Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные и структурные изменения монооксигеназной системы под влиянием простагландинов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональные и структурные изменения монооксигеназной системы под влиянием простагландинов"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

УДК 577.152.1 : 577.175.859

САДОВНИЧИЙ ВИТАЛИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРОСТАГЛАНДИНОВ.

03.00.04 - Биохимия

Автореферат . диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Гродно - 1995

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной гепато-гогии Института биохимии АН Беларуси

Научные руководители:

доктор биологических наук В. У. Буко, кандидат биологических наук А.Н. Арцукевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Лелевич В. В. доктор биологических наук Милютин А. А.

Оппонирующая организация:

Институт питания АМН Российской Федерации

Защита состоится 1995 г. в "в." час.

на заседании совета по защйте диссертаций Д 03.30.01 на соискание ученой степени кандидата медицинских наук в Институте биохимии АНБ по специальности биологическая химия (Беларусь, 230017, Гродно, БЛК, 50).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Беларуси.

Автореферат разослан "¡2 У" 1995 г.

Ученый секретарь совета, кандидат биологических наук

В.А. Аверин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема биотрансформации . чужеродных веществ в живом организме занимает важное место в биологии и медицине. Система цитохрома Р-450 эндоплазматического ретикулума печени участвует в метаболизме как многих эндогенных субстратов, так и большого многообразия лекарств, канцерогенов и различных экзогенных веществ. Превращая гидрофобные соединения в более полярные продукты, и таким образом, способствуя удалению их из организма, эта ферментная система выполняет функцию защиты внутренней среды организма от повреждающего действия ксенобиотиков.

В настоящее время общепринятым в биохимической токсикологии является феномен метаболической активации чужеродных веществ, когда токсичность большинства инертных липофильных чужеродных соединений обусловлена превращением их в реакционно способные метаболиты, вступающие в реакции с макромолекулами и запускающие цепь вторичных патобиохимических процессов. Как свидетельствуют многочисленные исследования, система цитохрома Р-450 вовлечена в наработку кислородных радикалов в микросомах печени. Индукция этой системы приводит к усилению каскада свободнорадикальных процессов, вызывающих гепатотоксический эффект и ведущих к окислительному повревдению печени.

Создание препаратов, способных управлять активностью моноокси-геназных реакций и защищающих мембрану клетки от повреждения, открывает широкие перспективы в области предупреждения и лечения "химической патологии". В процессе проводимого поиска гепатопротекго-ров среди естественных метаболитов были обнаружены защитные свойства "внутриклеточных гормонов" - простагландинов (ПГ*) серии Е. Поэтому представляется интересным изучить механизмы защитного эффекта ПГ в отношении 1-ой фазы детоксикации и генерации свободных радикалов с последующим инициированием перекисного окисления липидов.

Совокупность приведенных положений послужило основанием для данной работы, выполненной в соответствии с планом научно-

* Принятые сокращения в тексте автореферата: БКОД-бензилоксикумарин О-деэтилирование, ДСК-доксилстеариновая кислота, МЭОС- микросомаль-ная этанол-окисляющая система, ОБА-оксилтетраметилпиперидинбромаце-тамид, ПГ-простагландины, ПОЛ-перекисное окисление липидов, ПРОД-пентоксирезоруфин О-деэтилирование, ПХМБ-оксилтетраметилпипередин-парахлормеркурийбензоат, СОД- супероксиддасмутаза, ТЦК-оксилтетра-метилпиперидинциклогексилкарбодиимид, ЭКОД-этоксикумарин О-деэтили-рование, ЭМДЕ-этилморфин И-деметилирование, ЭРОД- этоксирезоруфин О-деэтилирование.

ü 2

исследовательской работы Института биохимии AHB по темам "Исследование молекулярных механизмов гепатотоксичности и защиты печени при алкогольном и токсическом поражении" (номер Гос. регистрации 0I9I00536II, постановление Президиума АН БССР. N115 от 5.12.90.), "Механизмы поражения печени альдегидами метаболического происхождения" (номер Гос. регистрации I994I729, постановление Президиума АН Беларуси N1 от 28.01.94.).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование влияния простагландинов на функциональные и структурные изменения монооксигеназной системы микросом печени крыс в условиях ее индуцирования или ингибирования.

Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить влияние IITEj и Г2а на биохимические функциональные параметры монооксигеназной системы микросом печени крыс в условиях индуцирования системы цитохрома Р-450 фенобарбиталом, хронической алкогольной интоксикацией и ацетоном в сочетанием с голоданием.

2. Охарактеризовать воздействие ÏÏTEj и ПГР2а на свободноради-кальные и антиоксидантные процессы в микросомах печени крыс, индуцированных фенобарбиталом, хронической алкогольной интоксикацией и ацетоном.

3. Провести сравнительное изучение функциональных и структурных особенностей микросомальной системы под. влиянием üTEj- при острой и хронической алкогольной интоксикации.

4. Изучить механизмы взаимодействия ÏÏTEj, ПГЕ2 и F2a с микро-сомальными мембранами печени интактных крыс.

Научная новизна. Установлено, что nrEj снижает активность монооксигеназной и антиоксидантной системы, ингибирует свободнора-дикальные процессы и ПОЛ при микросомальной индукции. В условиях ингибирования üTEj оказывает нормализующее действие на цитохром P-450-зависимую систему и обладает антирадикальной активностью. Действие ПГ обусловлено особенностями их взаимодействия с различными изоформами цитохрома Р-450. ПГ уменьшают микровязкость гидрофобной области белковой компоненты микросомальной мембраны. nTEj и ПГЕ2 изменяют информационное состояние белков поверхностного слоя микросомальной мембраны, а ПГТ^ проникает в липидный бислой и вызывает разжижение полярного его участка и ослабление белок-липидных гидрофобных связей. nrEj стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, уменьшая микровязкость гидрофобной области липидного бислоя и эффект "флюи-

дизации" гидрофобных областей белковых структур.

