Оптико-биосенсорный анализ белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных взаимодействий в реальном времени

Гнеденко, Оксана Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптико-биосенсорный анализ белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных взаимодействий в реальном времени
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оптико-биосенсорный анализ белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных взаимодействий в реальном времени"

На правах рукописи

ГНЕДЕНКО Оксана Валентиновна

ОПТИКО-БИОСЕНСОРНЫЙ АНАЛИЗ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ, БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В РЕАЛЬНОМ

ВРЕМЕНИ.

03.00.04.-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Иванов Юрий Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

академик РАМН

Егоров Алексей Михайлович

доктор биологических наук, профессор

Соколов Николай Николаевич

Ведущая организация:

Московская Медицинская Академия им. И. М. Сеченова

Защита состоится часов на заседании Диссертационного

совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, корп. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д.10, корп. 1.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

B.C Былинкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оптический биосенсор позволяет исследовать межмолекулярные взаимодействия в реальном времени без введения меток в анализируемые молекулы. Современные оптические биосенсоры характеризуются высокой чувствительностью, возможностью определять кинетические параметры образования и распада комплексов и быстротой анализа образца - несколько минут (Yeung et al., 1995). В настоящее время такие приборы нашли применение в фармакологических и протеомных исследованиях (Myszka and Rich, 2000; Natsume et al., 2000; Nelson et al., 2000), при эпитопном анализе антигенов (Novotny et al., 2000) и для детекции микробных антигенов (Nedelkov et al., 2000; Welschof et al., 1997). В качестве изучаемых объектов могут выступать различные пары: белок-белок, белок-липид, олигонуклеотид-олигонуклеотид, фермент-низкомолекулярный лиганд и т.д. В представленной работе оптический биосенсор использовался для изучения кинетических параметров взаимодействия антиген-антитело, взаимодействия белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с фосфолипидными слоями, а также для изучения кинетических параметров гибридизации олигонуклеотидов и взаимодействия фермент-низкомолекулярный лиганд.

Актуальность данной работы определяется тем, что с помощью оптического биосенсора "резонансное зеркало" вычислены кинетические параметры образования межмолекулярных комплексов различных видов, и тем самым продемонстрированы возможности оптического биосенсора в экспериментальном исследовании межмолекулярных взаимодействий, а также возможности практического применения биосенсора при разработке биоаналитических методов, биотехнологических систем, в фармакологии и исследовании метаболических путей.

Целью настоящей работы явилось определение с помощью оптического биосенсора кинетических констант образования и распада белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных комплексов.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- определить кинетические константы образования и распада комплексов MKA/HBsAg и HCV-core-Ag/MKA;

- показать возможность обнаружения HBsAg и антител к нуклеокапсидному белку ВГС в сыворотке крови людей с помощью оптического биосенсора;

- разработать методику ковалентной иммобилизации фосфатидилэтаноламинов на поверхности кюветы оптического биосенсора для исследования белок-липидных взаимодействий;

- определить кинетические характеристики взаимодействия мембранных белков микросомальной цитохром Р450-содержащей монооксигеназной системы с дилауроилфосфатидилэтаноламином (ДЛФЭ) и дистеароилфосфатидилэтаноламином (ДСФЭ);

- вычислить с помощью оптического биосенсора кинетические параметры гибридизации олигонуклеотидов;

- провести мониторинг взаимодействия глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с иммобилизованным 5-аминоизатином.

Научная новизна работы. В ходе выполнения работы определены константы скорости реакций образования и распада комплексов для следующих пар антиген-антитело: ЫЕЗ/НВзАё, СЕК24/НВ8Аё, НСУ-соге-А^СЕИ, НСУ-соге-А^СЕ12, НСУ-соге-А^СОП, НСУ-соге-А^В-1.

Путем ковалентной иммобилизации фосфолипидов на поверхности аминосилановой кюветы оптического биосенсора созданы стабильные фосфолипид-содержащие биочипы для исследования белок-липидных взаимодействий. Определены константы скорости ассоциациям и скорости диссоциации белок-липидных комплексов: ДЛФЕ/(1-Ь5, ДСФЕ/<1-Ь5, ДЛФЕадр, ДЛФШ-2В4, ДСФЕ/а-2В4.

Установлено, что глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа и глицерол-3-

фосфатдегидрогеназа являются изатин-связывающими белками. Определены константы скорости ассоциации и диссоциации комплекса 5-аминоизатин/ГФДГ. Показано, что лактатдегидрогеназа не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина.

Научно-практическая ценность работы. Показана возможность выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в сыворотке крови людей с помощью оптического биосенсора. Это создает основы для разработки диагностических методов, позволяющих детектировать маркеры заболеваний в реальном времени с высокой специфичностью, при этом требуется малое количество анализируемой пробы (несколько микролитров) и короткое время измерения (несколько минут).

Разработана методика ковалентной иммобилизации фосфатидилэтаноламинов на поверхности кюветы оптического биосенсора. Создание фосфолипидных биочипов позволяет исследовать кинетические характеристики белок-липидных взаимодействий и моделировать мембранные Р450-содержащие монооксигеназные системы.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 12-ой международной конференции "Цитохром P4S0: биохимия, биофизика и молекулярная биология" (Франция, 2001), на 5-ом конгрессе "Современные проблемы аллергологии,

иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2002), на 2-ом международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития. Биотехнология и медицина" (Москва, 2003), на 2-ой международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва - Плес - Москва, 2004). По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 4 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит страниц машинописного текста, 8 таблиц и 26 рисунков. Список литературы включает 207 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сывороточный очищенный HBsAg получен у "ИмБио" (Нижний Новгород, Россия). Моноклональные антитела (МКА) к HBsAg, 96% чистоты, были получены: NE3 в НИИ иммунологии МЗ РФ (Москва), CEN24 из Всесоюзного научного центра молекулярной диагностики и лечения (Москва). Иммуноферментный анализ сывороток выполняли, используя коммерческие тест-системы. Определение HBsAg проводили с помощью тест-систем: HBsAg ("Human", Германия), HBsAg (НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород). На наличие HBsAg исследовали 68 образцов сывороток крови людей: из них 37 от пациентов с ВГВ-инфекцией, а также 31 сыворотка от пациентов без ВГВ-инфекции.

Рекомбинантный нуклеокапсидный антиген вируса гепатита С (HCV-core-Ag) генотип 1Ь, аффинно очищенный до 96%, любезно предоставлен фирмой ЗАО "Вектор-Бест" (Россия, Новосибирская область, пос. Кольцове). МКА к эпигонам нуклеокапсидного антигена, аффинно очищенные до 96%, получены из НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва) и из Всесоюзного научного центра молекулярной диагностики и лечения (Москва).

В работе использовали 47 образцов сывороток крови людей для выявления антител к нуклеокапсидному белку (anti-core): из них 32 сыворотки, содержащие anti-core по данным ИФА, и 15 сывороток, не содержащих anti-core по данным ИФА. Иммуноферментный анализ сывороток и моноклональных антител выполняли, используя коммерческую тест-систему "Спектр" (ЗАО Вектор-Бест, Россия).

Полноразмерные формы цитохромов Р450 2В4 и Ь5, NADPH-зависимой цитохром Р450 редуктазы, а также укороченные формы t-b5 и t-Fp были выделены и любезно предоставлены к.б.н. Саменковой Н.Ф. и к.б.н. Кузнецовой ГЛ. (ГУ НИИ БМХ РАМН, Москва).

Цитохром Р450сат любезно предоставлен Dr. Hui Bon Hoa (Institute de Biologie Physico Chemique, Париж, Франция).

Адренодоксин любезно предоставлен проф. Усановым СА. (Институт биоорганической химии, Минск, Беларусь).

Олигонуклеотиды р14, ODN-11, ODN-14 и ODN-23 любезно предоставлены Ковалем В.В. и Федоровой О.С. (Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск, Россия).

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, глицерол-3-фосфатдегидрогеназа,

лактатдегидрогеназа любезно предоставлены к.б.н. Медведевой М.В. (Биологический факультет МГУ).

Биосенсор "резонансное зеркало"

При выполнении работы использовали одноканальный и двухканальный оптические биосенсоры "резонансное зеркало" IAsys и IAsys plus компании Affinity Sensors (Кэмбридж, Англия). Объем реакционной смеси в кювете одноканального биосенсора - 200 мкл,

двухканального биосенсора - 60 мкл. Образцы вносили непосредственно в кювету. Постоянную температуру 25°С в кювете одноканального биосенсора IAsys поддерживали с помощью термостата (Haake, Mess-Technik, Карлсруэ, Германия). Скорость перемешивания раствора в кювете составляла 7200 оборотов в мин (60 единиц прибора). Постоянную температуру 25°С в кювете двухканального биосенсора IAsys plus поддерживали с помощью элемента Пелтье. Частота колебаний мешалки двухканального биосенсора - 98 Гц.

Связывание HBsAg с иммобилизованными МКА Ассоциацию антигена с иммобилизованными МКА регистрировали после добавления антигена в большом избытке по отношению к иммобилизованным МКА (диапазон концентраций HBsAg 1,0-10^ М - l.MO^M). В кювету с иммобилизованными антителами добавляли 180-199 мкл (в случае одноканального биосенсора) или 40-48 мкл (в случае двухканального биосенсора) PBS/t буфера и прописывали базовую линию не менее 5 мин. После этого в кювету добавляли 1-20 мкл (в случае одноканального биосенсора) или 2-10 мкл (в случае двухканального биосенсора) раствора антигена и регистрировали связывание в течение 5-10 мин. Процесс диссоциации комплексов антиген/антитело регистрировался в течение 5-15 мин после замены раствора, содержащего антиген, на 200 мкл или 60 мкл PBS/t. Кювету регенерировали инкубацией с 200 или 60 мкл 10 мМ НС1 в течение 2 мин и последующей промывкой PBS/t. Для всех иммобилизованных антител регистрировали 4-7 кривых связывания с HBsAg при различных концентрациях антигена. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, FASTfit).

Связывание МКА с иммобилизованным core антигеном ВГС Ассоциацию антител с иммобилизованным антигеном регистрировали после добавления антител в большом избытке по отношению к иммобилизованному core белку (диапазон концентраций антител 2,87-Ю"8 М - 7,87-Ю"6 М). В кювету с иммобилизованным антигеном добавляли 48-59 мкл PBS/t буфера и прописывали базовую линию в течение не менее 5 мин. После этого в кювету добавляли 1-12 мкл раствора антител и регистрировали связывание в течение 5-10 мин. Процесс диссоциации комплексов антиген-антитело регистрировали в течение 5-15 мин после замены раствора, содержащего антиген, на 60 мкл PBS/t Кювету регенерировали инкубацией с 60 мкл 10 мМ НС1 в течение 2 мин и последующей промывкой PBS/t. Все антитела анализировали при 4-6 различных концентрациях. Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, FASTfit).

Иммобилизация ДЛФЭ и ДСФЭ на поверхности биосенсорной кюветы Фосфолипиды иммобилизовали на аминосилановой (АС) поверхности кюветы одноканального оптического биосенсора с использованием янтарного ангидрида. Перед началом иммобилизации АС-кювету инкубировали в течение 10 мин в 10 мМ КФБ, рН 7,6, при температуре 25°С. Затем этот буфер заменяли на раствор янтарного ангидрида (310 г/л в смеси ацетонитрила и 10 мМ КФБ, рН 7,6 в соотношении 1:1), который инкубировали в кювете в течение 1 ч. В результате на модифицированной АС-поверхности сформировался карбоксильный слой. После промывки кюветы 10 мМ КФБ, рН 7,6, ДЛФЭ или ДСФЭ ковалентно иммобилизовывали на карбоксильном слое через аминогруппы по стандартной методике. Карбоксильную поверхность активировали смесью EDC/NHS (IAsys Manual, 1993). После 7 мин активации проводилась иммобилизация ДЛФЭ или ДСФЭ (20 г/л в диоксане) в течение 10 мин. Несвязанный фосфолипид удаляли PBS/t. Непрореагировавшие эфирные группы на поверхности кюветы блокировали 1 М этаноламином, рН 8,5. Затем кювету промывали 50 мМ КФБ, рН 7,4, содержащим 1 М NaCl и 20% холат Na.

Связывание белков с липидами регистрировали после добавления белка в кювету в диапазоне концентраций 0,25'10"6М-0,75"10 М.

Используя калибровочную кривую для АС - кюветы (IAsys Manual, 1993), поверхностную концентрацию связавшегося с иммобилизованным липидом белка (/, молекул/см2) рассчитывали как >=Rxl0 /Мг, где R - смещение резонансного угла, регистрируемое прибором, Mr - молекулярная масса белка.

В качестве контрольной поверхности использовали кювету без иммобилизованного липида.

