Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное узнавание, аффинность и термодинамика белок-белковых взаимодействий в цитохром P450-зависимых монооксигеназных системах

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное узнавание, аффинность и термодинамика белок-белковых взаимодействий в цитохром P450-зависимых монооксигеназных системах"

Ж)

На правах рукописи

Яблоков Евгений Олегович

Молекулярное узнавание, аффинность и термодинамика белок-белковых взаимодействий в цитохром Р450-зависимых монооксигеназных системах

7

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

6 НОЯ 2014

005554647

Москва 2014

.1 (

и"

005554647

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Иванов Алексей Сергеевич

Официальные оппоненты: Долгих Дмитрий Александрович

доктор биологических наук, ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчиникова РАН, лаборатория инженерии белка, заведующий лабораторией

Митькевич Владимир Александрович

кандидат химических наук, ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, лаборатория конформационного полиморфизма белков в норме и патологии, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится «11» декабря 2014 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10, стр. 8.

>

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ и на сайте www.ibmc.msk.ru

Автореферат разослан «¿£ » ¿■"Углист Р.Р 2014 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Карпова Е.А.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Монооксигеназная система цитохрома Р450 играет важную роль в метаболизме ксенобиотиков, синтезе эндогенных биологически активных веществ, таких как стероидные гормоны, холестерин и простагландины. Монооксигеназная система микросом печени (микросомальные Р450-системы) эукариот состоят из трёх компонентов: флавопротеина, содержащего FAD и FMN (NADPH-зависимая Р450-редуктаза, CPR), цитохрома Р450 (CYP) и цитохрома Ь5 (CYB5). Все компоненты этой системы представляют собой мембранные белки. Наряду с печенью и надпочечниками, монооксигеназные системы, содержащие Р450, обнаружены также в почках, легких, некоторых отделах мозга, коже, слизистой оболочке носа, кишечника и других тканях [Арчаков А.И, 1975]. Митохондриальная монооксигеназная система состоит из следующих компонентов: FAD-содержащий флавопротеин (NADPH- или NADH-зависимая редуктаза, AdR) и негеминовый серосодержащий белок (адренодоксин, AdX) -водорастворимы и локализованы в матриксе митохондрий, третий - Р450 встроен в мембрану. Обращает на себя внимание высокая субстратная специфичность митохондриальных гемопротеинов, что делает эту систему еще более похожей на бактериальную. Митохондриальные цитохромы Р450 участвуют главным образом в окислении эндогенных субстратов.

В настоящее время нет единого представления о молекулярном механизме функционирования этой сложной системы и роли белок-белковых взаимодействий (ББВ) между отдельными редокс-партнёрами. В литературе имеются только отдельные разрозненные данные о ББВ в данной системе, что не позволяет делать однозначных заключений относительно функциональной важности такого комплексообразования.

Цитохром Р450-зависимые монооксигеназные системы присутствуют практически во всех живых организмах, что говорит о древности их возникновения. Известны одиночные данные о ББВ между белками-партнерами из разных организмов с образованием химерных комплексов. Это говорит о возможном консерватизме устройства и функционирования монооксигеназных систем и создает дополнительную проблему в изучении роли ББВ, так как обычно наблюдается высокая видовая специфичность молекулярного узнавания между белками-партнерами в различных молекулярных комплексах.

Поэтому изучение ББВ между белками-партнерами монооксигеназных систем из различных организмов является крайне актуальным. Данное исследование должно быть комплексным и

включать анализ не только специфичности молекулярного узнавания, но и оценку аффинности, кинетики и термодинамики ББВ. Последнее особенно важно для понимания механизмов формирования и функционирования белковых комплексов в цитохром Р450-зависимых монооксигеназных системах.

Цель работы

Определение специфичности молекулярного узнавания, аффинности и параметров

термодинамики взаимодействий между белками-партнёрами в цитохром Р450-зависимых монооксигеназных системах.

Задачи

1. Оптимизировать метод ковалентной иммобилизации и многократной нативной регенерации белков монооксигеназных систем на поверхности оптического чипа биосенсора.

2. Выполнить анализ аффинности, кинетики и селективности взаимодействий различных изоформ цитохрома Р450, цитохрома Ь5, цитохром Р450 редуктазы и адренодоксина.

3. Оценить видовую специфичность молекулярного узнавания между цитохромом Р450 и его редокс-партнёрами из разных видов живых организмов.

4. Выполнить комплексный анализ термодинамики белок-белковых взаимодействий между различными редокс-партнёрами монооксигеназных систем.

Научная новизна работы

Результаты работы носят фундаментальный характер. В работе впервые выполнен массовый комплексный анализ ББВ сразу для 9 изоформ из различных семейств цитохромов Р450 человека (около 20% от всех известных Р450 человека), включающий определение кинетических, равновесных и термодинамических параметров.

Объем полученных данных оказался достаточным для сравнительного анализа термодинамических особенностей ББВ и разделении их на группы в зависимости от соотношения энтальпийного и энтропийного компонентов. Такое разделение обнаружено впервые и представляет реальный вклад в фундаментальные знания о межмолекулярных взаимодействиях между белками, входящими в состав монооксигеназных систем.

В работе впервые выполнен подробный анализ взаимодействий микросомальных цитохромов Р450 с адренодоксином и цитохром Р450 редуктазой, а также митохондриальных цитохромов Р450 и Ь5, что дало новые фундаментальные данные о различиях между монооксигеназными

системами эндоплазматического ретикулюма и митохондрий.

Научно-практическая значимость работы

Полученные новые фундаментальные знания о разделении белок-белковых взаимодействий в Р450-зависимых монооксигеназных системах на группы в зависимости от соотношения энтальпийного и энтропийного компонентов крайне важны для дальнейшего исследования молекулярных механизмов функционирования этих систем.

Полученные данные об аффинности, консервативности и специфичности взаимодействий цитохромов Р450 с белками-партнёрами могут быть использованы в поисковых и прикладных работах по созданию лекарств нового поколения, контролирующих образование функционально активных белок-белковых комплексов.

Полученные новые термодинамические данные о белок-белковых взаимодействиях в Р450-зависимых монооксигеназных системах могут быть использованы для совершенствования методов и подходов компьютерного 31) моделирования сложных белковых комплексов.