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о рож ПГ как гепатопротектора и антиоксиданта, регулирующего монооксигеназную и антирадикальную системы. ПГЕ1 проявляет антиоксидантное действие в условиях индукции и ингибировании монооксигеназной системы. Кроме того, он является ингибитором мик-росомальных монооксигеназ на фоне индукции микросомальной системы и оказывает нормализующее действие на монооксигеназную систему при ее ингибировании. Впервые установлено, что ПГЕ ингибируют образование свободных радикалов и перекисей липидов при токсическом поражении печени, вероятно являясь ловушками для свободных радикалов. Сделана попытка выявить механизм взаимодействия ПГ с микросомальными мембранами "в норме и в условиях поражения печени. ПГЕ проникают в приповерхностный слой микросомальной мембраны, а ПГГ2а - в более глубинный липидный бислой, вызывая его разжижение. В условиях хронической алкогольной интоксикации ПГЕ! эффективно стабилизирует микро-сомальную мембрану. Данное соединение может применяться для предупреждения образования свободных радикалов микросомами печени, а также при поражении печени гепатотоксинами, поражающее действие которых связано с активацией свободнорадикальных процессов.

Основные положения, выносимые на защиту. •

1. ПГ являются антиоксидантами, снижающими образование свободных радикалов и гидроперекисей липидов при индукции и ингибировании микросомальной системы.

2. Антирадикальное действие ПГ серии Е и Р связано с особенностями их взаимодействия с различными изоформами цитохрома Р-450: ПГЕ оказывает антиоксидантное действие, ПГР2а может действовать как в роли антиоксиданта, так и в качестве прооксиданта.

3. ПГЕ-]- стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной, интоксикации, уменьшая микровязкость гидрофобной области липиднсао бислоя и фтоидизацию гидрофобных областей белковых структур. ''

Личный вклад соискателя. Работа выполнялась лично автором с 1990 по 1994 г.г. на базе лаборатории экспериментальной гепатологии Института биохимии АНБ. Автору принадлежит организация и проведение экспериментальной работы, обработка и обсуждение результатоа с последующими выводами. При моделировании опытов и трактовке полученных результатов автор пользовался консультативной помощью научных руководителей.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на

11-ом Гепатологическом симпозиуме (Белосток, Польша, 1992), 6-ом симпозиуме по свободным радикалам (Турин, Италия, 1992), 27-ом конгрессе Европейской ассоциации по изучению печени (Вена, Австрия, 1992), 9-ом конгрессе по изучению болезней печени (Базель, Швейцария, 1992), международной научной конференции (Гродно, 1993), 14-ом Европейском симпозиуме по метаболизму лекарств (Париж, Франция, 1994), международном конгрессе по изучению алкоголизма (Сидней, Австралия, 1994), 6-ом симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), 1-ом белоруской симпозиуме гепатологов (Гродно, 1994), 1-ом белоруском съезде фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994), а также на научных семинарах" Института биохимии АН Беларуси (1993, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 16 рисунков. Список литературы включает 39 отечественных и 164 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследования проведены на 198 половозрелых нелинейных крысах-самцах. Острую алкогольную интоксикацию вызывали однократным введением 25% раствора этанола в дозе 4 г/кг. ПГ Ej вводили внутрибрю-шинно в дозе 20 мг/кг одновременно с введением этанола. Хроническая алкогольная интоксикация вызывалась внутрижелудочным введением 40% раствора этанола в дозе 5 г/кг массы тела в течении 30 дней. üTEj и F2q вводили внутрибрюшинно в течении последних 10 дней в дозе 4 мг/кг. Интоксикация ацетоном вызывалась внутрижелудочным введением 33% раствора ацетона в течении 2 дней в дозе 5 мл/кг веса тела. ПГЕ| и Т^ вводили интраперитонеьЛьно в течении 3 дней в дозе 10 мг/кг. Фенобарбитал вводили внутрибрюшинно в дозе 80 мг/кг на протяжении 2 дней. ПГЕ| вводили интраперитонеально одновременно с фенобарбиталом в дозе 4 мг/кг. Контрольным животным внутрибрюшинно и внутрижелудочно вводился изотонический раствор хлорида натрия. Микросомальная фракция выделялась согласно Карузиной и Арчакову (1977).

Функцию монооксигеназной системы печени оценивали по содержанию цитохромов Р-450 и bg (Omura, Sato, 1964), электронтранспортной активности НАДФН- и НАДН-зависимых флавопротеидов (Dallner, 1963),

скорости окисления НАДФН и НАДН (Gillette, 1957), гидроксилирования субстратов: 7-этоксикумарина и бензилоксикумарина (Altlo, 1976), 7-этилрезоруфина и пентилрезоруфина (Burke, 1978), а также зтилморфи-на (Klinger, Muller, 1976). Функцию антиоксидантной системы оценивали по активности СОД (Nishlkiml, 1976) и наработке перекиси водорода (Hllderbrandt, 1978). Генерация свободных радикалов определялась хемилюминесцентным методом (Muller-Peddlnghaus,1977), содержание перекисей липидов и стимулируемое перекисное окисление липидов - тиобарбитуровым методом (Buege, Aust, 1978). Жирнокислотный и фосфолипидный состав мембран определялся методом газовой и тонкослойной хроматографии. Взаимодействие ПГ с микросомальной мембраной изучалось методом ЭПР, используя спиновые зонды: ГСШВ, ТЦК, ОБА, 5-и 16-ДСК.

