Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых методов исследования лимфоцитов и эритроцитов с помощью иммунологических биочипов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых методов исследования лимфоцитов и эритроцитов с помощью иммунологических биочипов"

1 V

На правахр^кописи

С'

а - '

003170354

ШИШКИН Александр Валентинович

РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ И ЭРИТРОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ

БИОЧИПОВ.

03.00.04- биохимия.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3 1222

Москва 2008.

003170354

Работа выполнена в государственном учреждении Гематологическом научном центре Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Ф И Атауллаханов

Академик РАН И РАМН А И Воробьев

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Егорова Марина Олеговна

Доктор биологических наук Рябых Татьяна Павловна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится*?2008 г в/^'^час на заседании Диссертационного совета Д001 042 02 в государственном учреждении Гематологическом научном центре РАМН (125167 г Москва Новый Зыковский проезд д 4-а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН Автореферат разослан « 2008 г.

Ученый секретарь диссертационого совета Д 001.042 02 кандидат медицинских наук

Е Е Зыбунова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы быстро развивается аналитические (диагностические) системы нового поколения - биочипы С их помощью возможно параллельное проведение большого количества однотипных исследований При массовом производстве себестоимость одного биочипа ничтожно мала, а их использование позволяет резко снизить расходы на проведение анализа Весьма перспективным представляется создание иммунологических биочипов, позволяющих осуществлять определение поверхностных антигенов клеток Наиболее востребованными они дотжны оказаться в области гематологии, где установление иммунофенотипа клеток опухоли является одним из ключевых критериев постановки диагноза

В настоящее время иммунофенотип клеток устанавливается с помощью ряда методов, позволяющих одновременно определять лишь один антиген (иммуноцитохимические методы и большинство иммунофлюоресцентных методов) или небольшое количество антигенов (проточная щпофлюориметрия) Использование биочипов позволит определять наличие в исследуемом образце клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены, с помощью панелей, включающих большое число антител Биочипы могут применяться для скрининговых исследований

Работы по созданию биочипов для определения поверхностных антигенов клеток в настоящее время проводятся несколькими зарубежными исследовательскими группами При создании биочипов, зарубежные исследователи не ставили никаких дополнительных задач, кроме определения поверхностных антигенов клеток В то же время, возможно применение нескольких новых подходов, способных значительно расширить возможности использования биочипов

Весьма перспективной представляется окраска связавшихся на биочипе клеток для проведения их морфологически о исследования Такой подход позволит определить, какие именно типы клеток экспрессируют тот ити иной поверхностный антиген Кроме того, существует возможность значительного повышения чувствительности анализа за счет точной регуляции скорости потока жидкости при отмывке биочипов Также представляется перспективной разработка способа сортировки клеток на биочипе (концентрирования в области пятен биочипа клеток, экспрессирующих определяемые антигены)

Цель работы. Создание иммунологических биочипов, позволяющих осуществлять определение клеточных поверхностных антигенов, а также проводить морфологическое исследование связавшихся клеток Задачи исследования-

1 Разработка методики изготовления биочиов выбор материала подложек для изготовления биочипов и способа иммобилизации антител

2 Оценка возможности использования созданных биочипов для определения поверхностных антигенов нормальных клеток крови (эритроциты и лимфоциты здоровых доноров) и клеток лимфатических опухолей (лимфоциты больных хроническим В-лимфолейкозом), а также для определения процентного содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены

3 Оценка возможности окрашивания связавшихся с биочипом клеток одним из общепринятых методов и проведения их морфологического исследования

4 Оценка чувствительности анализа и поиск путей ее повышения

5 Оценка возможности концентрирования клеток в области пятен биочипа

Научная новизна.

В данной работе предложен ряд новых подходов к использованию биочипов и продемонстрирована возможность их осуществления

1) Показана возможность осуществления окраски связавшихся с биочипом клеток и проведение их морфологического исследования

2) Разработан способ проведения анализа на биочипах с использованием проточной установки, позволяющий значительно повысить чувствительность метода Показано, что могут быть созданы скорости потока, при которых происходит отрыв неспецифически связавшихся клеток, а клетки, даже недостаточно прочно связавшиеся с антителами (из-за плохой очистки или низкой аффинности используемых антител и (или) невысокой экспрессии определяемых антигенов), остаются на поверхности пятен биочипа

3) Показана возможность проведения исследования процесса отрыва связавшихся с антителами клеток при различных скоростях потока жидкости

4) Разработан новый способ концентрирования в области пятен биочипа клеток, присутствующих в смешанной клеточной суспензии в небольших количествах

Практическая ценность и область применения результатов.

Полученные результаты позволили решить ряд методических и технологических проблем, связанных с разработкой, изготовлением и практическим использованием биочипов для определения поверхностных антигенов клеток Это должно оказаться весьма полезным в случае, если подобные биочипы будут в дальнейшем разрабатываться и производиться в нашей стране Технология изготовления биочипов была адаптирована к предполагаемым условиям производства (методом микроконтактного нанесения)

Было продемонстрировано хорошее соответствие (в пределах ошибки среднего) результатов определения процентного содержания клеток, экслрессирующих различные поверхностные антигены, при проведении анализа с помощью биочипов с данными проточной цитофлюориметрии При этом с помощью биочипа одновременно может быть определено гораздо большее количество поверхностных антигенов (на разных клетках)

Использование прозрачных подложек сделало возможным проведение микроскопического исследования связавшихся с биочипом клеток в проходящем свете Использование окраски позволяет осуществлять морфологическое исследование параллельно с определением поверхностных антигенов у одних и тех же клеток, что невозможно при использовании других методов

Отмывка биочипа в проточной камере позволяет избежать отрыва клеток, слабо связавшихся с антителами, что делает возможным определение слабо экспрессированных поверхностных антигенов

Предложен способ концентрирования клеток на биочипе, который может быть использован для выделения из суспензии клеток, присутствующих в малых количествах в случае необходимости их дополнительного исследования при отсутствии клеточного сортировщика

В зависимости от конкретных задач и уровня оснащенности лаборатории могут быть проведены различные виды дополнительных исследований связавшихся клеток В наиболее простом варианте (при качественном или полуколичественном определении плотности связывания клеток) проведение анализа с помощью разработанных биочипов может быть выполнено в клинической лаборатории любого медицинского учреждения, включая поликлинику

Достоверность научных положений.

Большинство экспериментов воспроизводилось не менее 3-4 раз с клетками одних и тех же доноров В диссертации приводятся только те результаты, которые хорошо воспроизводились в предварительных экспериментах (были получены те же значения титра и близкие значения плотности заполнения пятен) На приведенных графиках и диаграммах указана ошибка среднего, рассчитанная по результатам каждого эксперимента в отдельности

Только в экспериментах по исследованию процесса отрыва эритроцитов с поверхности биочипа при различных скоростях потока жидкости в проточной камере, в связи с большой трудоемкостью их исполнения, количественное определение плотности связывания эритроцитов проводилось однократно В предварительных экспериментах проводилась качественная оценка плотности связывания клеток

Личный вклад автора в выполнение работы.

Работа выполнена автором полностью самостоятельно, включая все предварительные эксперименты, а также отработку всех использованных методик При проведении значительной части экспериментов автором использовались собственные клетки

Без участия автора сотрудниками лаборатории гемоцитологии ГУ ГНЦ РАМН осуществлялось выполнение ряда клинических анализов методом проточной цитофлюориметрии С этими результатами сравнивались данные, полученные при исследовании тех же образцов клинического материала, проводившемся автором с помощью биочипов Кроме того, сотрудниками Института молекулярной биологии РАН на промышленной установке методом микроконтактного нанесения была изготовлена небольшая опытная партия биочипов

Положения, выносимые на защиту.

1 Отработана методика изготовления биочипов на выбранных прозрачных и оптически однородных пластиковых подложках, обеспечивающих иммобилизацию антител за счет адсорбции

2 Созданные биочипы позволяют проводить определение поверхностных антигенов эритроцитов, а также лимфоцитов здоровых доноров и больных В-ХЛЛ При этом может быть проведено определение процентного содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие поверхностные антигены, результаты которого хорошо совпадают с результатами, получаемыми с помощью проточной цитофлюориметрии

3 Показана возможность окраски связавшихся с биочипом клеток и проведения их морфологического исследования

4 Установлено, что чувствительность анализа зависит от условий отмывки биочипов Предложен способ отмывки биочипов в проточной камере, позволяющий добиться ее значительного повышения

5 Разработан способ концентрирования в области пятен биочипа клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены, основанный на использовании циклического режима инкубации/отмывки биочипа в проточной камере при его взаимодействии с клеточной суспензией

Апробация работы состоялась 27 марта 2008г на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в ГУ Гематологическом научном центре РАМН Результаты работы докладывались на II Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и

медицины» г Ижевск 2005г, IV Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» г Ижевск 2007г, 11-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века» г Пущино 2007г, школе-конференции молодых ученых аспирантов и студентов «Биомедицинская инжснерия-2007» г Пущино 2007г, V Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» г Ижевск 2008 заседании Удмуртского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (г Ижевск) 7 02 2008г Фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах лаборатории физической биохимии системы крови ГУ ГНЦ РАМН

Внедрение резучьтатов

Результаты внедрены в работу лаборатории физической биохимии системы крови ГУ ГНЦ РАМН, а также в работу Ижевской государственной медицинской академии (ИГМА) и используются для разработки новых образцов иммунологических биочипов

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ в материалах 5 научных конференций и 1 печатная работа в научном журнале, рекомендованном ВАК

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из четырех глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, содержит 57 рисунков и 8 таблиц Библиография включает 120 наименований

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Антитела

В работе использовались моноклональные мышиные антитела (IgG), специфичные к антигенам лимфоцитов CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CDlla, CDllb, CD 16, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM (ООО «Сорбент», Москва), a также антитела (IgM), специфичные к поверхностным антигенам эритроцитов А, В, D, С, с, Е, е (диагностикумы марки ЭРИТРОТЕСТ™- ЦОЛИКЛОН) (ООО «Гематолог», Москва) и человеческие сыворотки, специфичные к антигенам системы HLAI класса А2, А10, All, А32, В44, В62, В51, В40, В41 (ЗАО «Межрегиональный центр иммуногенетики и гистотипирующих реагентов» г Санкт-Петербург)

2.2 Реактивы.