Положения, выносимые на защиту

1. Для комплексов цитохромов Р450 с белками-партнёрами наиболее характерны значения Кс1 от 0,01 до 5 мкМ. Ведущая роль в формировании комплексов между различными изоформами цитохромов Р450 и белками-партнёрами в разных случаях может быть обусловлена как энтальпийным, так и энтропийным компонентом.

2. Образование комплексов цитохром Р450 редуктазы (СРЯ) и цитохрома Ь5 крысы с цитохромами Р450 человека (СУРЗА4, СУРЗА5, СУР1В1), адренодоксина человека (АёХ) с цитохромами Р450 лошади (СУР17А1) и быка (СУР 11А1) говорит о консервативности межмолекулярных взаимодействий между некоторыми белками-партнёрами монооксигеназных систем. Однако, для ряда других цитохромов Р450 (СУР17А1ец, СУР 11А 1Ьо\', СУР1 Ш1Ьит, СУР11В2Ьит) характерна относительная видовая специфичность - они взаимодействуют только с цитохромом Ь5 человека (СУВ5Ьиш).

3. Белок-белковые взаимодействия между партнёрами монооксигеназных систем разделяются на группы, в зависимости от ведущей роли термодинамических факторов в образовании комплексов. Комплексы митохондриальных и микросомальных цитохромов Р450 с Ас1Х делятся на энтальпийно-зависимые (ДНО, -ТД8>0) и энтропийно-зависимые (ДН>0, -ТД8<0), тогда как их комплексы с цитохром Р450 редуктазой (СРК) формируются только за счёт изменения энтропии (ДН>0, -ТД8<0). В тех случаях, когда цитохром Ь5 является аллостерическим эффектором цитохрома Р450, ведущим фактором их взаимодействия является изменение

энтальпии (ДН<0 и -TAS>0), во всех остальных случаях ведущую роль в их комплексообразовании играет изменение энтропии (ДН>0, -TAS<0). Личный вклад автора

Планирование всех экспериментов, анализ и интерпретация экспериментальных данных, формулировка теоретических положений выполнены лично автором работы под руководством д.б.н., профессора Иванова A.C. Все экспериментальные работы на оптическом биосенсоре выполнены автором лично. Гетерологическая экспрессия рекомбинантных CYP и их партнёров выполнена сомместно с к.б.н. Гилепом A.A. в Государственном научном учреждении «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, Минск.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях:

1. II Всероссийская научная конференция молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», 12-14 ноября 2012, Санкт-Петербург, Россия.

2. IV Съезд биофизиков России, 20 - 26 августа 2012, Нижний Новгород, Россия.

Публикации

По материалам работы опубликовано 6 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.

Структура и объём диссертации

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 53 рисунка. Список литературы включает 284 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и основные методы исследования

Препараты белков

Препараты высокоочищенных (>95% по SDS-PAGE) и функционально активных белков были любезно предоставлены сотрудниками Института биоорганической Химии Национальной Академии Наук республики Беларусь под руководством профессора Усанова С.А в рамках договора о научно-техническом сотрудничестве. Препараты, представляющие собой продукты гетерологической экспрессии целевых белков в Е. coli, были разделены на аликвоты по 5 мкл, заморожены в жидком азоте и хранились при температуре -40°С.

Поверхностный плазменный резонанс

Для исследования межмолекулярных взаимодействий был использован оптический биосенсор Biacore 3000 (GE Healthcare, США), работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса. Сигнал биосенсора регистрировался в каждом канале биосенсора в резонансных единицах (RU, 1 RU соответствует связыванию 1 пг белка/мм2 поверхности оптического чипа) и представлялся в виде сенсограмм, показывающих его изменение во времени. Все эксперименты были выполнены с использованием стандартных оптических чипов СМ5, покрытых слоем карбоксиметилированного декстрана.

Для оптимизации условий иммобилизации белка-лиганда на оптическом чипе проводили исследование зависимости уровня электростатического концентрирования белка у поверхности чипа от рН иммобилизационного буфера (процедура рН-скаутинга). Были использованы тестовые растворы белков (CYP51A1, CYP3A5, CYP3A4, CPR, AdX, CYB5A, CYB5B) с концентрацией 15 мкг/мл в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,0, 4,5, 5,0, 5,5), 5 мМ малеатном буфере (рН 6,6), 10 мМ HEPES-буфере (рН 7,4). Инжекции растворов белков выполнялись в течении 10 минут при скорости 5 мкл/мин. После каждой инжекции производилась регенерация поверхности чипа 25 мМ раствором NaOH при скорости инжекции 50 мкл/мин в течение 60 с. В качестве рабочего буфера был использован буфер HBS-N (150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7,4).

Для ковалентной иммобилизации белков-лигандов были использованы индивидуальные иммобилизационные буферы, состав которых был оптимизирован для каждого белка с помощью процедуры рН-скаутинга: 10 мМ HEPES (рН 7,4) для CYP 51А1 и CYP3A5; 5 мМ малеатный буфер (рН 6,6) для CYP3A4; 10 мМ ацетатный буфер (рН 5,0) для CPR и (рН 4,5) для AdX, CYB5A и CYB5B. Первоначально выполняли активацию карбоксильных групп декстрана на поверхности чипа с помощью инжекции свежеприготовленной смеси 1:1 растворов EDC (0,4 М) и NHS (0,1 М) в течении 7 минут при скорости 5 мкл/мин. Далее пропускали раствор белка

(15 мкг/мл) в соответствующем иммобилизационном буфере в течении 10 минут при скорости 2 мкл/мин. Не прореагировавшие активированные карбоксильные группы декстрана блокировали инжекцией 1,0 М раствора этаноламина-НС1 в течении 3 минут на скорости 5 мкл/мин. Количество иммобилизованного таким образом белка обычно колеблется в диапазоне 3000 -8000 К и (3 - 8 нг белка/мм2, что эквивалентно примерно 50 - 140 фмоль цитохрома Р450, 60 -100 фмоль СРК, 250 - 400 фмоль Ас1Х, 300 - 500 фмоль цитохрома Ь5). На рис. 1 приведена типичная сенсограмма процедуры иммобилизации белка (на примере СУВэД).

Время, с

Рис. 1. Типичная сенсограмма иммобилизации белка (на примере CYB5A).