Результаты исследований проанализированы методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента и методом достоверности разности сравниваемых величин.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ.

Влияние ПГ на активность компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем в условиях индукции и ингибирования микросоыальных систем окисления.

Длительный прием этанола приводил к увеличению содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени (в 1.4 раза), тогда как НАДФН-цитохром Р-450 редуктазная активность оставалась неизменной (табл.1). Приём алкоголя достоверно активировал микросомальное окисление НАДФН и этанола, в то время как параметры, относящиеся к цитохрому bg, оставались практически неизменными. Активность СОД .была увеличена в 1.3 раза. Длительный прием этанола приводил к достоверному увеличению образования перекисей липидов и НАДФН-зависимой хемилюминесценции, стимулируемой люминолом и люцигенином (Рис.2,3). Уровень восстановленного глутатиона в печени после приема алкоголя был снижен в 2 раза, тогда как содержание окисленного глутатиона оставалось неизменным (Рис.1). Интоксикация этанолом приводила к достоверному увеличению активности ЭКОД (примерно в 1.5 раза) и несущественному повышению активности БКОД и ЭРОД, тогда как активность ПРОД оставалась неизменной и более того, активность ЭМДЕ была несколько снижена.

Обработка крыс с хронической ажогольной интоксикацией üTEj снижала уровень цитохрома Р-450 и активность МЭОС ниже контрольного

Таблица 1

Влияние ПГЕ1 на содержание и активность' компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем печени крыс после хронической алкогольной интоксикации.

Показатели Контроль Этанол Этанол + ПГЕ1

Цитохром Ь5 & 0.49+0.03 0.47+0.02 0.37+0.03*»

Цитохром Р-450 & 0.62+0.05 0.83+0.03* 0.42+0.05*»

НАДН-цитохром Ь5 5715.4+390.96 4952.2+409.8 4711.9+306.95

редуктаза @

НАДФН-цитохром 234.0+39.3 234.7+34.8 204.0+19.8

Р-450 редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 2.24+0.24 2.86+0.2 3.38+0.2*

НАДФН-оксидаза @ 1.37+0.06 1.91+0.19* 1.57+0.14

МЭОС @ 238.4+12.7 286.5+14.6* 134.5+7.9*»

Продукция перекиси 0.45+0.02 0.48+0.036 0.46+0.02

водорода @

Супероксиддисмутаза, 32.8+0.49 40.2+1.25* 35.7+1.65»

% блокирования

НАДФН-зависимая 619+80 ' 1526+178* 521+52»

хемилюминесценция,

с.р.т./с на мг.белка

Таблица 2

Влияние ПГЕ1 на содержание и активность компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем печени крыс в условиях интоксикации ацетоном совместно с голоданием.

Показатели Контроль Ацетон Ацетон + ПГЕ1

Цитохром Ь5 & 0.46+0.03 0.46+0.04 0.39+0.03

Цитохром Р-450 & 0.63+0.04 0.91+0.15* 0.74+0.11

НАДН-цитохром Ь5 6020.9+662.45 3941.5+432.05* 2623.9+202.45*»

редуктаза @

НАДФН-цитохром Р-450 205.2+11.9 278.9+33.07* 197.2+22.48

редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 1.91+0.27 2.59+0.28 2.49+0.48

НАДФН-оксидаза @ 2.16+0.18 4.98+0.41* 2.94+0.43»

МЭОС @ 299.4+17.2 343.3+24.89 294.4+46.13

Образование перекиси 0.92+0.029 1.36+0.077* '1.16+0.053*»

водорода @

Супероксиддисмутаза, 21.5+1.87 33.5+1.72* 26.8+1.70»

% блокирования

НАДФН-зависимая 111+8 154+28* 106+7»

хемилюминесценция,

с.р.ш./с на мг.белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое + Б.Е.М для 8 животных.

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к этанолу или ацетону.

600 500 400 300 200 100 0

А

Г-1-1 Т

+

+ А *

1 * т

э э+пг а а+пг

160 140 120 100 80 60 40 20 0

+

*

«

В

к э э+пг а а+пг

А - р < 0,05 по отношению к контролю, + - р < 0,05 по отношению к этанолу или ацетону. К - контроль, Э - этанол, А - ацетон, ПГ - простатландины.

Рис. 1. Содержание восстановленного (А) и окисленного (В) глутагиона в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и в комбинации с просгагландинами.

35 30 25 20 15 10 5 0

103 срд} /МТ- белка

к

А

+

э+пг а а+пг

25 20 15 -10 -5

107 ерш /мг. белка в мин.

*

*

*

ш

в

+

э э+пг а а+пг

* - р < 0,05 по отношению к контролю, + - р < 0,05 по отношению к этанолу или ацетону. К - контроль, Э - этанол, А - ацетон, ПГ - простат ландины.

Рис. 2. НАДФН-зависимая хемилюминесценция, усиленная люминолом (А) и люцигенином (В) в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и в комбинации с просгагландинами.

уровня (табл.1). ПГЕ| нормализовал НАДФН-зависимую хемилюминесцен-цию микросом и активность СОД. ПГЕ1 повышал также НДДФН-оксидазную активность, тогда как уровень цитохрома Ь5 был снижен.

