимодействует с аминокислотными остатками цис-тенпов, принадлежащим белковым структурам мнкросомальной мембраны. Уменьшение значения величины х свидетельствует о увеличении частоты вращения спиновой метки, связанной в этом участке мнкросомальной мембраны, что в свою очередь, означает уменьшение микровязкости липидного бислоя в месте присоединения ПХМБ. Как следует из рис.4 ПГГ^сс наиболее выраженно влияет на микровязкость окружения спиновой метки ПХМБ. ПГЕ! и, в меньшей степени ПГЕ2 уменьшают микровязкость окружения этой метки, причем наблюдается зависимость воздействия от количества двойных связей в молекуле ПГ. ПГЕз, содержащий две двойные связи, слабее воздействует на микровязкость по сравнению с ПГЕ}, который содержит одну двойную связь.

Рис. 4. Зависимость времени корреляции вращательнрй диффузии (т) спиновой метки ПХМБ (А) и ТЦК (Б) в мембранах микросом печени крыс от концентрации-ПГ (1 - ПГЕ2, 2 - ПГЕЬ 3 - ШТ2а).

На рис.4 представлены кривые титрования ПГ суспензии микро-сом, меченных спиновой меткой ТЦК, которая взаимодействует с е-амипогруппами аминокислотных остатков белков, расположенных на поверхности мембраны. Видно, что ПГР2а не оказывает влияния на микровязкость окружения этой спиновой метки, связанной с микросо-мальной мембраной. Напротив, 11ГЕ1 и ПГЕ2 увеличивают значение величины х спиновой метки ТЦК и, следовательно, микровязкость ее окружения. Здесь также наблюдается зависимость степени воздействия от количества двойных связей в молекуле ПГ. ПГЕ2 в данном случае оказывает более сильное влияние на состояние микроокружения спиновой метки ТЦК, по сравнению с ПГЕ(.

Состояние липидной компоненты микросомальной мембраны изучали при помощи жирорастворимых парамагнитных зондов: 5- и 16 ДСК, ннтроксильные фрагменты которых локализуются на различной глубине липидного бислоя микросомальной мембраны. Упорядоченность липидного бислоя СБ), оцениваемая по поведению спинового зонда 5-ДСК в мембранах, модифицированных ПГ, возрастает, причем для ПГРза это увеличение значительно более выраженно по сравнению с ПГ серии Е (рис.5).

Рис. 5. Зависимость параметра упорядоченности (Б) спинового зонда 5-ДСК (А) и 16-ДСК (Б) в мембранах микросом печени крыс от концентрации ПГ (1 - ПГЕ2, 2 - ПГЕ(, 3 - ПГЕ2а).

Ш"];2а увеличивает упорядоченность глубишюго участка липидного бислоя, как следует из анализа поведения спинового зонда 16-ДСК.

В то же время ПГЕ1 и ПГЕ2 не влияют на упорядоченность этого участка мнкросомалыгой мембраны (рис. 5).

Острая и хроническая алкоголизация крыс приводит к структурным изменениям белковой и липиднон компоненты микросомальных мембран печени. Гидрофобное окружение, белковых структур мембран микросом одинаковым образом реагирует на способ алкоголизации животных. При остром и хроническом введении этанола наблюдается разжижение гидрофобных областей. Этот эффект составляет до 10% при острой и до 20% при хронической алкогольной интоксикации (рис.6). ПГЕг не оказывает стабилизирующего действия в случае однократного введения этанола и полностью стабилизирует мембрану при хронической алкоголизации животных.

, не

4,5 т

4 I

3,5 ]

з к

2,5 \ 2-Г 1.5 -1

0,5 0

А]

С,в (не)

12

10

т, не

8 [- -1

4 у- -'2 -1 0

I

I

-1 ]

1'Т!ЙП""М 1

! I I_Г., Л Л

Вг (НС)

С,6(не)

П Контроль П Этанол □ Этанол+ПГЕ

р<0,05 по сравнению с контролем,

р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

В

¡ШИЕЗ

Рис.6. Влияние ПГЕ) на время корреляции и параметр упорядоченности бромацетамидной метки (Вг) и спиновых зондов С5 и С!6 производных доксилстеариновой кислоты при острой (А) и хронической (В) алкогольной интоксикации.

Состояние липидного бислоя на уровне локализации 16-ДСК характеризуется увеличением его микровязкости при хронической алкогольной интоксикации на 45-50% (рис.6). Напротив, в случае острой интоксикации микровязкость уменьшается менее значительно, примерно на 15- 20%. При хронической алкоголизации на фоне введения ПГЕ}

наблюдается уменьшение микровязкости гидрофобной области липид-ного бислоя примерно до уровня, определяемого у контрольных животных. При острой алкогольной интоксикации введение ПП^ недостоверно повышает микровязкость гидрофобной области липидного бислоя на уровне локализации парамагнитной метки 16-ДСК (рис.6).