В работе в качестве белков-аналитов были использованы препараты CPR крысы, CYB5 тип А и В человека и крысы, AdX человека, CYP51A1 С. albicans, CYP11A1 быка, CYP17A1 лошади и CYP2C9, 1В1, 51А1, ЗА4, ЗА5, 11В1, 11В2 человека. Рабочие растворы белков готовились в стандартном буфере HBS-EP+ в диапазоне концентраций от 0,05 до 10 мкМ.

Во всех измерениях в качестве рабочего буфера был использован буфер HBS-EP+ ( 150 мМ NaCl, 0,05% v/v сурфактант Р20, 10 мМ HEPES, рН 7,4). Регистрацию межмолекулярных взаимодействий производили в диапазоне температур от 10 до 40°С, с шагом 5°С.

Инжекции белка-аналита производили при скорости потока 5 мкл/мин в течение 5-10 мин в зависимости от скорости образования комплексов лиганд/аналит. Фаза диссоциации комплексов регистрировалась также в течение 5-10 мин и заканчивалась инжекцией регенерационного буфера (1М NaCl, 0,05% сурфоктант Р20, 0,2% CHAPS, 10 мМ HEPES, рН 7,4) при скорости 55 мкл/мин в течение 50 с. Для контроля возможной неспецифической сорбции аналитов на декстран чипа был использован пустой канал биосенсора, не содержащий иммобилизованного белка-лиганда, через который одновременно с рабочим каналом пропускался раствор белка-аналита.

Обработка данных и анализ кинетики межмолекулярных взаимодействий выполнялся с

помощью программы В1Ле\'а1иаиоп V 4.1.1 (ОН НекЬсаге, США) и рассчитывали константы скоростей образования и распада комплексов (коп и кой", соответственно) и равновесные константы диссоциации комплексов (Кё).

Для анализа термодинамических параметров взаимодействия цитохромов Р450 с иммобилизованными белками-партнёрами выполнялись измерения при температурах 10, 15, 20, 25, 30, 35 и 40°С. Из полученных серий сенсограмм были определены зависимости значения Кс1 от температуры и построены графики Вант-Гоффа (уравнение 1) в координатах 1000/Т- 1пК<1 1пКс1 = (ЛН/И)(1000/Т) - (Дв/И) (1)

где Кс1 - константа диссоциации белок-белковых комплексов, Т - абсолютная температура, ДН - изменение энтальпии, ДХ - изменение энтропии и Я - универсальная газовая постоянная Больцмана.

Далее с помощью программы ОгарЬег 7 выполнялась линейная аппроксимация графиков Вант-Гоффа (коэффициент корреляции >0,9), из которой определялись значения изменения энтальпии (ДН).

Значения изменения энергии Гиббса (ДО) получали из уравнения 2:

АС = ЫПпКа (2)

где Кс1 - константа диссоциации белок-белковых комплексов при 298°К. Значения -ТД8 (энтропийный компонент) получали из уравнения 3:

Дв = ДН-ТДв (3)

Результаты и их обсуждение

Оптимизация условий иммобиолизации белков-лигапдов и процедуры анализа межмолекулярных взаимодействий

Для иммобилизации белка-лиганда используется его электростатическая преконцентрация за счет притягивания положительно заряженного белка к отрицательным зарядам (карбоксильные группы декстрана) на поверхности чипа. Для обеспечения положительного заряда белка-лиганда, иммобилизационный буфер должен иметь низкую ионную силу и его рН должен быть ниже р1 белка.

У цитохромов Р450 (СУР51А1, СУРЗА5, СУРЗА4) значение р1 лежит в диапазоне 8,0 - 8,5, что обеспечивает хорошую преконцентрацию этих белков при нейтральных значениях рН буфера с низкой ионной силой (концентрация солей <10 мМ). Поэтому главной задачей было максимальное сохранение нативности этих довольно лабильных белков при их иммобилизации. В результате для цитохромов Р450 были подобраны два оптимальных состава

иммобилизационных буферов: 10 мМ НЕРЕБ (рН 7,4) и 5 мМ малеат натрия (рН 6,6).

В тоже время у белков-партнёров цитохромов Р450 значение р1 лежит в диапазоне 4,5 - 5,5, что предопределяет использование в качестве иммобилизационного буфера слабокислый раствор ацетата натрия. Поэтому при оптимизации значений рН предпочтение отдавали буферам по возможности с максимально высоким рН, при котором достигалась иммобилизация минимально достаточного количества белка-лиганда. В результате для иммобилизации АёХ и СУВ5 использовали ацетатный буфер с рН 4,5, а для СРЯ значение рН - с рН 5,0.

Каждый эксперимент по анализу межмолекулярных взаимодействий повторяли не менее 3 раз. На рис. 2 в качестве примера показана серия типичных сенсограмм взаимодействия СУРЗА4 человека с иммобилизованным белком-партнёром СУВ5Вга1, полученная при 25°С.

- 0,2 мкМ

Рис. 2. Серия сенсограмм взаимодействия различных концентраций СУРЗЛ4Ьишап с иммобилизованным СУВ5Вга1 Необходимо отметить, что при иммобилизации в качестве лигандов цитохромов Р450 часто происходит потеря их способности взаимодействовать с белками-партнерами. Такое явление наблюдалось и в приведенных в качестве примера экспериментах - при перестановке белков местами СУВ5Вга1 (как аналит) не взаимодействовал с иммобилизованным в качестве лиганда СУРЗА4. Это, по-видимому, обусловлено сочетанием двух факторов - возможной потерей нативности крайне лабильного белка-лиганда и неудачной пространственной ориентацией белка при ковалентной иммобилизации на декстране, приводящей к блокированию доступа к интерфейсам белок-белковых взаимодействий.

Найденные оптимальные экспериментальные условия были далее адаптированы для всех белков, использованных в работе.

Аффинность и селективность взаимодействия СУР с С¥В5 (А и В) крысы и человека

Был выполнен биосенсорный анализ белок-белковых взаимодействий 10 различных цитохромов Р450 с 4 цитохромами Ь5 при температуре 25°С (таблица 1).

Таблица 1. Равновесные константы диссоциации (Кс1, мкМ) комплексов СУР-СУВ5 при 25°С.

СУВ5Ага1 СУВ5АЬит СУВ5Вга» СУВ5ВЬит

СУРЗА4Ьиш 0,20±0,03 0,35±0,04 0,50±0,02 0,30±0,03

СУРЗА5Ьшп 0,070±0,003 4,8±0,4 0,50±0,06 0,50±0,04

СУР51А1Ьит 19,8±3,7 75,3±6,8 .* 103,0±18,7

СУР51А1са1Ь - - - -

СУР11А1Ьоу - - - 0,50±0,02

СУР2С9Ьит - - - -

СУР17А1ец - 0,4±0,03 - -

СУР11В2Ьит - - - 0,19±0,003

СУР11В1Ьит - - - 0,5±0,03

СУРШПшт 0,01±0,003 0,01±0,001 0,04±0,002 0,04±0,005

* - «-» означает, что взаимодействие отсутствует.

Из таблицы видно, что значения Кс1 комплексов при 25°С лежат в диапазоне 0,01 - 103 мкМ. В качестве контроля на неспецифические белок-белковые взаимодействия вместо цитохромов Р450 через рабочий канал биосенсора инжектировали растворы альбумина и гемоглобина, которые не взаимодействовали с иммобилизованными СУВ5. Из полученных данных видно, что у некоторых СУР отсутствует избирательность во взаимодействии с белками-партнерами, то время как у других она наблюдается по отношению к изоформам СУВ5, а в ряде случаев имеет место видовая специфичность. Так микросомальные цитохромы СУРЗА4, СУРЗА5, СУР1В1 и СУР51А1 не проявили видовой специфичности и избирательности к изоформам СУВ5. Они взаимодействуют как с СУВ5А, так и с СУВ5В человека и крысы. Нужно отметить, что в случае взаимодействия СУР1В1 с СУВ5 аффинность очень высокая (Кс1 комплексов порядка 10"8 М). В тоже время, микросомальный СУР51А1 отличается очень низкой афинностью по отношению ко всем изоформам СУВ5 как человека, так и крысы (Кс1 комплексов - порядка 10"5 М). Ранее в работе УатагаЫ (2002) было продемонстрировано, что СУВ5 не оказывает никакого эффекта на активность СУР1В1. С чем связано высоко аффинное взаимодействие цитохрома Ь5 с СУР 1В1 и при этом отсутствие стимулирования/ингибирования активности последнего, остается неясным. Известно также, что СУВ5 не способен оказывать влияние на уровень каталитической активности и СУР51А1. В противоположность этому, СУВ5 влияет на активность СУРЗА4 и

СУРЗЛ5. Из наших данных видно, что эти СУР взаимодействуют с СУВ5А и СУВ5В как крысы, так и человека, однако все же наблюдается определённая видовая специфичность. Комплексы СУРЗА4 и СУРЗА5 с СУВ5В крысы и человека имеют практически одинаковую хорошую аффинность (К<1 порядка 0,3 - 0,5 мкМ). Комплексы СУРЗА4 с СУВ5А человека и крысы, а так же СУРЗА5 с СУВ5Ага1, характеризуются значениями Кс1 0,2, 0,35 и 0,07 мкМ соответственно. Тогда как для комплексов СУРЗА5 с СУВ5А человека значение К<1 составляет 4,8 мкМ. Причины этих особенностей, скорей всего в структурных различиях СУРЗА4 и СУРЗА5. Этот вопрос требует дальнейших исследований с применением методов 30 компьютерного моделирования белок-белковых комплексов и оптико-биосенсорных экспериментов с мутантными молекулами СУРЗА4 и СУРЗА5. Не исключено, что комплексы СУВ5В человека и крысы с этими СУР имеют сходные значения К<] из-за структурных особенностей гидрофильного домена митохондриальной изоформы цитохрома Ь5 (значительно большая жёсткость, чем у гидрофобного домена микросомальной изоформы).

Заслуживают отдельного внимания цитохромы Р450, продемонстрировавшие видовую специфичность и избирательность по отношению к изоформам СУВ5. Микросомальный СУР17А1 взаимодействовал только с СУВ5А человека, образуя комплексы с хорошей аффинностью (Кс1 0,4 мкМ). Микросомальный цитохром Ь5 является известным регулятором каталитической активности СУР17А1. Неспособность СУВ5В эффективно связываться с СУР17А1 коррелирует с известными данными о том, что СУВ5В не оказывает влияния на 17,20-лиазную активность СУР17А1.

Митохондриальные цитохромы Р450 (СУР11А1, СУР11В1, СУР11В2) образуют комплексы только с СУВ5В человека. Аффинность этих комплексов высока (Кё порядка 0,2 - 0,5 мкМ). В настоящей работе впервые продемонстрировано образование комплексов между СУВ5В и СУР11А1, СУР11В1 и СУР11В2, в то время как не зафиксировано образование комплексов с СУВ5А. Чем обусловлена такая избирательность митохондриальных СУР остается неясным и вопрос о возможном влиянии СУВ5В на активность митохондриальных цитохромов остаётся открытым. Тем не менее, следует учитывать локализацию цитохромов Р450 и СУВ5В в митохондриях - цитохромы Р450 локализованы на внутренней мембране митохондрии и контактируют с матриксом, в то время как митохондриальная изоформа СУВ5 находится во внешней мембране митохондрий. Таким образом, можно говорить о том, что в физиологических условиях эти белки скорее всего не встречаются.

Не было зафиксировано также образование комплексов микросомального СУР2С9 и СУВ5 (табл. 1). Ранее в ряде исследований разных авторов было показано наличие стимулирующего эффекта СУВ5А на активность СУР2С9. Вполне вероятно, что СУВ5 переносит электроны на

CYP2C9 по челночному механизму. Этот процесс сопряжен с формированием белок-белковых комплексов, характеризующихся очень быстрым распадом (kofr> 1 с"1). Образование комплексов с такими кинетическими параметрами практически невозможно зарегистрировать на оптическом биосенсоре. Не было взаимодействия и CYP51Alcalb с CYB5, что можно объяснить не только функциональными особенностями этого фермента, но и видовой специфичностью.

Определение термодинамических параметров взаимодействий СУР с CYB5 (А и В) крысы и чаовека

Регистрацию образования белок-белковых комплексов осуществляли в диапазоне температур от 10 до 40°С с шагом в 5°С. Таким образом получали семь значений Kd при разной температуре и строили графики Вант-Гоффа. Значения изменения свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии рассчитывали как описано в разделе «Материалы и методы». Полученные данные представлены в таблице 2. Можно видеть, что образование разных комплексов CYP-CYB5 отличается по термодинамическим параметрам - наблюдаются как энтальпийно-зависимое, так и энтропийно-зависимые процессы.