Обработка крыс, получавших этанол, ПГТ^ приводила к более выраженному прооксидантному эффекту, чем действие самого алкоголя на печень: наработка ^О^, образование перекисей липидов и НАДФН-зависимая хемилюминесценция, стимулируемая люминолом и люцигенином, были достоверно увеличены в 1.2; 1.3; 2 и 2.3 раза, соответственно, в то время как НАДФН-стимулируемое ПОЛ увеличивалось несущественно (Рис.2,3). Концентрации окисленного и восстановленного глутатиона снижались в 3.1 и 1.8 раза, соответственно (Рис.1). Этанол вместе с ГЕГ приводил к недостоверному увеличению активностей ЭРОД, ЭКОД и БКОД, тогда как активности ПРОД и ЭМДЕ снижались достоверно в 1.8 и 1.5 раза, соответственно.

Комбинация введения ацетона с голоданием активизировали окисление НАДФН и активность НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы (табл.2). Уровень цитохрома Р-450 в микросомах печени был достоверно увеличен в 1.8 раза. Наблюдалось достоверное увеличение активности СОД. НАДН-цитохром Ь5 редуктазная активность снижалась, тогда как окисление НАДН и содержание цитохрома Ь5 оставались неизменными в груп-

з

2.5 2 1.5 1

0.5 О

нмоль TBARS /мг. белка в мин.

* А

* Hh

..... Й! -Ь —-

..... ЧТ{"'! ....

к э э+пг а а+пг

0.4 0.3 0.2 0.1 О

нмоль TBARS /мг. белка

...... .........*.. * * Г—I—i в

Шв9т.

Щ

э э+пг а а+пг

3 2.5 2 1.5 1

0.5 О

гоГ'яь Н2О2 /мг. белка в мин.

ачгиеЗш

- »'№¡,4

iffiS liissa

+ С

4

э э+пг а а+пг

* - р < 0,05 по отношению к контролю, + - р < 0,05 по отношению к этанолу или ацетону.

К - контроль, Э - этанол, А - ацетон, ПГ - простатландины.

Рис. 3. НАДФН-сгимулируемое перекисное окисление липидов (А), образование перекисей липидов (В) и продукция перекиси водорода (С) в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и в комбинации с простагландинами.

к

пе, получавших ацетон. Комбинация ацетона с голоданием приводила к достоверному увеличению наработки перекиси водорода в 1.5, образования гидроперекисей лшшдов в 1.2, НАДФН-стимулированного ПОЛ в 1.52 и НАДФН-зависимой хемилюминесценции, стимулируемой люминолом и люцигенином в 3 и 3.1 раза, соответственно (Рис.2,3). Уровни восстановленного и окисленного глутатиона в печени резко снижались в 5.2 и 3.3 раза, соответственно (Рис.1). Интоксикация ацетоном приводила к достоверному увеличению активностей ЭРОД в 3.4, ЭКОД в 5.8, БКОД в 5.9 и ЭМДЕ в 1.8 раза, тогда как активность ПРОД была увеличена несущественно.

ПГЕ1 нормализовал большинство параметров, измененных сочетанием введения ацетона с голоданием. Как видно из таб.2, ПТЕ^- достоверно снижал содержание цитохрома Р-450 и образование перекиси водорода, НАДФН-зависимую хемилюминесценцию, окисление НАДФН и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазную активность. Снижение активности СОД после введения ПИ^ было несущественным. ПЛ^ также способствовал снижению и НАДН-цитохром Ь5 редуктазной активности.

ПГР^с улучшал большинство параметров, измененных комбинацией ацетона с голоданием. ПП^ достоверно повышал уровень восстановленного и окисленного глутатиона, снижал НАДФН-стимулируемое ПОЛ и НАДФН-зависимую хемилюминесценцию, стимулируемую люминолом и люцигенином, тогда как наработка Н2О2 снижалась несущественно, а образование перекисей липидов оставалось неизменным (Рис.2,3). ПГТ2а приводил к достоверному снижению активности ЭРОД и недостоверному уменьшению активностей ПРОД, БКОД и ЭМДЕ, тогда как активность ЭКОД оставалась неизменной.

Фенобарбитал вызывал почти двухкратное увеличение НАДФН-оксидазной и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазной активностей (табл.3). Активности МЭОС, СОД, КАДН-оксидазы и образование перекиси водорода были также повышены после введения фенобарбитала. Содержание цитохрома Р-450 увеличивалось более, чем в 2 раза. Обработка фенобарбиталом резко повысила НАДФН-зависимую хемилюминесценцию микросом'.

ПГЕ1 нормализовал НАДФН оксидазу, НАДФН-цитохром Р-450 редук-тазу и активность МЭОС у крыс, обработанных фенобарбиталом и достоверно снижал содержание цитохрома Р-450 и активность СОД. В то же время ПГЕ^ практически не изменял НАДФН-зависимую хемилюминесценцию и образование перекиси водорода. Все показатели, относящиеся к системе цитохрома Ь5: содержание цитохрома Ь5, НАДН-оксидазная и НАДН-цитохром Ь^-редуктазная активности были снижены после введения ПГЕ1.

Таблица 3

Влияние ПГЕа на содержание и активность компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем печени крыс после индукции микросом фенобарбиталом.

