Лекарственная устойчивость штаммов Mycobacterium Tuberculosis и оптимизация диагностических алгоритмов на примере Самарской области

Игнатьева, Ольга Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лекарственная устойчивость штаммов Mycobacterium Tuberculosis и оптимизация диагностических алгоритмов на примере Самарской области
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Лекарственная устойчивость штаммов Mycobacterium Tuberculosis и оптимизация диагностических алгоритмов на примере Самарской области"

На правах рукописи

Игнатьева Ольга Андреевна

ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ОПТИМИЗАЦИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ АЛГОРИТМОВ НА ПРИМЕРЕ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9АПР 2015

Самара-2015

005568049

Работа выполнена на кафедре биологической химии, биотехнологии и биоинженерии ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет» и в бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н. В. Постникова»

Научный руководитель:

доктор биологических наук Макурина Ольга Николаевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Минздрава России Шурыгин Александр Анатольевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории адаптации микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Нестерова Лариса Юрьевна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России (163000, г. Архангельск, пр. Троицкий, 51)

Защита диссертации состоится 4 июня 2015 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс:(342)2809211

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Туберкулез (ТБ) продолжает оставаться одной из серьезнейших проблем для здравоохранения во всем мире (WHO Global Tuberculosis Report, 2014). Особую тревогу вызывает неуклонное распространение штаммов М. tuberculosis со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ ТБ), то есть микобактерий, невосприимчивых к двум основным противотуберкулезным препаратам - изониазиду и рифампицину, а также штаммов с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ ТБ), то есть МЛУ ТБ штаммов, дополнительно устойчивых к фторхинолонам и резервным инъекционным препаратам.

Самарская область характеризуется неблагоприятной обстановкой по туберкулезу: по данным комплексных исследований, проведенных в области в 2001-2002 годах, доля больных с МЛУ ТБ составляла 20% среди впервые выявленных пациентов и 60% среди пациентов, получавших лечение в прошлом (Ruddy, 2005); в последующем систематического изучения распространенности антибиотикорезистентных штаммов в регионе не проводилось. Знание существующих уровней устойчивости к препаратам основного и резервного ряда, а также их динамики является обязательным для формирования правильной стратегии по борьбе с заболеванием.

В сложившейся ситуации особую актуальность приобретают вопросы, связанные с лабораторной диагностикой туберкулеза. Своевременное и точное выявление ТБ и определение спектра лекарственной устойчивости (ЛУ) возбудителя до начала лечения, а также адекватный контроль эффективности дальнейшей химиотерапии являются одним из важнейших факторов, определяющих успех терапии и противоэпидемических мероприятий. Правильный выбор быстрых и надежных методов лабораторной диагностики -существенный шаг на пути преодоления проблемы ЛУ ТБ.

Цель настоящей работы — выявление частоты встречаемости и закономерностей распространения лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis на примере Самарской области и разработка алгоритма лабораторной диагностики туберкулеза с использованием современных ускоренных методик.

Основные задачи исследования:

1. Оценить текущие уровни распространенности лекарственной устойчивости к основным и резервным противотуберкулезным препаратам среди штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ), выделенных от больных в Самарской области, и изучить динамику распространенности ЛУ штаммов за последние 10 лет.

2. Выявить основные мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (ПТП), среди штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в регионе, и провести апробацию новых ускоренных молекулярно-генетических методов выявления лекарственной устойчивости штаммов МБТ.

3. Определить основные генетические группы штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Самарской области, и провести анализ их ассоциированности с мутациями, определяющими лекарственную устойчивость.

4. Оценить эффективность метода диагностики туберкулеза путем определения жизнеспособности клеток микобактерий в клинических образцах с использованием моноазида пропидия.

5. Провести анализ факторов риска, ассоциированных с лекарственно устойчивым ТБ, а также факторов, влияющих на исход лечения и выживаемость больных туберкулезом.

6. Разработать алгоритм лабораторной диагностики туберкулеза с использованием современных ускоренных методов и оценить возможность внедрения данного алгоритма в рутинную практику диагностических лабораторий противотуберкулезных учреждений областного уровня.

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведен комплексный анализ динамики распространенности лекарственной устойчивости М. tuberculosis в Самарской области за последние 10 лет. Выявлен значительный рост доли антибиотикорезистентных штаммов среди впервые выявленных пациентов на фоне менее выраженного увеличения вторичной (или приобретенной) устойчивости, что свидетельствует об активной трансмиссии ЛУ штаммов в регионе.

Впервые в регионе проведена апробация молекулярно-генетического метода экспресс-диагностики лекарственной устойчивости GenoType MTBDRs/, в рамках которой показана возможность применения тест-системы непосредственно на клинических образцах, что существенно ускоряет диагностический процесс и обеспечивает своевременное назначение подходящей схемы лечения. Обнаруженные хорошие показатели специфичности тест-системы позволяют рекомендовать ее для экспресс-диагностики ЛУ к препаратам резервного ряда с обязательным последующим подтверждением результатов фенотипическими исследованиями.

Впервые проведена оценка метода определения жизнеспособности клеток микобактерий с использованием моноазида пропидия на материале респираторных образцов, полученных от пациентов на разных этапах лечения, и представлены данные относительно чувствительности и специфичности данного метода.

Предложен алгоритм лабораторной диагностики туберкулеза с использованием современных методик, направленный на ускоренное выявление ТБ и определение лекарственной устойчивости.

Теоретическое и практической значение работы

На основании данных, полученных в ходе апробации молекулярно-генетических тест-систем для определения ЛУ, разработан и внедрен в рутинную практику ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер им. Н.В. Постникова» новый алгоритм лабораторных исследований, позволяющий оптимизировать процесс диагностики ТБ и лекарственной устойчивости, тем самым способствуя ускорению выявления антибиотикорезистентных штаммов, ограничению их распространения и усовершенствованию мер инфекционного контроля. Разработанный алгоритм также может применяться в других регионах со сходной эпидемиологической ситуацией по туберкулезу. Данные, полученные в результате оценки эффективности тест-системы GenoType MTBDRj/, были использованы при составлении международных рекомендаций Всемирной Организации Здравоохранения по диагностике туберкулеза (WHO expert group meeting report Geneva: February 2013).

Сведения о распространенности лекарственной устойчивости и детерминирующих ее мутаций могут послужить основой для исследования

биологических свойств патогена, определяющих быстрое распространение ЛУ штаммов в популяции, а также для дальнейшего изучения причин формирования устойчивости в ходе лечения. Результаты оценки диагностического метода определения жизнеспособности микобактерий с использованием моноазида пропидия могут быть использованы для последующей оптимизации методики и возможного создания коммерческой тест-системы для отслеживания эффективности лечения у больных ТБ.

Данные по факторам риска могут быть полезными для идентификации тех пациентов, у которых вероятность ЛУ ТБ выше, таким образом, способствуя формированию целевой группы, в которой было бы рационально применять ускоренные методы диагностики, в том числе в условиях ограниченных ресурсов.

Полученные данные могут использоваться при чтении спецкурсов на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников, а также для обучения специалистов-бактериологов.

Основные положения, выпосимые на защиту

1. В Самарской области за последние 10 лет наблюдался рост распространенности ЛУ штаммов микобактерий, в том числе с МЛУ и ШЛУ, доля которых среди впервые выявленных больных увеличилась с 20,0% до 43,5% и с 0,0% до 2,9% соответственно. Выраженная динамика повышения уровней резистентности микобактерий среди впервые выявленных пациентов свидетельствует об активной трансмиссии лекарственно устойчивых штаммов в регионе.

2. В Самарской области преобладающими мутациями, определяющими устойчивость к изониазиду и рифампицину, являются S315T1 в гене katG и S531L в гене гроВ соответственно. Наиболее часто встречающимися мутациями, ассоциированными с резистентностью к фторхинолонам и аминогликозидам/ капреомицину, являются D94G в гене gyrA и A401G в гене rrs соответственно. Принадлежность к генетической группа Beijing, штаммы которой преобладают в Самарской области, ассоциирована с мутациями в генах katG и гроВ.

3. Ускоренные молекулярно-генетические методы GenoType MTBDRp/us и GenoType MTBDRr/ обладают высокими показателями

чувствительности, которые составили более 95% для изониазида и рифампицина и более 55% для препаратов группы фторхинолонов. Специфичность методик для большинства II I II также высока (свыше 90%). Использование данных тест-систем в качестве скрининговых методов играет важную роль в своевременной диагностике туберкулеза и лекарственной устойчивости.

4. Показатели чувствительности и специфичности метода определения жизнеспособности микобактерий с использованием моноазида пропидия варьируют в зависимости от срока сбора материала; тест может быть рекомендован к применению только совместно с культуральными исследованиями.

5. Спектр лекарственной устойчивости микобактерий значительно влияет на исход лечения и выживаемость пациентов с ТБ в Самарской области. У больных, инфицированных МЛУ/ШЛУ МБТ вероятность неблагоприятного исхода почти в 4 раза выше, чем у больных с JI4 ТБ, продолжительность жизни также достоверно меньше, чем у пациентов, инфицированных лекарственно чувствительными штаммами. Основным фактором, ассоциированным с повышенным риском множественной лекарственной устойчивости, является предыдущее лечение по поводу туберкулеза.

Апробация работы и публикации

Результаты исследования были представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом» (Санкт-Петербург, 2010); III всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Туберкулез с лекарственной устойчивостью микобактерий у больных ВИЧ-инфекцией» (Москва, 2009); совместном семинаре NIAID-ISTC «Research Opportunities in ТВ Drug Discovery and Diagnosis» (Москва, 2010); 21-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Милан, 2011); 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2013).

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, 4 статьи в зарубежных журналах, включенных в международные системы цитирования (Pubmed, Scopus и др.)

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 157 листах, содержит 22 рисунка и 22 таблицы. Список литературы включает 226 источников, из которых 184 — зарубежных.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора

Практическая часть работы выполнена в бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н. В. Постникова» в рамках международных научно-исследовательских проектов «ТБ-Евроген» (грант Евросоюза 201483) и «ТБ-Паннет» (грант Евросоюза 223681). Обобщение данных и анализ полученных результатов проводился на кафедре биологической химии, биотехнологии и биоинженерии ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет».

Личный вклад состоит в участии автора на всех этапах процесса: на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения в процессе проведения исследования. Автором проведена разработка дизайна исследования, организация набора и отслеживания пациентов и сбора биоматериала, сбор клинико-эпидемиологической информации, обобщение результатов и статистический анализ данных. Выполнение фенотипинеских и молекулярно-генетических исследований на материале клинических образцов и изолятов микобактерий производилось автором совместно с сотрудниками бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н. В. Постникова». Соискателем был разработан алгоритм лабораторной диагностики туберкулеза и лекарственной устойчивости с использованием современных молекулярно-генетических методик; автор принимал активной участие во внедрении данного алгоритма в рутинную практику бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н.В. Постникова».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектом исследования послужили 2 группы образцов:

- 877 респираторных образцов и полученных в последующем штаммов М. tuberculosis от 877 пациентов с легочным ТБ, проходивших стационарное или амбулаторное лечение с 01.09.2008 по 01.09.2010 в противотуберкулезных учреждениях г. Самары и Самарской области;

- 501 респираторный образец, полученный от 80 пациентов, находившихся на лечении в период с 09.01.2011 по 27.03.2014 в противотуберкулезных учреждениях г. Самары; сбор образцов производился на различных этапах лечения.

Образцы первой группы (N=877) были использованы для определения спектра лекарственной чувствительности с помощью молекулярно-генетических и фенотипических методов, а также для генотипирования; образцы второй группы (N=501) использовались для определения жизнеспособности микобактерий с применением моноазида пропидия. Клинико-эпидемиологические данные, полученные на пациентов первой группы, были использованы для анализа факторов риска ЛУ ТБ, исходов лечения, а также выживаемости больных.

Обработку клинических образцов, выделение чистых культур микобактерий и фенотипические тесты на лекарственную чувствительность проводили при помощи системы автоматизированных жидких питательных сред ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) и на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена в соответствии с рекомендациями производителя (Siddiqi, 2006) и Приказом № 109 Минздрава РФ соответственно. Выделение ДНК из клинических образцов проводили методом лизиса нагреванием с последующей ультразвуковой обработкой согласно рекомендации производителя тест-систем, использованных в работе (Hain Lifescience, Nehren, Германия). Выделение ДНК из изолятов проводили методом лизиса нагреванием с хлороформом (Yates, 2002). Идентификацию мутаций в генах rpoB, katG, inhA, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к изониазиду и рифампицину проводили с помощью тест-системы GenoType MTBDRp/u.5 V 1.0 (Hain, Lifescience) согласно рекомендациям производителя (Hillemann, 2007). Идентификацию мутаций в

генах gyrA, rrs h embB, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к фторхинолонам, аминогликозидам/ капреомицину и этамбутолу соответственно проводили с использованием тест-системы GenoType MTBDRs/ (Hain, Lifescience) также в соответствии с рекомендациям производителя (Hillemann, 2009). Все полученные культуры микобактерий были подвергнуты сполиготипированию с гибридизацией на мембранах с нанесенными олигонуклеотидными пробами по стандартной методике (Kamerbeek, 1997). Определение жизнеспособности микобактерий в клинических образцах проводили посредством инкубации с раствором моноазида пропидия (конечная концентрация 100 мкмоль) с последующей детекцией результатов с помощью метода GenoType MTBDRp/us V 2.0 (Hain, Lifescience) (Miotto, 2012).

Статистический анализ полученных данных осуществляли при помощи модулей Describe и Compare программы WINPEPI (Abramson, 2011), а также IBM SPSS Statistics 20 (SPSS Inc, Chicago, 111). Для сравнения пропорций использовали критерий согласия Пирсона (х2), а также рассчитывали отношение шансов (ОШ) с 95% доверительными интервалами; различия считали достоверными при значениях р < 0,05. Оценку факторов риска ЛУ ТБ проводили методом биноминальной логистической регрессии. Анализ выживаемости пациентов выполняли методом Каплана-Майера. Оценку влияния факторов на продолжительность жизни больных проводили с помощью метода регрессии Кокса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лекарственная устойчивость штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Самарской области, находившихся на лечении в

течение 2008-2010 гг.

По результатам проведенных фенотшшческими методами исследований доля антибиотикорезистентных штаммов в анализируемой группе оказалось достаточно высока. Среди изолятов, выделенных от впервые выявленных пациентов, 57,6% (95% ДИ 53,5 - 61,7%) были устойчивы к изониазиду; 45,9% (95% ДИ 41,8 - 50,1%) - к рифампицину; 43,5% (95% ДИ 39,4 - 47,7%) обладали множественной лекарственной устойчивостью. Среди изолятов, выделенных от получавших лечение в прошлом пациентов, доля ЛУ штаммов была выше: устойчивость к изониазиду была выявлена у 83,7% (95% ДИ 79,0 - 87,7%)

изолятов, устойчивость к рифампицину - у 78,0% (95% ДИ 72,9 - 82,6%), МЛУ - у 74,7% (95% ДИ 69,3 - 79,5%) штаммов (Рисунок 1).

л Впервые выявленные пациенты ■ Пациенты, получавшие лечение в прошлом

Препараты первого ряда Препараты второго ряда

Рисунок 1. Распространенность лекарственной устойчивости среди штаммов М. tuberculosis, выделенных от пациентов в Самарской области в 2008-2010 гг. SM - стрептомицин, INH - изониазид, RIF - рифампицин, ЕМВ -этамбутол, PZA - пиразинамид, АМК — амикацин, САР - капреомицин, OFL -офлоксацин, МОХ - моксифлоксацин, РТ - протионамид.

*Чув. - чувствительность ко всем препаратам сохранена

Помимо этого, значительное количество штаммов оказалось устойчивым к препаратам резервного ряда. Первичная устойчивость МБТ к офлоксацину достигала 17,9% (95% ДИ 13,4 - 23,2%), к моксифлоксацину - 19,3% (95% ДИ 14,4 - 25,0%); чуть ниже были уровни устойчивости к амикацину - 9,2% (95% ДИ 5,9 - 13,4%) и капреомицину - 9,2% (95% ДИ 5,9 - 13,5%). Уровни вторичной устойчивости к инъекционным препаратам почти достигали 20%, к фторхинолонам - 40%. 2,9% (95% ДИ 1,7 - 4,7%) изолятов от пациентов с впервые выявленным ТБ обладали широкой лекарственной устойчивостью. Среди ранее лечившихся пациентов ШЛУ ТБ был зафиксирован в 10,3% (95% ДИ 7,1 - 14,3%) случаях.

Анализ динамики уровней ЛУ с использованием данных систематических исследований, проведенных в регионе в 2001-2002 гг. (Балабанова, 2005) указывает на значительный рост доли антибиотикорезистентных штаммов. За последние 10 лет в Самарской области показатели первичной МЛУ возросли вдвое (с 20.0% до 43,5%), а для вторичной МЛУ увеличились с 55,6% до 74,7%. Также можно отметить увеличение доли штаммов, резистентных к антибиотикам резервного ряда. Особенно это заметно для препаратов группы фторхинолонов, устойчивость к которым в 2001-2002 годах встречалась не более чем в 4% случаев, а концу десятилетия выросла в 7 раз. Менее выражены изменения в процентном соотношении изолятов, устойчивых к инъекционным препаратам. Так, в начале 2000-х устойчивость к амикацину была диагностирована в 7,2% случаев и к настоящему моменту достигла 13,1%. Важно отметить, что в 2001-2002 гг. в Самаре не было выявлено ни одного штамма М. tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью, в текущем же исследовании ШЛУ ТБ был зафиксирован у 5,5% (95% ДИ 4,1 - 7,2%) пациентов.

Более всего обращает на себя внимание зафиксированная в рамках текущего исследования распространенность лекарственной устойчивости среди изолятов, выделенных от пациентов, никогда ранее не получавших лечение по поводу туберкулеза, а также значительный рост уровней первичной ЛУ. Вероятнее всего, это указывает на текущую активную трансмиссию антибиотикорезистентных штаммов М. tuberculosis в Самарской области. Наши наблюдения подтверждают результаты проведенных в регионе генетических исследований, в рамках которых были приведены доказательства трансмиссии мультирезистентных штаммов (Casali, 2012; Casali, 2014), а также данные, свидетельствующие о наличии активного эпидемиологического процесса (Концевая, 2014).

С помощью методов GenoType MTBDRp/us и GenoType MTBDRs/ (Hain, Lifescience) нами был проведен анализ частоты встречаемости основных мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью штаммов микобактерий, циркулирующих в регионе. Удалось установить, что в подавляющем большинстве случаев устойчивость к рифампицину была обусловлена мутациями в кодоне 531 гена гроВ (92,0%), причем наиболее распространенной была мутация S531L (82,1%). Устойчивость к изониазиду чаще всего определялась мутациями S315T1 в гене katG (88,3%). Устойчивость к фторхинолонам чаще всего определялась мутацией D94G гена gyrA (64,7%); у всех штаммов, которых молекулярно-генетическим методом была выявлена

устойчивость к группе инъекционных препаратов, обнаруживалась только мутация A401G в гене rrs. В абсолютном большинстве случаев (91,3%) устойчивость к этамбутолу была обусловлена мутацией M306V гена етЬВ.

Нами также была проведена оценка распространенности основных мутаций, определяющих лекарственную устойчивость М. tuberculosis, среди штаммов, относящихся к генетической группе Beijing, и среди штаммов других семейств. Было установлено, что мутации в генах гроВ и katG достоверно чаще встречаются среди изолятов, идентифицированных как Beijing, нежели среди изолятов других генетических групп (0111=6,01, 95% ДИ 3,98; 9,16 и ОШ=5,21, 95% ДИ 3,54; 7,68 соответственно). Мутации в гене inhA были более распространены в группе He-Beijing штаммов, однако статистически значимых различий в распространенности мутаций в данном гене между двумя группами выявлено не было (0111=0,63, 95% ДИ 0,33; 1,29). Также не было обнаружено и статистически достоверных различий в процентном соотношении мутаций, определяющих устойчивость к препаратам резервного ряда и этамбутолу (gyrA, rrs и етЬВ).

В рамках работы была проведена оценка основных диагностических показателей молекулярно-генетических тест-систем GenoType MTBDRp/i/s (Рисунок 2) и GenoType MTBDRj/ (Рисунок 3).

INH

МЛУ

Чувствител ьность

■ Специфичность

■ Прогностическая ценность положительного результата ш Прогностическая ценность отрицательного результата

Рисунок 2. Диагностические параметры теста GenoType MTBDR/>/im. INH - изониазид, RIF - рифампицин

100,0% 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0%

FQ AMK CAP KAN AG/CP EMB ШЛУ Чувствительность Специфичность ■ Прогностическая ценность положительного результата

_■ Прогностическая ценность отрицательного результата_

Рисунок 3. Диагностические параметры теста GenoType MTBDRä/. FQ -фторхинолоны, AMK - амикацин, CAP - капреомицин, KAN - канамицин, AG/CP - аминогликозиды/капреомицин, EMB - этамбутол

Выявлена высокая чувствительность метода GenoType MTBDRp/м,? для определения устойчивости МБТ к изониазиду и рифампицину, а также для обнаружения МЛУ ТБ, превысившая 95%; специфичность тест-системы составила более 80%.

Для метода GenoType MTBDR.y/ высокие показатели чувствительности были обнаружены при диагностике устойчивости к капреомицину (71,4%) и амикацину (63,6%); более низкой чувствительность была для этамбутола (36,0%), фторхинолонов (55,6%), канамицина (9,2%) и широкой лекарственной устойчивости (13,6%). В то же время показатели специфичности оказались очень высокими для всех ПТП, достигая 100% для большинства препаратов.

Причиной низких диагностических показателей в отношении канамицина и ШЛУ могут являться генетические особенности штаммов М. tuberculosis, характерных для определенного географического региона. В частности было показано, что штаммы генетической группы Beijing, преобладающие в Самарской области, зачастую несут мутации в гене eis, способные

обеспечивать резистентность только к канамицину, и не детектируемые тест-системой GenoType MTBDRy/ (Huang, 2011). Отсутствие перекрестной устойчивости в группе инъекционных препаратов среди штаммов, несущих мутации в гене eis, было показано и в исследованиях в Российской Федерации, в той числе и в Самарской области (Casali, 2012; Gikalo, 2012). Несмотря на эти особенности, тест-система GenoType MTBDRs/ может служить полезным скрининговым методом для экспресс-диагностики лекарственной устойчивости к резервным ПТП и ШЛУ ТБ, однако обязательным является подтверждение полученных результатов традиционными фенотипическими исследованиями.

ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК М. TUBERCULOSIS В РЕСПИРАТОРНЫХ ОБРАЗЦАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОАЗИДА ПРОПИДИЯ

В текущем исследовании нами был апробирован альтернативный метод лабораторной диагностики туберкулеза путем определения жизнеспособности микобакгерий в клиническом материале с использованием моноазида пропидия (ПМА) - специфического красителя, способного проникать в клетку микроорганизма и связываться с ДНК только при наличии поврежденной клеточной стенки. В целом методика продемонстрировала средние показатели чувствительности, достигающие 73,2% (95% ДИ 57,1-85,8%) для образцов от пациентов с ЛЧ ТБ и 63,4% (95% ДИ 52,8-73,2%) для образцов, полученных от МЛУ ТБ пациентов. Специфичность составила 74,7% (95% ДИ 64,2-83,4%) в группе проб от больных с ЛЧ ТБ и 77,1% (95% ДИ 71,8-81,9%) в группе проб от МЛУ ТБ больных. Диагностические параметры методики значительно варьировали в зависимости от срока сбора биоматериала. На начальных этапах лечения наблюдались наиболее высокие показатели чувствительности и прогностической ценности положительного результата (60% и выше). На более поздних этапах лечения (начиная со 2 месяца и далее) чувствительность метода ПМА несколько снижалась, однако одновременно повышались значения специфичности и прогностической ценности отрицательного результата, превысившие 70% и 90% соответственно для проб, собранных на 5-м и 6-м месяцах лечения. В целом, тест может быть использован в качестве

скринингового метода для отслеживания эффективности лечения пациентов, однако обязательным является подтверждение результата культуральными исследованиями.

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ

УСТОЙЧИВОСТИ В САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ: ФАКТОРЫ РИСКА, ВЛИЯНИЕ НА ИСХОДЫ ЛЕЧЕНИЯ И ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПАЦИЕНТОВ

Пациенты из разных групп (в зависимости от пола, возраста, района проживания, наличия вредных привычек и т.д.) могут быть в разной степени подвержены инфицированию ЛУ штаммами М. tuberculosis. В рамках текущего исследования было проведено изучение ассоциированных с лекарственной устойчивостью факторов риска, характерных для пациентов Самарской области; данная информация в перспективе позволяет сформировать группу больных с повышенным риском ЛУ ТБ.

Одним из наиболее важных факторов, ассоциированных как с устойчивостью отдельно к изониазиду и рифампицину, так и с МЛУ ТБ, было противотуберкулезное лечение в прошлом. У больных, начинающих повторный курс химиотерапии, риск быть инфицированными изониазид-устойчивым штаммом в 2 раза превышал таковой у пациентов, никогда раньше не лечившихся от ТБ (ОШ=2,11, 95% ДИ 1,15; 3,88, р=0,016); риск МЛУ ТБ был выше почти в 4 раза (ОШ=4,33, 95% ДИ 3,07; 6,11, р<0,001). Лечение в прошлом является одним из основных и наиболее существенных факторов, ассоциированных с лекарственной устойчивостью среди пациентов Самарской области.

Нами также была проведена оценка влияния спектра лекарственной устойчивости микобактерий на исход лечения пациентов. В результате было установлено, что наличие резистентности возбудителя к двум и более препаратам (исключая одновременную устойчивость к изониазиду и рифампицину) почти в 3 раза увеличивало риск неблагоприятного исхода лечения (ОШ=2,82 95% ДИ 1,62; 4,92, р<0,001). В еще большей степени возрастал риск неблагоприятного исхода химиотерапии у пациентов со

множественной (ОШ=3,55 95% ДИ 2,52; 5,01, р<0,001) и широкой (0111=4,80 95% ДИ 2,21; 10,4, р<0,001) лекарственной устойчивостью.

Было продемонстрировано, что спектр лекарственной устойчивости возбудителя значительно влияет и на продолжительность жизни пациентов. Медиана выживаемости пациентов с лекарственно чувствительным ТБ составила 10,35 лет, в то время, как у пациентов с МЛУ ТБ - 2,87 лет, а у пациентов с ШЛУ ТБ 1,84 года. При дальнейшем анализе факторов, влияющих на выживаемость больных, было установлено, что более молодой возраст (для группы 40-49 лет по сравнению с группой < 30 лет ОР=0,51; 95% ДИ 0,33; 0,78, р=0,002; для группы 50-59 лет по сравнению с группой < 30 лет ОР=0,47; 95% ДИ 0,29; 0,76, р=0,002), проживание в сельской местности (ОР=1,66, 95% ДИ 1,23; 2,24, р=0,001), а также наличие ВИЧ-инфекции (ОР=1,75; 95% ДИ 1,24; 2,48, р=0,002) ассоциированы с большей вероятностью летального исхода.

ОПТИМИЗАЦИЯ АЛГОРИТМА УСКОРЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Традиционные культуральные методы исследования, несмотря на свою точность и надежность, не позволяют в короткие сроки подтвердить диагноз ТБ и определить спектр ЛУ микобактерий, а, следовательно, и назначить адекватное лечение в оптимальные сроки и предотвратить трансмиссию устойчивых штаммов. На основании проведенных нами исследований по распространенности лекарственной устойчивости и ее выявления ускоренными молекулярно-генетическими методами, нами был разработан оптимизированный алгоритм диагностики ТБ, применимый на уровне областной лаборатории с учетом имеющегося опыта, доступного оборудования и современных рекомендаций (Рисунок 4).

В рамках разработанного алгоритма предполагается использование современной системы автоматического культивирования ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD), молекулярно-генетических тест-систем GenoType MTBDR/?/hs и GenoType MTBDRs/ (Hain, Lifescience) наряду с традиционными методами исследования с применением плотных питательных сред. Использование данного алгоритма может способствовать снижению числа

Рисунок 4. Предлагаемый алгоритм лабораторной диагностики туберкулеза с использованием ускоренных методик

больных с лекарственной устойчивостью (за счет своевременного выявления ЛУ у пациентов, их изоляции и немедленного назначения адекватного режима терапии, а значит предотвращения трансмиссии устойчивых штаммов) и, соответственно, обеспечит экономию средств, необходимых для длительного лечения таких больных дорогостоящими препаратами. Рациональное использование доступных на сегодняшний день методик способствует сокращению сроков пребывания больных в стационаре за счет укороченного обследования, подбора лечения и идентификации эпидемиологически неопасных больных. Кроме того, предложенный алгоритм лабораторных исследований существенно повысит уровень безопасности труда персонала лаборатории и уменьшит нагрузку сотрудников.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что за последние 10 лет в Самарской области наблюдался рост распространенности ЛУ штаммов микобактерий, в том числе с МЛУ и ШЛУ, доля которых среди впервые выявленных больных увеличилась с 20,0% до 43,5% и с 0,0% до 2,9% соответственно. Выраженная динамика повышения уровней резистентности микобактерий среди впервые выявленных пациентов свидетельствует об активной трансмиссии лекарственно устойчивых штаммов в регионе.

2. Показано, что в Самарской области преобладающими мутациями, определяющими устойчивость к изониазиду и рифампицину, являются S315T1 в гене katG и S531L в гене гроВ соответственно. Наиболее часто встречающимися мутациями, ассоциированными с резистентностью к фторхинолонам и аминогликозидам/капреомицину, являются D94G в гене gyrA и A401G в гене rrs соответственно. Выявлено, что для наиболее распространенной в Самарской области генетической группы Beijing характерна ассоциированность с мутациями в генах katG и гроВ.

3. Обнаружены высокие показатели чувствительности молекулярно-генетических методов GenoType MTBDRp/tw и GenoType MTBDRs/, составившие более 95% для изониазида и рифампицина и более 55% для препаратов группы фторхинолонов. Специфичность методик для большинства ПТП также была высока, достигая 90% и более. Использование данных тест-систем в качестве скрининговых методов играет важную роль в своевременной диагностике туберкулеза и лекарственной устойчивости.

4. Установлено, что показатели чувствительности и специфичности метода определения жизнеспособности микобактерий с использованием моноазида пропидия варьируют в зависимости от срока сбора материала; тест может быть рекомендован к применению только совместно с культуральными исследованиями.

5. Показано значительное влияние спектра лекарственной устойчивости микобактерий на исход лечения и выживаемость пациентов с ТБ в Самарской области. У больных, инфицированных МЛУ/ШЛУ МБТ вероятность неблагоприятного исхода почти в 4 раза выше, чем у больных с ЛЧ ТБ, продолжительность жизни также достоверно меньше, чем у пациентов,

инфицированных лекарственно чувствительными штаммами. Основным фактором, ассоциированным с повышенным риском множественной лекарственной устойчивости, является предыдущее лечение по поводу туберкулеза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Балабанова, Я.М. Использование автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г. Самаре / Я.М. Балабанова, И.М. Федорин, H.A. Маломанова, Ф. Дробниевский, В.В. Николаевский, X. Сун, Ю.А. Машкова, Т.Г. Симак, И.С. Концевая, O.A. Игнатьева, С.А. Миронова // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009. - № 10. - С. 63-70.

2. Балабанова, Я.М. Оптимизация лабораторной диагностики туберкулеза с использованием современных бактериологических и молекулярно-генетических методов / Я. М. Балабанова, Ф. Дробневски, И. М. Федорин, О. А. Игнатьева, Н. А. Маломанова // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2011 - № 2. - С. 36-43.

3. Николаевский, В. В. Чувствительность и специфичность молекулярно-генетической тест-системы Hain MTBDR/í/us для экспресс-диагностики лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза на материале мокроты / В. В. Николаевский, Я. М. Балабанова, С. А. Миронова, И. С. Концевая, О. А. Игнатьева, Ю. Д. Чинкова, Т. Г. Симак, Н.М. Сабирова, Н. А. Маломанова, И. М. Федорин, Ф. Дробневски // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2010 - № 4. - С. 28-34.

Публикации в зарубежных журналах

4. Drobniewski, F. Rapid diagnostics of tuberculosis and drug resistance in . the industrialized world: clinical and public health benefits and barriers to

implementation / F. Drobniewski, V. Nikolayevskyy, H. Maxeiner, Y. Balabanova, N. Casali, I. Kontsevaya, O. Ignatyeva // BMC Med. - 2013 - №11. - C. 190.

5. Ignatyeva, О. Detection of resistance to second-line antituberculosis drugs by use of the Genotype MTBDRs/ assay: a multicenter evaluation and feasibility study / O. Ignatyeva, I. Kontsevaya, A. Kovalyov, Y. Balabanova, V. Nikolayevskyy, K. Toit, A. Dragan, D. Maxim, S. Mironova, T. Kummik, I. Muntean, E. Koshkarova, F. Drobniewski // J. Clin. Microbiol. - 2012 - №5. - C. 1593-1597.

6. Kontsevaya, I. Diagnostic accuracy of the GenoType MTBDRs/ assay for rapid diagnosis of extensively drug-resistant tuberculosis in HIV-coinfected patients / I. Kontsevaya, O. Ignatyeva, V. Nikolayevskyy, Y. Balabanova, A. Kovalyov, A. Kritsky, O. Matskevich, F. Drobniewski // J. Clin. Microbiol. - 2013 — №1. — C. 243-248.

7. Nikolayevskyy, V. Utility of propidium monoazide viability assay as a biomarker for a tuberculosis disease / V. Nikolayevskyy, P. Miotto, E. Pimkina, Y. Balabanova, I. Kontsevaya, O. Ignatyeva, A. Ambrosi, G. Skenders, A. Ambrozaitis, A. Kovalyov, A. Sadykhova, T. Simak, A. Kritsky, S. Mironova, O. Tikhonova, Y. Dubrovskaya, Y. Rodionova, D. Cirillo, F. Drobniewski // Tuberculosis (Edinb). - 2014 - doi: 10.1016/j.tube.2014.11.005. [Epub ahead of print].

Публикации в других журналах и сборниках

8. Балабанова, Я. М. Оптимизация лабораторной диагностики туберкулеза с использованием современных бактериологических и молекулярно-генетических методов / Я. М. Балабанова, Ф. Дробневски, И. М. Федорин, О. А. Игнатьева, В. В. Николаевский, Н. А. Маломанова, Ю. Д. Чинкова, А. А. Рыбкина, И. С. Концевая, С. А. Миронова, А. М. Ковалёв, А. В. Шахмистова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом». - Санкт-Петербург. - 2010 С. 96-98.

9. Маломанова, Н. А. Опыт применения метода ускоренной молекулярно-генетической диагностики туберкулеза и лекарственной устойчивости / Н.А. Маломанова, Я.М. Балабанова, И.М. Федорин, В.В. Николаевский, Т.Г. Симак, Н.М. Ильина, М.В. Коробова, Ю.Д. Чинкова, А.А. Наумов, И.С. Концевая, С.А. Миронова, О.А. Игнатьева, Ф. Дробневский // Материалы 1П всероссийской научно-практической конференции с

международным участием «Туберкулез с лекарственной устойчивостью микобактерий у больных ВИЧ-инфекцией». - Москва. - 2009 С. 65.

10. Balabanova, Y. Epidemiology of Drug Resistant Tuberculosis in Samara Oblast, Russian Federation / Y. Balabanova, V. Nikolayevskyy, O. Ignatyeva, S. Mironova, A. Kovalev, N. Malomanova, Y. Chinkova, A. Rybkina, I. Fedorin, F. Drobniewski // Материалы совместного семинара NIAID-ISTC «Research Opportunities in ТВ Drug Discovery and Diagnosis». - Москва. - 2010.

11. Ignatyeva, O. Genetic analysis of the host-pathogen interaction in tuberculosis ("TB-EURO-GEN") study - progress and current tuberculosis epidemiology / O. Ignatyeva, I. Kontsevaya, Y. Balabanova, V. Nikolaevskyy, S. Mironova, A. Kovalev, A. Isaeva, Y. Chinkova, A. Rybkina, A. Kritskyy, D. Gromova, M. Korobova, A. Shakhmistova, N. Malomanova, I. Fedorin, S. Nejentsev, R. Horstmann, S. Hoffner, F. Drobniewski // Материалы 21-го Европейского конгресса по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям. — Милан. — 2011.

12. Kontsevaya, I. Performance of the GenoType MTBDRsl assay for rapid diagnosis of extensively drug-resistant tuberculosis in HIV-coinfected patients / I. Kontsevaya, O. Ignatyeva, V. Nikolayevskyy, Y. Balabanova, A. Kovalyov, A. Kritsky, O. Matskevich, F. Drobniewski // Сборник тезисов 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. — Пущино. - 2013. - С. 248-249.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДИ - доверительный интервал

ЛИ — среда Левенштейна-Иенсена

ЛУ — лекарственная устойчивость

ЛЧ — лекарственная чувствительность

МЛУ — множественная лекарственная устойчивость

ОР — отношение рисков

ОШ — отношение шансов

ПТП — противотуберкулезные препараты

ПМА - моноазид пропидия

ТБ — туберкулез

Ш ЛУ - широкая лекарственная устойчивость