Оптико-биосенсорный анализ термодинамических характеристик белок-белковых комплексов

Раченкова, Наталья Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптико-биосенсорный анализ термодинамических характеристик белок-белковых комплексов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оптико-биосенсорный анализ термодинамических характеристик белок-белковых комплексов"

На правах рукописи

РАЧЕНКОВА Наталья Ивановна

ОПТИКО-БИОСЕНСОРНЫЙ АНАЛИЗ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ.

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических пау* Иванов Юрий Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Соколов Николай Николаевич

доктор биологических наук, Штемберг Андрей Сергеевич

ТЦчутттяд организация:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится "_" _2006г. в _ часов на заседании Диссертационного совета

Д 001.010.01 при ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д.10, корп. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д.10, корп. 1.

Автореферат разослан декабря 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук ^

В.С. Былинкина

iâSfci

S jJt

/•"s

2>S

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Актуальность исследования белок-белковых взаимодействий обусловлена их важной ролью в реализации жизненно-важных функций в организме. В то же время белок-белковые взаимодействия являются наиболее перспективной мишенью лекарственных веществ [Veselovsky et al., 2002]. При конструировании лекарственных форм нового поколения бывает необходимо выявить и охарактеризовать функциональные белковые комплексы с целью предсказания влияния лекарства на взаимодействие белков в этих комплексах.

Для адекватного описания белок-белкового взаимодействия важно знать кинетические параметры комплексообразования (константы скоростей образования и распада комплексов), а также термодинамические параметры этих реакций (энтальпию и энтропию). Анализ значений термодинамических величин может раскрыть природу сил, связывающих молекулы друг с другом.

В настоящее время существуют различные методы определения характеристик комплексообразования: спектрофотометрический метод, метод изотермальной титрадионной калориметрии, метод тушепия флуоресценции и т.д. Однако, как правило, они не позволяют измерить одновременно все перечисленные выше параметры, либо обладают сравнительно невысокой чувствительностью [Данилов и соавт., 1986] и требуют большого количества образца. Новые методы, основанные на использовании ианотехнологии, такие как оптический биосенсор, позволяют быстро и с высокой точностью определять одновременно все кинетические характеристики: константы скоростей образования и распада комплексов, константы ассоциации и диссоциации, энтальпию и энтропию реакции комплексообразования [Stites, 1997]. Преимуществом метода оптического биосенсора также является то, что он позволяет регистрировать в реальном времени межмолекулярные взаимодействия без введения каких-либо меток в анализируемые молекулы. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью (до 10"12 М) и быстротой анализа - несколько минут [Davies et al., 1994]. Метод оптического биосенсора в последнее время широко используется для определения кинетических параметров белок-белковых взаимодействий [Ivanov et al., 2001; Ivanov et al., 2001; Ivanov et al., 1997; Ivanov et al-, 1999; Archakov and Ivanov, 1999; Морозов и соав., 1999; Ivanov et al., 2000; Ivanov et al., 1999].

В данной работе был использован метод оптического биосенсора для изучения белок-белковых взаимодействий следующих белковых пар: белки цитохром Р450-содержащей системы и протеолитические ферменты.

Протеолитические ферменты представляют огромный интерес для изучения, так как играют важную роль в обмене веществ всех живых организмов Кртпги-иттгнб^рм

i.i . ' Г t аА

протеолитнческих ферментов чрезвычайно широко распространены и встречаются у животных, растений и микроорганизмов. Имеются данные о том, что присутствие значительных количеств ингибиторов протеиназ в пищевых продуктах может играть благоприятную роль, например, препятствовать развитию ряда злокачественных образований, таких как рак простаты, прямой кишки, грудной полости и некоторых других [Troll and Wiesner, 1983]. Ингибиторы протеиназ могут играть важную роль в защите растений от поражения вредными насекомыми и патогенными микроорганизмами [Мосолов, 1983; Richardson, 1977].

Калликреин - кининовая система (ККС) является ключевой протеолитической системой, участвующей в регуляции широкого спектра физиологических функций организма и развитии многих патологических состояний. Этим объясняется большой интерес к структурно - функциональным особенностям и молекулярной биологии отдельных компонентов системы, молекулярным механизмам их взаимодействия и связи с другими системами регуляции. Накопленный в этой области за последние два десятилетия материал проясняет роль ККС в морфогенезе клеток, контроле тонуса гладкой мускулатуры некоторых органов, снижении кровяного давления, увеличения проницаемости сосудистой стенки, в том числе гематоэнцефалического барьера, развитии воспаления, трансформации клеток и других физиологических и патологических процессов [Яровая, 2000]. Протеолитические ферменты к настоящему времени исследованы достаточно подробно. Системы трипсин-ингибитор, калликреин-ингибитор являются хорошими модельными системами для изучения белок-белковых взаимодействий.

Актуальность изучения взаимодействия цитохром Р450-содержащих систем обусловлена их важной ролью в организме, так как эти системы ответственны за протекание ключевых биологических реакций, в которых участвуют посредством белок-белковых взаимодействий [Archakov and Bachmanova, 1990]. Цитохром Р450-содержащие монооксигеназные системы ответственны за метаболизм широкого класса эндогенных (холестерин, стероидные гормоны, простагладины) и экзогенных (лекарственные препараты, канцерогены, мутагены) веществ. Превращая исходный гидрофобный субстрат в более полярный продукт, цитохромы Р450 выполняют функцию по удалению неполярных молекул из организма и препятствуют накоплению токсичных гидрофобных соединений. В литературе описана возможность образования белкового комплекса цитохромов Р450саш/Ь5, так называемая модель "якоря". Оптический биосенсор позволяет изучать взаимодействия в гетерологических системах, когда один белок ковалентно пришит к поверхности, а другой добавляется в растворе. Таким образом, можно смоделировать взаимодействие мембранного цитохрома Ь5 и водорастворимого цитохрома Р450саш, а также рассчитать кинетические и

термодинамические параметры. Изучение дапной пары носит фундаментальный характер, так как может быть использовано в качестве модельной системы.

Циклоспорины - совершенно новый класс иммуносупрессивных препаратов. Это циклические пептиды, продуцируемые грибками. К белкам группы циклоспоринов относятся циклоспорин А, рапамицин, ЕК.-506, они обладают сходным механизмом действия. Рапамицин - макролид, выделенный из вгерЬошусез Ы^овсорюш. Рапамицин, лекарственный препарат, широко используемый для предотвращения отторжения трансплантированных органов, также он может найти применение и в онкологии. Как показали американские исследователи, его применение во время курса лучевой терапии опухолей головного мозга резко снижает вероятность прогрессирования опухолевого процесса и вероятность развития рецидивов [Зимин, 2002].

Цитолитические токсины (цитолизины) - это вещества белковой природы, которые при взаимодействии с цитоплазматической мембраной вызывают нарушение её структуры, приводящее к потере морфологической целостшхпи клеток. В настоящее время возрос интерес к веществам, обладающим мембранотропным и/или цитосгатическим действием, лежащим в основе противоопухолевого, кардиоешмулирующего, дерматонекротического, антимикробного, антипаразитарного и других фармакологических свойств этих соединений, и в последнее десятилетие в изучении цитолизинов актиний наблюдается значительный прогресс [Аш1ег1иЬ, Мабек, 2002].

Целью настоящей работы являлось создание стабильных белоксодержащих биочипов для определения кинетических и термодинамических параметров формирования и распада белок-белковых комплексов с помощью оптического биосенсора:

- Трипсин/соевый ингибитор трипсина,

- а-химотрипсин/основной панкреатический ингибитор трипсина,

- калликреин/соевый ингибитор трипсина,

- Р450 сатД-Ь5, Р450 сат/<3-Ь5,

- рапамици н/ПС-связывающий белок,

- О-актинЛиХ-Б II.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: • Произвести экспериментальный подбор условий ковалентной иммобилизации каждого из белков-партнеров на подложке оптического биосенсора для создания стабильных биочипов с целью исследования взаимодействий белковых пар: трипсин/соевый ингибитор трипсина, а-химотрипсин/основной панкреатический ингибитор трипсина, калликреин/ соевого ингибитора трипсина, Р450сатЛ-Ь5, Р450сатЛ1-Ь5, рапамицин/РК-связывающий белок, 0-актинЛ1ТХ-8 II.

• Осуществить подбор регенерационных буферов для полного распада комплексов, не приводящий к деградации иммобилизованного белка.

• Разработать методику измерения и определить температурную зависимость констант скорости образования и распада белок-белковых комплексов с помощью оптического биосенсора и рассчитать термодинамические параметры формирования белковых комплексов.

• Подтвердить теоретические представления о том, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары Р450сатЛ-Ь5, но не Р450сат/с1-Ь5.

Научная новизна работы.

1. Разработана методика ковалентной иммобилизации на поверхности кюветы оптического биосенсора следующих белков: трипсина, соевого ингибитора трипсина, а-химотрипсина, основного панкреатического ингибитора трипсина, калликреина, Р450сат, Ь Ъ5, <1-Ь5, рапамицина, ПС-связывающего белка, О-актина и ИТХ-Б П.

2. Впервые измерены зависимости констант скорости образования и распада комплексов от температуры и рассчитаны константы равновесия, энтальпии и энтропии реакций комплексообразования Р450сатЛ-Ь5, рапамтщн/РК-связывающий белок, О-актин/ЯТХ-8 П.

3. Показано, что энтропийная составляющая играет ведущую роль в образовании комплексов: Р450сашЛ-Ь5, рапамицин/РК-связывающий белок, О-актин/ЯТХ-Б П.

4. Подтверждены теоретические представления о том, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары Р450сатЛ-Ь5, но не Р450сатЛ1-Ь5.

Научно-практическая ценность работы:

• Созданы стабильные оптикобиосенсорные белоксодержащие биочипы, которые позволяют измерять кинетические характеристики белок-белковых взаимодействий.

• Полученные температурные зависимости констант скоростей образования и распада комплексов могут быть использованы для проверки математических моделей, описывающих эти взаимодействия.

• Измеренные кинетические и термодинамические параметры важны для поиска мишеней и конструирования лекарственных форм нового поколения.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на следующих конференциях:

15th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation: Chemical Biology in the Postgenomic Era New Approaches and Applications (Mainz, Germany, 2004);

International Symposium "Nano and Giga Challenges in Microelectronics Research and Development Opportunities" (Cracow, Poland, 2004);

Региональная научная конференция "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2004);

14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics (Dallas, Texas, U.S.A., 2005);

HUPO 4th Annual World Congress from Defining the Proteome to Understanding Function (Munich, Germany, 2005).

Апробация диссертации состоялась 16 ноября 2005 года на межлабораторном семинаре ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Орсховича РАМН.

Структура в объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 128 страниц машинописного текста, 9 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 196 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Прибор. Биосенсор "резонансное зеркало"

При выполнении работы использовали двухканальный оптический биосенсор "резонансное зеркало" IAsys plus компании Affinity Sensors (Кэмбридж, Англия). Объем реакционной смеси в кювете двухканального биосенсора 60 мкл. Образцы вносили непосредственно в кювету. Постоянную температуру поддерживали с помощью элемента Пелтье, встроенно! о в оптический биосенсор. Частота колебаний мешалки - 98 Гц.

Химические реактивы. 0.4М 1-этил-ЗЧЗ-диметил-аминопропил)карбодиимид (EDC) и 0,1М N-гидроксисукцинимид (NHS), 1 М этаноламин были получены из Affinity sensors (Кэмбридж, Англия). Остальные химические реактивы были приобретены у фирмы "Реахим" (Москва, Россия).

Белки. Мембранный полпоразмерный белок Ь5 (d-b5) был выделен по модифицированному методу Spatz and Stittmatter [Spatz and Stittmatter, 1971]. В работе использовался препарат цитохрома Ь5 с удельным содержанием 48-52 нмоль/мг белка, соотношением А41з/а276=0.6.

Очищенный фрагмент Ь5 (t-b5) был выделен по методу Omura and Takesue ич микросом печени кролика с последующей обработкой трипсином [Omura and Takesue, 1970]. Полноразмерная и укороченная формы белка Ь5 были выделены и любезно предоставлены

к.б.н. Семенковой Н.Ф., к.б.н. Кузнецовой Г.П. и д.б.н. Карузиной И.И. (ГУ НИИ Биомедицинской химии им. Ореховича РАМН, Москва).

Р450саш был экспрессирован из Escherichia coli, штамм TBI. Белки были выделены па апион-обменной хроматографической колонке и очищены до гомогенного состояния, как описано в [Gunsalus and Wagner, 1978] и любезно предоставлены доктором Уи Бон Уа (Institut de Biologie Physico Chemigue, Париж, Франция).

Актинопорин RTX-S II был выделен в гомогенном состоянии из тропической актинии R. macrodactylus и любезно предоставлен к.б.н. Клышко Е. (Тихоокеанский институт биоорганической химии РАН).

Трипсин (РРТ) и соевый ингибитор трипсина (STI), альфа-химотрипсин (ВРС) и основной панкреатический ингибитор трипсина (BPTI), калликреин (РРК), рапамицин, FK-связывающий белок, G-актин были приобретены у фирмы Sigma (США).

Спектральные методы анализа.

Концентрацию пигохрома Р450сат (в окисленной субстрат-связанной форме) определяли на спектрофотометре "HP 8453А" (Hewlett Packard, США) в 50 мМ трис-HCl буфере, pH 7.4, содержащем 200 мМ KCl и 0.4 мМ камфоры, используя коэффициент молярной экстинции Аз»] = 102 мМ 'см"1 [Gunsalus and Sligar 1978].