Показатели Контроль • Фенобарбитал Фенобарбитал + ПГЕ1

Цитохром Ь5 & Цитохром Р-450 & НАДН-цитохром Ь5 редуктаза @ НАДФН-цитохром Р-450 редуктаза @ НАДН-оксидаза @ ■ НАДФН-оксидаза @ МЭОС @ Образование перекиси водорода @ Супероксиддисмутаза, Z блокирования НАДФ- зависимая хемилюминесценция, с.p.m./с на мг.белка 0.46+0.02 0.40+0.01 2385.2+145.65 136.8+2.56 3.27+0.19 2.90+0.09 214.4+23.7 0.69+0.049 31.2+2.96 237+32 0.47+0.01 0.87+0.07* 2844.2+262.1 256.6+23.17* 4.82+0.3* 6.51+0.46* 339.2+46.5* 0.96+0.132* 55.1+2.65* 434+39* 0.32+0.02* tt 0.54+0.05*» 1561.7+99.41*» 165.2+13.7» 3.86+0.15*« 2.98+0.25» 223.3+22.2» 0.89+0.065* 47.4+2.61*» 379+26*

Таблица 4 Влияние ПГЕ1 на содержание и активность компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем печени крыс при острой алкогольной интоксикации.

Показатели Контроль Этанол Этанол + ПГ

Цитохром Ь5 & Цитохром Р-450 & НАДН-цитохром Ь5 редуктаза @ НАДФН-цитохром Р-450 редуктаза @ НАДН-оксидаза @ НАДФН-оксидаза @ МЭОС @ Продукция перекиси водорода @ Супероксиддисмутаза, % блокирования НАДФН-зависимая хемилюминесценция, с.р.т./с на мг.белка 0.42+0.02 0.46+0.01 4774.3+144.91 187.9+8.37 3.55+0.12 3.48+0.11 311.5+36.9 Д. 16+0.116 !, 30.4+0.53 524+114 0.30+0.01* 0.32+0.02* 3346.5+203.7* 205.8+4.86 3.55+0.11 3.58+0.17 191.75+9.1* 1.63+0.094* 36.1+1.65* 649+93 0.42+0.01 # 0.47+0.02 « 4003.3+335.9 260.4+13.54*» 3.98+0.08*» 3.93+0.07* 222.25+15.86* 1.55+0.124* 32.9+1.03*» 489+83

Каждая величина представлена как среднее арифметическое + Б.Е.М для 8 животных.

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по.отношению к этанолу или фенобарбиталу.

При острой алкогольной интоксикации содержание цитохромов Ъ5 и Р-450 достоверно снижалось в 1.4 и 1.44 раза соответственно (табл.4). Наблюдалось достоверное снижение НАДН-цитохром Ъ5-редуктазной активности в 1.4 раза, в то время как НАДФН-цитохром Р-450 редуктазная активность и.окисление НАДН и НАДФН оставались практически неизменными, а НАДФН-зависимая хемилюминесценция была несущественно увеличена. Активность МЭОС резко снижалась (в 2 раза), а активность СОД и продукция перекиси водорода достоверно повышалась в 1.2 и 1.5 раза соответственно.

ПЕЕ^ оказывал положительный эффект практически на все параметры, измененные при острой алкогольной интоксикации. Он полностью нормализовал содержание цитохромов Ь5 и Р-450, НАДН-цитохром Ь5 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазные активности и активность МЭОС. Кроме того, ПГЕ£ снижал активность СОД и достоверно не влиял на образование перекиси водорода и НАДФН-зависимую хемилюминесценцию.

Суммируя приведенные выше результаты, можно сделать следующее заключение: ПГ, в большей степени серии Е, обладают антиоксидантной и антирадикальной активностью, снижая генерацию свободных радикалов микросомами печени и ингибируя ПОЛ при воздействии различных гепа-тотоксинов. Этот эффект обусловлен нормализующим действием ПГ на монооксигеназную систему и, в особенности, на цитохром Р-450-зависимую цепь переноса электронов.

Взаимодействие ПГ с ыеибранаыи ыикросом печени крыс.

ПГ уменьшают время корреляции (т) спиновой метки ПХМБ, которая взаимодействует с аминокислотными остатками цистеинов, принадлежащим белковым структурам микросомальной мембраны. Уменьшение значения величины т свидетельствует о увеличении частоты вращения спиновой метки, связанной в этом участке микросомальной мембраны, что в свою очередь, означает уменьшение микровязкости липидного бислоя в месте присоединения ПХМБ. Как следует из рис.4 ШТ2а наиболее выражённо влияет на микровязкость окружения спиновой метки ПХМБ. ПГЕ]- и ПГЕ2 в меньшей степени уменьшают микровязкость окружения этой метки, причем наблюдается зависимость воздействия от количества двойных связей в молекуле ПГ. ПГЕ2. содержащий две двойные связи, слабее воздействует на микровязкость по сравнению с ПГЕр который содержит одну двойную связь.

На рис.4 представлены кривые титрования ПГ суспензии микросом, меченных спиновой меткой ТЦК, которая взаимодействует с «-аминогруппами аминокислотных остатков белков, расположенных на

поверхности мембраны. Видно, что ПГГ^ не оказывает влияния на микровязкость окружения этой спиновой метки, связанной с микросо-мальной мембраной. Напротив, ПП^ и ПГЕ2 увеличивают значение величины -г спиновой метки ТЦК и, следовательно, микровязкость еб окружения. Здесь также наблюдается зависимость степени воздействия от количества двойных связей в молекуле ПГ. ПГЕ2 в данном случае оказывает более сильное влияние на состояние микроокружения спиновой метки ТЦК, по сравнению с ПГЕ^-.