Для энтальпийно-зависимого образования комплексов характерны значения ДН <0 и -TAS >0 [Wesley Е., 1997, Brady GP., 1997]. Это свидетельствует о том, что взаимодействие молекул CYP и CYB5 происходит за счёт таких факторов, как образование солевых мостиков и водородных связей. В то же время энтропийная компонента (-TAS) положительна и противодействует образованию белок-белковых комплексов. Это может быть обусловлено десольватацией полярных групп при вытеснении воды из зоны контакта белковых молекул. Сенсограммы образования энтальпийно-зависимых комплексов при росте температуры от 10 до 40°С изменяются следующим образом: незначительно увеличивается скорость образования комплексов (ко,,) и существенно увеличивается скорость распада комплексов (kotr). В результате при повышении температуры происходит уменьшение аффинности энтальпийно-зависимых комплексов за счёт увеличения kofr. Данные, приведённые в табл. 2, проиллюстрированы графически на рисунках 3-5.

Таблица 2. Значения изменения свободной энергии Гиббса (ДО), энтальпии (ЛН), энтропии (-ТДБ) при образовании комплексов СУВ5-СУР

Пара (лиганд/аналит) АО (ккал/моль) АН (ккал/моль) -ТАв (ккал/моль)

СУВ5Ага1/СУРЗА411ип1 -9,0±0,3 -34,9±3,2 25,9±3,9

СУВ5АЬига/С¥РЗА4Ьиш -8,8±0,6 -39,7±4,0 30,7±4,6

СУВ5Вга1/СУРЗА411ит -8,6±0,4 -27,9±2,2 18,9±2,8

СУВ5ВЬит/СУРЗА411иш -8,9±0,8 -30,7±3,8 21,3±3,2

СУВ5Ага^С¥РЗА5Ьит -9,7±0,4 -34,8±2,7 25,1±3,7

СУВ5А11ит/СУРЗА5Ьит -7,2±0,2 -27,0±1,8 19,8±2,9

С¥В5Вга^СУРЗА5Ьи1п -8,6±0,3 -21,7±2,2 13,1±1,9

СУВ5ВЬит/СУРЗА5Ьит -8,6±0,2 -17,3±1,8 8,7± 1,3

С¥В5Ага^С¥Р51А1Ьит -6,4±0,9 62,9±7,4 -69,4±10,4

С¥В5АЬит/С¥Р51А111ит -5,6±0,8 76,6±9,5 -82,3±12,3

С¥В5Вга^С¥Р51А1Ьит - -

С¥В5В1шт/С¥Р51А1Ьит -5,4±0,8 32,1±3,8 -37,6±5,6

С¥В5Ага^С¥Р51А1са1Ь - - -

С¥В5АЬит/С¥Р51А1са1Ь - - -

СУВ5Вга1/С¥Р51А1са1Ь - - -

С¥В5ВЬит/С¥Р51А1са1Ь - - -

С¥В5АгаГ/С¥Р2С9Ьит - - -

С¥В5А11ит/С¥Р2С911ит - - -

С¥В5Вга^С¥Р2С9Ьиш - - -

С¥В5ВЬит/С¥Р2С911ит - - -

С¥В5Ага1/С¥Р17А1ед - - -

СУВ5А11ип1/С¥Р17А1ед -8,8±0,7 -15,3±2,5 6,5±0,8

СУВ5Вга1/С¥Р17А1еЧ - - -

С¥В5ВЬит/С¥Р17А1ец - - -

С¥В5Ага^С¥Р1В111ит -9,4±0,8 8,8±0,8 -20,4±3,1

С¥В5АЬит/С¥Р1В111ит -10,8±1,2 8,9±0,9 -19,7±2,2

С¥В5Вга»/СУР1В1Ьи111 -10,1±1,0 11,8±1,6 -21,8±1,8

С¥В5ВЬит/С¥Р1В111ит -10,0±1,1 16,6±1,9 -26,6±2,3

С¥В5Ага1/С¥Р11А1Ьоу - - -

С¥В5АЬит/С¥Р11А1Ьоу - - -

С¥В5Вга1/СУР11А1Ьоу - - -

С¥В5ВНиш/С¥Р11А1Ьоу -8,5±0,5 38,2±4,3 -46,7±5,8

С¥В5Ага^С¥Р11В1Ьит - - -

С¥В5АЬит/С¥Р11В1Ьит - - -

С¥В5Вга^С¥Р11В1Ьиш - - -

С¥В5ВНит/С¥Р11В11и1т -8,6±0,3 9,6±1,4 -18,1±3,2

С¥В5АгаУС¥Р11В211иш - - -

СУВ5А1шп1/С¥Р11В211шп - - -

С¥В5Вга1/С¥Р11В211ит - - -

С¥В5ВЬит/С¥Р11В2Ьит -9,2±0,4 61,3±6,4 -70,5±6,7

* - «-»- нет взаимодействия.

СУРЗА4, СУРЗА5, СУР17А1 образуют энтальпийно-зависимые комплексы с СУВ5А и СУВ5В. Значения термодинамических параметров этих комплексов приведены на рис 3.

Рис. 3. Термодинамические параметры образования энтальпийно-зависимых комплексов CYP-CYB5.

Цифрами обозначены комплексы: 1 - CYP3A4hum-CYB5Arat, 2 - CYP3A4hum-CYB5Ahum, 3 - CYP3A4hum-CYB5Brat, 4 - CYP3A4hum-CYB5Bhum, 5 - CYP3A5hum-CYB5Arat, 6 - CYP3A5hum-CYB5Ahum, 7 - CYP3A5hum-CYB5Brat, 8 - CYP3A5hum-CYB5Bhum, 9 - CYP17Aleq-CYB5Ahum.

Скорее всего комплексы этих CYP с цитохромом Ь5 образуются за счёт электростатических взаимодействий, так как известно, что для CYP3A4, CYP3A5 и CYP17A1 цитохром Ь5 является аллостерическим эффектором и для этого важны именно электростатические взаимодействия [Zhao С., 2012; Peng Н., 2013].