Концентрацию шггохрома Ь5 определяли из разностного спектра поглощения на спектрофотометре "HP 8453А" (Hewlett Packard, США) в 100 мМ KP буфере, pH 7.4, использую коэффициент молярной экстинции кш-кл восстановленной формы 165 мМ"'см"' [Omura and Sato 1964].

Иммобилизация на карбоксиметилдекстпановую и амииосилановую юоветы

Иммобилизация осуществлялась за счет образования пептидной связи между аминогруппой иммобилизуемого белка и активированной карбоксильной группой декстрановой подложки (в случае использования карбоксиметилдекстрановой подложки) или за счет образования связи между аминогруппой иммобилизованного белка и активированной аминогруппой аминосилановой поверхности (в случае использования аминосилановой подложки). В качестве иммобилизуемого лиганда поочередно использовали каждый из белков-партнеров. Концентрация иммобилизованного белка зависит от нескольких факторов: от pH и ионной силы иммобилизационного буфера, от концентрации и времени иммобилизации лиганда [User's Guide/Affinity Sensors].

Поверхностная концентрация иммобилизованного белка (I, молекул/мм2) была вычислена по формуле I =R3 1012/Мг, где R - интенсивность сигнала, Мг - молекулярная масса белка:

Контрольный канал был модифицирован по такой же процедуре, как и рабочий, за исключением того, что в иммобилизационный буфер в контрольный канал, добавлялся не белковый раствор, а буферный раствор, не содержащий никакого белка. Контрольный канал использовался для учета неспецифического взаимодействия белка с подложкой.

Процедура иммобилизации РРТ и STI.

Каждый из белков-партнеров был поочередно иммобилизован на подложке кюветы оптического биосенсора (ковалентное связывание аминогруппы белка с карбоксиметилдекстрановой подложкой, активированной с помощью 1-этил-3-(3-диметил-аминопропил)карбодиимида и N-гидроксисукцинимида [Ivanov et al., 2000]. Иммобилизация трипсина проводилась в течение 10 мин в 20 мМ боратном буфере, рН 8,5; а соевого ингибитора трипсина в течение 20 мин в 10 мМ ацетатном буфере, рН 5,0. После иммобилизации нековалентно связанный белок был удален из кюветы посредством ее промывки буфером PBS/T. Непрореагировавшие карбоксильные группы на декстрановой поверхности были дезактивированы 1 M этаноламином, рН 8,5, после чего кювета была промыта PBS/t. Поверхностная концентрация иммобилизованного PPT (PPTim) составила (1,2±0Д)*10И молекул/мм2 , a STT (STTim) составила (2,6±0,2)*10' молекул/мм2

Измерения белок-белковых взаимодействий проводились в диапазоне концентраций добавляемого белка (0,6-2,0 мкМ) в измерительной кювете.

Процедура иммобилизации ВРС и BPTI.

Иммобилизация альфа-химотрипсина была проведена в течение 10 мин в 20 мМ боратном буфере при рН 8,5; а основного панкреатического ингибитора трипсина 15 мин в 10 мМ ацетатном буфере при рН 5,0. После иммобилизации нековалентносвязанный белок был удален из кюветы посредством сс промывки буфером PBS/T. Непрореагировавшие карбоксильные группы на декстраповой поверхности были дезактивированы 1 M этаноламином, рН 8,5, после чего кювета была промыта PBS/t. Поверхностная концентрация иммобилизованного ВРС (ВРСщ) составила (9,3±0,2)*1010 молекул/мм2 , a BPTI (BPTIim) составила (2,5±0,2)*10п молекул/мм2

Измерения белок-белковых взаимодействий проводились в диапазоне концентраций добавляемого белка (0,02-0,2 мкМ) в измерительной кювете.

Процедура иммоб^ЛИМ"™ РРК и STI.

Иммобилизация калликреина была проведена в течение 10 мин в 10 мМ ацетатном буфере, рН 4,5; а соевого ингибитора трипсина 20 мин в 10 мМ ацетатном буфере, рН 5,0, нековалентносвязанный лиганд был удален из кюветы посредством ее промывки буфером PBS/T. Непрореагировавшие карбоксильные группы на декстрановой поверхности были дезактивированы 1 M этаноламином, рН 8,5, после чего кювета была промыта PBS/t.

Поверхностная концентрация иммобилизованного РРК (РРК,т) составила (1,9±0,2)*10'° молекул/мм2, a STI (STTm,) составила (2,6±0,2)* 1011 молекул/мм2

Измерения белок-белковых взаимодействий проводились в диапазоне концентраций добавляемого белка (1,0-3,0 мкМ) в измерительной кювете.

Процедура иммобилизации Р450 cam с t-. d-b5.

Иммобилизация t-b5 и d-b5 выполнялась в 10 мМ Na-ацетатном иммобилизационном буфере при рН 4,5 в течение 25 мин и 40 мин, соответственно. Иммобилизация Р450саш выполнялась в течение 15 минут в 10 мМ Na-ацетатном иммобилизационном буфере, рН 5,0. Нековалентно связанный лиганд был удален из кюветы путем ее промывки буфером PBS/T (138 мМ NaCI, 2,7 мМ KCI, 0,05% Твин 20, 10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,4,). Непрореагировавшие карбоксильные группы на декстрановой поверхности были блокированы 1 М этаноламином (рН 8,5) с последующей промывкой PBS/T. Поверхностная концентрация белка для иммобилизованных t-b5 (t-b5m), d-b5 (d-b5m) и P450cam (Р450сат,т) составила (1,1±0,2)-10п, (7,5±ОД)-Ю10 и (4,2±0Д)-Ю10 молекул/мм2, соответственно.

Измерения белок-белковых взаимодействий выполнялись при избыточных концентрациях в измерительной кювете лиганда в диапазоне 0,25 - 0,75 мкМ.

Процедура иммобилизации FK-связывающего белка.

В течение 30 минут активировали аминогруппы в рабочем и контрольном каналах аминосклановой кюветы полимеризованным глютаровым альдегидом. Затем в течение 10 минут промывали 10мМ КФБ, рН 7,7. Один из белков-партнеров, в данном случае - FKPB, добавляли только в рабочий канал и инкубировали не менее 30 минут, затем оба канала промывали 10 мМ КФБ, рН 7,7. Рабочий канал был отмыт от нековалентно связавшегося белка 10 мМ НС1. Непрореагировавшие реакционные центры рабочего канала, а также аминогруппы контрольного канала были блокированы 1М этаноламином, рН 8,5, после чего оба канала вновь промыли 10 мМ КФБ и 10 мМ НС1.

Поверхностная концентрация иммобилизованного FKPB (FKPBm) составила (4,5±0,2)*10ш молекул/мм2. Измерения белок-белковых взаимодействий проводились в диапазоне концентраций добавляемого белка (0,9-9,1 мкМ) в измерительной кювете.

Процедура иммобилизации О-актина и RTX-S П.

При иммобилизации RTX-S II в качестве иммобилизаионного буферного раствора использовался 20 мМ натрий-боратный буфер, рН 8,5. Иммобилизация проводилась в течение 60 минут. Иммобилизация G-актана проводилась в 10 мМ натрий-ацетатном буфере рН 4,5 в течение 30 минут. Нековалентно связанный белок удался из кюветы путем ее промывки буферным раствором PBS/t (138 мМ NaCI, 2,7 мМ KCI, 0,05% Твин 20, 10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4). Свободные, активированные EDC/NHS, карбоксильные

группы на декстрановой поверхности блокировались 1 М раствором этаноламина, рН 8,5, е последующей промывкой PBS/t. Поверхностная концентрация для иммобилизованных RTX-S П (RTX-S Пт) и G-актина (G-актиНщ,) составила (4,7 ± 0,2)-1010 и (6,6 ± 0,2)10'° молекул/мм2, соответственно.

Измерения белок-белковых взаимодействий выполнялись при избыточных концентрациях лиганда (неиммобилизованный белок) в диапазоне концентраций 2,8 нМ -83 нМ.

Определение константы скорости ассоциации и диссоциации методом оптического биосенсора.

Программное обеспечение к прибору (IAsys software, FASTfit) использует повторяющуюся процедуру обработки экспериментальных кривых ассоциации и диссоциации для получения величин уравнений (1) и (2).

Константа скорости ассоциации рассчитывалась по экспоненциальному уравнению,

аппроксимирующему кривую связывания:

Rt = Ro+ AR {1-ехр (-(£„, С + keg) t))} (1),

где Rt - сигнал прибора, t - время , Ro - сигнал при t = 0, С - концентрация лиганда, AR -

разница между сигналами Roo (при t = в равновесном состоянии) и Ro, коп и fcqff - константы

скорости ассоциации и диссоциации, соответственно. Анализ зависимости константы

скорости формирования комплексов от температуры выполнялся по зависимости начального

наклона кривых связывания от температуры.

Константа диссоциации рассчитывалась по уравнению:

R = exp (-kr0 -t) (2),

где Ra - разница между величиной сигнала Roo и сигналом в конце диссоциации.

Зависимости измеренных констант скорости ассоциации от температуры были

аппроксимированы уравнением Аррениуса:

кт= Aexp(-ACiOT*/RT) (3),

где А - константа, Т - абсолютная температура (°К), AG,,/- энергия активации реакции формирования комплексов, R- газовая постоянная.

Отсюда, был вычислен активацяонный барьер реакции формирования комплексов AGm*. Из соответствующих значений kqg- была рассчитана величина энергии активации реакции диссоциации комплексов (AGurr#) с использованием уравнения Эбринга: kaff= (kB T/h) exp (-AGoff#/RT) (4),

где кв - константа Больцмана, h- постоянная Планка. Время жизни комплексов определялось как Т = Vkaff (5),

Константа равновесия вычислялась (Кр) как

Кр = Km fooff (6),

Температурная зависимость взаимодействия исследовалась в диапазоне температур 15-40С. Расчет изменения энергии Гиббса (AG) для реакции комплексообразования выполнялся по уравпеншо [Мецлер, 1980]:

AG = -RTlnKp (7),

где Кр - константа равновесия.

Энтальпия (ДН) и энтропия (AS) процесса были определены из уравнения (8):

AG=AH-TAS (8),

где ДН и AS - изменение энтальпии и энтропии, Т - температура.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ взаимодействия РРТ с STI.

Природа реакции грипсин-ингибитор исследована достаточно подробно. К настоящему времени из литературы известна зависимость Кр в интервале температур от 10°С до 40°С [Onesti et al., 1992]. Константы равновесия комплекса T/STI при 25 °С, полученные методом изотермальной титрационной калориметрии составляют 1-109 М-1 при 25°С [Bauch and Trowbridge, 1972], МО11 М"1 [Моссолов и соав., 1982], а из кинетических кривых конкурентного ингибирования - 2-1011 М"1 [Onesti et al., 1992], то есть имеются разногласия в величинах на два порядка. Что касается термодинамических параметров AS, ДН, AG, ю к настоящему времени в литературе имеются следующие данные: AS, ДН, AG были измерены методом проточной калориметрии и составляли АН=8,6 юсал/моль, AS=69,8 кал/(моль-К), AG= -12,3 ккал/моль [Bauch and Trowbridge, 1972], вычисленные из кривых конкурентного ингибирования [Onesti et al., 1992] эти значения составляли ДН=5,9 ккал/моль, AS=67 кал/(моль-К). Данные по температурным зависимостям кинетических констант в литературе не встречаются. В то же время, значения этих констант при температуре 25 °С составляли: ^ = 5-Ю5 М"'с"' (была определена методом остановленного потока [Song and Suh, 1998]), к0$ = l,9-10"s с"1 (была определена из кинетических кривых конкурентного ингибирования, используя измеренные значения k?„ и Кр [Моссолов и соав., 1982]).

Исследование формирования комплексов PPT/STI с помощью 01ггическ01 о биосенсора было проведено в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 200 мМ KCl, 50 мМ СаСЬ, pH 5,0. Наблюдалось формирование комплексов PPT/STI при иммобилизации РРТ, эти комплексы были достаточно прочные, поэтому для проведения измерения

концентрационной зависимости связывания на одной кювете необходимо было подобрать регеяерационный буфер, который бы приводил к полному распаду комплексов на подложке оптического биосенсора. Нами было установлено, чго комплексы PPTm/STI полностью распадаются при инкубации в 1 мМ HCl.

При иммобилизации STI образования комплексов PPT/ST1 не наблюдалось, в то время как при иммобилизации РРТ комплексы образуются (рис. 1.). Это означает, что аминогруппы STI важны для образования комплекса на подложке оптического биосенсора. Действительно, из данных рентгено-структурного анализа видно, что аминогруппы STI: Lys 76, Lys 145, Lys 165, Lys 178 находятся вблизи места связывания с трипсином (PDB], и иммобилизация STI через эти аминогруппы может блокировать образование комплекса. На рисунке 1 приведены температурные зависимости связывания PPT,rn/STI. Как видно, с ростом температуры от 15 °С до 40 °С, наблюдается повышение амплитуды сигнала связывания. Это указывает на то, что константа равновесия реакции комплсксообразования возрастает с ростом температуры. Из рисунка 1 видно, что наблюдается повышение начального угла наклона кривой связывания с ростом температуры, это указывает на рост константы скорости формирования комплексов. Из таблицы 1, где представлены рассчитанные значения кинетических параметров комплексообразования, видно, что наблюдается рост скорости формирования комплексов в диапазоне температур 15-40 °С, а константа скорости диссоциации практически не изменяется. Так как константы коп растут с увеличением температуры, то это указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса РРТщ/STI.

Рис.1. Сепсо грамма формирования белок-белкового комплекса PPTm/STI. Экспериментальные условия: рабочий буфер: 0,05 М ацетатном буфере, содержащий 200 мМ KCl, 50 мМ СаСЬ, pH 5,0. Стрелками показаны добавки 0,17 мкМ STI в рабочем буфере.