Гибридизация олигонуклеотидов-мишеней с иммобилизованным олигонуклеотидным

зондом

Ассоциацию олигонуклеотидов-мишеней с иммобилизованным зондом регистрировали после добавления олигонуклеотидов-мишеней в большом избытке по отношению к иммобилизованному зонду (диапазон концентраций олигонуклеотидов-мишеней 0,90-10"5 М В кювету с иммобилизованным зондом добавляли 170 мкл гибридизационного буфера (20 мМ NajHPOct, 160 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, pH 7,5) и прописывали базовую линию не менее 5 мин. После этого в кювету вносили 30 мкл раствора олигонуклеотида-мишени и регистрировали изменение сигнала в течение 15 мин. Процесс диссоциации образовавшихся ДНК-ДНК дуплексов регистрировали в течение 5-15 мин после замены раствора олигонуклеотцда-мишени на 200 мкл гибридизационного буфера. Для разделения цепей ДНК-ДНК дуплекса в кювету добавляли 200 мкл бидистиллированной воды и инкубировали в течение 2 мин. Для олигонуклеотидов-мишеней были получены 5-7 кривых связывания при различных концентрациях. Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, FASTfit).

В качестве контрольной поверхности использовали кювету без иммобилизованного олигонуклеотада.

Иммобилизация 5-аминоизатина на КМД поверхности кюветы одноканального биосенсора IAsvs и связывание глицерол-З -фосфатдегидрогеназы и глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназы с иммобилизованным лигандом Карбоксиметилированный декстран активировали смесью 0,4М EDC/0,lM NHS в течение 7 мин и промывали 10 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 138 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1 и 0,05 % Твин-20 (PBS/t). Затем добавляли раствор 5-аминоизатина (60 мкг/мл). Иммобилизацию проводили в течение 15 мин в 10 мМ формиатном буфере, рН 3,0. Карбоксильные группы декстрана, активированные EDC/NHS, но не связавшиеся с 5-аминоизатином, блокировали 1 М раствором этаноламина (рН 8,5) в течение 2 мин. Кювету с иммобилизованным 5-аминоизатином промывали 50 мМ КФБ, рН 7,4, содержащим 1 М NaCl для удаления неспецифически сорбированных молекул. Связывание с иммобилизованным лигандом регистрировали после добавления фермента в кювету в диапазоне концентраций 0.З-10-6М - 7,710-6М. В кювету добавляли рабочий буфер и регистрировали базовую линию прибора в течение 5 мин, после чего добавляли фермент, за ассоциацией которого с 5-аминоизатином наблюдали около 5 мин. Процесс диссоциации комплексов фермент-низкомолекулярный лиганд регистрировали после замены раствора, содержащего фермент, на буфер. В качестве контрольной поверхности использовали кювету без иммобилизованного 5-аминоизатина.

Определение констант скорости ассоциации и диссоциации методом оптического биосенсора Программное обеспечение к прибору (IAsys software, FASTfit) использует процедуру обработки экспериментальных кривых ассоциации и диссоциации для получения величин и kgff из уравнений:

R=R«+Ri(Uxp(-/t)), где/= , (1}

где кт - константа скорости ассоциации, keg - константа скорости диссоциации, t - время; Ro - величина сигнала биосенсора при t=0; Rt сигнал биосенсора при t=<(b равновесном состоянии); [В] - концентрация добавляемого партнера в растворе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование взаимодействия МКА с HBsAg

Поверхностный антиген вируса гепатита В является основным диагностическим маркером ВГВ - инфекции. Выбор в качестве объектов исследования пар MKA/HBsAg обусловлен большим интересом к разработке новых тест-систем для диагностики гепатита В.

Были проведены эксперименты по иммобилизации на поверхности карбоксилатных кювет одноканального оптического биосенсора моноклональных антител к общегрупповым эпитопам поверхностного антигена вируса гепатита В - NE3 и CEN24; в качестве блокирующего реагента использовали этаноламин. Для исключения вклада неспецифических взаимодействий применили дифференциальную схему регистрации в 2-х кюветах: 1) рабочая кювета с иммобилизованными на поверхности моноклональными антителами; 2) контрольная кювета, на которой повторяется вся процедура иммобилизации, за исключением добавления пробы, содержащей антитела. Не наблюдалось связывания HBsAg с поверхностью контрольной кюветы, в то время как в рабочей кювете регистрировали образование комплексов МКА„,,/НВ$А£. Используя уравнения (1) и (2), из экспериментальных кривых вычислили кинетические параметры комплексообразования сывороточного очищенного HBsAg с иммобилизованными антителами (табл. 1). Минимальная концентрация HBsAg, определяемая с помощью карбоксилатной кюветы к одноканальному биосенсору с иммобилизованными МКА, составляет ОД мкг/мл.

Таблица 1. Параметры связывания HBsAg с МКА.

Тип кюветы Исследуемые пары U MV kogi c"1 KA)M-'

карбоксилатная CEN24BM/HBsAg (1,37±0,05)-105 (3,4±0,6) КГ1 (4,0±0,7)10e

карбоксилатная NE3HM/HBsAg (5,3*0,9)-104 (1,7±1,0) -lO'3 (3,0±2,0)-10'

аминосилановая NE3ra/HBsAg (6,3±1,5)-10J C^o^-io*1 (2,3±0,7) -If)'

карбоксилатная HBsAg™/NE3 (8,0±1,0) -lO" (3,2±0,9) -lO"3 (2,5±0,8) -10'

Далее в работе использовали двухканальный биосенсор IAsys plus, который позволяет проводить вычитание вклада неспецифического взаимодействия. В рабочем канале аминосилановой двухканальной кюветы были иммобилизованы моноклональные антитела NE3, в контрольном канале их не было, в качестве блокирующего реагента использовали бычий сывороточный альбумин. Минимальная концентрация HBsAg, определяемая с помощью аминосилановой кюветы с иммобилизованными NE3, составляет 0,4 мкг/мл. Константы скорости образования (£<«)> распада комплексов (kqff) и равновесная константа ассоциации иммобилизованными на аминосилановой поверхности

кюветы двухканального оптического биосенсора, представлены в таблице 1.

В эксперименте по изучению связывания МКА NE3 с иммобилюованным HBsAg сывороточный HBsAg был иммобилизован в рабочем канале карбоксилатной двухканальной кюветы, в качестве блокирующего реагента использовали ß - казеин. Кинетические параметры комплексообразования NE3 с иммобилизованным вычисленные из

экспериментальных кривых, представлены в таблице 1. Видно, что значение константы аффинности для NE3 не зависит от выбора поверхности кюветы, а также от порядка иммобилизации белков.

Полученные с помощью оптического биосенсора значения константы аффинности (равновесной константы ассоциации) моноклональных антител NE3 и CEN24 согласуются с описанными в литературе данными метода количественной преципитации: аффинность моноклональных anti-HBs к синтетическими линейным и циклическим пептидам, соответствующим аминокислотам 139-147 основного полипептида HBsAg, а также к полипептидному комплексу gp28/p23 из очищенного сывороточного HBsAg, составляла 2-Ю6- 5-106М"' (Brown et al., 1984); аффинность поликлональных anti-HBs по отношению к этим же синтетическим пептидам и к полипептидному комплексу gp30/p25 составляла 5,9-106 - 3,5-107 М'1 (Thanavala et al., 1986). Таким образом, показано, что оптический биосенсор может быть корректно применен для анализа взаимодействий антиген-антитело.

Двухканальный биосенсор IAsys plus существенно облегчает тестирование сложных биологических жидкостей. Представляет интерес использование оптического биосенсора для селективного выявления маркеров инфекционных заболеваний, в частности HBsAg, в сыворотках крови людей. Далее представлены результаты, полученные на карбоксилатной двухканальной кювете. В рабочем канале иммобилизовали МКА NE3, в качестве блокирующего реагента использовали цитохром С.

При тестировании образцов сыворотки на наличие поверхностного антигена ВГВ в оба канала кюветы добавляли по 6 мкл сыворотки к 54 мкл PBS/L Результирующая кривая, образующаяся при вычитании сигнала контрольного канала из сигнала рабочего канала, позволила выявить специфическое взаимодействие поверхностного антигена с иммобилизованными антителами. На рис. 1 приведены результирующие кривые взаимодействия компонентов сывороток №11 и №3 с NE3, иммобилизованными на карбоксилатной кювете. По данным иммуноферментного анализа, сыворотка №11 содержала HBsAg, а в сыворотке №3 HBsAg отсутствовал. При добавлении сыворотки №3 наблюдалось незначительное изменение результирующей базовой линии биосенсора. В случае сыворотки №11 было обнаружено образование комплексов антиген-антитело: после отмывки PBS/t уровень результирующего сигнала биосенсора был выше начального уровня на 20 arc сек. С помощью карбоксилатной двухканальной кюветы с иммобилизованными антителами NE3,

заблокированной цитохромом С, была протестирована 21 сыворотка (9 положительных и 12 отрицательных, по данным ИФА). Совпадение данных биосенсорного тестирования и ИФА составило 62%.

В качестве блокирующего реагента при иммобилизации МКА МЕЗ на карбоксилатной поверхности был использован также стрептавидин. С помощью такого биочипа было протестировано 52 сыворотки (33 положительных и 19 отрицательных, по данным ИФА). Совпадение данных биосенсорного тестирования и ИФА составило 69% (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительные данные по детекции НВ&А? в сыворотке крови с помощью оптического биосенсора и ИФА.

Кол-во сывороток ИФА Анализ с помощью оптического биосенсота

21J + +

12 + -

15 -

~ 4 I - | +

Таким образом, нами была показана возможность использования оптического биосенсора для выявления поверхностного антигена ВГВ в сыворотках крови людей.

3 4 5 Время, мин

Рис. 1. Кривые связывания компонентов сывороток с антителами NE3, иммобилизованными

на карбоксилатной кювете двухканального биосенсора IAsys plus. Стрелками обозначено

добавление сывороток или буфера.

Исследование взаимодействия HCV-eore-Ag/anti-core

С помощью оптического биосенсора были изучены кинетические параметры

взаимодействия нуклеокапсидного белка вируса гепатита С с различными моноклональными

антителами к нему. Нуклеокапсидный (core) белок является одним из структурных белков

ВГС. Антитела к core антигену появляются одними из первых при острой инфекции, титры антител нарастают при хронической инфекции и сохраняются пожизненно у большинства выздоровевших людей (Giuberti et al., 1992; Yamagushi et al., 2000; Nikolaeva et al., 2002). Выбор в качестве объектов исследования пар HCV-core-Ag/MKA был обусловлен большим интересом к разработке новых тест-систем для диагностики гепатита С.

Рекомбинантный нуклеокапсцдный белок вируса гепатита С (аминокислотная последовательность 1-131) был иммобилизован в рабочем канале аминосилановой двухканальной кюветы, непрореагировавшие реакционные центры рабочего канала, а также аминогруппы контрольного канала были блокированы БСА. Была измерена зависимость сигнала биосенсора от времени для различных концентраций добавляемых моноклональных антител: СЕ1, СЕН, СЕ12, CD11, В-1. Путем обработки экспериментальных кривых согласно уравнениям (1) и (2) были вычислены кинетические параметры взаимодействия различных моноклональных антител с иммобилизованным HCV-core-Ag (табл. 3). Минимальная концентрация МКА, определяемая с помощью аминосилановой двухканальной кюветы с иммобилизованным core белком ВГС, составляла 4 мкг/мл.

Оптический биосенсор использовался для выявления антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в сыворотках крови. При тестировании образцов сыворотки на наличие антител к core белку ВГС в оба канала кюветы добавляли по 6 мкл сыворотки к 54 мкл PBS/t. Результирующая кривая, образующаяся при вычитании сигнала контрольного канала из сигнала рабочего канала, выявила специфическое взаимодействие anti-core с иммобилизованным core белком ВГС.

Таблица 3. Параметры взаимодействия моноклональных антител с HCV-core-Ag.

МКА Титр антител по данным ИФА kotll MV ко* с Ка, М-1

СЕ1 - - - -

СЕ11 1/1000 О.шд-К? (3,8±0,8)-10ч (2,5*0,8)10"

СЕ12 1/500 (7,№,0)-1(? (1,7±0,2) -10'3 (4,0*2,0)-10'

CD11 1/500 (4,3±0Д)-КУ (3,0±1,0) -Ю-4 (1,4±0,5)106

В-1 1/2000 (8,0±2,0)1<У (2,та) -ю-4 (2,7±0,7)'Ю7

На рис. 2 приведены результирующие кривые взаимодействия сывороток №1 и №30 с НСУ-СОГе-А^. По данным иммуноферментного анализа, сыворотка №30 содержала антитела к соте белку ВГС, титр антител 1/2000, а в сыворотке №1 они отсутствовали. При

добавлении сыворотки №1 наблюдалось незначительное изменение результирующей базовой линии биосенсора. В случае сыворотки №30 было обнаружено образование комплексов антиген-антитело: после отмывки PBS/t уровень результирующего сигнала биосенсора выше начального уровня на 800 arc сек.