В случае образования энтропийно-зависимых комплексов компонента -TAS <0 [Wesley Е., 1997, Brady G.P., 1997]. Можно предположить, что формирование энтропийно-зависимых комплексов сопряжено с гидрофобными взаимодействиями и десольватацией поверхности белковых глобул. При этом часто значение энтальпийной компоненты положительно (ДН >0), что по-видимому обусловлено конформационными изменениями в молекулах CYP и CYB5. При росте температуры от 10 до 40°С значительно увеличивается скорость образования комплексов (кол), а скорость распада комплексов (kofr) возрастает незначительно. Таким образом, при повышении температуры происходит увеличение аффинности энтрапийно-зависимых комплексов за счёт роста величины к„„.

Митохондриальные СУР (СУР 11А1, СУР 11В1, СУР 11В2), а также микросомальные СУР 1В1 и СУР51А1, образуют комплексы с цитохромом Ь5 за счёт энтропийной компоненты. Значения термодинамических параметров этих комплексов показаны на рис. 4.

Рис. 4. Термодинамические параметры образования энтрапийно-зависимых комплексов митохондриальных СУР-СУВ5.

Цифрами обозначены комплексы:

1 - СУР11А1Ьоу-СУВ5ВЬшп, 2 - СУР11ВШит-СУВ5ВЬит, 3 - СУР11В2Ьит-СУВ5В11ит.

Образование комплексов в результате неспецифического гидрофобного взаимодействия мембранных доменов митохондриальных СУР и СУВ5 маловероятно, так как имеет место избирательность СУР11А1, СУР11В1 и СУР11В2 по отношению к СУВ5В.

Микросомальные СУР1В1 и СУР51А1 образуют энтропийно-зависимые комплексы со всеми изоформами цитохрома Ьз человека и крысы (СУВ5А и СУВ5В). Значения термодинамических параметров этих комплексов приведены на рис 5. Как уже было сказано выше, СУВ5 не оказывает никакого влияния на функциональную активность этих СУР. Можно предположить, что гидрофобные участки молекул СУР1В1 и СУР51А1 взаимодействуют с мембранным доменом СУВ5. Это предположение может удоволетворительно объяснить остутствие избирательности и низкую аффинность компексов СУР51А1-СУВ5, но остаётся непонятной причина столь высокого сродства СУР1В1 к цитохромам Ь5.

5 61

о (ккал/моль; ■ йН (ккал/моль) □ -ТЛБ (ккал/моль)

Рис. 5. Термодинамические параметры образования энтропийно-зависимых

комплексов СУР-СУВ5.

Цифрами обозначены комплексы: 1 - СУР1В1Ьит-СУВ5Ага1, 2 - СУР1ВИшт-СУВ5А1шт, 3 - СУР1ВЦшт-СУВ5Вга1, 4 - СУР1ВИшт-СУВ5В1шт, 5 - СУР51АШит-СУВ5Ага1, 6 - СУР51А1Ьит-СУВ5АЬит, 7 - СУР51А1Ьит-СУВ5Вга1, 8 - СУР51АШит-СУВ5ВЬит.

На рис. 6. в графическом виде представлено разделение комплексов СУР-СУВ5 на группы, в зависимости от значений энтальпийной и энтропийной компонент.

ЗА 4 ЗА5

-ТДЭ (ккал.'моль) ♦ _ 17А1 ю

АН-}ависимые

йн&лз-зависимые

»СУБ5А>шт #С I'ВГБЬит

■ С I Б5Агаг »С'г656ги

М ЛЗ 50

ДМ (ккатмоль)

1Б1

51А1

Д5- зависимы«?

51А1

Рис. 6. Разделение комплексов СУР-СУВ5 на группы, в зависимости

от значений энтальпийной (АН) и энтропийной (-ТД8) компонент.

Цветом обведены группы комплексов СУВ5 с цитохромами Р450. Стрелками указаны группы, соответствующие СУРЗА4, СУРЗА5, СУР17А1, СУР51А1, СУР1В1. Точки, не включённые в группы, соответствуют комплексам митохондраильных цитохромов с СУВ5В.

Можно сделать вывод, что СУВ5 образует энтальпийно-зависимые комплексы с теми СУР, по отношению к которым он играет роль аллостерического эффектора (СУРЗА4, СУРЗА5, СУР17А1). С этими результатами согласуются данные из литературы об исключительной важности электростатических взаимодействий для образования комплекса СУР с аллостерическим регулятором Ь5. Энтропийно-зависимые комплексы СУР-СУВ5 соответствуют тем цитохромам Р450, на активность которых СУВ5 не оказывает влияния. Скорее всего образование таких комплексов связано с гидрофобными взаимодействиями мембранных доменов СУР и СУВ5.

Аффинность и селективность взаимодействия СУР с СРК крысы и АйХ человека

Был выполнен биосенсорный анализ взаимодействий СУР с СРЯ и А(1Х при температуре 25°С. Полученные результаты показаны в таблице 3.

Таблица 3. Значения равновесной константы диссоциации (Кс1, мкМ) при 25°С комплексов цитохромов Р450 с адреиодоксипом и цитохром Р450 редуктазой.

Л(1Х1н1т СРИга!

СУРЗА4Ьиш 0,25±0,01 1,50±0,04

СУРЗА5Ьиш 0,55±0,03 0,70±0,04

СУР51А1Ьиш 0,45±0,03 0,30±0,05

СУР51А1са1Ь 3,5±0,3 0,020±0,001

СУР11А1Ьоу 0,010±0,001 0,31±0,02

СУР2С91шт 0,1±0,02

СУР17А1еЧ 0,01±0,003 1,8±0,06

СУР11В211ит 0,03±0,002 0,5±0,03

СУРПВИшт 0,08±0,004 0,3±0,01

СУР1В1Ьит 0,01±0,003 0,02±0,005

* - символ «-» означает отсутствие взаимодействия.

Как видно в табл. 3, все СУР образуют комплексы как с СРЯ, так и с Ас1Х. Значения К(1 всех комплексов лежат в диапазоне 0,01 - 3,5 мкМ. Для контроля возможного неспецифического белок-белкового взаимодействия вместо цитохромов Р450 в рабочий канал биосенсора инжектировали растворы альбумина и гемоглобина (как описано в разделе «Материалы и методы»). Альбумин не взаимодействовал ни с Ас1Х, ни с СРК, в то время как наблюдалось взаимодействие гемоглобина с СРИ (Кс1 порядка 8 мкМ). Это согласуется с данными других авторов о низкой избирательности редуктазы цитохромов Р450 по отношению к различным

белкам. CPR универсальна, обладает широкой специфичностью по отношению к белкам-партнёрам, что соответствует её роли поставщика электронов для всех цитохромов в эндоплазматическом ретикулюме. В её структуру заложена возможность "узнавать и обслуживать" десятки различных цитохромов. В тоже время адренодоксин поставляет электроны только нескольким митохондри&чьным цитохромам, которые требовательны к источнику электронов из-за большого разнообразия электрон-транспортных систем в митохондриях. Микросомальные цитохромы не столь требовательны к поставщикам электронов из-за их "монополизма" в микросомах.

Таким образом, можно говорить о чрезвычайно широкой специфичности (или не выраженной селективности) основных доноров электронов из микросомальной и митохондриальной монооксигеназных систем по отношению к редокс-партнёрам. Их низкая избирательность сочетается с довольно сильно различающейся аффинностью - значениия Kd для разных CYP могут отличаться на два порядка.

Определение термодинамических параметров образования комплексов CYP с CPR крысы и AdX человека

Биосенсорные исследования белок-белковых взаимодействий при разной температуре были выполнены по той же схеме, как описано выше. Из анализа зависимости Kd от температуры были рассчитаны термодинамические параметры, представленные в таблице 4 и в графическом виде на рисунках 7-9. Можно видеть, что энтропия играет важную роль в образовании комплексов адренодоксина и CPR с белками-партнёрами.

Исходя из анализа термодинамических характеристик комплексов CPR и AdX с цитохромами Р450, можно отметить разделение массива данных на две группы, в зависимости от значений -TAS и ДН. Белок-белковые комплексы из первой группы характеризуются значениями -TAS <0, АН >0 (энтропийно-зависимые комплексы), а для комплексов из второй группы типичны значения ДН <0 (энтальпийно-зависмые комплексы), а значения -TAS могут быть как положительными, так и отрицательными.

Таблица 4. Изменения свободной энергии Гиббса (ДО), энтальпии (ДН) и энтропии (-ТДБ) при образовании комплексов СУР-СРК и СУР-АсЗХ.

Пара (лиганд/аналит) AG (ккал/моль) ДН (ккал/моль) -TAS (ккал/моль)

AdXhum/CYP3A4hum -9,1±0,3 22,1±2,7 -31,2±4,7

CPRrat/CYP3A4hum -7,9±0,2 26,5±3,1 -34,4±5,3

AdXhum/C YP3 А5 hum -8,5±0,4 24,7±2,7 -33,2±4,9

CPRrat/CYP3A5hum -8,4±0,2 44,6±5,4 -53,0±7,9

AdXhum/C YP51A1 hum -8,7±0,3 33,9±4,3 -42,6±6,3

CPRrat/CYP51Alhum -8,8±0,7 26,4±2,9 -35,2±5,2

AdXhum/C YP51A1 calb -7,4±0,6 48,7±5,3 -56,2±8,4

CPRrat/CYP51A1 calb -10,4±0,8 28,6±3,3 -39,0±5,8

AdXhum/C YP17 A1 eq -10,8±0,9 12,0±1,1 -22,9±2,8

CPRrat/CYP 17Aleq -7,8±0,3 38,4±2,8 -46,2±6,5

AdXhum/CYP2C9hum - -

CPRrat/CYP2C9hum -9,3±0,5 42,3±4,4 -51,5±6,7

AdXhum/C YP IB lhum -10,8±0,8 45,9±4,8 -56,7±5,8

CPRrat/C YP 1В1 hum -10,5±0,9 39,0±4,5 -49,5±5,2

AdXhum/C YP 11A1 bov -10,8±0,7 -22,1±2,7 11,3±0,9

CPRrat/CYP 11A1 bov -8,9±0,8 49,3±6,2 -58,2±6,8

AdXhum/C YP 11 B2hum -10,3±0,5 -3,7±0,4 -6,6±0,7

CPRrat/CYP 1 lB2hum -8,6±0,4 24,5±3,7 -33,1±2,6

AdXhum/CYP 11В1 hum -9,6±0,4 -1,9±0,2 -7,8±0,8

CPRrat/CYP 1 IB lhum -8,9±0,3 17,93±2,8 -26,9±3,2

* - символ «-» означает, что взаимодействие отсутствует.

В первую группу входят энтропийно-зависимые комплексы CPR с микросомальными и митохондриальными цитохромами (рис. 7), а так же комплексы AdX с микросомальнми цитохромами (рис. 8). Значения -TAS <0 в данном случае могут быть обусловлены значительными перестройками в структуре белков во время формирования комплекса [Wesley Е., 1997, Brady GP., 1997]. Положительные значения ДН так же характерны для глубоких структурных изменений, которе могут сопровождаться разрывом солевых мостиков и водородных связей, а также десольватацией больших участков молекулярной поверхности в зоне контакта двух белков.

123456789 10

Рис. 7. Термодинамические параметры образования комплексов СРКгаЮУР.

Цифрами обозначены комплексы следующих СУР: 1 - СУРЗА4, 2 - СУРЗА5, 3 - СУР51А1Ылт, 4 - СУР51А1са1Ь, 5 - СУР17А1ея, 6 - СУР2С911ит, 7 - СУР1В1, 8 - СУР11А1Ьоу, 9 - СУРПВПшт, 10 - СУР 11 В2Ьит.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 8. Термодинамические параметры образования комплексов АёХЬиш-СУР.

Цифрами обозначены комплексы следующих СУР: I - СУРЗА4, 2 - СУРЗА5, 3 - СУР51А111ит, 4 - СУР51А1са1Ь, 5 - СУР2С9Ьит, 6 - СУР17А1ея, 7 - СУР 1В1.

Энтальпийно-зависимые комплексы митохондриальных цитохромов с АёХ, для которых он является естественным донором электронов входят во вторую группу (рис. 9). Эти комплексы образуются как за счёт уменьшения только энтальпии, так и за счёт сочетанного вклада энтальпии и энтропии. При повышении температуры от 10 до 40°С незначительно увеличивается скорость образования комплексов (ко,,) и существенно увеличивается скорость распада комплексов (к<,1г) что приводит к уменьшению аффинности с ростом температуры.