Обезжиренное сухое молоко («Kroger», USA), раствор для градиентного центрифугирования Ficoll-paque, ЭДТА, таблетки для приготовления буфера PBS, 0,05% раствор детергента «Tween-20», метанол («Sigma Aldnch», USA)

2.3 Подложки

Использовались следующие типы подложек 1) полистироловые подложки, 2) полистироловые подложки, обработанные в высокочастотном газовом разряде, 3) полистироловые подложки, обработанные глутаровым альдегидом, 4) подложки из пластифицированного поливинилхлорида (ПВХ), 5) обезжиренные предметные и покровные стекла, 6) стекла с полимерным покрытием (нитроцеллюлоза), 7) пленки из нитроцеллюлозы, 8) стекла с алюминизированной поверхностью, покрытые у-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) и обработанные окисленньм декстраном

2.4 Получение клеточной суспензии.

Лимфоциты были выделены из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности Полученные клетки ресуспензировались в инкубационном буферном растворе В экспериментах с эритроцитами использовалась цельная кровь или отмытые эритроциты, которые ресуспензировались в фосфатном буфере (PBS) Содержание клеток в суспензии определялось с помощью камеры Горяева

2.5 Изготовление биочипов.

Капли (0,5 мкл) растворов антител с различными разведениями наносились на подложки автоматической пипеткой в заранее отмеченные участки Подложки с нанесенными антителами помещались в камеру со 100% влажностью и инкубировались при +4°С в течение ночи, после чего высушивались и замораживались при -2б°С Биочипы могли храниться без потери свойств, по меньшей мере, в течение 12 месяцев В некоторых случаях изготовление биочипов осуществлялось с помощью установки для микроконтактного нанесения (объем капель 0,01 мкл)

2 6 Проведение анализа.

Биочипы, закрепленные в чашках Петри, в течение часа инкубировали с 1% раствором сухого молока в PBS и отмывали раствором детергента Затем в течение 30-40 минут осуществлялась инкубация с клеточной суспензией (оптимально 5,5 106 клеток/мл) при комнатной температуре без перемешивания После ее завершения для устранения не связавшихся с антителами клеток биочипы несколько раз ополаскивались PBS Качество отмывки оценивалось при помощи инвертированного микроскопа За пределами пятен биочипа связавшиеся клетки должны были отсутствовать После завершения отмывки биочип высушивался на воздухе (если не планировалась окраска связавшихся клеток флюоресцентно мечеными антителами) Связавшиеся на биочипе клетки могли быть

зафиксированы метанолом и окрашены по Романовскому-Гимзе. Затем проводилось морфологическое исследование клеток, связавшихся в области каждого пятна биочипа.

2.7 Определение процентного содержания в исследуемом образце клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены.

Каждое пятно биочипа фотографировалось через микроскоп с помощью цифрового фотоаппарата "Olimpus SP-350". Для определения плотности связывания клеток на поверхности пятен биочипа на микрофотографии каждого пятна выбиралось не менее 3 участков (соответствующих областям 100x100 мкм), в которых проводился подсчет клеток. Полученные значения усреднялись. Плотность заполнения поверхности пятен связавшимися клетками выражались в [кл/мм2].

Для того чтобы результаты анализа клеток на биочипах можно было сравнивать с данными проточной цитофлюориметрии, полученные значения плотности заполнения поверхности пятен связавшимися клетками было необходимо перевести в проценты. За 100% принималась средняя плотность связывания клеток в области пятен с антителами aHTH-CD45. Исходя из этого, осуществлялся пересчет в проценты плотности связывания клеток в области других пятен.

2.8 Окраска связавшихся клеток флюоресцентно мечеными антителами.

Биочип со связавшимися клетками в течение 30 минут при комнатной

температуре инкубировался с раствором флюоресцентно меченых антител, смешанных с инактивированной нагреванием человеческой сывороткой (10% по объему). Далее проводилась отмывка PBS. Затем осуществлялось исследование биочипа с помощью флюоресцентного микроскопа. Каждое пятно фотографировалось.

2.9 Проведение экспериментов с использованием проточной камеры.

Эксперименты по определению зависимости плотности связывания клеток на

биочипе от скорости отмывки, а также эксперименты по концентрированию клеток в области пятен биочипа проводились с помощью самостоятельно изготовленной проточной камеры с поперечным сечением капилляра 8 мм2 (рис. 1).

£

Рис. 1 Устройство проточной камеры 1) Корпус камеры, 2) Стекло, 3) Биочип, 4) Приводящая трубка, 5) Отводящая трубка, 6) Кран, 7) Трубка для дополнительного введения жидкости в капилляр камеры Общая длина канала проточной камеры 33 мм, ширина - 6 мм, глубина -1,3 мм Внутренний диаметр приводящей и отводящих трубок 3 мм Расстояние между краями отверстий трубок 21 мм

Камера подключалась к шприцевому насосу «Syringe pump Model 11 plus» («Harvard Apparatus, Inc », USA), позволяющему получить объемную скорость потока жидкости до 40000 мкл/мин

Проточная камера помещалась на предметном столике микроскопа таким образом, чтобы биочип, образующий одну из стенок ее канала, располагался внизу Камера заполнялась 1% раствором BSA или обезжиренного сухого молока в PBS Инкубация осуществлялась в течение 1 часа Затем через камеру в течение 5 минуг пропускался PBS с объемной скоростью 200 мкл/мин После этого в капилляр камеры через дополнительную трубку вводилось 0,3 мл разбавленной PBS гепаринизированной крови с концентрацией эритроцитов не менее 1,5* 107 клеток/мл, и осуществлялась инкубация в течение 10-15 минут при отсутствии потока Затем неспецифически связавшиеся клетки смывались потоком PBS, и проводилось фотографирование пятен биочипа При исследовании прочности связывания клеток с биочипом скорость потока увеличивалась на определенную величину и после пропускания потока жидкости в течение одной минуты, и осуществлялось фотографирование каждого пятна Эго повторялось многократно до полного отрыва всех клеток или до достижения максимально возможной скорости потока Определение количества клеток, связавшихся на единице площади поверхности пятна, проводилось так же, как описано выше 2.10 Концентрирование клеток в области пятен биочипа При необходимости достижения максимально возможного заполнения поверхности пятен клетками, присутствующими в суспензии в небольших количествах, использовался циклический режим инкубации Каждый цикл состоял из инкубации без потока в течение 10-15 мин и подачи потока в течение 3-5 секунд со скоростью, достаточной для отрыва неспецифически связавшихся клеток (500 мкл/мин для эритроцитов и 1000 мл/мин для лимфоцитов), но не вызывающей отрыв тех клеток, которые специфически связались с антителами Количество необходимых циклов инкубации/отмывки зависело от процентного содержания в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие антигены Все манипуляции проводились под контролем микроскопии

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3 1 Выбор материала подложки, способа нанесения и иммобилизации антител

Первоначально возможность связывания клеток с антителами, иммобилизированными на твердых поверхностях, была определена в экспериментах с планшетами для ИФА. В дальнейшем были проведены эксперименты, в которых использовались подложки из различных материалов (в том числе с модифицированной поверхностью), позволяющие осуществлять как нековалентную (адсорбция), так и ковалентную иммобилизацию антител, (см. "Материалы и методы").

Была исследована зависимость плотности связывания клеток на поверхности с иммобилизированными антителами от концентрации клеток в суспензии. В качестве титра рассматривалось максимальное разведение антител, при котором плотность связывания клеток не уменьшалось по сравнению с плотностью связывания клеток в лунках с меньшими разведениями. Основными критериями выбора материала подложки являлись: титр антител (характеризующий при прочих равных условиях прочность связывания антител с подложкой), прозрачность и оптическая однородность подложек и их стоимость. Обязательным условием являлось отсутствие лизиса клеток при их контакте с подложкой. Во всех экспериментах были использованы одни и те же антитела и клетки одних и тех же доноров. Приемлемые результаты были получены при использовании нескольких типов подложек, Клетки связывались в области пятен с иммобилизованными антителами, и при этом не разрушались (рис. 2).

Рис 2. Лимфоциты, связавшиеся на участке биочипа с иммобилизированными антителами анти-С045. Микрофотографии сделаны при увеличении микроскопа а) в 37,5 раз, б) в 300 раз. Биочип изготовлен на подложке из ПВХ.