С помощью аминосилановой двухканальной кюветы с иммобилизованным соте белком ВГС было протестировано 47 сывороток (32 положительные и 15 отрицательных, по данным ИФА). Совпадение данных биосенсорного тестирования и ИФА составило 74% (табл. 4).

Таблица 4. Сравнительные данные по детекции антител к нуклеокапсидному белку ВГС в сыворотке крови с помощью оптического биосенсора и ИФА.

Кол-во сыпиршпж ИФА Анализ с помощью оптического биосенсора

20 + +

12 + _

15 1 • I -

Таким образом, нами показана возможность использования оптического биосенсора для выявления антител к нуклеокапсидному белку ВГС в сыворотках крови людей.

Рис. 2. Результирующие кривые связывания компонентов сывороток с core белком ВГС, иммобилизованным на аминосилановой кювете двухканального биосенсора IAsys plus. Стрелками обозначено добавление сывороток или буфера.

Исследование взаимодействия мембранных и водорастворимых белков из питохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с иммобилизованными фосфолипидными

слоями

В данном разделе продемонстрировано применение оптического биосенсора для определения кинетических параметров взаимодействия мембранных белков цитохром Р450 2В4-содержащей монооксигеназной системы с иммобилизованным липидным слоем. Ранее предпринимались попытки применить этот метод для исследования белок-липидных взаимодействий (Ramsden et al., 1996), но созданные за счет адсорбции фосфолипидные слои были нестабильны. В настоящей работе был создан стабильный фосфолипид-содержащий биочип путем ковалентной иммобилизации фосфолипидов на поверхности аминосилановой кюветы оптического биосенсора (см. Материалы и методы исследования). Фосфолипидный слой был сформирован из насыщенных фосфолипидов: дилауроилфосфатидилэтаноламина (ДЛФЭ) и дистеароилфосфатидилэтаноламина (ДСФЭ), различающихся длиной остатков жирных кислот, при этом ДЛФЭ характеризовался более низкой температурой фазового перехода гель - жидкий кристалл (29°С), чем ДСФЭ (60°С) (Ивков и Берестовский, 1981). Роль гидрофобных мембранных фрагментов во встраивании белков была исследована путем сравнительного анализа взаимодействий с фосфолипидным слоем полноразмерных белков (d-b5 и d-Fp) и их лишенных трансмембранных доменов форм (t-b5 и t-Fp). Для выяснения влияния электростатических взаимодействий на встраивание мембранных белков в фосфолипидный слой использовали буферные растворы двух типов: 1) буфер высокой ионной силы (500 мМ КФБ), в котором электростатические взаимодействия слабые и основной вклад вносят гидрофобные взаимодействия; 2) буфер низкой ионной силы (25 мМ КФБ), в котором электростатические взаимодействия играют существенную роль.

Встраивание мономеров мембранных белков в фосфолипидный слой

Добавление растворов мембранных белков в измерительную кювету с иммобилизованным фосфолипидным слоем увеличивало амплитуду сигнала, что свидетельствовало о связывании соответствующего белка с фосфолипидным слоем (рис. 3 -5). При связывании белков с липидными слоями на поверхности кюветы происходит ряд процессов; в результате общее количество связавшегося белка (It) состоит из белка, адсорбированного на поверхности (1а), и белка, встроенного в фосфолипидный слой (It). Замена белкового раствора буфером приводила к диссоциации комплексов белок-липид. Белок, связанный за счет электростатических взаимодействий, удаляли добавлением 50 мМ КФБ, рН 7,4, содержащего 1 М Nad (далее 1 М NaCl). Повторная промывка 1М NaCl не вызывала дальнейшей диссоциации (рис. 3). Белок, который не может быть удален КФБ/Е и 1М NaCl, рассматривался как встроенный в фосфолипидный слой за счет гидрофобных

взаимодействий (/,). Удалялся он с поверхности биочипа только в результате обработки раствором детергента - холата Ыа в концентрации 20% в 50 мМ КФБ, содержащем 1 М ЫаС1,рН 7,4 (далее СЬ).

Встраивание белка моделировалось системой уравнений:

где А - число Авогадро; к (молекул белка/см2) - общее количество адсорбированного на поверхности (/,) и встроенного в фосфолипидный слой (/,) белка (71= I, + /,); И к^' — константы скорости ассоциации для процессов адсорбции и встраивания, обусловленного гидрофобными взаимодействиями; ко« - константа скорости диссоциации белок-липидных комплексов; С - концентрация белка, добавляемого в измерительную кювету; 8о и Я -поверхности, доступные для связывания белка в начальный момент времени и в момент измерения.

Данные по взаимодействию ё-Ь5 и Ы)5 с ДЛФЭ и ДСФЭ, а также с ^модифицированной поверхностью кюветы в 500 и 25 мМ КФБ/Е представлены на рис. 3. Видно, что, как в условиях высокой, так и в условиях низкой ионной силы, <1-Ь5 встраивался в ДЛФЭ с близкими значениями (рис. 3, табл. 5), в то время как встраивание этого белка

в ДСФЭ происходило лишь в буфере с высокой ионной силой. Встраивание ё-Ъ5 в фосфолипидный слой в 25 мМ КФБ/Е было полным (Р=1), тогда как в 500 мМ КФБ/Е доля встроенного белка была значительно меньше (Р=0,4). В условиях высокой ионной силы наблюдалось взаимодействие ё-Ъ5 с немодифицированной АС-поверхностью, однако адсорбированный белок полностью отмывался КФБ/Е. В буфере низкой ионной силы взаимодействие между й-Ъ5 и АС-поверхностью не наблюдалось. Таким образом, электростатические взаимодействия существенно влияют на связывание белка с фосфолипидными слоями: препятствуя обратимой адсорбции ё-Ъ5, они не влияют на его встраивание в ДЛФЭ и полностью ингибируют его встраивание в ДСФЭ. Причем, нельзя полностью исключить влияние степени агрегации ё-Ъ5 на его способность встраиваться в фосфолипидный слой в буфере низкой ионной силы. Укороченный Ь5 не взаимодействует с фосфолипидным слоем ни в 500 мМ КФБ/Е, ни в 25 мМ КФБ/Е (рис. 3). Отсутствие взаимодействия ЬЪ5 с фосфолипидами указывает на то, что гидрофобный мембранный фрагмент этого белка играет решающую роль в его встраивании.

1/А(ди&) = кт°{С-(к„„Ш) 1!А(И,!д1) = ктЧС

^/Бо,

(3)

(4)

(5)

(6)

Рис. 3. Связывание <1-(-о-) или 1-Ъ5 (*-)с ДЛФЭ и <1-(-п-)или Й>5 (в-)с ДСФЭ. Инкубационная смесь содержала 500 мМ (А), 25 мМ (В) КФБ/Е. Стрелками указано добавление 0,5 мкМ (1-, ЬЬ5 в соответствующем буфере. Здесь и на рис. 4-6 - пунктир обозначает адсорбцию исследуемого бежа на ^модифицированной АС-поверхности; №С1 -1М ЫаС1; СЬ - 20% раствор холата натрия + 1М КаС1; /, - количество белка, встроенного в лшщдный слой.

В отличие от ё-Ъ5, ё-Бр не встраивался в фосфолипидные слои в буфере высокой ионной силы, но встраивался (только в ДЛФЭ) в буфере низкой ионной силы; доля встроенного в ДЛФЭ белка Р=1 (рис. 4). В условиях высокой ионной силы <1-Рр адсорбировался как на ДЛФЭ, так и на ДСФЭ, а также на "модифицированной АС-поверхности, и полностью отмывался или КФБ/Е, или 1 М N(£1, что указывает на отсутствие встраивания. Таким образом, наличие обратимой адсорбции белка не является обязательным фактором для его встраивания. В отличие от ё-Ъ5, электростатические силы способствуют встраиванию ё-Бр в ДЛФЭ. Усеченный Бр не взаимодействует с фосфолипидными слоями ни в условиях низкой, ни в условиях высокой ионной силы, из чего следует, что гидрофобный мембранный

фрагмент флавопротеина (также как и в случае цитохрома Ь5) необходим для встраивания белка.

Таблица 5. Параметры связывания белков с ДЛФЭ и ДСФЭ наАС- поверхности.

Буфер Белок Слой ^оп X Ю-5, см/с кж'х 10"", см/с koftx Ю-4, с* Р /,х 10 , молекул/с /|Х 10 , молекул/с

500 мМ КФБ/Е d-b5 ДЛФЭ ДСФЭ 1,0±0,2 2,0+0,4 6,3±1,2 10,0±2,3 25,0±б,2 25,0±4,8 0,45±0,06 0,43+0,06 14±1 19+2 б,4±0,7 8,2±0,8

d-2B4 ДЛФЭ ДСФЭ 2,8±0,6 5,0±1,0 2,3±0,5 4,0±0,7 50±12 50±11 0,33±0,05 0,28±0,04 9,0±0,8 11,0±1,2 2,9±0,3 3,1±0,3

25 мМ КФБ/Е d-b5 ДЛФЭ ДСФЭ 0 0 3,6±0,8 0 0 1,00±0,14 0 4Д±0,4 0 4Д±0,5 0

d-Fp ДЛФЭ ДСФЭ 0 0 0,4±0,1 0 0 1,00+0,13 0,54+0,05 0,54±0,06

Примечание. ¥=1,11, - доля встроенного в фосфолипидный слой мембранного белка; ° и ' -реакции адсорбции и гидрофобного встраивания белка в фосфолипидные слои, соответственно.

Рис. 4. Связывание <Ц-о-)или t-Fp (»-)с ДЛФЭ и <Ц-С1-)или t-Fp (ш-)с ДСФЭ.

Инкубационная смесь содержала 500 мМ (А), 25 мМ (В) КФБ/Е. Стрелками указано добавление 0,25 МкМ d-, t-Fp (А) И 0,75 МкМ d-, t-Fp (В) в соответствующем буфере. Другие обозначения такие же, как на рис. 3.

Более сложная картина наблюдалась при изучении взаимодействия d-2B4 с фосфолипидными слоями. Способность мембранных белков встраиваться в биомембрану определяется их гидрофобностыо. Согласно шкале Эйзенберга (Eisenberg et al, 1982) гидрофобность d-2B4 составляет -8,15, что выше, чем гидрофобность d-b5 и d-Fp (-12,65 и -40,33, соответственно). Данные по встраиванию d-2B4 представлены на рис. 5. Видно, что в 500 мМ КФБ/Е d-2B4 встраивается как в ДЛФЭ, так и в ДСФЭ. Встраивание белка сопровождается его адсорбцией. Доля встроенного как в ДЛФЭ, так и в ДСФЭ белка составляла около 30% (табл. 5). При взаимодействии с немодифицированной АС-поверхностью d-2B4 адсорбируется на ней за счет электростатических сил и может быть полностью удален с поверхности путем инкубации в 1 М NaCl. В буфере низкой ионной силы наблюдалась сильная адсорбция d-2B4 на немодифицированную АС-подложку, обусловленная как электростатическими, так и гидрофобными взаимодействиями, и белок был удален с АС-поверхности только с помощью 2% Ch.

500 1000 1500 2000

»M

500 1000 1500

t(c)

Рис. 5. Связывание d-2B4 с ДЛФЭ (-о-) и ДСФЭ (-□-)• Инкубационная смесь содержала 500 мМ (А), 25 мМ (В) КФБ/Е. Стрелками указано добавление 0,25 мкМ d-2B4 в соответствующем буфере. Другие обозначения такие же, как на рис. 3.

Такое поведение d-2B4 существенно отличается от поведения двух других изученных белков, которые легко десорбировались с АС-поверхности при инкубации либо в КФБ/Е, либо в 1 М NaCl. Если для удаления 2В4, встроенного в ДЛФЭ или в ДСФЭ, использовать 2% Ch (т. е. такую концентрацию холата натрия, которая позволяет удалить весь белок с немодифицированной подложки), то с фосфолипидной поверхности удалялось не более 30% белка. Весь белок удалялся только при концентрации холата натрия 20%. Это означает, что гидрофобные взаимодействия d-2B4 с фосфолипидным слоем гораздо сильнее, чем его адсорбция на немодифицированной поверхности, и, следовательно, происходит встраивание 2В4 в фосфолипидный слой.

Взаимодействие водорастворимых белков с фосфолипидными слоями

Водорастворимые белки обладают меньшей гидрофобностью, чем мембранные, и поэтому можно предположить, что их взаимодействие с гидрофобными фосфолипидными слоями будет слабее, чем взаимодействие мембранных белков. Изучено взаимодействие с фосфолипидными слоями трех водорастворимых белков: Ad, P450cam и альбумина. Известно, что адренодоксин - отрицательно заряженный белок, взаимодействующий со своими редокс-партнерами, включая P450scc, путем электростатических взаимодействий (Coghlan and Vickery, 1991). На рис. 6 показано отсутствие связывания Ad с ДЛФЭ и с ДСФЭ как в 500 мМ, так и в 25 мМ КФБ.