15.0

-5.0

-15.0

-25.0

■ЛЭ (ккап/мопь) ■ЛН (ккал/моль) □ -ТДЗ (ккал/моль)

Рис. 9. Термодинамические параметры образования комплексов Ас1Х1шт-СУР.

Комплексы СУР: 1 - СУР1 1А1Ьоу, 2 - СУР11В 11шт, 3 - СУР11В2Ьит.

На рис. 10. в графическом виде представлено разделение комплексов СУР-СУВ5 на группы в зависимости от термодинамических параметров их формирования. -ТДЭ (ккал/моль)

11А1-ЛН-зависимь,

mi--ТР-

11В1 11В2

ÜH&ÜS-3ae и сим ые

■ AdXhum A CPRrat

45 60

ДН (ккал/моль)

йS-зависимые

Рис. 10. Разделение комплексов CYP-CPR и CYP-AdX на группы в зависимости от значений

энтальпийной (АН) и энтропийной (-TAS) компонент.

Цветом обведена группа энтальпийно-зависимых комплексов AdX с митохондриальными цитохромами Р450. Стрелками указаны точки, соответствующие комплексам AdX с CYP11А1, CYP11В1, CYP11В2.

Таким образом, можно сделать вывод, что CPR не отличает микросомальные цитохромы от митохондриальных и образует с ними комплексы со схожими термодинамическими параметрами. В тоже время, AdX взаимодействует с митохондриальными цитохромами за счёт изменения энтальпии и демонстрирует при этом более высокую аффинность.

Выводы

1. Выполнен глубокий массовый анализ белок-белковых взаимодействий компонентов монооксигеназных систем, получены кинетические и равновесные константы, рассчитаны термодинамические параметры. Для комплексов цитохромов Р450 с белками-партнёрами наиболее характерны значения Кс1 от 0,01 до 5 мкМ.

2. Обнаружено образование комплексов СРК и СУВ5 крысы с цитохромами Р450 человека (СУРЗА4, СУРЗА5, СУР1В1), адренодоксина человека с цитохромами Р450 лошади (СУР17А1) и быка (СУР 11А1), что позволяет говорить о консервативности межмолекулярных взаимодействий между некоторыми белками-партнёрами монооксигеназных систем.

3. Обнаружено, что цитохромы СУР17А1ея, СУР11А1Ьоу, СУР] 1В1Ьиш, СУРШШит, взаимодействовали только с СУВ5Ьит, но не с СУВ5га1. Таким образом для ряда цитохромов характерна относительная видовая специфичность.

4. Показано, что если СУВ5 является аллостерическим эффектором СУР, то для таких комплексов характерны значения ДН<0 и -ТД8>0. В том случае, если СУВ5 не оказывает влияния на активность СУР, комплексы характеризуются значениями ДН>0, -ТДЬО.

5. Обнаружено, что комплексы СРЯ с микросомальными и митохондриальными цитохромами Р450 характеризуется одинаковыми Кс1. Комплексы СРЯ-СУР образуются за счёт изменения энтропии, значения ДН>0 и -ТД5<0. Адренодоксин способен различать микросомальные и митохондриальные цитохромы, взаимодействуя с митохондриальными цитохромами за счёт изменений энтальпии и энтропии (ДНО и -ТД5</>0), а с микросомальными СУР - за счёт изменения энтропии (ДН>0 и -ТДХ<0).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гнеденко О.В., А.С. Иванов, Е.О. Яблоков, С.А. Усанов, Д.В. Муха, Г.В. Сергеев, А.В. Кузиков, Н.Е. Москалева, Т.В. Булко, В.В. Шумянцева, А.И. Арчаков. «Белок-белковые взаимодействия в Р450 ЗА4 и ЗА5 системах»// Биомедицинская химия, 2014, Т.60(1), 1727.

2. Gnedenko O.V., Е.О. Yablokov, S.A. Usanov, D.V. Mukha, G.V. Sergeev, T.V. Bulko, A.V. Kuzikov, N.E. Moskaleva, V.V. Shumyantseva, A.S. Ivanov, A.I. Archakov. «SPR and electrochemical analyses of interactions between CYP3A4 or 3A5 and cytochrome Ь5.» // Chemical Physics Letters. 2014, v. 593, p. 40-44. doi: 10.1016/j.cplett.2013.12.041

3. Ershov P, Mezentsev Y, Gnedenko O, Mukha D, Yantsevich A, Britikov V, Kaluzhskiy L, Yablokov E, Molnar A, Ivanov A, Lisitsa A, Gilep A, Usanov S, Archakov A. "Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: experimental simulation and SPR validation" // Proteomics. 2012, V. 12(22), P. 3295-8. doi: 10.1002/pmic.201200135. Epub 2012 Nov 2

4. Ivanov AS, Medvedev A, Ershov P, Molnar A, Mezentsev Y, Yablokov E, Kaluzhsky L, Gnedenko O, Buneeva O, Haidukevich I, Sergeev G, Lushchyk A, Yantsevich A, Medvedeva M, Kozin S, Popov I, Novikova S, Zgoda V, Gilep A, Usanov S, Lisitsa A, Archakov A. "Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: Practical realization and further SPR validation" // Proteomics. 2014., Jul. 15, doi: 10.1002/pmic.201400117. [Epub ahead of print]

5. Калужский Л.А., Яблоков E.O., Гнеденко O.B., Мольнар А.А., Янцевич А.В., Муха Д.В., Гилеп А.А., Иванов А.С., Усанов С.А., Арчаков А.И. «Влияние низкомолекулярных ингибиторов и субстратных аналогов цитохрома Р450(51) человека на его взаимодействие с микросомальным цитохромом Ь5 человека» // Медицинский академический журнал. Приложение. Материалы II всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», 12-14 ноября 2012, Санкт-Петербург, Россия. С.269.

6. Яблоков Е.О., Гнеденко О.В. Мольнар А.А Иванов А.С. Усанов С.А. Арчаков А.И. «Молекулярное узнавание между белками в Р450-зависимых монооксигеназных системах» //Материалы IV съезда биофизиков России, 20-26 августа 2012, Нижний Новгород, Россия. С. 325.

Подписано в печать 30.10.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Типография ООО «Ай-клуб» (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39