Наибольшие значения титров были получены при использовании подложек с покрытием А1/АПТЭС/окисленный декстран и подложек из пластифицированного ПВХ. Изготовление подложек с покрытием А1/АПТЭС/окисленный декстран оказалось дорогостоящим и трудоемким, а воспроизводимость результатов при их использовании была неудовлетворительной. Поэтому во всех последующих экспериментах использовались биочипы, изготовленные на подложках из ПВХ. Примеры результатов, полученных при их использовании, приводятся на рис. 3.

^ 14000 3

■| 12000

р 10000 S

-i.....i—Í—

- CD3 CD4 -A— CD8 -т— CD16 -»— CD19 ■■*— CD45

íV-i--. \ *

\ \

rf- 22000 5 20000

J, 18000

0 1BQOO | 14000 « 12000

1 ЮООО

3 8000

ш 6000

g 4000

О 2000

! !

IV(AB)Rh+

-■—А с- ■ В (D)Rh

3 1/80 1/160 Ш20 1Л401/12801'2560!/51ЯЛаКСГ2М80 -

Разведение антител

1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/1281/256

Разведение антител

б.

Рис. 3. а) Зависимость плотности связывания лимфоцитов в области пятен биочипа от разведения антител (1%0) анти-СПЗ, анти-С04, анти-Сй8, анти-СВ16, анти-СВ19, анти-СИ45. б) Зависимость плотности связывания в области пятен биочипа эритроцитов группы 1У(АВ)Я11+ от разведения антител (1%М) анти-А, анти-В и анти-Юг(О). Биочипы изготовлены на подложках из ПВХ. На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).

3.2 Определение процентного содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены.

Плотность связывания клеток могла быть выражена как в [кл/мм2] (рис. 3-а), так и в процентах (рис. 4). Для этого за 100% принималась плотность связывания клеток с антителами анти- СБ45 (в области пятна с наибольшей концентрацией антител), исходя из чего, в процентах выражалась плотность связывания клеток в области других пятен

I s° i 40

■ CD3 о CD4

->*- CD8 - » CD16 CD19 CD45

S

■ г\\ -

I 1ЛО 1/1.0 1/3» IWDI/lilOlftSM/SlM'IDMOIM« -

Разведение антител

Рис. 4. Зависимость плотности связывания лимфоцитов в области пятен биочипа от разведения антител (1^) анти-СОЗ, анти-СВ4, анти-С08, анти-С016, анти-СР19, анти-С045. Плотность связывания лимфоцитов (заполнение поверхности пятна) выражена в процентах относительно плотности связывания клеток в области пятна с антителами анти-Сй4Ь. На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).

Результаты сравнивались с данными, полученными при анализе образца крови того же донора с помощью проточной цитофлюориметрии. (таблица 1).

Таблица 1. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CD8, CD 16, CD19, CD45, определенное при анализе, проведенном с помощью проточкой цитофлюориметрии и биочипов

метод Поверхностные антигены

CD3 CD4 CD8 CD16 CD19 CD45

Проточная цитофлюориметрия 68% 48,9% 17% 17% 19% 100%

Анализ на биочипах 67±2% 47±3% 20±3% 16±2% 17±3% 100%

Таким образом, выраженная в процентах, плотность заполнения пятен биочипа лимфоцитами, экспрессирующими различные СБ антигены, хорошо соответствовала их фактическому процентному содержанию в суспензии Этот факт может быть объяснен тем, что при инкубации биочипа с суспензией, содержащей различные типы клеток, в контакт с его поверхностью приходят как клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, и способные связываться с антителами, так и клетки, не имеющие этих антигенов Они экранируют антитела от других (осевших позже) клеток и делают невозможным их связывание При последующей отмывке биочипа на его поверхности остаются только связавшиеся с антителами клетки

Поэтому, отношение полученной плотности заполнения пятна связавшимися клетками к максимально возможной (при данных условиях) плотности заполнения, соответствует фактическому процентному содержанию в суспензии клеток, имеющих соответствующий поверхностный антиген Данное соответствие справедливо, если присутствующие в суспензии клетки имеют примерно одинаковые размеры, а инкубация суспензии с биочипом осуществляется без перемешивания Указанное соответствие наблюдалось в диапазоне от минимального разведения антител до титра, что позволяет при изготовлении биочипов использовать более разбавленные растворы антител (по сравнению с исходной концентрацией коммерчески доступных образцов данных антител) 3.3 Определение влияния концентрации клеток в суспензии на плотность заполнения пятен биочипа и на соотношение субпопуляций связавшихся клеток.

Представленные на рис 5-а результаты демонстрируют линейную зависимость плотности связывания клеток в области пятен биочипа от концентрации клеток в суспензии в диапазоне от 0 кл/мд до определенного значения (в данном случае 5,5 106 кл/мл), после которого наступает насыщение Дальнейшее увеличение концентрации клеток уже не оказывает влияния на плотность связывания Это обусловлено тем, что клетки, осевшие на поверхность биочипа, образуют монослой и экранируют антитела от тех клеток, которые оседают поверх него

СС2 е- С019 СС-55

СОЗ -С019 -С045

Концентрация клеток (кл/млхЮ)

Концентрация клеток (кл/мл х10 )

Рис. 5. Влияние концентрации клеток в суспензии а) на плотность заполнения связавшимися клетками (кл/мм2) пятен биочипа с антителами, специфичными к различным поверхностным антигенам; б) на относительную плотность заполнения связавшимися клетками пятен с антителами, специфичными к различным поверхностным антигенам. Относительная плотность заполнения пятен выражена в процентах. За 100% принимаюсь плотность связывания клеток в области пятен с антителалш анти- СВ45. Во время инкубации биочипы были закреплены на дне чашек Петри (площадь поверхности дна 961,6 мы'), объем образцов клеточной суспензии составлял 2,2 мл. На представленных кривых обозначены ошибки среднего (порезультатам 3 измерений).

Несмотря на различия абсолютных значений плотности связывания клеток в области пятен (кл./мм2) (рис. 5-а), выраженная в процентах относительная плотность связывания клеток с антителами, специфичными к разным поверхностным антигенам, (рис. 5-6) не зависела от концентрации клеток в исследуемой суспензии.

Таким образом, процентное содержание в суспензии клеток, экспрессирующих те или иные поверхностные антигены, может быть определено при различных концентрациях клеток в исследуемом образце.

Следует заметить, что при исследовании образцов суспензии с концентрациями менее 2x106 кл/мл из-за низкой плотности связывания подсчет количества клеток желательно проводить на участках большей площади

3.4 Окраска и морфологическое исследование связавшихся с биочипом клеток. Связавшиеся на биочипе клетки могли быть зафиксированы и окрашены, например, по Романовскому-Гимзе. Это позволяло проводить их морфологическое исследование (рис. 6). Несмотря на то, что структура хроматина клеток выглядит несколько иначе (из-за меньшего распластывания клеток), чем при окраске в мазках или отпечатках, данный подход позволяет надежно определить, какие именно типы клеток связались в области того или иного пятна биочипа. Это особенно существенно в том случае, если один и тот же антиген присутствует на разных типах клеток (рис. 6-в).

Рис. 6 Микрофотографии, демонстрирующие возможность морфологического исследования меток, связавшихся на биочипе Окраска по Романовскому-Гимзе а) эритроциты здорового донора, связавшихся в области пятна с антителами анти-О (увеличение в 600 раз), б) лимфоциты здорового донора, связавшихся в обчасти пятна биочипа с антителами анти-СйЗ (увеличение в 1350раз), в) лимфоциты здорового донора, связавшихся в области пятна биочипа с антителами анти-С045 (увеличение в 1350раз), г) лимфоциты бочьного В-ХЛЛ, связавшиеся в области пятна с антителами анти-С019 (увечичсние в 1350раз)

Следует заметить, что морфологическое исследование связавшихся на биочипе клеток, не заменяет, а дополняет морфологическое исследование клеток в мазках или отпечатках На биочипе могут связаться только клетки, имеющие определяемые антигены Если в исследуемом образце будут присутствовать клетки, не имеющие этих антигенов, они будут удалены при отмывке биочипа

3 5 Окраска связавшихся клеток флюоресцентно мечеными антителами.

Связавшиеся на биочипе клетки могли быть окрашены флюоресцентно мечеными антителами При исследовании с помощью флюоресцентной микроскопии неспецифического связывания лимфоцитов не выявлялось (рис 7-в) Мечеными антителами окрашивались только клетки, связавшиеся в области строго определенных пятен биочипа (таблица 2, рис 7-а) Как видно из представленных в таблице 2 результатов, определяется нормальная коэкспрессия антигенов С03/С04, СВЗ/СБв, СБЗ/С045, С020/19, С020/С045, С016/С045, СШ6/С056

Таблица 2. Результат окрашивания Р1ТС-мечеными антителами клеток, связавшихся в области различных пятен биочипа

БИС- меченые антитела, использованные для окраски связавшихся клеток антитела, иммобилизованные на биочипе

анти-СБ4 анти-СБ8 анти-СШ9 анти-СБ45 анти-СБ56

анти-СОЗ НТС + + +

анти-СП16Р1ТС + +

анти-СБ2(ШТС + +

Знаком (+) отмечено наличие окрашивания

Рис. 7. Результат окрашивания связавшихся с биочипом лимфоцитов FITC-мечеными антителами анти-СВ20. Увеличение в 150 раз. а) Окрашивание клеток связавшихся в области пятна с антителами anmu-CD19 (коэкспрессия CD19/CD20); микрофотография выполнена при УФ освещении, б) тот же фрагмент пятна с антителами anmu-CD19 (микрофотографии в проходящем белом свете), в) Отсутствие окраски клеток, связавшихся в области пятен с антителами анти-СВ4 (микрофотография выполнена при УФ освещении), г) тот же фрагмент пятна с антителами anmu-CD4 (микрофотография в проходящем белом свете).

Само по себе связывание клеток на биочипе не позволяет определять наличие коэкспрессии нескольких антигенов у каждой отдельно взятой клетки. Окраска связавшихся на биочипе клеток флюоресцентно мечеными антителами позволяет устранить этот недостаток. Она может быть использована для выявления диагностически значимых вариантов коэкспрессии антигенов при исследовании опухолевых клеток. Кроме того, этот подход делает возможным дополнительное определение ядерных и цитоплазматических антигенов у связавшихся на биочипе клеток. Представляется перспективной окраска препарата несколькими антителами мечеными различными флюорохромами.

3.6 Оценка чувствительности анализа, проводимого с помощью биочипов.

В экспериментах с суспензиями эритроцитов с известным иммунофенотипом, на биочипах с антителами (IgM) анти-А, анти-В, анти-D, анти-С, анти-с, анти-Е, анти-е после отмывки ополаскиванием связавшиеся эритроциты оставались только в области пятен с антителами анти-А, анти-В и анти-D, а в области пятен с антителами анти-С, анти-с, анти-Е, анти-е практически отсутствовали. Следовательно, связывание эритроцитов с данными антителами было менее прочным. Скорости потоков жидкости, возникающие при отмывке биочипов, были слишком высокими, что приводило к отрыву клеток. Таким образом, при отмывке биочипа путем ополаскивания, чувствительность метода в ряде случаев оказывается недостаточной для обнаружения некоторых антигенов при использовании имеющихся антител.

Чувствительность анализа могла быть повышена при проведении отмывки биочипа в проточной камере. При этом могли быть созданы такие скорости потока, при которых происходил отрыв только не связавшихся с антителами клеток. Эритроциты,

экспрессирующие антигены С,с,Е,е оставались связанными в области пятен с

соответствующими антителами (рис.8)

■ншввшяшшн

Шг т.

' : - -ОЖ-

«б.

Рис. 8. Эритроциты с имму но фенотипом ссВЕе, связавшиеся в области пятна с антителами анти-с. Отмывка биочипа осуществлялась в проточной камере, а.) увеличение в 37,5раз б.) увеличение в 600раз.

3.7 Исследование процесса отрыва клеток при отмывке биочипа в проточной камере.

Отрыв неспецифически связавшихся эритроцитов (за пределами пятен) происходил при скорости потока 400-550 мкл/мин (сдвиговая скорость потока 4.5-6 с"1), что соответствует действующему на эритроцит напряжению сдвига 18-24 мПа. Эритроциты, не имеющие тех или иных поверхностных антигенов, но неспецифически связавшиеся на поверхности пятен с антителами, специфичными к данным антигенам, отрывались при таких же скоростях что и эритроциты, связавшиеся вне пятен биочипа (фон) (рис. 9). Таким образом, перекрестная реактивность антител не выявлялась.

24000

I 22000 1 20000 * 18000 & 16000 5 14000 | 12000 3 юооо 1 8000 д вооо

£ 4000

-■-Фон • - анти-А ^ -а— анти-В

V.

Сдвиговая скорости потока (с'1)

Рис. 9 Зависимость от сдвиговой скорости потока отмывающей жидкости плотности связывания эритроцитов группы 0(1)ЯИ+ неспецифически связавшихся с подложкой биочипа в области пятен с антителами анти-А и анти-В, а также вне этих пятен (фон). На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).

Отрыв эритроцитов, специфически связавшихся с иммобилизированными антителами анти-С, анти-с, анти-Е, анти-е, происходил при скоростях, больших, по крайней мере, на 1 - 2 порядка (рис. 10) по сравнению с неспецифически связавшимися клетками. Было отмечено влияние разведения антител на динамику отрыва. Чем большим

было разведение антител, тем меньшие скорости требовались для отрыва клеток из области пятен.

.....№

g 160-i-U. i

ttfUi

100 200 300 400 500 600

Сдвиговая скорость потока (с*1)

"S 20000■

5

g 18000-

g" 16000.

| 14000-

ЖПНш

Разведение

антител

внти-С

100 200 300 400 500 600 Сдвиговая скорость потока (с')

Рис. 10 Зависимость от сдвиговой скорости потока отмывающей жидкости а) количества эритроцитов с иммунофенотипом ссйЕе, остающихся связанными в области пятен биочипа с антителами анти-е; б) количества эритроцитов с иммунофенотипом ССЭее, остающихся связанными в области пятен с антителами анти-С

-•■■1/16 * 1/32 ► фон

100 200 300 400 500 600 Сдвиговая скорость потока (с'1)

1 18000

2 16000

| 14000

п <2000

I юооо

ÍÜ В ООО

S 6000

ъ 4000

Е жо

I о

i« 41 ti* f »•!

100 200 300 400 500 600 Сдвиговая скорость потока (с1)

Рис. 11 Зависимость от сдвиговой скорости потока отмывающей жидкости а) количества эритроцитов группы 1(0)ЯИ+ с иммунофенотипом ССОее, остающихся связанными в области пятен биочипа с антителами анти-й; б) количества эритроцитов группы А(П), остающихся связанными в области пятен биочипа с антителами анти- А, На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).

Для отрыва эритроцитов из области пятен с антителами анти-0 (рис 11-а) требовались значительно большие скорости потока, чем для отрыва эритроцитов из области пятен с антителами анти-С, анти-с, анти-Е, анти-е. Количество молекул антигена Б на поверхности эритроцитов с иммунофенотипом ССОее не превышает количества антигенов С. По этому можно сделать предположение о более высокой аффинности антител анти-0 по сравнению с антителами анти-С.

Из области пятен с антителами анти-А (рис. 11-6) и анти-В в данном диапазоне скоростей потока отрыва эритроцитов соответственно А(П) и В(Ш) групп не происходило. Это может быть обусловлено большей экспрессией молекул данных антигенов (810-1170 тыс. молекул на 1 эритроците), и (или) большей аффинностью антител.

3.8 Концентрирование клеток в области пятен биочипа.

С помощью проточной камеры может осуществляться концентрирование клеток в области пятен биочипа (рис. 12). Для этого используется циклический режим инкубации биочипа с клеточной суспензией. Каждый цикл включает инкубацию без потока (5-10 минут) и подачу потока жидкости (3-5 секунд) со скоростью, достаточной для отрыва неспецифически связавшихся клеток. Количество циклов инкубации/отмывки, необходимых для достижения максимально возможной плотности связывания клеток в области пятна с антителами зависит от содержания в суспензии клеток, экспрессируюших соответствующий антиген. Таким образом, биочипы могут использоваться для сортировки клеток.

тшщжт•: Щц

Рис. 12. Лимфоциты, связавшиеся в области пятна с антителами анти- СО 19 при инкубации биочипа в проточной камере в циклическом режиме. Увеличение в 300 раз. а) после проведения 1 цикла инкубации/отмывки (заполнение клетками поверхности пятна составляет 15%). б) после проведения 17 циклов инкубации/отмывки (заполнение клетками поверхности пятна составляет 94%). Фактическое содержание СИ19+ лимфоцитов в суспензии 16%.

3.9 Примеры использования биочинов для исследования клеток здоровых доноров и больных хроническим В-лимфолейкозом.

С помощью биочипов были исследованы клетки здоровых добровольцев и ряда больных, страдающих хроническим В-лимфолейкозом (В-ХЛЛ). Полученные результаты (рис. 13 и 14) сравнивались с данными клинических исследований, проведенных с помощью проточной цитофлюориметрии. При этом отмечалось их хорошее соответствие (в пределах ошибки среднего).

у о о о о р

о Я я о о

| ПОмочил В проточная цигофпоориметрия I

йййоВоооЗоою ооооиооооио*

Антиген 8

Ь о 2 5 3

О О О О 3

Рис. 13. Сопоставление результатов исследования клеток здорового донора с помощью биочипов, с результатами, полученными с помощью проточной цитофлюориметрии.

I □ Биочип а Проточная цитофпоориметрия

: _ 100

8

О О О О Антиген

О О О О О

о о

б.

□ Биочип □ Проточная Цитофлюориметрия

Рис. 14. Сопоставление результатов исследования клеток больных В-ХЛЛ, проведенного с помощью биочипов, с результатами клинического исследования, проведенного методом проточной цитофлюориметрии. а) больной А., б) больная К.

При клинических исследованиях, проведенных с помощью проточной цитофлюориметрии, определялось значительно меньшее число поверхностных антигенов по сравнению с анализом, проводимым на биочипе. Поэтому могла быть сопоставлена только часть полученных данных.

С помощью биочипов возможно одновременное определение (на разных клетках) значительно большего количества поверхностных антигенов по сравнению с методом проточной цитофлюориметрии. Количество антител, которые могут быть иммобшшзированы на подложке биочипа, лимитируется только размерами подложки и диаметром пятен.

3.10 Биочипы для определения антигенов I класса системы НЬА.

Были проведены эксперименты с биочипами, для изготовления которых использовались неочищенные человеческие сыворотки, применяемые для лимфоцитотоксического теста. Использовались лимфоциты двух добровольцев с известным НЬА иммунофенотипом (ранее установленным в лимфоцитотоксическом тесте): А2, А32, В44, В51 и А2, А11.В44, В62. При отмывке биочипов ополаскиванием происходил отрыв всех клеток со всей поверхности биочипа. Следовательно, чувствительность анализа при отмывке биочипов ополаскиванием оказалась недостаточной из-за очень низкой прочности связывания клеток в области пятен. При отмывке биочипов в проточной камере (скорость потока 2000 мкл/мин) клетки, несущие определяемые антигены оставались связанными в области пятен после полного

устранения клеток, не связавшихся с антителами Иммунофенотип, определенный при анализе на биочипах (рис 15), соответствовал данным лимфоцитотоксического теста

А2 - А10 АН А32 В62 А2 А10 А11 А32 В62

В40 В41 В44 В51 а В40 В41 В44 В51

Рис. 15. Резуптаты определения антигенов Н1Л I класса с помощью биочипов у 2 добровольцев (а и б) На представленных схемах биочипов цветом выделены ячейки, соответствующие тем пятнам, где произошло связывание клеток

Таким образом, была показана принципиальная возможность использования биочипов для определения антигенов системы НЬА Кроме того, дополнительно было продемонстрировано, что применение проточной камеры позволяет осуществлять анализ на биочипах даже при использовании неочищенных сывороток, обеспечивающих очень низкую прочность связывания клеток

ВЫВОДЫ.

1 Отработана методика изготовления биочипов на выбранных прозрачных и оптически однородных пластиковых подложках, обеспечивающих иммобилизацию антител за счет адсорбции Созданы экспериментальные биочипы, позволяющие определять до 32 различных поверхностных антигенов лимфоцитов, а также биочипы для определения поверхностных антигенов эритроцитов (А, В, Б, с, С, е, Е)

2 Продемонстрировано специфическое связывание на биочипах эритроцитов, а также лимфоцитов здоровых доноров и больных В-ХЛЛ При этом может быть определено процентное содержание в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие поверхностные антигены

3 Показана возможность проведения морфологического исследования связавшихся на биочипе клеток

4 Чувствительность анализа, проводимого с помощью биочипов, может быть значительно повышена за счет использования отмывки в проточной камере

5 Разработан способ концентрирования в области пятен биочипа клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены, основанный на использовании предложенного циклического режима инкубации/отмывки биочипа в проточной камере при его взаимодействии с клеточной суспензией

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах. 1 А.В Шишкин Разработка микрочипов для иммунофенотипирования клеток опухолей системы крови Материалы II Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» Ижевск 25-28 апреля 2005 -С 92-95

2 А.В Шишкин Разработка иммунологических биочипов для определения поверхностных антигенов клеток Материалы IV Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» Ижевск 23-27 апреля 2007 - часть I - С 83-87

3 А В. Шишкин, И И Шмырев Новые подходы к использованию иммунологических «клеточных» биочипов Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» Пущино 29 октября-2 ноября 2007 - С 223

4 А.В. Шишкин, И И Шмырев Разработка иммунологических биочипов для исследования поверхностных антигенов клеток крови Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» Пущино 29 очтября-2 ноября 2007 - С 223-224

5 А В. Шишкин, Н Г Овчинина Разработка иммунологических биочипов для исследования нормальных и опухолевых клеток крови Материалы школы-конференции молодых ученых аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия-2007» Пущино 2007 - С 8-13

6 А.В. Шишкин, Н Г Овчинина Способ повышения чувствительности анализа, проводимого с помощью иммунологических биочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов клеток Материалы V Межрегиональной межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Современные аспекты медицины и биологии» Ижевск, 21-24 апреля 2008 - часть I -С 77-79

7 А В Шишкин. Создание клеточного сортировщика на основе иммунологических биочипов Материалы V Межрегиональной межвузовской научно- практической конференции молодых ученых и студентов «Современные аспекты медицины и биологии» Ижевск, 21-24 апреля 2008 -часть I-C 79-81

8 А.В. Шишкин Иммунологические биочипы для определения поверхностных антигенов нормальных и опухолевых клеток крови Материалы V Межрегиональной межвузовской научно- практической конференции молодых ученых и студентов «Современные аспекты медицины и биологии» Ижевск, 21-24 апретя 2008 - часть I -С 75-77

9 N Ovchinina, A Shishkin, Yu Lcdnev Methods for increasing the biochip immunological sensitivity//I Tissue Antigens - 2008 -Vol 71 - p 395

Подписано в печать 15 05 2008 г

Формат 60/84 1x16 Бумага офсетная Печать офсетная Уел п л 1 5 Тираж 100 экз Заказ № П-243

Типография «Телер» 127299, Москва, ул Космонавта Волкова, 12 Тел (495) 937-8664,156-4084

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Шишкин, Александр Валентинович

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Методы изготовления биочипов

1. Синтез вещества на биочипе

2. Методы нанесения белков на поверхность биочипа

2.1. Последовательные методы

2.1.1. Нанесение капель автоматической пипеткой

2.1.2. Микроконтактное нанесение 1 б

2.1.3. Микроструйное нанесение

2.1.4. Ближнее электронапыление

2.2. Параллельные методы

2.2.1. Микроконтактная печать

2.2.2. Метод микропроточных сетей

2.2.3. Фотоактивируемая иммобилизация белка

2.2.4. Дальнее электронапыление 20 3 Заключение

II. Методы иммобилизации белка на биочипах

1. Адсорбция

2. Химическое связывание

2.2. Связывание молекул белка с твердой поверхностью с 26 помощью молекул, имеющих альдегидные группы

2.3 Аминирование поверхности твердого субстрата

2.4 «Пришивка» молекул белка через Шиффовы основания 29 и их восстановление

3. Методы, при которых осуществляется ковалентное связывание 30 белка с предварительно адсорбированным на поверхности подложки веществом

3.1 Активация поверхности пластика глутаровым диальдегидом

4. Методы, при которых осуществляется прочное нековалентное 31 связывание молекул белка с предварительно иммобилизованным на поверхности подложки веществом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новых методов исследования лимфоцитов и эритроцитов с помощью иммунологических биочипов"

В современных биологических и медицинских исследованиях все большее распространение получает скрининговый подход, требующий параллельного проведения большого числа анализов. Все большее применение в последние годы находят биочипы (микрочипы, микроматрицы)- небольшие аналитические устройства, имеющие в себе компоненты биологического происхождения и предназначенные для проведения одновременного параллельного анализа многих межмолекулярных взаимодействий.Биочип представляет собой твердый субстрат, на поверхность которого нанесен упорядоченный рисунок (чаще всего решетка) микропятен одного или нескольких биологических веществ [28]. Именно это определение биочипа (микроматрицы, микрочипа) и будет в дальнейшем использоваться в данной работе.Применение биочипов открывает большие перспективы. При массовом производстве себестоимость 1 биочипа очень мала, а при его использовании расходуется минимальное количество реактивов.В основу создания биочипов положены следующие принципы: 1)миниатюризация;2) параллельность и одновременность проведения многих тестов; 3) объединение множества аналогичных тест-систем на одном носителе. [22,60] Огромный вклад в развитие микрочипов внесли академик А.Д. Мирзабеков [5,6,22,27,33,58] и профессор из Лондонского университета R. Ekins [60,62], показавшие, что размеры аналитической системы в иммунологии могут быть уменьшены без потери чувствительности.Несколькими годами ранее к подобным выводам пришел Tse-Wen Chang [56].На подложке биочипа могут быть иммобилизированы молекулы различных веществ биологического происхождения. Чаще всего это молекулы белков или нуклеиновых кислот.Работа над глобальным проектом «Геном человека» дала мощный стимул развитию олигонуклеотидных биочипов, на их создание выделялось огромное финансирование. В настоящее время олигонуклеотидные биочипы производятся промышленно и включают свыше 400000 различных нуклеотидов [18]. Они успешно применяются для биологических и медицинских исследований [111].Создание ДНК-биочипов было более простой задачей по сравнению с созданием белковых биочипов. Это связано с тем, что молекулы ДНК менее разнообразны в химическом и биофизическом плане, более стабильны и менее подвержены повреждениям.Для создания белкового биочипа необходимо было преодолеть большое количество технологических и биохимических проблем. В частности, в отличие от нуклеотидов, химические свойства различных белков сильнее отличаются между собой, и химически связать с подложкой одинаковые количества разных белков достаточно сложно. Растворы различных белков обладают различной вязкостью и поверхностным натяжением, что создает проблемы при переносе равных количеств различных белков на подложку контактными методами. При контакте с подложкой нативная'структура белков может изменяться. Молекулы белков имеют различный электрический заряд, в связи с этим между ними и подложкой (также имеющей определенный электрический заряд) действуют силы электростатического притяжения или отталкивания [1,14,16].Тем не менее, в течение последних нескольких лет многие сложности были преодолены, и ряд зарубежных биотехнологических компаний освоил выпуск иммунологических биочипов, предназначенных для различных целей (выявление аллергенов, гаптенов, антигенов возбудителей инфекционных заболеваний, опухолевых антигенов, для выявления антител, для мониторинга наличия белковых токсинов в окружающей среде и др.) [28].Весьма перспективным представляется создание иммунологических биочипов, предназначенных для исследования поверхностных антигенов клеток. Но их создание является еще более сложной задачей по сравнению с созданием обычных белковых биочипов, предназначенных для выявления свободных молекул.Помимо сложностей, общих для всех белковых биочипов, здесь возникают дополнительные ограничения.1) Должны использоваться высокоаффинные антитела, прочно связывающиеся с клетками.2) Молекулы антител должны быть прочно прикреплены к подложке, чтобы не происходило их отрыва после связывания с клетками при отмывке биочипа.3) Сайты неспецифического связывания должны быть блокированы веществом, не способным связываться с молекулами адгезии клеток.4) При контакте с подложкой не должно происходить разрушения клеток.В 1983 г. Chang создал, пожалуй, первый в мире биочип для иммунофенотипирования клеток [56]. С помощью микропипетки он наносил капли растворов антител на покровные стекла в условиях низкой температуры и 100% влажности. Иммобилизация белка на подложке обеспечивалась за счет адсорбции. Созданные им биочипы позволяли определять некоторые поверхностные антигены лимфоцитов. Но эти работы вскоре были надолго забыты, так как нанесение капель вручную было чрезвычайно трудоемким и достаточно длительным.Вместе с тем в современных условиях такие биочипы могут оказаться чрезвычайно полезными для иммунофенотипирования клеток и найти свое применение в области гематологии и онкологии.В гематологии диагноз ставится по совокупности результатов нескольких исследований опухолевых клеток [34]: 1) определения иммунофенотипа; 2) морфологических исследований; 3) цитохимических исследований; 4) кариологических исследований; 5) генетических исследований.Определение иммунофенотипа клеток и морфологическое исследование являются ведущими лабораторными диагностическими методами.Иммунофенотипирование клеток осуществляется с помощью проточной цитофлюориметрии или ряда иммуноцитохимических (иммунофлюоресцентных) методов.Проведение исследований с помощью данных методов является трудоемким, требует высокой квалификации персонала, дорогостоящего оборудования и относительно высокого расхода антител и может быть доступно только в небольшом числе ведущих гематологических учреждений.Создание и последующее внедрение иммунологических биочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов клеток в значительной мере могло бы способствовать решению этих проблем.Автору не известно о проведении работ в данном направлении, в нашей стране. На момент написания данной работы в зарубежной литературе было опубликовано лишь несколько статей, посвященных этой теме [46-49,54,63,73,77,83,101,106,119].Созданные иностранными авторами биочипы еще не вышли за пределы их лабораторий.Кроме того, в опубликованных работах не уделяется внимания морфологическим и иным исследованиям клеток, связавшихся с биочипом.Такой подход не позволяет получить информацию о том, какие именно клетки оказалась связанными с теми или иными антителами на поверхности биочипа. Информация об иммунофенотипе дается в отрыве от информации о других характеристиках связавшихся клеток, что снижает ее диагностическую ценность. Еще не исследованы очень многие вопросы, связанные с закономерностями связывания клеток с биочипом и их отрыва.Целью работы является создание иммунологических биочипов, позволяющих осуществлять определение поверхностных антигенов, а также проводить морфологическое исследование связавшихся клеток.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шишкин, Александр Валентинович

ВЫВОДЫ.

1. Отработана методика изготовления биочипов на выбранных прозрачных и оптически однородных пластиковых подложках, обеспечивающих иммобилизацию антител за счет адсорбции. Созданы экспериментальные биочипы, позволяющие определять до 32 различных поверхностных антигенов лимфоцитов, а также биочипы для определения поверхностных антигенов эритроцитов (А, В, D, с, С, е, Е)

2. Продемонстрировано специфическое связывание на биочипах эритроцитов, а также лимфоцитов здоровых доноров и больных B-XJIJI. При этом может быть определено процентное содержание в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие поверхностные антигены.

3. Показана возможность проведения морфологического исследования связавшихся на биочипе клеток.

4. Чувствительность анализа, проводимого с помощью биочипов, может быть значительно повышена за счет использования отмывки в проточной камере.

5. Разработан способ концентрирования в области пятен биочипа клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены, основанный на использовании предложенного циклического режима инкубации/отмывки биочипа в проточной камере при его взаимодействии с клеточной суспензией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенные исследования показывают перспективность использования предложенных новых подходов в области создания клеточных биочипов. Данная диссертационная работа - лишь начало исследований и разработок в этой области, оказавшейся весьма обширной. Дальнейшие работы могут проводиться еще по целому ряду направлений: 1) создание биочипов на более совершенных подложках; 2) увеличение панели антител; 3) поиск новых подходов, позволяющих сократить время проведения отдельных стадий анализа с помощью биочипов; 4) расширение набора методов дополнительных исследований связавшихся с биочипом клеток; 5) автоматизация различных этапов проведения анализа и процесса считывания результата; 6) совершенствование конструкции проточной камеры; 7) проведение исследований с использованием клеткок различных опухолей системы крови.

Кроме того, необходимо проведение фундаментальных исследований для выявления новых закономерностей и дальнейшего изучения уже найденных.

Недостаточное финансирование и отсутствие некоторых необходимых реактивов и оборудования заставили проделать большую работу по упрощению процессов изготовления биочипов и всех этапов проведения анализа. В результате биочипы могут быть изготовлены при самых минимальных затратах, а исследования с их помощью могут проводиться с использованием минимального набора оборудования, имеющегося в клинической лаборатории любого лечебно-профилактического учреждения. Это особенно валено, поскольку потребность в иммунологическом исследовании клеток огромна, а существующее оборудование (проточные цитофлюориметры, люминисцентные микроскопы и др.) очень дорого и доступно для очень ограниченного числа клинических лабораторий. Внедрение биочипов позволило бы существенно улучшить имеющуюся ситуацию.

Следует заметить, что для внедрения биочипов в клиническую практику необходима автоматизация считывания результата. Одним из возможных путей решения данной задачи может быть создание простой по конструкции и недорогой установки для определения интенсивности флюоресценции пятен биочипа со связавшимися клетками (окрашенными флюоресцентным красителем), аналогичной по конструкции флюоресцентному ридеру, созданному в лаборатории физической биохимии системы крови ГУ ГНЦ РАМН [1].

На поверхности клеток экспрессируется огромное количество молекул, обладающих антигенными свойствами. Все они могут быть определены с помощью иммунологических биочипов при наличии соответствующих антител. Наиболее востребованным должно оказаться создание биочипов для определения антигенов системы HLA, канцер-специфических антигенов, молекул адгезии, антигенов стволовых клеток.

Необходимо подчеркнуть, что использование в будущем подобных биочипов для целей диагностики не означает отказа от использования проточной цитофлюориметрии, поскольку она позволяет определять значительно большее количество признаков у каждой клетки в отдельности. Оба этих метода имеют свои преимущества и недостатки и способны дополнять друг друга. Биочипы должны быть использованы главным образом для скриниговых исследований, что весьма затруднительно при использовании других методов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шишкин, Александр Валентинович, Москва

1. Авсеенко Н.В. Разработка метода иммобилизации белков в микрочипах для имму но ферментного анализа: Дис. . канд. биол. наук. Москва. 2002. -158 с.

2. Антитела. Методы/ Под ред. Д. Кэтти.- М.: Мир, 1991-3 84с.

3. Асцатуров И. А. Иммунофенотипирование в диагностике хронических лимфопролиферативных заболеваний: Дис. . канд. мед. наук. Москва. 1997г.- 98 с.

4. Атлас клеток крови и костного мозга/Под ред. Козинца Г.И.- М.: Триада-Х, 1998. -150с.

5. Василисков В.А., Тимофеев Э.Н., Суржиков С.А., Дробышев А.Л., Шик В.В., Мирзабеков А.Д. Метод получения микрочипов с помощью сополимеризации с акриламидом// Мол. Биол.-1998. Т.32, № 5.- С. 923-925

6. Воробьев А.И., Бриллиант М.Д. Лимфоцитома селезенки и классификация лимфоцитом// Тер. Архив- 1982. №8.- С.8-14.

7. Воробьев А.И., Бриллиант М.Д., Тихонова Л.Ю., Самойлова Р.С., Маргулис Е.Я., Кременецкая A.M. Зрелоклеточные лимфоцитарные опухоли.//Тер. Архив.- 1986. №9.-С. 4-8.

8. Воробьев А.И., Кременецкая A.M., Лорие Ю.Ю., Харазиашвилли Д.В., Шкловский-Корди Н.Е. «Старые» и «новые» опухолилимфатической системы// Тер. архив,- 2000. №7.- С.9-13.

9. Гайер Г. Электронная гистохимия.- М.:Мир, 1974- 132с,- С.10-14.

10. Гистология (введение в патологию)/ Под. ред. Улумбекова Э.Г., Челышева Ю.А. М.: ГЭОТАР, 1997. -960с.- С.29-32.

11. Глузман Д.Ф., Сидоренко С.П., Надгорная Н.А. Цитохимия и иммуноцитология злокачественных лимфопролиферативных заболеваний. Киев. Наукова думка, 1982.- 240с.-С.240-244.

12. Донсков С.И. Группы крови системы Rhesus. Теория и практика,- М.: Союзинформбиология, 2005.-392с. -С.62-67.

13. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. «Теория и практика иммуноферментного анализа», М.: Высшая школа, 1991.-142с.

14. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г. Путешествие в трансфузиологию- М.: Монолит, 2002. 112с.-С. 60-61.

15. Иммуноферментный анализ/ Под ред. Нго Т.Т., Ленхофф Г.- М.: Мир, 1988.- 444с.

16. Иммуноцитохимия и моноклональные антитела в онкогематологии/ Под ред. Пинчука В.Г. и Глузмана Д.Ф.- Киев, Наук, думка, 1990.-232с.

17. Киселев J1.J1. Геном человека и биология 21 века// Вестник РАН-2000. Т. 70, №5.- С.412-424.

18. Ковальчук J1.B. Антигенные маркеры клеток иммунной системы человека. CD (cluster differentiation) система.- М.: Издательство Российского государственного медицинского университета, 2003 .78с.

19. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А., Боев С.Ф., Сазонов В.В. Клетки крови и современные технологии их анализа- М.:Триада-фарм, 2002.- 538с.-С.77-137

20. Лимфоциты. Методы/ Под ред. Клауса Дж. М.: Мир, 1990.- 400.с.

21. Лысов Ю., Флорентьев В., Хорлин А., Храпко К., Шик В., Мирзабеков А. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод// Доклады Академии Наук СССР- 1988. Т. 303.- С. 1508-1511.

22. Малашенко О.С., Самойлова Р.С., Булычева Т.Н. Двойной иммуноцитохимический метод исследования линейности и пролиферативной активности при различных лимфопролиферативных заболеваниях// Гематология и трансфузиология.- 1994. №3.- С.3-7.

23. Малашенко О.С., Самойлова Р.С., Булычева Т.И. Иммуноцитохимический метод оценки пролиферативного статуса лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях// Клиническая и лабораторная диагностика.- 1995. №3.- С.51-54.

24. Медведев В. Биочипы, как пример индустриальной биологии// Компьютерра- 2001. №36.- С.25-32 http://offline.computerra.ru/2001/413/12805/

25. Микроскопическая техника, руководство для врачей и лаборантов/ Под ред. Саркисова Д.С. и Перова Ю.Л.- М.: Медицина, 1996.-542с.-С.125-127

26. Нанотехнология в ближайшем десятилетии, прогноз направлений исследований./ Под ред. Роко М.К., Уильямса Р.С., Аливисатоса П.-М.: Мир 2002.-292с.

27. Опухоли лимфатической системы/ под ред. Воробьева А.И. и Кременецкой A.M.- М.:Ньюдиамед, 2007. 294с.- С. 32.

28. Органическая химия (основной курс)/ Под ред. Тюкавкиной Н.А.-М.: Дрофа, 2003.-640с.

29. Погорелов В.М., Козинец Г.И. Иммуномагнитная сорбция злокачественных клеток.//Клин.-лаб.диагн.- 2000, №12.- С. 43-46.

30. Равич-Щербо М.И., Новиков В.В. Физическая и коллоидная химия.-М.: Высшая школа, 1975.- 255с.

31. Рубина А.Ю., Паньков С.В., Иванов С.М., Дементьева Е.И., Мирзабеков А.Д. Белковые микрочипы// Доклады Академии Наук-2001, Т.381, № 5- С.701-704

32. Руководство по гематологии/ под ред. Воробьева А.И. -М. :Ньюдиамед, 2002., Т1.-280с.

33. Самойлова Р.С., Даровский Б.М., Лукина Е.А., Полянская A.M.

34. Диагностика реактивных лимфаденопатий и стадии лейкемизации лимфосарком с использованием наиболее простых методов иммунологического фенотипирования//Тер. Архив.-1986.№9.- С.72-77.

35. Справочник по лабораторным методам исследования/ Под ред. Даниловой Л.А.- С.-Петербург. Питер, 2003.- 736с.

36. СтрайерЛ. Биохимия-М.: Мир, 1984.-Т1.-232с.

37. ТупицынН.Н. Иммунодиагностика гемобластозов/В кн. Клиническая онкогематология/ Под ред. Волковой М.А.-М. Медицина, 2001.-576с.- С. 124-143.

38. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. Микроэлектрофорез клеток крови в норме и патологии.- Минск. Беларусь, 1974. 143с.

39. Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Лабораторно- клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови- М.:Медицинское информационное агентство, 2004.-128с.

40. Ярилин А.А. Основы иммунологии.- М. Медицина, 1999.-720с.

41. Avent N.D., Liu W., Worner K.M., Mawby W J. Jones J. W., Ridgwell K., Tanner M .J.A. Immunochemical analysis of the human erythrocyte Rh polypeptides.//J. Biol. Chem.-1996.-Vol. 271. P.14233-14239.

42. Avseenko N.V., Morozova T.Ya., Ataullakhanov F.I., Morozov V.N. Immobilization of proteins in immunochemical microarrays fabricated by electrospray deposition//Anal. Chem.- 2001.-Vol. 73.-P 6047-6052.

43. Balcells M., Klee D., Fabry M. and Hocker H. Quantitative assessment of protein adsorption by combination of ELISA with radioisotope-based studies.//J. Colloid and Interface Sci.-1999.-Vol.220.- P.198-204.

44. Beier M. and Hoheisel, J.D. Versatile derivatization of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips// NAR-1999.-Vol. 27. -P.1970-1977.

45. Belov L, de la Vega O, dos Remedios C.G., Mulligan S.P., Christopherson R.I. Immunophenotyping of leukemias using a cluster of differentiation antibody microarray//Cancer research.- 2001.-Vol.61.-P.483-4489.

46. Belov L., Huang P., Barber N., Mulligan S.P., Christopherson R.I. Identification of repertoires of surface antigens on leukemias using an antibody microarray //Proteomics.-2003.-Vol.3.-P.2147-2154.

47. DNA Chip: New Technique Developed for Attaching Biological Cells to Non-Biological Surfaces// http://enews.lbl.gov (February 6, 2006)

48. Bernard A., Delamarche E., Schmid H., Michel В., Bosshard H.R., Biebuyck H. P. Printing patterns of proteins// Langmuir.- 1998.-Vol.14.-P.2225-2229.

49. Bernard A., Michel B. and Delamarche E. Micromosaic immunoassays// Anal. Chem.-2001. -Vol.73. P.8-12.

50. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. High-density oligonucleotide arrays// Biosensors & Bioelectronics.- 1996.-Vol.l 1.- P.687-690.

51. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow

52. Scand.J.Clin.Lab.Investig.-1968.-Vol.21-Suppl.97.-p. 1-9.

53. Campbell С .J., O'Looney N., ChongKwan M., Robb J.S., Ross A.J., Beattie J.S., Petrilc J. & Ghazal P. A cell interaction microarray for blood phenotyping// Anal.Chem.- 2006.-Vol.78.- P.1930-1938.

54. Carton J.P. Defining the Rh blood group antigens -Biochemistry and molecular genetics.// Blood Rev.-1994-Vol. 8.-P.199-212.

55. Chang T.W. Binding of cells of distinct antibodies coated on solid surface// J. Of immunological methods.- 1983.- Vol. 65.- P.217-223.

56. Chapman R.G., Ostuni E., Takayama Sh., Holmlin R.E., Yan L. and Whitesides G.M. Surveying for surfaces that resist the adsorption of proteins// J. Am. Chem. Soc.- 2000.- Vol.122.- P.8303-8304.

57. Elcins R.P. An overview of present and future ultrasensitive non-isotopic immunoassay development// Clin. Biochem. Revs. 1987.- Vol. 8.- P. 1222.

58. Elcins R.P., Berger H., Chu F.W., Finckh P., Krause F. Miniaturized immunoarrays: ultrasensitive multianalyte immunoassays on a chip//Nanobilogy.- 1998.- Vol.4.- p. 197-220.

59. Ekins R.P., Chu F.W. Multianalyte microspot immunoassay -microanalytical "Compact Disk" of the future// Clin. Chem.- 1991.-Vol.37.- P.1955-1967.

60. Ellmark P., Belov L., Huang P., С Soon Lee, Solomon M. J., Morgan D. K., Christopherson R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers// Proteomics.- 2006.-Vol.6.-P. 1791-1802.

61. Erber WN and Mason DY. Immunoalkaline phosphatase labelling of terminal transferase in hematological samples.//Am. J. Clin. Path. -1986.-Vol.88.-P.43-50.

62. Fodor S.P., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu A.T., Solas D. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis//Science.-1991 .-Vol.251 .-P.767-773.

63. Gerard-Marchant R., Hamlin I., Lennert K., Rilke F., Stansfeld A.G., van Unnik J.A.M. Classification of non-Hodgkin's lymphoma.// Lancet; 1974.- Vol. 2-P.406-408.

64. Guschin D., Yershov G., Zaslavsky A., Gemmel A., Shick V., Proudnikov D., Arenkov P., Mirzabekov A. Manual manufacturing of oligonucleotides, DNA, and protein microchips.//Anal Biochem-1997.-Vol.250.-P.203-211.

65. Haab B.B., Dunham M.J. and Brown P.O. Protein microarreys for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions// Genom Biology.-2001.-Vol.2.- research 0004.10004.13

66. Habeeb A.F.E.A. and Hiramoto R. Reaction of proteins with glutaraldehyde //Archives of Biochem. And Biophys.- 1968. Vol. 126.-P. 16-26.

67. Harris N.L., Jaffe E.S., Stain H., et al. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Group.//Blood.-1994.- Vol.84. №5.-P.1361-1392.

68. Hengsakul M., Cass A.E.G. Protein patterning with a photoactivatable derivative of biotin//Bioconjugate Chem.-1996.- Vol. 7.-P.249-254.

69. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques.- N.Y., San Diego, Boston, Acad. Press. 1996-21 Op.

70. Janshoff A., Steinem C., Michalke A., Henke C., Galla H.J. Monofunctionalized b-cyclodextrins as sensor elements for the detection of small molecules/ZElsevier/ Sensors and Actuators.- 2000.- Vol.70.-P.243-253.

71. James C.D., Davis, R.C., Craighhead, H.G., Isaacson, M., Turner, J.N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing//Langmuir.- 1998.-Vol.14.-P.741-744.

72. Joos Т. O., Schrenk M., Hopfl P., Kroger K., Chowdhury U., Stoll D. Schorner D., Durr M., Herick K., Rupp S., Sohn K. and Hammerle H. A microarray ELISA for autoimmune diagnostics//Electrophoresis.- 2000.-Vol.21 .-P.2641 -2650.

73. Ко I.K., Kato K. & Iwata H. Antibody microarray for correlating cell phenotype with surface marker//Biomaterials.- 2005.- Vol.26.- P.687-696.

74. Lahiri J., Ostuni E., Whitesides G.M. Patterning ligands on reactive SAMs by microcontact printing//Langmuir.- 1999.-Vol.l5.-P.2055-2060.

75. Lee S.H. and Ruckenstein E. Adsorption of proteins onto polymeric surfaces of different hydrophylicities a case study with BSA//J. Colloid and Interface Sci.- 1988. Vol.l25.-P.365-379.

76. Lemmo A.V., Fisher J.T., Geysen H.M., Rose D.J. Characterization of an inkjet chemical microdispenser for combinatorial library synthesis//Anal. Chem.- 1997.-Vol.69.-P.543-551.

77. Lennert K. The non-Hodgkin's lymphomas. /Ed.I. Magrath.-London, Arnold, 1997,- P.133-167.

78. Lin J.-N., Herron J., Andrade J. D. and Brizgys M. Characterization of immobilized antibodies on silica surfaces//IEEE Trans. Biomed. Eng.-1988,-Vol. 35.-P.466-471.

79. Liu A. Y. Differential Expression of Cell Surface Molecules in Prostate Cancer Cells// Cancer Research.-2000.-Vol.60.-P.3429-3434.

80. Lueking A., Horn M., Eickhoff H., Biissow K., Lehrach H., Walter G. Protein microarrays for gene expression and antibody screening//Anal. Biochem.- 1999.-Vol. 270.-P.103-111.

81. Lukes R.J., Collins R.D. New approaches to the classification of lymphomata.//Br. J. Cancer.-1975.-Vol. 31.-P.1-28.

82. Macbeth G., Schreiber S.L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination//Science.-2000.-Vol.289.-P.1760-1763.

83. Marbrook I. In: Selected Methods in Cellular hninunology/Mishell В. B. and Shigi S. M. (eds.) San Francisco, W. II. Freeman, 1980.-p.188.

84. Martin В., Gaber В. P., Patterson C.H., Turner D.C. Direct protein microarray fabrication using a hydrogel "stamper'V/Langmuir.- 1998.-Vol.21.-P. 3971-3975.

85. Mc Gall G.H., Barone A.D., Diggelmann M., Fodor S.P.A., Gentalen E., Ngo N. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrate//! Am. Chem. Soc.-1997.-Vol.l 19.-P.5081-5090.

86. Melo J.V., Hedge U., Parreira A., Thompson I., Lampert I.A.,Catovsky D. Splenic lymphoma with circulating villous lymphocytes: differential diagnosis of В cell leukaemias with large spleens.// J. Clin. Path.-1987.-Vol. 40.-P. 642-651.

87. Miller R. G. In: Handbook of Experimental Immunology/ Weir D. M Blackwell C, Herzenberg L. A. and Herzenberg L. A. (eds.)-Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1986.- p.54.1.

88. Moerman R., Frank J., Marijnissen J. С., M. van Dedem G. W. K., Picoliter dispensing in wells of a micro-array by means of electrospraying//Journal of Aerosol Science.-1999.-Vol.30.-P.551-552.

89. Moerman R., Frank J., Marijnissen J. C.M., Schalkhammer Т., van Dedem G.W.K. Miniaturized electrospraying as a technique for the production of microarrays of reproducible micrometer-sized proteinspots//Anal Chem.- 2001.-Vol. 73.-P.2183-2189.

90. Moody M.D., Van Arsdell S.V., Murphy K.P., Orencole S.F. and Burns C. Array-based ELISAs for high-throughput analysis of cytokines//BioTechniques.- 2001 .-Vol.31 .-P.186-194.

91. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method to fabricate functionally active protein films//Anal. Chem.- 1999.-Vol.71.-P.1415-1420.

92. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method for mass fabrication of mono- and multi-component microarrays of biological and biologically active sub stances//Anal. Chem.- 1999.-Vol.71.-P.3110-3117.

93. Morozov,V.N., Morozova, T.Ya., Kallenbach, N. R. Atomic force microscopy of structures produced by electrospraying polimer solutions//Int. J. Mass. Spectrom. Ion Processes.-1998.-Vol.178.- P.143-159.

94. Mourio I.,Colin Y., Cherif-Zahar В., Carton J.P., Le Van Kim C., Molecular genetic basis of human Rhesus blood system.//Nat. Genet.-1993.-Vol. 5.-P.62-65.

95. Naviroj S., Culler S.R., Koenig J.L. and Ishida H. Structure and adsorption characteristics of silane coupling agents on silica and e-glass fiber: dependence on pH.//J. Colloid Interface Sci.-1984.-Vol.97.-P.308-317.

96. Nilsson K. and Mosbach K. Immobilization of ligands with organic sulfonyl chlorides//Meth. Enzymol.-1984.-Vol.l04.-P.56-69.

97. Norde W. and Zoungana T. Surface-induced changes in the structure and activity of enzymes physically immobilized at solid /liquid interfaces.

98. Biotechnol.-1998.-Appl. Biochem. -Vol.28.-P.133-143.

99. Nuzzo R.G., Allura D.L. Adsorptionof bifunctional organic disulfides on gold surface// J. Amer. Chem. Soc. -1983.-Vol.l05.-P.4481-4483.

100. Nuzzo R.G., Zegarski, B.R., Dubois, L.H. Fundamental studies of the chemisorption of organosulfur coumpounds on Au. Implication for molecular self-assembling on gold surfaces//.!. Amer. Chem. Soc.- 1987.-Vol.l09.-P.773-740.

101. Pease A. N., Solas D., Sullivan E.J., Cronin M.T., Holmes C.P., Fodor P.A. Ligh-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994.-Vol. 91.-P.5022-5026.

102. Penzol G., Armisen P., Fernandez-Lafuente R., Rodes L. And Guisan J. M. Use of dextrans as long and hydrophilic spacer arms to improve the performance of immobilized proteins acting on macromolecules//Biotechnol. and Bioeng.-1998.- Vol.60.-P. 518-523.

103. Pirrung M.C., Huang C.Y. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin// Bioconjugate Chem.- 1996.-Vol.7.-P.317-321.

104. Pritchard D.J., Morgan H., Cooper J.M. Patterning and regeneration of surfaces with antibodies//Anal. Chem.-1995.- Vol.67.- P.3605-3607.

105. Proudnikov D., Timofeev E., Mirzabekov A. Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips//Anal Biochem.- 1998.-Vol.259.-P.34-41.

106. Raidt D. G. In: Selected Methods in Cellular Immunology/Mishell В. B. and Shigi S. M. (eds.) San Francisco, V. H. Freeman,-1980. p.193.

107. Schena M., Heller R.A., Theriault T.P., Konrad K., Lachenmeier E., Davis R.W. Microarrays: biotechnology's discovery platform for functional genomics// TIB TECH.- 1998.-Vol.16.-P.301- 306.

108. Shalon, D., Smith, S.J. Brown, P.O. A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization//Genome Research.-1996.-Vol.6.-P.639-645.

109. Steinman R. M., Voorhis W. С van, Spalding D. M. In: Handbookof Experimental Immunology/ Weir D. M., Blackwell C, Herzenberg L. A. and Herzenberg L. A. (eds.).-Oxford, Blackwell Scientific Publishers, 1986,-p. 49.1

110. Vandenberg E. Т., Bertilsson L., Leeidberg B.,Uvdal K., Erlandsson R., Elwing H. and Lundstorm I. Structure of 3-aminopropil triethhoxy silane on silicon oxide//J. Colloid Interface Sci.- 1990.-Vol.147.-P. 103-118.

111. Williams C.A., Chase M.W. Methods in immunology and immunocytochemistiy, Vol V.- N. Y., Academic Press, 1976.- 312 p.

112. Winklmair M., Schuetz A. J., Weller M.G. and Niessner R. Immunochemical array for the identification of cross-reacting analytes. //J. Anal. Chem. -1999.- Vol.363.- P.731-737.