Анализ поведения парамагнитной метки 5-ДСК, локализованной в приповерхностной области микросомальной мембраны, свидетельствует о том, что при однократном введении этанола наблюдается усиление 6е-лок-липндных связей и, наоборот, они ослабевают при хронической интоксикации животных. Эти эффекты слабо выражены и составляют до 5% но отношению к контрольным животным. Присутствие ПГЕ, усугубляет этот эффект и в том и в другом случае (рис.6).

В заключении можно сделать вывод, что ПГЕ! достаточно эффективно стабилизирует структуры микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, тогда как при острой алкогольной интоксикации подобный эффект отсутствует.

Генерация свободных радикалов в результате аутооксидации фер-рокомплекса цнтохрома Р-450 и, как следствие, активация ПОЛ в условиях индукции монооксигеназпой системы играет ключевую роль в поражении печени. Поэтому важнейшей задачей является иншбирование этих процессов путем снижения образования кислородных интермедиа-тов цптохром Р-450-зависимой системы или обезвреживания радикалов соединениями, имеющими свойства "радикальных ловушек". ПГ отвеча ют всем требованиям, предъявляемым к гепатопротекторам, и обладают следующими протективными действиями: во-первых, они являются стабилизаторами микросомальных мембран и антиоксидантами; во-вторых, взаимодействуя с цнтохромом Р-450, они снижают активность моноок-сигеназ и генерацию сунероксид-аниона, и в-третьих, эти соединения являются общеизвестными регуляторами внутриклеточного метаболизма. Кроме того, синтетические аналоги ПГЕ способны улавливать свободные радикалы, что может указывать на многофакторность антирадикального и антиоксидантного эффекта ПГ.

Полученные данные позволяют предположить, что стабилизация структурных изменений липидного окружения микросомальных гемо-протелнов ПГ является одним из механизмов антирадикального и антиоксидантного эффекта ПГ, опосредованного через нормализацию активности цитохромов, состветствующих редуктаз и микросомальных ок-сидаз.

ВЫВОДЫ.

1. ПГЕ] в условиях индукции микросомальной системы многократным введением этанола, фенобарбиталом и ацетоном, а также при ее ин-гибировании однократным введением этанола нормализует активность компонентов монооксигеназной и ангиоксидантной систем.

2.ПГ серии Е проявляют антирадикальное и антиоксидантное действие, снижая образование "свободных радикалов и ингибируя процессы ПОЛ, а также повышая активность защитных антирадикальных систем.

3. ПГр2<х действует как прооксидант при хронической алкогольной интоксикации и антиоксидант в условиях индукции микросомальной системы ацетоном в сочетании с голоданием. Различия эффектов ПГЕ и ПГР связаны с особенностями их влияния на различные изоформы ци-тохрома Р-450.

4.ПГ уменьшаю! микровязкость гидрофобной области белковой компоненты микросомальной мембраны, что более выражено у TiFFja, чем у ПГЕ. ПГ серии Е изменяют конфирмационное состояние белков поверхностного слоя мембраны, а III Fja вызывают увеличение вязкости гидрофобных участков лшгадного бислоя. Степень изменения микровязкости мембраны зависит от числа двойных связей в молекуле ПГЕ.

5. ПГЕ связываются с функционально активными группами (аминогруппами, SII-группами), расположенными на поверхности микросомальной мембраны. ПГЕ2а проникает в глубину липидного бислоя н вызывает разжижение полярного его участка и ослабление белок-липидных гидрофобных связей.

6. ПГЕ) стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, уменьшая микровязкость гидрофобной области липидного бислоя и флюидизацию гидрофобных областей белковых структур.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

l.Buko V., Sadovnichy V. Prostaglandins and cytoprotection of liver cells// The llth Hepatological Symposium "Bialystok Liver Day".-Bialystok, 1992,- P. 40-42.

2.Buko V., Sadovnichy V. Effect of prostaglandin Ej on radical generation in rat liver microsomes// Abstracts of the VI Bienniale Meeting "Free Radicals: from Basic Science to Medicine". Free radicals Research Communications.- 1992.- Suppl.l.- Ref 4.11.

3. Sadovnichy V., Nemkevich V., Buko V. Prostaglandin Et and cytochrome P-450 dependent production of free oxygen radicals: Abstracts of the 27th EASL Meetind// Journal of Hepatology.- 1992,- V. 16.-Suppl.l.- P. 82.