Взаимодействие Р450 сат с немодифицированной АС-подложкой и с липидными слоями представлено на рис. 6. После адсорбции на немодифицированную АС-поверхность в 500 мМ КФБ белок десорбировался 1 М NaCl, в то время как в 25 мМ КФБ он десорбировался только 2% Ch. В 500 мМ КФБ, Р450сат адсорбировался на ДЛФЭ и ДСФЭ слоях и его полная десорбция наблюдалась лишь в 2% Ch. В буфере низкой ионной силы десорбция этого белка с ДЛФЭ слоя и с немодифицированной АС-поверхности достигалась с помощью 2% Ch, а на ДСФЭ (фосфолипид с более длинными ацильными цепями) Р450сат не адсорбировался. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что связывание Р450сат с липидными слоями зависит от типа используемого фосфолипида и определяется не только электростатическими, но и гидрофобными взаимодействиями.

Альбумин - водорастворимый белок, способный связываться со многими гидрофобными соединениями (Jakoby et al., 1995). Этот белок связывался с ДЛФЭ и в 500 мМ, и в 25 мМ КФБ. Связывание было обратимым - белок легко десорбировался при инкубации в 1 М NaCl. Связывания альбумина с ДСФЭ не наблюдалось. Хотя альбумин является водорастворимым белком, его связывание с фосфолипидным слоем зависело от длины ацильных цепей фосфолипида; оно наблюдалось для фосфолипида с более короткими ацильными цепями. Взаимодействие альбумина с немодифицированной АС-подложкой

существенно зависело от ионной силы буфера. В условиях высокой ионной силы белок десорбировался буфером, тогда как в 25 мМ КФБ его взаимодействие имело гидрофобную природу, так как отсутствовала десорбция альбумина при инкубации в 1 М №0, полная десорбция наблюдалась только в 2% Ch.

Таким образом, водорастворимые белки или не адсорбировались на поверхности фосфолипида (Ad), или адсорбировались только за счет электростатических взаимодействий (альбумин), или за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий (Р450сат). Причем адсорбция водорастворимых белков была больше в случае фосфолипида с меньшей длиной ацильной цепи.

Рис. 6. Связывание водорастворимых Ad и Р450саm с иммобилизованными на АС-поверхности ДЛФЭ (-0-) и ДСФЭ (-□-). Инкубационная смесь содержала 500 мМ (А), 25 мМ (В) КФБ. Стрелками указано добавление 0,25 мкМ Ad и 0,25 мкМ Р450сат в соответствующем буфере. Другие обозначения такие же, как на рис. 3.

Исследование кинетики образования и распада олигонуклеотидных дуплексов (pl4HODN-ll) и (P14HODN-14)

В данном разделе продемонстрировано применение оптического биосенсора для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотидчшигонуклеотид. Специфичная к последовательности модификация одно- и двухцепочечных нуклеиновых кислот реакционноспособными производными олигонуклеотидов, способными образовывать соответствующие дуплексы и триплексы, - один из наиболее перспективных вариантов антисмыслового подхода к регуляции экспрессии генов (Кпогге and Vlassov, 1985). Олигонуклеотиды и их производные могут быть направлены на матричные РНК с целью ингибирования процесса трансляции, а также на вирусные РНК или одноцепочечные ДНК для контроля процессов репликации или транскрипции.

Биотинилированный 14-мерный дезоксирибонуклеотид имеющий ту же

нуклеотидную последовательность, что и антисмысловой реагент, использованный ранее (Fedorova et al., 1992), был иммобилизован через стрептавидин на КМД поверхности кюветы одноканального оптического биосенсора, как описано выше. Олигонуклеотиды ODN-11, комплементарны олигонуклеотиду и представляют собой регионы

ДНК-мишени.

[-Стрептавндии-бшгтнв-ШЦСНг^МН-рТСАСССТСТТСССА -3' (р14)

GGGAGAAGGGT -5' (ODN-1I)

ACTGGGAGAAGCGT -5' (0DN-14)

ACTGGGAGAAGGGTAAGTTCCGT -5' (ODN-23)

Типичные кривые связывания для дуплексов представлены

на рис. 7. Путем обработки экспериментальных кривых согласно уравнениям (1) и (2) были вычислены кинетические характеристики реакции гибридизации (табл. 6). Таблица 6. Кинетические константы образования и распада олигонуклеотидных дуплексов.

Комплекс ken, М" с" koth с1

(pl4)(ODN-14) 183+162 (4+1)-10-4

(P14)(ODN-11) 219+39 (2,0+0,4)-10-3

Диссоциация дуплексов (р14)-(ОЭМ-11) характеризуется более высокой константой скорости, чем диссоциация дуплексов (р14)-(ОЭМ-14), что согласуется с относительной стабильностью комплексов. Для ОЭМ-23 не наблюдалось увеличения интенсивности сигнала оптического биосенсора, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного олигонуклеотида с иммобилизованным р14. Этот результат согласуется со способностью нуклеотидной последовательности ОЭМ-23 образовывать стабильную шпильку с выступающим Т и дефектной парой ТО в ножке.

500

1000

1600

Время, с

Рис. 7. Типичные кривые связывания для дуплексов (pl4) (ODN-14) и (pl4) (ODN-ll). Стрелками обозначены добавки: 1 - 1,81-Ю'5 М олигонуклеотида ODN-14, 6,9М О'5 М олигонуклеотида ODN-ll;2-20MMNa2HP04,160 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, рН 7,5.

Исследование взаимодействия NAD-зависимых дегидрогеназ цитозоля с иммобилизованным 5-аминоизатииом

В этом разделе показано применение оптического биосенсора для изучения взаимодействия фермент-низкомолекулярный лиганд. Изатин (индолдион-2,3) -низкомолекулярный эндогенный непептидный регулятор, обнаруженный практически во всех органах, тканях и биологических жидкостях животных и человека (Medvedev et al., 1996; Гловер и др., 1997; Sandier et al., 2000). В данной работе с помощью оптического биосенсора было изучено взаимодействие иммобилизованного 5-аминоизатина с NAD-зависимыми дегидрогеназами цитозоля: глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой (ГАФД), глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (ГФДГ) и лактатдегидрогеназой (ЛДГ).

5-аминоизатин (аналог изатина, сохраняющий биологическую активность в отношении внутриклеточных мишеней: моноаминооксидазы и ANP-стимулируемой гуанилатциклазы (Medvedev et al., 1999)) был иммобилизован на КМД поверхности кюветы одноканального оптического биосенсора (см. Материалы и методы исследования). Для оценки вклада неспецифического связывания были также проведены контрольные эксперименты с КМД кюветой оптического биосенсора без иммобилизованного 5-аминоизатина.

Добавление раствора ГАФД увеличивало амплитуду сигнала биосенсора как в измерительной кювете с иммобилизованным аналогом изатина (рабочая кювета), так и в

контрольной кювете. Однако уровень сигнала был существенно выше в случае рабочей кюветы. Результирующая кривая, полученная при вычитании сигнала контрольной кюветы из сигнала рабочей кюветы, выявляла специфическое взаимодействие 5-аминоизатаним/ГАФД (рис. 8, кривая 1). В присутствии в концентрации от 1 до 100

мкМ наблюдалось уменьшение интенсивности сигнала (рис. 8). Это свидетельствует о том, что изатин взаимодействует с МЛО-связывающим участком фермента.

Рис. 8. Ассоциация ГАФД с 5-аминоизатином, иммобилизованным на КМД поверхности кюветы оптического биосенсора, в отсутствие и в присутствии NAD+. Кривая 1 соответствует взаимодействию в отсутствие NAD+; кривая 2 соответствует взаимодействию в присутствии 1 мкМ NAD+; 3-5 мкМ NAD+; 4-50 мкМ NAD+; 5 -100 мкМ NAD*. NAD+

содержался в рабочем буфере (0,1 М глициновый буфер, рН 8,9) и в добавляемом образце фермента. Концентрация ГАФД во всех случаях составляла 0,3 мкМ. Молярную концентрацию фермента рассчитывали исходя из того, что ГАФД - тетрамер.

Добавление раствора ГФДГ в измерительную кювету с иммобилизованным 5-аминоизатином приводило к появлению характерного ответа, что свидетельствовало о комплексообразовании между ферментом и 5-аминоизатином. При этом величина сигнала биосенсора возрастала с увеличением концентрации добавленного фермента. Взаимодействие ГФДГ с поверхностью контрольной кюветы без иммобилизованного 5-аминоизатина не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии неспецифического связывания в измеряемом диапазоне концентраций фермента. Путем обработки экспериментальных кривых связывания ГФДГ с иммобилизованным 5-аминоизатином

согласно уравнениям (1), (2) были вычислены кинетические параметры образования и распада комплекса 5-аминоизатинии/ ГФДГ. Константы скорости ассоциации (£„„) и диссоциации (*„/) имели следующие значения: £OT=(6,6iO,3)'102 Nf'c"1 и к0#=(42±С1,\)Л(У^с1. Величина константы диссоциации Кр=(6,4±0,3)-10"6М согласуется с литературными данными

о взаимодействии других ферментов с низкомолекулярными лигандами (Shaw et al., 2003; Koh et al., 2003). Еще один NAD-зависимый фермент цитозоля скелетных мышц - ЛДГ - не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина. Это позволяет предположить, что далеко не все растворимые ферменты цитозоля связываются с изатином.

ВЫВОДЫ

1. Определены кинетические константы образования и распада комплексов MKA/HBsAg и HCV-core-Ag/MKA с помощью оптического биосенсора.

3. Разработана методика ковалентной иммобилизации фосфатидилзтаноламинов на поверхности кюветы оптического биосенсора.

4. Полноразмерные мембранные белки - цитохром Р450 2В4, цитохром Ь5 и NADPH-цитохром Р450 редуктаза - встраиваются в созданные фосфолипидные слои. Определены константы скорости ассоциации для процессов адсорбции и встраивания, обусловленного гидрофобными взаимодействиями, а также константы скорости диссоциации белок-липидных комплексов: ДЛФЕ„„/(1-Ь5, ДСФЕ„„/ d-b5, ДЛФЕвм/d-Fp, ДЛФЕии|/<1-2В4, ДСФЕии/0-2В4.

5. Оптический биосенсор применен для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотид-олигонуклеотид. Вычислены кинетические параметры гибридизации 11-мера TGGGAAGAGGG (ODN-11) и 14-мера TGGGAAGAGGGTCA (ODN-14) с 14-мерным биотинилированным олигонуклеотцдом pTGACCCTCTTCCCA (р14), иммобилизованным на поверхность декстрановой кюветы через стрептавидин.

6. Глицеральдегид-3-фосфатдещдрогеназа и глицерол-3-фосфатдегидрогеназа являются изатин-связывающими белками. Это взаимодействие специфическое, поскольку лактатдещдрогеназа, также NAD-зависимый фермент цитозоля, не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина. Определены кинетические константы образования и распада комплекса 5-аминоизатинии/ГФДГ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Koval V.V., Gnedenko O.V., Ivanov Yu.D., Fedorova O.S., Archakov A.I., Knorre D.G. Real -time oligonucleotide hybridization kinetics monitored by resonant mirror technique. IUBMB Life, 1999, v. 48, p. 317-320.

2. Archakov A.I., Ivanov Yu.D., Kanaeva I.P., Gnedenko O.V., Kuznetsova G.P., Samenkova N.F. Interactions of membrane-bound and water-soluble proteins of P450-containing systems with phospholipid layers immobilized on the optical biosensor cuvette. 12* International conference on cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology. September 11-15, 2001. La Grande Motte-France, P 416.

3. Ivanov Y.D., Kanaeva I.P., Gnedenko O.V., Pozdnev V.F., Shumyantseva V.V., Samenkova N.F., Kuznetsova G.P., Tereza A.M., Schmid R.D., Archakov A.I. Optical biosensor investigation of interactions of biomembrane and water-soluble cytochromes P450 and their redox partners with covalently immobilized phosphatidylethanolamine layers. J. Mol. Recognit. 2001, v. 14, p. 185-196.

4. Семенова Н.В., Иванов Ю.Д., Гнеденко О.В., Конев ВА., Ковалев О.Б., Учайкин В.Ф., Морозов С.Г., Арчаков А.И. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью оптического биосенсора. Выявление поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) методом оптического биосенсора. Новости науки и техники. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2001, № 1, с. 183-185.

5. Иванов Ю.Д., Гнеденко О.В., Конев ВА, Ковалев О.Б., Николаева Л.И., Семенова Н.В., Учайкин В.Ф., Арчаков А.И. Детекция поверхностного антигена вируса гепатита В с помощью оптического биосенсора. Вопросы мед. химии, 2001, т. 47, №4, с. 419-425.

6. Гнеденко О.В., Иванов Ю.Д., Николаева Л.И., Константинова Н.И., Конев ВА., Ковалев О.Б., Говорун В.М., Учайкин В.Ф., Арчаков А.И. Возможности определения поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С с помощью оптического биосенсора. 5-й Конгресс. Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. 12-14 ноября, 2002, Москва, Россия, с. 334.

7. Иванов Ю.Д., Панова Н.Г., Гнеденко О.В., Бунеева ОА., Медведев А.Е., Арчаков А.И. Исследование тканевого и субклеточного распределения изатин-связывающих белков при помощи оптического биосенсора. Вопросы мед. химии, 2002, т. 48, № 1, с. 73-83.

8. Иванов Ю.Д., Гнеденко О.В., Николаева Л.И., Конев ВА., Ковалев О.Б., Учайкин В.Ф., Говорун В.М., Покровский В.И., Арчаков А.И. Определение поверхностного антигена вируса гепатита В с помощью оптического биосенсора. Журн. микробиол., 2003, №2, с. 58-62.

9. Иванов Ю.Д., Николаева Л.И., Гнеденко О.В., Константинова Н.И., Кузнецов В.Ю., Светлов СА., Ковалев О.Б., Конев ВА, Говорун В.М., Учайкин В.Ф., Арчаков А.И. Выявление комплексов антиген/антитело методом оптического биосенсора и атомно-силовой микроскопии. П Московский Международный Конгресс. Биотехнология: Состояние и перспективы развития. Биотехнология и медицина. 2003, Москва, Россия, с. 8.

10. Бунеева ОА, Гнеденко О.В., Панова Н.Г., Медведева М.В., Иванов Ю.Д., Медведев А.Е. Глицерол-3-фосфатдегидрогеназа - изатип-связывающий белок цитозоля. Биомедицинская химия, 2003, т. 49, № 6, с. 627-631.

11. Ivanov Yu.D., Gnedenko O.V., Lipov PA., Moshkovskiy S., Serebryakova M., Archakov A.I. Optical biosensor study of protein complex formation in proteomics. 2nd International Conférence. Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine. 14-19 July, 2004. Moscow - Pies - Moscow, Russia, Abstr. 1.1.4.

Автор признателен сотрудникам лабораторий нанобиотехнологии и микросомального окисления ГУ НИИ БМХ РАМН за поддержку при выполнении данной работы. Автор благодарен сотрудникам кафедры детских инфекционных болезней РГМУ к.м.н. В А. Коневу и к.м.н. О.Б. Ковалеву, а также сотруднику Института полимиелита и вирусных энцефалитов РАМН к.б.н. Л.И. Николаевой за большую помощь в проведении экспериментов с сыворотками крови людей. Автор благодарен зав. лабораторией биохимии аминов и циклических нуклеотидов ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН д.б.н. А.Е. Медведеву и сотруднику этой лаборатории к.б.н. О.А. Бунеевой за большую помощь в проведении экспериментов с NAD-зависимыми дегидрогеназами цитозоля.

Проведенные исследования поддержаны Межведомственнаой научно-технической программой "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", грантами РФФИ №99-04-48081, №01-04-48245, №03-0448244.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ton • константаскорости ассоциации koff - константа скорости диссоциации

- константа ассоциации (константа аффинности)

- константа диссоциации КМД - (карбоксиметил)декстран БСА - бычий сывороточный альбумин

HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В

HCV-core-Ag - нуклеокапсидный белок вируса гепатита С

anti-HBs - антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В

anti-core - антитела к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С

МКА - моноклональные антитела

ВГВ - вирус гепатита В

ВГС - вирус гепатита С

d-2B4 - полноразмерный цитохром Р450 2В4

d-Fp - полноразмерная NADPH- зависимая цитохром Р450 редуктаза

t-Fp - лишенная трансмембранного сегмента (укороченная) NADPH- зависимая цитохром

Р450 редуктаза

d-b5 - полноразмерный цитохром Ь5

t-b5 - лишенный трансмембранного сегмента (укороченный) цитохром Ь5

Ad - адренодоксин

Р450саш - цитохром Р450сат

ДЛФЭ - дилауроилфосфатидилэтаноламин

ДСФЭ -дистеароилфосфатидилэтаноламин

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

NAD - никотинамидадениндинуклеотид

ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ГФДГ- глицерол-3-фосфатдегидрогеназа

ЛДГ- лактатдегидрогеназа

NHS - N-гидроксисукцинимид

EDC - 1-этил-3[(3-диметиламино)пропил]карбодиимид КФБ - К-фосфатный буфер

КФБ/Е - К-фосфатный буфер, содержащий 0,25 г/л Эмульгена 913

Принято к исполнению 20/05/2005 Исполнено 23/05/2005

Заказ № 893 Тираж 100 экз

0 0 0 «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 www autoreferat ru

s 4

■/ 'V

151::эл 2?Э5 Vй*

, г

^274

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гнеденко, Оксана Валентиновна

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Принцип оптико-биосенсорного анализа межмолекулярных взаимодействий

2.2 Взаимодействие антиген-антитело

2.2.1 Методы изучения кинетики реакции антиген-антитело

2.2.2 Характеристика поверхностного антигена вируса гепатита В

2.2.3 Характеристика нуклеокапсидного белка вируса гепатита С

2.3 Взаимодействие белок-липид

2.3.1 Методы исследования белок-липидных взаимодействий в мембранной цитохром Р450-содержащей монооксигеназной системе

2.3.2 Мембранные и водорастворимые белки цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем

2.4 Взаимодействие олигонуклеотид-олигонуклеотид

2.5 Взаимодействие фермент - низкомолекулярный лиганд

3 Материалы и методы исследования

4 Результаты исследования и их обсуждение

4.1 Исследование взаимодействия MKA/HBsAg

4.2 Исследование взаимодействия HCV-core-Ag/anti-core

4.3 Исследование взаимодействия мембранных и водорастворимых белков из цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с иммобилизованными фосфолипидными слоями

4.4 Исследование кинетики образования и распада дуплексов p14) (ODN-11) и (p14) (ODN-14)

4.5 Исследование взаимодействия NAD-зависимых дегидрогеназ цитозоля с иммобилизованным 5-аминоизатином

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптико-биосенсорный анализ белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных взаимодействий в реальном времени"

Актуальность

Оптический биосенсор позволяет исследовать межмолекулярные взаимодействия в реальном времени без введения меток в анализируемые молекулы. Современные оптические биосенсоры характеризуются высокой чувствительностью, возможностью определять кинетические параметры образования и распада комплексов и быстротой анализа - несколько минут [Yeung et al., 1995]. В настоящее время такие приборы нашли применение в фармакологических и протеомных исследованиях [Myszka and Rich, 2000; Natsume et al., 2000; Nelson et al., 2000], при эпитопном анализе антигенов [Novotny et al., 2000] и для детекции микробных антигенов [Nedelkov et al., 2000; Welschof et al., 1997]. В качестве изучаемых объектов могут выступать различные пары: белок-белок, белок-липид, олигонуклеотид-олигонуклеотид, фермент-низкомолекулярный лиганд и т.д. В представленной работе оптический биосенсор использовался для изучения кинетических параметров взаимодействия антиген-антитело, взаимодействия белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с фосфолипидными слоями, а также для изучения кинетических параметров гибридизации олигонуклеотидов и взаимодействия фермент-низкомолекулярный лиганд.

Исследование кинетики взаимодействия антиген-антитело позволяет получить данные, важные как в теоретическом плане (изучение общих механизмов белок-белковых взаимодействий, определение специфичности взаимодействия антиген-антитело, эпитопное картирование), так и для практического применения (разработка иммуно-тест-систем и терапевтических препаратов на основе антител). Поверхностный антиген вируса гепатита В является основным диагностическим маркером ВГВ - инфекции. Со времени открытия HBsAg в изучении различных аспектов ВГВ инфекции достигнут значительный прогресс, однако, вирусный гепатит В продолжает оставаться важной проблемой здравоохранения: у 10% больных он переходит в хроническое течение, а при хроническом гепатите, в свою очередь, в 1% случаев развивается цирроз и рак печени. Гепатит С также представляет серьезную угрозу здоровью людей из-за очень высокой вероятности (до 85% случаев) перехода в хронический процесс, приводящий в дальнейшем к циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме. Нуклеокапсидный (core) белок является одним из структурных белков ВГС. Антитела к core антигену появляются одними из первых при острой инфекции, титры антител нарастают при хронической инфекции и сохраняются пожизненно у большинства выздоровевших людей [Giuberti et al., 1992; Yamagushi et al., 2000; Nikolaeva et af., 2002]. Выбор в качестве объектов исследования пар MKA/HBsAg и HCV-core-Ag/MKA обусловлен большим интересом к разработке новых тест-систем для диагностики гепатитов В и С. Создание эффективных диагностических систем невозможно без информации о кинетических характеристиках взаимодействия белков-маркеров с иммобилизованными белками-зондами. В настоящей работе оптический биосенсор был применен для исследования кинетики взаимодействия пар HBsAg/MKA и HCV-core-Ag/MKA и для детекции HBsAg и anti-core в сыворотке крови.

Актуальность изучения цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем обусловлена их центральной ролью в метаболизме широкого спектра эндогенных субстратов и ксенобиотиков [Арчаков, 1975; Archakov and Bachmanova, 1990]. Липидное окружение может влиять на структуру и функциональные свойства белков. Несмотря на значительное количество работ в области липид-белкового взаимодействия, пока нет стройной модели, описывающей механизм этого взаимодействия. Это обусловлено недостатком данных, в том числе, по кинетическим характеристикам взаимодействия. Кинетические параметры липид-белковых взаимодействий определялись или по тушению флуоресценции аминокислотных остатков мембранного фрагмента [Dufourcq et al., 1975; Yang et al., 1981], или путем введения специальных флуоресцентных меток [Leto and Holloway, 1979]. В настоящее время оптические биосенсоры находят все большее применение для исследования в реальном времени белок-белковых взаимодействий [Ivanov et al., 1997, 1999a,b,

2000, 2001 a, b], а также взаимодействий пленарный липидный слой - белок [Ramsden et al.f 1996; Salamon and Tollin, 1996a,b; Heyse et al., 1998], но созданные за счет адсорбции фосфолипидные слои были нестабильны. В представленной работе были созданы стабильные фосфолипид-содержащие биочипы путем ковалентной иммобилизации фосфолипидов на поверхности аминосилановой кюветы оптического биосенсора и исследовано взаимодействие мембранных и водорастворимых белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с иммобилизованными фосфолипидными слоями.

Специфичная к последовательности модификация одно- и двухцепочечных нуклеиновых кислот реакционноспособными производными олигонуклеотидов, способными образовывать соответствующие дуплексы и триплексы, - один из наиболее перспективных вариантов антисмыслового подхода к регуляции экспрессии генов [Knorre and Vlassov, 1985]. Оли гону клеотиды и их производные могут быть направлены на матричные РНК с целью ингибирования процесса трансляции, а также на вирусные РНК или одноцепочечные ДНК для контроля процессов репликации или транскрипции. В представленной работе оптический биосенсор был применен для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотид/олигонуклеотид.

Изатин - низкомолекулярный эндогенный непептидный регулятор, обнаруженный практически во всех тканях и биологических жидкостях животных и человека [Medvedev et al., 1996; Гловер и др., 1997; Sandler et al., 2000]. Хотя изатин-связывающие белки обнаружены в мембранной и растворимой фракциях клеток, идентифицировано всего несколько мишеней действия изатина (моноаминооксидаза, А-подтип рецепторов натрийуретических пептидов и растворимая NO-стимулируемая гуанилатциклаза тромбоцитов человека) [Glover et al., 1995; Medvedev et al., 1996; Гловер и др., 1997; Medvedev et al., 1998; Sandler et al., 2000]. Однако выявленные мишени действия изатина не могут объяснить всей биологической активности, свойственной этому соединению in vivo. В данной работе с помощью оптического биосенсора было изучено взаимодействие иммобилизованного 5-аминоизатина с NAD-зависимыми дегидрогеназами цитозоля: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (ГАФД), глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (ГФДГ) и лактатдегидрогеназой (ЛДГ).

Цель работы

Определение с помощью оптического биосенсора кинетических констант образования и распада белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных комплексов.

Задачи работы

- определить кинетические константы образования и распада комплексов MKA/HBsAg и HCV-core-Ag/MKA;

- вычислить с помощью оптического биосенсора кинетические параметры гибридизации олигонуклеотидов;

Научная новизна

В ходе выполнения работы определены константы скорости реакций образования и распада комплексов для следующих пар антиген-антитело: NE3/HBsAg, CEN24/HBsAg, HCV-core-Ag/CE11, HCV-core-Ag/CE12, HCV-core-Ag/CD11, HCV-core-Ag/B-1.

Путем ковалентной иммобилизации фосфолипидов на поверхности аминосилановой кюветы оптического биосенсора созданы стабильные фосфолипид-содержащие биочипы для исследования белок-липидных взаимодействий. Определены константы скорости ассоциациии и скорости диссоциации белок-липидных комплексов: ДЛФЕ/<3-Ь5, flCOE/d-b5, ДЛФЕ/d-Fp, ДЛФЕ/с1-2В4, ДСФЕ/с!-2В4.

Установлено, что глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и глицерол-3-фосфатдегидрогеназа являются изатин-связывающими белками. Определены константы скорости ассоциации и диссоциации комплекса 5-аминоизатин/ГФДГ. Показано, что лактатдегидрогеназа не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина.

Научно-практическая ценность работы

Показана возможность выявления поверхностного антигена вируса гепатита В, а также антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в сыворотке крови людей с помощью оптического биосенсора. Это создает основы для разработки диагностических методов, позволяющих детектировать маркеры заболеваний в реальном времени с высокой специфичностью, при этом требуется малое количество анализируемой пробы (несколько микролитров) и короткое время измерения (несколько минут).

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на 12-ой международной конференции "Цитохром Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология" (Франция, 2001), на 5-ом конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2002), на 2-ом международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития. Биотехнология и медицина" (Москва, 2003), на 2-ой международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва - Плес - Москва, 2004). По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 4 тезисов докладов.

Работа выполнена в ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего" и РФФИ (гранты №99-0448081, №01-04-48245, №03-04-48244).

Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 21 февраля 2005 года.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 108 страниц машинописного текста, 8 таблиц и 26 рисунков. Список литературы включает 207 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гнеденко, Оксана Валентиновна

6. выводы

2. Оптический биосенсор может быть использован для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в сыворотке крови людей. 3. Разработана методика ковалентной иммобилизации фосфатидилэтаноламинов на поверхности кюветы оптического биосенсора.

4. Полноразмерные мембранные белки - цитохром Р450 2В4, цитохром Ь5 и NADPH-цитохром Р450 редуктаза - встраиваются в созданные фосфолипидные слои. Определены константы скорости ассоциации для процессов адсорбции и встраивания, обусловленного гидрофобными взаимодействиями, а также константы скорости диссоциации белок-липидных комплексов: ДЛФЕим/с1-Ь5, ДСФЕИМ/ d-b5, ДЛФЕим/d-Fp, ДПФЕим/d-2В4, ДСФЕИ„^-2В4.

5. Оптический биосенсор применен для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотид-олигонуклеотид. Вычислены кинетические параметры гибридизации 11-мера TGGGAAGAGGG (ODN-11) и 14-мера TGGGAAGAGGGTCA (ODN-14) с 14-мерным биотинилированным олигонуклеотидом pTGACCCTCTTCCCA (р14), иммобилизованным на 7

0 ^поверхность декстрановои кюветы через стрептавидин. - - — ~ (

6. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа и глицерол-3-фосфатдегидрогеназа являются изатин-связывающими белками. Это взаимодействие специфическое, поскольку лактатдегидрогеназа, также NAD-зависимый фермент цитозоля, не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина. Определены кинетические константы образования и распада комплекса 5-аминоизатиним/ГФДГ.

5. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленной целью - определение с помощью оптического биосенсора кинетических констант образования и распада белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных комплексов - были проведены исследования взаимодействий антиген-антитело, белок-липид, олигонуклеотид-олигонуклеотид, фермент-низкомолекулярный лиганд с помощью оптического биосенсора. В диссертационной работе продемонстрировано применение оптического биосенсора для анализа взаимодействия антиген-антитело, в частности, пар MKA/HBsAg и HCV-core-Ag/anti-core. Полученные с помощью оптического биосенсора значения константы аффинности МКА к HBsAg не зависят от выбора типа кюветы и от порядка иммобилизации белков (показано на примере пары NE3/HBsAg), а также согласуются с описанными в литературе данными метода количественной преципитации. Были определены константы скорости ассоциации и константы скорости диссоциации для следующих пар антиген-антитело: NE3/HBsAg, CEN24/HBsAg, HCV-core-Ag/CE11, HCV-core-Ag/CE12, HCV-core-Ag/CD11, HCV-core-Ag/B-1. Также продемонстрирована возможность использования оптического биосенсора для выявления в сыворотке крови людей поверхностного антигена ВГВ и антител к нуклеокапсидному белку ВГС.

Путем исследования взаимодействия белок - липид с помощью оптического биосенсора определены константы скорости ассоциации для процессов адсорбции и встраивания, обусловленного гидрофобными взаимодействиями, а также константы скорости диссоциации белок-липидных комплексов: ДЛФЕ/с1-Ь5, ДСФЕ/с1-Ь5, ДЛФЕ/d-Fp, ДЛФЕЛ1-2В4, ДСФЕЛ1-2В4. Мембранные белки 2В4, Fp и Ь5 встраиваются в фосфолипидные слои. Была продемонстрирована доминантная роль гидрофобных мембранных фрагментов d-b5 и d-Fp во встраивании их в липидный слой. Наряду с гидрофобными взаимодействиями в процессе встраивания d-b5 и d-Fp принимают участие электростатические силы. Электростатические взаимодействия препятствовали адсорбции цитохрома Ь5 на ДЛФЭ слой, но не влияли на его встраивание, и в то же время способствовали встраиванию Fp в фосфолипидный слой. Эффективность встраивания уменьшалась с увеличением длины ацильной цепи фосфолипида. В буфере низкой ионной силы не наблюдали встраивания

Ь5 и Fp в липид с более длинной ацильной цепью (ДСФЭ). Встраивание d-b5 увеличивалось при температуре ДЛФЭ-слоя выше точки фазового перехода.

На примере d-2B4 было показано, что степень агрегации белка влияла на его взаимодействие с липидным слоем; агрегаты d-2B4 не встраивались в фосфолипидный слой.

Водорастворимые белки или не адсорбировались на поверхности фосфолипида (Ad), или адсорбировались только за счет электростатических взаимодействий (альбумин), или за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий (Р450сат). Причем адсорбция водорастворимых белков была больше в случае фосфолипида с меньшей длиной ацильной цепи.

В работе продемонстрировано применение оптического биосенсора для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотид-олигонуклеотид. Определены кинетические параметры гибридизации олигонуклеотидов ODN -11 и ODN -14 с иммобилизованным зондом р14. Результаты, полученные с помощью оптического биосенсора, т.е. в гетерогенных условиях, сравнили с данными, полученными в гомогенных условиях: методом температурного скачка, а также рассчитанными из кривых плавления олигонуклеотидных дуплексов. Процесс диссоциации имеет сходные количественные характеристики и в одном, и в другом случае. Процесс ассоциации, происходящий в чувствительном слое биосенсора, более адекватно отражает реакцию в живых клетках.

В представленной работе также показана возможность использования оптического биосенсора для изучения взаимодействия фермент низкомолекулярный лиганд на примере NAD-зависимых дегидрогеназ цитозоля и низкомолекулярного эндогенного непептидного регулятора изатина. Показано, что глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и глицерол-3фосфатдегидрогеназа являются изатин-связывающими белками. Это взаимодействие является специфическим, поскольку показано также, что еще один NAD-зависимый фермент цитозоля - лактатдегидрогеназа - не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина. Определены константа скорости ассоциации и константа скорости диссоциации для пары 5-аминоизатиНим/ГФДГ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гнеденко, Оксана Валентиновна, Москва

1. Ахрем А.А., Лапко А.Г., Лапко В.Н., Морозова Л.А., Репин В.А., Тищенко И.В., Чащин В.Л. Аминокислотная последовательность адренодоксина из митохондрий надпочечника свиньи // Биоорганическая химия, 1978, т. 4, с. 462475.

2. Баранов А.А., Каганов Б.С., Потапов А.С., Зайнудинов З.М. Хронический гепатит В у детей // Вопросы современной педиатрии, 2002, т.1, №3, с. 44-55.

3. Гловер В., Медведев А.Е., Сандпер М. Изатин: возможная роль в функциональном взаимодействии натрийуретических пептидов и моноаминов // Вопр. мед. химии, 1997, т. 43, с. 515-521.

4. Заслонко И.С., Смирнов В.Н., Тереза A.M. Численное моделирование высокотемпературного распада метилнитрата // Кинетика и катализ, 1988, т. 29, вып. 3, с.519 522.

5. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного слоя. М.: Наука. 1981, 293с.

6. Калиткин Н.Н. Численные методы. М.: Наука, 1978, 512с.

7. Карузина И.И., Бачманова Г.И., Ментгазетдинов Д.Э. Выделение и свойства цитохрома Р450 из микросом печени кроликов // Биохимия. 1979, т. 44, с. 1044-1057.

8. Курский М.Д., Костерин С.А., Рыбальченко В.К. Биохимическая кинетика. Киев: Высшая школа, 1977, 262с.

9. Полак Л.С., Гольденберг М.Я., Левицкий А.А. Вычислительные методы в химической кинетике. М.: Наука, 1984, 280с.

10. Робинсон У.С. Вирусология. Под ред. Б. Филдса. М. 1989, т. 3, с. 287-330.

11. Тернер М., Ричарде Ф., Варга Дж., Розенстайн Р., Конигсберг У., Стьюард М., Файнстайн А., Бил Д. Структура и функции антител. Под ред. Глинна Л., Стьюарда М. М.: Мир, 1983, с. 122-125.

12. Цупрун В.Л., Мясоедова К.Н., Берндт П., Зограф О., Черняк В.Я., Арчаков А.И., Скулачев В.П. Гексамерная организация цитохрома Р450, изолированного из микросом печени //Докл. АН СССР, 1985, т. 285, с. 1496-1499.

13. Alexander G.J.M. Immunology of hepatitis В virus infection // Br. Med.Bull., 1990, v. 46, p. 354-367.

14. Almeida J.D., Waterson A.P. Immune complexes in hepatitis // Lancet, 1969, v. 2, p. 983-986.

15. Andersen K.B., Vangran M.H. Gel centrifugation chromatography for macromolecular separations // J. Chromatogr., 1982, v. 240, p. 1-8.

16. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P450 and Active Oxygen. Taylor and Francis: London, 1990, 275p.

17. Ashish В., Murthy G.S. Analysis of human chorionic gonadotropin-monoclonal antibody interaction in BIACORE // J. Biosci., 2004, v. 29, p. 57-66.

18. Authier L., Grossiord C., Brassier P., Limoges B. Gold nanoparticle-based quantitative electrochemical detection of amplified human cytomegalovirus DNA using disposable microband electrodes //Anal. Chem., 2001, v. 73, p. 4450-4456.

19. Bassett S.E., Brasky K.M., Lanford R.E. Analysis of hepatitis С virus (HCV)-inoculated chimpanzees reveals unexpected clinical profiles // J.Virol., 1998, v. 72, p. 2589-2599.

20. Bayer M.E., Blumberg B.S., Werner B. Particles associated with Australia antigen in the sera of patients with leukaemia, Down's syndrome, and hepatitis // Nature (London), 1968, v. 218, p. 1057-1059.

21. Benters R., Niemeyer C.M., Drutschmann D., Blohm D., Wohrle D. DNA microarrays with РАМАМ dendritic linker systems // Nucleic Acids Res., 2002, v. 30, №2, e10.

22. Black S., French J.S., Williams C.H., Coon M.J. Role of a hydrophobic polipeptide in the N-terminal region of NADPH-cytochrome P450 reductase in complex formation with P450 LM // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, v. 91, p. 1538-1539.

23. Black S.D., Coon M.J. Structural features of liver microsomal NADPH-cytochrome P450 reductase. Hydrophobic domain and connection region // J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 5929-5936.

24. Black S., Coon M.J. Studies on the identity of the heme-binding cysteinyl residue in rabbit liver microsomal cytochrome P450 isozyme 2 // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, v. 128, p. 82-89.

25. Black S. Membrane topology of the mammalian P450 cytochromes // FASEB J. 1991, v. 6, p. 680-685.

26. Blanck J., Smettan G., Ristau O., Ingelman-Sundberg M., Ruckpaul K. Mechanism of rate control of the NADPH-dependent reduction of cytochrome P450 by lipids in phospholipid vesicles // Eur. J. Biochem., 1984, v. 144, p. 509-513.

27. Bosterling В., Trudell J.R. Association of cytochrome b5 and cytochrome P450 reductase with cytochrome P450 in the membrane of reconstituted vesicules // J. Biol.Chem., 1982, v. 257, p. 4783-4787.

28. Brown S.E., Howard C.R., Zuckerman A.J., Steward M.W. Determination of the affinity of antibodies to hepatitis В surface antigen in human sera // J. Immunol. Methods, 1984, 72(1), 41-48.

29. Borer P.N. Nucleic acids. In Handbook of Biochemistry and Molecular Biology (Fasman G.D., ed.), CRC, Cleveland, OH, 3rd ed., 1975, Vol I, p. 589.

30. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis С virus: quasispecies and genotypes // Semin. Liver Dis., 1995, v.15, p. 41-63.

31. Cantor C.R., Schimmel P.R. Biophysical Chemistry. Part III. The Behavior of Biological Macromolecules. W.H. Freeman and Co., San Francisco, 1980, 534 p.

32. Carman W.F., Zanetti A.R., Karayiannis P., Waters J., Manzillo G., Tanzi E., Zuckerman A.J., Thomas H.C. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus // Lancet, 1990, v.336, p. 325-329.

33. Carman W.F., Van Deursen F.J., Mimms L.T., Hardie D., Cappola R., Decker R., Sanders R. The prevalence of surface antigen variants of hepatitis В virus in Papua New Guinea, South Africa and Sardinia // Hepatology, 1997, v. 26, p. 16581666.

34. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis В virus // J. Viral Hepatitis, 1997, v. 4, p. 11-20.

35. Chiang Y.L., Coon M.J. Comparative study of two highly purified forms of liver microsomal cytochrome P450: Circular dichroism and other properties // Arch. Biochem. Biophys., 1979, v.195, p. 178-187.

36. Chisari F.V., Ferrari C. Hepatitis В virus immunopathogenesis // Annu.Rev.lmmunol., 1995, v. 13, p. 29-60.

37. Chocholova L., Kolinova M. Effect of isatin (2,3-dioxoindoline) on audiogenic seizures in rats and its relationship to electrographic and behavioural phenomena // Physiol. Bohemoslov, 1979, v. 28, p. 495-502.

38. Chocholova L., Kolinova M. Effect of isatin (2,3 dioxoindoline) on physiological and pathological electrographic manifestations and vigilance // Physiol. Bohemoslov, 1981, v. 30, p. 129-137.

39. Choulier L., Andersson K., Hamalainen M.D., van Regenmortel M.H.V., Malmqvist M., Altschuh D. QSAR studies applied to the prediction of antigen-antibody interaction kinetics as measured by BIACORE // Protein Engineering, 2002, v. 15, p. 373-382.

40. Chu T.-W., Kimura T. Studies on adrenal steroid hydroxylases // J. Biol. Chem., 1973, v. 248, p. 5183-5189.

41. Coghlan V.M., Vickery L.E. Site-specific mutations in human ferredoxin that assect bonding to ferredoxin reductase and cytochrome P450scc // J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 18606-18612.

42. Coon M. J., Chiang Y.L., French J.S. Chemical characterization of enzymes involved In drug metabolism.// The induction of drug metabolism. Estabrook R.W., Lindenlaub E. eds Stuttgart, New York - F.K. Schatlaner Verlag, 1979, p. 201-211.

43. Cramp M.E., Carucci P., Rossol S., Chokshi S., Maertens G., Williams R., Naoumov N.V. Hepatitis С virus (HCV) specific immune response in anti-HCV positive patients without hepatitis С viraemia // Gut., 1999, v. 44, p. 424-429.

44. Crumeyrolle-Arias M.f Medvedev A., Cardona A., Barritault D., Glover V. In situ imaging of specific binding of 3H.isatin in rat brain // J. Neurochem., 2003, v.84, p. 618-620.

45. Dane D.S., Cameron C.H., Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis // Lancet, 1970, v. 1, p. 695-698.

46. Dignam I.D., Strobel W. NADPH-cytochrome reductase from rat liver: purification by affinity chromatography and characterization // Biochem., 1977, v. 26, p. 116-1123.

47. Dubertret В., Calame M., Libchaber A.J. Single-mismatch detection using gold-quenched fluorescent oligonucleotides // Nat. Biotechnology, 2001, v.19, p. 365-370.

48. Dufourcq J., Faucon J.F., Lussian C., Bernon R. Study of lipid-protein interactions in membrane models: intrinsic fluorescence of cytochrome b5 -phospholipid complexes // FEBS Lett., 1975, v. 57, p. 112-116.

49. Eigen M. and Maeyer L. Temperature jump methods. In Investigation of Rates and Mechanisms of Reactions (Hammes, G.G., ed.). 3rd ed., John Wiley & Sons, New York, NY. 1974, p. 79.

50. Eisenberg D., Weiss R.M., Terwillinger T.C., Wilcox W. Hydrophobic moments and protein structure// Faraday Symp. Chem. Soc., 1982, v.17, p.109-120.

51. Estabrook R.W., Werringloer J. The microsomal enzyme system responsible for the oxidative metabolism of many drugs. The induction of drug metabolism. Estabrook R.W., Lindenlaub E., eds. Stuttgart - N.Y., Schattauer F.K. Verlag, 1979, pp. 187-199.

52. Farci P., Alter H.J., Grovindarajan S.,Wong D.C., Engle R., Lesniewski R.R., Mushahwar I.K., Desai S.M., Miller R.H., Ogata N. Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis С virus // Science, 1992, v. 258, p. 135-14.

53. Fedorova O.S., Podust L.M. Application of tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(lll) for the investigation of DNA spatial structure by a chemical modification method // J. Inorg. Biochem., 1988, v. 34, p. 149-155.

54. Francois G., Kew M., Van Damme P., Mphahlele M.J., Meheus A. Mutant hepatitis В viruses: a matter of academic interest only or a problem with farreaching implications?//Vaccine, 2001, v. 19, p. 3799-3815.

55. Freeman W.M., Robertson D.J., Vrana KE. Fundamentals of DNA hybridization arrays for gene expression analysis // Biotechniques, 2000, v. 29, p. 1042-1046.

56. French J.S., Guengerich F.P., Coon M.J. Interaction of cytochrome P450, NADPH-cytochrome P450 reductase, phospholipid, and substrate in the reconstituted liver microsomal enzyme system // J. Biol. Chem., 1980, v. 255, p. 4112-4119.

57. Ganem D., Schneider R.J. Hepadnaviridae and their replication. In: Fields Virology. Knipe D.M., Howley P.M., Chanock R.M., eds. Philadelphia: Lippincott-Raven. 2001, 4th ed., p. 2703-2737.

58. George A. J. Т., Danga R., Gooden C.S.R., Epenetos A.A., Spooner R.A. Quantitative and qualitative detection of serum antibodies using resonant mirror biosensor//Tumor Targeting, 1995, v.1, p. 245-250.

59. Glover V., Halket J.M., Watkins P.J., Clow A., Goodwin B.L., Sandler M. Isatin: identity with the purified endogenous monoamine inhibitor tribulin // J. Neurochem., 1988, v. 51, p. 656-659.

60. Glover V., Medvedev A., Sandler M. Isatin is a potent endogenous antagonist of guanylate cyclase-coupled atrial natriuretic peptide receptors // Life Sci., 1995, v. 57, p. 2073-2079.

61. Gomara M.J., Ercilla G., Alsina M.A., Наго I. Assessment of synthetic peptides for hepatitis A diagnosis using biosensor technology // J. Immunol. Methods, 2000, v. 246, p. 13-24.

62. Gotoh M., Hasegawa Y., Shinohara Y., Shimizu M., Tosu M. A new approach to determine the effect of mismatches on kinetic parameters in DNA hybridization using optical biosensor// DNA Research, 1995, v. 2, p. 285-293.

63. Grab P.J. Hepatitis B: virus, pathogenesis and treatment//Vaccine, 1998, v. 16, p. 11-16.

64. Gum J.R., Strobel H.W. Purified NADPH-cytochrome P450 reductase. Interaction with hepatic microsomes and phospholipid vesicles // J. Biol. Chem., 1979, v. 254, p. 4177-4185.

65. Gum J.R., Strobel H.W. Isolation of the membrane-binding peptide of NADPH-cytochrome P450 reductase //J. Biol. Chem., 1981, v.256, p. 7478-7486.

66. Gunsalus I. C., Sligar S.G. Oxygen reduction by the P-450 monooxygenase systems //Adv. Enzymol., 1978, v. 47, p. 1-44.

67. Hadler S.C., Margolis H. Viral hepatitis. In: Evans A.S., editor. Viral infections of humans. Epidemiology and control. New York: Plenum medical Book Company. 1998, p. 351-391.

68. Haniu M., Armes L.G., Yasunobi K.T., Shastry B.A., Gunsalus I.C. Amino acid sequence of the Pseudomonas putida cytochrome P-450. Parts I and II // J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 12657-12667.

69. Hanukoglu I. Steroidogenic enzymes structure, function and role in regulation of steroid hormone biosynthesis // J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1992, v. 43, p. 779804.

70. Heinemann F.S., Ozols J. The complete amino acid sequence of fenobarbital induced liver microsomal cytochrome P450 // J. Biol. Chem., 1983, v. 258, p. 41954201.

71. Heyse S., Stora Т., Schmid E., Lakey J.H., Vogel H. Emerging techniques for investigating molecular interactions at lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta, 1998, v. 85507, p. 319-338.

72. Hilleman M.R. Vaccine perspectives from the vantage of hepatitis В // Vaccine Research, 1992, v. 1, p. 1-15.

73. Holloway P.W., Katz T.J. Effect of cytochrome b5 on the size, density, and permeability of phosphatidylcholine vesicles // J. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 90029007.

74. Honda M., Brown E.A., Lemon S.M. Stability of a stem-loop involving the initiator AUG controls the efficiency of internal initiation of translation on hepatitis С virus RNA // RNA, 1996, v. 2, p. 955-968.

75. Jansson I., Schenkman I.B. Studies on three microsomal transfer enzyms systems//Arch. Biochem. Biophys., 1977, v. 178, p. 89-107.

76. Jakoby M.G., Covey D.F., Cistola D.P. Localization of tolbutamide binding sites on human serum albumin using titration calorimetry and heteronuclear 2-D NMR // Biochemistry, 1995, v. 34, p. 8780-8787.

77. Jensen K.K., Orum H., Nielsen P.E., Norden B. Kinetics for hybridazation of peptide nucleic asids (PNA) with DNA and RNA studied with the BIAcore technique // Biochemistry, 1997, v. 36, p. 5072-5077.

78. Jokelainen P.T., Krohn K., Prince A.M., Finlayson N.D.C. Electron microscopic observations on virus-like particles associated with SH antigen // J. Virol., 1970, v. 6, p. 685-689.

79. Knorre D.G., Vlassov V.V. Complementary-addressed (sequence-specific) modification of nucleic acids // Progr. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 1985, v. 32, p. 291320.

80. Koh D.W., Patel C.N., Ramsinghani S., Slama J.T., Oliveira M.A., Jacobson M.K. Identification of an inhibitor binding site of poly(ADP-ribose) glycohydrolase // Biochemistry, 2003, v. 42(17), p. 4855-4863.

81. Kondo K., Tajima S., Sato R., Narita K. Primary structure of the membrane-binding segment of rabbit cytochrome b5 // J. Biochem., 1979, v. 86, p. 1119-1128.

82. Koziel M.J. Immunology of viral hepatitis//Am. J. Med., 1996, v. 100, p. 98-109.

83. Kumar P. Isatin inhibition of rat testicular alkaline phosphatase. A non-allosteric phenomenon // Enzyme, 1979, v. 24, p. 152-157.

84. Medvedev A.E., Goodwin B.L., Clow A., Halket J.M., Glover V., Sandler M. Inhibitory potency of some isatin analogues on human monoamine oxidase A and В //Biochem. Pharmacol., 1992, v. 44, p. 590-592.(a)

85. Medvedev A.E., Gorkin V.Z., Fedotova I.В., Semiokhina A.F. Monoamine oxidase inhibitors, as anticonvulsants // Can. J. Physiol. Pharmacol., 1994, 71 (Suppl. 1) 400.(a)

86. Medvedev A.E., Gorkin V.Z., Fedotova I.В., Semiokhina A.F., Sandler M., Glover V. Antiseizure effect of isatin and reduction of monoamine oxidase activity in rats with experimental audiogenic seizures // Med. Sci. Res. 1994, v. 22, p. 555-557.(b)

87. Medvedev A.E., Clow A., Sandler M., Glover V. Isatin a link between natriuretic peptides and monoamines? // Biochem. Pharmacol., 1996, v.52, p. 385-391.

88. Medvedev A., Sandler M., Glover V. Interaction of isatin with type A-natriuretic peptide receptor: possible mechanism // Life Sci., 1998,v. 62, p. 2391-2398.

89. Medvedev A.E., Goodwin B.L., Sandler M., Glover V. Efficacy of isatin analogues as antagonists of rat brain and heart atrial natriuretic peptide receptors coupled to particulate guanylyl cyclase // Biochem. Pharmacol., 1999, v. 57, p. 913915.

90. Miwa G.T., Lu A.Y.H. Studies on the stimulation of cytochrome P450-dependent monooxygenase activity by dilauroylphosphatidylcholine // Arch. Biochem. Biophys., 1981, v. 211, p. 454-458.