Состояние липидной компоненты микросомальной мембраны изучали при помощи жирорастворимых парамагнитных зондов: 5- и 16-ДСК, ни--троксильные фрагменты которых локализуются на различной глубине липидного бислоя микросомальной мембраны. Упорядоченность липидного бислоя (Б), оцениваемая по поведению спинового зонда 5-ДСК в мем-

0.8 0.6 0,4 0.2-1

Т.НС

Л. нс

0.15

0.3 0.45

-тМ

0.6

-тМ 0.45 0.6

Рис. 4. Зависимость времени корреляции вращательной диффузии (г) спиновой метки ПХМБ (А) и ТЦК (Б) в мембранах микросом печени крыс от концентрации ИТ (1 - ПГЕг, 2 - ПГЕ1, 3 - ШТгсО.

Рис. 5. Зависимость параметра упорядоченности (Б) спинового зонда 5-ДСК (А) и 16-ДСК (В) в мембранах микросом печени крыс от концентрации ПГ (1 - ПГЕг, 2 - ПГЕ1, 3 - тТгсО.

бранах, модифицированных ПГ,возрастает, причём для ПИ^ это увеличение значительно более выраженно по сравнению с ПГ серии Е (рис.5).

ШТ2а увеличивает упорядоченность глубинного участка липидного бислоя, как следует из анализа поведения спинового зонда 16-ДСК. В то же время ПТЕ-^ и ПП^ не влияют на упорядоченность этого участка микросомальной мембраны (рис. 5).

■ Острая и хроническая алкоголизация крыс приводит к структурным изменениям белковой и липидной компоненты микросомальных мембран печени. Гидрофобное окружение белковых структур мембран микросом одинаковым образом реагирует на способ алкоголизации животных. При остром и хроническом введении этанола наблюдается разжижение гидрофобных областей. Этот эффект составляет до 10% при острой и до 20% при хронической алкогольной интоксикации (рис.6): ПГ не оказывает стабилизирующего действия в случае однократного введения этанола и полностью стабилизирует мембрану при хронической алкоголизации животных.

Состояние липидного бислоя на уровне локализации 16-ДСК характеризуется увеличением его микровязкости при хронической алкогольной интоксикации на 45-50% (рис.6). Напротив, в случае острой интоксикации микровязкость уменьшается менее значительно, примерно на 15- 20%. При хронической алкоголизации на фоне введения ПГ наблюдается уменьшение микровязкости гидрофобной области липидного бислоя примерно до уровня, определяемого у контрольных животных. При ост-

■ контроль

а этанол

□ эганол+ пге

Вг (не) С16 (не) С5 (%)

Вг (не) С,6 (не) С5 (%)

ií - р< 0.05 по сравнению с контролем, + - р<0.05 по сравнению с этанолом

Рис.6. Влияние ПГЕ1 на время корреляции и параметр упорядоченности бромацетамидной метки (Вг) и спиновых зондов С5 - и Ci6 производных доксилстеариновойкислоты при острой (А) и хронической (В) алкогольной интоксикации.

рой алкогольной интоксикации введение ПГ недостоверно повышает микровязкость гидрофобной области липидного бислоя на уровне локализации парамагнитной метки 16-ДСК (рис.6).

Анализ поведения парамагнитной метки 5-ДСК, локализованной в приповерхностной области микросомальной мембраны, свидетельствует о том, что при однократном введении этанола наблюдается усиление белок-липидных связей и, наоборот, они ослабевают при хронической интоксикации животных. Эти эффекты слабо выражены и составляют до Ъ% по отношению к контрольным животным. Присутствие ПГ усугубляет этот эффект и в том и в другом случае (рис.6).

В заключении можно сделать вывод, что ЛГЕд- достаточно эффективно стабилизирует структуры микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, тогда как при острой алкогольной

интоксикации подобный эффект отсутствует.

* * *

Генерация свободных радикалов в результате аутооксидации ферро-комплекса цитохрома Р-450 и, как следствие, активация ПОЛв условиях индукции монооксигеназной системы играет ключевую роль в поражении печени. Поэтому важнейшей задачей является ингибирование этих процессов путем снижения образования кислородных интермедиатов цито-хром Р-450-зависимой системы и обезвреживания радикалов соединениями, имеющими свойства "радикальных ловушек". ПГ отвечают всем требованиям, предъявляемым к гепатопротекторам, и обладают следующими протективными действиями: во-первых, они являются стабилизаторами микросомальных мембран и антиоксидантами; во-вторых, взаимодействуя с цитохромом Р-450, они снижают активность монооксигеназ и генерацию супероксид-аниона, и в-третьих, эти соединения являются общеизвестными регуляторами внутриклеточного метаболизма.

Полученные данные позволяют предположить, что стабилизация структурных изменений липидного окружения микросомальных гемопроте-инов ПГ является одним из механизмов антирадикального и антиокси-дантного эффекта ПГ, опосредованного через нормализацию активности цитохромов и постигтотгувщих редуктаз. Кроме того, ПГ серии Е способны улавливать свободные радикалы, что указывает на многофакторность антирадикального и антиоксидантного эффекта ПГ.

ВЫВОДЫ.

I. ПГЕ| в условиях индукции микросомальной системы многократным введением этанола, фенобарбиталом и ацетоном, а также при еб

ингибировании однократным введением этанола нормализует активность компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем.

2. ПГ серии Е проявляют антирадикальное и антиоксидантное действие, снижая образование свободных радикалов и ингибируя процессы ПОЛ, а также повышая активность защитных антирадикальных систем.

3. ПГГ^а действует как прооксидант при хронической алкогольной интоксикации и антиоксидант в условиях индукции микросомальной системы ацетоном в сочетании с голоданием. Различия эффектов ПГЕ и ПГР связаны с особенностями их влияния на различные изоформы цито-хрома Р-450.

4. ПГ уменьшают микровязкость гидрофобной области белковой компоненты микросомальной мембраны, что более выражено у П1Т2а, чем у ПГЕ. ПГ серии Е изменяют конформационное состояние белков поверхностного слоя мембраны, а ПГТ^ вызывают увеличение вязкости гидрофобных участков липидного бислоя. Степень изменения микровязкости мембраны зависит от числа двойных связей в молекуле ПГЕ.

5. ПГЕ связываются с функционально активными грушами (аминогруппами, БН-группами), расположенными на поверхности микросомальной мембраны. ГИТ2а проникает в глубину липидного бислоя и вызывает разжижение полярного его участка и ослабление белок-липидных гидрофобных связей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Buko V., Sadovnichy V. Prostaglandins and cytoprotection of liver cells// The 11th Hepatologlcal Symposium "Bialystok Liver Day".- Blalystok, 1992.- P. 40-42. -

2. Buko V., Sadovnichy V. Effect of prostaglandin Ej on radical generation in rat liver microsomes// Abstracts of the VI Bien-niale Meeting "Free Radicals: from Basic Science to Medicine". Free radicals Research Communications.- 1992.- Supfcl.l.- Ref 4.11.

3. Sadovnichy V., Nemkevich V., Buko V. Prostaglandin Ej and cytochrome P-450 dependent production of free oxygen radicals: Abstracts of the 27th EASE Meetlnd// Journal of Hepatology.- 1992.-V. 16.- Suppl.1.- P. 82.

4. Sadovnichy V., Buko V. Effect of prostaglandin Ej on etha-nol biotransformation, free radical and H202 production by liver microsomes in acute and chronic alcohol Intoxication// IX International Congress in Liver Diseases: Extrahepatic Manifestation In

Liver.- Basel.- 1992..- P. 21.

5. Арцукевич A. H., Садовничий В. В. Взаимодействие простаг-ландинов Ер Е2 и F2a с мембранами микросом печени крыс при острой и хронической ажогольной интоксикации// Материалы международной научной конференции.- Гродно, 1993.- Ч.1.- С. 98-99.

6. Садовничий В. В., Мюллер Д., Буко В. У. Эффект простаглан-динов F2a на генерацию свободных радикалов, образование гидроперекисей липидов, содержание глутатиона и реакции О-деэтилирования и N-деметилирования в микросомах печени крыс, индуцируемых хронической алкогольной интоксикацией и комбинацией ацетона совместно с голоданием/ Инситут биохимии АНБ.- Гродно, 1993.- 20 е.- Деп. в ВИНИТИ 02.12.93, N 2995-В93.

7. Буко В. У., Садовничий В. В. Влияние простагландинов Ej на функции .микросомальных цепей переноса электронов и цитохром Р-450 зависимое образование кислородных радикалов/ Инситут биохимии АНБ.-Гродно, 1993.- 20 е.- Деп. в ВИНИТИ 02.12.93, N 2996-В93.

8. Buko V.U., Sadovnichy V.V. Cytochrome P-450 mediated inhibition of free radical reactions by prostaglandin Ej//14th European Workshop on Drug Metabolism.- Paris, 1994.- P.113.

9. Sadovnichy V,V., Muller D., Buko V.U. The effect prostaglandin F2a on free radical generation during chronic alcohol intoxication and combination of acetone wit starvation// 14th European Workshop on Drug Metabolism.- Paris, 1994.- P. 184.

10. Садовничий В. В., Буко В. У. Влияние простагландинов F2a на генерацию свободных радикалов при хронической алкогольной интоксикации и введении ацетона// Актуальные вопросы гепатологии: Тезисы докладов Первого Белоруского симпозиума гепатологов.- Гродно, 1994.- С. 37-38.

11. Buko V., Artsukevich A., Sadovnichy V., Maltsev A. Interaction of prostaglandin E2 with microsomal membrane in chronic alcohol intoxication//' Alcoholism: Clinical and Experimental Research, 1994.- Y. 18,'N 2.- P. 51 A, 11.17.

12. Арцукевич A. H., Садовничий В. В., Шарейко С. Ч., Буко В. У. Влияние простагландинов на структуру мембран микросом и функциональные свойства монооксигеназной системы печени крыс// Материалы VI оиыпссиумп по Янсхймия липидов.- Санкт-ПетерОурГ, 1994.- С. 18.

13. Sadovnichy V. The effect of prostaglandins Ej and F2a on free radical generation during chronic alcohol intoxication// 38th and 21st International Institutes on the Prevention and Treatment of Alcoholism and Drug Dependence.- Prague, 1994.- P. 290.

14.. Арцукевич А. Н., Садовничий В. В., Буко В. У. Структура -. мембран микросом и функциональные свойства монооксигеназной системы печени крыс в присутствии простагландинов// Материалы Первого съезда белоруского общества фотобиологов и биофизиков.-Минск,1994.-С.8.

Р Э 3 Ю М Э

САДАУН1ЧЫ В1ТАЛБ ВГТАЛЬЕВГЧ

ФУНКЦЫЯНАЛЬНЫЯ I СТРУКТУРНЫЙ ЗМЯНЕННГ МГКРАСАМАЛБНАИ М0НААКС1ГЕНАЗНАИ СГСТЭМЫ ПАД УПЛЫВАМ ПРАСТАГ1АВД31НАУ

Ключавыя словы: прастагландз1ны (ПГ), свабодныя радыкалы, цытахром Р-450, м1красамальная мембрана, этанол, ацэтон, фенабарб1тал. Аб'ект даследавання: м1красомы печан1 пацукоу.