Рассчитанное из уравнения (3) значение активационного барьера реакции ассоциации AGon* составляет 23,2 ккал/моль, а значение активационного барьера реакции диссоциации AGoff", рассчитанное из уравнения (4) составляет 22,9 ккал/моль.

Порядок константы скорости диссоциации комплексов PPTWSTT составляет - б-10'V что соответствует времени жизни комплексов порядка 4-5 часов. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, Fastfit). Из таблицы 1 видно, что константа равновесия Кр растет с ростом температуры в интервале (1,6 -3,3)-109 М"1. В таблице 1 представлены значения энергии Гиббса (AG) реакции комплексообразования PPTjm/STI, рассчитанные из уравнения (7). Интервал этих значений составляет от (-12,1) до (13,6) ккал/моль, что хорошо согласуется с литературными данными, где при температуре 25°С значение AG составляет (-12,3) ккал/моль [Stites, 1997].

Из уравнения (8) были определены энтальпия и энтропия реакции, которые составляют 7,7±0,7 ккал/моль и 68,0±6,0 кал/(моль-К) соответственно. Как видно, энталышйный член положительный, энтропийный (TAS) также положительный. Отсюда, можно сделать вывод, что реакция комплексообразования PPTm/STI эндотермическая, а вклад энтропийной составляющей гораздо больше, чем энтальпийной. Это согласуется с данными работы [Stites, 1997, Baugh and Trowbridge, 1972]. Кинетические константы, полученные нами: кт = 1,3-Ю5 MV, koJ} =6,5-10"5 с*1, Кр=2,010® М"1 при 25 °С, хорошо согласуются с полученными раннее константами, которые были измерены другими методами [Song and Suh Se, 1998; Onesti et al., 1992]. Таблица 1.

Кинетические параметры к„„, к0д и константы равновесия реакции комплексообразования PPTim/STI.

trypsinm/ soybean tr. inhibitor T=15° T=20e T=25° T=30° T=35° T=40°

Km-W, M-'c1 1,02±0,17 1,42±0,16 1,47±0,16 1,51±0,26 1,91 ±0,44 2,09±0,33

KrUf.v-1 6,4±0,6

Kp-IO^M"1 1,6±0,3 2Д±03 2,3±0,3 2,4±0,5 3,0+0,7 3,3+0,6

AG, ккал/моль -12,1±0,1 -12,5±0,1 -12,7±0,1 -12,9±0,1 -13,3±0,1 -13,6±0,1

АН, ккал/моль 7,7±0,7

AS, кал/моль.К 68,0±6,0

Анализ взаимодействия ВРС с ВРТ1.

Взаимодействие химотрипсин-ингибитор на сегодняшний день исследовано достаточно подробно. Основной панкреатический ингибитор трипсина принадлежит к типу одноцентровых ингибиторов [Bidlingmeyer, Chrispeels, 1977; Chauvet, Acher, 1975], взаимодействует с химотрипсином с участием остатка гистидина-57, входящего в состав каталитического участка активного центра фермента. Известна константа равновесия реакции комплексообразования BPC/BPTI, которая составляет 1,0-10® М"1 [Vincent et al., 1972], 10® M"1 [Bosterling, Engel, 1976]. Было бы интересно, определить константы методом оптического биосенсора, так как подтверждение полученных экспериментальных данных, открывает возможности для изучения различных белок-белковых взаимодействий новым современным методом.

Исследование формирования комплексов BPC/BPTI было проведено в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, 20 мМ СаС12, 0,005% Triton Х-100, pH 8,5. Наблюдалось формирование комплексов BPC/BPTI при иммобилизации ВРС, эти комплексы были достаточно прочны и полностью распадаются лишь при инкубации в 1 мМ HCl.

При иммобилизации ВРТТ образования комплексов не наблюдалось. Формирование комплексов BPC/BPTI при иммобилизации ВРС через их аминогруппы и отсутствие комплексообразования при иммобилизации ВРТТ означает, что аминогруппы BPTI, важны для формирования комплексов на подложке оптического биосенсора. Действительно, из данных рентгено-структурного анализа видно, чпго аминогруппы BPTI: Lys 15, Lys 41, Lys 46 находятся вблизи места связывания с химотрипсином [PDB], и иммобилизация BPTI через эти аминогруппы может блокировать образование комплекса. На рисунке 2 приведены температурные зависимости связывания ВРСщ/ВРТС Как видно, с ростом температуры от 15°С до 35 °С, наблюдается сложная зависимость амплитуды сигнала связывания. Из рисунка 2 видно, что наблюдается повышение начального угла наклона кривой связывания с ростом температуры. Это указывает на рост константы скорости формирования комплексов от температуры. В таблице 2 представлены рассчитанные значения кинетических и равновесных параметров реакции комплексообразования. Видно, что наблюдается рост скорости формирования комплексов в 2,5 раза в диапазоне температур 15-35 °С. Константа скорости диссоциации практически не изменяется. Так как константы Кп растут с увеличением температуры, то это указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса ВРСщ/ВРП.

Рассчитанное из уравнения (3) значение активационного барьера реакции ассоциации AGon* составляет 23,0 ккал/моль. Рассчитанное из уравнения (4) значение AG0fr* составляет 22,8 ккал/моль.

Рис.2. Сеисограмма формирования белок-белкового комплекса ВРСт/ВРП. Экспериментальные условия: рабочий буфер: 50 мМ Tris-HCl, 20 мМ СаСЬ, 0,005% Triton X-100, pH 8,5. Стрелками показаны добавки BPTI в указанном рабочем буфере.

Порядок константы скорости диссоциации комплексов ВРСщ/ВРП составляет 6,4-10"5 с"1, что соответствует времени жизни комплексов порядка 4 часов. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, Fastfit). Как видно из таблицы 2, константа равновесия Кр растет с ростом температуры в интервале от 4,2-10* М"1 до 10-108 М"1. В таблице 2 представлены значения энергии Гиббса (AG) реакции комплексообразования ВРСщ/ВРП, рассчитанные из уравнения (7). Интервал этих значений составляет от (-11,3) до (-12,6) ккал/моль. Температурная зависимость AG реакции комплексообразования ВРСщ/ВРТТ удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка.

Из уравнения (8) были определены энтальпия и энтропия реакции, которые составляют 8,4±0,4 ккал/моль и 68,0±3,0 кал/(моль-К) соответственно. Как видно, энтальпийный член положительный, энтропийный (TAS) также положительный. Реакция комплексообразования ВРСщ/ВРП эндотермическая, а вклад энтропийной составляющей гораздо больше, чем энтальплйной, то есть движущей силой реакции комплексообразования является энтропийная составляющая. Наши результаты хорошо согласуются с данными, полученными ранее снектрофотометрическим методом: Кр= 10s М-1, АН = 4,0 ккал/моль (при pH 7,0) [Bosterling, Engel, 1976].

Таблица 2.

Кинетические параметры кот к0д и константы равновесие реакции комплексообразованиа BPCim/BPTI.

ВРСи/ВРП Т=15° Т=20° "Г=25° Т=30° Т=35°

fcJHV (2,5±0Д)-104 (3,1±0,3)- 10" (3,4±0,3)10* (4,7+0,5)-104 (6,1±0,6)104

(6,4±1,0)-10"5

Кр, М"1 (4,2±0,8)-10* (5Д±0,9)-10" (5,6±1,0)10» (1,0±0,2)10у

AG, ккал/моль -11,3±0,1 -11,б±0,1 -11,9±0,1 -12,3±0,1 -12,6±0,1

АН, ккал/моль 8,4±0,4

AS, ккал/моль-К (6,8*0,3)102

АОоп*, ккал/моль 23,0±0Д

AGoff*, ккал/моль 22,8± 0,2

Анализ взаимодействия РРК с STL

Исследование взаимодействия калликреинов и ингибиторов трипсина проводилось и раньше. Показано, что STI является сильным ингибитором калликреииа, константа диссоциации комплекса составляет 4,7-10"9 М [Пасхина, 1075], 2,9-107 М"1 [Matthew et al., 2002]. Так как существуют противоречия в константах, было интересно исследовать параметры комплексообразования с помощью метода оптического биосенсора.

Исследование формирования комплексов PPK/STI было проведено в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 200 мМ KCl, 50 мМ СаСЬ, pH 5,0. Необходимо было подобрать регенерационный буфер, который бы приводил к полной диссоциации комплексов на подложке оптического биосенсора, нами было установлено, что это происходит в 10 мМ HCl.

На рисунке 3 приведены температурные зависимости связывания РРКда/STI. Как видпо, с ростом температуры от 15 до 40 °С, наблюдается повышение амплитуды сигнала связывания. Это указывает на то, что константа равновесия реакции комплексообразовапия возрастает с ростом температуры. При иммобилизации STI образования комплексов не наблюдалось. По-видимому, аминогруппы, участвующие во взаимодействии белков, были вовлечены в процесс иммобилизации. Из рисунка 3 видно, что наблюдается повышение начального угла наклона кривой связывания с ростом температуры, это указывает на рост константы скорости формирования комплексов.

буфер

Рис.3. Сенсограмма формирования белок-белкового комплекса РРКщ/STI. Рабочий буфер: 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 200 мМ КС1, 50 мМ СаСЬ, рИ 5,0. Стрелками показаны добавки 5 мкМ STI в рабочем буфере.

В таблице 3 представлены рассчитанные значения кинетических параметров реакции комплексообразования. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, Fastfit). Наблюдается рост константы скорости формирования комплексов (коп) в диапазоне температур 15-40°С, что указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса РРКдп/STT.

Значение энергии активации реакции ассоциации, рассчитанное из уравнения (3), AGon* составляет 6,2 ккал/моль Порядок константа скорости диссоциации комплексов PPKim/STI составляет 10"4 с'1, что соответствует времени жизни комплексов порядка 1 часа. Рассчитанное из уравнения (4) значение AG0ff* составляет 22Д ккал/моль. Как видно из таблицы 3 и рисунка 3, константа равновесия Кр растет с ростом температуры и имеет порядок 10® М"1. В таблице 3 представлены значения энергии Гиббса (ДО) реакции комплексообразования PPKlra/STI, рассчитанные из уравнения (7). Порядок величины этих значений составляет (-10) ккал/моль. Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными, полученными ранее: значение энергии Гиббса составляет (-12,5) ккал/моль при 25 °С [Bemett, 2002]. Температурная зависимость AG реакции комплексообразования PPK/STI удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка

Из уравнения (8) были определены энтальпия и энтропия реакции, которые составляют 17,8 ккал/моль и 99,7 кал/(моль-К) соответственно. Как видно, энталышйный член положительный, энтропийный (TAS) также положительный. Реакция комплексообразования PPK/STI эндотермическая, а вклад энтропийной составляющей гораздо больше, чем энталышйной.

Таблица 3.

Кинетические параметры к0гь кф и константы равновесия реакции комплекеообразовання РРК|Ш/8Т1.

РРКщ/ЗТТ Т=15° Т=20° Т=25° Т=30° Т=35° Т=40°

кот М"'с"' (3,5±0,1)-104 (3,8±0,1)104 р.шлую4 (1,6±0,1)-1(Р (игЬО^-Ю5 (3,3±0,2)105

К/Г, с"' (3,6±0,1>10'4 (9Д±0,5)10^

Кр,М' (0,9±0,2)10" (1,1±0,2)108 (1,4±03)108 (4,4±03)10" (4,7±0,4)10*

АО, ккал/моль -10,4*0,1 -10,7±0,1 -11,1±0,1 -11,9±0,1 -12,2±0,1 -12,810,1

АН, ккал/моль 17,»±0,5

дв, кал/моль-К 99,7±5,0

Шоп*, ккал/моль 17,4±0,1

ккал/моль 22,0±0Д

Анализ взаимодействия Р450 сат с Ъ <1-Ь5.

В настоящее время исследованию цитохромов уделяется большое внимание. В литературе нет данных о термодинамических характеристиках взаимодействия Р450сатЛ-Ь5 и Р450сат/(1-Ь5, поэтому представляет интерес исследование температурной зависимости данных белковых комплексов с помощью оптического биосенсора.

Важным моментом в методе оптического биосенсора является подбор состава инкубационного буфера, в котором наблюдается взаимодействие белков. Было выполнено исследование формирования комплексов Р450сатЛ-Ь5 и Р450сат/с)-Ь5 в калий-фосфатном (КР) буфере (рН 7,4) в диапазоне концешрацией от 50 мМ до 500 мМ и диапазоне температур от 15 до 40 °С.

Было установлено, что в случае пары Р450еат/<1-Ь5 при иммобилизации как <1-Ъ5, так и Р450сат, не наблюдалось образование комплексов. Образование комплексов Р450сатЛ-Ь5 при концентрациях КР буфера 50 мМ и 100 мМ также не наблюдалось во всем температурном диапазоне и при иммобилизации как 1-Ь5, так и Р450сага, что согласуется с данными, полученными ранее методом флуоресцентного титрования [в1ау1оп е1 а!., 1988]. В то же время при концентрации КР буфера 500 мМ наблюдалось формирование комплексов Р450сатЛ-Ъ5Ш1 (иммобилизован г-Ъ5), но не комплексов Р450саш1т/1-Ь5 (иммобилизован Р450сат). Так как в процессе иммобилизации участвуют аминогруппы связанного с подложкой белка, то отсутствие взаимодействия Й>5 с Р450сат,ш указывает на то, что

аминогруппы находятся либо в активном центре белка, либо вблизи цептра связывания. Этот вывод согласуется с данпыми о том, что лизины Lys 344, Lys 392 на поверхности Р450сат принимают участие в комплексообразовании [Stayton et al., 1988; Stayton et al., 1989; Stayton et al., 1990]. Известно, что при повышении ионной силы среды возрастают гидрофобные взаимодействия [Мапсега, 1999], поэтому появление взаимодействия между t-b5 и Р450сат в 500 мМ КР буфере может быть обусловлено существенным вкладом гидрофобных взаимодействий между этими белками.