91. Moriya K., Fujie H., Shintani Y., Yotsuyanagi H., Tsutsumi Т., Ishibashi K., Matsuura Y., Kimura S., Miyamura Т., Koike K. The core protein of hepatitis С virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice // Nat. Med., 1998, v. 4, p. 1065-1067.

92. Muller M. Vergleichende pharmacologische Studien mit Indole und Isatin. Med. Exp. 1962, v.7, p. 155-160.

93. Murray R.L., Gunsalus I.C., Dus K.M. Active site studies of cytochrome P-450cam. I. Specific cysteine labeling with the affinity reagent isobornyl bromacetate as a model for substrate binding //J. Biol. Chem., 1982, v.257, p. 12513-12525.

94. Myszka D.G., Morton T.A., Doyle M., Chaiken I.M. Kinetic analysis of a protein antigen-antibody interaction limited by mass transport on an optical biosensor // Biophys. Chem., 1997, v. 64, p. 127-137.

95. Myszka D.G., Rich R.L. Implementing surface plasmon biosensors in drug discovery // Pharm. Sci. Technol. Today, 2000, v. 3(9), p. 310-317.

96. Nassar A-E.F., Zhang Z., Chynwat V., Frank M.A., Rusling J.E. Orientation of myoglobin in cast multibilayer membranes of amphiphilic molecules // J. Phys. Chem., 1995, v. 99, p. 11013-11017.

97. Natsume Т., Nakayama H., Jansson O., Isobe Т., Takio K., Mikoshiba K. Combination of biomolecular interaction analysis and mass spectrometric amino acid sequencing //Anal.Chem., 2000, v. 72(17), p. 4193-4198.

98. Nedelkov D., Rasooly A., Nelson R.W. Multitoxin biosensor-mass spectrometry analysis: a new approach for rapid, real-time, sensitive analysis of staphylococcal toxins in food // Int. J. Food Microbiol., 2000, v. 60, p. 1-13.

99. Nelson R.W., Nedelkov D., Tubbs K.A. Biosensor chip mass spectrometry: a chip-based proteomics approach // Electrophoresis, 2000, v. 21(6), p. 1155-1163.

100. Nisimoto Y., Otsuka-Murakami. Cytochrome b5, cytochrome c, and cytochrome P-450 interactions with NADPH-cytochrome P-450 reductase in phospholipid vesicles // Biochemistry, 1988, v.27(16), p. 5869-5876.

101. Noshiro M., Harada N. Omura T. Immunological study on the route of electron transfer from NADH and NADPH to cytochrome P450 of liver microsomes // J. Biochem., 1980, v. 88, p. 1521-1535.(a)

102. Novotny L.A., Jurcisek J.A., Pichichero M.E., Bakaletz L.O. Epitop mapping of the outer membrane protein P5-homologous fimbrin adhesin of nontypeable Haemophilus influenzae// Infect Immun., 2000, v. 68(4), p.2119-2128.

103. Omata Y., Albara K., Ueno Y. Conformation between the substrate binding side and heme studied by excitation energy transfer // Biochim. Biophys. Acta, 1987, v. 912, p. 115-123.

104. Omura Т., Sato R. The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes. 1. Evidence for its hemoprotein nature. 2. Solubilization, purification and properties // J. Biol. Chem., 1964, v. 239, p. 2370-2385.

105. Omura Т., Takesue S. A new method for simultaneous purification of cytochrome b5 and NADH-cytochrome b5 reductase from rat liver microsomes // J. Biochem., 1970, v. 67, p. 249-257.

106. Panova N.G., Zemskova M.A., Axenova L.N., Medvedev A.E. Does isatin interact with rat brain monoamine oxidases in vivo?// Neurosci. Lett., 1997, v. 233, p. 58-60.

107. Pape G.R., Gerlach T.J., Diepolder H.M., Gruner N., Jung M., Santantonio T. Role of the specific T-cell response for clearance and control of hepatitis С virus // J. Viral. Hepat., 1999, v. 6, p. 36-40.

108. Patil S.D., Prakash K., Hedge S.N. Inhibition by isatin of Na+-dependent glucose and amino acid transport in pigeon intestine // Indian J. Biochem. Biophys. 1985, v. 22, p. 249-251.

109. Prince A.M., Brotman В., Huima Т., Pascual D., Jaffery M., Inchauspe G. Immunity in hepatitis С infection //J. Infect. Dis., 1992, v. 165, p. 438-443.

110. Ramsden J.J., Bachmanova G.I., Archakov A.I. Kinetic evidence for protein clustering at a surface // Phys. Rev., 1994, v.50, p. 5072-5076.

111. Ramsden J.J., Bachmanova G.I., Archakov A.I. Immobilization of proteins to lipid bilayers // Biosensor Bioelectron, 1996, v. 11, p. 523-528.

112. Robinson N.C., Tanford С. The binding of deoxycholate, Triton X-100, sodium dodecyl sulfate, and phosphatidylcholine vesicles to cytochrome b5 // Biochemistry, 1975, v.14, p. 369-378.

113. Roseman M.A., Holloway P.W., Calabro M.A., Thompson Т.Е. Exchange of cytochrome b5 between phospholipid vesicles // J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 4842-4849.

114. Ruckpaul K., Rein H., Blanck J., Coon M.J. Molecular mechanism of interactions between phospholipids and liver microsomal cytochrome P450 LM2 //Acta Biol. Med. Germ., 1982, v. 41, p. 193-203.

115. Ruckpaul K., Rein H. Cytochrome P450. Berlin, Academie Verlag, 1984, p. 111162, 405.

116. Ruster В., Zeuzem S., Roth W.K. Hepatitis С virus sequences encoding truncated core proteins detected in a hepatocellular carcinoma // Biochem. Biophis. Res. Comm., 1996, v. 219, p. 911-915.

117. Sakaguchi M., Mihara K., Sato R. A short amino-terminal segment of microsomal cytochrome P450 functions both as an insertion signal and as a stop-transfer sequence // EMBO J., 1987, v. 6, p. 2425-2431.

118. Sareen K., Kohli R.P., Amma M.K.P., Gujral M.L. Anticonvulsant drugs based on the neurochemistry of seizures // Indian J. Physiol. Pharmacol., 1962, v. 6, p.87-93.

119. Sato R. Distribution and physiological function. Cytochrome P450, edited by Sato R. and Omura T. (Kodansha L.T.D. Acad. Press, N.Y.- Tokyo), 1978, p. 2335.

120. Sato R., Imai Y., Taniguchi H. Reaction mechanism of liver microsomal cytochrome P450 as studied by reconstituted techniques. The induction of drug metabolism. Estabrook R.W. eds Stuttgart - N.Y., 1979, pp. 213-224.

121. Seeger C., Mason W.S. Hepatitis В virus biology // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000, v. 64, p. 51-68.

122. Shaw M.A., Ostap E.M., Goldman Y.E. Mechanism of inhibition of skeletal muscle actomyosin by N-benzyl-p-toluenesulfonamide // Biochemistry, 2003, v. 42(20), p. 6128-6135.

123. Shimizu T.t Nazawa Т., Hatano M., Satake H., Imai Y., Hashimoto S., Sato R. Circular dichroism spectra of purified cytochromes P-450 from rabbit liver microsomes// Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 579, p.122-133.

124. Singh В., Sharma R., Sareen K.N., Sohal M.S. Isatin enzyme interactions. V. Activation of rat liver acid phosphatase // Enzyme, 1977, v. 22, p. 256-261.

125. Skubitz К. M., Smith T. W. Determination of antibody-hapten association kinetics: a simplified experimental approach // J. Immunol., 1975, v. 114, p. 13691374.

126. Southern E., Mir K., Shchepinov M. Molecular interactions on microarrays // Nature Genet., 1999, v. 21, p. 5-9.

127. Spatz L., Strittmatter P. A form of cytochrome b5 that contain on additional hydrophobic sequence of 40 amino acid residues // Proc. Natl. Acad. Sci., 1971, v. 68, p. 1042-1046.

128. Ste'phenne J. Recombinant versus plasma derived hepatitis В vaccines: issues of safety, immunogenicity and cost-effectiveness//Vaccine, 1988, v. 6, p. 299-303.

129. Ste'phenne J. Development and production aspects of a recombinant yeast-derived hepatitis В vaccine // Vaccine, 1990, v.8, p. 69-73.

130. Sullivan M.R., Holloway P.W. The binding of cytochrome b5 to phosphatidylcholine vesicle//Biochem. Biophys. Res. Commun., 1973, v. 54, p. 808815.

131. Taniguchi H., Imai Y., Sato R. Role of the electron transfer system in microsomal drug monooxygenase reaction catalyzed by cytochrome P450 // Arch. Biochem. Biophys., 1984, v. 232, p. 585-596.

132. Taton T.A., Mirkin C.A., Letsinger R.L. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes // Science, 2000, v. 289, p. 1757-1760.

133. Tatton W., Chalmers-Redman R., Tatton N. Neuroprotection by deprenyl and other propargylamines: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase rather than monoamine oxidase В // J. Neural Transm., 2003, v.110, p. 509-515.

134. Thanavala Y.M., Brown S.E., Howard C.R., Roitt I.M., Steward M.W. A surrogate hepatitis В virus antigenic epitope represented by a synthetic peptide and an internal image antiidiotype antibody//J. Exp. Med., 1986,164(1), 227-236.

135. Uvarov V.Yu., Leshenko A.V., Rukavishnikov I.G., Dzhuzenova Ch.S., Archakov A.I. Effect of microenviroment and intermolecular cross-linking on the tertiary structure of cytochrome P450LM2 // Biokhimiya, 1988, v. 53, p. 1433-1438.

136. Uvarov V.Yu., Tretiakov V.E., Leshenko A.V., Rukavishnikov I.G., Dzhuzenova Ch.S., Tretiakova L.Z., Archakov A.I. Effect of microenviroment on the tertiary structure of cytochrome P450LM2 // Eur. J. Biochem., 1990, v. 181, p. 391-396.

137. Villano S.A., Vlahov D., Nelson K.E., Kohn S., Thomas D.L. Persistence of viremia and the importance of long-term follow-up after acute hepatitis С infection // Hepatology, 1999, v. 29, p. 908-914.

138. Voznesensky A.I., Schenkman J.B. Quantitative analysis of electrostatic interactions between NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome P450 enzymes//J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 15724-15731.

139. Vuk-Pavlovic S., Blatt Y., Glaudemans C.P., Lancet D., Pecht I. Hapten-linked conformational equilibria in immunoglobulins XRPC-24 and J-539 observed by chemical relaxation // Biophys. J.f 1978, v. 24, p. 161-174.

140. Waters J.A., Kennedy M., Voet P., Hauser P., Petre J., Carman W., Thomas H. C. Loss of the common "a" determinant of hepatitis В surface antigen by a vaccine-induced escape mutant//J. Clin. Invest., 1992, v.90, p. 2543-2547.

141. Welschof M., Terness P., Kipriyanov S.M., Stanescu D., Breitling F., Dorsam H., Dubel S., Little M., Opelz G. The antigen-binding domain of a human lgG-anti-F(ab')2 autoantibody//Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1997, v. 94, p. 1902-1907.

142. Wiedermann G., Ambrosch F., Kremsner P., Kunz C., Hauser P., Simoen E., Andre F., Safary A. Reactogenicity and immunogenicity of different lots of a yeast-derived hepatitis В vaccine//Postgrad Med. J., 1987, v. 63, p. 109-113.

143. Yamaguchi N., Tokushige K., Yamauchi K., Hayashi N. Humoral immune response in Japanese acute hepatitis patients with hepatitis С virus infection // Can. J. Gastroenterol., 2000, v. 14, p. 593-598.

144. Yang C.S., Baskin L.B., Wu N.S. Lateral mobility and organization of microsomal proteins. In: Abstracts of 5-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. Tokio, Japan, 1981, p. 6.

145. Yasukochi Y., Maters B.S. Some properties of a detergent-solubilized NADPH-cytochrome с (cytochrome P450) reductase: purified by biospecific affinity chromatography//J. Biol. Chem., 1976, v. 251, p. 5337-5344.

146. Yeung D., Gill A., Maule C.H., Davies R.J. Detection and quantification of biomolecular interactions with optical biosensors // Trends in analytical chemistry, 1995, v. 14, p. 49-56.

147. Yun C.-H., Ahn Т., Guengerich F.P. Conformational change and activation of cytochrome P4502B1 induced by salt and phospholipid // Arch. Biochem. Biophys., 1998, v. 356, p. 229-238.

148. Zammatteo N., Jeanmart L., Hamels S., Courtois S., Louette P., Hevesi L., Remacle J. Comparison between different strategies of covalent attachment of DNA to glass surfaces to build DNA microarrays II Anal. Biochem., 2000, v. 280, p. 143150.

Информация о работе

Гнеденко, Оксана Валентиновна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Оптико-биосенсорный анализ белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных взаимодействий в реальном времени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы