Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В

Згода, Виктор Гаврилович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В"

на правах рукописи

Згода Виктор Гаврилович

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450 ПОДСЕМЕЙСТВА 2В

03.01.04 - биохимия

автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

москва-»* 3 окт 2013

005534045

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик

РАМН Арчаков Александр Иванович

Официальные Егоров Алексей Михайлович, доктор

оппоненты: биологических наук, профессор, академик

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства

Защита состоится 14 ноября 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу 119121, Москва, Погодинская ул., д.10, стр.8. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН. Автореферат разослан "_" июля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.010.01

РАМН, МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет, зав. лабораторией

Ярыгин Константин Никитич, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лабораторией

Сычев Дмитрий Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, профессор кафедры

кандидат химических наук

Карпова Е.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Цитохромы Р450 (CYP) являются ключевыми ферментами первой фазы метаболизма и относятся к наиболее важными катализаторам окисления лекарственных препаратов. Р450 широко распространены в природе и обнаружены во всех аэробных организмах. В настоящее время известны геномные последовательности более чем 18500 цитохромов Р450, составляющих десятки и сотни семейств и подсемейств, соответственно. Изоферменты цитохрома Р450 - представители разных семейств и подсемейств отличаются субстратной специфичностью и регуляторами их активности (ингибиторами и индукторами). В настоящее время у человека идентифицировано 57 форм цитохрома Р450 и 15 из них участвуют в метаболизме ксенобиотиков, включая 90% реакций I фазы метаболизма лекарств [Nelson et al, 2013].

Активность монооксигеназной системы в отношении того или иного лекарственного препарата определяется, главным образом, концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохрома Р450. Поэтому, индивидуальные особенности метаболизма лекарственных соединений определяются персональным профилем - концентрацией и активностью цитохромов Р450 [Арчаков и соавт., 2008].

Белки подсемейства CYP2B составляют 0,2-10% от содержания всех цитохромов Р450 в печени, при этом наблюдается высокая межиндивидуальная вариабельность концентрации данных белков [Hesse, 2004]. Согласно современным данным, активность CYP2B6 в микросомах печени человека варьирует в 80 раз [Wang et al, 2008]. Такие межиндивидуальные различия в концентрации CYP2B6 в печени и его ферментативной активности могут приводить к значительной вариабельности терапевтического действия множества лекарств, которые метаболизируются CYP2B6.

Благодаря достижениям молекулярной биологии, механизмы индукции генов, кодирующих CYP2B, изучены достаточно хорошо. Однако, концентрация белка и его активность определяются после синтеза полипептидной цепи на рибосомах. Такие посттрансляционные события, как фолдинг, модификации первичной структуры и, наконец, деградация белка

являются определяющими для реализации монооксигеназной функции Р450 [А§шаг, 2005]. Однако данные механизмы исследованы значительно хуже.

Для определения сложных, многокомпонентных изменений, которые происходят в посттрансляционной судьбе белков, необходимо использовать методические подходы, при которых возможно регистрировать сотни и тысячи белков. Одним из таких подходов является протеомика, которая позволяет идентифицировать и выявлять количественные и качественные изменения в белковом составе клеток и тканей.

В настоящей работе для изучения посттрансляционной регуляции Р450 использовался экспериментальный подход, основанный на комбинации протеомных высокопроизводительных методов и последующей верификации полученных данных с использованием модельных экспериментальных систем.

Цель работы: определение молекулярных механизмов посттрансляционной регуляции микросомальных цитохромов Р450 и взаимодействий белков монооксигеназной системы печени с клеточными компонентами, отвечающими за фолдинг, окислительную модификацию и деградацию белков на примере ферментов подсемейства СУР2В Основные задачи исследования:

1. Провести экспериментально обоснованный выбор метода протеомного анализа мембранных белков и их количественной оценки.

2. Исследовать влияние индукторов Р450 на изменение в белковом составе клеток печени.

3. Определить роль цитозольных факторов и микросомальных белков клеток печени в встраивании гема в апобелок СУР2В.

4. Исследовать молекулярные механизмы посттрансляционной окислительной модификации СУР2В.

5. Исследовать механизмы протеолитической деградации нативного и модифицированного СУР2В.

Научная новизна.

С использованием разработанного высокопроизводительного протеомного метода установлено, что введение индукторов цитохромов Р450 (фенобарбитала и 3-метилхолантрена) приводит значительному изменению белкового профиля в ходе индукции цитохрома Р450 в печени мыши.

Установлен молекулярный механизм сборки полипептидной цепи и гемовой части СУР2В в структурно- и функционально-активный фермент.

Изучены окислительные посттрансляционные изменения цитохрома Р450 и возможное влияние этих изменений на время жизни белка. Предложен механизм, по которому проходит деградация белков подсемейства цитохромов СУР2В, и показана роль определенных участков аминокислотной последовательности белка в механизме определении пути деградации. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фармакологическая индукция Р450 сопровождается увеличением содержания белковых компонентов монооксигеназной системы; шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

2. В сборке функционально активного холофермента Р450 участвуют эндогенный восстановленный глутатион и шаперон ОЯР94.

3. Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода (АФК), которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых СУР2В.

4. В реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома СУР2В с АФК приводит к химической модификации трех из четырех остатков цистеина цитохрома и образованию белковых агрегатов. Данные модификации являются сигналом для протеаз, ответственных за деградацию белков надсемейства.

5. Катаболизм СУР2В в модельных дрожжевых системах включает протеасомный либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической деградации. В дрожжах, дефицитных по вакуольным (лизосомным) ферментам скорость деградации СУР2В значительно снижается. При внесении мутаций в первичную структуру СУР2В скорость его деградации значительно увеличивалась за счет вовлечения протеасомных ферментов в этот процесс.

Научно-практическая значимость работы. Разработанные методические подходы протеомного анализа могут быть использованы в работах по поиску

маркеров заболеваний и анализу белкового состава биологических объектов. Поскольку цитохромы Р450 активно участвуют в окислении ксенобиотиков (в том числе лекарственных соединений), знание посттрансляционных молекулярных механизмов, контролирующих функцию монооксигеназной системы, может быть использовано при разработке лекарственных соединений и для оптимизации и персонализации фармакотерапии.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: 12-th International symposium on microsomes and drug oxidations (Montpellier, France, 1998); International workshop "From Sequence to function: Experimental and Bioinformatic Studies of Cytochrome P450 Superfamily" (Moscow, 2000); 12-th International Conference on Cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology (France, 2001); International Meeting on Proteome Analysis (Munchen, 2001); International Conference Genomics and Bioinformatics for Medicine (St.Peterburg-Moscow, 2002); 13-th International Conference on Cytochromes P450 (Prague, 2003); 2nd International Conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004); 14th International conference on Cytochromes P450: biophysics and bioinformatics (Dallas, USA, 2005); HUPO 3th Annual World Congress в Пекине (КНР) в 2004 г; 3-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Новосибирске (Россия) в 2006 г., HUPO 6th Annual World Congress в Сеуле (Южная Корея) в 2007 г., HUPO 7th Annual World Congress в Амстердам (Нидерланды) в 2008 г., 4-ая международная конференция «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Москве и Нижнем Новгороде (Россия) в 2008 г., НПРО 8th Annual World Congress в Торонто (Канада) в 2009 г.; HUPO 9th Annual World Congress в Сиднее (Австралия) в 2010 г., Taiwan-Russia Research Cooperation Symposium "New mass spectrometry methods in proteomics" в Гаосюне (Тайвань) в 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 научных работ в российских и иностранных научных изданиях, в том числе 46 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК, и 23 публикации в докладах научных конференций. Индекс Хирша составляет 12 по данным систем «Scopus» и «Web Of Science».

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 293 страницах печатного текста, содержит 8 таблиц и 35 рисунков.

Основное содержание работы В обзоре литературы рассмотрены методические подходы протеомного анализа и особенности анализа белков клеточных мембран. Описаны основные достижения в области протеомики белков монооксигеназной системы печени, а также количественной оценки их содержания методами масс-спектрометрии. Обсуждены вопросы активации Р450 посредством сборки апобелка с гемовой частью. Описаны данные по посттрансляционной окислительной модификации белков и влияние этих изменений на деградацию белков надсемейства Р450.

материалы и методы Материалы. Среда для культивирования дрожжей была получена в «BD Biosciences Clontech» (США). Реагенты для клонирования, ферменты рестрикции, лигазы, полимеразы приобретены в «New England BioLabs» (США). Поликлональные антитела кролика (IgG) заказаны коммерчески и получены против очищенного препарата CYP2B1 и выделены из сыворотки иммунизированных животных с использованием иммуноафинной хроматографии на Protein A-Sepharose («SigmaAldrich», США) по методике, рекомендованной производителем. Affigel-10 получали от «Bio-Rad» (США). Гелданомицин предоставлен «Drug Synthesis and Chemical Branch, Developmental Therapeutics Branch, NCI». 7-Пентоксирезоурфин и резуорфин от «Molecular Probes» (Eugene, США). Очищенный человеческий Hsp90, крысиные моноклонапьные airra-GRP94 IgG антитела и кроличьи поликлональные анти-GRP78 IgG антитела получены от «StressGen Biotechnologies» (Victoria, ВС, Канада). Мышиные и крысиные моноклональные aHTH-Hsp90 IgG антитела любезно предоставлены проф. David О. Toft (Mayo Clinic, Rochester, США) и проф. William Welch (UCSF, США), соотвественно. Очищенный GRP94 предоставлен проф. Christopher Nicchita (Duke University, Durham, США). Дрожжевые штаммы были любезно предоставлены профессором Randy Hampton (University of California, San Diego, CA).

Индукция белков микросомальной системы, выделение микросомальных фракций. Крысам (Sprague-Dawley, самцы) или мышам (Albino mice, самцы) вводили внутрибрюшинно раствор натриевой соли фенобарбитала (80 мг/кг веса) или раствора 3-метилхолантрена в кукурузном масле из расчета 50 мг/кг веса, ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным вводили изотонический раствор или масло, соответственно. Через 24 часа после последней инъекции животных забивали декапитацией. Выделенную печень перфузировали холодным (4°С) изотоническим KCl и готовили гомогенаты с использованием гомогенизатора Даунса в 2-х кратном объеме калий фосфатного буфера 0.1 М, pH 7.4. Выделение микросом и цитозольной фракции из гомогенатов использовали дифференциальное центрифугирование по методу, описанному в [Zgoda et. al., 2002].

Очищенный препарат цитохрома Р450 2В4 получали по методу (Karuzina et al. 1999). НАДФН-цитохром-Р450 редуктазу выделяли по методу Yasukuchi и Masters [Yasukuchi, Masters, 1976].

Протеомные методы анализа. Одномерный денатурирующий электрофорез. Разделение белков микросом проводили с помощью одномерного электрофореза в редуцирующих условиях в градиентном 9-16%-ном ПААГ (концентрирующий гель содержал 4% акриламида) длиной 20 см и Tris-глициновом буфере по Лэммли. Электрофорез проводили в следующих условиях: 10 мА — в концентрирующем геле, 20 мА — в разделяющем геле при водяном охлаждении камеры до 10°С.

Двумерный электрофорез фракции микросом. Перед постановкой двумерного электрофореза осадки микросом осаждали смесью метанол/хлороформом и растворяли в буфере, содержавшем 8 М мочевины, 2 М тиомочевины, 2% амфолинов (pH 3-10), 100 мМ ДТТ, 16,7% раствора (30% CHAPS + 10% NP 40) для полного растворения белков, находящихся в образце. Образцы центрифугировали при 15 000 g 15 мин. Разделение в первом направлении проводили по методу, описанному в [Zgoda et al, 2006]. После проведения разделения белков ПААГ визуализировали по методу, описанному [Shevchenko, 1996]. Полученные данные анализировались с помощью программы Mellanie II («GeneBio», Швейцария). Гидролиз и экстракцию белков микросом из геля проводили по протоколу, описанному в [Jensen, et. al., 1999].

Масс-спектрометрический анализ с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра проводили в условиях, описанных в [Zgoda et al, 2006].

Масс-спектрометрический анализ с использованием SDS-PAGE LC-ESI— MS/MS. Из одномерного геля вырезали полосы, гидролиз и экстракцию пептидов из геля проводили по протоколу, описанному в [Jensen et. al., 1999]. Обращенно-фазовую жидкостную хроматографию и тандемную масс-спектрометрию осуществляли на приборе Agilent 1100 nanoflow HPLC-Chip Cube в сочетании с Agilent 1100 ХСТ Ultra Series MSD ионной ловушкой (Agilent, США).

Обработку тандемных масс-спектров и идентификацию белков проводили с помощью программы Spectrum Mill MS Proteomics Workbench Rev A.03.03.078 (Agilent), с использованием базы данных Swiss-Prot. Были заданы следующие поисковые параметры: расщепляющий фермент - трипсин, точность определения масс моноизотопных пептидов ±200 ррш, точность определения масс в спектрах MS/MS ±0,5 Да и возможность пропуска двух сайтов расщепления. Окисление метионинов было учтено как возможная модификация пептидов. Были выбраны следующие критерии положительной идентификации: минимум два пептида, идентифицированных со счетом > 7 и суммарный счет по белку >14.

Трехмерную жидкостную хроматографию (3D-LC) проводили, используя устойчивую к нагреванию mRP-колонку как первый шаг разделения. Разделение белков проводили на хроматографе LC 1100 Agilent, используя mRP-C18 колонку (4.6 мм х 50 мм, Agilent). Разделения проводили с помощью линейного градиента ацетонитрила при 80°С. Скорость потока составляла 0,75 мл/мин, детекцию проводили по поглощению при 280 нм. Каждую фракцию белков упаривали, используя вакуумный концентратор 5301 (Eppendorf, Германия). Белки растворяли в 50 мМ гидрокарбонате аммония и обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 15 минут при 4°С. После трипсинолиза (1 мкг фермента/100 мкг белка, 37°С в течение часа, затем 2 мкг/100 мкг белка, 37°С на всю ночь) к приготовленным растворам добавляли муравьиную кислоту до конечной концентрации 1%. Затем приготовленные растворы упаривали, используя вакуумный концентратор 5301 (Eppendorf, Германия), растворяли в 0,1% муравьиной кислоте и анализировали с помощью 2D LC-MS/MS, как описано в [Zgoda et.al, 2009]

Структурное и функциональное восстановление CYP2B1 in vitro.

В экспериментах по изучению роли Hsp90 в восстановлении 2В1 для удаления балластных белков препараты микросом обрабатывали 0.075% холатом натрия [Zgoda et. al., 2002]. Гомогенаты печени или микросомы инкубировали с 50 мкМ гемином. Активность восстановленного гемином Р450 в микросомах определяли по маркерным субстратам CYP2B1: 16р-окисление тестостерона (нмоль 1бр-ОНТ/мг белка/мин) и пентокси-резоруфин-о-деметилирование (PROD) (нмоль резоруфина /мг белка/мин), как описано ранее [Zgoda et. al., 2002].

Обработка цитозоля GA-агарозой.

Гелданомицин (GA) дериватизировали и иммобилизировали на AffIgel-10 агарозе по методике, описанной ранее [Whitesell et al, 1999]. Аликвоты супернатанта инкубировали с GA-агарозой (50 ц1, 50% цитозоль, 50% агароза) на качающейся платформе при 4°С в течение 1 часа. Агарозу осаждали центрифугированием при 5000g в течение 1 мин. Аликвоты полученного супернатанта использовали для реконструкции 2В1, SDS-PAGE-электрофореза и для проведения иммуноблотинга с airm-Hsp90 IgG антителами.

Связанные с агарозой белки элюировали Лемли буфером и анализировали с использованием SDS-PAGE и окрашиванием серебрением.

Супернатант фракционировали на С18 Dynamax-100A колонке (250x4.6 мм) (Vanan, США) уравновешенной 0.1% TFA в Н20 (буфер А). Регистрацию вели на проточном спектрофотометре при длине волны 214 нм. Разделение соединений достигалось градиентом буфера Б (80% ацетонитрил в Н20, содержащий 0.1% TFA) от 0 до 70% в течение часа при потоке 1 мл/мин. Фракции собирали по 1 мл и высушивали на центрифужном испарителе. Восстановленные в 0.1 М калий фосфатном буфером (рН 7.4) хроматографические фракции использовали для исследования гемин-зависимого восстановления активности Р450. Фракции, инкубация с которыми восстанавливала активность CYP2B1, анализировали на ЯМР-спектрометре в дейтерированном хлороформе на приборе Varían Unity 400 по методике, описанной в [Correia, 1984].

Эффект GA и GSH на гемин-зависимое восстановление CYP2B1.

GA (0-200 мкМ, конечные концентрации) растворяли в DMSO или использовали только DMSO (контроль) и инкубировали с супернатантом (SN)

(15 мг белка/мл) на качающейся платформе при 4°С в течение 1 ч. Микросомы печени (10 мг белка/мл; 20 мкл) полученные от РВ-индуцированных или PB/AIA-крыс, инкубировали в присутствии или в отсутствии гемина в водяной бане при 37°С в течение 15 мин. Активность CYP2B1 после гемин-зависимого восстановления измеряли по скорости образования 1бр-гидрокситестостерона в контрольных и гемин-восстановленных образцах микросом по методике, описанной выше.

Вестерн Блот Hsp90, GRP94, GRP78, ERp29, CYP2B1.

Микросомы печени или цитозоль (5 мкг белка) полученные от РВ и PB/AIA-крыс подвергали SDS-PAGE-электрофорезу. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом электропереноса при 100V в течение 1 ч. Мембраны блокировали 3% желатином в TBS; рН 7,5 в течение 1 ч и затем инкубировали с моноклональными aHTH-Hsp90, анти-GRP94, a.wm-GRP78, анти-ERp29, анти-2В1, моно- или поликлональными антителами (первичные антитела) в TBS, содержащем 0,05% Tween 20 (TBST) и 1% желатин. После двух часов инкубации с первичными антителами нитроцеллюлозные мембраны отмывали дважды TBST и добавляли АР-конъюгированные вторичные антитела в 1% желатине в TBST. Блоты визуализировали и набором для окрашивания (Био-Рад).

Окрашенные блоты сканировали на денситометре и оценивали количественно с использованием стандартного программного обеспечения.

Мономеризацию CYP2B4 и НАДФН-цитохром-Р450 редуктазы проводили по методу Bachmanova и соавт [Bachmanova et al, 1986].

Концентрацию цитохрома Р450 и Ь5 измеряли на спектрофотометре «Hewlett Packard» 8451А (США) по дифференциальному спектру поглощения его восстановленного СО-комплекса при длинах волн 450 и 490 нм [Omura and Sato, 1964]. При расчетах использовали коэффициенты молярной экстинкции 91 и 165 мМ"1 см"1, соответственно.

Скорость реакции N-деметилирования бензфетамина в мономерной реконструированной системе измеряли по накоплению конечного продукта реакции - формальдегида [Nash, 1953]. Концентрацию перекиси водорода измеряли тиоцианатным методом [Thurman et al, 1972]. Содержание общего гема определяли пиридингемохромогеновым методом [Omura, Sato, 1964].

Содержание гема, связанного с цитохромом Р450, измеряли методом гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке BioSil Sec250 фирмы «BioRad», США. Содержание гема в элюате регистрировали с помощью спектрофотометра с проточной кюветой Waters 991 при 418 нм.

Молекулярную массу цитохрома Р450 измеряли в процессе проведения гель-фильтрации на колонке Biosil Sec250 (0,75x60 см) фирмы «BioRad» (США). Колонку уравновешивали 100 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,025% эмульген 913, и наносили на колонку 50 мкл инкубационной смеси, содержащей 3,3 мкМ цитохром Р450. Элюцию белков MPC проводили в условиях, описанных в [Згода и соавт., 1997].

Образование карбонильных групп регистрировали по методу Levine и Federici. [Levine, Federici, 1982].

Определение содержания SH-групп цистеинов проводили с использованием пиренмалеимида в качестве флюоресцирующей метки с применением метода пептидного картирования [Weltman, 1973].

Плазмиды для экспрессии CYP2B1. cDNA CYP2B1 крысы амплифицировали с использованием ПЦР и клонировали в pYES2/CT (URA-меченные, под контролем дрожжевого GAL 1-промотора) и pYcDE-2 (TRP-меченные, под контролем дрожжевого ADH1 -промотора). В результате клонирования были получены дрожжевые экспрессионные плазмиды pYES2-2В1 и pYcDE-2Bl, соответственно. Экспрессионный вектор pKKCYP2Bl(His)4, кодирующий полноразмерную последовательность гемопротеина CYP2B1 с заменами Glu2 на Ala для оптимизации экспрессии любезно предоставлены профессором J. R. Halpert (University of Texas, Galveston, TX).

Трансформация дрожжевых клеток плазмидами. Трансформацию проводили по протоколам, описанным в Gietz и Schiestl (Gietz, Schiestl, 1995). Условия ведения культуры дрожжей описаны ранее в [Murray et al., 2002].

Результаты и обсуждение

Сравнение методов протеомного анализа мембранных белков.

Основной задачей протеомнкн является инвентаризация белков, которые экспрессируются в клетке. Согласно современным представлениям, более 30% всех белков являются мембранными. Интерес исследования мембранных белков обусловлен не только их широкой представленностью в клетке, но также важностью функций, которые они выполняют. Межклеточные взаимодействия, рецепторные функции, передача сигнала от внешнего воздействия внутрь клетки - это лишь незначительный перечень функций белков мембран.

Для определения наиболее эффективного протеомного метода для анализа мембранных белков использовали препараты микросом печени. Часть препарата использовалась для проведения 20-элсктрофореза (2БЕ) и последующей идентификацией белков методом МАЬОГ-ТОР. Другая аликвота микросом использовалась для предварительного разделения белков методом БОБ-РАйЕ с последующим вырезанием полос, гидролизом белков в геле и анализом экстрагированных пептидов посредством жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЬС-МБ/МБ).

Для выполнения безгелевых протеомных исследований методом двумерной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (2Б ЬС-МБ/МБ) гидролизованные трипсином белки микросомальной фракции анализировали последовательным разделением смеси пептидов. На первом этапе разделение достигалось методом хроматографии на сильном катионнообменном носителе. На втором этапе с разделением методом обращенно-фазовой хроматографии и одновременной детекцией тандемных масс-спектров пептидов.

Для анализа методом трехмерной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЗБ ЬС-МБ/МБ) белки, соллюбилизированные из мембран, хроматографировали при 80°С на термостабильной тЯР колонке. Собранные в ходе разделения четыре белковые фракции гидролизовали трипсином и анализировали методом 2Б ЬС-МБ/МБ. Идентификацию белков проводили с использованием программного обеспечения ЗрейгатМШ со значением оценочного параметра равного 14, обеспечивающего уровень ложно-положительных идентификаций менее 0.01%. Кроме того, согласно рекомендациям комитета НЦРО, идентификация считалась достоверной, при

использовании двух и более протеотипических пептидов. Общее число белков, идентифицированных во всех экспериментах по анализу протеома микросомальной фракции печени, составило 4142. Сравнительный анализ данных, полученных при использовании всех четырех протеомных подходов, показал, что большая часть белков (3703) была идентифицирована при использовании метода 3D LC-MS/MS (табл. 1). Применение методов 2-D LC-MS, SDS-PAGE-LC-MS и 2DE позволили идентифицировать 1410, 519 и 125 белков, соответственно.

Воспроизводимость результатов имеет важное значение для сравнительной протеомики, т.к. только повторяющиеся белковые идентификации могут быть использованы для сопоставления данных. Как видно из таблицы 1, с точки зрения воспроизводимости наилучший показатель оказался у метода, основанного на 3D-LC-MS/MS, для которого абсолютное число белков, идентификация которых совпала во всех трех повторениях, составила 964, что превышает значения данного показателя у SDS-PAGE-LC-MS/MS и 2D LC MS/MS (213 и 451 белков, соответственно) (см. табл. 1).

Таблица 1. Эффективность протеомных методов анализа.

Способ Число Число белков, Число белков, идентифици- Число идентифици-

разделения идентифициро идентифи- рованных с предсказан- рованных CYP

ванных цированных в ными трансмембранными

белков трех повторах спиралями*' (доля)

каждого метода

2ш: = 25 - 1 1 14%) 2 1

si)s-p\c¡r 514 Их (27%) 15

21Ы С 1410 451 29* (21%) 16 ' ' ' 1

3D-LC 3703 964 659 (18%) 38

а) Трансмембранные спирали предсказывали посредством http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/.

При анализе мембранных фракций клетки всегда встает вопрос о способности того или иного протеомного метода идентифицировать гидрофобные белки. Поэтому следующим параметром, по которому проводилось сравнение протеомных методов, явилась их способность идентифицировать белки с трансмембранными фрагментами. Поскольку аннотации белков в доступных публичных ресурсах содержат, главным образом, данные о внутриклеточной локализации белков без указания на то, является белок трансмембранным или прикрепленным к мембранам, мы использовали методы предсказания трансмембранных фрагментов белков. Данные методы основаны на анализе первичной структуры белка и точность предсказания достигает 90-95% (http://www.cbs.dtu.dk/ 5епЛсез/ТМНММ-2.0/).

Так, наибольшая доля мембранных белков наблюдалась при использовании метода ЗОЯ-РАСЕ (табл. 1). При этом абсолютное число мембранных белков, обнаруженных при использовании этой технологии, равно 138-ми, а при применении безгелевых методов анализа 20-ЬС-М8/М8 и ЗО-ЬС-МБ/МБ, соответственно 295 и 659. Среди мембранных белков цитохромы Р450 занимают особое место вследствие важности выполняемой ими функции биотрансформации эндогенных и экзогенных субстратов. Всего в геноме мыши расшифровано 55 последовательностей белков надсемейства Р450. При этом для 46 из них показана экспрессия генов в печени. С использованием ЗБ-ЬС-МБ/МЗ-подхода удалось идентифицировать 38 изоформ Р450 или 83% от числа цитохромов Р450 печени (табл. 1).

Таким образом, наиболее информативным методом анализа сложных смесей, содержащих мембранные белки, является ЗО-ЬС-МЯ/МЯ.

Влияние индукторов Р450 на изменение белкового состава клеток печени мыши.

Как было показано выше, использование метода ЗО-ЬС-МБ/МБ предоставляет наиболее полную информацию о белках, экспрессированных в клетках печени. Протеомный анализ с использованием данного подхода проводили на девяти образцах микросом и цитозольных фракций (3 контрольных, 3 индуцированных фенобарбиталом (ФБ) и 3 индуцированных метилхолантреном (МХ)), при этом каждый из образцов являлся результатом объединения трех гомогенатов ткани печени мышей.

В ходе протеомного анализа гидролизованных трипсином фракций удалось идентифицировать 3234 и 2854 белка в микросомальной фракции и цитозоле, соответственно. Из них только белки, которые встречались во всех трех повторах, использовали для дальнейшего анализа.

По результатам общего протеомного профилирования количественная оценка может быть проведена путем непосредственного сравнения интенсивности масс-спектрометрических сигналов (площади под хроматографическими пиками). Для достоверного проведения количественного анализа белков или пептидов без применения изотопных меток необходимо использовать среднее значение интенсивностей минимум 4-х протеотипических пептидов, идентифицирующих белок [А. Копылов и соавт., 2009]. В ходе статистического анализа было выявлено 18 белков микросом и 26 белков в

цитозольной фракции, содержание которых достоверно изменялось более чем 2 раза при введении индукторов Р450. При этом 9 белков с измененным содержанием относились к белкам монооксигеназной системы печени. На рисунке 1 представлены результаты количественной оценки содержания Р450 в микросомах контрольных и индуцированных образцов. Видно, что при введении мышам ФБ наблюдалось увеличение концентрации СУР 2В10, 2В19, 2С29, 2С32, ЗА11 и ЗА13 от двух до семи раз. При использовании МХ в качестве индуктора, наблюдалось статистически значимое увеличение содержания только двух цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в 3,2 и 5 раз, соответственно. При этом для ЫАПРН-редуктазы наблюдалось двукратное увеличение концентрации в ФБ-индуцированных пробах, а для цитохрома Ь5 это увеличение было незначительно (менее 30%).

Проведенный анализ количественных изменений белков монооксигеназной системы в ходе индукции показал совпадение полученных результатов с литературными данными, что подтверждает эффективность разработанного метода количественного протеомного анализа без использования изотопных меток [Москалева и соавт., 2011].

2.0Е-02

5 1.8Е-02

л 1.6Е-02

^ 1.4Е-02

§ 1.2Е-02

о; га X X пиком 1.0Е-02

г 8.0Е-03

X 6.0Е-03

§ £ 4.0Е-03

О.

О X 2.0Е-03

О.ОЕ+ОО

Рис 1. Количественная оценка содержания Р450 в контрольных микросомах (□) и индуцированных МХ ( Ш) или ФБ (■) образцах.

Наряду с ожидаемыми результатами изменения содержания белков монооксигеназной системы, также наблюдалось значительное увеличение концентраций белков с шапероновой функцией. В таблице 2 представлены белки, которые участвуют в сворачивании белков и уровень которых

статистически значимо изменялся при введении индукторов Р450 более чем в 2 раза.

Как видно из таблицы, в ходе индукции ФБ и MX наблюдалось увеличение концентрации для пяти из шести белков шапероного ряда, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и только для одного белка - ERP57 -зарегистрировано снижение содержания. При этом наибольшее увеличение зарегистрировано для GRP-94 - 6,2 и 4,4 раза по сравнению с контролем в образцах ФБ и MX, соответственно. Для двух шапероновых белков цитоплазмы содержание изменялось разнонаправлено: HSP 90 - снижение в 2,1 раза в MX пробах, а концентрация Stress-induced-phosphoprotein 1 повышалась в 4,1 и 1,3 раза в ФБ- и МХ-образцах, соответственно.

Таблица 2. Список шапероновых белков, содержание которых изменялось при введении индукторов Р450 более чем в 2 раза.___

№ Название белка, ID Локализация ФБ/Контроль* MX/Контроль

1 Grpl70 Q9JKR6 ЭР t2.5±0.5 T2.5±0.2

2 GRP-94, Р08113 ЭР 16.2+0.15 t4.4+0.22

3 GRP-78, P20029 ЭР t2.1±0.21 11.4+0.51

4 CRP55.P14211 ЭР t2.1±0.31 11.810.04

5 Protein disulfide-isomerase P09103 ЭР t2.80±0.76 t2.02±0.01

6 ERP57 protein P27773 ЭР Тз. i+о.оз ¿0. 3+0.1

7 Heat shock protein HSP 90, PI 1499 Цитоплазма 1.1 ±0.4 4-2.1+0.4

8 Stress-induced-phosphoprotein 1 Q60864 (цит, ядро) Цитоплазма, ядро t4.1 +0.5 tl.3 ± 0.01

•Средние значения и стандартные отклонения получены по результатам 3-х независимых экспериментов

протеомного профилирования цитоплазменной фракции и теней микросом клеток печени.

Среди белков с измененной экспрессией можно выделить ряд белков, выполняющих функцию защиты клетки от окислительного стресса. Так, содержание каталазы, СОД и пероксидоксина увеличивалось более чем в 2 раза при введении индукторов. Также наблюдалось увеличение содержания белков, восстанавливающих или защищающих БН-группы белков от окисления (Таблица 3, номера 1-9), а также ряда других белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки (Таблица 3, номера 9-27).

Таким образом, с использованием разработанного протеомного ЗО ЬС-М8/М8-метода показано, что индукция Р450 ФБ-лом или МХ-ном сопровождается увеличением содержания белков 4-х групп: 1. собственно белков монооксигеназной системы;

2. шаперонов, потенциально участвующих в фолдинге белков монооксигеназной системы;

3. белков, защищающих клетку от окислительного стресса (каталаза, СОД, пероксидазы);

4. белков домашнего хозяйства, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

Таблица 3. Список белков, содержание которых изменялось более чем в 2 раза при введении индукторов Р450.

№ Название белка, ID Локализация PhB/Контроль 3-МС/Контроль

1 Catalase, Р24270 Цитоплазма Т2.4+0.6 t3.6±0.5

2 SOD I, P08228 Цитоплазма Тб±1.5 t8. 311.2

3 peroxiredoxin 6, 008709 Цитоплазма 1 Т2.4Ю.2

4 glutathione peroxidase, PI 1352 Цитоплазма Tl.7±0.5 t3.1±l.l

5 Thioredoxin 1, Q8VBT0. Цитоплазма t 1.8+0.3 t 2.110.3

б Glutathione S-Transferase, Q5RL51 Цитоплазма f2.9±0.3 t 310.60

7 Methionine sulfoxide reductase Q9JLC3 Цитоплазма t 5.1 ±0.3 4 0.110.1

8 Selenium binding protein 2 (AP56) Q63836 Цитоплазма t 2+0.3 110.12

9 Selenium binding protein 1 (SP56), P17563 Цитоплазма t 210.2 0.910.3

10 Fatty acid synthase, 089060 Цитоплазма 1±0.2 4-0.1510.03

11 Phosphoglucomutase2, B0LAB9 Цитоплазма 4- 0.3210.04 40.4910.04

12 UDP-glucose pyrophosphorylase 2, Q91ZJ5 Цитоплазма 0.17±0.06 4- 0.06+0.03

13 Enolasel,alpha non-neuron, Q5FW97 Цитоплазма 1.08+0.49 4- 0.3910.21

14 S-adenosylhomocysteine hydrolase, Q5M9P0 Цитоплазма 0.53+0.08 4- 0.36Ю.03

15 Sorbitol dehydrogenase, Q64442 Цитоплазма 4 0.38±0.01 0.5710.14

16 Glycine N-methyltransferase Q9QXF8 Цитоплазма 0.71±0.06 4- 0.5010.05?

17 esterase D/formylglutathione hydrolase; Q9R0P3 Цитоплазма t 0.42±0.03 0.27Ю.05

18 Carbonic anhydrase 3, PI6015 Цитоплазма 12.17±0.31 0.9710.50

19 Fthfd protein, Q8CIF2 Цитоплазма t 1.54±0.17 4- 0.5710.31

20 malate dehydrogenase 1, P08249 Цитоплазма 0.6310.12 0.7710.14

21 Lactoylglutathione lyase Q9CPU0 Цитоплазма 0.4910.06 4 0.1210.04

22 Fatty acid binding protein 1, liver P12710 Цитоплазма 1.1910.22 t 3.2810.9

23 Interferon-inducible GTPase, Q9QZ85 ЭР 40.510.1 110.1

24 progesterone receptor membrane component, 055022 ЭР T2.910.5 tl. 810.50

25 .lajor urinary proteins , P04938 ЭР Тб.4+1.1 Т3.9Ю.8

26 Cytosol aminopeptidase Q9CPY7 Цитоплазма t2.110.7 4 0.510. 4

27 Dpys protein Q8K.0X3 Цитоплазма 12.1+0.5 40.310.5

'Средние значения и стандартные отклонения получены по результатам 3-х независимых экспериментов протеомного профилирования цитоплазмы и теней микросом клеток печени.

Роль цитозольных факторов и мембранных белков клеток печени в встраивании гема в апобелок CYP2B.

Из представленных выше результатов следует, что увеличение синтеза белков моноксигеназной системы сопровождается увеличением концентрации целой группы белков, выполняющих шапероновую функцию и локализованных в ЭР. Поэтому можно предположить, что данные белки участвуют в фолдинге и сборке гемовой части и полипептидной цепи индуцированных Р450.

С целью проверки данной гипотезы использовали экспериментальную модельную систему обратимой инактивация цитохрома Р450.

Ранее было показано, что введение суицидного ингибитора цитохромов Р450 аллилизопропилацетамида (AIA) крысам ведет к инактивации изоформы 2В1. Кроме того, инактивированный Р450 может быть структурно и функционально восстановлен in vitro при инкубации экзогенного гемина с гомогенатами печени [G.C. Farrell, М.А. Correia, 1980]. Однако, если раствор гемина добавляли к выделенными микросомам, содержащим инактивированный CYP2B1, данного восстановления не происходило. Из этого следует, что для восстановления характерных спектральных свойств и активности белка необходимы факторы, локализованные в гомогенате печени, но отсутствующие в выделенных центрифугированием микросомах.

Таким образом, инактивация цитохрома CYP 2В1 может служить моделью для изучения механизмов фолдинга и сборки гемовой и апочасти данного фермента.

Гемин-зависимое структурное и функциональное восстановление AIA-инактивированного микросомального CYP2B1.

Разрушение гема Р450 проводили посредством внутибрюшинного введения AIA крысам, предварительно прошедших индукцию фенобарбиталом в течение 5 дней. Как видно из данных, представленных на рис. 2А, инактивация Р450 выражалась в потере 80% спектрально регистрируемого Р450 и пропорциональном снижении 1бр-тестостерон гидроксилазной (16Р-ТОН) и пентокси-резурофин О-диметилазной (PROD) активностей Р450. При инкубации инактивированных гомогенатов печени с экзогенным гемином наблюдалось восстановление 70% спектрально регистрируемых цитохромов Р450. При этом, функциональная активность Р450, измеренная с

использованием маркерных специфичных реакций, для 2В1 (16(3-ТОН и PROD) восстанавливалась полностью (рис. 2А). Кроме того, доля спектрально-восстановленного цитохрома Р450 совпадала с содержанием иммунорегистрируемой формы 2В1 апобелка микросом. Таким образом, можно предположить, что основной изоформой Р450, которая восстанавливается после внесения эндогенного гемина, является CYP2B1.

При выделении микросом из гомогенатов ткани печени и при дальнейшей их инкубации в калий-фосфатном буфере (КФБ) в присутствии 50 мкМ гемина восстановление CYP2B1 не происходило (рис. 2Б).

В случае, когда КБФ заменяли цитозольной фракцией, которую получали дифференциальным центрифугированием постмитохондриального

супернатанта, опять наблюдалось восстановление содержания Р450 и восстановление 16(3-гидроксилазной активности на 75% от значений, полученных в контрольных экспериментах (рис. 2Б). Данные факты являются доказательством того, что цитозоль содержит некий фактор(ы), который(е) участвует(ют) в гемин-зависимом восстановлении спектральных свойств и активности Р450 2В1.

А 2.5

I 2 в

; 1.5

I 1

I 06

-L

ШШ

2.5 2 1.5

0.5 0

16(5-ОНаза

16р-ОНаза

Рис. 2. Гемин-зависимое восстановление структуры и функции инактивированного А1А СУР2В1. (А) восстановление в гомогенате печени, (Б) восстановление в изолированных микросомах. (А) Гомогенаты печени контрольных или инактивированных животных инкубировали с гемином (50 мкМ). Обозначения: (О) контрольные микросомы печени; (В) инактивированные А1А-микросомы, выделенные после инкубации гомогенатов печени с 50 мкМ гемином и (И) инактивированные А1А микросомы выделенные из гомогенатов ткани. (Б) Микросомы печени контрольных или инактивированных А1А препаратов инкубировали с гемином или без гемина в БЫ или КФБ. Обозначения: (П) контрольные микросомы печени; (И) инактивированные А1А-микросомы после инкубации с супернатантом печени и 50 мкМ гемином (И) инактивированные А1А микросомы после инкубации с супернатантом без добавления гемина и (В) инактивированные А1А микросомы после инкубации с КФБ и 50 мкМ гемином. Измерения содержания Р450 (нмоль/мг белка) и 16р-ТОН активности (нмоль/мг белка/мин) измеряли по методам, представленным в МиМ. Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

"обозначает статистически достоверные различия с Р < 0:01 от значений, полученных при измерении активности СУР2В1 или содержания Р450 без добавления гемина в среду инкубации.

Роль Hsp90/GRP94 в гемин-зависимом восстановлении CYP2B1, инактивированного суицидным ингибитором.

Ранее было показано, что шаперон Hsp90 участвует в сборке апобелка и тема nNOS, тем самым активируя фермент [А. Bender et al, 1999]. Учитывая структурное сходство nNOS и Р450, мы проверили возможность участия Hsp90 в встраивании гема в апобелок СYP2B1. С этой целью использовали гелданомицин (GA) - специфичный ингибитор белков шапероной группы Hsp90 и его аналога в эндоплазматическом ретикулуме - GRP94. На рисунке 3 представлена зависимость степени восстановления А1А-инактивированного CYP2B1 от концентрации добавленного в среду инкубации GA. Как видно из рис. 3, происходит зависимое от концентрации GA ингибирование процесса восстановления 16ß-TOH активности 2В1. При этом добавление GA не влияло на 16ß-TOH активность CYP2B1 в контрольных образцах (неинактивированные микросомы). Таким образом, можно заключить, что замедление процесса восстановления инактивированного цитохрома CYP2B1 не связано с ингибированием монооксигеназной активности Р450 и указывает на возможность участия Hsp90/GRP 94 в сборке CYP2B1.

го

< I

5 ü

2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 Н О

i—*" i— О 50 100 150 200 КФБ

GA (цМ)

Рисунок 3. Ингибирующий эффект гелданомицина (GA) на процесс гемин-зависимого восстановления функции инактивированного AIA CYP2B1. Цитозоль клеток печени инкубировали с контрольными микросомами (П) или инактивированными микросомами в присутствии разных концентраций GA (ЕЕ)Дбр-ТОН активность измеряли по методике, описанной в МиМ. Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%."обозначает статистически достоверные различия с Р < 0.01 от значений, полученных при измерении активности 2В1 без добавления GA в среду инкубации.

В дальнейшем, для исследования роли Нвр90 в сборке тема и белковой части Р450 было проведено удаление Нвр90 из цитозольной фракции методом аффинной хроматографии. Для этого ОА химически сшивали с агарознами микрочастицами и инкубировали с цитозольной фракцией клеток печени. Эффективность удаления ШР90 контролировали с использованием БОБ-РАОЕ электрофореза и иммунохимического анализа Н8Р90 (рис 4). Как видно из представленного рисунка 4, двукратная последовательная инкубация аффинного сорбента эффективно удаляла большую часть Н8Р90 из цитозоля, что подтверждалось иммунохимическими исследованиями с использованием Вестерн блот с антителами против Н8Р90 (рис. 4С). При этом удаление Н8Р90 из цитозоля не оказывало заметного влияния на степень восстановления инактивированного СУР2В1 (Рис. 4В), что подвергает сомнению участие данного белка в восстановлении Р450. Другим белком, на который С А оказывает ингибирующее воздействие, является вЯР 94 - белок, прикрепленный к ЭР.