На рисунке 4 приведены температурные зависимости взаимодействия t-b5,m/P450cam. Как видно из рисунка, при повышении температуры от 15 °С до 40 °С происходит рост амплитуды сигнала связывания. Это указывает на то, что константа равновесия реакции комплексообразования возрастает с температурой. С увеличением температуры наблюдается повышение тангенса начального угла наклона кривой связывания t-b5/P450cam, что указывает на рост константы скорости формирования комплексов.

К(отаед)

ВРЕМЯ (мня)

Рис. 4. Сенсограмма формирования белок-белкового комплекса t-b5„„/P450cam. Инкубационная смесь содержала 0,5 М КР буфер, рН 7,4. Стрелкой показана добавка 0,42 мкМ Р450саш в указанном буфере.

В таблице 4 представлены рассчитанные значения кинетических параметров комплексообразования. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, Fastfit).

Видно, что наблюдается рост на два порядка скорости формирования комплексов в диапазоне температур 15-40°С, в тоже время константа скорости диссоциации не изменяется. Константы кт имеют порядок юМо4 mV, что указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса P450cam/t-b5.

Аппроксимация с помощью уравнения (3) зависимости этой константы от температуры дает следующее выражение:

кт =1,1-102'5 exp(-29,4/RT) (8)

Рассчитанное из уравнения (3) значение энергии активации реакции ассоциации AGJ1 составляет 29,4 ккал/моль. Порядок константы скорости диссоциации комплексов t-b5lm/P450cam составляет -Ю-4 с"1. Рассчитанное из уравнения (4) значение AG0/ составляет 22,4 ккал/моль. Из таблицы 4 видно, что константа равновесия Кр имеет величину порядка 106- 10* М"1 и растет с повышением температуры. В работе [Marcus, Sutin, 1985] значение Кр, измеренное методом флуоресцентного титрования при температуре 25 °С, составляет 1,7-106 М"1. В таблице 4 представлены величины AG реакции комплексообразования t-b5inl/P450cam, рассчитанные из уравнения (7) Температурная зависимость AG реакции комплексообразования t-b5lm/P450carn удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка и ее можно представить выражением: AG = AH Т AS, где АН и AS -изменение энтальпии и энтропии, соответственно.

Из уравнения (8) были определены значения энтальпия и энтропия реакции, которые составили 29,3+0,2 ккал/моль и 0,13+0,02 ккал/(моль-К), соответственно. Таким образом видно, что в реакцию комплексообразования основной вклад вносит энтропийный член, так как его значение превышает по модулю положительную составляющую энтальпии (например, при температуре 25 °С (298 К) величина TAS = 38,74 ккал/моль).

Полученные нами экспериментальные результаты согласуются с данными, полученными с помощью компьютерного молекулярного моделирования в лаборатории молекулярно-графического конструирования лекарств ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. С помощью метода молекулярного докинга были получены гипотезы белок-белковых комплексов и отобраны лучшие с точки зрения геометрической комплиментарное™, расчетной энергии взаимодействия и вероятности переноса электронов между белками. Компьютерное молекулярное моделирование показало, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары P450cam/t-b5, но не P450cam/d-b5.

Таблица 4.

Кинетические и термодинамические параметры реакции комплексообразовання t-Ь5|ж/Р450с,„.

t-b} ш/ P4S0on Т=15° Т=20° Т=25° Т=30° Т=35" Т=40°

(6,0±0,1)10" (l.TtO^lO3 (2,5±0,3)-10J (З,6±0,4)103 (дад-ю* (4Д±0,4)-104

Kp.Nf1 (ЗД±0,4)-106 (s.ftto^j-io6 (U±0,4)107 (1,9±0,6)-107 (1,0±0,6>10» (23±0,6)10'

AG, ккал/моль -8,5±0.1 -9,3±0.1 -9,7±0.1 -10,0±0,1 -11,<ШЦ -12,<Ш),1

АН, ккал/моль 29,3±0Д

AS, кал/мольК 0,13±0,01

AGo«*, ккал/моль 29,4±0Д

AGoJ*, ккал/моль 22,4±0Д

Анализ взаимодействия рапамнцина с FKPB.

В литературе есть данные о константе образования комплекса FKPB/рапамицин 0^2-1 О*9 М [Bierer et al., 1990], 2-Ю"9 М [Choi et al., 1996], было бы интересно исследовать термодинамические характеристики данного белкового комплекса и зависимость кинетических констант от температуры.

Исследование формирования комплексов FKPB/Rapamycin с помощью оптического биосенсора было проведено в 20 мМ КР буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,015% Triton Х-100, рН 7,5. Наблюдалось формирование комплексов FKPB/Rapamycin при иммобилизации FKPB (рис. 5.); эти комплексы были достаточно прочные, поэтому для проведения измерения концентрационной зависимости связывания на одной кювете необходимо было подобрать ре генерационный буфер, который бы приводил к полной диссоциации комплексов на подложке оптического биосенсора. Нами было установлено, что комплексы FKPBlrn/RapamyciTi полностью диссоциируют при инкубации в 1 мМ НС1.

На рисунке 5 приведены температурные зависимости связывания РКРВт/Яаратус'т. Как видно, с ростом температуры от 15 °С до 40 °С, наблюдается повышение амплитуды сигнала связывания. При этом в диапазоне температур 15 - 30 °С амплитуда связывания практически не изменяется и лишь при увеличении температуры до 35 °С и 40 °С наблюдается увеличение сигнала связывания. Это указывает на то, что константа равновесия реакции комплексообразования возрастает с ростом температуры. Из рисунка 5 видно, что наблюдается повышение начального угла наклона кривой связывания с рос I ом температуры до 35 °С и 40 °С, это указывает на рост константы скорости формирования комплексов.

В. (от ад.) 15

ву*Ч>

1,7 жМ1Цяшуаа

4 3

ВРЕШЦши)

Т=40°С

T=a3°c

Рис.5. Сенсограмма формирования белок-белкового комплекса FKPBlm/Rapamycin. Экспериментальные условия: рабочий буфер: 20 мМ КР, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,015% Triton Х-100,рН 7,5.

В таблице 5 представлены рассчитанные значения кинетических параметров реакции комплексообразования. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software, Fastfit). Наблюдается рост константы скорости формирования комплексов (кт) в диапазоне температур 15-40 °С, что указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса FKPBm/Rapamycin (рис. 5). Рассчитанное из уравнения (3) значение энергии активации реакции ассоциации AG«,* составляет 7,6 ккал/моль. Порядок константы скорости диссоциации комплексов FKPBlm/Rapamycin составляет - 10"6 с 1 , что соответствует времени жизни комплексов порядка 80-ти часов. Рассчитанное из уравнения (4) значение ДО0д# составляет 24,8 ккал/моль. Как видно из таблицы 5 и рисунка 5, константа равновесия Кр растет с ростом температуры и имеет порядок Ю10 М"1. В таблице 5 представлены значения энергии Гиббса

(AG) реакции комплексообразоваиия FKPBim/Rapamycin, рассчитанные из уравнения (7). Интервал этих значений составляет от (-13,3) до (-15,3) ккал/моль. Температурная зависимость AG реакции комплексообразоваиия FKPBim/Raparnycin удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка.

Из уравнения (8) были определены энтальпия и энтропия реакции, которые составляют 8,4±0,5 ккал/моль и 75,4±3,0 кал/моль-К соответственно. Как видно, энталышйный член положительный, энтропийный (TAS) также положительный. Отсюда, можно сделать вывод, что реакция комплексообразоваиия PPTlm/STI эндотермическая, а вклад энтропийной составляющей гораздо больше, чем энталышйной.

Таким образом, было проведено исследование формирования и распада комплекса FKPBnn/Rapamycin методом оптического биосенсора. Константа скорости формирования комплексов FKPB1IT1/Rapamycüi растет с ростом температуры, а диссоциации не изменяется. Рассчитаны активационные параметры кинетических констант формирования и распада комплекса FKPB^Rapamycin из зависимостей констант скорости ассоциации и диссоциации от температуры. Показан решающий вклад энтропийной составляющей в реакцию

Таблица 5.

Кинетические и термодинамические параметры реакции комплексообразоваиия FKPBjm/рапамиции.

FKPBm/ ропамицин Т=15° Т=20° Т=25° Т=30° Т=35° Т=40°

^М'У1 (O^tO.^lO5 О.ШДН? (0,9±0,l)10s (0,8±0,1)10:' (1,4±0Д)105 (l.ftfcO^lO5

(3,5±0 3)10^

Кр,М"' (1,4±0,2)10'и (3,1±0,3)10ш (2,б±0,3)101и (2,3±0,3)10,и (4,0±0,4)10ш (5,4±0,4)10ш

AG, ккал/моль -13,3±0,1 -13,9±0,1 -14,1±0,1 -14,3±0,1 -14,9±0,1

АН, ккал/моль 8,36±0,5

AS, кал/моль-К 75,4±3,0

AGon*, ккал/моль

AQoff*, ккал/моль 24,8+ 0,4

Анализ взаимодействия в-актина с НТХ-8II.

В литературе отсутствуют данные о кинетических и термодинамических параметрах белок-белкового комплекса актин-цитолизин, поэтому существует необходимость их изучения для выяснения роли белок-белковых взаимодействий актинопоринов в механизме переформирования, а также влияния этих полипептидов на процессы клеточной пролифщяции.

Формирование комплексов ЯТХ-в II с в-актином проходило в 20 мМ натрий-ацетатном буферном растворе, рН 4,5 и диапазоне температур от 15 °С до 40 °С. В то же время, показано, что комплекс О-актинщ, /ЛТХ-Я II при данных условиях не образуется. На приведенных сенсограммах (рис. 6) видно отсутствие формирования комплексов между иммобилизованным в-актином и ЯТХ-8 П. Так как в процессе иммобилизации белка на карбокиметилдекстрановой поверхности кюветы принимают участие аминогруппы лизина, то зависимость формирования комплексов от порядка иммобилизации (отсутствие взаимодействия ЙТХ-8 П с иммобилизованным О-актином) указывает на важную роль аминогрупп в-ахтина в процессе комплексообразования.

На рисунке б приведены температурные зависимости взаимодействия ЯТХ-в ПщД}-ахтин. Из рисунка видно, что при повышении температуры от 15 "С до 40 "С происходит рост амплитуды сигнала связывания. Это указывает на то, что константа равновесия реакции комплексообразования возрастает с температурой.

и(огн.ед.) Мжр

Рис.6. Сенсограмма взаимодействий в системе ИТХ-ЗИщ/ О-актин. Рабочий буфер: 20 мМ натрий-ацетатный буфер, рН 4,5. Стрелкой показана добавка 11,5 нМ в-актина в рабочем буфере.

В таблице 6 представлены рассчитанные значения кинетических параметров реакции комплексообразования. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (LAsys software, Fastfit). Наблюдается рост константы скорости формирования комплексов (к0„) в диапазоне температур 15-40 °С, что указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса RTX-S П1Ш/ G-актин (рис. 6). Рассчитанное из уравнения (3) значение энергии активации реакции ассоциации AGon* составляет 6,2 ккал/моль. Порядок константы скорости диссоциации комплексов RTX-S ПтЛЗ-актин составляет ~10"4 с"1. Рассчитанное из уравнения (4) значение AG0ff# составляет 22,2 ккал/моль. Из таблицы 6 видно, что константа равновесия Кр имеет величину порядка 108 М"1 и растет с повышением температуры. В таблице 6 представлены величины AG реакции комплексообразования RTX-S IIm/G-актин, рассчитанные яз уравнения (7). Температурная зависимость AG реакции комплексообразования RTX-S ПщДг-актин удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка.

Из уравнения (8) были определены значения АН и AS, которые составили 6,2±0,1 ккал/моль и 60,1 ±0,3 кал/(моль ■ К), соответственно. Таким образом видно, что в реакцию комплексообразования основной вклад вносит энтропийный фактор, так как значение Т AS превышает по модулю положительную составляющую энтальпии (например, при температуре 25°С (298К) величина Т AS = 17,9 ккал/моль).

Таблица 6.

Кинетические и термодинамические параметры реакции комплексообразования RTX-S IWG-актнн.

RTX-S Him/ G-актин Т=15° Т=20° Т=25° Т=30° Т=35° Т=40°

коп,M-'c' (6,7±0,3) 104 (1,2*0,1) Ю3 (1,3±0,1) -10' (1,4±0,1) Ю5 (1,7±0,1)105 (l.ifcfcO.lJ-lO1

kaff,Cl (г.&ьолукг4

Кр,м" (2,4±0,1>10* (4,3±0,1)-108 (4,6±0,1)-10" (5,0*0,1) 10" (6,1±0,1)101' (6,4*0,1)10*

AG, ккал/моль -10,9±0,1 -11,5*0,1 -11,7±0,1 -ll,ftt0,l -12Д±Ю,1 -12,6*0,1

АН, ккал/моль 6Д±0,1

AS, кал/моль-К 60,1±03

AGwi*, ккал/моль 6,2±0,1

AGoff*, ккал/моль 22,2±0,2

выводы

1. Созданы стабильные оптико-биосенсорные белоксодержащие биочипы, которые позволяют измерять кинетические характеристики и их температурные зависимости для белковых пар: P450cam/t-b5, P450cam/d-b5, трипсин/соевый ингибитор трипсина, а-химотрипсин/основпой панкреатический иншбитор трипсина, калликреин/ соевый ингибитор трипсина, рапамицин/Ж-связывающий белок, G-atrraH/RTX-S II.

2. Из температурной зависимости определены константы скоростей образования и распада белок-белковых комплексов и рассчитаны термодинамические параметры. Показало, что энтропийная составляющая играет ведущую роль в образовании комплексов данных белковых пар.

3. Подтверждена гипотеза о том, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары P450cam/t-b5, но не P450cam/d-b5.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Н.И. Раченкова, Ю.Д. Иванов, B.C. Скворцов, А.С. Иванов, А.А. Молнар, А.И. Арчаков, Уи Бон Уа. Исследование взаимодействия цитохромов Р450саш и Ь5 с помощью метода оптического биосенсора и компьютерного моделирования. Биомедицинская химия, 2005, т. 51, №5, с. 501-512;

Н.И. Раченкова, Ю.Д. Иванов, А.А. Молнар, А.И. Арчаков. Исследование взаимодействия трипсина и соевого ингибитора трипсина с помощью метода оптического биосенсора. Биомедипинская химия, 2005, т. 51, № 6, с. 614-623;

Ivanov Yu.D., Konstantinova N.A., Svetlov S.K., Hui Bon Hoa G. and Archakov A.I. The optical biosensor study of redox partners' interactions in the P450cam system in hydroxylation conditions. IS* International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation: Chemical Biology in the Postgenomic Era New Approaches and Applications. 4-9 July, 2004. Mainz, Germany, p. 124;

Ivanov Yu.D., Konstantinova N.A., Gnedenko O.V., Lipov P.A., Vigltnskaya A.O., Archakov A.I. Optical resonant mirror biosensor nanochips for investigation of cytochrome P450cam and P4502B4 monooxygenase systems. International Symposium "Nano and Giga Challenges in Microelectronics Research and Development Opportunities". 13-17 September, 2004. Cracow, Poland, p. 126;

конференция "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии". 2004. Владивосток, с. 57;

Ivanov Yu.D., Ivanov A.V., Kuznetsov V. Yu., Konstantinova N.A., Strushkevich N.V., Usanov S.A. and Aichakov A.I. Nanospies trace the formation and decay of P450-contaning complexes. 14A International Conférence on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics. 31 May - 5 June, 2005. Dallas, Texas, U.S.A., p. 150;

Ivanov Yu.D., Ivanov A.V., Gnedenko O.V., Konstantinova N.A., Pleshakova Т.О., Svetlov S.K., Frantsuzov P.A and Archakov A.I. AFM and Optical Biosensor Nanotechnology in Révélation of Protein Complexes. HUPO 4lh Annual World Congress from Defïning the Proteome to Understanding Function. 29 August - 1 September, 2005. Munich, Germany, p. 330.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю - заведующему лабораторией нанобиотехнолопш Института Биомедхимии им. В.Н. Ореховича РАМН, доктору биологических наук, кандидату физико-математических наук Юрию Дмитриевичу Иванову за предоставление темы для настоящей работы, руководство, помощь и поддержку при её выполнении.

Особо благодарю сотрудников лаборатории микросомалыюго окисления ИБМХ РАМН д.б.н. Карузину Ирину Ивановну, к.б.н. Кузнецову Галину Петровну и к.б.н. Саменкову Наталью Федоровну за выделение белков цитохромов. Выражаю глубокую признательность Dr. Hui Bon Ноа за предоставленные белки.

Глубоко признательна сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии за предоставленную пару белков О-актин/RTX-S П, отдельное спасибо к.б.н. Клышко Елене за помощь в проведении экспериментов.

Выражаю глубокую признательность сотрудникам лаборатории нанобиотехнолопш и лаборатории биохимии и химической патологии белков ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН за полезные советы и помощь в работе.

Автор благодарен зав. лабораторией молекулярно-графического конструирования лекарств ГУ НИИ БМХ РАМН д.б.н. Иванову Алексею Сергеевичу и сотруднику этой лаборатории к.б.н. Скворцову В. С. за помощь в работе.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТ

Проведенные исследования были выполнены при финансовой поддержке гранта "Медицинские диагностические системы будущего", в рамках работы: "создание нового поколения биоиммуносенсоров и биочипов", грантов РФФИ "05-04-48690" и научной

школы "325.2003.4", 1NTAS "01-470", также работа была поддержана Janssen Research Foundation, Федеральной целевой программой: Протеомика в медицине и биотехнологии (государственная поддержка протеомных исследований: нанобиотехнология и компьютерное конструирование лекарств, контрактами с Федеральным агентством но науке и инновациям по теме лотов ЖС-13.5/002, ЖС-КП.6/003). В рамках ФЩГГП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы", а также грантом 1.2.29 ОАО МКНТ (2005 г.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

PBS/t калий-фосфатный буфер с Tween 20

NHS N-гидроксисукцинимид

EDC 1-этап-3-(3-диметиламинонропил)карбодиимид

КР калий-фосфатный буфер

Р450 сам цитохром Р450 сам

Ь5 цитохром Ь5

d-b5 полноразмерный цитохром Ь5

t-b5 трункированный цитохром Ь5

STI соевый ингибитор трипсина (семейство Кунитца)

BBI соевый ингибитор трипсина (семейство Баумана-Бирк)

РСБ (RBP) ретинол-связывающий белок

РРТ трипсин (свинной)

ВРС химотрипсин (бычий)

PBTI основной панкреатический ингибитор трипсина

РРК калликреин (свинной)

RBP ретинол связывающий белок

FKPB FK-связывающий белок

RTX-S П актиношрин тропической актинии Radianthus macrodactylus

Лот константа скорости реакции ассоциации комплексов

kaff константа скорости реакции диссоциации комплексов

Кр константа равновесия реакции комплексообразования

AG изменение энергии Гиббса

дд изменение энтальпии

AS изменение энтропии

Принято к исполнению 06/12/2005 Заказ № 1363

Исполнено 09/12/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2007-4 5731

2 9 ДЕК 2L5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Раченкова, Наталья Ивановна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Метод оптического биосенсора для исследования 11 взаимодействия биомолекул в реальном времени

2.2. Термодинамические параметры.

2.3. Растительные белковые ингибиторы протеолитических 15 ферментов

2.3.1. Ингибиторы протеиназ из бобовых. Распространение и 17 классификация

2.3.2. Семейство ингибитора Кунитца

2.3.3. Реактивные центры ингибиторов

2.3.4. Механиз действия ингибиторов

2.4. Капликреин-кининовая система

2.4.1. Калликреины

2.4.2. Прекалликреин и калликреин плазмы крови

2.4.3. Контактная система активации прекалликреина

2.4.4. Тканевые калликреины

2.5. Общие представления о молекулярной организации 41 электрон-транспортных цепей в Р450-содержащих монооксигеназных системах

2.5.1. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи 43 Р450сат-содержащей монооксигеназной системы

2.6. Рапамицин и FKPB

2.6.1. Рапамицин и циклоспорины

2.6.2. Иммунофилины - FKPB

2.7. Актинопорины

2.7.1. Фармакологические исследования актинопоринов

2.7.2. Механизм действия актинопоринов

2.7.3. RTX-SII -актинопорин тропической актинии Radianthus 58 macrodactylus

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Процедура иммобилизации белка на подложку кюветы 60 3.1.1. Иммобилизация белка на карбоксиметилдекстрановую и аминосилановую кюветы

3.2. Расчет кинетических и термодинамических параметров 74 образования и распада комплексов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Анализ взаимодействия РРТ с STI

4.2. Анализ взаимодействия ВРС с ВРТ

4.3. Анализ взаимодействия РРК с STI

4.4. Анализ взаимодействия Р450 cam с t-, d-b

4.5. Анализ взаимодействия FKPB с рапамицином

4.6. Анализ взаимодействия G-актина с RTX-SII 102 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106 ВЫВОДЫ 109 БЛАГОДАРНОСТИ 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

PBS/t Фосфатно-солевой буфер

NHS N-гидроксисукцинимид

EDC 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

КР калий-фосфатный буфер

Pd Путидаредоксин

PdR путидаредоксин редуктаза

Ad Адренодоксин

AdR адренодоксин редуктаза

Р450 сам цитохром Р450 сам

Ь5 цитохром Ь d-b5 полноразмерный цитохром Ь t-b5 трункированный цитохром Ь

NADH Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

NADPH Никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

STI соевый ингибитор трипсина (семейство Кунитца)

BBI соевый ингибитор трипсина (семейство Баумана-Бирк)

РСБ (RBP) ретинол-связывающий белок

РРТ трипсин (свинной)

ВРС химотрипсин (бычий)

PBTI основной панкреатический ингибитор трипсина

РРК калликреин (свинной)

FKPB FK-связывающий белок

RTX-S II актинопорин тропической актинии Radianthus macrodactylus коп k0ff константа равновесия реакции комплексообразования константа скорости реакции ассоциации комплексов константа скорости реакции диссоциации комплексов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптико-биосенсорный анализ термодинамических характеристик белок-белковых комплексов"

Актуальность

Актуальность исследования белок-белковых взаимодействий обусловлена их важной ролью в реализации жизненно-важных функций в организме. В то же время белок-белковые взаимодействия являются наиболее перспективной мишенью лекарственных веществ [Veselovsky et al., 2002]. При конструировании лекарственных форм нового поколения бывает необходимо выявить и охарактеризовать функциональные белковые комплексы с целью предсказания влияния лекарства на взаимодействие белков в этих комплексах.

В настоящее время существуют различные методы определения характеристик комплексообразования: спектрофотометрический метод, метод изотермальной титрационной калориметрии, метод тушения флуоресценции и т.д. Однако, как правило, они не позволяют измерить одновременно все перечисленные выше параметры, либо обладают сравнительно невысокой чувствительностью [Данилов и соавт., 1986] и требуют большого количества образца. Новые методы, основанные на использовании нанотехнологии, такие как оптический биосенсор, позволяют быстро и с высокой точностью определять одновременно все кинетические характеристики: константы скоростей образования и распада комплексов, константы ассоциации и диссоциации, энтальпию и энтропию реакции комплексообразования [Stites, 1997]. Преимуществом метода оптического биосенсора также является то, что он позволяет регистрировать в реальном времени межмолекулярные взаимодействия без введения каких-либо меток в анализируемые молекулы. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью (до 10"12 М) и быстротой анализа - несколько минут [Davies et al., 1994]. Метод оптического биосенсора в последнее время широко используется для определения кинетических параметров белок-белковых взаимодействий [Ivanov et al., 2001; Ivanov et al., 2001; Ivanov et al., 1997; Ivanov et al., 1999; Archakov and Ivanov, 1999; Морозов и соав., 1999; Ivanov et al., 2000; Ivanov et al., 1999].

Протеолитические ферменты представляют огромный интерес для изучения, так как играют важную роль в обмене веществ всех живых организмов. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов чрезвычайно широко распространены и встречаются у животных, растений и микроорганизмов. Имеются данные о том, что присутствие значительных количеств ингибиторов протеиназ в пищевых продуктах может играть благоприятную роль, например, препятствовать развитию ряда злокачественных образований, таких как рак простаты, прямой кишки, грудной полости и некоторых других [Troll and Wiesner, 1983]. Ингибиторы протеиназ могут играть важную роль в защите растений от поражения вредными насекомыми и патогенными микроорганизмами [Мосолов, 1983; Richardson, 1977]

Циклоспорины - совершенно новый класс иммуносупрессивных препаратов. Это циклические пептиды, продуцируемые грибками. К белкам группы циклоспоринов относятся циклоспорин А, рапамицин, FK-506, они обладают сходным механизмом действия. Рапамицин - макролид, выделенный из Stephomyces higroscopicus. Рапамицин, лекарственный препарат, широко используемый для предотвращения отторжения трансплантированных органов, также он может найти применение и в онкологии. Как показали американские исследователи, его применение во время курса лучевой терапии опухолей головного мозга резко снижает вероятность прогрессирования опухолевого процесса и вероятность развития рецидивов [Зимин, 2002].

Цитолитические токсины (цитолизины) - это вещества белковой природы, которые при взаимодействии с цитоплазматической мембраной вызывают нарушение её структуры, приводящее к потере морфологической целостности клеток. В настоящее время возрос интерес к веществам, обладающим мембранотропным и/или цитостатическим действием, лежащим в основе противоопухолевого, кардиостимулирующего, дерматонекротического, антимикробного, антипаразитарного и других фармакологических свойств этих соединений, и в последнее десятилетие в изучении цитолизинов актиний наблюдается значительный прогресс [Anderluh, Macek, 2002].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось создание стабильных белок-содержащих биочипов для определения с помощью оптического биосенсора кинетических и термодинамических параметров формирования и распада белок-белковых комплексов:

- Трипсин/соевый ингибитор трипсина,

- а-химотрипсин/основной панкреатический ингибитор трипсина,

- калликреин/соевый ингибитор трипсина,

- Р450 cam/t-b5, Р450 cam/d-b5,

- рапамицин/РК-связывающий белок,

- G-aKTHH/RTX-S II.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

• Произвести экспериментальный подбор условий ковалентной иммобилизации каждого из белков-партнеров на подложке оптического биосенсора для создания стабильных биочипов с целью исследования взаимодействий белковых пар: трипсин/соевый ингибитор трипсина, а-химотрипсин/основной панкреатический ингибитор трипсина, калликреин/ соевого ингибитора трипсина, P450cam/t-b5, P450cam/d-b5, рапамицин/РК-связывающий белок, G-aKTHH/RTX-S II.