4. Sadovnichy V., Buko V. Effect of prostaglandin Et on ethanoi biotransformation, free radical and H202 production by liver microsomes in acute and chronic alcohol intoxication// IX International Congress in Liver Diseases: Extrahepatic Manifestation in Liver.- Basel.- 1992,- P. 21.

б.Арцукевнч A. H., Садовничий В. В. Взаимодействие простаг-ландинов Ej, Е2 и Р2а с мембранами микросом печени крыс при острой и хронической алкогольной интоксикации/./ Материалы международной научной конференции,- Гродно, 1993.- Ч.1.- С. 98-99.

6. С-адовничпй В. В., Мюллер Д., Вуко В. У. Эффект простаглан-динов Р2а на генерацию свободных радикалов, образование гидроперекисей. липидов, содержание глутатиона и реакции О-деэтилирования и N-деметилирования в микросомах печени крыс, индуцируемых хроннче-ской алкогольной интоксикацией и комбинацией ацетона совместно с голоданием/ Институт биохимии АНБ.- Гродно, 1993.- 20 е.- Деп. в ВИНИТИ 02.12.93, N 2995-В93.

7. Вуко В. У., Садовничий В. В. Влияние простагландинов Е) на функции микросомальных цепей переноса электронов и цитохром Р-450 зависимое образование кислородных радикалов/ Институт биохимии АНБ. - Гродно, 1993,- 20 е.- Деп. в ВИНИТИ 02.12.93, N 2996-В93.

8. Buko V.U., Sadovnichy V.V. Cytochrome P-450 mediated inhibition of free radical reactions by prostaglandin Et /'/14th European Workshop on Drug Metabolism.- Paris, 1994,- P. 113.

9. Sadovnichy V,V., Muller D., Buko V.U. The effect prostaglandin F2a on free radical generation during chronic alcohol intoxication and combination of acetone wit starvation// 14th European Workshop on Drug Metabolism.- Paris, 1994,- P..184.

10.Садовничий В. В., Буко В. У. Влияние простагландинов F2a на генерацию свободных радикалов при хронической алкогольной интоксикации и введении ацетона// Актуальные вопросы гепатологшг. Тезисы докладов Первого Белоруского симпозиума гепатологов,- Гродно, 1994.- С. 37-38.

11.Buko V., Artsukevich A,, Sadovnichy V., Maltsev A. Interaction of prostaglandin E2 with microsomal membrane in chronic alcohol intoxication/'/ Alcoholism: Clinical and Experimental Research, 1994.-V. 18, N 2,- P. 51A, 11.17.

12.Арцукевич A. H., Садовничий В. В., Шарейко С. Ч., Буко В. У. Влияние простагландинов на структуру мембран мнкросом и функциональные свойства монооксигеназной системы печени крыс/ / Материалы VI симпозиума по биохимии лишгдов,- Санкт-Петербург, 1994.-С. 18.

13.Sadovnichy V. The effect of prostaglandins Ej and F2a on free radical generation during chronic alcohol intoxication// 38th and 21st International Institutes on the Prevention and Treatment of Alcoholism and Drug Dependence.- Prague, 1994.- P. 290.

14.Арцукевич А. П., Садовничий В. В., Буко В. У. Структура мембран мнкросом и функциональные свойства монооксигеназной системы печени крыс в присутствии простагландинов// Материалы Первого съезда белорускою общества фотобиологов и биофизиков. -Минск, 1994.-С. 8.

15-Bnko V., Artsukevich A., Sadovnichy V. Modification of liver microsomal membranes isolated from ethanol-treated rats by prostaglandin E, // Alcohol, Alcoholism.- 1995,- V 30, N 4.- P. 504.

16.Sadovnichy V., Buko V. The effect of prostaglandin E5 on functional and structural changes of monooxygenase system during acute, and chronic alcohol intoxication.// Exp. Toxicol. Pathol.-1996.-V.18,N5.-P.386.

17.Buko V.IJ., Sadovnichy V.V. Cytochrome P-450 and free radical generation in rat liver microsomes under the influence of prostaglandin Ej.// Biochem. and Mol. Biol. Inter.-i99fi.-V,39,N6.-P. 1177-1184.

18.Sadovnichy V., Muller -D., Buko V. Effect of prostaglandin F2a on free radical generation, glutathione content and microsomal oxidase activities in rat liver microsomes induced either by.ethanol or acetone.// Pol. J. Pharmacol.- 1997.-V.49, N6. - p. 431-437.

Подписано к печати 27.11.97 г. Бумага офсетная 60x84. 1/16. 1,68 п.л. Тираж 100 экз.

Ротапринтами участок Гродненского государственного медицинского института, г. Гродно, ул Горького, 80.