КРВ ЭИ ЭЫЛЗА вы/ад НзрЭО 12 3 4 5 6 7 (1*) (2х)

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Аффинное удаление №р90 из цитозоля клеток печени мыши и влияние цитозоля на восстановление I ¿Р-тестостерон гидроксилазной активности инактивированного А1А микросомального СУР2В1. (А) Электрофореграмма удаления №р90 из цитозольной фракции клеток печени с использованием микрочастиц Ай"^е1-10, модифицированных вА . Стандарты молекулярных масс (сверху вниз (Ша): 209, 124, 80, 49, 39, 28; полоса 1); стандарт Н5Р90 (полоса 2) интактный цитозоль (5 мкг белка; полоса 3); 1 -ая инкубация цитозоля с вА-связанными микрочастицами (5 мкг белка; полоса 4); 2-ая инкубация цитозоля с вА-связанными микрочастицами (5 мкг белка; полоса 5); НйрЭО, элюированный с микрочастиц после первой и второй инкубации с цитозолем (полосы 6 и 7, соответственно) (В) Действие интактного цитозоля и фракций, полученных после удаления ШР90 на гемин-зависимое восстановление 1 бр-ТОН функции инактивированного А1А СУР2В1. (С) Изменение содержания иммунохимически регистрируемого №р90 в интактном цитозоле (полоса 2) и после двух раундов удаления ШР90 с вА-связанными микрочастицами, соответственно (полосы 3 и 4), в микросомах (полоса 5). Полосы 1 и 6 - молекулярный стандарт с массой 101 Ша. Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%."обозначает статистически достоверные различия с Р < 0.01 от соответствующих значений полученных при измерении активности микросомального 2В1 инкубированного с гемином.

Для выявления роли СтКР94 в гемин-зависимом восстановлении активности С УР2В1 проводили исследования по определению изменения содержания ОЯР94 в ходе инактивации цитохрома Р450 2В1 суицидным ингибитором А1А. Результаты иммунохимического определения содержания ОИР94 в ходе А1А инактивации представлены на рисунке 5. Как видно из представленных данных, введение А1А крысам одновременно с инактивацией Р450 приводило к существенному увеличению содержания С11Р94 по сравнению с контрольными неинактивированными микросомами. Согласно полученным данным, иммунохимически-регистрируемое увеличение содержания ОЯР94 начиналось уже через 15 мин после введения суицидного ингибитора и достигало максимального двукратного увеличения концентрации через час после введения крысам А1А. (рис. 5Б). При этом концентрация других исследованных белков шапероновой группы в ЭР, таких как СЯР78 и ЕЯр29 не изменялась

Рис. 5. Исследование роли микросомального СЯР94 в гемин-зависимом восстановлении активности инактивированного суицидным ингибитором цитохрома СУР2В1. (А) Вестерн-блот анализ ОЯР94 в микросомах печени контрольных крыс (полоса 2), микросомах печени крыс через час после введения А1А (полоса 3), полосы 1 и 4 стандарт ОЯР94 (Б) Содержание иммунохимически детектированного вРР94 в контрольных микросомах (□) и микросомах печени крыс через час после введения А1А *Обозначает статистически достоверные различия с Р < 0.01 от соответствующих значений полученных при измерении в контрольных микросомах.

Наряду с (ЖР94, локализованным в микросомальной фракции, существует также фактор в цитозольной фракции, без которого сборка гемовой и белковой частей невозможна. С целью определения роли цитозоля в восстановлении структурных и функциональных свойств инактивированного А1А цитохрома Р450 2В1 проводили систематическое фракционирование цитозольной фракции клеток печени. При проведении фракционирования методом разделения на молекулярных мембранах с размером пор, непроницаемым для белков (> 500 Да), было показано, что активный компонент является низкомолекулярным

(Рис. 5Б)

0.81

_Н__1Ш_Iт А

СЯР94 С(ЗР78 ЕГ?р29

соединением. В дальнейшем полученная низкомолекулярная фракция анализировалась с использованием обращенно-фазовой хроматографии. Хроматограмма разделения низкомолекулярной фракции цитозоля представлена на рисунке 6А. Как видно из рисунка, в ходе разделения низкомолекулярных соединений цитозоля было выделено 5 фракций. В дальнейшем, каждая из фракций (после упаривания и восстановления в исходном объеме КФБ) инкубировалась с А1А инактивированными микросомами в присутствии гемина.

I 700

я 600

I 600

г 400

| 300

I 200

Й 100 о

¡=3 ' 06

§ 0.4

10 11 12 13 14 15 Время (мин)

БИ КРВ вБИ

фракция

Рис. 6. НРЬС фракционирование соединений низкомолекулярной фракции цитозоля клеток печени (а) и роль фракций в восстановлении 16Р тестостерон гидроксилазной активности инактивированного 2В1 (б). НРЬС фракционирование. Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

"обозначает статистически достоверные различия с Р < 0.01 от соответствующих значений полученных при измерении активности 2В1 инкубированных с КФБ или гемином.

Как видно из данных, представленных на рисунке 6Б, фракции 3 и 4 участвовали в гемин-зависимом восстановлении инактивированного СУР 2В1. Фракции, обладающие активностью в гемин-зависимом восстановлении цитохрома Р450, были выделены в препаративном режиме и подвергнуты структурному анализу с использованием протонного ЯМР. Полученные спектры показали, что фракция 3 представлена восстановленным глутатионом (С8Н), в то время как фракция 4 содержит смесь 08Н и пальмотоил-глицерида. Тестирование данных соединений на возможность участия в процессе гемин-зависимого восстановления Р450 показало, что внесение экзогенного 08 И к инактивированным микросомам в концентрации 3 мМ восстанавливало активность и спектральные свойства Р450 в той же мере, как это происходило в случае использования цитозоля (рис. 6). С другой стороны, использование 1-10 мМ пальмиотил-глицерида не оказывало восстанавливающего действия.

Полученные данные указывают на роль эндогенного 08 Н как кофактора, участвующего в сборке гемовой части и апобелка цитохрома Р450.

Дополнительная верификация роли ОЯР94 проводилась с использованием вА, но в реконструированной системе, содержащий инактивированные микросомы крысы и ОБН вместо цитозоля (рис. 7). Как видно из представленных данных, ингибирующее действие вА зависело от дозы в одинаковой мере как для микросом, восстановленных гемином в присутствии цитозоля, так и в присутствии 08Н.

Таким образом, в модельной системе было показано, что для сборки гемовой части с апобелком СУР2В1 необходимо участие минимум 2 составляющих: эндогенного восстановленного 0811 в цитозоле и ОКР94 в микросомах.

Рисунок 7. Ингибирующий эффект GA на процесс гемин-зависимого восстановления функции инактивированного ALA CYP2B1 в реконструированной системе. GSH (3 тМ) и 5 мМ гемин инкубировали с контрольными микросомами (О) или инактивированными микросомами ((Ш)) в присутствии разных концентраций GA (0-200 мкМ). Каждая точка представляет собой среднее значение минимум трех измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

Результаты, показывающие увеличение содержания GRP94 в ЭР в течение короткого времени после введения суицидного инактиватора, а также в ходе индукции CYP2B1 фенобарбиталом (более чем в 5 раз), указывают на участие этого шаперона в поддержании апобелка в конформации, позволяющей встраивание гема.

Н202-зависимая инактивация цитохрома Р450 в реконструированной монооксигеназной системе.

Как было показано выше, увеличение синтеза белков моноксигеназной системы сопровождается повышением концентрации целой группы белков, выполняющих функцию защиты клетки от активных форм кислорода (табл. 3).

100

200

КРВ

GA (ИМ)

Так, согласно протеомным данным, в ходе индукции Р450 наблюдалось увеличение содержания каталазы и супероксидисмутазы в 3 и 7 раз, соответственно. Кроме того, наблюдалось значительное увеличение концентрации глутатионпероксидазы - фермента катализирующего восстановление перекисей липидов в соответствующие спирты и восстановление пероксида водорода до воды. Это может быть обусловлено тем, что различные формы Р450 катализируют частично сопряженные монооксигеназные реакции и продуцируют перекись водорода (Н2О2), образующуюся в активном центре Р450 при распаде пероксикомплекса. При этом активные формы кислорода (АФК) являются причиной самоинактивации белка. Для выяснения молекулярного механизма окислительной модификации Р450 и роли ферментов, утилизирующих АФК, исследовали инактивацию CYP2B4 в реконструированной монооксигеназной системе (MPC), состоящей из очищенных препаратов CYP 2В4 и НАДФН-цитохром-Р450 редуктазы в присутствии неионного детергента Эмульген 913.

Как показано на рисунках 8А и Б, скорость инактивации Р450 (уменьшение пика спектрального поглощения при 450 нм) в реакции N-деметилирования бензфетамина (N-ДМБ) зависит от концентрации Р450 и редуктазы в MPC. Самую высокую скорость обесцвечивания Р450 наблюдали при молярном соотношении Р450:редуктаза равном 1:1 (рис. 8А). В данном случае содержание Р450 снижалось на 70% во время инкубации в течение первых 20 минут при 30°С. При молярном соотношении Р450:редуктаза равном их молярному соотношению в микросомах (1:0,05) инактивации проходила медленнее - почти полное обесцвечивание Р450 наблюдали только через 8 часов инкубации при 30°С (рис. 8Б). В отсутствие НАДФН обесцвечивание Р450 не превышало 10%, что говорит о том, что процесс инактивации в MPC является НАДФН-зависимой реакцией. Уменьшение содержания А450 сопровождалось потерей N-ДМБ активности и коррелировало с увеличением концентрации перекиси водорода в среде инкубации.

Для реконструированных систем с использованием молярных соотношений Р450:редуктаза 1:1 и 1:0,05 наблюдали схожие величины соотношения концентрации образованной перекиси водорода к концентрации инактивированного CYP 2В4 (рис. 8). Как видно из рисунка 8, более высокие скорости обесцвечивания Р450 при равных молярных соотношениях белков

коррелируют с повышенным образованием Н2О2, которое было приблизительно в 10 раз больше, чем образование перекиси водорода, наблюдаемое при молярном соотношении 1:0,05. Близкие уровни инактивации для обеих реконструированных систем указывают на участие Н2О2 в обесцвечивании Р450. Дополнительное доказательство того, что обесцвечивание Р450 при Ы-деметилировании бензфетамина связано с образованием Н2О2, образующейся в активном центре цитохрома, получили в эксперименте с использованием катал азы.

Рисунок 8. Снижение содержания Р450, накопление Н202 и образование формальдегида при N-деметилировании бензфетамина в MPC. Реконструированная система содержала Р450 и редукгазу в молярном соотношении 1:1 (А) и 1:0,05 (В). Снижение содержания Р450 в отсутствие (□) или в присутствии (■) НАДФН; образование Н202 в отсутствие (Д) или в присутствии (А) НАДФН; образование формальдегида (х). Результаты представляют собой средние значения для 3-5 независимых измерений, для которых SE составляла менее чем 10%. FA, формальдегид.

Как показано на рисунке 9, 50 ед./мл каталазы, добавляемой к реакционной смеси, ингибирует обесцвечивание Р450 приблизительно на 40%. При этом дальнейшее увеличение концентрации каталазы до 1000 Ед./мл не замедляло инактивацию Р450. Такая ограниченная защита действия каталазы позволяет предположить, что в реакцию обесцвечивания Р450 вовлечена Н202, образующаяся в активном центре Р450 и, следовательно, недоступная для каталазы. Предположительно, каталаза изменяет градиент концентраций Н202 между активным центром фермента и основным объемом раствора. Она расщепляет Н202 в среде, тем самым увеличивая градиент концентраций и способствуя более активной диффузии Н202 из активного центра Р450. Таким образом, снижение уровня равновесной концентрации Н202 около гема приводит к замедлению скорости обесцвечивания белка.

[P450J, цМ

3.0

2.0

1.0 0

О 2 - 4, , , 6 !

Время инкубации (ч)

Рисунок 9. Эффект каталазы на скорость инактивации Р450. Реакционная смесь (1,5 мл) содержала мономеры Р450 (3,3 мМ) и редуктазы (0,16 мМ), бензфетамин (1 мМ) и КФБ (100 мМ, рН 7,35) с 0,025% Эмульгеном 913. Реакционную смесь инициировали, добавлением 1 мМ НАДФН и инкубировали при 30°С. Снижение содержания Р450 без НАДФН (х); с 1 мМ НАДФН (□); тоже самое в присутствие 50 Ед./мл каталазы (■). Величины приведены в виде средних значений трех независимых измерений, для которых SE всегда составляла менее 10%.

Окислительная модификация гема в Р450

Спектральные измерения, проведенные в MPC, показали, что инактивация Р450 в моноокеигеназных реакциях сопровождается уменьшением интенсивности пика поглощения при 450 нм. Изменение интенсивности поглощения может быть следствием либо потери, либо разрушением гема Р450. Анализ с использованием гель-фильтрационной ВЭЖХ показал, что при окислении бензфетамина происходит потеря 90% связанного с белком гема (рис. 10А). При этом в контроле без добавления в систему НАДФН потеря связанного с Р450 гема в течение 8 часов инкубации составляла только 5%.

Для более детального исследования механизма модификации гема Р450 измеряли общее содержание гема, содержащегося в среде инкубации (рис. 10В) при помощи методики, регистрирующей гем независимо от того, связан он с белком или нет [Omura and Sato, 1964].

Было обнаружено, что снижение содержания общего гема коррелировало со снижением связанного с Р450 гема (рис. 10), что позволяет предположить, что обесцвечивание Р450 можно объяснить разрушением гема.

На основании данных, полученных в экспериментах с использованием каталазы (рис. 11В) мы предположили, что образование перекиси водорода Н2Ог, образующейся в активном центре цитохрома Р450, и перекиси водорода Н2Ог, накапливаемой в среде инкубации, играют различную роль при разрушении гема.

Рисунок 10. Снижение содержания связанного и общего гема при обесцвечивании цитохрома Р450. Реакционная смесь и условия инкубации такие же, как описано на рисунке 8. (А) Потерю связанного с Р450 гемом определяли при помощи гель-фильтрационной ВЭЖХ. Нативный Р450 (о); инкубация без НАДФН (•); инкубация в присутствие 2 мМ НАДФН (м). (В) Потерю общего гема из Р450 определяли при помощи способа с использованием пиридина-гемохромогена. Для определения общего содержания гема в разное время отбирали аликвоты реакционной смеси объемом 500 мкл, содержащей 1 мМ Р450. Инкубация без НАДФН (•); инкубация в присутствие 2 мМ НАДФН (ш). Данные на графике представляют собой средние значения трех независимых измерений, для которых БЕ всегда составляла менее 10%

Р450, Гем. % Р-150, Геч, %

Рисунок 11. Зависимость между скоростью обесцвечивания Р450 и снижением количества связанного с ферментом или общего гема в отсутствие или в присутствии каталазы. Реакционная смесь, условия инкубации и измерения содержания связанного с ферментом или общего гема описаны на рисунке 10. (А) Инкубацию проводили без каталазы. Содержание Р450 (0); снижение количества связанного с ферментом (а) или общего гема (о). (В) В присутствии каталазы (50 ед/мл). Содержание Р450 (♦); снижение количества связанного с ферментом (■) или общего гема (•). Данные представляют собой средние значения трех независимых измерений, для которых БЕ всегда составляла менее 10% измеряемой величины.