Мэта работы: даследаванне Уплыву ПГ на функцыянальныя 1 структурныя змяненн1 монаакс1геназнай с1стэмы м1красом печан1 пацукоУ ва умовах яе 1дцуцыравання I 1нг1б1равання.

Метады даследавання: экспериментальны, б1ях1м!чны, спектрафотамет-рычны, флуарыметрычны, хем1люм1н1сцэнтны, храматаграф!чны, ЭПР-спектраскап!я, статыстычны.

Апаратура: спектрафатометр, флуарыметр, ЭПР-спектрометр, газавы храматограф, хем!люм1нометр.

Атрыманыя рэзультаты: ПГЕ| ва Умовах 1ндукцы1 1 1нг1б1равання м1красамальнай с1стэмы нармал1зуе актыунасць кампанентау. монаакс1геназнай 1 антыакс1дантнай с1стэм. ПГТ2а дзейн1чае як пра-акс!дант пры хран1чнай алкагольнай 1нтакс1кацы1 1 як антыакс!дант пры 1ндукцы1 ацэтонам. ПГ серы! Е звязываюцца з функцыянальна ак-тыуным! групам1, размешчаным1 на паверхн1 м1красамальнай мембраны, а ПГТ2а пран1кае у глыб!ню л1п1днага б1слоя, разбауляючы яго. ПГЕ! стаб1л1зуе структуру м1красамальнай мембраны пры хран1чнай алкагольнай 1нтакс1кацы1.

Навуковая нав!зна: устаноулена; што ПГЕ праяуляюць антырадыкальнае 1 антыакс1дантнае дзеянне, зн1жаючы утварэнне свабодных радыкалау 1 1нг1б1руючы працэсы перак1снага ак1слення л1п1дау, а таксама павы-шаючы актыунасць ахоУных антырадыкальных с1стэм. Рэкамендацы! па выкарыстанню: ПГЕ-]- можа выкарыстоувацца у якасц! антыакс!данта 1 гепатапратэктара.

Гал1на прымянення: 61ях1м1я, фармакалог1я, такс!калог1я, медыцына.

РЕЗЮМЕ

САДОВНИЧИЙ ВИТАЛИИ ВИТАЛЬЕВИЧ

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МИКРОСОМАЛЫКЖ М0Н00КСИГЕНАЗН0И СИСТЕМЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРОСТАГЛАНДИНОВ.

Ключевые слова: простагландины (ПГ), свободные радикалы, цитохром Р-450, микросомальная мембрана, этанол, ацетон, фенобарбитал. Объект исследования: микросомы печени крыс.

Цель работы: исследование влияния ПГ на функциональные и структурные изменения монооксигеназной системы микросом печени крыс в условиях еб индуцирования и ингибирования.

Методы исследования: экспериментальный, биохимический, спектрофото-метрический, флуориметрический, хемилюминесцентный, хроматографи-ческий, ЭПР-спектроскопия, статистический.

Аппаратура: спектрофотометр, флуориметр, ЭПР-спектрометр, газовый хроматограф, хемилюминометр.

Полученные результаты. ПГЕ1 в условиях индукции и ингибирования микросомальной системы нормализует активность компонентов монооксигеназной и антиоксидантной систем. ПИ^ действует как прооксидант при хронической алкогольной интоксикации и как антиоксидант при индукции ацетоном. ПГ серии Е связываются с функционально активными группами, расположенными на поверхности микросомальной мембраны, а ШТ2а проникает в глубину липидного бислоя, разжижая его. ПТЕ^-стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации.

Научная новизна: установлено, что ПГЕ проявляют антирадикальное и антиоксидантное действие, снижая образование свободных радикалов и ингибируя процессы перекисного окисления липидов, а также повышая активность защитных антирадикальных систем.

Рекомендации по использованию: ПИ^ может использоваться в качестве антиоксиданта и гепатопротектора.

Область применения: биохимия, фармакология, токсикология, медицина.

SUMMARY

VITALY V. SADOVNICHY

FUNCTIONAL AND STRUCTURAL CHANGES OF MONOOXYGENASE SYSTEM UNDER THE INFLUENCE OF PROSTAGLANDINS.

Key words: prostaglandins (PG), free radicals, cytochrome P-450, microsomal membrane, ethanol, acetone, phenobarbltal. Study subject: rat liver microsomes.

Study goal: study the Influence of PG on functional and structural parameters of rat liver monooxygenase system during microsomal induction and inhibition.

Stady methods: experimental, biochemical, spectrophotometrlc, fluo-rlmetrlc, chromatographic, chemlluminescence, ESR-spectrometric, statistical.

Equipment: spectrophotometer, fluorlmeter, gas chromatograph, chemilumlnometer, ESR-spectrometer.

Results. During microsomal Induction and inhibition PGEj normalize activity of monooxygenase and antioxidant systems. PGF2a act as prooxldant during chronic alcohol intoxication and as antioxidant during Induction by acetone. PGE1 bind with functional active groups which located on surface of microsomal membrane, whereas PGF2a penetrate into deeper lipid bilayer, fluidlzing membrane. PGEj stabilize microsomal membrane structure during chronic alcohol Intoxication.

New scientific data: PGE have antiradical and antioxidant effect, decreasing free radical generation and inhibiting lipid peroxidation, and so increasing activity of defense antiradical systems. Usage recommendation: PGE1 may be use as antioxidant and hepatopro-tector.

Usage area: biochemistry, pharmacology, toxicology, medicine.

Подписано к печати 11.11.95 г. Тираж 100 экз. Заказ 162.

Отпечатано ОУС г. Гродно