Молекулярно-генетический анализ мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам

Хахалина, Анастасия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам"

На правах рукописи

ХАХАЛИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ gyrA и gyrB, СВЯЗАННЫХ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ФТОРХИНОЛОНАМ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ч Ж ISH

Москва-2014

005551728

Работа выполнена в Государственном казенном учреждении здравоохранения «Московский городской научно-практический Центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы» (ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ) Научные руководители:

кандидат медицинских наук Носова Елена Юрьевна доктор биологических наук Макарова Марина Витальевна Официальные оппоненты:

Леви Диана Тимофеевна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный эксперт Управления экспертизы протнвобактериальных медицинских иммунобиологических препаратов.

Черноусова Лариса Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук, заведующая отделом микробиологии. Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «Л_ »¿?Х-/11г^>.б2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии рг микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей н благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, http://www.gabrich.ru

Автореферат разослан «-3 >■> года.

Ученый секретарь Диссертационного совет доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Современная эпидемическая обстановка по туберкулёзу характеризуется увеличением количества больных, у которых выявляются штаммы Mycobacterium tuberculosis (МБТ) с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) как среди пациентов с хроническим течением процесса, так и у впервые выявленных лиц (Migliori G. et. al., 2009).

Фторхинолоны являются одними из основных препаратов в составе резервного ряда противотуберкулезных препаратов, используемых для химиотерапии больных туберкулёзом с множественной лекарственной устойчивостью (Chan Е. et al., 2004; Chiang С. et al., 2006; Yew W. et al., 2000). Однако их широкое использование для лечения различных неспецифических заболеваний привело к быстрому развитию к ним лекарственной устойчивости (ЛУ) М. tuberculosis (Wang J. et al., 2007). В связи с этим необходимо быстрое выявление возбудителя и определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) к этой группе препаратов.

Микробиологическое определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к фторхинолонам с использованием плотной среды Левенштейна-Йенсена (Л-Й) длительное. Использование жидких сред в автоматизированных системах типа Bactec 960 позволяет сократить время исследования. Однако в настоящее время сертифицированных культуральных тестов для определения лекарственной чувствительности M tuberculosis к фторхинолонам в Bactec 960 нет, есть только рекомендованные критические концентрации (КК) к данным препаратам (Исаева Ю.Д. и др., 2012; Grace Lin S-Y. et al., 2009; Rüsch-Gerdes S. et al., 2006).

В этом отношении молекулярно-генетические методы позволяют в течение двух суток выявлять ДНК М. tuberculosis непосредственно в диагностическом материале и определять мутации в генах-мишенях, связанных с развитием устойчивости М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (ПТП).

Мишенью действия фторхинолонов в М. tuberculosis является ДНК-гираза, которая состоит из двух субъединиц А и В, кодируемых генами gyrA и gyrB соответственно (Ginsburg A. et. al 2003; Lau R. et al. 2011; Shi R. et al. 2006; Takiff H. et al. 1994). Регион, определяющий устойчивость к фторхинолонам (РОУФ) генов gyrA (320 п.н.) и gyrB (375 п.н.), является консервативной областью, где возникают пукле

тидные замены (мутации), связанные с устойчивостью М. tuberculosis к фторхиноло-нам. Преобладающее большинство мутаций (45-85%) сосредоточено в РОУФ гена gyrA. Замены в гене gyrB встречаются как самостоятельно, так и в сочетании с геном gyrA (Groll A. et al., 2009). Доля таких штаммов среди всех М. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, составляет около 7%, однако роль некоторых из них в развитии устойчивости до конца не ясна (Wang J. et al., 2007). Кроме того, не все мутации в генах gyrA и gyrB связаны с перекрёстной устойчивостью М. tuberculosis ко всей группе фторхинолонов.

Таким образом, одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB может дать дополнительную информацию о лекарственной чувствительности к фторхинолонам исследуемого штамма, а также повысить корреляцию молекулярно-генетических данных с микробиологическими результатами лекарственной чувствительности M tuberculosis к данным препаратам.

Степень разработанности темы исследования

Большой вклад в изучение молекулярного развития ЛУ МБТ к фторхинолонам внесли зарубежные ученые. В работах Takiff Н.Е, Ginsburg A, Shi R. было показано, что устойчивость МБТ к фторхинолонам связана с появлением мутаций в генах gyrA и gyrB (Takiff H. et al., 1994; Ginsburg A. et al., 2003; Shi R. et al., 2006). В настоящее время охарактеризовано их значительное количество. В 85% штаммов, устойчивых к фторхинолонам, мутации сосредоточены в РОУФ гена gyrA (320 п.н.), содержащих полиморфные кодоны 88, 90, 91, 94 и 95. Кодон 95 содержит естественно-обусловленный полиморфизм Ser95Thr, не влияющий на JI4 МБТ к фторхинолонам (Yew W. et al., 2002). Мутации в 90, 91 и 94 кодонах связаны с ЛУ ко всем препаратам группы фторхинолонов (An D. et al., 2009). Также описаны мутации вне РОУФ gyrA, вызывающие ЛУ к фторхинолонам (Devasia R. et. al, 2012). В последние годы в литературе широко обсуждается вопрос о влиянии мутаций в РОУФ гена gyrB (375 п.н.) на чувствительность МБТ к препаратам фторхинолонового ряда (Cui Z. et. al, 2011; Pantel A. et. al., 2011). Замены в гене gyrB могут встречаться как самостоятельно, так и в сочетании с мутациями в гене gyrA и составляют около 7% среди всех устойчивых МБТ к фторхинолонам (Wang J. et al., 2007; Groll A. et al., 2009).

В России среди ученых, которые занимаются изучением этой проблемы, в области диагностики и эпидемиологии лекарственно-устойчивых форм возбудителя ту-

беркулеза известны имена: Черноусова Л.Н., Грядунов Д.А., Антонова О.В., Мокро-усов И.В. и другие. Однако работы данных авторов в основном посвящены выявлению мутаций в гене gyrA. В то же время остается мало изученным вопрос о роли мутаций в гене gyrB МБТ или в сочетании с заменами в gyrA в развитии устойчивости ко всем фторхинолонам или к отдельным из них, а также их связь с уровнем устойчивости.

Цель исследования

Выявить мутации в генах gyrA и gyrB и определить их спектр с помощью биологических микрочипов и модифицированного метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для быстрого и точного определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам у больных туберкулезом легких.

Задачи исследования:

1. Разработать модификацию метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») и оценить эффективность его применения для выявления мутаций в гене gyrB ДНК М. tuberculosis из диагностического материала (мокроты).

2. Провести сравнительный анализ результатов молекулярно-генетического определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к фторхинолонам в гене gyrA с помощью коммерческих тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDR.s7» в диагностическом материале (мокроте).

3. Провести анализ мутаций в генах gyrA и gyrB М. tuberculosis с помощью «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах, выделенных из диагностического материала больных туберкулёзом легких.

4. Определить связь мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis с уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину с использованием модифицированных жидких сред Middlebrook 7Н9 в автоматизированной системе Bactec 960.

5. Изучить спектр мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у впервые выявленных больных туберкулезом легких и с хроническим течением процесса.

Научная новизна

Впервые с помощью метода «M-SSCP», разработанного в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, определен вклад мутаций в гене gyrB в развитие лекарственной устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrB»).

Впервые разработанный молекулярно-генетический метод «M-SSCP» в сочетании с коммерческой тест-системой «ТБ-БИОЧИП-2» позволил расширить анализируемый спектр мутаций в генах, ответственных за лекарственную устойчивость М. tuberculosis к фторхинолонам.

Установлена связь между типом мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis и уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину.

На большом количестве биологического материала показано процентное распределение мутаций в двух генах М. tuberculosis, выделенных у впервые выявленных больных и с хроническим течением процесса, что имеет большое эпидемиологическое значение.

Теоретическая и практическая значимость работы

Получены новые данные, демонстрирующие, что одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB позволяет расширить анализируемый спектр мутаций и дать более полную информацию о лекарственной чувствительности М. tuberculosis к фторхинолонам исследуемого штамма.

Установлено, что коммерческая тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» позволяет с высокой чувствительностью одновременно выявлять ДНК М. tuberculosis и определять как часто, так и редко встречающиеся мутации в гене gyrA. Применение ее для исследования диагностического материала позволит сократить время получения результата и тем самым своевременно скорректировать режим химиотерапии. Разработанный метод «M-SSCP» можно применять как скрининг-тест для быстрого выявления мутаций в гене gyrB М. tuberculosis.

Разработанные методические рекомендации «Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов», утвержденные Департаментом Здравоохранения города Москвы от 29.09.2008 года, применяются в клинической практике противотуберкулезных учреждений.

Полученные данные анализа мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью метода «M-SSCP» и секвенирования были использованы в разработке тест-системы «ТБ-ТЕСТ», основанной на технологии гидрогелевых биочипов в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Работа поддержана государственным контрактом с Министерством образования и науки РФ № 16.522.11.2003 и программой фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»), В настоящее время данная тест-система проходит клинические испытания.

Методология и методы исследования

Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с лекарственной устойчивостью М. tuberculosis к препаратам резервного ряда (фторхинолонам). Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлся респираторный материал (мокрота) и культуры М. tuberculosis, полученные от больных туберкулезом легких.

Исследование проводилось в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

Исследовано 390 проб ДНК МБТ, выделенных из 316 культур и 74 образцов мокроты, полученных от 154 больных с впервые выявленным туберкулезом легких и 162 больных с хроническим течением процесса. Все больные находились на лечении в филиалах и клиниках ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ. Специфичность метода «M-SSCP» оценивали, используя музейные штаммы нетуберкулезных мико-бактерий (M.avium АТСС35712, М. intracellulare АТСС35761, М. scrofulaceum АТСС35787), грамотрицательных (Е. coli АТСС25922, Р. aeruginosa АТСС27853) и грамположительных (S.aureus АТСС25923) микроорганизмов, а также культуры, выделенные из диагностического материала больных (К. pneumoniae, S. pneumoniae, S. intermedins, S. agalactiae).

В качестве контроля использовали лабораторный штамм М. tuberculosis H37Rv (АТСС 25618), чувствительный ко всем противотуберкулезным препаратам.

Микробиологические методы

Определение J14 МБТ к изониазиду и рифампицину в автоматизированной системе типа Bactec 960 с применением жидкой среды Middlebrook 7Н9 (М7Н9) проводили согласно методическому руководству Becton Dickinson (2002). - Режим доступа: http://www.bd. com/ds/technicalCenter/cIsi/clsi-960pza.pdf. Определение J14 МБТ к OFX методом абсолютных концентраций на плотной среде Л-И проводили согласно приказу №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской Федерации». Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) к левофлоксацину и моксифлоксацину в автоматизированной системе типа Bactec 960 с применением жидкой среды М7Н9 проводили согласно рекомендациям S. Rusch-Gerdes и соавт. (2006).

Молекулярно-генетические методы

Для определения J14 МБТ к фторхинолонам в гене gyrA использовали тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и GenoType MTBDRs/.

Тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» («БИОЧИП - ИМБ», Россия). Выделение и экстракцию ДНК МБТ из мокроты и культур, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), электрофорез и гибридизацию на биологических микрочипах проводили согласно прилагаемому руководству «Руководство по применению набора реагентов для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и определения их лекарственной чувствительности к фторхинолонам на биологических микрочипах «ТБ-БИОЧИП-2» (Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФРС 2010/08555, 03.10.2010).

Тест-система «GenoType MTBDRsl» (GenoType, Hain Lifescience, Германия). ПЦР и гибридизацию на стрипах проводили согласно прилагаемому протоколу (Genotype MTBDR^/гл?: a Further step toward rapid identification of drug-resistant M. tuberculosis (2008).

Для выявления мутаций в гене gyrB ДНК МБТ из мокроты и культур использовали метод «M-SSCP» (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов М. tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrB»).

В качестве референс-метода применяли секвенирование РОУФ генов gyrA и gyrB с помощью автоматического секвенатора GS Junior («Roche», Германия).

Статистическая обработка результатов и программное обеспечение

Сбор и обработка информации о пациенте, учет данных микробиологических и молекулярно-генетических исследований осуществлялись с помощью лабораторной информационной системы «Алиса» (ЗАО «Фирма Гален»), Подбор олигонуклеотид-ных праймеров проводили с помощью компьютерной программы Oligo v.6.31. Специфичность выбранных праймеров оценивали с помощью базы данных BLAST WWW-сервиса в NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Чувствительность (способность обнаружить истинную устойчивость), специфичность (способность обнаружить истинную чувствительность) и достоверность их различия оценивали с помощью программы Epi-Info 3.3. При расчете характеристик методов и доли совпадений результатов вычислялся 95% доверительный интервал (ДИ). Различия считались достоверными при р<0,05.

Личное участие автора в получении результатов

Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в постановке экспериментов, учете и интерпретации результатов лекарственной чувствительности М. tuberculosis к группе фторхинолонов молекуляр-но-генетическими методами, определении спектра мутаций в генах-мишенях и их связь с уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину. Микробиологическая часть исследования (культуральный посев) осуществлялась автором совместно с научными сотрудниками Исаевой Ю.Д. и Крыловой ЛЛО. в централизованной бактериологической лаборатории ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ. Секвениро-вание культур М. tuberculosis проводилось совместно с сотрудником Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Земенковым Д.В. Соискатель в соавторстве разработал методические рекомендации по определению лекарственной чувствительности М. tuberculosis с помощью биочипов и метод «M-SSCP» для выявления мутаций в гене gyrB из диагностического материала.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее эффективной для выявления М. tuberculosis и определения мутаций в гене gyrA при исследовании диагностического материала (мокроты) является тест-система «ТБ-БИОЧИП-2». Метод «M-SSCP» может применяться как скрининг-тест для выявления ДНК М. tuberculosis в мокроте и определения электрофоретиче-ских отличий, связанных с появлением мутаций в гене gyrB.

2. Разработанный метод «M-SSCP» в сочетании с тест-системой «ТБ-БИОЧИП-2» позволяет расширить анализируемый спектр мутаций в генах gyrA и gyrB, ответственных за устойчивость М. tuberculosis к фторхинолонам.

3. Высокий уровень устойчивости М. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксацину связан с заменами Gly88Cys, Asp94Gly, Asp94His, Asp94Tyr и двумя двойными мутациями Asp94Gly и Asp94Asn, Asp94Gly и Ala90Val в гене gyrA. Мутация в гене gyrB Asp500His связана с умеренным к левофлоксацину и низким к моксифлоксацину уровнем устойчивости, a Asn538Asp с низким уровнем к обоим препаратам. Замена Arg485His не приводит к устойчивости к данным препаратам.

4. Большим генетическим разнообразием в анализируемых генах-мишенях обладают устойчивые к офлоксацину штаммы М. tuberculosis, выделенные от больных с хроническим течением процесса.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности результатов работы свидетельствует использование сертифицированных микробиологических и молекулярно-генетических методов, которые характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Проведен достаточный объем исследований, что позволило корректно осуществить статистическую обработку полученных данных. Комплексное молекулярно-генетическое выявление мутаций, ответственных за устойчивость к фторхинолонам в двух генах одновременно, позволило получить сопоставимые результаты с микробиологическим определением лекарственной чувствительности М. tuberculosis к данной группе препаратов, что свидетельствует о достоверности полученных результатов.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ (протокол № 9 от 29 ноября 2013 г.).

Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом, «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2010; Конгрессе европейского респираторного сообщества, Барселона, 2010; X Московской ассамблее «Здоровье столицы», Москва, 2011; V ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2013; VI научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных

групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва 2013; Научно-практической конференции молодых ученых, посвященной дню борьбы с туберкулезом, Москва, 2014.

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 21 опубликованной работе, включая 6 статей в рецензируемых научных изданиях, 5 - в других научных изданиях, 8 - в материалах конференций, 1 — патентное изобретение и 1 - методические рекомендации.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 125 наименований, из них 23 отечественных и 102 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 5 рисунками и 13 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Модификация метода конформационного полиморфизма длин од-ноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для выявления мутаций в гене gyrB ДНК М. tuberculosis, ответственных за устойчивость к фторхинолонам

На сегодняшний день молекулярно-генетическое выявление мутаций, связанных с развитием устойчивости МБТ к фторхинолонам, проводится только в гене gyrA. В связи с этим в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патомор-фологии МНПЦБТ была предпринята попытка адаптировать метод SSCP для выявления мутаций в гене gyrB ДНК МБТ, выделенной не только из культур, но и из диагностического материала (мокроты).

Подбор олигонуклеотидных праймеров проводили с помощью компьютерной программы Oligo v.6.31. (2000, Molecular Biology Insights, Inc). Из нескольких пар были выбраны следующие: «внешние» Fl — 5' AGA GTT GGT GCG GCG TAA GA 3', R1 - 5' AAC АСА TG С CCG TTC TCG AT 3' и «внутренние» F2 - 5' TAA GAG CGC CAC CGA CAT CG 3', R2 - 5' GCA TGA ACC GGA АСА АСА AC 3'. Оценку специфичности выбранных праймеров проводили с помощью базы данных BLAST WWW-сервиса в NCBI http://vyww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Было установлено отсутствие перекрестной реакции с ДНК других микроорганизмов и человека. Изменяя параметры темпе-

ратуры отжига праймеров, время каждого цикла и количество циклов, был подобран оптимальный режим амплификации для проведения первой и второй стадии ПЦР, увеличивающий чувствительность метода. Выбранные условия представляют собой следующее: 1-ый этап - 94° - 4 мин; 2-ой этап: 94° - 30 сек., 59° - 40 сек., 72° - 40 сек (25 циклов); 3-ий этап: 72° - 4 мин; 10° - хранение. Для визуализации ПЦР продуктов амплификации, полученных после второй стадии, проводили электрофорез в 2% ага-розном геле (рис. 1).

100

М 1 23456789 10 М

Рис. 1. Электрофоретические профили образцов ДНК М. tuberculosis, полученные после второй стадии ПЦР

Примечание: 1 - контрольный штамм H37R.V; 2-10 - образцы ДНК М. tuberculosis, М-маркер 100-500 п.н. (Синтол, Россия)

Для электрофоретического разделения одноцепочечных фрагментов ДНК были подобраны следующие условия: для денатурации смешивали 4 мкл образца с 6 мкл денатурирующего раствора и прогревали в термостате при 95° - 10 мин, разделение денатурированных ампликонов проводили в 8% полиакриламидном геле при напряжении 400 V в течение 5 часов при температуре 8°С в TBE буфере. Для визуализации результатов электрофореза проводили окраску геля с помощью азотнокислого серебра. После окраски гель оценивали при белом свете (визуально) без специального оборудования (рис. 2).

К 1234 567 8К

Рис. 2. Электрофоретические профили М. tuberculosis гена gyrB

Примечание: К - контроль, 1, 2, 7 - образцы ДНК М. tuberculosis, чувствительные к фторхинолонам (не содержат мутации), 3-6, 8 - образцы ДНК М. tuberculosis, устойчивые к фторхинолонам (содержат мутации).

Исследуемые образцы ДНК, показавшие отличия на электрофореграмме от контрольного штамма H37Rv, секвенировали для определения типа мутаций.

Предложенный метод «M-SSCP» может дать дополнительную информацию по исследуемому штамму, обладает высокой специфичностью и позволяет выявлять мутации в гене gyrB ДНК МВТ, ответственных за устойчивость к фторхинолонам, выделенной не только из культур МВТ, но и из диагностического материала (мокроты), тем самым сокращая время исследования.

2. Эффективность применения тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRs/» и метода «M-SSCP» в образцах мокроты

Для сравнения эффективности двух коммерческих тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDR^/» и метода «M-SSCP» отобрали 74 образца мокроты, из которых были выделены культуры МВТ на среде М7Н9 в Bactec 960. С помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» ДНК МБТ была выявлена во всех 74 (100%) образцах и только в 67 (90,5%) с помощью «GenoType MTBDRs/». Полученные результаты сравнили с данными люминесцентной микроскопии и посевом в Bactec 960 (табл. 1).

Таблица 1.

Совпадения выявления ДНК М. tuberculosis в мокроте с помощью тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRs/» и метода «M-SSCP» с данными люминесцентной микроскопии и посева в Bactec 960

Результаты микроскопии Рост МБТ обнаружен Bactec 960 Обнаружена ДНК МБТ

ТБ-БИОЧИП-2 GenoType MTBDRs/ «M-SSCP»

ЛЮМ+ (п=54) 54 54 51 54

ЛЮМ-(п=20) 20 20 16 20

Всего: 74 74 74(100%) 67 (90,5%) 74 (100%)

Как видно из таблицы 1, достоверно большей чувствительностью (р<0,05) при выявлении ДНК МБТ в мокроте обладали тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» и метод «М-БЗСР», для которых совпадение с результатами роста МБТ в Вас1ес 960 составило 100%.

Далее сравнили результаты молекулярно-генетического выявления мутаций в гене gyrA с помощью «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDRs/» и в гене gyrB с помощью метода «M-SSCP» с бактериологическим определением ЛЧ к OFX на среде ЛИ в 67 образцах мокроты, в которых была обнаружена ДНК МБТ двумя тест-системами и методом «M-SSCP» (рис. 3).

«rJQtynpy* ®*вА1й$Шг

100%

р.ВДЛЩ

i i

¡»(MWK 35 (5?.**) 3>. .1 .1

(4МЖ mi*i,mi

DCfX'f.wiwi.'ca.ieA'

Л-Й МШШ1 тЖОЧЖ ! ТКИОЧШ-i. SSOpH

(gmO «яижряииг

(gfr.4 И jprf)

Рис. 3. Результаты молекулярно-генетического выявления мутаций в генах gyrA и gyrB и микробиологического определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis, выделенных из 67 образцов мокроты, полученных от больных с множественной лекарственной устойчивостью

Результаты, полученные с помощью тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDRs/», показали, что мутации в гене gyrA МБТ в 29 (43,3%) образцах обнаружены не были, что совпало с результатами бактериологического определения ЛЧ к OFX. Из 38 (56,7%) образцов мокроты, в которых МБТ показали фенотипиче-скую устойчивость к OFX, в 35 (52,2%) были выявлены мутации в гене gyrA с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и в 34 (50,7%) с помощью «GenoType MTBDRs/». В одном случае тест-система «GenoType MTBDRs/» не выявила мутацию Gly88Cys, так как 88 кодон не включен в данную систему. В трех образцах, в которых не были выявлены мутации в гене gyrA двумя тест-системами, в двух были обнаружены отличия на электрофореграмме и после секвенирования определена мутация Ala543Thr в гене gyrB. В одном образце мутации не были обнаружены. Можно предположить, что замены в генах gyrA и gyrB находятся за пределами РОУФ исследуемого тест-системами «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRs/» и методом «M-SSCP» или в развитии лекарственной устойчивости задействованы другие молекулярные меха-

низмы (Оеуаз1а Я. е1;.а1, 2012,Б. е1 а!., 2005, Угее^ов М. е1 а1., 2003). Также рекомендованная в приказе № 109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» КК ОРХ - 2,0 мкг/мл на плотной среде Л-Й может является низкой для оценки ЛУ МБТ (Низова А.В., 2009).

Результаты исследования показали, что большей эффективностью среди коммерческих тест-систем обладает «ТБ-БИОЧИП-2», а метод «М-88СР» может применяться как скрининг-тест для выявления мутаций в гене §угВ из диагностического материала (мокроты).

3. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах М. tuberculosis

Исследовано 316 культур МБТ, выделенных из диагностического материала 316 больных туберкулезом легких, с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» на наличие мутаций в генах gyrA и gyrB. Полученные результаты сравнили с микробиологическим определением ЛЧ к OFX на среде Л-Й (рис. 4).

Рис. 4. Данные молекулярно-генетического выявления мутаций в гене gyrA с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и микробиологического определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к офлоксацину

Из 316 культур МБТ в 185 (58,5%) мутации в gyrA обнаружены не были, они также были чувствительными к офлоксацину, тогда как для 131 штамма МБТ были

выявлены некоторые расхождения с результатами микробиологического определения ЛЧ к OFX. Из 131 OFX -устойчивой культуры МБТ в 10 (3,2%) с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» мутации в гене gyrA обнаружены не были, в остальных 121 (38,3%) штамме полученные данные совпали с микробиологическим определением

10 (3.2%)

мутации ие -Еыякяекы

I I OFX чувствительные Щ OFX устойчивые

185 (58.5%)

ЛЧ.

Далее все исследуемые штаммы МБТ были проанализированы на наличие мутаций в гене с помощью метода «М-88СР» (рис. 5).

40,3%) &гл

шашн не КО.&/Л 4( 13Ш

Рис. 5. Данные молекулярно-генетического выявления мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2», метода «M-SSCP» и микробиологического определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к офлоксацину

Из 185 (58,5%) OFX-чувствительных культур МБТ в одном штамме было определено электрофоретическое отличие и после секвенирования выявлена мутация Arg485His, не связанная с развитием ЛУ к фторхинолонам (Pantel A. et.al, 2011). Из 10 (3,2%) OFX-устойчивых культур МБТ, не имевших мутации в гене gyrA, в четырех (1,3%) были выявлены отличия и после секвенирования определены мутации в gyrB -Ala543Thr, Asp500His, Asn538Asp. В двух (0,6%) штаммах МБТ, в которых с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP», мутации не были выявлены, после секвенирования они были определены в гене gyrA (His70Arg и Gly88Ala) и (Asp89Asn). Эти кодоны не включены в тест-систему «ТБ-БИОЧИП-2». В четырех (1,3%) культурах после секвенирования мутации в исследуемых генах обнаружены не были. Возможно, это также связано либо с низкой КК для оценки ЛУ МБТ к OFX -2,0 мкг/мл, либо мутации в генах gyrA и gyrB находятся за пределами РОУФ, либо в развитии устойчивости задействованы другие молекулярные механизмы (Низова А.В., 2009; Devasia R. et.al, 2012, Hegde S. et al., 2005, Viveiros M. et al., 2003).

В одной из 121 (38,3%) устойчивой к OFX культуры МБТ мутации были выявлены одновременно в двух генах gyrA (Asp94Gly) и gyrB (Asp500Ala).

Исследование показало, что при выявлении мутаций в двух генах gyrA и gyrB одновременно чувствительность метода по выявлению мутаций, связанных с ЛУ к

Q OFX чувствительные Щ OFX устойчивые

1(0,3%)

фторхинолонам, достоверна (р<0,05) и увеличивается до 96,9% (95% ДИ: 92-99,2), тогда как при исследовании одного гена ^гА она составляет 92,4% (95% ДИ: 86-96,3).

Полученный спектр мутаций при исследовании культур МБТ с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2», метода «М-БвСР» и секвенирования РОУФ генов gyгА и £угВ представлен на рисунке 6.

СМ»АЦДШ70АГ8

Среди одиночных мутаций в гене gyrA преобладали замены в 94 (58,8%) и 90 (20,0%) кодонах. В девяти (6,8%) культурах была выявлена мутация Ser91Pro, и в одной Gly88Cys (0,7%). Восемь культур (5,6%) имели двойные замены в этом гене. В одном (0,7%) штамме МБТ мутации (Asp94Gly и Asp500Ala) были выявлены одновременно в двух генах. Пять мутаций были обнаружены в гене gyrB, одна из которых (Arg485His) не связана с устойчивостью МБТ к фторхинолонам.

4. Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB и их связь с уровнем устойчивости М. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксацину

Для исследования возможной связи типа мутаций в генах gyrA и gyrB с их уровнем устойчивости к фторхинолонам случайным образом было отобрано 68 культур МБТ, из которых 38 были фенотипически устойчивые к OFX и 30 чувствительные.

А5рЖау,Л1а90Уа|

A*t»94Tvr 2 (1,S4)

Aij>94ms 3 (2,1*в)

Рис. 6. Спектр мутаций в генах gyrA и gyrB М. tuberculosis, устойчивых к офлоксацину

Определение МИК ЬУХ и МОХ для выбранных устойчивых к ОРХ штаммов МБТ проводили в жидкой среде М7Н9 с использованием системы Вайес 960. Конечные концентрации ЬУХ в пробирках со средой МС1Т колебались в пределах от 0,125 до 32,0 мкг/мл и МОХ от 0,063 до 10,0 мкг/мл. Устойчивость определяли при МИК >2 мкг/мл для ЬУХ и >0,5 мкг/мл для МОХ (ЯизсЬ-Оегёез Б. е1:. а1, 2006).

Мутации в гене ¿угА были выявлены в 36 из 38 культур МБТ, устойчивых к ОРХ, и в двух в гене gyrB (Азп538Азр и А8р500Н1з). Из 30 чувствительных штаммов МБТ в 29 культурах мутации в этих генах отсутствовали, в одном определена мутация в гене gyrB с заменой Аг§485Шз (табл. 2).

Таблица 2.

Значение МИК левофлоксацина и моксифлоксацина и мутации в генах gyrA и gyrB М. tuberculosis (п=39)

gyrA gyrB Количество штаммов M. tuberculosis

МИК LVX / МИК ус-ти >2,0 (мкг/мл) МИК МОХ/ МИК ус-ти >0,5 (мкг/мл)

кодоны кодоны 1,0 2,0 4,0 8,0 16,0 32,0 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0

Asp94Gly 1 7 3 2 1 12

Ala90Val 4 3 2 4 2 3

Asp94Ala 6 2 3 1

Asp94Tyr 1 1

Asp94His 1 1

Ser91 Pro 1 1

Gly88Cys 1 1

Gly88Ala His70Arg 1 1

Asp94Tyr Ala90Val 1 1

Asp94Gly Ala90Val 1 1

Asp94Gly Asp94Asn 1 1

Arg485His 1 1

Asn538Asp 1 1

Asp500His 1 1

Всего: 39

Как видно из таблицы 2, мутации в гене gyrA и две замены А8п538Авр и Азр500Н15 в гене ^угВ связаны с перекрёстной устойчивостью МБТ к фторхинолонам. Мутация А^485Шв в гене %угВ не приводит к устойчивости МБТ к ЬУХ и МОХ. Вы-

сокий уровень устойчивости к обоим препаратам связан с заменами в 94 кодоне гена gyrA Asp94Gly, Asp94His, Asp94Tyr, в 88 Gly88Cys и двумя двойными мутациями Asp94Gly и Asp94Asn, Asp94Gly и Ala90Val. Напротив, мутация Asn538Asp в гене gyrB связана с низким уровнем устойчивости МБТ к обоим препаратам, a Asp500His -с умеренным к LVX и низким к МОХ.

5. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у больных с впервые выявленным туберкулезом легких и с хроническим течением процесса

Для дальнейшего анализа спектра мутаций в генах gyrA и gyrB было исследовано 316 культур МБТ, выделенных из диагностического материала (мокроты) 154 больных с впервые выявленным туберкулезом легких и 162 с хроническим течением процесса.

Среди 154 впервые выявленных больных у 129 (83,7%) МБТ были чувствительными, и у 25 (16,3%) устойчивыми к OFX. Из 129 (83,7%) штаммов МБТ, чувствительных к OFX, у 116 (75,3%) определена полиморфная замена Ser95Thr, не приводящая к устойчивости к фторхинолонам, и у 13 (8,4%) с диким типом (wt). Среди 25 (16,3%) устойчивых МБТ к OFX преобладающей мутацией являлась Ala90Val (5,2%), которую, по данным литературы, связывают с высоким уровнем устойчивости к OFX, умеренным к LVX и С1Р и низким к МОХ и GTX (Каш К. et al., 2006; Sirgel F. et al., 2012; Suzuki Y. et al., 2012). В двух (1,3%) штаммах была выявлена мутация в гене gyrB Ala543Thr (рис. 7).

Рис. 7. Спектр мутаций ДНК М tuberculosis, экстрагированной из культур, полученных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2», метода «M-SSCP» и секвенирования

Q OFX чувствительные Щ OFX устойчивые

Среди 162 больных с хроническим течением процесса у 56 (34,6%) МБТ были чувствительными, и 106 (65,4%) устойчивыми к OFX. В большинстве устойчивых к OFX штаммов МБТ была определена мутация Asp94Gly, которая составила 26,0%. Замена Ala90Val была выявлена в 11,1% и по частоте встречаемости среди устойчивых штаммов занимала второе место. Кроме того, спектр мутаций характеризуется наличием двойных мутаций в гене gyrA, которые составили 4,8% от всех устойчивых культур, а также наличием мутаций в одном штамме одновременно в двух генах (0,6%). Также были определены редко встречающиеся замены Gly88Cys (0,6%) и Asp89Asn (0,6%). В трех штаммах были выявлены мутации в гене gyrB, в двух -Asn538Asp, Asp500His, которые, по данным S. Malik и соавторов (2012), приводят к высокому уровню устойчивости МБТ к LVX, но к низкому к МОХ, и в одном -Arg485His, которая не приводит к устойчивости к фторхинолонам (Malik S. et. al., 2012). Во всех устойчивых и чувствительных к OFX штаммах МБТ определена полиморфная замена Ser95Thr (рис. 8).

лт»

С1>в8Л1».Ш\7ВЛги Л<.р94Туг,Л1*90У»1

Л.р'М'ЛЛ.SU

»ил'.) Д

<;ь»8С>* i «¡л«»

КУГА и аугв Л.рЧ-И.К м

1 Т-]

| | OFX чувствительные §§ OFX устойчивые

Asp94C;lv. (26.0%)

A.j.s-jfiu- г ¡U'-j 40. JW.

Рис. 8. Спектр мутаций ДНК М. tuberculosis, выделенных из культур, полученных от больных с хроническим течением процесса, с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2», метода «M-SSCP» и секвенирования

Из полученных результатов следует, что среди устойчивых МБТ к OFX наибольшим разнообразием характеризуется спектр мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК возбудителя, выделенного у больных с хроническим течением процесса. Большая часть мутаций, выявленных в культурах М. tuberculosis у этой группы больных, связана с высоким уровнем устойчивости не только к фторхинолонам второго, но четвертого поколения.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что метод «M-SSCP» может применяться как скрининг-тест для выявления мутаций в гене gyrB ДНК М. tuberculosis из диагностического материала (мокроты).

2. Установлено, что при исследовании диагностического материала (мокроты) коммерческими тест-системами большей эффективностью обладает «ТБ-БИОЧИП-2», которая с высокой чувствительностью позволяет одновременно выявлять ДНК М tuberculosis в мокроте и определять не только часто встречаемые мутации Ala90Val, Ser91Pro, Asp94Gly, Asp94Ala, Asp94Asn, Asp94His, Asp94Tyr, но и редко определяемую Gly88Cys гена gyrA.

3. Выявленные мутации в двух генах gyrA и gyrB с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» позволяют расширить анализируемый спектр мутаций, ответственных за устойчивость М. tuberculosis к фторхинолонам.

4. Определена связь мутаций в генах gyrA и gyrB с уровнем устойчивости М. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксацину. Высокий уровень устойчивости связан с заменами в гене gyrA Asp94Gly, Asp94His, Asp94Tyr, Gly88Cys и двумя двойными мутациями Asp94Gly и Asp94Asn, Asp94Gly и Ala90Val. Низкий уровень связан с мутацией Asn538Asp в гене gyrB, а замена Asp500His с умеренным к левофлоксацину и низким к моксифлоксацину. Мутация Arg485His в гене gyrB не приводит к устойчивости М. tuberculosis к данным препаратам.

5. Среди устойчивых М. tuberculosis к офлоксацину большим разнообразием характеризуется спектр мутаций в анализируемых генах ДНК возбудителя, выделенных из диагностического материала больных с хроническим течением процесса. Большая часть таких мутаций связана с высоким уровнем устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В лабораторной диагностике туберкулеза для быстрого выявления ДНК МБТ и определения JI4 к фторхинолонам в гене gyrA в диагностическом материале и культурах рекомендуется использовать тест-систему «ТБ-БИОЧИП-2», которая позволяет определять часто встречающиеся мутации Ala90Val, Ser91Pro, Asp94Gly, Asp94Ala, Asp94Asn, Asp94His, Asp94Tyr и редко определяемую Gly88Cys.

2. Разработанный метод «M-SSCP» рекомендуется использовать как скрининг-тест для выявления мутаций в гене gyrB ДНК МБТ из диагностического материала (мокроты) и культур. Использование тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «М-SSCP» позволит расширить спектр мутаций в анализируемых генах, что повысит корреляцию с микробиологическим определением ЛЧ МБТ к фторхинолонам.

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

1. Продолжение исследований, направленных на выявление мутаций, влияющих на устойчивость М. tuberculosis как в РОУФ генов gyrA и gyrB, так и вне исследуемого региона.

2. Необходимо продолжить изучение роли мутаций в гене gyrB или в сочетании с заменами в gyrA в развитии лекарственной устойчивости М. tuberculosis ко всем фторхинолонам (перекрестная устойчивость) или к отдельным препаратам из этой группы, а также их связи с уровнем устойчивости возбудителя.

3. Изучение других механизмов развития лекарственной устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам в качестве возможных рассматривают белковую мимикрию ДНК и усиленное выведение препарата из клетки с помощью эффлюксных помп.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мороз, A.M. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов: Методические рекомендации / A.M. Мороз, Е.Ю. Носова, К.Ю. Галкина, М.А. Краснова, A.A. Букатина. - М.: МНПЦБТ, 2008. - 25 с. (Утверждено Департаментом Здравоохранения города Москвы, 29.09.2008).

2. Букатина, A.A. Выявление Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью с помощью биологических микрочипов у впервые выявленных больных и с подозрением на туберкулез /A.A. Букатина // Научно-практическая конференция молодых ученых, посвященная Всемирному дню борьбы с туберкулезом. — 2009. — С. 17-19.

3. Букатина, A.A. Использование молекулярно-биологических методов для анализа мутаций в трёх генах gyrA, gyr В и rrs для диагностики широкой лекарствен-

ной устойчивости M.tuberculosis /A.A. Букатина // Научно-практическая конференция молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом. - 2010. - С. 13-15.

4. Букатина, A.A. Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB, ответственных за устойчивость М. tuberculosis к фторхинолонам молекулярно-биологическими методами / A.A. Букатина, Ю.Д. Исаева, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова // Сб. трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». - 2010. - т. 1. - С. 109-112.

5. Носова, Е.Ю. Диагностика множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis с помощью молекулярно-генетических методов / Е.Ю. Носова, A.A. Букатина, М.Б. Гикало // В сб.: Научные труды (к 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки, профессора М.М. Авербаха). - 2010. - С. 110-114.

6. Дорожкова, И.Р. Успешное решение многолетней проблемы экспресс-диагностики возбудителя туберкулеза и его лекарственной чувствительности к препаратам I и II ряда / И.Р. Дорожкова, Е.Ю. Носова, З.П. Абрамова, К.Ю. Галкина, A.A. Букатина, A.M. Мороз // III научно-практическая конференция «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ». -2010.-С. 28-29.

7. Мороз, A.M. Комплексная экспресс-диагностика возбудителя туберкулеза, н его лекарственная чувствительность к препаратам I и II ряда / A.M. Мороз, И.Р. Дорожкова, М.В. Макарова, З.П. Абрамова, Е.Ю. Носова, A.A. Букатина // Туберкулез и болезни легких. — 2011. - № 5. - С. 56-75.

8. Исаева, Ю.Д. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к левофлоксацину с помощью автоматизированной системы BactecT" MMGIT™ 960 / Ю.Д. Исаева, A.A. Букатнна, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова // Сб. материалов (тезисы докладов) XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 2011. - С. 268.

9. Носова, Е.Ю. Молекулярно-генетнческие исследования во фтизиатрии / Е.Ю. Носова, М.А. Краснова, К.Ю. Галкина, A.A. Букатина, Ю.Д. Исаева // Туберкулез и болезни легких. - 2011. - № 6. - С. 28-32.

10. Исаева, Ю.Д. Определение критических концентраций левофлоксаци-на для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis в

жидкой Middlebrook 7Н9 (Bactec™MGIT™ 960) и плотной Левенштейна-Йенсена питательных средах / Ю.Д. Исаева, A.A. Букатина, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова, М.В. Макарова, A.M. Мороз // Туберкулез и болезни легких. - 2012. - № 12. - С. 36-42.

11. Исаева, Ю.Д. Использование различных культуральных методов для определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к фторхиноло-нам / Ю.Д. Исаева, М.В. Макарова, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова, A.A. Букатина // Сб. материалов V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. -2013.-С. 176-177.

12. Носова, Е.Ю. Глава 8. Молекулярно-генетические исследования в лабораторной диагностике туберкулеза и определении лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis. Монография «Лабораторные исследования при туберкулезе» (под ред. академика РАМН, проф. В.И. Литвинова и проф. A.M. Мороза) / Е.Ю. Носова, М.А. Краснова, A.A. Букатина, М.Б. Гикало. - М.: изд-во «Информационные технологии в медицине», 2013. - 343 с. - С. 142-168. - 500 экз.

13. Исаева, Ю.Д. Глава 6. Сравнительное изучение определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с помощью тест-системы Sensititre Му-соТВ и других культуральных методов. Монография «Лабораторные исследования при туберкулезе» (под ред. академика РАМН, проф. В.И. Литвинова и проф. A.M. Мороза) / Ю.Д. Исаева, Л.Ю. Крылова, М.В. Макарова, A.A. Букатина, М.Б Гикало. -М.: МНПЦБТ: изд-во «Информационные технологии в медицине», 2013. - 343 с. - С. 111 - 120.-500 экз.

14. Исаева, Ю.Д. Глава 7. Выявление Mycobacterium tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью. Монография «Лабораторные исследования при туберкулезе» (под ред. академика РАМН, проф. В.И. Литвинова и проф. A.M. Мороза) / Ю.Д. Исаева, Л.Ю. Крылова, A.A. Букатина, М.В. Макарова, A.M. Мороз. - М.: МНПЦБТ: изд-во «Информационные технологии в медицине», 2013. - 343 с. - С. 121 - 141. -500 экз.

15. Носова, Е.Ю. Молекулярные механизмы развития широкой лекарственной устойчивости и методы ее определения у М. tuberculosis / Е.Ю. Носова, М.Б. Гикало, A.A. Хахалина, К.Ю. Галкина, С.Г. Сафонова // Туберкулез и социально значимые заболевания. - 2013. - № 2. - С. 56-60.

16. Беспятых, Ю.А. Определение лекарственной устойчивости и генотипи-рование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis при помощи экспериментального набора «ТБ-ТЕСТ» / Ю.А. Беспятых, Е.А. Шитиков, Д.В. Зименков, Е.В. Кулагин, Д.А. Грядунов, Е.Ю. Носова, А.А. Букатина, М.В. Шульгина, В.Ю. Журавлев, Е.Н. Ильина // Пульмонология. - 2013. - №4. - С.77-81.

17. Nosova, E.Yu. Use of biological microchips for detection and determination of M. tuberculosis susceptibility to isoniazid, rifampicin and fluoroquinolones in ТВ patients / E.Yu. Nosova, K.Yu.Galkina, A.A. Bukatina, A.M. Moroz // 5th Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Abstract Book. - Dubrovnik. - 2009. -P. 83.

18. Nosova, E. Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis drug resistance using molecular genetics methods / E. Nosova, A. Bukatina, K. Galkina, M. Krasnova // European respiratory society. - Barcelona. - 2010. - v. 36. - P. 354.

19. Nosova, E.Y. Analysis of mutations in the gyrA and gyrB genes and their association with the resistance of Mycobacterium tuberculosis to levofloxacin, moxifloxa-cin and gatifloxacin / E.Y. Nosova, A.A. Bukatina, Y.D. Isaeva, M.V. Makarova, K.Y. Galkina, A.M. Moroz // Journal of Medical Microbiology. - 2013. - v. 62. - № 1. - P. 108-113.

20. Isaeva, Y. Determination of critical concentrations of moxifloxacin and gatifloxacin for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in the BACTEC MGIT 960 system / Y. Isaeva, A. Bukatina, L. Krylova, E. Nosova, M. Makarova, A. Moroz // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 2013. - v. 68. - №10. - P. 22742281.

21. Патент 2439162 Российская Федерация, МПК C12Q 1/68, C12R 1/32. Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrB I Носова Е.Ю., Краснова М.А., Букатина А.А., Галкина К.Ю., Гикало М.Б., Мороз A.M., Литвинов В.И. Заявитель и патентообладатель: Государственное учреждение здравоохранения Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом ДЗМ (RU). — № 2010140202/10; заяв. 01.10.2010; опубл.10.01.2012, Бюл. 1. - 7 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДИ Доверительный интервал

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

КК Критическая концентрация

Л-Й Левенштейна-Йенсена плотная питательная среда

ЛУ Лекарственная устойчивость

ЛЧ Лекарственная чувствительность

МБТ Микобактерии туберкулеза

МИК Минимальная ингибирующая концентрация

МЛУ Множественная лекарственная устойчивость

п.н. Пары нуклеотидов

ПТП Противотуберкулезные препараты