• Подтвердить теоретические представления о том, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары P450cam/t-b5, но не P450cam/d-b5.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Разработана методика ковалентной иммобилизации на поверхности кюветы оптического биосенсора следующих белков: трипсина, соевого ингибитора трипсина, а-химотрипсина, основного панкреатического ингибитора трипсина, калликреина, P450cam, t-b5, d-b5, рапамицина, FK-связывающего белка, G-актина и RTX-S II.

2. Впервые измерены зависимости констант скорости образования и распада комплексов от температуры и рассчитаны константы равновесия, энтальпии и энтропии реакций комплексообразования P450cam/t-b5, рапамицин/РК-связывающий белок, G-aKTHH/RTX-S II.

3. Показано, что энтропийная составляющая играет ведущую роль в образовании комплексов: P450cam/t-b5, рапамицин/РК-связывающий белок, G-актин/RTX-S II.

4. Подтверждены теоретические представления о том, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары P450cam/t-b5, но не P450cam/d-b5.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ:

• Созданы стабильные оптикобиосенсорные белок-содержащие биочипы, которые позволяют измерять кинетические характеристики белок-белковых взаимодействий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации были представлены на следующих конференциях:

15th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation: Chemical Biology in the Postgenomic Era New Approaches and Applications (Mainz, Germany, 2004);

International Symposium "Nano and Giga Challenges in Microelectronics Research and Development Opportunities" (Cracow, Poland, 2004);

14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics (Dallas, Texas, U.S.A., 2005);

HUPO 4th Annual World Congress from Defining the Proteome to Understanding Function (Munich, Germany, 2005).

Работа выполнена в ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке гранта "Медицинские диагностические системы будущего", в рамках работы: "создание нового поколения биоиммуносенсоров и биочипов", грантов РФФИ ( № 05-04-48690 и научной школы № 325.2003.4), INTAS № 01-470, а также Janssen Research Foundation, Федеральной целевой программы: "Протеомика в медицине и биотехнологии (государственная поддержка протеомных исследований: нанобиотехнология и компьютерное конструирование лекарств)", контрактами с Федеральным агентством по науке и инновациям по теме лотов ЖС-13.5/002), ЖС-КП.6/003, ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы", а также грантом 1.2.29 ОАО МКНТ (2005 г).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

Н.И. Раченкова, Ю.Д. Иванов, B.C. Скворцов, А.С. Иванов, А.А. Молнар, А.И. Арчаков, Уи Бон Уа. Исследование взаимодействия цитохромов Р450сат и Ь5 с помощью метода оптического биосенсора и компьютерного моделирования. Биомедицинская химия, 2005, т. 51, № 5, с. 501-512;

Н.И. Раченкова, Ю.Д. Иванов, А.А. Молнар, А.И. Арчаков. Исследование взаимодействия трипсина и соевого ингибитора трипсина с помощью метода оптического биосенсора. Биомедицинская химия, 2005, т. 51, № 6, с. 617-625;

Ivanov Yu.D., Konstantinova N.A., Svetlov S.K., Hui Bon Hoa G. and Archakov A.I. The optical biosensor study of redox partners' interactions in the P450cam system in hydroxylation conditions. 15th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation: Chemical Biology in the Postgenomic Era New Approaches and Applications. 4-9 July, 2004. Mainz, Germany, p. 124;

Ivanov Yu.D., Konstantinova N.A., Gnedenko O.V., Lipov P.A., Viglinskaya A.O., Archakov A.I. Optical resonant mirror biosensor nanochips for investigation of cytochrome P450cam and P4502B4 monooxygenase systems. International Symposium "Nano and Giga Challenges in Microelectronics Research and Development Opportunities". 13-17 September, 2004. Cracow, Poland, p. 126;

Клышко E.B., Константинова Н.И., Иванов Ю.Д., Монастырская М.М., Киселева М.И., Козловская Э.П., Исследование межмолекулярного взаимодействия G-актина и актинопорина RTX-S II из актинии Radianthus macrodactylus. Региональная научная конференция "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии". 2004. Владивосток, с. 57;

Ivanov Yu.D., Ivanov A.V., Kuznetsov V. Yu., Konstantinova N.A., Strushkevich N.V., Usanov S.A. and Archakov A.I. Nanospies trace the formation and decay of P450-contaning complexes. 14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics. 31 May-5 June, 2005. Dallas, Texas, U.S.A., p. 150;

Ivanov Yu.D., Ivanov A.V., Gnedenko O.V., Konstantinova N.A., Pleshakova Т.О., Svetlov S.K., Frantsuzov P.A. and Archakov A.I. AFM and Optical Biosensor Nanotechnology in Revelation of Protein Complexes. HUPO 4th Annual World Congress from Defining the Proteome to Understanding Function. 29 August - 1 September, 2005. Munich, Germany, p. 330.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Раченкова, Наталья Ивановна

выводы

1. Созданы стабильные оптико-биосенсорные белок-содержащие биочипы, которые позволяют измерять кинетические характеристики и их температурные зависимости для белковых пар: P450cam/t-b5, P450cam/d-b5, трипсин/соевый ингибитор трипсина, а-химотрипсин/основной панкреатический ингибитор трипсина, калликреин/ соевого ингибитора трипсина, рапамицин/РК-связывающий белок, G-актин/RTX-S II.

2. Из температурной зависимости определены константы скоростей образования и распада белок-белковых комплексов и рассчитаны термодинамические параметры. Показано, что энтропийная составляющая играет ведущую роль в образовании комплексов данных белковых пар.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю -заведующему лабораторией нанобиотехнологии Института Биомедхимии им. В.Н. Ореховича РАМН, доктору биологических наук, кандидату физико-математических наук Юрию Дмитриевичу Иванову за предоставление темы для настоящей работы, руководство, помощь и поддержку при её выполнении.

Особо благодарю сотрудников лаборатории микросомального окисления Института д.б.н. Карузину Ирину Ивановну, к.б.н. Кузнецову Галину Петровну и к.б.н. Саменкову Наталью Федоровну за выделение белков цитохромов. Выражаю глубокую признательность Dr. Hui Bon Ноа за предоставленные белки.

Глубоко признательна сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии за предаставленную пару белков G-amiH/RTX-S II, отдельное спасибо к.б.н. Клышко Елене за помощь в проведении экспериментов.

Выражаю глубокую признательность сотрудникам лаборатории нанобиотехнологии и лаборатории биохимии и химической патологии белков ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН за полезные советы и помощь в работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленной целью - создание оптико-биосенсорных белковых биочипов для определения термодинамических и кинетических параметров формирования и распада белок-белковых комплексов - были проведены исследования взаимодействия данных белковых пар с помощью оптического биосенсора. Было продемонстрировано, что константа диссоциации реакции комплексообразования, измеренная методом оптического биосенсора для сериновых протеиназ, изучаемых в данной работе, совпадало с литературными данными. Это указывает на применимость данного метода для исследования белковых пар:

- Трипсин/соевого ингибитора трипсина,

- а-химотрипсин/основного панкреатического ингибитора трипсина,

- калликреин/соевого ингибитора трипсина,

- Р450 cam/t-b5,

- Р450 cam/d-b5,

- Рапамицин/РК-связывающий белок,

- G-aKTHH/RTX-S II.

Исследование взаимодействия Р450сат с t-b5 и d-b5 методом оптического биосенсора показали, что для пары d-b5/P450cam не наблюдалось образования комплексов в диапазоне температур от 15°С до 40°С как при иммобилизации d-b5, так и при иммобилизации Р450сат. Для пары t-b5/P450cam комплексообразование существенно зависит от того, какой из белков иммобилизован на поверхности оптического биосенсора. Комплексообразование наблюдалось только в случае иммобилизации t-b5, что указывает на участие аминогрупп Р450сат во взаимодействии с Ь5. Так как с ростом температуры константа скорости формирования комплексов t-b5/P450cam растет, а константа скорости диссоциации практически не изменяется, сделан вывод о существенном вкладе энтропийной составляющей в реакцию комплексообразования. Рассчитана энергия активации формирования и распада комплекса t-b5/P450cam из зависимостей констант скорости ассоциации и диссоциации от температуры.

Исследование формирования и распада комплексов сериновых протеиназ PPTim/STI, BPCjm/BPTI, PPKjm/STI показало, что комплексообразование также существенно зависит от того, какой из белков иммобилизован на поверхности оптического биосенсора через его аминогруппы. В случае иммобилизации STI и BPTI комплексообразования не наблюдалось, что указывает на участие аминогрупп STI и BPTI в комплексообразовании. Константа скорости формирования комплексов PPTim/STI, BPCim/BPTI, PPKjm/STI растет с ростом температуры, а диссоциации не изменяется. Рассчитаны активационные параметры кинетических констант формирования и распада комплексов PPTjm/STI, BPCjm/BPTI, PPKjm/STI из зависимостей констант скорости ассоциации и диссоциации от температуры. Показан решающий вклад энтропийной составляющей в реакцию комплексообразования.

Взаимодействие белков FKPB/рапамицин зависит от температуры. С ростом температуры увеличивается константа скорости образования комплексов, следовательно, можно сделать вывод, что в реакцию комплексообразования существенный вклад вносит энтропийная составляющая. Рассчитана энергия активации и энергия распада данных белковых комплексов. Впервые определены кинетические константы образования и распада комплексов FKPB/рапамицин.

Впервые было исследовано взаимодействие RTX-S II с G-актином методом оптического биосенсора и расчитаны кинетические и термодинамические параметры. Показано, что комплексообразование существенно зависит от того, какой из белков иммобилизован на поверхности оптического биосенсора. Образование комплексов наблюдалось только в случае иммобилизации RTX-S II, что указывает на участие аминогрупп G-актина во взаимодействии с RTX-S II. Так как с ростом температуры константа скорости формирования комплексов RTX-S ll/G-акгин растет, сделан вывод о существенном вкладе энтропийной составляющей в реакцию комплексообразования. Из зависимостей констант скорости реакций ассоциации и диссоциации от температуры рассчитана энергия активации формирования и распада комплекса RTX-S ll/G-акгин.

Таким образом, взаимодействие неполярных (гидрофобных) молекул с водной средой играет главную роль в комплексообразовании данных белковых пар. Неполярное (гидрофобное) связывание возникает в результате стремления гидрофобных групп к ассоциации друг с другом, вследствие чего их контакт с молекулами воды ослабевает. При этом происходит стабилизация системы уменьшается ее свободная энергия при одновременном увеличении энтропии), что в итоге приводит к появлению сил притяжения. Возникновение гидрофобных взаимодействий является эндотермическим процессом, определяемым энтропией, и сила таких взаимодействий возрастает с температурой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Раченкова, Наталья Ивановна, Москва

1. Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия, 2000.

2. Иванов А.С., Молнар А.А., Козловская Э.П., Монастырная М.М. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проводимость биологических и модельных мембран // Биол. мембраны, 1987. Т. 4. с. 243-248.

3. Колодзейская М.В., Пивненко Т.Н., Маленьких Л.Г., Кладницкая Г.В. // Приклад, биохим. и микробиол, 1988. 24. №3. с. 353-360

4. Клышко Е.В., Ильина А.П., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Гузев К.В., Монастырская М.М., Козловская Э.П., Липкин А.В., Барсова Е.И., Крышко И.Б., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А., Актинопорины: структура и функция // Вестник ДВО РАН, 2004. 4, с. 51-56

5. Мосолов В.В. // Протеолитические ферменты, 1971, М. Наука с. 414

6. Мосолов В.В. // Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза, 1983 М. Наука, с. 40

7. Мосолов В.В., Валуева Т.А., Соколова Е.В., Антонов В.К. // Докл. АН СССР, 1976. 221. №2. с. 484-497

8. Мосолов В.В., Колосова Г.В., Валуева Т.А., Дронова Л.А., // Биохимия, 1982. 47. №5 с. 797-802

9. Мосолов В.В., Соколова Е.В., Ливенская О.А. // Биохимия, 1984. 49. №8.с. 13341342

10. Мецлер Д., // Биохимия, 1980, издательство "Мир",

11. Нестеренко М.В., Гвоздева Е.Л., Мицкевич Л.Г., Мосолов В.В. // Биохимия, 1989. 54. №5.с. 838-845.

12. Нортроп Д., Кунитц М., Харриот Р. // Кристаллические ферменты, 1950 М. Ин. Лит. с. 346

13. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. // Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды, 1985. М.: Высшая школа. 280 с.

14. Радюк В.Г., Шкуматов В.М., Чащин В.Л., Ахрем А.А. Реконструкция холестерингидроксилирующей системы на основе иммобилизованного адренодоксина // Биохимия, 1983 . 48. с. 454-463.

15. Сафронова Н. //"Медицинский Вестник", 2004 №27 (298),

16. Яровая Г.А. // Калликреин-кининовая система: новые факты и концепции (Обзор), 2000А

17. Ako Н., Foster R.J., Rayn С.А. Mechanism of action of naturally occurring proteinase inhibitors. Studies with anhydrotrypsin and anhydrochymotrypsin purified by affinity chromatography. // Biochemestry. 1974. 13. N. 1. p. 132-139

18. Anderluh G. and Macek P. Actinoporins, pore-forming toxins of sea anemones (Actiniaria) Menes-08.qxd p. 132-148

19. Anderluh, G., Macek, P., Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). // Toxicon, 2002. 40, p. 111-124.

20. Aoki M., Ishimuri K.,Morishima 1. Roles of negatively charged surface residues of Putidaredoxin in interactions with redox partners in P450 cam monooxygenase system. // Biochem. Biophys. Acta. 1998.1386,1. p.157-167.

21. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P450 and Active Oxygen.- London, New York, Philadelphia, Taylor&Francis, 1990. p. 275.

22. Archakov, A.I., Ivanov, Yu.D., In Biophysics of Electron Transfer and Molecular Bioelectronics, Plenium Publication Corporation, 1999, p. 173-194.

23. Athanasiadis, A., Anderluh, G., Macek, P., Turk, D., Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina. // Structute, 2001. 9, p. 341-346.В

24. Batista, Jezernik, 1992 Morphological changes ofV-79 cells after equinatoxin II treatment. // Cell Biol Int Rep. 1992; 16(2): 115-23.

25. Batista U, Macek P, Sedmak В The cytotoxic and cytolytic activity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina. // Cell Biol Int Rep. 1990;14(11):1013-24.

26. Baugh R.J. and Trowbridge C. G. Calorimetry of some trypsin-trypsin inhibitor reactions. // J. Biol. Chem, 1972, 247, 7498.

27. Beaubien G., Rosinski Chupin I., Mattei M.G., Mbikay M., Chretien M., Siedan N.G. Gene structure and chromosomal localization of plasma kallikrein. // Biochemistry, 1991, 30,1628 - 1635.

28. Bidlingmeyer D.V.U., Chrispeels M. J. Purification and characterization of vicilin peptidohydrolase, the major endopeptidase in the cotyledons of mung-bean seedlings. // Eur J Biochem. 1977, 77 (1). 223-233

29. Bidlingmeyer D.V.U., Leary T.R., Laskowski M., Identity of the tryptic and alpha-chymotryptic reactive sites on soybean trypsin inhibitor (Kunitz). // Jr. Biochemestry. 1972. II. N. 17. p. 3303-3310

30. Bhoola K.D., Figueroa C.D., Worthy K. Bioregulation of kinins: kallikreins, kininogens, and kininases. // Pharmacol. Rev. 1992, 44, p. 1 60.

31. Blanquet. Propetties and composition of the nematocyst toxin of the sea anemone, Aiptasiapallida // Comp Biochem Physiol. 1968;25(3):893-902.

32. Brady A., MacDonald R.J. The expression of two kallikrein gene family members in the rat kidney. //Arch.Biochem.Biophys. 1990, 278, p. 342 349.

33. Bonina T.A., Gilep A.A., Estabrook R.W., Usanov S.A., Engineering of proteolytically stable NADPH-cytochrome P450 reductase. // Biochemistry (Mosc), 2005, 70(3), 357-65

34. Bonner G., Preis S., Schunk U., Iwersen D. The Kallikrein Kinin System in Health and Disease., Germany: Limbach - Verlag Braunschweig, 1988, p. 79 - 96.

35. Bosterling В., Quast U. Soybean trypsin inhibitor (Kunitz) is doubleheaded. Kinetics of the interaction of alpha-chymotrypsin with each side. // Biochem. et Biophys. Acta. 1981. 657. N1. p. 58-72

36. Bowman D.E. Ibid. 1946. 63. N3. p. 547-550

37. Bunc M, Drevensek G, Budihna M, Suput D. Effects of equinatoxin II from Actinia equina (L.) on isolated rat heart: the role of direct cardiotoxic effects in equinatoxin II lethality // Toxicon. 1999;37(1 ):109-23.

38. Bunc M, Frangez R, Horvat I, Turk T, Suput D. Effects of equinatoxins in vivo. Possible role of degranulation of thrombocytes and granulocytes // Ann N Y Acad Sci. 1994 Mar 9;162-7.

39. Bunc M, Rozman J, Stare R, Macek P, Suput D. Equinatoxin ll-induced lysis Of the cultured endothelial cell line ECV-304. // Cell Mol Biol Lett. 2002;7(2), p. 351-353.С

40. Cardin A.D., Jackson R.L., Donaldson V.H., Chao J., Margolius H.S. Processing of apolipoprotein B-100 of human plasma low density lipoproteins by tissue and plasma kallikreins. //Adv. Exp. Med. Biol. 1986, 198.Part B, p.195 202

41. Chauvet J., Acher R. The reactive sites of Kunitz bovine-trypsin inhibitor. Role of lysine-15 in the interaction with chymotrypsin. // Eur. J. Biochem. 1975. 54. N 1. p. 31-38

42. Chao J., Chai K.X., Chao L. Tissue kallikrein inhibitors in mammals. // Immunopharmacology. 1996, 32, p. 67 72.

43. Chu J.W, Kimura T. Studies on adrenal steroid hydroxylases. Molecular and catalytic properties of adrenodoxin reductase (flavoprotein). // J. Biol. Chem. 1973. 248. p. 20892094.

44. Colman R.W. Surface-mediated defense reactions. The plasma contact activation system. // J. Clin. Invest. 1984, 73, p. 1249 1253.

45. Colman R.W. Inhibitory and antiadhesive properties of human kininogens. // Agent. Action. Suppl. 1993, 42, p. 125 -143.

46. Colman R. W. et. al. // Circulation. 1996, 94, p.1-42.

47. Colman R.W. // Immunopharmacology, 1996 32, p. 9 -18.D

48. Davie E.W., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. // Biochemistry 1991, 30, p. 10363-10370.

49. Davies, R.J., Edwards, P.R., Watts H., Lowe C.R., Buckle P.E., Yeng D. The resonant mirror: a versatile tool for the study of biomolecular interactions. // Techniques in Protein Chemistry. Acad. Press, Inc, 1994. p. 285-292.

50. DeLa Cadena R., Colman R. The sequence HGLGHGHEQQHGLGHGH in the light chain of high molecular weight kininogen serves as a primary structural feature for zinc-dependent binding to an anionic surface. // Protein Sci. 1992, 1, p. 151-160.

51. DeLa Cadena R.A., Wachtvogel Y.T., Colman R.W. // Hemostasis and . Trombosis: Basic Principles and Clinical Practice, 1974.

52. De los Rios. Mechanism of the leakage induced on lipid model membranes by the hemolytic protein sticholysin II from the sea anemone Stichodactyla helianthus // Eur J Biochem. 1998,1 ;252(2):284-9.

53. De los Rios V., Mancheno J.M., del Pozo A.M., Alfonso C., Rivas G., Onaderra M., Gavilanes J.G. Sticholisin II, a cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus, is a monomer-tetramer associating protein // FEBS Letters, 1999. V. 455. P. 27-30.

54. Devlin, Isolation and partial purification of hemolytic toxin from sea anemone, Stoichactis helianthus//J Pharm Sci., 1974;63(9):1478-80.

55. Dotsenko V.L., Neshkova H.A., Yarovaya G.A The regulating interrelationship of some serine proteinases from leukocyte with the human plasma kallikrein-kinin system. // Agent Action. Supl., 1992. 38, p. 144-156.

56. Dunn J.T., Kaplan A.P. Formation and structure of human Hageman factor fragments. //J.Clin.Invest., 1982, 70, p. 627 631.E

57. Elmoujahed A., Gutman N., Brillard M., Gouthier F. Substrate specificity of two kallikrein family gene products isolated from the rat submaxillary gland. // FEBS Lett., 1990, 265, p. 137-140.

58. Espana F., Estelles A., Griffin J.H., Aznar J. Interaction of plasma kallikrein with protein С inhibitor in purified mixtures and in plasma. // Thrombosis and Haemostasis, 1991, 65, p. 46-51.F

59. Ferlan I., Equinatoxin, a lethal protein from Actinia equina-l. Purification and characterization // Toxicon, 1974 Jan;12(1):57-61.

60. Finkenstadt W.R., Laskowski M., Jr. Peptide bond cleavage on trypsintrypsin inhibitor complex formation. //J. Biol. Chem., 1965. 240. N 2. p. 962-963

61. Fisher R.S., Goldberg R.B. // Cell,. 1982. 29. N 2. p. 651-660

62. Fritz H.,Jochum H., Geiger R., Duswald Kh., Dittmer H., Kortmann H., Neumann S., Lang H. Folia Histochem Cytobiol. // Citobiol., 1986, 24, p. 99 -119.

63. Freedman M.N., Grossberg A.L., Pressman D. The effects of complete modification of amino groups on the antibody activity of antihapten antibodies. Reversible inactivation with maleic anhydride// Biochemistry, 1968. 7. N 5. p. 1941-1950

64. Fujikawa K., Davie E.W. Human factor XII (Hageman factor). // Meth. Enzymol., 1981, 80, p. 198-211.G

65. Galettis P., Norton R.S. Biochemical and pharmacological studies of the mechanism of action of tenebrosin C, a cardiac stimulatory and hemolytic protein from the sea anemone, Actinia tenebrosa //Toxicon, 1990. V. 28. P. 695-706.

66. Garcia-Olmedo F., Salcedo G., Sanchez-Monge R., Gomez L., Royo J., Carbonero P. // Oxf. Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. 4. p. 275-334

67. Geren K., Tuls J., O'Brien P., Millett F., Peterson Y.A. The involvment of carboxylate groups of putidaredoxin reductase//J. Biol. Chem. 1986. 261. p. 15491-15495.

68. Gomara M.J., Ercilla G., Alsina M.A., Наго I. Assessment of synthetic peptides for hepatitis A diagnosis using biosensor technology // J. Immunol. Methods, 2000, 246, p. 1324.

69. Green N.M. Competition among trypsin inhibitors. // J. Biol. Chem., 1953. 205. N 2. p. 121-138

70. Gurewich V., Johnstone M., Loza J.P., Pannel R. Pro-urokinase and prekallikrein are both associated with platelets. Implications for the intrinsic pathway of fibrinolysis and for therapeutic thrombolysis.//FEBS Lett., 1993,318, p. 317-321.

71. Gunsalus, I. C., and Wagner, G.C. Bacterial P-450cam methylene monooxygenase components: cytochrome m, putidaredoxin, and putidaredoxin reductase. // Methods Enzymol., 1978, 52, p. 166-188.H

72. Haniu M., Armes L.G., Yasunobi K.T., Shastry B.A. and Gunsalus L.C. Amino acid sequence of the Pseudomonas putida cytochrome P-450, parts I and II. // J. Biol. Chem., 1982.257, p. 12657-12667.

73. Haynes R., Osuga D.T., Feeney R.E. Modification of amino groups in inhibitors of proteolytic enzymes// Biochemistry, 1967. N 2. p. 541-547

74. Hedegaard J., Gunsalus I.C. Mixed function oxidation. IV. An induced methylene hydroxylase in camphor oxidation // J.Biol.Chem., 1964. 240. p. 4038-4043.

75. Hintz M. J., MockD.M., Peterson L.L., Tuttle K., Peterson J.A. Equilibrium and kinetic studies of the interaction of cytochrome P450cam and putidaredoxin //J.Biol.Chem., 1982. 257. p. 14324-14332.

76. Hessinger. Binding of human lymphotoxin to target-cell membranes and its relation to cell-mediated cytodestruction // Proc Natl Acad Sci USA, 1973 Nov;70(11):3082-6.

77. Hojima Y., Pieree J.V., Pisano J.J. Pumpkin seed inhibitor of human factor Xlla (activated Hageman factor) and bovine trypsin // J.Biol.Chem., 1983, 258, p. 400 406.

78. Holden М., Mayhew M., Buuk D, Roitberg A., Vilker V. Probing the interactions ofputidaredoxin with redox partners in camphor P4505-monooxygenase by mutagenesis of surface residues// J.Biol.Chem., 1997. 272, 35. p. 21720-21725.

79. Honkakoski P., Linnala-Kankkunen A., Usanov S.A., Lang M.A., Highly homologous cytochromes P-450 and b5: a model to study protein-protein interactions in a reconstituted monooxygenase system // Biochim. Biophys. Acta, 1992 Jul 13; 1122 (1), 6-14

80. Jochum M., Machleidt W., Fritz H. // Handbook of Mediators in Septic Shock, London, Tokyo:CRC Press. 1993, p. 335 361.

81. Jung, C., Hui Bon Hoa, G., Schroeder, K.-L., Simon, M., and Doucet, J.P. // Biochemistry 1992, 31, p. 12855-12862.К

82. Kaplan A.P., Silverberg M. The coagulation-kinin pathway of human plasma. // Blood. 1987, 70, p. 1 -15.

83. Koide Т., Ikenaka T. Studies on soybean trypsin inhibitors. 1. Fragmentation of soybean trypsin inhibitor (Kunitz) by limited proteolysis and by chemical cleavage. // Eur. J. Biochem., 1973. N 3. p. 401-407

84. Kortt A.A.,1979, // Biochim. Et Biophys. Acta, 577(2), 371-382;

85. Kortt A.A., Jermyn M.,A. Acacia proteinase inhibitors. Purification and properties of the trypsin inhibitors from Acacia elata seed. // Eur. J. Biochem. 1981. 115. N 3. p. 551-557

86. Kunitz M. // J. Gen. Physiol., 1946. 29. N 3. p. 149-154.

87. Macek P., Belmonte G., Pederzolli C., Menestrina G. Mechanism of action of equinatoxin II, a cytolysin from the sea anemone Actinia equina L. belonging to the family of actinoporins//Toxicology, 1994. V. 87. P. 205-227.

88. Macek P. Polypeptide cytolytic toxins from sea-anemones (Actiniaria) // FEMS Microbiol. Immunol., 1992. V. 105. P. 121-130.

89. Maeda K. // Biochem. et Biophys. Acta, 1986. 271. N3. p. 250-256

90. Mancheno J.M., Martin-Benito J., Gavilanes J.G., Hermoso J.A. Crystal and electron microscopy structures of Sticholysin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation. // Structure, 2003. V. 11. p. 1-20.

91. Mancera, R.L. II in Proc. of 3rd International Conference on Molecular Structural Biology (Eds. A.J. Kungl and P.J.Andrew), Vienna, Austria . 1999, p. 92.

92. Marcus RA, Sutin N. Electron transfer in chemistry and biology // Bioph Biochim Acta 1985. 811: p. 265-322.

93. Margolius H.S. Tissue kallikreins and kinins: regulation and roles in hypertensive and diabetic diseases // Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol., 1989, 29, p. 343 364.

94. Mignatti P., Rifkin D.B. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion // Physiol. Rev., 1993, 73, p. 161 -195.

95. Miles L.A, Greengard J.S, Griffin J.H. A comparison of the abilities of plasma kallikrein, beta-Factor XIla, Factor Xla and urokinase to activate plasminogen // Thromb. Res., 1983, 29, p. 407-417.

96. Murray S.R., Chao J., Chao L. //Agent Action. Supl., 1983, 38(1), p. 26 33.

97. Myszka D.G., Rich R.L. Implementing surface plasmon biosensors in drug discovery // Pharm. Sci. Technol. Today, 2000, v. 3(9), p. 310-317.N

98. Nagase H., Salveseu G. // Innovation in Proteases and their Inhibitors., New York; Walter de Gruyter, 1993 p. 315 - 332.

99. Narat. The humoral and cellular immune response to a lipid attenuated pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina L. // Toxicon, 1994 Jan;32(1):65-71.

100. Natsume Т., Nakayama H., Jansson O., Isobe Т., Takio K., Mikoshiba K. Combination of biomolecular interaction analysis and mass spectrometric amino acid sequencing //Anal.Chem., 2000, v. 72(17), p. 4193-4198.

101. Nedelkov D., Rasooly A., Nelson R.W. Multitoxin biosensor-mass spectrometry analysis: a new approach for rapid, real-time, sensitive analysis of staphylococcal toxins in food // Int. J. Food Microbiol., 2000, v. 60, p. 1-13.

102. Negreiros A.N., Carvalho M.M., Filho J.X., Blanco-Labra A., Shewry P.R., Richardson M. The complete amino acid sequence of the major Kunitz trypsin inhibitor from the seeds of Prosopsis juliflora. // Phytochemistry, 1991. 30. N 9. p. 2829-2833

103. Nelson D.R., Strobel H.W. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P450 proteins//J. Biol. Chem., 1988. 263. p. 6038-6050

104. Nelson R.W., Nedelkov D., Tubbs K.A. Biosensor chip mass spectrometry: a chip-based proteomics approach // Electrophoresis, 2000, v. 21(6), p. 1155-1163.

105. Norton R.S. Structure and function of peptide and protein toxins from marine organisms. //J. Toxicol.-Toxin Rev., 1998. V. 17. p. 99-130.

106. Novotny L.A., Jurcisek J.A., Pichichero M.E., Bakaletz L.O. Epitop mapping of the outer membrane protein P5-homologous fimbrin adhesin of nontypeable Haemophilus influenzae // Infect Immun., 2000, v. 68(4), p.2119-2128.

107. Odani S., Koide Т., Ono Т., Wheat germ trypsin inhibitors. Isolation and structural characterization of single-headed and double-headed inhibitors of the Bowman-Birk type. // J. Biochem., 1986. 100. N4. p.975-983

108. Odani S., Ono T. Chemical substitutions of the reactive site leucine residue in soybean Bowman-Birk proteinase inhibitor with other amino acids. // J. Biochem., 1980. 88. N5. p. 1555-1558

109. Odani S., Ono Т., Ikenaka T. Proteinase inhibitors from a mimosoideae legume, Albizzia julibrissin. Homologues of soybean trypsin inhibitor (Kunitz). // J Biochem (Tokyo), 1979. 86. N6. p. 1795-1805

110. Omura, Т., and Takesue, S. A new method for simultaneous purification of cytochrome b5 and NADH-cytochrome b5 reductase from rat liver microsomes // J. Biochem., 1970, 67, p. 249-257.

111. Onesti S, Matthews D.J., Aducci P., Amiconi G., Bolognesi M., Menegatti E., Ascenzi P. //J. Mol. Recognit., 1992, 5(3), 105-114.

112. Osawa K„ Laskowski M., Jr. //J. Biol. Chem., 1966. 241. N 17. p. 3955-3961P

113. Page J.D., Colman R.W. Localization of distinct functional domains on prekallikrein for interaction with both high molecular weight kininogen and activated factor XII in a 28-kDa fragment (amino acids 141-371)//J.Biol.Chem., 1991, 266, p. 8143-8148.

114. Page J.D., Yen J.L., Harris R.B., Colman R.W. Localization of the binding site on plasma kallikrein for high-molecular-weight kininogen to both apple 1 and apple 4 domains of the heavy chain // Arch Biochem Biophys., 1994, 314, p. 159 -164.

115. Pederzolli. Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin II, a cytolysin from a sea anemone // Bioconjug Chem., 1995;6(2):166-73.

116. Pochapsky T.C., Lyons T.A., Kazanis S., Arakaki T. Ratnaswamy. A structure-bassed model for cytochrome P450cam-putidaredoxin interactions // Biochemistry, 1996. 78. p. 723-733

117. Polanowski A., Wilusz Т., Nienartowioz В., Cielar E., Slominska A., Nowak K. Isolation and partial amino acid sequence of the trypsin inhibitor from the seeds of Cucurbita maxima //Acta Biochim. Polonica, 1980. 27. N 3. p. 37-382

118. Poulos T.L. The crystal structure of cytochrome P450cam.// In Cytochrome P450cam: Structure, Mechanism and Biochemistry, edited by P.R.Ortiz de Montellano. New York, London, Plenum Press, 1986. p. 505-523.

119. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam //J. Mol. Biol., 1987.195. p. 687-700.

120. Prado E.S., Juliano L., Araujo-Viel M.S., Juliano M.A. Tissue kallikreins and related enzymes: characterization by model oligopeptides //Adv.Exp.Med.Biol., 1986, 198, Part B, p. 241-247.

121. Pub Med http://www.ncbi.nlm.nih.gov/R

122. Read R.J., James M.N.G. In: Proteinase ingibitors // Eds A.J.,Barret, G. Salvesen -Amsterdam: Elsevier, 1986. p. 301-336

123. Retxios A.D., Rosenfeld R., Schiffman S. Effects of chemical modifications on the surface- and protein-binding properties of the light chain of human high molecular weight kininogen // J. Biol. Chem., 1987, 262, p. 3074 3081.

124. Richardson M. //Phytochemestry, 1977. 16. N. 1. p. 159-169

125. Richardson M. // Food Vhem., 1981. 6. N 2. p. 235-253

126. Rojkar R., Schmaier A.H Proc. Activation of the plasma kallikrein/kinin system on endothelial cells. //Assoc. Am. Phys., 1999,111, p. 220-227.

127. Ryan C.A. //Ann. Rev. Plant Physiol., 1973. 24. N 2. p. 173-196S

128. Sato R. Distribution and physiological function. Cytochrome P450, edited by R. Sato and T. Ornura (Kodansha L.T.D.-Acad. Press, N.Y.- Tokyo), 1978. p. 23-35.

129. Schapira M. // Seminars in Thrombosis and Haemostasis, 1987, 13, p. 69 78.

130. Schmaier A.H., Silverberg M., Kaplan A.P., Colman R.W. Hemostasis and Trombosis. Basic principles and clinical practice // Philadelphia: J.B.Lippincott Company, 1987, p.18-37.

131. Scott C.F., Colman R.W. Function and immunochemistry of prekallikrein-high molecular weight kininogen complex in plasma. //J. Clin. Invest., 1980, 65, p. 413-421.

132. Scott C.F., Silver L.D., Purdon A.D., Colman R.W. Cleavage of human high molecular weight kininogen by factor Xla in vitro. Effect on structure and function. // J.Biol.Chem., 1985, 260, p. 10856 -10863.

133. Scott C.F., Silver L.D., Shapira M., Colman R.W. Cleavage of human high molecular weight kininogen markedly enhances its coagulant activity. Evidence that this molecule exists as a procofactor. // J.Clin.Invest., 1984, 73, p. 954 962

134. Shnirov, V.L., Monastyrnaya, M.M., Zhadan, G.G., Kuznetsova, S.M., Kozlovskaya, E.P., Calorimetric study of interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane. // Biochem. Intl. 1992. 26, p. 219-229.

135. Shurnko, R.M., Gill, R.,Wood, S., De Meyts, P.,0gawa, Y„ Heding, A. 4-th European BIAsymposium on Biomolecular Interaction Analysis: Abstracts.- Heidelberg (Germany), 1994. p. 24.

136. Sket D, K, Ferlan Draslar I, Lebez D. Equinatoxin, a lethal protein from Actinia equina. II. Pathophysiological action//Toxicon, 1974;12(1):63-8.

137. Sligar S.G., Debrunner P.G., Lipscomb I.D., Namtvett, M.J. Gunsalus I.C. Role of the putidaredoxin COOH-terminus in P-450cam hydroxylations. // Proc. Nat. Acad. Sci.( USA), 1974.21. p. 3906-3910.(a)

138. Song O., Chao J., Chao L. High level expression of human tissue kallikrein in the circulation induces hypotension in transgenic mice. // Immunopharmacology, 1996, 32, p. 105-107.

139. Song H. K. and Suh Se W„ 1998, // J. Mol. Biol., 275, 347-363.

140. Spatz, L., and Strittmatter, P. A form of cytochrome b5 that contains on additional hydrophobic sequence of 40 amino acid residues. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1971, 68, p. 1042-1046

141. Stadnicki A., DeLa Cadena R., Sartor R.B., Kettner C.A., Colman R.W. The contact system in experimental enterocolitis. // Immunopharmacology, 1996, 33, p. 314 316.

142. Steinmann W.//Immunopharmacology, 1996, 32, p. 2-5.

143. Stayton P.S., Fisher M.T., Sliger S.G. Determination of cytochrome b5 association reactions. Characterization of metmyoglobin and cytochrome P-450cam binding to genetically engineered cytochromeb5. // J. Biol. Chem., 1988 263(27), p. 13544-13548.

144. Stayton P.S., Poulos T.L., Sliger S.G. 1989 Putidaredoxin competitively inhibits cytochrome b5-cytochrome P-450cam association: a proposed molecular model for a cytochrome P-450cam electron-transfer complex. // Biochemistry, 1987: p. 8201-8205.

145. Stayton P.S., Sligar S.G. The cytochrome P-450cam binding surface as defined by site-directed mutagenesis and electrostatic modeling//Biochemistry, 1990. 29. p. 73817386.

146. Suput D, Frangez R, Bunc M. Cardiovascular effects of equinatoxin III from the sea anemone Actinia equina (L.) //Toxicon, 2001; 39(9):1421-7.

147. Svendsen I., Boisen S., Hejgaard J. // Carlsberg Res. Commun., 1982. 47. N.1. p.4553

148. Sweet R.M., Wright H.T., Janin J., Chothia C.H., Blow D.M. Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2.6-A resolution. // Biochemestry, 1974.13. N. 20. p. 4212-4228т

149. Tamburini P.P., Schenkman J.В. Differences in the mechanism of functional interaction between NADPH-cytochrome P450 reductase and its redox partners. // Molecular Pharmacology, 1986. 30. p. 178-185.

150. Tans G., Rosing J. // Siminar in Thrombosis and Heostasis, 1987, 13, 25 35.

151. Tayeh M.A., Olson S.T., Shore J.D. //J. Biol. Chem., 1985, 260, p. 10856-10842.

152. Troll W., Wiesner R. Protease inhibitors: possible anticarcinogens in edible seeds // The Prostate, 1983. 4. N 3. p. 345-349

153. Turk, Т., Cytolytic toxins from sea anemones. // J. Toxicol.-Toxin Rev., 1991. 10, p. 223-262.U

154. User's Guide/Affinity Sensors Saxon Way, Bar Hill Cambridge, CB385L, EnglandV

155. Valcarcel. Coupling continuous separation techniques to capillary electrophoresis // J. Chromatogr., 2001, 27;924(1-2):3-30. Review.

156. Veselovsky A.V., Ivanov Yu.D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P. and Janssen P.,

157. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs // J. Mol.

158. Recognit., 2002, 15, 405-422

159. Vincent J. P., Schweitz H., Lazdunski M„ 1972, 42. (3), 505-510

160. Vodkin L.O. // Plant Physiol., 1981. N3. p. 766-771W

161. Wang J., Xiong W., Yang Z., Davis Т., Deney M.J., Chao J., Chao L. // Hypertension, 1994, 23, p. 236-243.

162. Welschof M., Terness P., Kipriyanov S.M., Stanescu D., Breitling F., Dorsam H., Dubel S., Little M., Opelz G. The antigen-binding domain of a human lgG-anti-F(ab')2 autoantibody// Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1997, v. 94, p. 1902-1907.

163. Wong J., Chao L„ Chao J. //J.CIin.lnvest., 1995, 95, p. 1710-1716.Y

164. Yamamoto M., Hara S., Ikenaka N. Amino acid sequences of two trypsin inhibitors from winged bean seeds (Psophocarpus tetragonolobus (L)DC.). II J. Biochem., 1983. 94. N3. p.849-861

165. Yarovaya G.A., Dotsenko V.L., Neshkova H.A. Intern.Conf.Kinin 91. Munich. Toward Understandig // The Molecular Basis of Kinin Action. Abs., 1991, p.188.

166. Zhou G.H., Chao L., Chao J., Zhou. Kallistatin: a novel human tissue kallikrein inhibitor. Purification, characterization, and reactive center sequence. // J.Biol.Chem., 1992, 267, p. 25873 25880.

167. Zorec R, Tester M, Macek P, Mason WT. Cytotoxicity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina involves ion channel formation and an increase in intracellular calcium activity//J Membr. Biol. 1990;118(3):243-9.t

Информация о работе

Раченкова, Наталья Ивановна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Оптико-биосенсорный анализ термодинамических характеристик белок-белковых комплексов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы