Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени полностью фторированными органическими соединениями

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Индукция цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени полностью фторированными органическими соединениями"

31 9 -

АКАДЕМИЯ НАУК УзССР ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

Шехтман Диана Григорьевна

Индукция цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени полностью фторированными органическими соединениями

03. 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ 1991

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР

Научный руководитель:'

кандидат биологических наук - В. В. Образцов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф.- А. Н. Саприн

доктор биологических наук, проф.- А. И. Гагельганс

Ведущая организация - Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " г. в

час., на заседании Специализированного Совета КЛБ.01.01 в Институте физиологии АН УзССР (г.Ташкент, ул.Ниязова, I)

С диссертацией моаио ознакомиться в библиотеке Института физиологии АН УзССР. у

«/'/« 19Э1Г,

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализировало, доктор биологических наук -

.едкиматов В. А.

Общая характеристика работы.

Высокая химическая инертность полностью фторированных органических соединений (ПФОС), как и другие уникальные физико-химические свойства обусловлены предельной элвктроотри-цательнсстьв атома фтора, его значительным коьалэнтным радиусом (Кнунянц, Фокин,1968).'С другой стороны, низкая энергия мемлолэ-кулярных взаимодействий в жидких ПФОС обеспечивает им способность растворять большие объемы газов. (Clark et al, 19661.

Эти две особенности жидких ПФОС предопределили использование фторуглеродов в качестве газопервносяших сред в биологии и медицине (Geyer et al, 1982, Ohyanagi et al, 1984, Крылов и др., 1985).

При изучении взаимодействия ПФОС о биологически.® объектами различных уровней организации m было об н аружено никаких следов химических превращений молекул ПФОС и, поэтому химическая инертность ПФОС долгое время отождествлялась с -их полной нейтральностью в отношении биологических систем (Yokoyama et al,1978). .Тем не менее, исследования последних лет убедительно доказывают, что ряд эффектов ПФОС на биологические объекты не могут быть объяснены лишь на основе способности фторуглеродов транспортировать газы (Маевсккй , -1Э80). Среди обнаруженных эффектов особое место занимает взаимодействие ПФОС с микросомальными мембранами печени, ори котором в результате связывания фторуглеродов с микросомальным штохромом F-450, происходит разобщение процесса гидроксшмрования в цитохром P-450-зависимой мсноокси-геназной системе (Ullrich et al,1971; Staudt, 1974; Geyer, 1931).

Цитохром Р-4Б0 - является ключевым ферментом монооксигеназной системы, которая локализована в эндошгазматическом ретикулуме печени животных и выполняет окислительную модификацию множества гидрофобных соединений: разнообразных лекарств, полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), этанола, стероидов, простаглан-динов и др.(Gonney, 1969). Особенностью цитохром P-450-зависимой монооксигеназной системы печени животных, является способность к увеличению количества" и активности ее ферментов в ответ на введение в организм ряда, веществ-индукторов. Кроме того, для монооксигеназной система характерна множественность форм цитохрома

Р-450, каждая из которых синтезируется при введении в организм определенных ксенобиотиков-индукторов.

Известно, что введенные в организм в виде субмикрснной эмульсии перфторуглероды накапливаются в клетках печени (Miller et al, 1978). В этом случае, непосредственная близость ПФОС к мембранам эндоплазматического ретикулума печени наряду с возможностью взаимодействовать с цитохромом Р-450 ставит вопрос о влиянии перфторуглеродов на функционирование этой ферментной системы, содержание и активность ее ферментов,- детоксицирующую функцию печени.

Ш® работы. Целью настоящей работы явилось исследование влияния ПФОС на функционирование монооксигеназной системы печени крыс.

За® та доследования. I.Определить способность ПФОС индуцировать цитохром Р-450 в микросомах печени крыс.

2.Определить круг перфторуглеродов, вызывающих индукцию цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс, провести анализ их фнзико -химических свойств.

3.Методами иммунохимического анализа, путем исследования метаболизма специфичных субстратов, определить изоформу цитохрома Р-450, синтезированную в ответ на введение ПФОС. 4.Оценить влияние ПФОС на детоксицирующую функцию печени. 5.Исследовать особенности функционирования монооксигеназной системы в зависимости от дозы введенной эмульсии, способов ее введения.

На2чная_ндвизна. Впервые обнаружено явление увеличения содержания и активности ферментов монооксигеназной системы печени крыс при введении животным эмульсии ПФОС. Определен диапазон физико-химических свойств ПФОС, обеспечивающих перфторуглеродам способность к индукции цитохрома P-4S0. Установлена идентичность изоформы цитохрома Р-450, синтезированной в ответ на введение животным эмульсии фторуглеродов, изоформе этого фермента, образующейся в ответ на введение типичного индуктора монооксигеназных ферментоЕ - {енобарОитала.

Практическое_значение. По своему содержанию работа представляет экспериментальное исследование влияния ПФОС на монооксигеназную систему печени крыс. Полученные данные расширяют представления о

механизме индукции цигохрома Р-450 по фенобарбиталовому типу. Впервые исследована динамика изменений детоксицирумцей функции печени в■зависимости от дозы введенной эмульсии. Результаты работы необходимо учитывать при анализе последствий применения газопереносящих срэд на основе перфторуглвродов в биологии и медицине. Представленные данные дают возможность оценить перспективы использования ПФОС в качестве уникальных индукторов ферментов монооксигеказной системы печени.

АпробацияjjaÖOTU. Результаты диссертации были представлены на III Советско-Американском симпозиуме го проблеме № "Переливание крови, ее компонентов и кровезаменителей", Москва, 1984; на Всесоюзных; конференциях: "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среда человека", Москва, 1935; "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды.", Новосибирск, 1987; "Пдтохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989; на ежегодных рабочих совещаниях по проблема "Перфторуг^ероды в биологии и медицине", Ленинград,1988j Новосибирск, 1989; Пущино, 1990.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объэм_и_стр£ктщза_работы.

Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение и обсуждение результатов, заключение, выводы. Список литературы содержит iSp наименований. Работа изложена на юР страницах машинописного текста, содержит i¿ таблиц,! 9рисунков.

59й§Е®™е_работы. '

Работа проводилась на половозрелых крысах-самцах линии "Vistar", весом 180-200 г из вивария ИБФ АН СССР. В качестве индукторов ферментов монооксигеназной системы использовали, эмульсии ПФОС, фенобарбитал^®), метилхолантрен(МХ), Арохлор 1254. Индукторы вводили животным следующим образом: инъекции ФБ, MX, Арохлора 1254 делали внутрибршинно в дозах 80 мг/кг в течении четырех дней, 40 мг/кг в течении трех дней, 100 мг/кг в течении трех дней соответственно. Эмульсию ПФОС вводили в хвостовую вену однократно. В работе использовали -ПФОС, полученные от К.Н.Макарова ( ИНЭ0С АН СССР), которые по данным ЯМР-спектроскопии и

ГЖХ имели содержание основного в е щества не менее 94-93 %. Субмикронные эмульсии фгоруглеродов, получены на дезинтеграторе "Донор-1", в условиях, обеспечивающих. стерильность и апирогенность эмульсии. Вводимый препарат представлял собой эмульсию голубовато-белого цвета. В таблице I представлен состав эмульсии ПФОС. Состав эмульсии ПФОС.- Таблица 1.

ПФОС

Хлорид Na Хлорид Mg Глюкоза

10-12SS (по оОьвму)

юг т

0,94 Ш 11 ПМ

pH

Проксаяол 268 Хлорид К

Гидройарбонат На Дигидрофосфат На 7,4

3,5-4% 5,2 Ш 14,3 пМ 1,4 тМ

Средний диаметр частиц эмульсии, измеряемый: на фотонно-корвлляцн-онном спектрометре "Coulter N 4"(США), составил 0,1-0,15 ш, содержание иона фтора-10~5М.

Микросош выделяли методом дифференциального центрифугирования (Карузияа, Арчаков,1974). Содержание цитохромов F-450 и bg определяли спэктрофотометрически (Оmura, Sato, 1964).

Электрофорез в ПААГ проводили по методу Лаеммли в присутствии додецилсульфата натрия (Laemnli, 1970), приспособленному для пластинок 1X6x1X5 мм в градиентном геле (7,5-15%).

Активность ШДФК-зависиыой цитохром Р-450 редуктазы определяли по скорости восстановления цитохрома с (Phyilllpeon et al, 1962).

Определение скорости свободного НАДФН окисления и исследование спектров связывания цитохрома Р-450 с ПФОС проводили по методам, предложенным Стаудтом с соавт. (Staudt et al, 1981). Скорость НДДФН-зависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ) регистрировали по образованию, мадонового даальдегида (Владимиров, Ар-чаков, 1972).

Скорость реакции гидроксилирования бенз(а)пирена (Б(а)П) регистрировали по 3-ОН Б(а)П, определяемому флуориматрически (Цырлов, Ляяович, 1979). N-дбштилирование бензфетамина (БФ) определяли по скорости образования формальдегида, используя реактив Nash (Nash, 1964).

Скорость эпоксидирования алдрина определяли па методу Вольфа (Wolí, 1980). Количество ди&лдрина, образующегося в течении pea-

кцни, измеряли на ГЖХ с детектором электронного захвата. Метаболизм 7-этоксирезору{яша (7-ЭР) и пенгоксирезоруфина (ПР) определяли прямым флуориметрическим методом по образованию резоруфина (Prough et al, 1978).

Белок определяли по методу Лоури и др.(Ьо«гу et al, 1951).

Реакцию двойной иммунодаффузии по Оухтерлони проводили как рекомендовано Томасом с соавт.(Thomas et al, 1981).

Содержание индивидуальных форм цитохрома Р-450 в препаратах микросом определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза (Pickett et al, 1981).

Ингибированиэ монооксигеназных реакций осуществляли при инкубации микросом печени с антителами против изоформ цитохрома Р-450 крыс (Thomas, 1977). Все исследования по определению изоформ цитохрома Р-450 проводили совместно и на базе ИКЭМ СО АМН СССР, в лаборатории профессора В.В. Ляховича.

Двтоксицирующую функцию печени оценивали по продолжительности . наркотического сна крыс после внутрибршшнного введения гексэнала (Седова, 1980).

1.Особенности функционирования монооксигеназной системы печени крыс пасла введения эмульсий ПЗОС.

Внутривенное введение крысам эмульсии, содержащей перфтордеде-калин (ПФД), привадило к изменениям в составе и активности ферментов монооксигеназной системы печени. На третьи сутки после введения эмульсии содержание микросомальных цитохромов Р-450 и Ь^ увеличивалось относительно контроля в 2,8 и 1,9 раза соответственно (рис Л).

Спектральные характеристики индуцированных форм цитохромов нэ . отличались от контрольных. На рисунка 2 представлен далипептидный профиль микросом, выделенных из печени крыо, получивших эмульсию ПФД. Белковый: состав микросом контрольных и экспериментальных животных идентичен, за исключением шшпгептвдных зон в диапазоне 16 и 50 кДа, приписанных цитохромам Ъ^ и Р-450 соответственно (Уатапо, 1982). Увеличение содержания микросомального цитохрома Р-450 сопровождалось увеличением скорости окисления свободного НАДФН микросомами, выделенными из печени животных, получивших

- в -

эмульсии, ПФОС. Максимальная скорости окисления НАДФК отмечена на вторые сутки после инъекции и составляла 225% по отношению к контролю (рис.3). Поскольку окисление НАДФН в мембранах микросом в присутствии ионов железа, как правило, сопровождаются процесса-

Рис.Г 2 4 . б 8 Ю Г2 дни Рис.2

Рис.1 Динамика содержания цитохромов Р-450 и Ь^ после введения эмульсии перфтордекаяин/перфтортрибугиламин. Указано среднеквадратичное отклонение. Количество зкйвотшйс (п) в каждой экспериментальной точке-15. Данные -пяти независимых инъекций. Рис.2.Полипэптидный профиль фракций микросом, выделенных из печени животных, получивших эмульсию, содержащую ПОД в дозе 10 мг/мл. ПААГ-7-15% в присутствии 0,1% ДЦС-Ма- А-эмудьсия ПФД, Б-контроль.

ми ПОЛ (Арчаков, 1983), представляло интерес проследить влияние на процессы НАДФН-зависимого ПОЛ в мембранах микросом эмульсии ПФОС. Иньекция животным эмульсии ПФОС резко снижает уровень НАДФН-зависимого ПОЛ. На вторые сутки после введения эмульсии интенсивность процессов НАДФН-зависимого ПОЛ уменьшается более, чем в 10 раз, а на 10-е сутки не отличается от контрольного значения (рис.4). По-видимому, это связано с тем, что моноокеигеназная система ми-.кросом и система ПОЛ взаимосвязаны, причем в момент максимальной индукции цитохрома Р-450 в микросомах крыс также наблвдалось ингибированиэ ГОЛ <Каган, 1974'). Не исключено, что в момент максимальной индукции цитохрома Р-450 наблюдается и перераспределение продуктов оксидазных реакций, катализируемых цитохромом Р-450 в системе, разобщенной перфторуглеродами (Жуков, Арчаков, 1986).

Увеличение общего содержания микросомальных цитохромов сопро-

вокдалось-повышением активности НДЦФК-зависимой цитохром-Р-450

Рис.3' 2 ^ б ■ 8 10 Дни Рис2^63 Ю-дш< Рис.3,4. Изменение, скорости окисления НАДФН микросомами, выделенными из печени животных, получивших эмульсию ПФОС (рис.3) Изменение интенсивности НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс после введения эмульсии ПФОС (рис.4). п=6, две независимые инъекции эмульсии.

редуктазы. Посла введения эмульсии, содержащей ПФД, активность этого ферменм достигала 0,30^0,02 мкмоль цитохрома с/мин мг, что в три раза выше значения активности этого фермента в контроле.

Таким образом, экспериментальный материал однозначно показывает наличие всех признаков эффэкта индукции, причем анализ представленных в работе данных'свидетельствует, что изменение исследуемых параметров монооксигвназной системы при внутривенном введении животным эмульсий, содержащих ПФД, принципиально не отличаются от изменений, вызываемых введением животным обычных углеводородных ксенобиотиков, в частности, фенобарбитала (Дяхович, Цырлов 1981).

_2л^зшд-Х1Мчвские__£§°??ства__перфторуглерозных__индукторов

цитохрома_Р-450.'

Поскольку использованная нами эмульсия ПФОС является смесью сложного состава, возникает вопрос о природе компонентов, ответственных за наблюдаемые изменения в микросоМальных мембранах. Для ответа на этот вопрос животным вводили раздельно компоненты эмульсии: солевую композицию эмульсии, солевую композицию с проксанолом 268, кроме того вводились эмульсии различных ПФОС в дозе 10 мл/кг (2 г ПФОС на кг массы тела).

Во всех экспериментах на протяжении 10 дней после внутривенного

введения животным солевой композиции, солевой композиции с проксанолом 268 не наблюдалось достоверных изменений в 'содержании микросомальных цитохромов. Введение в организм -крыс эмульсий различных ШОС приводило 'к двоякого рода эффектам. Эмульсии одной ■ группы' перфторуглеродов вызывали индукцию цитохрома Р-450, эмульсии второй группы не оказывали индуцирующего действия (табл.2, 3). Все фторуглероды, вызывающие индукцию цитохрома Р-450, способны образовывать фермент-субстратные комплексы с цитохромом Р-450. Добавление этих ПФОС к микросомам приводило к появлению ешк'тров связывания, характерных -для образования комплекса цитохрома Р-450- с субстратами I типа с константой связывания (Ка) в диапазоне от 1,1x.1а-4 М до 7хЮ~5 М.

Таблица 2. ФТОРУГЛЕРОДЫ, ВЫБЫВАЮЩИЕ ИНДУКЦИЮ ЦИТОХРОМА Р-450.

ПФОС ¡Структура 1Индук-"!мо,п. масса ¡ция

1,1 "Ю-4 12 7,0-Ю-5 22,5 5,0-Ю"5 24 5,3 "КГ4 43

Знак "+"соотвэтствувт содержанию цитохрома Р-450 в микросомах выше контрольного уровня в 2-Зраза. ПФИ-дарфторлвргидроиндан, ПФД-дар-фтордэкалкн, ПФДГА-перфторпвргидроацвнафен, ПФТПА-перфторпропил-амин.

Согласно современным представлениям (Ляхович, Цырлов, 1981; Snyder, Remmer, 1982) необходимым этапом для развития индукции ферментов моноокскгеназной системы по фенобарбитэловому типу является продолжительное пребывание молекулы ксенобиотика в активном центре цитохрома Р-450. В соответствии с изложенными требованиями к углеводородным индукторам, мы проанализировали

рг,ш Н«|с'лш1 'мМ| V

Vе

ПФИ 412 QQ

ЩД ' 462 ОЭ

ПФДГА 524 (5^)

ПФТПА. 521 M^-CjF,

+ 24,0 52

+ 12,5 26

+ 3,8 22

+ 20,0 5,1

Таблица 3. ФТОРУГЛЕРОДЫ, НЕ ВЫЗЫВАЮЩИЕ ИНДУКЦИЮ ЦИТОХРОМА Р-450.

ПФОС¡Структура, !11ндук- ! Р7 мм ^¡С.^^.мМ! Кд, М ¡Т^ С мол.масса ¡ция " ...

ПШДП 595 СРз-ОМО /'Сь^Э

ПФГБА 671 [^СЛ пфпэ 636

ст.

ПФО 438 СЬ(СЬ)«С6

2,0 7,1 не опр. 40

1,14 1,2 не опр. 61

1,2 1,25 не опр. ео

50,5 46,0 6-Ю"5 14

Знак "-" говорит об отсутствии достоверных отличий в содержании цигохрома Р-450. ШЦП-перфтор-п-метилциклогексилпиперидин. ПФТБА-перфтортрибутиламин, ПФПЗ-перфторполиэфир, ПФО-перфтороктан.

некоторые физико-химические свойства ПФОС и пришли к заключению, что ПФОС, способные образовывать фермент-субстратные комплексы с цитохромом Р-450 и вызывать индукцию монооксигэназной системы, обладают относительно высокой растворимостью в воде и в лжшдах.

С другой стороны, увеличение растворимости и давления насыщенных паров выше некоторого критического значения, по-видимому, приводит к отсутствию индукции цитохрома Р-450, поскольку ПФОС с такими свойствами быстро выводятся из организма. Более того, ВЕедэние ПФОС с давлением насыщенных паров (Р ) более 30 мм.рт.ст., например, перфтороктан, вызывает гибель животных в результате газовой эмболии [Уокоуата е1 аХ, 1982). Взаимозависимость между растворимостью и Ру, и числом атомов углерода и фтора в молекуле ПФОС, по-видимому, ограничивает разнообразие фторуглеродных индукторов молекулами о, числом атомов в диапазоне, близком к Сд-С12 и Р^б-^щ. что соответствует молекулярной массе 400-550.

Анализ данных, представленных в таблицах 2 ,3, показывает, что присутствие в молекуле ПФОС гегороатома азота, как и детали структуры молекулы перфторуглеродов, не оказывают влияния на свойства ПФОС, как индукторов. Представляется также важным

сопоставить индуцирующую способность ПФОС со скоростью выведения их из организма. Установлено, что после внутривенного введения эмульсий 1ШС, последние выводятся из организма о выдыхаемым воздухом, причем время голувыведения ^,л,(сут.)* определяется уравнением i ^^О'051^-0'331®^-13'64 (Уатапоис111 а1, 1985). Сопоставляя значения критической температуры ТКр и Ру, легко показать, что способностью индуцировать цитохром Р-450 в микросомах печени обладают ПФОС с относительно высокими скоростями выведения из организма, с ^^ от 3 суток.

3.Исследование изоформ цитохрома Р-450, синтезированных в ответ

9э_§195§ние_эмхльсии_ПФ0С

Известно, что введение в организм определенных ксенобиотиков может приводить к увеличению содержания в печени животных различных форм цитохрома Р-450 (Мишин, Ляхович, 1935). Гак, барбитураты и, в частности, • ФЕ вызывают индукцию изоформы цитохрома Р-450, так называемого "фенобарбиталового" тша. Введение же в организм ПА.У, к которым относится МХ, приводит к появлению в микросомах печени изоформ цитохрома Р-448 - цитохромов Р- 450с и Р-450^. Изучению этих форм микросокального цитохрома уделяется ■ большое внимание, поскольку именно изоформы цитохрома Р-448, принимая участив в гидроксилировании ряда соединений, способны превращать их в продукты, обладающие мутагенными и канцерогенными свойствами

Ряд соединений, например, полихлорированные бифенилы (Арохлор 1254) индуцируют как те, так и другие изоформы цитохрома Р-450.

Качественная оценка изоформ цитохрома Р-450, синтезированных в печени животных в.ответ на введение эмульсии ПФОС, была получена в реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони с помощью антител против форм цитохрома Р-450ь и Р-450с изолированных из печени животных, получивших соответственно ФБ и МХ. Для сравнения изоформ использовали индукторы цитохрома Р-450 - ФБ, МХ, Арохлор 1254 (АР) Микросомы, выделенные из печени крыс, получивших эмульсию, содержащую ПФД, образовывали линию преципитации с антителами к цитохрому Р-450^, как и микросомы, выделенные из печени животных, получивших ФБ и Арохлор1254 (рис,5а) и не взаимодействуют с антителами к цитохрому ?-450с (Р-448), с которыми прешшитируют микросомы, выделенные из печени животных, получивших МХ и АР

(рис.56). Эти даикыо свидетельствуют о наличии б микросомах печени крыс, которым вводилась эмульсия ПФОС, изоформы цитохрома Р-4С0, иммунологически идентичной изофсрме цитохрома Р-450^ и об отсутствии изоформы, идентичной цитохрому Р-448.

Так™ образом, внутривенное введение животным эмульсии ПФОС не вызывает появления в печени цитохрома Р-448, что соответствует представлениям об отсутствии у ПФОС канцерогенной активности.

Содержание изоформы цитохрома Р-4Б0, иммунологически идентичной ФБ-индуцируемсй форме Р-450^, определяли методом ракетного иммуно-электрофсреза с использованием антител к цитохрому Р-450^ (рис.6). Следует заметить, что ферма Р-450^ иммунологически идентична форма Р-450е, которая также индуцируется Ф5-индукторами (У1ав1к ог а1, 1982). Цитохромн Р-450е и Р-ДбО^ имеют высокую степень гомологии в первичной структуре - Э7,4 % (Ри311-Каг1уаиа е1; а1, 1982).

Рис.5 (а, б).Тест двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. АТ-Р-450ь~антитела к цитохрому Р-450^ (рис.а) и АТ-Р-450с-антитела . к цитохрому Р-450с (рис.(5). МХ, АР, ФБ, ПФД-мякросомы, выделенные из ггечени животных после введения крысам соответственно МХ, ФБ, АР и эмульсии, содержащей ПФД. Р-460^ и Р-450с-очищбнные изоформы "Ь" и "с" цитохрома Р-450. К-микросомы, выделенные из печени контрольных животных. Концентрации белка: АТ (центральные лунки)-20 мг/мл} ПФД, ФБ, МХ, АР-1 мг/мл; Р-4Б0Ь и Р-450с-0,1 мг/мл. Объем лунки-Ю дал.

Поэтому, иммунохимическое определение содержания формы

цитохрома Р-450 с помощью антител к цитохрому Р-450ь соответствует суммарному содержанью цитохромов Р-450ь и Р-45О0 . Процентное содержание цитохрома Р-450^н_е относительно общего уровня цитохрома Р-450, определяемого спектрометрическим методом, при индукции ПФД составило 72,2±5,4 %, при индукции ФБ - 40,2^0,2 %. Мы

Рио.6. Ракетный иммуноэлект-рофзрез. Агарозшй гель содержит антитела к цитохрому Р-450^ в концентрации 20 мг/мл. Первые три "ракеты" отражают содержание цитохрома Р-450^ в концентрациях: 0,1! 0,2; 0,3 мг/мл соответственно} в лунках 4,5,6-микросомы, выделенные из печени животных, получивших ПФД, АР, ФБ соответственно. Концентрация белка I мг/мл. Обьем лунки-Ю мкл. полагаем, что ФБ и ПФД в различной степени индуцируют синтез имму-нологически идентичных форм Р-450ь и Р-450е. ПФД, по-видимому, в большей степени способствует увеличению содержания цитохрома Р-450в .

Функциональная активность цитохрш Р-450-зависимсй системы метаболизма ксенобиотиков оценивалась по . пяти специфическим субстратам: БФ, ПР, Б(а)П, 7-ЭР, адцрину. Как видно из таблицы 4, активность бензпиренгкдроксилазы существенно увеличивается при индукции МХ и в сравнении с этим незначительно увеличивается при индукции ФБ и ПФД. Скорость И-деметилирования БФ и эпоксидарования алдрина увеличивается при индукции ФБ и ПФД, в то время, как скорость О-деалкилирования ПР значительно выше лишь при индукции ФБ. Надо заметить, что метаболизм алдрина и ПР осуществляет лишь цитохром Р-450ь (Сиепйег1оЬ е* а1, 1982), а метаболизм 7-ЭР и Б(а)П- цитохром Р-4Б0С. Полученные результаты еще раз подтверждают, что ПФД является индуктором ФБ-тила.

Данные о ФБ-тиде индукции были получены и при применении метода ингибировакия метаболизма специфичных субстратов антителами против

индивидуальных форм цитохрома Р-450. Метаболизм БФ и алдрина в значительной степени ингибируется антителами к цитохрому Р-450^ как при индукции ФБ, так и при индукции ПФД, что свидетельствует об участии в процессах метаболизма этих субстратов цитохрома Р-450.

Таблица 4.

МОНООКСЙГЕНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ КРЫС ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ЭМУЛЬСИИ ПФД, ФБ, МХ.

Индуктор! Активность к субстратам, нмоль/мг мин

! Б(а)П ! Г- ЭР ! БФ ¡Алдрин 1 ПР

Контроль 0,5±0,И 0,1Г±0,01 5,0±0,5 2,3-0,3 0,05-0,003

ПФД 0,9±0,22 0,08±0,01 Г5,9±0,8 7,9-0,1 0,06^0,004

ФБ 0,7±0,2 0,10±0,01 Х?,0±0,4 9,0^0,5 0,95-0,05

МХ 4,5-0,3 V,0-0,5 4,5-0,5 1,5±0,2 0,00

Степень ингибирования метаболизма БФ антителами к цитохрому Р-450^ в микросомах, выделенных из печени животных, получивших эмульсию ПФД составил 55 Ж, ФБ - 50 й. Процент ингибирования метаболизма алдрина при введении ПФД составил 45 %, при введении ФБ - 55%. Метаболизм Б(а)П в микросомах, выделенных из печени животных, получивших эмульсию, содержащую ПФД, практически полностью ингиби-ровался антителами к цитохрому Р-450с. Степень ингибирования метаболизма Е(а)П микросомами, выделенными из печени крыс, получивших МХ составила 90 %, эмульсию ПФД - 20 %.

Таким образом, представленные результаты показывают, что ПФД -индуктор ФБ-типа,. а его введение в организм в составе эмульсии не вызывает появления цитохрома Р-448.

Синтез изоформы цитохрома Р-450^ в ответ на введение ПФД еще раз доказывает то, что индукция этой изоформы может быть вызвана целым рядом химически неродственных соединений (Гуткина и др., 1986), в данном случае таких как ПФД, ФБ, гексахлорбензол, гексахлор-циклогексзн, полихлорированнне бифеншш). Следует отметить, что такие свойства фторуглеродных индукторов, как неизменность их молекул при взаимодействии с ферментами монооксигеназной системы,

способность вызывать индукцию ФБ-тша служат доказательством того, что ФБ и другие индукторы этого типа индуцируют цитохром Р-450 исходной молекулой, а не ее гидроксилированными продуктами.

С проявлением функциольной активности цитохром P-450-зависимой монооксигеназной системы печени In vivo связана так называемая детоксицирущая функция печени, определяющая концентрацию и спектр продуктов ряда экзогенных и эндогенных метаболитов в циркулирующей крови. Наблидаекыэ изменения активности ферментов цитохром P-450-зависимой монооксигеназной системы в микросомах, выделенных из печени животных после введения фторуглэродов, ставят вопрос о возможных изменениях и в детокскциругадей функции печени in vivo.

Для исследования этой функции, измеряли продолжительность наркотического сна крыс после введения животным гексенала, на фоне предварительно введенной эмульсии ПФОС (рис.7). На третьи сутки после введения эмульсии, содержащей 1ВД, длительность гексеналово-го сна сокращается до 3 минут, относительно 18-19 минут у контрольных групп животных. По-видимому, ПФД, индуцируя в печени животных фенобарбиталовую форму цитохрома Р-450, увеличивает активность монооксигеназной система в огно ш ении соединений ряда барбитуратов, в том числе и гексенала. Ускоренный метаболизм гексенала способствует его быстрому выведению из кровотока и снижению его физиологического действия. Как видно из рис.7, в первые. 12 - 24 часа посла введения эмульсии, детоксицирущая функция печени была угнетена, что сопровождалось удлинением наркотического "сна крыс.

Рис.7. Продолжительность сна крыс после введения эмульсии, содержащей ПФД. Доза введенного гексенала - 60 мг/кг. п=6.

6 8 10 Дни

5. 3§вис™ость_5^щя_ю|д^ции_дитдх2ома__Р-450__от__дозы__вводимой

эм2льсии^_спдсобдв_еа_ввэзения Применение эмульсий терфторуглеродов в качестве компонентов

инфузионшх сред ставило перед наш серию практических задач, связанных с определением зависимости уровня индукции цитохрома Р-450 от дозы вводимой эмульсии, способов ее Еведения.

Так при дозе эмульсии 3,3 г ПФД/кг повышенный уровень цитохрома Р-450 наблюдается со вторых по шестнадцатые сутки с момента введения эмульсии. При дозе 0,3 г ПФД/кг - уровень цитохрома Р-450 уяо на шестые сутки приближается к контрольным значениям. ПФОС являются эффективными индукторами при любом способе введения: внутривенное и внутрибрнымнное введение эмульсий ПФОС, внутрибрюшшшое введение неэмульгированной фторуглеродной жидкости. При первых двух способах введения эмульсии эффект индукции наступает практически одновременно, обеспечивая уже на третьи сутки наиболее высокий уровень индукции цитохрома Р-450. При введении фторуглеродной жидкости процесс индукции развивается значительно медленнее, достигая повышенного стационарного уровня лишь ко второй - четвертой неделе с момента введения эмульсии- Но при гаком способе введения фторуглеродной жидкости повышенный уровень цитохрома Р-450 сохраняется до двух:-трвх месяцев. Из дозовой зависимости индукции, представленной на рисунке 8, следует что эффективность ПФД, как индуктора цитохрома' Р-450-зависимой монооксигеназной системы сравнима с эффективностью ФБ: внутривенное введение эмульии, содержащей 100-300 мг ПФД/кг вызывает достоверное увеличение содержания цитохрома Р-450.

§ I

Я юо и о ы

Рис.8. Содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс в зависимости от дозы ПФД. Уровень цитохрома Р-450 определяли на третьи ЧТ—¡.М им Ш сумей. 11=6.

ПЕРФ'ГОРЛЕШРН , иг/кг иасси 7вла

С другой стороны, увеличение дозы вводимого внутривенно ПФД более, чем 1-2 г/кг не приводит к дальнейшему росту содержания цитохромв Р-450 в микросомах, а лишь поддерживает повышенный уровень фермента более длительное время.

Различие в картине индукции при введении эмульсии и чистой фторуглеродной жидкости, по-видимому, связано с тем что при введении жидких ПФОС скорость их выведения приблизительно на порядок

ниже, чем при введении соответствующей дозы эмульсии (Moore, 1981).

Обнаруженные изменения в микросомах печени после введения эмульсий ПФОС заставляют пересмотреть точку зрения на фторуглероды, как на биологически инертные соединения.

Данные, полученные в работе позволяют сделать следующие выводы.

1.Химически инертные полностью фторированные органические соединения являются индукторами цитохром P-450-зависимой монооксигеназной системы печени крас, что сопровождается увеличением содержания микросомального цитохрома Р-450, увеличением скорости свободного НАДФН-окисления, уменьшением скорости НАДФН-зави-симого ПОЛ.

2.Индукцию ферментов монооксигеназной системы печени вызывают ПФОС, имеющие сравнительно высокую растворимость' в липкдах, способные образовывать фермент-субстратные комплексы с цитохромом Р-450, с молекулярными массами близкими к 400 - 550, что соответствует числу атомов С9~С12' и F1&_F21' с пеР1ЮДом по~ лувыведэния из организма от 3 до 65 суток.

3.Методами иммунохимического анализа, путем исследований метаболизма специфичных субстратов установлено, что введение ПФОС не приводит к появлению цитохрома Р-448, а вызывает синтез изофорш P-450i}+e, иммунологически идентичной изоформе P-45Qb, появляющейся в организме в ответ на введение ФБ.

4.Введение эмульсии ПФОС усиливает детоксицирующую функцию печени животных, сопровождающуюся уменьшением продолжительности наркотического сна крыс, вызванного введением гексенала.

5.Эффективность ПФД как индуктора близка к эффективности ФБ. Продолжительность индукции определяется дозой введенной эмульсии. Эффект наблюдается при внутривенном и внутрибрюшинном способах' введения эмульсии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I.Образцов В.В.,Шэхтман Д.Г.,Сологуб Г.Р..Белоярцев Ф.Ф. Индукция микросомальных цигохромов в печени крыс после внутривенного введения животным эмульсии перфторорганических соединений. "Биохимия",X985,т.50,вып.7,сЛ220-1224.

2.Шехтман Д.F..Образцов В.В.,Шибаев К.В.,Сологуб Г.Р..Белоярцев Ф.Ф. Индукция микросомальных цитохромов и изменение дето-ксикационной функции печени после введения эмульсии перфторорганических соединений животным и человеку.

Тез.Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среда человека",Москва,1985,с.137.

3.Белоярцев Ф.Ф..Иваницкий Г.Р..Маевский Е.И..Образцов В.В., Шехтман Д.Г. Химически инертные фторуглероды - индукторы ферментов монооксигеназной системы микросом печени.

"Доклады АН СССР",1986,T.286.N3,с.729-732.

4.ГришановаА.Ю.,Образцов В.В./Шехтман Д.Г..Ляхович В.В. Фено-барбиталовый тип индукции цитохрома Р-450 микросом печени перфтордекалином.

"Биохимия",I987,т.52,вып.7,сЛ138-I143.

б.Кошечкина Е.В., Шехтман Д.Г..Образцов В.В. Прединдукционное состояние монооксигеназной системы печени при введении фторуглеродной эмульсии"

Тез.Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды".Новосибирск,1Э87,с Л04.

6.Образцов В.В..Шехтман Д.Г. Полностью фторированные органические соединения (ПФОС)- индукторы ферментов цитохром P-450-зависимой монооксигеназной системы печени.

Тез. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды", Новосибирск,1987,сЛ07.

7.Образцов В.В.,Шехтман Д.Г..Склифас А.Н., Макаров К.Н. Анализ физико-химических свойств фторуглеродных индукторов цитохрома Р-450 в мембранах эндоплазматяческого ретикулума печени. "Биохимия",1988,т.53,выл.4,о.613-619.

8.Образцов В.В..Шехтман Д.Г., Гришанова А.Ю..Мишин В.М. Перфторорганические соединения не индуцируют образования цитохрома Р-448 в печени крыс.

"Биофизика",1989,т.XXXIV, вып. I,'c.I46-I47.

9.V.Hiehln, V.Obraztsov, A.Grlehanova, N.Gutkina, D.Shekhtiran, O.Khateenko, V.Lyakhovich. The phenobarbital-type Induction ol rat liver microsomal monooxygenasee by perlluorodecalin. "Chem.-Biol. Interactions", 1989, V. 72, p.143-155.

Ю.Образцов В.В., Гудкова О.В., Склифас А.Н..Мехтман Д.Г. Поиск рецептора для индукции ферментов цитохром P-450h+p- зависимой монооксигеназной системы печени.

Тез. Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта,1989,с.355-356.

II. Гудкова 0.В.,Склифас А.Н., Шехтман Д.Г., Образцов В.В., Кукуйкин Н.И. Механизм ингибирования цитохром P-450-зависимой монооксигеназной система печени фторуглеродами. Тез.Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта,1989,с.295-296.

12.Образцов В.В., Гудкова О.В., Склифас А.Н., Шехтман Д.Г. Влияние фторуглеродных эмульсий на детоксширующую функцию печени. Сборник ^Применение перфторорганических соединений в медицине", Новосибирск,1990,с.150-151.