Как видно из рис. 11В, каталаза предотвращала обесцвечивание и потерю связанного Р450 гема в одинаковой степени (приблизительно на 40%). Корреляция между данными процессами в отсутствие или при наличии каталазы, указывает на то, что Н202, образующаяся в активном центре фермента, может нарушать взаимодействие между гемом и апоферментом, что приводит к высвобождению гема из фермента. Тот факт, что каталаза

полностью предотвращает разрушение общего гема, говорит о том, что гем разрушается Н2О2, накапливаемой в среде инкубации. Таким образом, представленные выше результаты доказывают, что окислительная инактивация Р450 в MPC связана с модификацией гемовой части Р450, которая включает в себя последовательно потерю и дальнейшее разрушение гема перекисью водорода.

Агрегация Р450

Уменьшение спектрального содержания Р450 во время монооксигеназной реакции сопровождается агрегацией белка, которую определяли при помощи гель-фильтрационной ВЭЖХ в неденатурирующих условиях в присутствии детергента Эмульген 913 (рис. 12). Поскольку данный детергент обладает максимумом поглощения при 276 нм и, следовательно, затрудняет регистрацию белка в области от 200 до 280 нм, измерения проводили флуорометрическим способом. Анализ ВЭЖХ показал снижение интенсивности флуоресценции нативного Р450 (пик 50 кДа) и появление высокомолекулярных агрегатов (95 кДа и более) при окислении бензфетамина в MPC. Суммарная площадь пиков для каждой хроматограммы в данном случае не менялась.

I 40

i 20

15 20

Объем элющш (мл)

Рисунок 12. Гель-фильтрационная ВЭЖХ нативного и инактивированного Р450 в неденатурирующих условиях. Аликвоты инкубационной смеси объемом 50 мкл, содержащей 3.3 мМ Р450, забирали до (о) и после инкубации в течение 8 часов при 30°С с 1 мМ НАДФН (•). Разделение белков отслеживали измеряя интенсивность флуоресценции белка модифицированного о-фталальдегидом при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания 455 нм.

Возможны два объяснения агрегации белка. Одно - это изменение физико-химических свойств инактивированного Р450 вследствие модификации аминокислотных остатков, изменение поверхностного заряда молекул Р450 и, как следствие, агрегация на основе нековалетных взаимодействия. Другой механизм может быть связан с образованием межбелковых ковалентных сшивок.

Окисление БН-групп при инактивации Р450

Пептидное картирование и измерение флуоресценции 8Н-групп, меченных пиренмалеимидом (ПМ), позволили нам определить 8Н-содержащие пептиды цитохрома Р450. На рисунке 13 показано, что четыре пика флуоресценции, соответствующие БН-содержащим пептидам, различались для нативного и инактивированного Р450 ОФ-ВЭЖХ. Пик 1 не изменялся при инактивации. Снижение пиков 2, 3, и 4 наблюдали через 3 часа и через 6 часов инкубации в присутствие НАДФН и объединенные площади данных пиков снижались приблизительно на 50% и на 80%, соответственно. Такие результаты указывают на то, что остатки цистеинов модифицируются при окислительной модификации Р450.

= 0.0

г з.о в

в 0.0 к

£з.о

ни

40 50 60 70 80 90 Время удерживания (мин)

Рисунок 13. Разделение при ОФ-ВЭЖХ пептидов после гидролиза меченного ПМ Р450. (А) контроль; (В) инкубация в течение 3 часов; (С) инкубация в течение 6 ч. Интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения 343 нм, длина волны испускания 396 нм) вН-содержащих пептидов (пики 1, 2, 3, 4) измеряли используя детектор БЫтас^.

На рисунке 14 приведена корреляция между обесцвечиванием Р450, агрегацией белка и уменьшением содержания БН-групп белка в отсутствие и в присутствии каталазы в зависимости от времени. Схожий ингибирующий эффект каталазы при данных процессах указывает на то, что перекись водорода Н202, образующаяся в результате окислительного разобщения монооксигеназных реакций, может быть вовлечена в модификацию апопротеина и его цистеинов в частности.

100 80 60 40

20 0

Рисунок 14. Сравнение скорости обесцвечивания Р450, агрегации и окисление SH-групп белка в отсутствие (А, о, о, соответственно) или в присутствии каталазы (А,*,и, соответственно). Каждая точка представляет собой среднее значение пяти измерений, для которых стандартная ошибка составляла менее 10%.

Образование ковалентных сшивок в Р450

Окислительная модификация аминокислот, таких как цистеин, гистидин, тирозин и триптофан, может приводить к конформационным изменениям в молекуле белка. Используя SDS-PAGE (рис. 15), мы обнаружили, что инактивация Р450 сопровождается образованием межмолекулярных перекрестных сшивок. Как видно на элекрофореграмме (рис. 15), реакция инактивации Р450 сопровождалась образованием продуктов белковой агрегации. При этом окраска серебрением визуализировала белковые полосы, которые по молекулярному весу соответствовали димеру и тримеру Р450. Денситометрический анализ показал, что интенсивность зарегистрированных ковалентных димеров и тримеров обратно пропорциональна исчезновению полосы мономерного Р450. При гель-фильтрационной ВЭЖХ в присутствии 0,1% SDS также обнаружены продукты, которые могут представлять собой олигомеры Р450 (450 кДа и более). Скорость образования перекрёстных сшивок в Р450 и исчезновения мономеров Р450 не коррелировала со скоростью обесцвечивания Р450, наблюдаемого спектральным методом. После 8 часов инкубации в MPC Р450 инактивировался более чем на 85%, а исчезновение полосы мономерного белка составляло только 38%. Ингибирующее действие каталазы на образование перекрёстных сшивок указывает на то, что в данный процесс вовлечена перекись водорода. Тем не менее, H202 только частично может обуславливать образование перекрёстных сшивок, поскольку мы не обнаружили корреляции между полимеризацией и скоростью обесцвечивания

Р450. Образование ковалентносшитых агрегатов молекул Р450 было более медленным по сравнению с обесцвечиванием гемопротеина, что говорит о вторичной природе данного процесса, позволяя предположить, что неспецифические радикальные реакции могут вносить вклад в модификацию апопротеина.

330> 220>

94>

67> б0> 43>

30>

20.1> 18.5>

S ii

Рисунок 15. SDS-PAGE нативного и инактивированного Р450 в различные временные интервалы инкубации в MPC. Для анализа отбирали аликвоты реакционной смеси, содержащей 10-20 мг Р450, обрабатывали буфером Лемли и инкубировали при 90°С в течение 2 мин. Белковые стандарты Я) кД| представлены на электрофорезе в двух ¡мпшшср) крайних дорожках. Контроль, инкубация в MPC течение 2 ч., в течение 4 ч.; в течение 6 ч.; в течение 8 ч., дорожки 1-5, соответственно. Уменьшение полоски для мономера Р450 на дороже 5 составляло 40%.

|<178кДя ! (трпмер)

94кДа (димер)

т» ка»

(флаво-протеин)

шт

Образование карбонильных групп в Р450 в ходе инактивации

Доказательством участия гидроксильных радикалов в ковалентной модификации Р450 служит образование карбонильных групп. В своих работах 81асктап показал, что карбонильные модификации белка обусловлены их окислением с участием металлов с переменной валентностью ^асктап, 1993]. Железо гема может катализировать превращение перекиси водорода в свободные гидроксильные радикалы в реакции Фентона. Радикалы «ОН чрезвычайно реакционны и могут вызывать образование межмолекулярных перекрёстных сшивок в результате окисления аминокислотных остатков. Как показано на рисунке 16, содержание карбонильных групп в Р450 через 6 часов инкубации было больше (кривая Ь, пик 2), чем в контроле (кривая а, пик 1). При этом, наиболее значимое увеличение наблюдали в высокомолекулярной фракции белка (> 100 кДа). Каталаза снижала образование карбонильных групп на 35% (кривая с, пик 3), позволяя предположить, что перекись водорода может инициировать окислительные реакции свободных радикалов, участвующих в модификации аминокислот.

Рисунок 16. Сравнение содержания кабронильных групп в нативном и инактивированном Р450. Инкубацию проводили при 30°С в течение 8 часов в отсутствие или в присутствии каталазы (50 ед/мл). Образцы (100 мкл) забирали и обрабатывали 2% 2,4-динитрофенил-гидразином в течение 40 мин при 30°С. Контроль (кривая а, пик 1); инкубация в течение 8 часов без каталазы (кривая Ь, пик 2); инкубация в течение 8 часов с каталазой (кривая с, пик 3).

>100 kDa

10 11 12 13 14 15 О&ъем элюции (мл)

На основании приведенных в данном разделе данных мы предположили следующий механизм деградации цитохрома Р450 при монооксигеназных реакциях. Инактивация Р450 в основном происходит из-за перекиси водорода Н202, образующейся непосредственно в активном центре фермента. Перекись водорода модифицирует некоторые аминокислотные остатки, включая Cys 436, SH группа которого является коаксиальным лигандом железа гема. Окисление данного остатка вызывает выход гема из цитохрома Р450. В результате потери гема и окислительной модификации аминокислотных остатков изменяется конформация белка. Именно эти изменения цитохрома Р450, по нашему мнению, ответственны за агрегацию белка, за счет ионных и гидрофобных взаимодействий.

Низкая скорость образования межмолекулярных сшивок между агрегатами указывает на вторичность этого процесса. Данные, полученные нами при исследовании полимеризации в присутствии каталазы, которая ингибирует этот процесс, указывает на вовлеченность перекиси водорода в образование межмолекулярных сшивок. Вероятно, ведущую роль в этом процессе играют высокореакционные гидроксильные радикалы, образующиеся при распаде перекиси водорода в реакции Фентона при участии ионов железа, освобождающихся при распаде гема. Одним из показателей участия гидроксильных радикалов в модификации апофермента Р450 является образование карбонильных групп в модифицированных при окислении белках [Tavares et al, 2012].

Известно, что окислительная модификация белков может служить сигналом для эндогенных протеаз к деградации модифицированных белков. Таким

образом, окислительная модификация Р450 в ходе несопряжённых окислительно-восстановительных реакций может представлять собой начальную стадию в его деградации в клетке [Davies, 2001].

Протеолитическая деградация нативного и модифицированного CYP2B.

Для определения механизмов деградации Р450 монооксигеназной системы печени мы использовали штаммы Saccharomyces cerevisiae, дефицитные по генам протеасомного и вакуольного пути. Данная модельная система использовалась ранее для изучения деградации белков, ассоциированных с ЭР, но отличных от цитохромов Р450 [Kostova и Wolf, 2003].

Учитывая высокую эволюционную консервативность между системами деградации дрожжей и млекопитающих и наличие генетически охарактеризованных штаммов S. cerevisiae, дефектных по вакуольному или Ub-зависимому протеасомному пути, данная модель была использована для изучения молекулярных механизмов деградации CYP 2В1. Исследование роли системы деградации UBC/HRD в гидролизе CYP2B1.

Основной задачей исследования было определение молекулярных механизмов деградации CYP2B и количественная оценка данного процесса с использованием штаммов дрожжей с дефектными (отсутствующими) системами деградации в сравнении с уровнем деградации того же белка в диком типе дрожжей. Роль связанного с ЭР Ub-конъюгирующего фермента ЦЪсбр или Ubc7p или обоих этих ферментов в деградации CYP2B1 исследовали с использованием pYcDE-2Bl экспрессионного вектора в дрожжевых штаммах ubcöA, ubc7A и ubc6_/ubc7A, дефицитных по одному или обоим ферментам протеасомного пути деградации белков. Во время стационарной фазы роста культуры не наблюдалось статистически достоверных изменений содержания CYP2B1 в указанных выше трансфецированных штаммах по сравнению с контрольным штаммом (wt S. cerevisiae), в котором все системы деградации белков находятся в рабочем состоянии (рис. 17).

Следовательно, деградация CYP2B1 проходит по протеолитическому пути, не связанному ни с одним из двух известных сегодня Ub-зависимых путей мембранных белков. Аналогичный экспрессионный анализ проводился на контрольных (wt) и штаммах дрожжей, дефицитных по второму из возможных

путей протеолической деградации, включающий гены кгс12-1, кгс11к и кгс13Д. При этом иммуноферментный анализ микросомального белка также не выявил различий в скорости протеолитического расщепления СУР2В1. Полученные результаты указывают на отсутствие взаимосвязи протеолитического метаболизма СУР2В1 с Нгс12р белками и, соответственно, с 268 протеасомой.

СУР2В1 100

лог стац лог стаи лог стац пог стаи

иЬсУй иЬс6й/иЬс7Д

Рис. 17. Протеолитическая деградация СУР2В1 в контрольном штамме Ш 5. сегетйюе и в штаммах дрожжей, дефицитных по убиквитин-конъюгирующим белкам. Штаммы дрожжей, трансформированные экспрессионным вектором СУР2В1 (рУсОЕ/2В1) или пустым вектором (рУсВЕ-2; данные не представлены) растили при 30°С в ББ среде с соответствующими добавками для селекции. Клетки собирали центрифугированием на ранней фазе логарифмического (ОП <1.0 при 600 нм) или на поздней стадии (20-24 ч после достижения 0п=0.5 при 600 нм). Полученный из этих клеток микросомальный белок анализировали методом Вестерн Блот используя анти-СУР2В1 антитела (верхняя панель рисунка) На нижней панели представлены относительные величины денсиметрирования иммуноблотов белка выделенного из клеток поздней стадии по отношению к клеткам ранней стадии. Представленные значения выражены в виде средних ±8.Б., полученные по крайней мере в трех независимых экспериментах.

Исследование роли РЕР4 генов в протеолитической деградации СУР2В1

Экспрессионный анализ рУЕ82-2В1 выявил значительное замедление уровня деградации СУР2В1 в рер4& штамме по сравнению с контрольным штаммом, содержащим нормальный ген Рер4, участвующий в вакуолярной протеолитической деградации данного цитохрома (рис. 18). Как видно из представленных данных, в культуре рер4Ь. в стационарной фазе роста наблюдалась значительное (более пяти раз) увеличение содержания С^УР2В1 по сравнению с диким штаммом (Рис. 18).

Sief wt рвр4Л

i-1 I-1

wt рер4Д

Генотип дрожжей

Рис 18. Протеолитическая деградация CYP2B1 в контрольном штамме wt S. cerevisiae и в штаммах дрожжей, дефицитных по рер4& белкам. Детальное описание эксперимента см. в подписях Рис. 17. Значения выражены в виде средних ±S.D. полученные не менее чем в трех независимых экспериментах. "Статистически достоверное различие (р<0.01).

Полученные данные указывают на то, что вакуолярный путь деградации является основным для CYP2B1, эксперссированного в дрожжах. Учитывая высокую гомологию между вакуолярными протеазами дрожжей и лизосомальными протеолитическими ферментами, можно предположить, что и в клетках млекопитающих деградация Р450 проходит по тому же метаболическому пути.

CYP2B1-3A4CT деградация в дрожжах.

Как было показано выше, цитохром CYP2B1 проходит протеолитическую деградацию по лизосомальному метаболическому пути, что отличает данную изоформу от цитохрома CYP3A4, который преимущественно гидролизуется с участием протеасомальной системы [Murray and Correia, 2001]. Такие различия в молекулярных механизмах деградации мембранных CYP2B1 и CYP3A4 подразумевают наличие структурных или молекулярных детерминант, которые определяют протеолитический путь деградации белков. До настоящего времени такие детерминанты не определены и, теоретически, могут быть локализованы на любом участке молекулы Р450.

Согласно представлениям о структуре микросомальных Р450 N-концевая последовательность белка является трансмембранным фрагментом и менее

доступна для протеаз по сравнению с С-концевым фрагментом, экспонированным в цитозоль клетки (Williams et al., 2004; Yano et al., 2004). Поэтому мы исследовали роль С-концевых аминокислотных остатков CYP3A4 в определении гидролитического пути деградации. Для этого с использованием молекулярно-биологических подходов была разработана химерная конструкция белка, включающая полноразмерный CYP2B1, к С-концевому участку которого добавили семь С-концевых остатков CYP3A4 (CYP2B1-3A4 СТ).

Генотип дрожжей

рер4Д

hrd2-1 Генотип дрожжей

Рис 19. Протеолитическая деградация СУР2В1-ЗА4СТ в контрольном штамме 5. Сетеуише, в штаммах дрожжей, дефицитных по рер4-белкам (левая панель) и в штаммах дрожжей, дефицитных по /ггс/2-7 белкам (правая панель). Значения выражены в виде средних ±8.0., полученные не менее чем в трех независимых экспериментах.

На первом этапе проводили определение кинетики протеолитической деградации СУР2В1-ЗА4СТ в штаммах дрожжей, дефицитных по рер4 ферменту (рис. 19). Из представленных данных видно, что в отличие от немодифицированного СУР2В1, не наблюдалось ожидаемого замедления деградации химерного белка С¥Р2В1-ЗА4СТ в культуре в рер4А дефицитных штаммах дрожжей. Эти данные означают, что химерный СУР2В1-ЗА4СТ больше не является субстратом для вакуолярных гидролаз и его деградация проходит по другому метаболическому пути. При изучении роли кг(12-1 на уровень протеолитического расщепления химеры СУР2В1-ЗА4СТ было зарегистрировано статистически значимое двукратное увеличение содержания

химерного цитохрома в поздней стационарной фазе роста клеток по сравнению с аналогичными клетками контрольных дрожжей (рис 19).

Полученные данные указывают на то, что введение гептапептида в С-концевую последовательность CYP3A4 достаточно для изменения молекулярного пути протеолитической деградации.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что за деградацию нативного CYP2B1 в S. cerevisiae и в клетках млекопитающих ответственна протеолитическая система лизосомальных ферментов. Кроме того, путь гидролитического метаболизма CYP2B1 может быть изменен на убиквитин-зависимый при модификации первичной структуры белка.

Заключение

Протеомный анализ изменения содержания белков под воздействием индукторов Р450 показал, что одновременно с индукцией гемопротеинов наблюдается сопряженное увеличение концентраций шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

На рис. 20 представлена возможная схема участия этих белков в встраивании гема в апофермент, окислительной модификации аминокислотных остатков и, наконец, деградации белка.

Как видно из схемы, потеря гема цитохромом Р450 происходит при окислении Cys436 CYP2B перекисью водорода, образующейся в активном центре в ходе разобщения монооксигеназной реакции или в ходе окисления суицидного субстрата ALA. Сульфоксидные группы цистеинов могут быть восстановлены при участи эндогенного глутатиона. Однако, одного восстановления цистеина недостаточно для сборки гема и апофермента. Очевидно, что только в комплексе с GRP94 у CYP2B возникает конформация, при которой апобелок способен принять гем и восстановить характерные для Р450 спектральные и функциональные свойства. Совместная индукция цитохромов и GRP94, а также некоторых других шаперонов позволяет предположить участие этой группы белков не только в восстановлении инактивированной формы CYP2B, но также и в фолдинге белка в ходе его синтеза.

Протеомные данные об увеличении в ходе индукции концентрации каталазы и других ферментов, участвующих в утилизации АФК, говорят о защитных реакциях клетки в ответ на окислительный стресс. Такая реакция клетки позволяет снизить уровень инактивации Р450, происходящей из-за перекиси водорода, образующейся непосредственно в активном центре фермента. В результате потери гема и окислительной модификации аминокислотных остатков изменяется конформация гемопротеина. Именно эти изменения цитохрома Р450, по нашему мнению, ответственны за агрегацию белка, за счет ионных и гидрофобных взаимодействий.

Низкая скорость образования межмолекулярных сшивок между агрегатами указывает на вторичность этого процесса. Данные, полученные нами при исследовании полимеризации в присутствии каталазы, которая ингибирует этот процесс, указывают на вовлеченность перекиси водорода в образование межмолекулярных сшивок. Вероятно, ведущую роль в этом процессе играют высоко реакционные гидроксильные радикалы, образующиеся при распаде перекиси водорода в реакции Фентона при участии ионов железа, освобождающихся при распаде гема. Одним из показателей участия гидроксильных радикалов в модификации апофермента Р450 является образование карбонильных групп в модифицированных белках [Skarydova, Wsol, 2011]

Окислительная модификация белков является сигналом для эндогенных протеаз к деградации модифицированных белков [A. Pickering and К.. Davies, 2012]. При этом предполагается, что основную роль в катаболическом гидролизе CYP2B играют ферменты лизосомальной системы, а при модификации первичной структуры CYP2B скорость деградации белка увеличивается за счет участия протеасомных белков.

н,о

Продукты разрушения гема. Образование "ОН радикалов в реакции Фентона

Эндогенный вБН Восстановление 811-групп цистеинов

Нашивная конформация

Деградация по лизосомальному пути

Деградация по иВСпути

к (О

ю о

Ш сч о ш

■ч-

св

о Л X о н

Я К 5 Я

К Ч

а «

о я

X о я

я «

ч о

я «

и о с

ей

<и X

(Ч И

я 'а & £

9 «

я рц

<и

выводы

1. Разработанный метод протеомного анализа, основанный на ЗБ фракционировании белков и пептидов с последующим тандемным масс-спектрометрическим анализом, позволяет идентифицировать более 3700 белков в одном эксперименте.

2. Индукция цитохромов Р450 фенобарбиталом или метилхолантреном параллельно с увеличением содержания белковых компонентов монооксигеназной системы сопровождается индукцией: шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

3. В формировании функционального цитохрома Р450 участвуют эндогенный низкомолекулярный фактор (идентифицированный как восстановленный глутатион) и шаперон ОЯР94, способствующие связывании гема апоцитохромом.

4. Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции фенобарбиталом или метилхолантреном является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода, которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых СУР2В.

5. При отсутствии каталазы в реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома СУР2В с АФК приводит к химической модификации 8Н-групп трех из четырех остатков цистеина цитохрома, образованию карбонильных групп, нековалентных белковых агрегатов, с последующим формированием межмолекулярных ковалентных сшивок СУР2В. Данные модификации служат сигналом для протеолитической деградации этого цитохрома.

6. Катаболизм СУР2В в модельных дрожжевых системах, включает протеасомный либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической деградации. Анализ скорости деградации в дрожжах, дефицитных по лизосомальным ферментам по сравнению с нативными штаммами, предполагает основную роль лизосомальной протеазы Рер4 в деградации СУР 2В1. При внесении мутаций в первичную структуру СУР2В скорость его деградации значительно увеличивалось за счет вовлечения протеасомных ферментов в этот процесс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Згода В.Г., Карузина И.И., Никитюк О.В., Арчаков А.И. Модификация апофермента цитохрома Р450 в процессе его окислительной самоинактивации в монооксигеназной реконструированной системе // Вопросы медицинской химии. 1996. Т. 42, № 3. С.203-210.

2. Згода В.Г., Карузина И.И., Арчаков А.И. Самоинактивация цитохрома Р-450 2В4 в ходе каталитического цикла в монооксигеназной реконструированной системе // Вопросы медицинской химии. 1997. Т. 43(4). С.217-225.

3. Арчаков А.И., Згода В.Г., Карузина И.И. Окислительная модификация цитохрома Р450 и других макромолекул в процессе их обновления // Вопросы медицинской химии. 1998. Т. 44, №1. С.3-27.

4. Archakov A.I., Lisitsa A.V., Zgoda V.G., Ivanova M.S., Koymans L. Clusterization of P450 superfamily using the objective pair alignment method and the UPGMA program // Journal of Molecular Modeling . 1998. V. 4, №7. P.234-238

5. Karuzina I.I., Zgoda V.G., Kuznetsova G.P., Samenkova N.F., Archakov A.I. Heme and apoprotein modification of cytochrome P450 2B4 during its oxidative inactivation in monooxygenase reconstituted system // Free Radic Biol Med. 1999. V. 26(5-6). P.620-632.

6. Zgoda V.G., Arison В., Mkrtchian S., Ingelman-Sundberg M., Correia M.A. Hemin-mediated restoration of allylisopropylacetamide-inactivated CYP2B1: a role for glutathione and GRP94 in the heme-protein assembly // Arch Biochem Biophys - 2002. V. 408(1). P.58-68.

7. Archakov A.I., Karuzina I.I., Petushkova N.A., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. Production of carbon monoxide by cytochrome P450 during iron-dependent lipid peroxidation // Toxicol In Vitro. 2002. V.16(l). P.l-10.

8. Murray B.P., Zgoda V.G., Correia M.A. Native CYP2C11: heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae reveals a role for vacuolar proteases rather than the proteasome system in the degradation of this endoplasmic reticulum protein // Mol Pharmacol. 2002. V. 61(5). P.l 146-1153.

9. Xue L., Zgoda V.G., Arison В., Correia M.A. Structure-function relationships of rat liver CYP3A9 to its human liver orthologs: site-directed active site mutagenesis to a progesterone dihydroxylase // Arch Biochem Biophys. 2003. V. 409(1). P.l 13-126.

10. Арчаков А.И., Канаева И.П., Петушкова H.A., Згода В.Г., Лисица А.В., Карузина И.И. Создание протеомных карт белков микросом клеток печени и лимфоцитов крови мышей с целью разработки новых диагностических тестов // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003. Т. 7, №9. С.179-181.

П.Хаитов Р.М, Алексеев Л.П., Арчаков А.И., Говорун В.М., Згода В.Г., Топтыгин А.Ю., Тихонова О.В., Хаитов М.Р., Ульянова Л.И. Протеомный анализ иммунокомпетентных клеток человека. Протеомный анализ активированных Т-лимфоцитов человека // Иммунология. 2003. Т. 24, №5. С.276-281.

12.Шавкунов А.С., Лазарев В.Н., Згода В.Г., Говорун В.М., Леви П., Янссен П., Арчаков А.И. Экспрессия гена цитохрома CYP51 Mycobacterium tuberculosis в Escherichia coli // Биомедицинская химия. 2003. Т. 49, №2. С.145-152.

13.Канаева И.П., Петушкова Н.А., Лохов П.Г., Згода В.Г., Карузина И.И., Лисица А.В., Арчаков А.И. Исследование микросом клеток печени мыши методами протеомного анализа // Биомедицинская химия. 2004. Т.50, №4. С.367-375.

14.Петушкова Н.А., Канаева И.П., Шереметьева Г.Ф., Згода В.Г., Лохов П.Г., Лисица А.В., Карузина И.И.,Арчаков А.И. Использование протеомных технологий для выявления и идентификации цитохромов Р450 микросом клеток печени человека // Физиология и патология иммунной системы. 2005. Т. 9, №5. С.11-17.

15.Liao М., Zgoda V.G., Murray В.Р., Correia М.А. Vacuolar degradation of rat liver CYP2B1 in Saccharomyces cerevisiae: further validation of the yeast model and structural implications for the degradation of mammalian endoplasmic reticulum P450 proteins // Mol Pharmacol. 2005. V. 67(5). P. 1460-1469.

16.Kanaeva I.P., Petushkova N.A., Lisitsa A.V., Lokhov P.G., Zgoda V.G., Karuzina I.I., Archakov A.I. Proteomic and biochemical analysis of the mouse liver microsomes // Toxicol In Vitro. 2005. V. 19(6). P.805-812.

17. Petushkova N.A., Kanaeva I.P., Lisitsa A.V., Sheremetyeva G.F., Zgoda V.G., Samenkova N.F., Karuzina I.I., Archakov A.I. Characterization of human liver cytochromes P450 by combining the biochemical and proteomic approaches // Toxicol In Vitro. 2006. V.20(6). P.966-974.

18. Zgoda V., Tikhonova O., Viglinskaya A., Serebriakova M., Lisitsa A., Archakov A. Proteomic profiles of induced hepatotoxicity at the subcellular level // Proteomics -2006. V. 6(16). P.4662-4670.

19. Filatov A.V., Krotov G.I., Zgoda V.G., Volkov Y. Fluorescent immunoprecipitation analysis of cell surface proteins: a methodology compatible with mass-spectrometry // J Immunol Methods. 2007. V. 319(1-2). P.21-33.

20. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // Proteomics. 2007. V. 7(1). P.4-9.

21.Петушкова H.A., Лисица A.B., Карузина И.И., Згода В.Г., Шереметьева Г.Ф., Саменкова Н.Ф., Никитин И.П., Сахарова Т.А., Копылов А.Т., Арчаков А.И. Идентификация цитохромов Р450 микросом клеток печени человека с помощью масс-спектрометрии // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53, №4. С.400-411.

22. Крутикова М.П., Кротов Г.И., Згода В.Г., Филатов А.В. Изучение липидных рафтов методом гельфильтрации с предварительным окрашиванием флуоресцентно-меченными антителами // Биологические мембраны. 2007. Т. 24, №4. С.323-332.

23.Кротов Г.И., Крутикова М.П., Згода В.Г., Филатов А.В. Профилирование белков рецепторного комплекса молекулы CD4 // Биохимия. 2007. Т.72, №11. С.1216-1224.

24. Копылов А.Т., Згода В.Г. Количественные методы в протеомике // Биомедицинская химия. 2007. Т.53, №6. С.613-643.

25. Archakov A., Ivanov Y., Lisitsa A., Zgoda V. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins // Proteomics. 2009. V. 9(5). P.1326-1343.

26. Лисица A.B., Петушкова H.A., Никитин И.П., Згода В.Г., Карузина И.И., Мошковский С.А., Ларина О.В., Скипенко О.Г., Полищук Л.О., Тиле Г., Арчаков А.И. Одномерное протеомное картирование цитохромов Р450 печени человека // Биохимия. 2009. Т.74, №2. С.153-161.

27. Crumeyrolle-Arias М., Buneeva О., Zgoda V., Kopylov A., Cardona A., Tournaire М.С., Pozdnev V., Glover V., Medvedev A. Isatin binding proteins in rat brain: in situ imaging, quantitative characterization of specific [3H] isatin binding, and proteomic profiling // J Neurosci Res. 2009. V. 87(12). P.2763-2772.

28. Копылов A.T., Згода В.Г., Арчаков А.И. Количественный масс-спектрометрический анализ содержания белков в биологических пробах без использования изотопных меток // Биомедицинская химия. 2009. Т.55, №2. С.125-139.

29. Иванов Ю.Д., Иванов А.В., Кайшева А.Л., Згода В.Г., Усанов С.А., Уа Уи Бон Г., Арчаков А.И. Продуктивные и непродуктивные комплексы в цитохром Р450-содержащих системах // Биомедицинская химия. 2009. Т.55, №3. С.310-330.

30. Zgoda V.G., Moshkovskii S.A., Ponomarenko Е.А., Andreewski T.V., Kopylov A.T., Tikhonova O.V., Melnik S.A., Lisitsa A.V., Archakov A.I. Proteomics of mouse liver microsomes: performance of different protein separation workflows for LC-MS/MS // Proteomics. 2009. V. 9(16). P.4102-4105.

31. Lisitsa A.V., Petushkova N.A., Thiele H., Moshkovskii S.A., Zgoda V.G., Karuzina I.I., Chernobrovkin A.L., Skipenko O.G., Archakov A.I. Application of slicing of one-dimensional gels with subsequent slice-by-slice mass spectrometry for the proteomic profiling of human liver cytochromes P450 // J Proteome Res. 2010. V. 9(1). P.95-103.

32. Buneeva O., Gnedenko O., Zgoda V., Kopylov A., Glover V., Ivanov A., Medvedev A., Archakov A. Isatin-binding proteins of rat and mouse brain: proteomic identification and optical biosensor validation//Proteomics. 2010. V. 10(1). P.23-37.

33.Кайшева А.Л., Иванов Ю.Д., Згода В.Г., Французов П.А., Плешакова Т.О., Крохин Н.В., Зиборов B.C., Арчаков А.И. Визуализация и идентификация вирусных частиц гепатита с при помощи атомно-силовой микроскопии, сопряженной cMS/MS анализом // Биомедицинская химия. 2010. Т.56, №1. С. 26-39.

34. Иванов А.В., Копылов А.Т., Згода В.Г., Торопыгин И.Ю., Хряпова Е.В., Иванов Ю.Д. Масс-спектрометрическая идентификация сайтов взаимодействия цитохрома Р450 2в4 с NADPH:uhtoxpom р450 редуктазой // Биомедицинская химия. 2010. Т.56, №1. С.40-54.

35. Иванов А.С., Згода В.Г., Арчаков А.И. Технологии белковой интерактомики // Биоорганическая химия. 2011. Т.37, №1. С.8-21.

36. Москалева Н.Е., Згода В.Г., Арчаков А.И. Масс-спектрометрическое определение содержания цитохромов Р450 и их ферментативной активности // Биоорганическая химия. 2011. Т.37, №2. С.149-164.

37.Medvedev A., Kopylov A., Buneeva O., Zgoda V., Archakov A. Affinity-based proteomic profiling: problems and achievements // Proteomics. 2012. V.12(4-5). P. 621637.

38.Тананова O.H., Арианова E.A., Гмошинский И.В., Аксенов И.В., Згода В.Г., Хотимченко С.А. Влияние наночастиц диоксида титана на белковый профиль микросом печени крыс // Вопросы питания. 2012. Т.81, №2. С.18-22.

39. Buneeva О.A., Medvedeva M.V., Kopylov А.Т., Zgoda V.G., Medvedev A.E. Use of biotinylated ubiquitin for analysis of rat brain mitochondrial proteome and interactome // Int JMolSci.2012. V. 13(9). P.l 1593-11609.

40.Бунеева О.А., Копылов A.T., Тихонова O.B., Згода В.Г., Медведев А.Е., Арчаков

A.И. Влияние аффинного сорбента на протеомное профилирование изатинсвязывающих белков мозга мыши // Биохимия. 2012. Т.77, №11. С.1326-1338.

41. Archakov A., Zgoda V., Kopylov A., Naryzhny S., Chernobrovkin A., Ponomarenko E., Lisitsa A. Chromosome-centric approach to overcoming bottlenecks in the Human Proteome Project // Expert Rev Proteomics. 2012. V. 9(6). P.667-676.

42.Федченко В.И., Бунеева O.A., Копылов A.T., Калошин А.А., Аксенова JI.H., Згода

B.Г., Медведев А.Е. Масс спектрометрическая детекция мономерной реналазы в моче человека//Биомедицинская химия. 2012. Т.58, №5. С.599-607.

43. Москалева Н.Е., Згода В.Г. Современные методы анализа цитохромов Р450 // Биомедицинская химия. 2012. Т.58, №6. С.617-634.

44. Ivanov Y.D., Bukharina N.S., Frantsuzov Р.А., Pleshakova Т.О., Kanashenko S.L., Medvedeva N.V., Argentova V.V., Zgoda V.G., Munro A.W., Archakov A.I. AFM study of cytochrome CYP102A1 oligomeric state // Soft Matter. 2012. V.8. P.4602-4608.

45. Zgoda V.G., Kopylov A.T., Tikhonova O.V., Moisa A.A., Pyndyk N.V., Farafonova Т.Е., Novikova S.E., Lisitsa A.V., Ponomarenko E.A., Poverennaya E.V., Radko S.P., Khmeleva S.A., Kurbatov L.K., Filimonov A.D., Bogolyubova N.A., Ilgisonis E.V., Chernobrovkin A.L., Ivanov A.S., Medvedev A.E., Mezentsev Y.V., Moshkovskii S.A., Naryzhny S.N., Ilina E.N., Kostijukova E.S., Alexeev D.G., Tyakht A.V., Govorun V.M., Archakov A.I. Chromosome 18 transcriptome profiling and targeted proteome mapping in depleted plasma, liver tissue and HepG2 cells // J Proteome Res. 2013. V.12(l). P.123-134.

46. Kopylov A.T., Zgoda V.G., Lisitsa A.V., Archakov A.I. Combined use of irreversible binding and MRM technology for low- and ultralow copy-number protein detection and quantitation // Proteomics. 2013. V.13(5). P.727-742.

Материалы трудов конференций

47. Zgoda V., Tikhonova О., Lisitsa A., Archakov A. Proteomic profiles of induced hepatotoxicity at the subcellular level. /Яn: Abstr. HUPO 5rd annual world congress.-Long Beach, California.-2006.-P.145.

48. Zgoda V., Tikhonova O., Lisitsa A., Archakov A. Proteomic profiles of induced hepatotoxicity at the subcellular level. //In: Abstr. 3rd International conference "Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine".-Novosibirsk.-2006.-P.65.

49.3года В.Г. Протеомика индуцированный гепатотоксичности на субклеточном уровне. Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 9. С. ЗЬ-З

50. Zgoda V., Tikhonova О., Kopylov A., Kurbatov L., Archakov A. Gene Expression And Proteomic Profiling Of Induced Hepatotoxicity In Mice // HUPO 7th Annual World Congress. 16-20.08.2008, Amsterdam, Netherlands. P264.

51. Kopylov A., Zgoda V., Archakov A. Label-Free Absolute Quantitative Analysis In Mass Spectrometry // HUPO 7th Annual World Congress. 16-20.08.2008, Amsterdam, Netherlands. P297.

52. Лисица A.B., Арчаков А.И., Иванов Ю.Д., Згода В.Г. Путь к обратному числу Авогадро в протеомике // Конференция «Химическая биология -Фундаментальные проблемы бионанотехнологии». 10-14.06.2009 Новосибирск. С.36.

53.Zgoda V.G., Kurbatov L., Andrievski Т., Kopylov A., Melnik S.A., Yourasova O., Archakov A.I. Transcriptome and proteome profiling of high- and medium copied proteins of Chr-18 // HUPO 8th Annual World Congress. 26-30.09.2009, Toronto, Canada-A 104.

54. Andrievski Т., Zgoda V.G., Kurbatov L., Kopylov A., Moshkovskii S.A., Archakov A.I. Possible reasons of ambiguity in expression study by microarray and ion trap proteomics // HUPO 8th Annual World Congress - 26-30.09.2009, Toronto, Canada - C514.

55. Archakov A.I., Ivanov Yu., Zgoda V.G. AFM/MS irreversible fishing technology for detection of low- and extra-low copied proteins // HUPO 8th Annual World Congress. 26-30.09.2009, Toronto, Canada. N102.

56.Melnik S.A., Zgoda V.G., Moshkovskii S.A., Kopylov A., Ponomarenko E.A., Fomchenkova E., Archakov A.I. Proteomics of Mouse Liver Microsomes: Performance of Different Protein Separation Workflows for LC-MS/MS // HUPO 8th Annual World Congress. 26-30.09.2009, Toronto, Canada. 0103.

57. Moshkovskii S.A., Zgoda V.G., Melnik S.A., Chernobrovkin A.L., Andrievski T.V., Ponomarenko E.A., Lisitsa A.V., Archakov A.I. Gene-Centric View to the Proteins of 18th Chromosome Identified in Blood Plasma: Potential Biomarkers // HUPO 8th Annual World Congress. 26-30.09.2009, Toronto, Canada. S403.

58. Zgoda V., Kopylov A. Multidimensional System Biology of Leukemia HL60 Cell Differentiation // HUPO 9th Annual World Congress. 19-23.09.2010, Sydney, Australia. P.188.

59. Chernobrovkin A.L., Lisitsa A.V., Moshkovskii S.A., Zgoda V.G., Archakov A.I. Knowledge-Based Refinement in Mass-Spectrometric Identification of Proteins // HUPO 9th Annual World Congress. 19-23.09.2010, Sydney, Australia. P.268.

60. Рыбина A.B., Андреевский Т., Згода В.Г., Курбатов JI.K. Сравнение результатов протеомного и транскриптомного анализа и определение корреляции между ними //ИВТН-2010. С.9.

61.Kopylov A., Zgoda V., Archakov A. Combination of irreversible binding and MRM for low- and ultra-low copied proteins detection and quantitation // HUPO 10th Annual World Congress. 03-07.09.2011, Geneva, Switzerland. P.1012.

62. Chernobrovkin A., Zgoda V., Lisitsa A., Archakov A. Increasing sequence coverage for the proteins identified by data-dependent LCMS/MS recruiting high-resolution massspectra from regular LC-MS runs // HUPO 10th Annual World Congress. 0307.09.2011, Geneva, Switzerland. P. 1143.

63.Chernobrovkin A.L., Zgoda V.G., Lisitsa A.V., Archakov A.I. Comprehensive analysis of unidentified LC-MS features for investigating proteins diversity in high-throughput proteomics experiments // 12th annual conference in Bioinformatics. 11-14.06.2012, Stockholm, Sweden. P.35.

64.Tikhonova O., Zgoda V., Kurbatov L., Novikova S., Archakov A. Multidimensional Systems Biology of Leukemia HL60 Cell Differentiation // HUPO 11th Annual World Congress. 09-14.09.2012, Boston, Massachusetts, USA. P.175.

65.Kopylov A., Zgoda V., Boiko A., Moisa A., Archakov A. Strategy of Peptide N-termini Derivatization by Compound with High Proton Affinity // HUPO 11th Annual World Congress. 09-14.09.2012, Boston, Massachusetts, USA. P.226.

66. Zgoda V., Moskaleva N. Mass Spectrometric Determination of the Concentration and Enzyme Activity of Cytochromes P450 // HUPO 11th Annual World Congress. 0914.09.2012, Boston, Massachusetts, USA. P.269.

67. Archakov A., Zgoda V., Kopylov A. Proteome of 18th Chromosome in Plasms, Liver Cells and HepG2 Cells Investigated by SRM/MRM // HUPO 11th Annual World Congress. 09-14.09.2012, Boston, Massachusetts, USA. P.288.

68. Archakov A., Lisitsa A., Kopylov A., Zgoda V. Transcriptoproteome of Chr 18: Recent State C-HPP // Proteomic Forum 2013 - 17-21.03.2012, Berlin, Germany. PH032.

69.Арчаков А.И., Згода В.Г., Лисица A.B., Мошковский С.А., Чернобровкин A.JI. Способ повышения точности определения последовательности аминокислотных остатков биополимера на основе данных масс-спектрометрического анализа, вычислительная система // Патент на изобретение RUS 2408011 от 30.01.2009 г.

Заказ № 24-Р/09/2013 Подписано в печать 05.09.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Згода, Виктор Гаврилович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ В.Н.ОРЕХОВИЧА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

05201351023

на правах рукописи

Згода Виктор Гаврилович

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450

ПОДСЕМЕЙСТВА 2В

специальность 03.01.04 - биохимия

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7

ВВЕДЕНИЕ 11

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16

Цитохромы Р450, общая характеристика 16

СУР1А2 17

СУР2В6 18

СУР2В6 19

Подсемейство СУР2С 31

СУР2Б6 34

СУР2Е1 34

Подсемейство СУРЗА 35

Протеомика, основные методы протеомных исследований 37

Методы разделения белков, применяемые в протеомных исследованиях. 38 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата

натрия (ДСН-ПААГ) 46

Особенности разделения мембранных белков 47

Безгелевые методы протеомного анализа 48

Методы протеомного анализа цитохромов Р450 54

Методы предварительного разделения белков суперсемейства Р450 в

протеомике 54

Масс-спектрометрический анализ цитохромов Р450 56 Идентификация цитохромов Р450 в биологических объектах методами масс-

спектрометрии 56

Методы количественного масс-спектрометрического анализа. 58 Относительное масс-спектрометрическое количественное определение

цитохромов Р450 без использования изотопной метк 60

Использование методов с введением изотопной метки для масс-

спектрометрического анализа цитохромов Р450 62

Фолдинг и сборка белков 67

Основная роль молекулярных шаперонов 68

Основы и нарушения белкового фолдинга 69

Классификация шаперонов. 70

Система ШР70 71

Шаперонины 72

Система ШР90 73

Взаимосвязь трансляции и фолдинга 75

Поддержание протеома и сеть протеостаза 77

Протеостаз при старении и заболеваниях 78

Ко-трансляционная вставка гема в апофермент Р450 81

Встраивание гема в молекулу апофермента Р450 82

Факторы, определяющие аффинность взаимодействия гема с белком. 84

Роль гема в фолдинге гемопротеинов 84

Ориентация гема в белке 84

Молекулярный механизм встраивая гема в Р450 85

Окислительная инактивация Р450 87

Окислительная инактивация цитохрома Р450 в процессе катализа и при

автоокислении 88

Исследование окислительной модификации гема и апофермента цитохрома

Р450 в монооксигеназной реконструированной системе 97

Внутриклеточная окислительная модификация других маромолекул и их

деградация 98

Системы деградации белков 104

Убиквитин-зависимая 268 протеасомная система 105

Система деградации белков эндоплазматического ретикулума 109 Цитохромы Р450 как модель для изучения протеолитической деградации

интегральных белков ЭР 111

Деградация белков Р450 112

Деградация отдельных изоформ Р450 117

ERAD нативных CYP 3А4, 2С11 И 2В1 в CEREVISIAE 124

Заключение 128

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 129

Материалы 129

Протеомные методы анализа 130

Проведение гидролиза белков трипсином в растворе 131

Введение метки в пептиды тяжелыми атомами кислорода [О] 131

LC-ESI -MS/MS -анализ 132

Структурное и функциональное восстановление CYP2B1 in vitro 136

Обработка цитозоля GA-агарозой 137

Эффект GA и GSH на гемин-зависимое восстановление CYP2B1 138

Анализ вестерн-блот Hsp90 13 8 Анализ вестерн-блот микросом печени с антителами IgG против GRP94,

GRP78 и ERp29 139

Ингибирование гемин-зависимого восстановления 2В1 антителами 139

Исследование деградации Р450 2В 140

Плазмиды для экспрессии СYP2B1 140

Экспрессионный вектор СYP2B1 -3А4СТ 140

Трансформация дрожжевых клеток плазмидами 141 Экспрессия CYP2B1 и CYP2B1-3A4CT в Escherichia coli, функциональная

реконструкция монооксигеназной системы 141

Выделение микросом дрожжей 141

Иммуноблотинг CYP2B1 142 Методы исследования окислительной модификации цитохрома Р450 2В4. 143

Выделение НАДФН-цитохром Р450 редуктазы 145

Мономеризация CYP2B4 и НАДФН-цитохром Р450 редуктазы 145

Инактивация Р450 в монооксигеназной реконструированной системе 146

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 150

Сравнительный анализ методов протеомного анализа мембранных

белков 150

Разработка метода количественной оценки содержания белков в биоматериале

без использования изотопных меток 155

Влияние индукторов Р450 на изменение белкового состава клеток печени

мыши 166

Верификация количественных протеомных данных методом МРМ 174

Роль цитозольных факторов и мембранных белков клеток печени во

встраивании гема в апобелок CYP2B 185

Гемин-зависимое структурное и функциональное восстановление AIA-

инактивированного микросомального СYP2B1 186

Роль Hsp90/GRP94 в гемин-зависимом восстановлении CYP2B1,

инактивированного суицидным ингибитором 188

Н202-зависимая инактивация цитохрома Р450 в реконструированной

монооксигеназной системе 195

Окислительная модификация гема в Р450 200

Агрегация Р450 204

Образование ковалентных сшивок в Р450 207

Изменения в первичной структуре цитохрома Р450 2В4 при его

инактивации в MPC 210

Окисление SH-групп при инактивации Р450 210

Образование карбонильных групп в Р450 в ходе инактивации 212

Протеолитическая деградация нативного и модифицированного CYP2B 215

Исследование роли системы деградации UBC/HRD в гидролизе CYP2B1 215

Исследование роли генов РЕР4 в протеолитической деградации CYP2B1 217

Деградация CYP2B1-ЗА4СТ в дрожжах 218

ОБСУЖДЕНИЕ 223

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 240

ВЫВОДЫ 244

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 245

БЛАГОДАРНОСТИ 293

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

*ОН - гидроксильный радикал 16ß-OHT - 1бр-ОН-тестостерон IDE - одномерный электрофорез DNPTi - 2,4-динитрофенилгидразин 2DE - двумерный электрофорез MX - 3-метилхолантрен AIA - аллилазизопропил

AQUA - метод абсолютной количественной оценка белка с использованием изотопно-меченных пептидов АДФ - аденозиндифосфат

CAR - конститутивный андростановый рецептор

СВВ - куммаси голубой

СЕ - капиллярный электрофорез

cICAT (Cleavable Isotope Coding Affinity Tag) - расщепляемая изотопная метка CID (Collision Induced Dissociation) - диссоциация ионов в результате столкновений CYP - цитохром Р450

DDEP - диметил-4-этил-1,4-дигидропиридин DEX - дексаметазон

DIGE (Differential Imaging Gel Electrophoresis) - гель-электрофорез с

дифференциальной окраской

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

ERAD - ассоциированная с ЭР деградация белков

ESI - метод ионизации методом электростатического распыления

ETD - метод фрагментации пептидов переносом электронов

GA - гелданамицин

GR - глюкокортикоидньтй рецептор

GRP94 - белок, регулируемый глюкозой

GSH - глутатион

GSSG - дисульфид глутатиона

HMGCoA - З-гидрокси-З-метилглутарил-СоА

HSP - белок теплового шока

HUPO - международная организация Протеом человека

ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) - маркируемая изотопом аффинная метка

ICPL (Isotope-Coded Protein Label) - маркируемая изотопом белковая метка

iTRAQ (Isobaric Tagging Reagents Amino-Reactive Quantification) - реагент для

изобарной метки

КРВ - калий-фосфатный буфер

LC-ESI-MSYMS - жидкостная тандемная хроматомасс-спектрометрия MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) -времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией веществ лазерной десорбцией при содействии матрицы

МНС - главный комплекс гистосовместимости MRM - мониторинг множественных реакций mRP - обращенная фаза с макропорами MS/MS - тандемная масс-спектрометрия

MudPiT (Multidimentional Protein Identification Technology) - протеомная

технология многомерной идентификации белков

MUP - основной белок мочи

NAPQI - N-ацетилхинонимин

NE - норетиндрон

nNOS - нейрональная NO-синтаза

NP40 - нонилфеноксиполиэтоксиэтанол

N-ДМБ - N-деметилирование бензфетамина

pi - изоэлектрическая точка

PMF (Peptide Mass Fingerprint) - метод протеомной идентификации белков по

массам пептидов

PXR - прегнановый X рецептор

QQQ - масс-спектрометр с тройным твадруполем

q-TOF- времяпролетный масс-спектрометр с гибридным квадруполем RPLC - обращенно-фазовая жидкостная хроматография RP-LC-MS/MS - метод жидкостной обращено фазовой хроматографии и тандемной масс-спектрометрии

SCX - ионнобменная хроматография на сильнокатионном носителе

SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture) - внесение метки

стабильного изотопа в клеточной культуре

SNP - однонуклеотидный полиморфизм

ТАО - ингибитор тролеиомицина

TBS - трис-солевой буфер

TBST - тритон содержащий трис-солевой буфер Ub - убиквитин

UPS - убиквитин протеасомная система

VDR - рецептор витамина D

АТФ - аденозин трифосфат

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВМЗ - цитохром Р450 Bacillius megaterium, CYP103

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФ - гель фильтрация

ДГА - дегидроаскорбиновая кислота

ДСН - додецил-сульфатом натрия

ДСН-ПААГ - полиакриламидный гель с додецил-сульфатом натрия ИЭФ (IEF) - изоэлектрофокусирование, к ДНК - кодирующая ДНК мРНК - матричная РНК

MPC - мономерная реконструированная система

НАДФН - восстановленный никотинамидаденинуклеотидфосфат

02* - супероксиданион

ПМ - пиренмалеимид

ПРОД - пентокси-резурофин О-деметилаза Р450сам - цитохром Р450 Pseudomonasputida CYP101 РРР - 2-фенил-2-(1-пиперидинил)пропан СОД - супероксиддисмутаза ФБ - фенобарбитал

цАМФ - циклический адепозинмонофосфат ЦФА - циклофосфамид ЭР - эндоплазматический реитикулум ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

ВВЕДЕНИЕ

Цитохромы Р450 (СУР) являются ключевыми ферментами первой фазы метаболизма и относятся к наиболее важными катализаторам окисления лекарственных препаратов. Р450 широко распространены в природе и обнаружены во всех аэробных организмах. В настоящее время известны геномные последовательности более чем 18500 цитохромов Р450, составляющих десятки и сотни семейств и подсемейств, соответственно. Изоферменты цитохрома Р450 -представители разных семейств и подсемейств, отличаются субстратной специфичностью и регуляторами их активности (ингибиторами и индукторами). В настоящее время у человека идентифицировано 57 форм цитохрома Р450 и 15 из них участвуют в метаболизме ксенобиотиков, включая 90% реакций I фазы метаболизма лекарств [1].

Активность монооксигеназной системы в отношении того или иного лекарственного препарата определяется, главным образом, концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохрома Р450. Поэтому индивидуальные особенности метаболизма лекарственных соединений определяются персональным профилем - концентрацией и активностью цитохромов Р450 [2].

Белки подсемейства СУР2В составляют 0,2-10% от содержания всех цитохромов Р450 в печени, при этом наблюдается высокая межиндивидуальная вариабельность концентрации данных белков [3]. Согласно современным данным, содержание СУР2В6 в микросомах печени человека варьирует в 80 раз [4]. Такие межиндивидуальные различия в концентрации СУР2В6 в печени и его ферментативной активности могут приводить к значительной вариабельности терапевтического действия множества лекарств, которые метаболизируются СУР2В6.

Благодаря достижениям молекулярной биологии механизмы индукции генов,

кодирующих СУР2В, изучены достаточно хорошо. Однако концентрация белка и

его активность определяются после синтеза полипептидной цепи на рибосомах.

Такие посттрансляционные события, как фолдинг, модификации первичной

структуры и, наконец, деградация белка являются определяющими для реализации

монооксигеназной функции Р450 [5]. Однако данные механизмы исследованы значительно хуже.

Основные задачи исследования:

2. Исследовать влияние индукторов Р450 на изменения в белковом составе клеток печени.

3. Определить роль цитозольных факторов и микросомальных белков клеток печени во встраивании гема в апобелок СУР2В.

4. Исследовать молекулярные механизмы посттрансляционной окислительной модификации СУР2В.

5. Исследовать механизмы протеолитической деградации нативного и модифицированного СУР2В.

Научная новизна.

С использованием разработанного высокопроизводительного протеомного метода установлено, что введение индукторов цитохромов Р450 (фенобарбитала и 3-мегилхолантрена) приводит к значительному изменению белкового профиля в ходе индукции цитохрома Р450 в печени мыши.

Изучены окислительные посттрансляционные изменения цитохрома Р450 и возможное влияние этих изменений на время жизни белка. Предложен механизм, по которому проходит деградация белков подсемейства цитохромов СУР2В и показана роль определенных участков аминокислотной последовательности белка в механизме определении пути деградации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фармакологическая индукция Р450 сопровождается увеличением содержания белковых компонентов мопооксигеназной системы; шаперопов, вовлеченных в фолдинг белков мопооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомсостатические и метаболические функции клетки.

2. В сборке функционально активного холофермента Р450 участвуют эндогенный восстановленный глутатион и шаперон вКР94.

4. В реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома СУР2В с АФК приводит к химической модификации трех из четырех остатков цистеина цитохрома и образованию белковых агрегатов. Данные модификации являются сигналом для протеаз. ответственных за деградацию белков иадсемейства.

5. Катаболизм СУР2В в модельных дрожжевых системах включает протсасомпый либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической

деградации. В дрожжах, дефицитных по вакуольным (лизосомным) ферментам, скорость деградации CYP2B значительно снижается. При внесении мутаций в первичную структуру CYP2B скорость его деградации значительно увеличивалась за счет вовлечения протеасомных ферментов в этот процесс.

Научно-практическая значимость работы. Разработанные методические подходы протеомного анализа могут быть использованы в работах по поиску маркеров заболеваний и анализу белкового состава биологических объектов. Поскольку цитохромы Р450 активно участвуют в окислении ксенобиотиков (в том числе лекарственных соединений), знание посттрансляционных молекулярных механизмов, контролирующих функцию монооксигеназной системы, может быть использовано при разработке лекарственных соединений и для оптимизации и персонализации фармакотерапии.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: 12-th International symposium on microsomes and drug oxidations (Montpellier, France, 1998); International workshop "From .Sequence to function: Experimental and Bioinformatic Studies of Cytochrome P450 Superfamily" (Moscow, 2000); 12-th International Conference on Cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology (France, 2001); International Meeting on Proteome Analysis (Munchen, 2001); International Conference Genomics and Bioinformatics for Medicine (St.Peterburg-Moscow, 2002); 13-th International Conference on Cytochromes P450 (Prague, 2003); 2nd International Conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004); 14th International conference on Cytochromes P450: biophysics and bioinformatics (Dallas, USA, 2005); HUPO 3th Annual World Congress в Пекине (KFIP) в 2004 г; 3-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Новосибирске (Россия) в 2006 г., HUPO 6th Annual World Congress в Сеуле (Южная Корея) в 2007 г., HUPO 7th Annual World Congress в Амстердам (Нидерланды) в 2008 г., 4-ая международная конференция «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Москве и Нижнем Новгороде (Россия) в 2008 г., HUPO 8th Annual World Congress в Торонто (Канада) в 2009 г.: HUPO 9th Annual World Congress в Сиднее (Австралия) в 2010 г., Taiwan-Russia

Research Cooperation Symposium '"New mass spectrometry methods in proteomics'' в Гаосюне (Тайвань) в 2011 г.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цитохромы Р450, общая характеристика.

Цитохромы Р450 (CYP) являются основным ферментом системы первой

Информация о работе

Згода, Виктор Гаврилович
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Згода, Виктор Гаврилович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия